DE60209380T2

DE60209380T2 - Kaffeepflanze mit verringerter alpha-d-galaktosidase-aktivität

Info

Publication number: DE60209380T2
Application number: DE60209380T
Authority: DE
Inventors: Pierre Res Vale das Araucarias 86047-670 Londrina MARRACCINI; Alain Deshayes; John William Rogers
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2001-10-10
Filing date: 2002-08-15
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2022-08-16
Also published as: US7238858B2; CN1635895A; WO2003032713A2; JP4276945B2; ATE318319T1; RU2303349C2; MY129821A; WO2003032713A3; ZA200403452B; DE60209380D1; EP1436402B1; EP1436402A2; JP2005505290A; ES2258173T3; CA2457821A1; AU2002333434B2; BR0213180A; US20040199943A1; OA12667A; CO5580845A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Modifikation von Galactomannanen, die in der grünen Kaffeebohne vorhanden sind, indem man den endogenen Grad an α-D-Galactosidaseaktivität dadurch vermindert, dass man in eine Kaffeepflanzenzelle ein Konstrukt einführt, das eine Nucleinsäure enthält, die in eine Antisense-Kopie der mRNA transkribiert wird, für die das α-D-Galactosidasegen codiert, oder einen Teil davon.
Bei Kaffeebohnen machen Zellwandpolysaccharide etwa 48% des Trockengewichts der reifen Kaffeebohne aus, und von diesen bilden Mannane etwa die Hälfte. Diese Polysaccharide sind in gereinigter Form im wesentlichen unlöslich und weisen eine sehr geringe Galactoseverzweigung auf (Bradbury and Haliday, J. agric. Food Chem. 38 (1990), 389-392). Es ist anerkannt, dass Mannanpolymere der Hauptgrund für die großen Verluste beim Gewicht des ursprünglichen Bohnenkaffees sind, die während der Herstellung von löslichen Kaffeedrinks beobachtet werden. Die Verluste treten entweder auf, wenn unlösliches Material während der ursprünglichen Extraktion als Sedimente zurückbleibt, oder wenn sich während der Lagerung von Kaffeeflüssigkeiten Niederschläge und Gele bilden. Es wurde ferner gezeigt, dass Mannane den Hauptbestandteil bilden, der für das Trübwerden und für Niederschläge beim Stehenlassen von Kaffeegetränken verantwortlich ist.
In einigen Pflanzen wurde festgestellt, dass der Grad der Galactoseverzweigung der Mannanketten teilweise von der Aktivität der α-D-Galactosidase (EC 3.2.1.22) abhängt. Dieses Enzym ist in der Lage, α-1,6-verknüpfte Galactoseeinheiten von Galactomannanen freizusetzen, die in Pflanzensamen-Speichergewebe bei der Reifung gespeichert werden (Buckeridge und Dietrich, Plant Sci. 117 (1996), 33-43). Ferner wurde gezeigt, dass auch die Akkumulation von Galactomannanen mit einem sehr niedrigen Galactose/Mannose-Ver hältnis in einigen Pflanzen-Endosperm- oder Keimblattgeweben mit einem Maximum an α-D-Galactosidaseaktivität während der Reifung dieser Gewebe und mit deren Härtung und Trocknung korreliert sind (Kontos und Spyropoulos, Plant Physiol, Biochem. 34 (1996), 787-792).
Die α-D-Galactosidaseaktivität wurde auch mit der Fähigkeit in Verbindungs gebracht, Galactosidasereste zu entfernen, die an Galactomannan-Polysaccharide α-1,6 gebunden sind, was eine verminderte Löslichkeit der Polymeren zur Folge hat (McCleary, Carb. Res. 92 (1981), 269-285). Außerdem scheint die Entfernung von Galactose-Seitenketten von Galactomannanen deren Fähigkeit zu erhöhen, mit anderen Polysacchariden zu wechselwirken, z.B. mit Xanthanen in Guar, was von einer Bildung eines komplexen Gels begleitet ist. Die Galactoseverzweigung an Kaffeekörnermannanen vermindert sich von etwa 40% in jungen Körnern während der Reifung bis auf das niedrige Niveau, das in den reifen Körnern gefunden wird. Gleichzeitig nimmt die α-D-Galactosidase-Enzymaktivität während der Reifung der Kaffeekörner zu.
Die cDNA von α-D-Galactosidase wurde kloniert (Zhu und Goldstein, Gene 140 (1994), 227-231). Aufgrund der Information, die man aus der reifen Kaffeebohnen-α-D-Galactosidase gewonnen hat, wird angenommen, dass sie aus 363 Aminosäuren besteht und als ein Präproenzym aus 420 Resten synthetisiert wird. Im Anschluss an die Biosynthese entfernen dann zwei Proteasespaltungen ein Sekretationssignal (38 Reste) sowie ein weiteres Signalpeptid (19 Reste), wobei das Protein erzeugt wird, das die N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, die für das aktive Enzym charakteristisch ist.
Angesichts der bekannten Effekte von Galactomannanen auf die Herstellung und/oder Lagerfähigkeit von löslichem Kaffee bestand auf dem Fachgebiet ein Bedarf, diese Situation zu verbessern.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von löslichem Kaffee zu schaffen, bei dem man gleichzeitig die bekannten Nachteile bei einer Lagerung von Kaffeeflüssigkeiten vermeidet. Das obige Problem wurde dadurch gelöst, dass man eine Kaffeepflanzenzelle bzw. eine Kaffeepflanze bereitstellt, bei der die Galactoseverzweigung an den Galactomannanen erhöht ist.
Diese Aufgabe wird dadurch erreicht, dass man den endogenen Grad der α-D-Galactosidaseaktivität vermindert, indem man in eine Kaffeepflanzenzelle ein Konstrukt einführt, das eine Nucleinsäure enthält, die zu einer Antisense-Kopie der mRNA transkribiert wird, für die das α-D-Galactosidasegen codiert, oder in einen Teil davon.
Zu diesem Zweck kann die Antisense-Kopie der mRNA, für die das α-D-Galactosidasegen codiert, irgendeine Ribonucleinsäure sein, die in der Lage ist, unter physiologischen Bedingungen Dimere zu bilden, d.h. mit der mRNA zu hybridisieren, für die das α-D-Galactosidasegen codiert, und zwar unter den Bedingungen, die in der Zelle herrschen. Somit muss die Antisense-Kopie kein 100-%iges Homologes ihres entsprechenden Gegenstücks sein, sondern muss nur eine ausreichende Bindung zur Bildung eines Dimers zeigen. Folglich liegen Antisense-Kopien (sowie die entsprechenden Nucleinsäuren, von denen sie transkribiert werden), die durch Substitution, Deletion und/oder Insertion von Nucleotiden modifiziert sind, im Bereich der vorliegenden Erfindung. Diesbezüglich versteht es sich ferner, dass die Antisense-Kopie ein volles Gegenstück zu der mRNA sein kann, für die das α-D-Galactosidasegen codiert, d.h. sie kann ein RNA-Molekül darstellen, das im wesentlichen die gleiche Länge wie die mRNA aufweist, die für das α-D-Galactosidase-Polypeptid codiert. Andererseits kann die Antisense-Kopie nur einen Teil der mRNA überdecken, die für das α-D-Galactosidase-Polypeptid codiert.
Die Nucleinsäure, die für eine Ribonucleinsäure codiert, die antisense zu der mRNA ist, für die das α-D-Galactosidasegen codiert, oder zu einem Teil davon, kann unter der Kontrolle eines konstitutiven oder eines induzierbaren Promotors stehen, so dass das Niveau der Antisense-RNA ein fach gesteuert werden kann. In allen Fällen sollte das Niveau der Antisense-Kopie jedoch ausreichend hoch sein, so dass die Zahl an mRNA-Kopien, die für das α-D-Galactosidase-Polypeptid codieren und die für die Ribosomen zugänglich sind, vermindert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der verwendete Promotor der Kaffee-csp1-Promotor, der einen ausreichend hohen Transkriptionsgrad ergibt.
Die vorliegende Erfindung stellt daher eine transgene Kaffeepflanze bereit, in der der Grad der α-D-Galactosidaseaktivität vermindert wurde, so dass letztlich die Galactoseverzweigung an den Galactomannanen erhöht ist. Die Pflanze ist eine transgene Pflanze, deren Zellen ein Konstrukt beherbergen, das in der Lage ist, eine Antisense-Kopie der mRNA zu erzeugen, die sich von dem α-D-Galactosidasegen ableitet, oder eines Teils davon.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von löslichem Kaffee bereit, das die Stufe der Verwendung von Kaffeebohnen umfasst, die von einer transgenen Kaffeepflanze stammen, die eine verminderte α-D-Galactosidaseaktivität aufweist. Diesbezüglich liefert die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Erhöhung der Löslichkeit von Kaffee durch Erhöhung der Galactoseverzweigung.
Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, die Löslichkeit von Kaffee-Galactomannanen dadurch zu erhöhen, dass man ihre Galactoseverzweigung erhöht. Die angewandte Strategie besteht darin, das endogene Niveau an α-D-Galactosidaseaktivität zu vermindern, indem man eine Antisense-Kopie ihrer cDNA unter der Kontrolle eines Kaffee-csp1-Promotors einführt.
Dieser csp1-Promotor wurde bereits charakterisiert (Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem. 37 (1999), 273-282) und kontrolliert die Expression eines Gens, das für das Kaffee 11S-Speicherprotein codiert. Eine Kassette, die den Promotor enthält, wurde konstruiert und in den T-DNA-Abschnitt eines binären Transformationsvektors eingeführt, der sich von dem pTiT37-Plasmid ableitet (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). Dieser rekombinante Vektor wurde in Agrobacterium tumefaciens eingeführt, das dazu verwendet wurde, Kaffeepflanzen zu transformieren. Kaffeepflanzen, die in ihrem Genom als Insert die T-DNA beherbergten, wurden regeneriert und auf die α-D-Galactosidaseaktivität in ihren Körnern analysiert.
I Analyse der α-D-Galactosidaseaktivität in Kaffeekörnern während der Reifung
Früchte wurden zu unterschiedlichen Reifungsstufen geerntet (das Alter wird ausgedrückt als Wochen nach der Blüte: WAF), und zwar von Coffea arabica, Varietät Caturra T2308, die in einem Gewächshaus gezüchtet wurde (Temperatur von etwa 25°C, 70% Feuchtigkeit und natürliche Beleuchtung). Die Kaffeekirschen wurden im Anschluss an die Ernte in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu ihrer Verwendung bei –85 °C gelagert. Für Reifungsstudien wurden Endosperm- und Perisperm-Gewebe getrennt.
Pflanzenmaterial wurde in flüssigem Stickstoff zerkleinert und in einem eiskalten Enzymextraktionspuffer extrahiert (Glycerin 10% v/v, Natriummetabisulfit 10 mM, EDTA 5 mM, MOPS (NaOH) 40 mM, pH 6,5), bei einem ungefähren Verhältnis von 20 mg pro 100 μl. Die Mischung wurde auf Eis 20 min gerührt, zentrifugiert (12.000 g × 30 min), in Teilmengen aufgeteilt und bei –85 °C bis zur Verwendung gelagert. α-D-Galactosidaseaktivität wurde spektrophotometrisch mit dem Substrat p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid (pNGP) nachgewiesen.
Die Reaktionsmischung enthielt 200 μl pNGP, 100 mM in McIlvain's Puffer (Citronensäure 100 mM - Na₂HPO₄, 200 mM, pH 6,5) bis zu einem Endvolumen von 1 ml mit Enzymextrakt. Man hielt die Reaktion auf 26 °C und startete sie mit der Zugabe an Enzym und stoppte sie durch 4 Volumina Stopplösung ab (Na₂CO₃-NaHCO₃ 100 mM, pH 10,2). Die Absorption wird bei 405 nm bestimmt. Die Entwicklung von Nitrophenyl wird unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten ϵ = 18300 (spezifisch für pH 10,2) errechnet und in mmol min^–1 mg Protein^–1 umgerechnet. Gesamtprotein wurde in den in wässrigen Puffern extrahierten Proben nach dem Verfahren von Bradford gemessen (Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254). Zur Bestimmung der Aktivität wurde jede Probe extrahiert und in Teilmengen aufgeteilt, und die Tests wurden dreifach durchgeführt, wobei die Ergebnisse als Mittelwerte angegeben werden.
α-D-Glactosidaseaktivität ist in den Stadien des jungen Korns extrem niedrig oder nicht feststellbar, und erreicht ein Maximum, das mit einer Rotverfärbung des Pericarps zusammenfällt. In späteren Stufen nimmt die Aktivität ab, während die Kirschen weiterhin rot sind. Die Aktivitäten werden auch in unterschiedlichen Geweben der Kaffeepflanze verglichen. Die Aktivität im Perisperm, den Wurzeln und Blättern ist besonders niedrig, und liegt nahe an den Nachweisgrenzen. Hohe Aktivitäten wurden jedoch im Endosperm festgestellt, wo die Aktivität ein Maximum bei etwa 36 WAF erreicht, jedoch auch im keimenden Korn im Anschluss an ein Einweichen in Wasser.
II Isolierung von α-Galctosidase-cDNA voller Länge aus C. arabica
Obwohl verschiedene Kaffee-α-D-Galactosidase-cDNA-Sequenzen in der Literatur zugänglich sind, wird die Quelle des Kaffeematerials nicht angegeben. Um festzustellen, ob zwischen C. arabica und C. canephora Aminosäure- und Nucleinsäure-Sequenzunterschiede beobachtbar sind, wurde beschlossen, α-D-Galactosidase-cDNAs von beiden Spezies zu klonieren.
Eine cDNA-Bibliothek von Coffea arabica var. Caturra T2308 wurde gemäß Rogers et al. (Plant Physiol. Biochem., 37 (1999), 261-272) mit PolyA+ mRNA konstruiert, die 30 Wochen nach der Blüte extrahiert wurde. Diese Plasmid-cDNA-Bibliothek (10 ng) wurde mittels PCR untersucht, wobei man die Primer BETA1 (SEQ ID NO:2) und BETA3 (SEQ ID NO:3) verwende te, die direkt von der Kaffee-α-D-Galactosidase-cDNA-Sequenz abgeleitet wurden (Zhu und Goldstein, 1994). Der BETA1-Primer findet sich zwischen den Nucleotiden 177 und 193 in der Sequenz SEQ ID NO: 1. Der BETA3-Primer findet sich zwischen den Nucleotiden 1297 und 1313 in der Sequenz SEQ ID NO: 1. Die PCR-Reaktion wurde mit Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, USA) durchgeführt in einem geeigneten 1 × Puffer, 0,2 mM einer jeden dNTP und 0,25 μM von jedem Oligonucleotid. Die Denaturierungs-, Renaturierungs- und Kettenverlängerungstemperaturen betrugen 94 °C für 30 s, 46 °C für 30 s bzw. 72 °C für 3 min. Dieser Zyklus wurde im Robocycler Statagene (USW) 30 mal wiederholt. PCR-Produkte wurden mit einer Microcon 100 (Millipore SA, BP307 Saint Quentin Yvelines cedex 78054, Frankreich)-Patrone gereinigt und, wie von Stratagene (USA) beschrieben wird, in den pCR-Script SK (+) ligiert. Die Ligationsmischung wurde dann dazu verwendet, den E.coli-Stamm XL1-Blue MRF' zu transformieren, und ein rekombinanter Vektor, der das α-D-Galactosidase-Fragment enthielt, wurde gereinigt und in den SfrI-Ort des pCR-Script SK Amp (+) kloniert. Seine Sequenz ist zwischen den Positionen 177 und 1313 der Sequenz SEQ ID NO: 1 angeordnet.
Gemäß der Literatur enthält das 5'-Ende der α-D-Galactosidase-cDNA stromauf des 5'-Endes des BETA 1-Primers 198 Phasenpaare. Um diese Sequenz aus unserem Genotyp zu klonieren, führten wir eine zusätzliche PCR durch, wie sie oben beschrieben wurde, mit den Primern BETA100 (SEQ ID NO: 3) und BETA101 (SEQ ID NO: 4). Diese C. arabica-Sequenz wurde in den pCR Script Amp SK (+)-Vektor kloniert und lieferte pLP1 und entspricht SEQ ID NO: 1.
Die erhaltene cDNA enthält ein offenes Leseraster von 1263 bp, beginnend in Position 51 und endend in Position 1313 der Sequenz SEQ ID NO: 1. Das Translationsprodukt entspricht Sequenz ID NO: 2, was nahelegt, dass die Kaffee-α-D-Galactosidase als ein Präproenzym synthetisiert wird, wobei der Translations-Startcodon ATG in Position 51 anstelle von ATG in Position 126 verwendet wird. Andererseits zeigte die Analyse der α-D-Galactosidase-cDNA, die aus C. canephora kloniert wurde, dass ihr Tanslationsprodukt dem Protein, das in C. arabica gefunden wird, sehr homolog (Ähnlichkeit > 99%) ist.
III Expression des α-D-Galactosidasegens während der Kornreifung
Die Expression des Gens, das in Kaffeebohnen von C. arabica Caturra für die α-Galactosidase codiert, die auf unterschiedlichen Entwicklungsstufen, d.h. 9, 12, 16, 30 und 35 Wochen nach der Blüte (WAF), geerntet wurden, wurde überwacht. Zu diesem Zwecke wurden 10 μg der Gesamt-RNAs dieser Kaffeebohnen 15 min bei 65 °C in 1 × MOPS-Puffer (20 mM MOPS, 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 7) in der Gegenwart von Formamid (50%) und Formaldehyd (0,66 M Endkonzentrat) denaturiert. Sie wurden dann durch Elektrophorese 6 Stunden bei 2,5 V/cm in Gegenwart von 1 × MOPS-Puffer auf einem 1,2-Agarosegel, das 2,2 M-Formaldehyd als Endkonzentration enthielt, aufgetrennt.
Nach der Wanderung wurden die RNAs mit Ethidiumbromid (BET) gemäß Sambrook et al. angefärbt (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, Kapitel 9.31 bis 9.51). Das ermöglicht es, die auf einem Gel abgeschiedenen Mengen anhand der Fluoreszenzintesitäten der 18S und 255 ribosomalen RNAs zu standardisieren. Die Gesamt-RNAs wurden dann übertragen und gemäß den Empfehlungen von Boehringer Mannheim (Roche-Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, Postfach 310120, Mannheim 31, DE) auf eine positiv geladene Nylon-Membran übertragen und fixiert. Die Vorhybridisierung und die Hybridisierung wurden entsprechend den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Ergebnisse des Northern-Blottings zeigen ein Maximum der Genexpression während der Frühphase der Endospermentwicklung. Das Maximum einer spezifischen mRNA-Expression unter Gewächshausbedingungen erfolgte bei etwa 26 WAF und entspricht dem Beginn der Zunahme der Enzymaktivität. Die Maximumsperiode der mRNA-Expression entspricht der Hauptperiode der Endosperm-Expansion, und unter diesen Bedingungen erfolgt eine Härtung der reifenden Körner. Die Maximumsexpression für α-Galactosidase-spezifische mRNA fiel entweder zusammen mit der oder erfolgte geringfügig später als die Maximumsexpression der 11S-Körnerspeicherprotein-mRNA. Diese Ergebnisse führten zur Konstruktion einer Antisense-Kassette der Kaffee-cDNA, die für die α-Galactosidase codierte, unter der Kontrolle des 11S-Kaffeepromotors, um den Grad der α-Galactosidaseaktivität in Kaffeebohnen bei der Reifung zu vermindern.
IV. Konstruktion der α-Galactosidase-Antisensekassette
Die 11s-Promotor-Sequenz (Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem. 37 (1999), 273-282) aus Kaffee wird mit den spezifischen Primern UP210-1 entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 7, und BAGUS2, entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 8, vervielfältigt. Das Oligonucleotid UP210-1 entspricht der Sequenz zwischen den Nucleotiden 24 und 76, veröffentlicht von Marraccini et al., supra und enthält in seinem 5'-Ende die synthetische Sequenz CGGGGTACCCCG, die eine KpnI-Restriktionsstelle enthält und der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht. Der BAGUS2-Primer enthält in seinem 5'-Ende die synthetische Sequenz CGCGGATCCGCG, die der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht, die eine BamHI-Restriktionsstelle trägt. Dieser Primer enthält auch die Nucleotide 998 bis 976 der Sequenz, die von Marraccini et al. (1999) publiziert wurde. Diese Reaktion wird in Gegenwart von Pfu-DNA Polymerase (3 Einheiten) durchgeführt, mit 10 ng pCSPP4 (WO 99/02688), in einem Endvolumen von 50 μl, das 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 01% Triton X-100, 2 mM MgCl₂, 10 μg/ml BSA, 0,2 mM einer jeden dNTP, 0,25 μM eines jeden der obigen Oligonucleotide enthielt. Die Reaktionsmischung wurde dann für 30 Zyklen inkubiert (94°C-60s, 55°C-60s, 72°C-3 min), gefolgt von einem abschließenden Verlängerungszyklus bei 72 °C für 7 min.
Das PCR-Fragment aus etwa 950 bp wurde mit einer Microcon 100-Kassette (Millipore, Frankreich) gereinigt und in den pCR-Script Amp SK (+)-Vektor in Gegenwart von T4 DNA-Ligase (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin 53711 USA) gemäß den von dem Lieferanten gestellten Empfehlungen ligiert. Als nächstes wurde der E. coli Stamm XL1-Blue MRF' mit der gesamten Ligationsmischung transformiert. Es wurde ein Transformant ausgewählt, und sein Plasmid wurde gereinigt, um den Insert zu sequenzieren, um die Orientierung des PCR-Fragments zu bestimmen. Die Analyse machte es so möglich, das Plasmid pLP7 zu selektieren.
Eine kürzere Version des 11S-Promotors wurde ebenfalls gemäß dem gleichen Ansatz vervielfältigt, außer dass der Primer UP213-1 mit der Nucleinsäure SEQ ID NO: 11 den Primer UP210-1 ersetzte. Dieser Primer entspricht der Sequenz zwischen den Nucleotiden 754 und 777, veröffentlicht von Marraccini et al., supra, und enthält in seinem 5'-Ende die synthetische Sequenz SEQ ID NO: 9. Das führte zur Vervielfältigung eines 250 bp-Fragments des p11S-Kaffee-Promotors, der wie oben beschrieben kloniert wurde und das Plasmid pLP8 lieferte.
Der TNOS-Terminator wird vervielfältigt, indem man dem oben für die Vervielfältigung des p11S-Promotors beschriebenen Protokoll folgte, außer dass die Primer TNOS1 mit der Nucleinsäuresquenz SEQ ID NO: 12 und TNOS2 mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 13 verwendet wurden. TNOS1 enthält die Sequenz SEQ ID NO: 10 in seinem 5'-Ende. TNOS2 enthält die Sequenz SEQ ID NO: 9 in seiner 5'-Endsequenz. Diese Primer führten zur Vervielfältigung der TNOS-Sequenz aus dem kommerziellen p35SGFP-Vektor (Clontech Laboratories Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, California 94303-4230 USA). Das PCR-Produkt wurde in den pCR-Script Amp SK (+)-Vektor, wie oben beschrieben, kloniert, was zu dem rekombinanten Vektor führte, der pLP32 genannt wurde, und wurde zur Bestimmung seiner Orientierung sequenziert. Dieser Vektor wurde dann mit BamHI verdaut, um die TNOS-Sequenz zu entfernen, die danach mit der T4-DNA-Polymerase behandelt wurde, um glatte Enden zu erzeugen.
Andererseits wurden die pLP7 und pLP8-Vektoren mit EcoRI linearisiert und ebenfalls mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen. Der TNOS-Terminator wurde dann in der korrekten Orientierung in die pLP7 und pLP8-Vektoren kloniert, was zu den Vektoren p11STNOS7 bzw. p11STNOS7+ führte.
Die α-Galactosidase-cDNA wurde aus dem vorher isolierten Vektor pLP1 vervielfältigt, wobei man die obigen Bedingungen anwandte, außer dass die Primer BETA100B1 mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 14 und BETA101B1 mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 15 verwendet wurden. Diese Oligonucleotide entsprechen den vorher verwendeten BETA101 und BETA100-Primern, bei denen eine BamHI-Restriktionsstelle, die der Sequenz SEQ ID NO: 10 entsprach, in ihre 5'-Enden eingeführt wurde. Das PCR-Produkt wurde in den pCR-Script Amp SK(+)-Vektor, wie oben beschrieben, kloniert, was zu dem rekombinanten Vektor führte, der pLP20 genannt wurde.
Dieses Plasmid wurde mit BamH1 verdaut, um die α-Galactosidase-cDNA freizusetzen. Andererseits wurden die Aufnahmevektoren p11STNOS7 und p11STNOS7+ unabhängig voneinander mit Hilfe des gleichen Restriktionsenzyms verdaut und durch eine CIAP-Behandlung gemäß dem Lieferanten (Promega, USA) dephosphoryliert. Die α-Galactosidase-cDNA wurde in der Antisense-Orientierung kloniert, und zwar in den p11STNOS7 bzw. p11STNOS7+-Vektoren, was zu den Vektoren führte, die als pALPHA1 und pALPHA9 bezeichnet wurden.
Um diese Kassetten in den binären Vektor zu mobilisieren, der während der Transformation einer Kaffeezellsuspension verwendet wurde, wurde eine abschließende PCR-Reaktion mit der Pfu-DNA-Polymerase durchgeführt, wobei man die Primer UPSAL1 mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 16 und UPSAL2 mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 17 verwendete. Beide Oligonucleotide enthalten eine SalI-Restriktionsstelle und erkennen DNA-Sequenzen des pCR-Script Amp SK(+)-Vektors, die die 11S-Promotoren- und die NOS-Terminator (TNOS)DNA-Abschnitte flankieren. Außerdem fehlt diese Restriktionsstelle bei der Sequenz, die in die T-DNA des binären Plasmids eingeführt werden sollte. Diese PCR-Produkte wurden wiederum in den pCR-Script Amp SK(+)Vektor kloniert, der mit SalI verdaut wurde, um die Bestätigung zu erhalten, dass diese Restriktionsstelle die Kassetten flankiert. Die erhaltenen Plasmide wurden pALP414 und pALP50 genannt und leiten sich von pALPHA1 bzw. pALPHA9 ab.
V. Klonieren der α-Galactosidase-Antisense-Kassette in den binären Transformationsvektor
Die α-Galactosidase-Kassetten, die in den Vektoren pALP414 und pALP50 enthalten waren, wurden sequenziert, um eine Bestätigung für ihre Integrität zu erhalten, insbesondere um zu bestätigen, dass während der PCR-Vervielfältigungszyklen keine Punktmutationen oder Umlagerungen aufgetreten waren. Diese Kassetten wurden dann durch Verdauung der pALP414 und pALP50-Vektoren mit dem SalI-Restriktionsenzym gereinigt und unabhängig in das pBin19-Derivatplasmid kloniert, das mit dem Vektor verwandt ist, der von Leroy et al. (Plant Cell Rep. 19 (1999), 382-389) beschrieben wird, außer dass das Gen crylAc fehlte. Um das zu tun, wurde der Vektor mit dem SalI-Restriktionsenzym verdaut, das eine einzigartige Stelle zwischen den uidA- und csr1-1-Genen erkennt, und dephosphoryliert. Nach dieser Ligation wurden die Vektoren pBIA121, pBIA126 und pBIA9 selektiert. In dem pBIA121-Vektor ist die aus pALP414 erhaltene SalI-Kassette in der Orientierung [LB]Gus-Intron > p11S (lange) Antisense-α-Galactosidase-cDNA > csr1-1 [RB] kloniert. Die gleiche Kassette ist jedoch in dem pBIA126-Vektor in der umgekehrten Orientierung kloniert. Andererseits weist die SalI-Kassette, die aus pALP50 erhalten wurde und in dem pBIA9-Vektor kloniert wurde, die folgende Orientierung auf: [LB]Gus-Intron > p11 (kurze) Antisense-α-Galactosidase-cDNA > csr1-1 [RB].
VI Transformation of Agrobacterium tumefaciens
Die binären Transformationsvektoren pBIA121, pBIA126 und pBIA9, die oben beschrieben wurden, wurden unabhängig voneinander nach dem direkten Transformationsverfahren, das von An et al. (Plant Mol. Biol. Manuel, Gelvin, Schilperoort und Verma Eds, Kluwer Academic Publishers Dordrecht, Netherlands, A3 (1993, 1-19) beschrieben wurde, in den abgerüsteten Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 eingeführt. Für jede Transformation wurden die rekombinanten Agrobacterium tumefaciens-Klone an LB-Medium, das mit Kanamycin (50 μg/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und Rifampicin (50 μg/ml) ergänzt war, selektiert.
Um die Struktur der Plasmide zu prüfen, die in Agrobacterium tumefaciens eingeführt wurden, wurden sie gemäß der Schnell-Minipräparationstechnik extrahiert und dann durch Restriktionsmapping nach einer Reverse-Transformation im E. coli-Stamm XL2Blue MRF' analysiert.
VII Transformation von Coffea sp.
Blatt-Explantate wurden jeweils fünf Wochen für 3 bis 5 Monate kultiviert und subkultiviert, bis an der Kante der Explantate somatische Embryos erschienen. Somatische Embryos wurden in der Torpedeo-Stufe geerntet, mit einem sterilen Skalpell verletzt und zwei Stunden in einer 0,09%-igen NaCl-Lösung eingeweicht, die den rekombinanten Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 bei einer OD₆₀₀ _nm von 0,3 bis 0,5 enthielt. Die Cokultur wurde in der Dunkelheit auf einem halbfesten MS-Medium ohne Hormone für drei Tage durchgeführt, und dann in flüssigem MS-Medium, das Cefotaxim (1 g/l) enthielt, für 3 bis 5 Stunden bei einem konstanten jedoch leichten Rühren gewaschen. Embryos wurden auf einem halbfesten Medium mit 5 μM BAP, 90 μM Saccharose in Gegenwart von Cefotaxim (400 mg/l) unter Schwachlichtbedingungen (16 Stunden Photoperiode pro Tag) kultiviert. Nach einem Zeitraum von 3 bis 4 Wochen wurden sie auf ein selektives MS-Medium überführt, das mit Cefotaxim (400 mg/l) und Chlorsulfuron (80 mg/l) ergänzt war. Sie wurden dann jeden Monat auf ein neues selektives Medium übertragen, bis eine Regeneration von Kalli erfolgte. Transformierte Embryos, die um die Kalli herum wuchsen, wurden dann auf dem halbfesten MS-Medium mit Morel-Vitaminen (1 μM BAP und 30 μM Saccharose) kultiviert, um ihre Keimung auszulösen. Nach dieser Stufe wurden sie auf das Wurzelmedium übertragen, das dem eben beschriebenen Medium entsprach, jedoch ohne BAP.
Um die Wirksamkeit der Transformation zu prüfen, wurden Kalli, Sprößlinge und Blätter regelmäßig auf die Expression des uidA-Reporters mit einem GUS-histochemischen Assay getestet (Jefferson et al., J. EMBO 6 (1987), 3901-3907).
Nach dieser Prozedur wurden verschiedene individuelle Pflanzen ausgewählt und in vitro mittels Mikroschnitten vervielfältigt. Einige von ihnen wurden in ein Gewächshaus überführt, um ihre Entwicklung zu erreichen. Es wurden keinerlei morphologische Anormalitäten beobachtet.
VIII Analyse somatischer Embryos von transformierten Kaffeepflanzen
Somatische Embryos wurden auch ausgehend von Blatt-Explantaten induziert, um die Anwesenheit von α-Galactosidase-Antisense-mRNA nachzuweisen. 11S-Kaffee-Speicherproteine wurden in somatischen Embryos nachgewiesen (Yuffa et al., Plant Cell Rep. 13 (1994) 197-202), was darauf hindeutete, dass der csp1-Promotor in diesem Gewebe aktiv ist. Wenn das der Fall ist, sollte die Analyse von somatischen Embryos, die von den Blättern von jungen transgenen Kaffeepflanzen induziert wurden, den Nachweis der Anwesenheit der α-Galactosidase-Antisense-mRNA früher als in den Bohnen gestatten.
Gesamt-RNAs wurden dann aus 100 mg von transformierten somatischen Embryos, wie weiter oben beschrieben, extrahiert und durch RT-PCR getestet, wobei man das Kit Access RT-PCR-System (Promega, USA) verwendete. Zuerst wurde die Anwesen heit einer 11S-spezifischen mRNA durch Durchführung einer RT-PCR unter Verwendung der Primer bestätigt, die in der Codiersequenz der 11S cDNA angeordnet sind. Das wurde unter Verwendung der Primer SO11, der der Sequenz SEQ NO: 18 entspricht, und SO2-1, der der Sequenz SEQ ID NO: 19 entspricht, durchgeführt. Der SO11-Primer entspricht der Sequenz zwischen den Nucleotiden 1035 und 1059 der von Marraccini et al., supra, veröffentlichten Sequenz. Andererseits entspricht der SO2-1-Primer den letzten 24 Nucleotiden der veröffentlichten Sequenz. Die Synthese des ersten Strangs der cDNA (Stufe der Reverse-Transkription) wurde, wie von dem Lieferanten beschrieben, durchgeführt (45 min, 48 °C). Die folgenden Parameter wurden für die PCR-Reaktion verwendet: 45 Zyklen (60 s bei 94 °C für die Denaturierstufe, 90 s bei 52 °C für die Renaturierstufe, 4 min bei 68 °C für die Verlängerungsstufe), mit einer Endverlängerung bei 68 °C für 7 min.
Aus diesem Experiment wurde ein PCR-Produkt von 1590 bp erhalten, das der 11S cDNA-Sequenz, flankiert von den Primern SO11 und SO2-1, entsprach. Das Ergebnis bestätigte, dass 11S mRNA in allen untersuchten Geweben fehlte, d.h. Wurzeln, Blättern, Blüten, jedoch wirksam in somatischen Embryos von Coffea canephora sowie in Bohnen bei 27 WAF vorhanden waren.
Zweitens wurde die Anwesenheit von α-Galactosidase-Sense-mRNA dadurch geprüft, dass man eine RT-PCR-Reaktion durchführte, wobei man nur den Primer B33 verwendete, der der Sequenz SEQ ID NO: 21 entsprach, und zwar während der Phase der Reverse-Transkription (Bedingung 1). Dieser Primer entspricht der komplementären Sequenz der Nucleotide 1286 bis 1314 der Sequenz SEQ ID NO: 1.
Parallel dazu wurde der Nachweis der α-Galactosidase-Antisense-mRNA durchgeführt, indem man nur den Primer B11 während der Phase der Reverse-Transkription verwendete (Bedingung 2). Dieser Primer entspricht der Sequenz zwischen den Nucleotiden 50 und 78 der Sequenz SEQ ID NO:1. Nach dieser Reverse-Transkription (45 min, 48 °C) wurde die Reak tionsmischung bei 94 °C für eine Minute behandelt, um die MMLV-Reverse-Transkriptase zu inaktivieren. Das fehlende Oligonucleotid, B11 bei Bedingung 1 und B33 bei Bedingung 2, wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde mittels PCR fortgesetzt: 45 Zyklen (60 s bei 94 °C für die Denaturierungsstufe, 90 s bei 45 °C für die Renaturierungsstufe, 4 min bei 68 °C für die Verlängerungsstufe), mit einer abschließenden Verlängerung bei 68 °C für 7 min. Unter Verwendung von somatischen Zellen von nicht-transformiertem C. arabica wurde für den Versuch gemäß Bedingung 1 ein Vervielfältigungsprodukt von 1310 bp beobachtet, jedoch nicht für das Experiment für Bedingung 2. Für somatische Embryos, die aus einem Kaffeepflänzchen erhalten wurden, das mit dem pBIA9-Vektor transformiert wurde, war es möglich, ein Vervielfältigungsprodukt während der Versuchsbedingung 2 nachzuweisen, was die Anwesenheit der α-Galactosidase-Antisense-mRNA bestätigte. Sequenzprotokoll

Claims

Transgene Kaffeepflanze, die eine Kaffeepflanzenzelle enthält, die Galactomannane produziert, wobei die Zelle dadurch modifiziert wurde, dass in die Zelle ein Konstrukt eingeführt wurde, das eine Nucleinsäure enthält, die in eine Ribonucleinsäure transkribiert wird, die antisense zur mRNA oder zu einem Teil davon, die sich von dem α-D-Galactosidasegen ableitet, ist, so dass das endogene Ausmaß der α-Galactosidaseaktivität so vermindert ist, dass die Galactoseverzweigung der Galactomannane erhöht ist.
Kaffeepflanze nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure, die in eine Ribonucleinsäure transkribiert wird, die antisense zu der mRNA oder zu einem Teil davon, die sich von dem α-D-Galactosidasegen ableitet, ist, unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors steht.
Pflanze nach Anspruch 2, wobei der Promotor der Kaffee csp1-Promotor ist.
Verfahren zur Herstellung eines löslichen Kaffees, das die Stufe der Verwendung von Kaffeebohnen umfasst, die von einer Kaffeepflanze gemäß irgendeinem der vorausgehenden Patentansprüche erhalten wurden.
Verfahren zur Erhöhung der Löslichkeit von Kaffee, das die Stufe der Verwendung von Kaffeebohnen umfasst, die von einer Pflanze gemäß irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche erhalten wurden.
Verwendung von Kaffeebohnen, die von einer Kaffeepflanze nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche erhalten wurden, zur Herstelung von löslichem Kaffee.