JPH06125778A - リボザイムを用いたｒｎａ転写機能を有するベクターとそれを用いたｒｎａ製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 余分な塩基配列が付加していない１種または
２種以上のＲＮＡ転写産物を、優れた転写効率で製造す
ること。 【構成】 ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セル
フプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断
するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該Ｒ
ＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードす
るＤＮＡ配列を含む加してなるリボザイムＲＮＡをコー
ドするＤＮＡ配列を含むベクター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リボザイムを用いたＲ
ＮＡ転写機能を有するベクターとそれを用いたＲＮＡ製
造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構
成されていると確信されていたが、1981年に酵素活性を
有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見され、従
来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期的発見
はコロラド大学のチェック（T.Cech）らによってもたら
された。すなわち、原生動物のテトラヒメナのリボソー
ムＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体においては、機能上不必要
なイントロン（ＩＶＳ）がタンパク質酵素の力を借りず
に、セルフスプライシングにより取り除かれることが証
明された(Cell,Vol.31,p.147-157(1982);Nature Vol.30
8, p.820-825 (1984))。

【０００３】その後、例えばホスホジエステル結合をセ
ルフスプライシングする触媒機能を有するＲＮＡ分子が
次々と発見された。また、他のＲＮＡ分子を切断するＲ
ＮＡ分子（リボザイム）も見出されている。最近このよ
うな中で、ハセロフ（J.Haseloff）と ジャーラック
（W.L. Gerlach）は、数種の植物病原性ウイルスのサテ
ライトウイルスのリボザイムの間で共通に保持されてい
る塩基配列に着目し、わずか24塩基で構成された短鎖リ
ボザイムを遺伝子操作技術を用いて構築し、人工リボザ
イムの作出に成功した（NatureVol.334, p.585-591 (19
88)；特願平3-502638号) 。

【０００４】また、大塚らは非自己のＲＮＡ分子の切断
を触媒する短鎖リボザイムを化学合成で調製した（特願
平2-195883号）。図１はこの短鎖リボザイムの構造と作
用部位を示すもので、当該人工リボザイムは、基質とな
るＲＮＡ分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結
合部位Ｃと、24個の特定の塩基配列を有するＢ（触媒活
性部位を含む）から構成されており、基質として示され
た標的ＲＮＡはＡ（ＧＵＣ）部分に隣接する位置で切断
を受ける（図中、矢印で示す）。

【０００５】なお、このＡ部分のＲＮＡ配列は、ＧＵＣ
のみに限定されるものではなく、他の配列に変更するこ
とも可能である。そして、このハセロフ（J.Haseloff）
らの人工リボザイムの構築において用いられた手法は、
上記のリボザイムの設計に基づいてリボザイムＲＮＡと
相補塩基配列を有し、リボザイムＲＮＡをコードするＤ
ＮＡを合成してプラスミドに挿入し、さらにこの組み換
えプラスミドを形質転換して得られたクローンを適当な
制限酵素で切断して、リボザイムＲＮＡをコードするＤ
ＮＡ断片を得、これを鋳型としてインビトロ（in vitr
o）で転写することにより人工リボザイムを得るもので
あった。かかる手法の実施においては標的ＲＮＡの結合
部位の塩基配列が異なる３種のリボザイムを合成し、こ
の３種のリボザイムがクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼに対応するｍＲＮＡを各々異なる位置
で切断することを明らかにしている。

【０００６】リボザイムは基質特異性が高く、標的部位
の数塩基の違いも認識することができる。ベネット（M.
J.Bennett）らは、リボザイムを用いて４つのアイソザ
イム遺伝子より構成されるマメのグルタミンシンセテー
スｍＲＮＡの切断実験を行い、４つのうち１つの遺伝子
由来のｍＲＮＡを標的とするよう設計したリボザイム
が、塩基配列がよく似た他のアイソザイム遺伝子由来の
ｍＲＮＡは切断しないことを報告している（Nucleic Ac
ids Research,Vol.20,p.831-837(1992)）。

【０００７】リボザイムのこれらの性質を利用して、リ
ボザイムを薬剤、特に、抗ＲＮＡウイルス剤として応用
しようという試みがなされている。ロッシー（J.J.Ross
i）らは、リボザイムを用いてヒト免疫不全症ウイルス
(HIV-1)を切断をすることに成功した（Science Vol.24
7, p.1222-1224(1990)) 。彼らはHIV-1のgag遺伝子中の
ＧＵＣの3'側を切断するリボザイムを設計し、これをコ
ードするＤＮＡをヒトβ−アクチンプロモーターの下流
に連結し、CD４を有するヒーラ細胞に形質転換した。こ
の形質転換体にHIV-1を感染させ、ポリメラーゼ伸長反
応により正常なgagＲＮＡが顕著に減少していることを
確認した。

【０００８】ところが、リボザイムの基質特異性が高い
ということは、逆の見方をすると、リボザイムの認識部
位に塩基置換や欠損等の変異が生じると、もはや当該リ
ボザイムはこれを基質とすることができずに、切断でき
ないことになってしまう。そのため、塩基配列が頻繁に
変化する微生物由来のＲＮＡ、例えば、前述の塩基配列
の変化速度が早いことが知られているHIV-1では、永続
的に作用するリボザイムを設計することは困難である。

【０００９】これを解決する方法の一つとして、標的Ｒ
ＮＡの多数の作用部位に多種類のリボザイムを同時に作
用させることが考えられ得る。一ヵ所の標的部位が変異
を起こしたとしても、他の標的部位が同時に変異を起こ
す確率はかなり低いであろうし、標的部位として、その
ＲＮＡが機能するのに重要な部位を選択しておけば、変
異を起こした場合そのＲＮＡは、もはや機能することが
できなくなってしまう。

【００１０】一方、リボザイムと同様のものにアンチセ
ンスＲＮＡがある。これは、標的ＲＮＡを相補する塩基
配列を有するＲＮＡで、標的ＲＮＡあるいは標的ＲＮＡ
をコードするＤＮＡ鎖と２本鎖を形成することで標的Ｒ
ＮＡの転写あるいは、標的ＲＮＡが機能することを阻止
するものである。その作用機構は、非常に複雑で、標的
ＲＮＡの転写阻害、スプライシング阻害、翻訳阻害、あ
るいは標的ＲＮＡと２本鎖を形成することにより、ＲＮ
ase による分解を誘導する等が報告されている（Antise
nse Nucleic Acids and Proteins(Eds. J.N.M.Hol and
A.R.van der Krol)Marcel Dekker,New York(1991))。

【００１１】アンチセンスＲＮＡもリボザイム同様、抗
ＲＮＡウイルス剤等の薬剤としての応用が試みられてい
る。ハン（L.Han）らは、マウス白血病ウイルスのパッ
ケージングに必須なウイルス遺伝子の配列に相補的なア
ンチセンスＲＮＡを発現するトランスジェニックマウス
を作成し、これが白血病ウイルスに曝されても全く発病
しないことを示した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., V
ol.88 ,p.4313-4317(1992)）。

【００１２】アンチセンスＲＮＡの場合も、リボザイム
同様基質特異性が高い。そのため、前述のリボザイムと
同様に、標的ＲＮＡにかかわる問題をはらんでいること
が当該分野で知られている。リボザイムあるいはアンチ
センスＲＮＡを生体内に供給する方法として、化学的方
法；酵素法；また、あるいは遺伝子組み換え法で合成し
たものを生体外部から入れる方法；遺伝子組み換え法、
すなわちリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡをコー
ドするＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだも
のを、適当なベクターに挿入し、これを生体内に導入す
ることにより、生体内でリボザイムあるいはアンチセン
スＲＮＡを産生する方法が知られている。前者の化学的
方法は、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡの効果
を持続させるためには、頻繁にリボザイムあるいはアン
チセンスＲＮＡを生体内に注入し、十分な濃度を維持す
る必要がある。

【００１３】これに対して、後者の遺伝子組み換え法は
生体内で絶えずリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡ
を産生し続けることができるため、リボザイムあるいは
アンチセンスＲＮＡを注入し続ける等の問題点を解決す
ることができる。ところで、多種類のリボザイムあるい
はアンチセンスＲＮＡを生体内に供給する場合、それぞ
れのリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体外で
前述のように合成し、生体外から供給することは可能で
あるが、組み換え遺伝子法によりこれを行うことは、多
種の遺伝子を生体内に導入するのと同じことであり、こ
の技術は非常に困難であることが当該分野で知られてい
る。

【００１４】リボザイムに関しては、唯一、チェン（Ch
en) らは多種のリボザイムを一度に作用させるものとし
て、一つのプロモーターの下流に多種のリボザイムを幾
つも連結し、一分子中に多種のリボザイム活性部位をも
つものとして考案した(Nucleic Acids Res.Vol.20,p458
1-4589(1992)) 。しかし、このような構築物は一分子中
に相補的な配列を多く含み、それらの干渉作用により必
ずしもリボザイム活性が高いとはいえない。このこと
は、連結するリボザイム活性部位が多くなるほど顕著で
あると考えられる。

【００１５】さらに、リボザイムあるいはアンチセンス
ＲＮＡの様な特定のＲＮＡ転写物をインビトロ（in vit
ro) で得ようとする場合、従来法においては、目的とす
るＲＮＡをコードするＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転
写する際に、当該ＤＮＡにより組み換えられたプラスミ
ドを制限酵素で切断してから転写するという余分の手間
を要するものであった（ラン・オフ法と呼ばれてい
る）。

【００１６】この理由は、当該プラスミドに挿入された
ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡを転写する場合に必然的
に生ずる、5'末端側と3'末端側における余分な塩基配列
を可能な限り転写させないようにするためである。すな
わち、5'末端側は、プロモータのすぐ下流に上記ＤＮＡ
を連結させることによって処理されていたが、3'末端側
の処理は、ＲＮＡの転写において未だユニバーサルなタ
ーミネータが見い出されておらず、当該3'末端側の処理
に際して制限酵素を使用するいわゆるランオフ法を採ら
ざるを得なかった（図２）。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】上記の制限酵素を使用
する従来の方法は、制限酵素を使用するという余分の手
間に加えて、転写において切断された線状のＤＮＡを使
用する必要があるため、インビトロ（in vitro）では、
ＲＮＡを合成することが可能であるが、生体内におい
て、ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含む組み換えベク
ターを保持、増殖せしめつつＲＮＡ転写物を産生させる
ことができないという欠点を有していた。さらに、5'末
端側の処理においてプロモーターのすぐ下流に目的とす
るＲＮＡに対応するＤＮＡを連結したとしても、転写開
始点から目的とするＲＮＡに対応するＤＮＡまでの間の
余分な塩基配列が付加してしまうということを避けるこ
とができなかった。まして、余分な塩基配列が付加され
ていない複数個のＲＮＡを同時に産生させるベクター
は、存在しなかった。

【００１８】本発明の課題は、上記のin vitroでの制限
酵素による切断を行わずに、目的とするＲＮＡ転写物を
コードするＤＮＡにより組み換えられた環状のベクター
をそのまま鋳型として用いることができるとともに余分
な塩基配列を有しないＲＮＡ、あるいは、余分な塩基配
列を有しない多種類のＲＮＡを同時に転写することが可
能であり、かつ生体内においても当該組み換えベクター
を保持増殖させながら目的とするＲＮＡ転写物を高い転
写効率で産生することが可能な、リボザイムを用いたＲ
ＮＡの新規な転写システムを提供しようとするものであ
る。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、ベクターの構築において、目的とするＲＮＡ転
写物の5'末端と3'末端とを各々セルフプロセッシングに
より切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを一
単位とし、当該１単位又は２単位以上を直列に連結し、
特定の配列のプロモーターの下流に、あるいは特定の配
列のプロモーター及びターミネーターの間に配置するこ
とにより、上記の課題を解決し得ることを見出し、本発
明を完成するに至ったものである。

【００２０】すなわち、本発明は次の(1)から(4)を要旨
とするものである。 (1) ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプ
ロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断する
リボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該ＲＮＡ
単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードするＤ
ＮＡ配列を含むベクター。

【００２１】(2) 前記(1)に記載したＲＮＡ単位を、１
乃至10単位連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含
むベクター。 (3) 前記(1)に記載したＲＮＡ単位をｎ個（ｎは１以上
の整数）連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターにおいて、5'末端側から１番目の上記ＲＮＡ単
位の5'末端の近傍にプロモーターが付加されており、か
つ当該プロモーターに対応するターミネーターが、5'末
端側からｎ番目の上記ＲＮＡ単位の3'末端の近傍に付加
されていることを特徴とする、ＲＮＡをコードするＤＮ
Ａ配列を含むベクター。

【００２２】(4) 前記(1)〜(3)に記載されたベクター
を鋳型として、当該ベクターＤＮＡをＲＮＡに転写する
ことを特徴とする、5'末端側と3'末端側がセルフプロセ
ッシングされたＲＮＡ転写物の製造方法。 (5) 前記(1)〜(3)に記載されたベクターにより形質転
換された、微生物、又は動物細胞若しくは植物細胞。

【００２３】以下、本発明を更に詳述する。本発明のベ
クターは、調製したＲＮＡ１単位をセルフプロセッシン
グにより切断する、又は２単位以上を直列に連結するこ
とにより構築することができる。本発明のベクターの構
築は、まずＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セル
フプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断
するリボザイムを有するＲＮＡ単位を調製することによ
り行うことができる。

【００２４】すなわち、目的とするＲＮＡ転写物の5'末
端側と3'末端側を処理するため２つのリボザイムＲＮＡ
をコードするＤＮＡ断片を連結する。このうち、第１の
ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ転写物の5'末端側を処理するため
のもので、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードす
る部分と、その両端の基質となる転写されるＲＮＡの切
断部位（5'末端側）を認識する結合部位をコードする部
分を含む。このリボザイムＲＮＡとコードするＤＮＡは
目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡの5'上流側
に連結する。

【００２５】また、同じく挿入される第２のＤＮＡ配列
は、転写されたＲＮＡの3'末端側を処理するためのもの
で前記目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡの3'
下流側に連結され、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位を
コードする部分とその両端の基質となる転写されるＲＮ
Ａの切断部位（3'末端側）を認識する結合部位をコード
する部分より成る。

【００２６】そして、複数個のＲＮＡ単位を連結するベ
クターの構築においては、上記において調製したＲＮＡ
単位の5'末端と3'末端とを各々、セルフプロセッシング
により切断するリボザイムを有するＲＮＡをコードする
ＤＮＡを１単位又は２単位以上を直列に連結することに
よりなる。次に、ＲＮＡ転写物の製造においては、上記
のベクターを用いてＲＮＡ転写物を製造する。かかる場
合は、当該組み換えベクターを試験管内あるいは微生物
（細菌、酵母、カビを含む）、植物、動物等の生体中に
保持せしめてＲＮＡの転写を行う。

【００２７】なお、上記ＲＮＡ単位を単数個コードする
ベクターに関しては、プロモーターの3'の下流側の転写
開始点から開始され、目的とするＲＮＡ転写物の領域を
すぎても終了せず、目的とするＲＮＡ転写物の3'側のプ
ロセッシングリボザイムの領域をも通過し転写が続けら
れる。この時、生成したＲＮＡの5'末端及び3'端末は、
すでにリボザイムによるセルフプロセッシングにより切
断されて余分な塩基配列は付加されない。

【００２８】上記ＲＮＡ単位を複数個連結してコードす
るベクターに関しては、前記(1)のベクターと同じく、
プロモーターの3'の下流側の転写開始点から開始され、
目的のＲＮＡ転写物群の領域を過ぎても転写が続けられ
る。同時に、各目的ＲＮＡの5'末端及び3'端末のプロセ
ッシングリボザイムの作用により、余分な塩基配列が付
加されない各目的ＲＮＡが切り出される。

【００２９】なお、本発明において上記ＲＮＡ単位を連
結可能な単位数は100単位程度までであるが、好ましく
は１〜10単位程度である。以上の点を更に具体的に説明
する。例えば、図３は酵母の凝集性に関する遺伝子由来
ｍＲＮＡ（以下、SFL1ｍＲＮＡという。）を切断し得る
リボザイムを産生する本発明の組み換えプラスミドpGEN
E 8459v3の構造を表すものである。すなわち、pGENE 84
59（多比良ら、特願平1-329831及び、K.Taira et.al.,
Protein Engineering,3, 733-737(1990)) のEcoRI／Sac
I断片を取り除き、この代わりに、常法により化学合成
した新たなオリゴヌクレオチドEcoRI／SacI断片を挿入
することを示している。

【００３０】挿入する塩基配列は図３のpGENE 8459v3の
EcoRIサイトからSacIサイトに相当し、両鎖とも化学合
成した後、それぞれの5'末端をリン酸化してリガーゼを
用いて連結する。当該プラスミドは、 T7 ＲＮＡポリメ
ラーゼのためのプロモータの下流側にSFL1ｍＲＮＡの切
断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状
の触媒活性部位をコードする部分からなるリボザイムＲ
ＮＡに対応するＤＮＡ部分を有しており、更にその5'上
流側と3'下流側において転写されたＲＮＡがセルフプロ
セッシングにより切断される切断部位（Cleavage site)
と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記
セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位か
らなるリボザイムＲＮＡをコードする２つのＤＮＡ配列
を有している。

【００３１】そして、上記結合部位をコードするＤＮＡ
配列は、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてそ
の両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成す
る。当該プラスミドにおいては、転写は T7 プロモータ
の下流＋１から始まり、SFL1用のリボザイム部分、及び
その下流側の塩基配列部分が順次ＲＮＡに転写される。
そして、転写されたＲＮＡは前記した5'末端及び3'末端
の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプロ
セッシングされることにより、余分な塩基配列は得られ
るリボザイムには付加されない。

【００３２】従って、この図３の組み換えプラスミドを
鋳型として転写することにより得られるリボザイムＲＮ
Ａは図４の塩基配列を有するものとなる。このリボザイ
ムＲＮＡは5'及び3'末端側に相補の塩基配列を有し、塩
基対を形成してヘアピン構造となっており、このため生
体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安
定性を有するものである。

【００３３】また、例えば、図５及び図６は、HIV-1遺
伝子あるいは、これに由来するｍＲＮＡの5'側Long ter
minal repeat配列（以下、LTRという。）と、HIV-1のta
t遺伝子あるいは、これ由来のｍＲＮＡを切断し得るリ
ボザイムをそれぞれ産生する本発明の組み換えプラスミ
ドpV3TA-LTR-tatの構造を表すもので、以下にその構築
の概要を述べる。

【００３４】前述のpGENE8459（多比良ら、特願平1-329
831及び、K.Taira etal. Protein Engineering,3, 733-
737(1990)) のEcoR／SacI断片を取り除き、常法により
化学合成した新たなオリゴヌクレオチドEcoRI／SacI断
片を代わりに挿入した。挿入した塩基配列は図７に示
す、pV3TA-LTRのEcoRIサイトからSacIサイトに相当し、
両鎖とも化学合成した後、それぞれの5'末端をリン酸化
してリガーゼを用いて連結した。

【００３５】次に、得られたプラスミドのXhoI／SalI断
片を取り除き、常法により化学合成した２種の合成リン
カー（図９Ｂ，Ｃに塩基配列を示す。）の5'末端をリン
酸化してリガーゼを用いて連結したものを代わりに挿入
した。挿入後、リガーゼを用いて連結した。更に、得ら
れたプラスミドのSalI／HindIII 断片を取り除き、常法
により化学合成した新たなオリゴヌクレオチド（図９Ｄ
に塩基配列を示す。）を代わりに挿入し、リガーゼを用
いて連結した。こうして得られた、図７の組み換えプラ
スミドpV3TA-LTRのApaI／EcoRV 断片を取り除き、常法
により化学合成したオリゴヌクレオチドApaI／EcoRV 断
片（図９Ｅに塩基配列を示す）を代わりに挿入し、リガ
ーゼを用いて連結した。こうして得られた図８に示す、
組み換えプラスミドpV3TA-tatを鋳型に、図10に示した
２種の化学合成プライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラ
ーゼチェイン反応）法により増幅し、制限酵素KpnI及び
HindIIIで処理後、図７のpV3TA-LTRのKpnI-HindIII間に
挿入し、リガーゼを用いて連結し、図５及び図６の組み
換えプラスミドpV3TA-LTR-tatを構築した。

【００３６】当該プラスミドは T7ＲＮＡポリメラーゼ
のためのプロモーターの下流側に以下の構造体を有して
いる。すなわち、生体内での安定性を計るため3'末端部
分に少なくとも20個以上最大100個のアデニン残基より
なるポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加
したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入され
た状態（Cotten and Birnstiel,EMBO J.,8,3861-3866(1
989)）で、LTRｍＲＮＡ結合部位およびループ状の触媒
活性部位を有するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ
配列と、その5'上流側と3'下流側において転写されたＲ
ＮＡがセルフプロセッシングにより切断される切断部分
（Cleavage site）と、この切断を行うループ状の触媒
活性部位及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認
識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードする
２つのＤＮＡ配列、これらに続く形で上記構造体中のLT
RｍＲＮＡ結合部位をtatｍＲＮＡ結合部位に変更したも
のである。

【００３７】これら結合部位をコードするＤＮＡ配列も
また、切断部位直前にある１つの塩基部分を除いてその
両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する。
該プラスミドは、転写を T7プロモータの下流＋１から
始め、LTR用のリボザイム部分、その3'側セルフプロセ
ッシングリボザイム部分、tat用のリボザイム部分の5'
側セルフプロセッシングリボザイム部分に続いてtat用
のリボザイム部分およびその下流側の塩基配列部分を順
次ＲＮＡに転写していくが、転写されたＲＮＡは前記し
た４つのリボザイムによりセルフプロセッシングされる
ことにより、余分な塩基配列が付加していないLTR用お
よびtat用リボザイムに切り分けられる。

【００３８】また、例えば図11は、図８のpV3TA-tat に
T7プロモーターに対するターミネーターを付加した構造
を表すもので、以下にかかる構築の概要を述べる。前述
のpV3TA-tat のKpnI／HindIII 断片を取り除き、常法に
より化学合成したT7ターミネーター配列を含むKpnI／Hi
ndIII 断片を代わりに挿入した。このようにして、図11
に示す組み換えプラスミドpV3TA-tat-Term1 を得た。

【００３９】当該プラスミドは、前述のpGENE8459v3 や
pV3TA-LTR-tat と同様にプロセッシングリボザイムの作
用によりtat 切断用のリボザイムが切り出される。この
際、T7ターミネーターを付加することにより、tat 用リ
ボザイムの転写量がT7ターミネーターを付加しないもの
の約２倍に増加することが判明した（図17) 。すなわ
ち、特定のプロモーターにあったターミネーターを付加
することにより、リボザイムの生産量を上げることが可
能になる。

【００４０】かかる図５、図６、及び図11の組み換えプ
ラスミドを鋳型として転写することにより得られる２種
のリボザイムＲＮＡは、それぞれ図16に示す塩基配列を
有するものとなる。当該リボザイムは、t-ＲＮＡ構造を
形成するようになっており、さらに3'側には30個のアデ
ニン残基によりなる、ポリＡテイルを有している。これ
らの構造は、生体内におけるエキソヌクレアーゼによる
分解に際し、安定性を保持することが当該技術分野で知
られている。

【００４１】この図３、図５、図６、及び図11の組み換
えプラスミドは、リボザイムＲＮＡを製造するリボザイ
ムとして、SFL1切断用のリボザイム、LTR 切断用のリボ
ザイム、tat 切断用のリボザイム、プロモーターとして
T7 ＲＮＡポリメラーゼのためのターミネーター及びベ
クターとしてpUC119を用いているが、本発明は特にこれ
らの要素に限定されるものではない。

【００４２】すなわち、上記の図３の組み換えプラスミ
ドは、リボザイムＲＮＡを生産するものであるが、２種
に限らず、5'末端と3'末端とを各々、セルフプロセッシ
ングにより切断するリボザイムを有する異なるリボザイ
ムをコードするＤＮＡ断片を連結することで、所望する
種のリボザイムＲＮＡを生産させることが可能である。
また、両プロセッシングリボザイムの間のリボザイムを
全て同じものにすることにより、プラスミド当たりの同
一種のリボザイムの生産量を上げることも可能となる。
さらに、製造するＲＮＡはリボザイムに限らず、例えば
ＲＮＡウイルスのＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、種々の
ｍＲＮＡ等、広くＲＮＡ転写産物の製造に適用可能であ
る。

【００４３】用いるプロモーターも、例えばSP6 ,GAL7,
SV40,CaMV35S等、種々のものを使用することが可能であ
り、用いるターミネーターも上記プロモーターに対応す
るものを選択することが可能である。さらに本発明にお
いては、組み換えベクターは、特に環状のままであって
も、ＲＮＡを転写できるための種々の生体中においても
機能を発揮するものであって、リボザイム機能を発揮さ
せようとする生体、例えば植物、動物等の種類に応じて
適切なベクターを選択することができる。

【００４４】

【実施例】以下に、実施例により本発明を詳細に説明す
る。ただし、これらの実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。 〔実施例１〕 組み換えベクターpGENE 8459v3の構築 先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira,
K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukaw
a, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で図３
のEcoR／SacI断片を化学合成し、これを含む溶液 3.3μ
l(100pmol)を制限酵素EcoRIとSacIで前もって切断して
おいた組み換えプラスミドpGENE8459（多比良ら、特願
平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi, H., Maed
a, H., andFurukawa, K. Protein Engineering,3, 733-
737(1990)）に林等の方法（1)Hayasi,K.,Nakazawa,M.,I
shizaki,Y. and Obayashi,A.Nucleic Acids Res.,13,32
61-3271(1985), 2)Hayashi,K.,Nakazawa,M.,Ishizaki,
Y.,Hiraoka,N. and Obayashi,A.Nucleic Acids Res.,1
3,7979-7992(1985)) により連結した。

【００４５】この溶液を用いて大腸菌MV1184株を形質転
換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、
挿入された断片中のXhoＩサイトを利用してポジティブ
なクローンを選択した。また、塩基配列はＤＮＡシーク
エンサー（アプライドバイオシステムズ社製370A）を用
いて確認した。 〔実施例２〕 組み換えベクターpV3TA-LTRの構築 先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira
K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa,
K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で図８Ａ
のEcoRI／SacI断片を化学合成し、前述の林等の方法
で、制限酵素EcoRIとSacIで前もって切断しておいた図
３の組み換えプラスミドpGENE 8459v3に連結し、大腸菌
MV1184に形質転換した。コロニーを形成させた後プラス
ミドを取り出し、断片が挿入されたことによりKpnIサイ
トが消失したことを利用してポジティブなクローンを選
択した。

【００４６】得られた組み換えプラスミド0.5μgを制限
酵素XhoIとSalIで処理したものに、先に述べた方法（多
比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shins
hi,H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Enginee
ring,3, 733-737(1990)）で化学合成し、リン酸化し、
連結した図８の合成リンカー（Ｂ，Ｃ）を２μg 加え、
前述の林らの方法で連結した。これを大腸菌MV1184に形
質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出
し、断片が挿入されたことによりば BamHIサイトが消失
したことと、ApaIサイト、EcoRV サイトが生じたことを
利用してポジティブなクローンを選択した。

【００４７】さらに、こうして得られた組み換えプラス
ミド 0.5μgを制限酵素SalIとHindIII で処理し、先に
述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K.,
Oda,M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. P
rotein Engineering,3, 733-737(1990)）で化学合成し
た図９Ｄの合成リンカーを前述の林等の方法で連結し
た。これを大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成
させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたこと
によりSalIサイトが消失したことを利用してポジティブ
なクローンを選択した。この組み換えプラスミドの塩基
配列をＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステ
ムズ社製370A）を用いて確認した。 〔実施例３〕 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構
築 先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira
K., Oda, M., Shinshi,H., Maeda, H., and Furukawa,
K. Protein Engineering,3, 733-737(1990) ）で化学合
成した図８ＥのApaI／EcoRV断片を、制限酵素ApaIとEco
RVで処理した図７の組み換えベクターpV3TA-LTRに前述
の林らの方法で連結し、これを大腸菌MV1184に形質転換
し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断
片が挿入されたことをＤＮＡシークエンサー（アプライ
ドバイオシステムズ社製370A）を用いて塩基配列を確認
することによりポジティブなクローンを選択した。

【００４８】こうして得られたプラスミド（以下、pV3T
A-tat と呼ぶ）（図８）を鋳型に、図10に示した２種の
プライマーを用い、ゲルファンド（D.H.Gelfand）等の
方法（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applic
ations. Academic Press, Inc., San Diego,CA, p.129-
141(1990)）に従い、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反
応）法により増幅反応をおこなった。増幅反応は、92℃
で１分30秒、50℃で２分、72℃で４分、これを１サイク
ルとして25サイクル行った。なお、この反応はパーキン
エルマーシータスインストルメンツ社製ＤＮＡサーマル
サイクラー480を用いた。得られたＤＮＡ断片を、常法
に従いクロロホルム抽出、エタノール沈澱を行った後、
制限酵素KpnIとHindIIIで処理し、制限酵素KpnIとHindI
IIで処理した組み換えプラスミドpV3TA-LTRに連結し、
大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後、
プラスミドを取り出し断片が挿入されたことを制限酵素
EcoRIとHindIIIで切断することにより確認した。 〔実施例４〕組み換えプラスミドpV3TA-tat-term 1及び
pV3TA-tat-term２の構築 次に前記のようにして構築した組み換えプラスミドpV3T
A-tatの３^' 末端にT7ターミネーターを付加した。先に
述べた方法によりT7ターミネーター配列（METHOD IN EN
ZYMOLOGY,VOL185,p.60-89(1990))を含むKpnＩ／HindIII
リンカー2.0μgを合成し、制限酵素KpnＩ／Hind IIIで
切断しておいたpV3TA-tat0.5μgに前述の方法で連結
し、大腸菌MV1184に形質転換した。コロニーを形成させ
た後、プラスミドを取り出し、制限酵素KpnＩ／Hind II
Iで処理し、アガローズゲル電気泳動することにより、
この合成リンカーが挿入されていることを確認した。こ
のプラスミドをpV3TA-tat-term 1（図11）と称する。な
お、このプラスミドpV3TA-tat-term1 は、Escherichia
coli MV1184 に導入されて、E.coli TERM 1 として通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてお
り、その寄託番号は微工研菌寄第13143 号である。

【００４９】次に組み換えベクターpV3TA-tat-term1の
改変を行った。先に述べた方法により、図11のXho1サイ
トからApa1サイトの配列を有するXhoＩ／ApaＩリンカー
2.0μgを合成し、制限酵素XhoＩとApaＩ1 で理したpV3T
A-tat-term10.5μgに前述の方法で連結し、大腸菌MV118
4に形質転換した。コロニーを形成させた後プラスミド
を取り出し、制限酵素XhoＩとApaＩとで処理し、アガロ
ースゲル電気泳動法により、この合成リンカーがが挿入
されていることを確認した。このプラスミドをpV3TA-ta
t-term 2( 図12）と称する。なお、このプラスミドpV3T
A-tat-term 2は、Escherichia coliMV1184に導入され
て、E.coli TERM 2 として通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は微工
研菌寄第13144 号である。 〔実施例５〕組み換えプラスミドpV3TA-(tat)_n(n-1〜5,
10) 型の構築 pV3TA-tat のSmaIサイトにBglII リンカー（5'-GGGAGAT
CTCCC-3') を、KpnIサイトにBamHI リンカー（5'-CGGAT
CCGGTAC-3') を挿入した。このようにして得たプラスミ
ドを、制限酵素BglII とBamHI で処理し、tat 用リボザ
イム配列を含むBglII BamHI ＤＮＡ断片及びtat 用リボ
ザイム配列を含まないBglII BamHI ＤＮＡ断片（以下、
BglII BamHI ベクターと呼ぶ）をアガロースゲル電気泳
動により分離回収した。回収したＤＮＡ断片をT4リガー
ゼを用いて連結後、再度、制限酵素BglII と BamHIで処
理した。当該反応物をBglII-BamHIベクターに連結し、
当該ベクターを用いてE.coli MV1184 を形質転換し、コ
ロニーを形成させた後でプラスミドを取り出し、これを
制限酵素BglII と BamHIで処理することにより、tat 用
リボザイム配列を含むBglII- BamHI ＤＮＡ断片を１〜
５個、及び10個含むものを選択した。以後、この種のプ
ラスミドをpV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10) 型と呼ぶ（図13−
Ｂ）（ここでｎは、tat 用リボザイムを含むBglII-BamH
I ＤＮＡ断片が何個入ったかを意味する。例えば、1 個
ではpV3TA-(tat)₁、2 個ではpV3TA-(tat)₂。 〔実施例６〕直列連結型リボザイム発現プラスミドの構
築 pV3TA-tat を制限酵素XhoIで処理し、Klenow flagment
で平滑化したのち、制限酵素HindIII で処理し、tat 用
リボザイム配列を含むXhoI-HindIII ＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動により分離回収した。当該ＤＮＡ断
片を、pV3TA-tat を制限酵素XbaIで処理し、Klenow fla
gment で平滑化した後、制限酵素HindIII で処理したも
のに連結した。さらにこれを制限酵素XbaIで処理し、Kl
enow flagment で平滑化したのち、制限酵素HindIII で
処理し、先のＤＮＡ断片を連結した。以下、この操作を
繰り返し、T7プロモーターの下流にtat 用リボザイム配
列が直列に１個〜５個、及び10個含むものを構築した。
ただし、この構築方法では、１個あるいはそれ以上連な
ったtat 用リボザイム配列の5'端と3'端に自分自身を切
断するプロセッシングリボザイムが付加される。以下、
この種のプラスミドを直列連結型リボザイム発現プラス
ミド(n-1〜5,10) と呼ぶ（図13−Ｂ）。 〔実施例７〕リボザイムの製造 前述の方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K.,
Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K.
Protein Engineering,3, 733-737(1990)）でＲＮＡの転
写を行った。

【００５０】図14において、(A)から(D)は、鋳型ＤＮＡ
として環状のpGENE 8459v3を用いた場合を、また、(E)
から(H)は鋳型ＤＮＡとして制限酵素HindIIIにより切断
した線状pGENE 8459v3を用いた場合をそれぞれ示してい
る。転写反応時間は、(A)と(E)の場合30分；(B)と(F)の
場合１時間；(C)と(G)の場合２時間30分；(D)と(H)の場
合６時間であった。

【００５１】³²Ｐでラベル化された上記(A)〜(H)の各転
写産物は8.3％尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル
を用いて解析した。図16には約50塩基から130塩基まで
の領域を示す。図15において、(A)から(E)は、鋳型ＤＮ
Ａとして環状のpV3TA-LTR-tatを用いた場合を示してお
り、(A)は０分；(B)は30分；(C)は１時間；(D)は２時
間；(E)は４時間転写反応をさせた。

【００５２】³²Ｐでラベル化された上記(A)〜(E)の各転
写産物は8.3％尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル
を用いて解析した。図15には約50塩基から300 塩基まで
の領域を示す。更にpV3TA-tat、pV3TA-tat-term1及びpV
3TA-tat-term2を鋳型として用いたInvitroにおける転写
反応を行った。塩化セシュウム密度勾配遠心法で精製し
たプラスミドpV3TA-tat、pV3TA-tat-term1及びpV3TA-ta
t-term2の各々２μgを、40mMTris-HCl(pH7.5),6mM MgCl
₂,2mMスペルミジン、0.01％ bovine serum alubumin,0.
375mM ATP,CTP,GTP,UTP, 0.74MBq α-³²Ｐ〔CTP〕20uni
tsT7 ＲＮＡ ポリメラーゼを含む反応溶液50μl中37℃
で反応させ、０、１、３、６、12、24時間ごとに７μl
ずつ回収した。これらに0.02％ブロモフェノールブル
ー、0.02％キシレンシアノール、50mM EDTA、９M尿素を
含む水溶液を等容量加え、90℃で２分間加熱した後オー
トラジオグラフィーにかけた。なお、各々のオートラジ
オグラムの強度はフジ写真フイルム社製のバイオイメー
ジアナライザーＢＡ100により測定した。

【００５３】オートラジオグラフィーの結果を図17に示
す。(A)から(F)はpV3TA-tatを鋳型に用いた場合、(G)か
ら(L)はpV3TAtat-term1を鋳型に用いた場合、(M)から
(R)はpV3TA-tat-term2を鋳型に用いた場合の各々の結果
を示す。反応時間は(A)、(G)、(M)が０時間；(B)、
(H)、(N)が１時間；(C)、(I)、(O)が３時間；(D)、
(J)、(P)が６時間；(E)、(K)、(Q)が12時間；(F)、
(L)、(R)が24時間であった。また、これらのオートラジ
オグラムの内、tat 用リボザイムの部分の強度の相対値
（レーン(B)の値を１とした場合）をグラフ化して表し
たのが図18である。

【００５４】図18の結果より転写されたtat用リボザイ
ムの転写量はT7ターミネーターを３^' 末端に付加したpV3
TA-tat-term1では付加しないpV3TA-tatの２倍であっ
た。更にSac1サイトを除去したpV3TA-tat-term2はpV3TA
-tat-term1の約２倍、pV3TA-tatの約４倍であった。ま
た、図17の結果より、ターミネーターを３^'末端に付加
することにより高分子量域側の非特異的な転写物の生産
が抑制されており、さらにSacＩサイトを除去したこと
により、５^'端処理用のリボザイムが付加したtat用リボ
ザイム転写量が劇減していた。以上の結果をまとめる
と、pV3TA-tat-term2をリボザイムの転写、発現プラス
ミドとして用いれば、従来のリボザイム発現プラスミド
であるpV3TA-tatに比較して目的とするリボザイムの生
産量を少なくとも４倍にすることができ、さらに高分子
領域側の非特異的な転写物の生産を抑制することか可能
となり、リボザイムによるＲＮＡの生産方法の著しい進
歩をもたらしたことになる。

【００５５】図19において、(A)はpV3TA-(tat)₁、(B)は
pV3TA-(tat)₂、(C)はpV3TA-(tat)₃、(D)はpV3TA-(ta
t)₄、(E)はpV3TA-(tat)₅、(F)はpV3TA-(tat)₁₀をそれぞ
れ等量鋳型に用い、６時間転写反応させたものを、7M尿
素を含む５％ポリアクリドアミノゲル電気泳動により解
析した結果である。ここで5'CAR は、5'端にある5'端処
理用リボザイム、5'CAR+3'CAR は各tat 用リボザイムの
間に位置する5'端処理用リボザイムと3'端処理用リボザ
イムが連結したもの、5'CAR+3'CAR+tatRは、5'端処理用
リボザイムと3'端処理用リボザイムとtat 用リボザイム
が連結したものである。5'CAR 及び 5'CAR+3'CAR+tatR
は、添加した鋳型の種類に関係なく一定であるが、その
他のものは鋳型のｎ数に比例して増加した。すなわち、
tat 用リボザイムとその5'側及び3'側に位置する端処理
用リボザイムを一単位として、当該単位数に比例してta
t 用リボザイムの生産量が増加した。

【００５６】図20は、tat 用リボザイムの生産量を経時
的に調べたものである。ここで、pV3TA-(tat)₁を鋳型と
した場合の反応６時間後のtat 用リボザイム量を相対的
に示したものである。これより明らかなように、tat 用
リボザイム量は鋳型のｎ数に比例して増加しており、ｎ
=10 の場合いずれの時間においてもｎ＝１の場合のほぼ
10倍のtat 用リボザイム量が生産された。

【００５７】以上のことにより、両プロセッシングリボ
ザイムの間のリボザイムを全て同じものにすることによ
り、プラスミド当りのリボザイムの生産量を上げること
ができることが判明した。 〔実施例８〕リボザイム反応 Ａ）pGENE 8459v3を用いて製造したリボザイム反応 図16の「SFL1用リボザイム」及び線状pAM19SFL1ac(Pst
I)を鋳型として同様に転写及び電気泳動された「SFL1ｍ
ＲＮＡ」をそれぞれポリアクリルアミドゲルより切り出
し、400μlの0.3M酢酸ナトリウム／0.1mM EDTA／20mM T
ris・HCl(pH8)を含む緩衝液を用いてそれぞれのＲＮＡ
を抽出した。常法によりエタノール沈澱を行い、単離し
た基質(SFL1ｍＲＮＡ）が酵素(SFL1用リボザイム）より
過剰な条件で混合し、50mM Tris・HCl(pH8)／10mM MgCl
₂を含む緩衝液中37℃で切断反応を追った。

【００５８】図５及び図６と同じ組成のゲルで解析した
結果を図21に示す。(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の反応時
間は、それぞれ0.1、2.5、5.5、9.5時間である。時間と
共にSFL1ｍＲＮＡが図４のような複合体をリボザイムと
形成し、SFL1ｍＲＮＡが二つに切断される。図14及び図
21の結果より明らかなように、a. 環状のpGENE 8459v3
を鋳型とした場合、61塩基で構成されるSFL1用リボザイ
ムが放出された。これは5'端処理用及び3'端処理用のリ
ボザイムが効率よく作用したためである。また、5'端処
理用リボザイムとSFL1用リボザイムが連結した断片も徐
々に切断を受け二つに別れる（図14、A〜D）。b. 3'端
処理用リボザイムのすぐ下流にあるHindIIIサイトを切
断した線状pGENE 8495v3を鋳型とした場合、まず5'端処
理用リボザイム、SFL1用リボザイム、及び3'端処理用リ
ボザイムが連結された状態で産生され、徐々に切断を受
けるが、環状のpGENE 8459v3を鋳型とした場合と比べて
転写効率が悪く、また副産物も多かった（図14、E〜
H）。T7 ＲＮＡポリメラーゼを用いてSFL1遺伝子の転写
産物を作成し、その後、単離したSFL1用リボザイムと混
ぜた場合においては、SFL1用リボザイムがうまく作用す
ると76塩基のSFL1転写産物が切り出されるように結合部
位を設計したものであり（図４）、実際予想どおり76塩
基の断片が確認できた（図21) 。

【００５９】以上の結果をまとめると、5'端処理用リボ
ザイムと3'端処理用リボザイムは分子内で設計どおりに
切断反応を起こした。また、SFL1用リボザイムも設計ど
おりに分子間で切断反応を起こした。また環状ＤＮＡを
鋳型とする方が転写効率および純度の面で優れており、
またpGENE 8459v3の「SFL1用リボザイム」領域はカセッ
ト式になっており他の配列と置き換えることができるの
で、特に短いＲＮＡ転写産物を単離する場合、pGENE 84
59v3の方が従来のラン・オフ法より優れている（制限酵
素を用いて切断する手間もはぶける）ことが明らかにな
った。 Ｂ）pV3TA-tat、pV3TA-LTRおよびpV3TA-LTR-tat用いて
製造したリボザイム反応pV3TA-tat、pV3TA-LTR、pV3TA-
LTR-tatおよびT7-LTR（T7 プロモーターの下流にHIV-1
のgag遺伝子のｃＤＮＡ（転写開始点から422塩基対下流
を含む）を有するＤＮＡ断片）、T7-tat（T7 プロモー
ターの下流にHIV-1のtat遺伝子のｃＤＮＡ（翻訳開始点
から149塩基対下流を含む）を有するＤＮＡ断片）を鋳
型として同様に転写および電気泳動されたtat用リボザ
イム、LTR用リボザイム、tat用リボザイム＋LTR用リボ
ザイムおよびLTRＲＮＡ、tatＲＮＡをそれぞれポリアク
リルアミドゲルより切り出し、前述と同様にゲルからＲ
ＮＡを抽出した。エタノール沈澱後、tat用リボザイム
とtatＲＮＡ、LTR用リボザイムとLTRＲＮＡ、tat用リボ
ザイム＋LTR用リボザイムとLTRＲＮＡとtatＲＮＡをそ
れぞれ前述の条件で切断反応を行った。

【００６０】図14と同じ組成のゲルで解析した結果を図
22に示す。(A)〜(F)は、tat用リボザイムとtatＲＮＡ、
(G)〜(L)は、tat用リボザイム＋LTR用リボザイムとLTR
ＲＮＡとtatＲＮＡ、(M)〜(R)はLTR用リボザイムとLTR
ＲＮＡの切断反応の結果である。反応時間は(A)、(G)、
(M)が０時間；(B)、(H)、(N)が0.5時間、(C)、(I)、(O)
が１時間；(D)、(J)、(P)が２時間；(E)、(K)、(Q)が４
時間；(F)、(L)、(R)が６時間である。

【００６１】図15及び図22の結果より、pV3TA-LTR-tat
を鋳型とした場合、163 塩基で構成されるtat用リボザ
イムおよびLTR用リボザイムの両方が産生されているこ
とが明らかである。すなわち、pV3TA-tatより産生され
たtat用リボザイムは、tat ＲＮＡ（149塩基）を、49塩
基と100塩基のＲＮＡ断片に切断し、pv3TA-LTRより産生
されたtat用リボザイムは、LTRＲＮＡ（422塩基）を、7
0塩基と352塩基のＲＮＡ断片に切断しているが、pV3TA-
LTR-tatより産生されたリボザイムは、tatＲＮＡとLTR
ＲＮＡをそれぞれ同じパターンで切断している。

【００６２】これらのことからをまとめると、２個の5'
端 処理用リボザイムと２個の3'端処理用リボザイムは
分子内で設計通りに切断反応を起こし、２種のリボザイ
ムすなわちLTR用リボザイム、tat用リボザイムが産生さ
れた。また、産生された両リボザイムは余分な塩基配列
を含まず、さらに、それぞれの標的ＲＮＡを設計通りに
切断した。両端にシスに作用するリボザイムを有するＲ
ＮＡをコードするＤＮＡをつなげていくことで、複数種
のリボザイムのようなＲＮＡを一度に産生することが可
能である。 Ｃ）組み換えプラスミドpV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10) 型を
鋳型として用いたin vitro転写切断反応 組み換えプラスミドpV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10) 型を鋳型
として用い、これにより転写されるリボザイムによるHI
V-1tatＲＮＡの切断を、転写反応と切断反応を同時に行
う転写切断反応を用いて検討した。

【００６３】反応は、以下の条件で行った。すなわち、
40mM Tris-HCl(pH8.0),20mM MgCl₂,2mM スペルミジン,1
mM ジチオスレイトール,1mM NTP,2 units／μl ヒト胎
盤リボヌクレアーゼインヒビター,20nM tat ＲＮＡ(³²P
で放射ラベルしたもの),2nM 鋳型プラスミドの混合物を
37℃で保温し、各時間ごとに採取した。

【００６４】採取した反応物を7M尿素を含む５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により解析した結果を図23に
示す。(A)はpV3TA-(tat)₁、(B)はpV3TA-(tat)₂、(C)はp
V3TA-(tat)₃、(D)はpV3TA-(tat)₄、(E)はpV3TA-(ta
t)₅、(F)はpV3TA-(tat)₁₀を鋳型として用いたもので、
反応時間は0,1,3,6,12時間で行った。これより明らかな
ように、切断効率は鋳型のｎ数に比例して増加してい
た。また、切断効率を直列連結型リボザイム発現プラス
ミドを鋳型として用いた場合と比較したのが図24であ
る。これは、反応開始６時間後の添加したtat ＲＮＡの
切断された割合を示したものである。

【００６５】ｎ数が３個までは両方ともにほぼ同じ切断
効率を示したが、直列連結型ではそれ以上のｎ数におい
ては飽和状態に達したのに対して、pV3TA-(tat)_n(n-1〜
5,10) 型では直線的に増加していた。以上のことによ
り、pV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10)型を用いた場合のほう
が、単にリボザイムを直列に連結したものに比べて、切
断効率の点で有利であることが示された。

【００６６】

【発明の効果】本発明のリボザイムＲＮＡをコードする
ＤＮＡ断片を含むベクターは、環状のままでも制限酵素
を用いることなく5'末端及び3'末端側において余分な塩
基配列が付加されていないＲＮＡ転写物を製造すること
が可能なものであり、従来のように制限酵素を用いる場
合に比べて簡便な操作でＲＮＡ転写物の製造を行うこと
ができるほか、試験管内のみでなく、生体内においても
該組み換えベクターを保持増殖せしめながら、ＲＮＡ転
写物の産生を図ることができる。特に、3'末端にターミ
ネーターを付加することにより、本発明のベクターは、
それらを含まないリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ
断片を含むベクターに比して転写効率が飛躍的に高める
ことが可能になる。

【００６７】また、本発明のリボザイムＲＮＡをコード
するＤＮＡ断片を複数個連結させたものを含むベクター
は、5'末端及び3'末端側において余分な塩基配列が付加
されていない複数種のＲＮＡ転写物を一度に製造するこ
とが可能なものであり、また、同一のＲＮＡ転写物の生
産性を向上させることが可能となる。この場合も、試験
管内のみでなく、生体内においても該組み換えベクター
を保持増殖せしめながら、ＲＮＡ転写物の産生を図るこ
とができる。

【００６８】これらのことは、例えば、余分な塩基配列
を付加されていないリボザイムＲＮＡあるいはアンチセ
ンスＲＮＡを生体内で一度に多種製造することが可能で
あることを意味し、特にこれらを塩基配列が変化しやす
い、例えば前述のHIV-1に効果的に作用させることが可
能となる。さらに、一度に多種のＲＮＡに、リボザイム
ＲＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡを作用させることも
可能となる。

【００６９】本発明のベクターは、医薬、動物薬、農薬
或いは試薬等、又はそれらの製造に有効に利用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ハセロフ（J.Haseloff）等が示した短鎖人工
リボザイムの構造を示す図である。

【図２】 従来の転写手段であるラン・オフ法を示す模
式図である。

【図３】 組み換えプラスミドpGENE 8459v3の構造を示
す図である。

【図４】 SFL1用リボザイムの塩基配列とその5'端およ
び3'端におけるステム構造、さらにSFL1ｍＲＮＡとの複
合体を示す図である。

【図５】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を
示す図である。

【図６】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を
示す図である。

【図７】 組み換えプラスミドpV3TA-LTRの構造を示す
図である。

【図８】 組み換えプラスミドpV3TA-tatの構造を示す
図である。

【図９】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR、pV3TA-tatの
構築に用いた合成リンカ−の塩基配列を示す図である。

【図10】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構築に
用いたＰＣＲ反応用の合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーの塩基配列を示す。

【図11】 組み換えプラスミドpV3TA-tat-term１の構造
を示す図である。

【図12】 組み換えプラスミドpV3TA-tat-term２の構造
を示す図である。

【図13】 pV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10) 型プラスミドの概
念図である。

【図14】 環状および線状のpGENE 8459v3を鋳型として
転写して得られた各種転写産物の電気泳動図である。

【図15】 pV3TA-LTR-tatを鋳型として転写して得られ
た各種転写産物の電気泳動図である。

【図16】 LTR用及びtat用リボザイムの塩基配列とその
ｔＲＮＡ構造およびポリＡテイル構造を示す図である。

【図17】 pV3TA-tat, pV3TA-tat-term１及び pV3TA-ta
t-term２を鋳型として転写して得られたそれぞれの転写
産物の電気泳動図である。

【図18】 pV3TA-tat, pV3TA-tat-term１及び pV3TA-ta
t-term２を鋳型として転写して得られた転写産物-tatリ
ボザイムＲＮＡの、pV3TA-tat で転写された生産物を１
とした場合の転写効率の反応時間に対する変化を示した
図である。

【図19】 pV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10) 型プラスミドをそ
れぞれ等量鋳型に用い、転写反応させたものの電気泳動
図である。

【図20】 pV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10) 型プラスミドをそ
れぞれ鋳型として転写して得られた転写産物-tatリボザ
イムＲＮＡの、pV3TA-tat で転写された生産物を１とし
た場合の転写効率の反応時間に対する変化を示した図で
ある。

【図21】 SFL1用リボザイムによるSFL1-ｍＲＮＡの切
断を示す電気泳動図である。

【図22】 LTR用リボザイム及びtat用リボザイムによる
LTRＲＮＡおよびtatＲＮＡの切断を示す電気泳動図であ
る。

【図23】 プラスミドpV3TA-(tat)_n(n-1〜5,10) 型を鋳
型として用いたin vitro転写切断反応の結果物の電気泳
動図である。

【図24】 切断効率を連結するリボザイムの単位数との
関連において検討を行った図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/10 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 大川 淳 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号 長 瀬産業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 岡部 宗一 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号 長 瀬産業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 嶋山 隆 東京都新宿区西新宿２丁目１番１号 日立 化成工業株式会社内 (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業株 式会社筑波開発研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、
   セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々
   切断するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当
   該ＲＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコー
   ドするＤＮＡ配列を含むベクター。
2. 【請求項２】 請求項１に記載したＲＮＡ単位を、１乃
   至10単位連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む
   ベクター。
3. 【請求項３】 請求項１に記載したＲＮＡ単位をｎ個
   （ｎは１以上の整数）連結したＲＮＡをコードするＤＮ
   Ａ配列を含むベクターにおいて、5'末端側から１番目の
   上記ＲＮＡ単位の5'末端の近傍にプロモーターが付加さ
   れており、かつ当該プロモーターに対応するターミネー
   ターが、5'末端側からｎ番目の上記ＲＮＡ単位の3'末端
   の近傍に付加されていることを特徴とする、ＲＮＡをコ
   ードするＤＮＡ配列を含むベクター。
4. 【請求項４】 請求項１乃至請求項３に記載されたベク
   ターを鋳型として、当該ベクターＤＮＡをＲＮＡに転写
   することを特徴とする、5'末端側と3'末端側がセルフプ
   ロセッシングされたＲＮＡ転写物の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項１乃至請求項３に記載されたベク
   ターにより形質転換された、微生物、又は動物細胞若し
   くは植物細胞。