DE69734058T2 - Raps cysteinprotease-promotor und eine methode zur eindämmung der genetischen vielfalt von pflanzen - Google Patents

Raps cysteinprotease-promotor und eine methode zur eindämmung der genetischen vielfalt von pflanzen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Promotoren und ein Konstrukt, das dieselben umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Eingrenzung von pflanzlichem Keimplasma.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Promotors zur Expression eines interessierenden Gens (GOI) in einem spezifischen Gewebe oder Geweben einer Pflanze.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Promotoren für Cysteinproteasen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung dieser Cysteinprotease-Promotoren zur Expression eines GOI in einem spezifischen Gewebe oder Geweben einer Pflanze.
  • Promotoren steuern die räumliche und zeitliche Expression von Genen durch Modulieren ihres Transkriptionsgrades. Frühe Ansätze für genetisch manipulierte Nutzpflanzen verwendeten starke konstitutive Promotoren, um die Expression von Fremdgenen anzutreiben. Da Strategien in der Pflanzenbiotechnologie ausgeklügelter geworden sind, gibt es Anforderungen für spezifische Promotoren, um die Transgenexpression auf ein besonderes Gewebe oder auf ein besonderes Entwicklungsstadium auszurichten.
  • Cysteinproteasen sind Mitglieder einer großen Multigenfamilie in Pflanzen (Praekelt et al., 1988; Goetting-Minesky und Mullin, 1994), Tieren (Wiederanders et al., 1992) und Einzellern (Mallinson et al., 1994). Cysteinproteasen werden als ein inaktiver Vorläufer synthetisiert (Praekelt et al., 1988). Das Prä-Pro-Enzym ist auf den Sekretionsweg gerichtet (Marttila et al., 1995) und wird posttranskriptional in den Vakuolen durch proteolytische Spaltung des Propeptidfragments zur Erzeugung des aktiven Enzyms verarbeitet (Hara-Nishimura et al., 1993 und 1994).
  • Pflanzliche Cysteinproteasen nehmen an unterschiedlichen Stoffwechselereignissen mit physiologischer Bedeutung teil. Während der Saatkeimung und pflanzlichen Alterung sind sie am Proteinabbau beteiligt (Jones et al., 1995; Valpuesta et al., 1995; Smart et al., 1995) und spielen eine Schlüsselrolle in der Proteinspeichermobilisierung während der Keimung (Boylan und Sussex, 1987). Während der Samenentwicklung katalysieren Cysteinproteasen die posttranslationale Reifung von Proteinvorläufern zu ihrer reifen Form (Hara-Nishimura et al., 1995). Zusätzlich sind einige Gegenstand der hormonellen Regulierung entweder durch Giberillinsäure (Koehler und Ho, 1990; Watanabe et al., 1991) oder Ethylen (Cervantes et al., 1994; Jones et al., 1995). Andere werden als Reaktion auf Streß wie Verwundung (Linthorst et al., 1993; Lidgett et al., 1995), Austrocknung (Guerrero et al., 1990) und Kälte (Schaffer und Fischer, 1988) induziert oder sind an Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen beteiligt (Goetting-Minesky und Mullin, 1994).
  • Keimungsspezifische Cysteinproteasen wurden für Gerste (Marttila et al., 1995), Reis (watanabe et al., 1991), Mais (Debarros und Larkins, 1994), Kichererbse (Cervantes et al., 1994) und Wicke (Becker et al., 1994) charakterisiert, und eine Cysteinprotease wurde für Ölraps beschrieben (Comai und Harada, 1989). Jedoch sind die veröffentlichten Daten für Ölraps widersprüchlich. Ferner ist diese Art aufgrund ihrer amphidiploiden Natur schwierig zu untersuchen. Dietrich et al. (1989) betrifft die räumlichen Muster der Expression von drei Genen, die während der Saatkeimung in Brassica napus exprimiert werden. Das durch eines dieser Gene codierte Polypeptid, als COT44 bezeichnet, ist mutmaßlich eine Cysteinprotease.
  • Anstelle der Verwendung von eher herkömmlichen und mühseligen Techniken wie substraktive oder differentielle Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken oder Differential-Display-Techniken, wodurch potentiell Klone unbekannter Identität erzeugt werden, wurden Cysteinproteinasen (Cysteinproteasen) in Ölraps untersucht, die in keimenden Samen exprimiert werden. Promotoren aus Genen, die nur nach Saatkeimung exprimieren werden, wurden isoliert und charakterisiert.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Exprimieren eines Gens bereitgestellt, das das funktionsfähige Binden einer DNA-Sequenz, die einen Cysteinprotease-Genpromotor umfaßt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen der 19, 20 oder 21 besteht, an das Gen umfaßt, so daß das Gen nur nach Saatkeimung exprimiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Ölraps-Cysteinprotease-Genpromotor der Klasse 1, 2 oder 6.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Promotor, der wenigstens einen Teil einer Sequenz wie in den 19, 20 oder 21 gezeigt oder wenigstens einen Teil einer Sequenz, die substantielle Homologie dazu aufweist, oder eine Variante davon umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Promotor mit den charakteristischen Motiven oder Merkmalen von Promotoren der vorliegenden Erfindung.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt bereitgestellt, das den Promotor wie oben definiert umfaßt, funktionsfähig gebunden an ein Gen, das für ein interessierendes Protein codiert.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt, das in einer Pflanzen funktionell ist, bereitgestellt, das ein Unterbrechergen, das ein Produkt codiert, das die Zellfunktion unterbrechen kann, und einen Promotor wie oben definiert umfaßt, wobei das Unterbrechergen funktionell an eine extern regulierbare Genkontrollregion gebunden ist und durch sie kontrolliert wird, die einen Promotor einschließt, der durch die äußere Anwendung eines chemischen Induktors induzierbar ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DNA, die wenigstens einen Teil der in den 12, 13, 14, 15, 16 oder 17 gezeigten Sequenz oder wenigstens einen Teil einer Sequenz, die eine wesentliche Homologie dazu aufweist, oder eine Variante davon umfaßt, und die für eine Cysteinprotease codiert.
  • Die Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Konstrukt, das in einer Pflanze funktionell ist und die DNA wie oben definiert umfaßt, funktionsfähig gebunden an einen Promotor.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionssystem für das Gewebe oder die Gewebe eines Pflanzenmaterials bereitgestellt, worin das Expressionssystem ein interessierendes Gen umfaßt, fusioniert an einen Genpromotor wie oben definiert, worin das Expressionssystem in dem Gewebe oder den Geweben des Pflanzenmaterials exprimiert werden kann.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionssystem bereitgestellt, das ein Konstrukt wie oben definiert umfaßt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Pflanzengenom bereitgestellt, das ein rekombinantes DNA-Konstrukt wie oben definiert oder ein Expressionssystem wie oben definiert umfaßt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Pflanze, ein Pflanzensamen oder eine Pflanzenzelle mit einem rekombinanten Pflanzengenom wie oben definiert bereitgestellt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird geschütztes Keimplasma bereitgestellt, das ein rekombinantes DNA-Konstrukt wie oben definiert umfaßt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Pflanze oder Samen bereitgestellt, die/der zur Reife wachsen kann, umfassend ein rekombinantes DNA-Konstrukt wie oben definiert.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Genpromotors wie oben definiert zur Induzierung der Expression eines interessierenden Gens bei Fusion an den Genpromotor in dem Gewebe oder den Geweben eines Pflanzenmaterials bereitgestellt.
  • Bevorzugt ist der induzierbare Promotor des rekombinanten DNA-Konstrukts funktionell an ein Repressorprotein gebunden und kontrolliert es, und der Unterbrechergenpromotor schließt eine Operatorsequenz ein, die durch das Repressorprotein erkannt wird, so daß in Gegenwart des Induktors das Repressorgen erzeugt wird, das mit der Operatorsequenz wechselwirkt, wodurch der zweite Promotor ausgeschaltet und die Expression des Unterbrechergens gehemmt wird.
  • Bevorzugt ist das Unterbrechergen eine Nukleotidsequenz, die in der sense-Orientierung zu einem endogenen Pflanzengen ist, das wesentlich für die pflanzliche Entwicklung ist, oder zu einem Gen, das eine gewünschte Eigenschaft auf die Pflanze überträgt, oder umfaßt eine partielle sense-Sequenz des endogenen Pflanzengens.
  • Bevorzugt ist das Unterbrechergen eine Nukleotidsequenz, die in der antisense-Orientierung zu einem endogenen Pflanzengen ist, das wesentlich für die Pflanzenentwicklung ist, oder zu einem Gen, das eine gewünschte Eigenschaft auf die Pflanze überträgt.
  • Bevorzugt ist das endogene Pflanzengen wesentlich für die Saatkeimung oder frühe Sämlingsentwicklung.
  • Bevorzugt ist die extern regulierbare Genkontrollregion eine chemisch induzierbare Genpromotorsequenz aus dem Glutathion-S-Transferasesystem (das Gegenstand unserer internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB96/02116 ist), dem Alc-System (das Gegenstand unserer internationalen Patentanmeldungen Nrn. PCT/GB96/01883 und PCT/GB96/01846 ist) oder dem Ecdyson-System (das Gegenstand unserer internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB96/01195 ist).
  • Bevorzugt codiert das Repressorproteingen einen bakteriellen Repressor wie den Lac-Repressor oder einen von 434-, P22- oder lambda-Bakteriophagen verwendeten Repressor.
  • Bevorzugt enthält das Unterbrechergen oder der Unterbrecherpromotor einen "Pseudo-Operator".
  • Bevorzugt ist das Unterbrechergen ein cytotoxisches Gen.
  • Bevorzugt codiert das Unterbrechergen eine Rekombinase oder Transposase, die angepaßt ist, um eine Nukleotidsequenz auszuschneiden, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen flankiert wird.
  • Bevorzugt kann das rekombinante DNR-Konstrukt in dem Gewebe oder den Geweben eines keimenden Sämlings oder eines sich entwickelnden Korns oder einer Pflanzen exprimiert werden, wenn das Konsturkt innerhalb der genomischen DNA des Korns oder des Sämlings oder der Pflanze integriert ist, bevorzugt stabil integriert ist.
  • Bevorzugt ist das Expressionssystem zumindest für das Gewebe eines keimenden Sämlings oder eines sich entwickelnden Korns oder einer Pflanze (z.B. in der Wurzel, den Keimblättern, den Blättern und dem Stengel).
  • Bevorzugt ist das Expressionssystem innerhalb einer genomischen DNA eines keimenden Sämlings oder der genomischen DNA eines sich entwickelnden Korns oder der genomischen DNA einer Pflanze integriert, bevorzugt stabil integriert.
  • Bevorzugt wird der Genpromotor zur Induzierung der Expression eines interessierenden Gens bei Fusion an den Genpromotor zumindest in dem Gewebe oder den Geweben eines keimenden Sämlings oder eines sich entwickelnden Korns oder einer Pflanze verwendet (z.B. in der Wurzel, den Keimblättern, den Blättern und dem Stengel).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der Promotor eine DNA-Sequenz, die derjenigen der Promotorregion des Klons pKS12p6 wie in 19 gezeigt entspricht.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der Promotor eine DNA-Sequenz, die derjenigen der Promotorregion des Klons pKS25p7 wie in 20 gezeigt entspricht.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der Promotor eine DNA-Sequenz, die derjenigen der Promotorregion des Klons pKS66p1 wie in 21 gezeigt entspricht.
  • Eine noch mehr bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Sämling, ein Korn oder eine Pflanze, umfassend ein Konstrukt, das ein an einen Cysteinprotease-Promotor fusioniertes Unterbrechergen umfaßt, worin das Konstrukt innerhalb der genomischen DNA des Sämlings, des Korns oder der Pflanze integriert ist, bevorzugt stabil integriert ist, worin der Promotor wenigstens einen Teil einer in den 19, 20 oder 21 gezeigten Sequenz oder wenigstens einen Teil einer Sequenz, die eine wesentliche Homologie dazu aufweist, oder eine Variante davon umfaßt, worin das Unterbrechergen ein Gen ist, das Barnaseribonuklease codiert.
  • Eine noch mehr bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Sämling, ein Korn oder eine Pflanze, umfassend ein Konstrukt, das ein an einen Cysteinprotease-Promotor fusioniertes Unterbrechergen umfaßt, worin das Konstrukt innerhalb der genomischen DNA des Sämlings, des Korns oder der Pflanze integriert ist, bevorzugt stabil integriert ist, worin der Promotor wenigstens einen Teil einer in den 19, 20 oder 21 gezeigten Sequenz oder wenigstens einen Teil einer Sequenz, die eine wesentliche Homologie dazu aufweist, oder eine Variante davon umfaßt, und worin das Unterbrechergen ein Gen ist, das eine Rekombinase codiert, die angepaßt ist, um eine Nukleotidsequenz auszuschneiden, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen flankiert wird.
  • Somit wird gemäß einer höchst bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes DNA-Konstrukt zur Insertion in das Genom einer Pflanze, um die Kontrolle der Pflanzenentwicklung darauf zu übertragen, bereitgestellt, das in Reihe umfaßt:
    • (a) eine induzierbare Genpromotorsequenz, die auf die Gegenwart oder Abwesenheit eines exogenen chemischen Induktors anspricht;
    • (b) entweder ein Gen, das ein Repressorgen unter der Kontrolle der induzierbaren Genpromotorsequenz codiert, oder ein Gen, das einen Inhibitor des Produkts des nachfolgend unter (e) angegebenen Disruptorgens codiert;
    • (c) eine Operatorsequenz, die auf das Repressorgen anspricht;
    • (d) eine Genpromotorsequenz der vorliegenden Erfindung; und
    • (e) ein Gen, das einen Proteinunterbrecher für eine Pflanzeneigenschaft codiert, die wesentlich für das Wachstum der Pflanze ist, wobei die Gegenwart oder Abwesenheit des exogenen chemischen Induktors entweder das Wachstum zur Reife ermöglicht oder die Verlangsamung des Wachstums oder dessen Anhalten in einem geeigneten Stadium verursacht.
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete induzierbare Promotor kann die Expression des Repressorproteins als Reaktion auf Stimulation durch einen exogenen chemischen Induktor fördern, wobei in Abwesenheit des chemischen Induktors kein Repressorprotein exprimiert wird, um mit dem Operator wechselzuwirken, wodurch die Expression des Unterbrecher-Proteingens erlaubt wird, und in Gegenwart des chemischen Induktors das Repressorprotein exprimiert wird, wodurch die Expression des Gens, das den Inhibitor der Pflanzenentwicklung codiert, verhindert und ein ungehinderte Pflanzenwachstum erlaubt wird.
  • Der Begriff "Pflanzenmaterial" schließt eine sich entwickelnde Karyopse, eine keimende Karyopse oder ein Korn oder einen Sämling, einen Pflänzling oder eine Pflanze oder Gewebe oder Zellen davon ein, wie zum Beispiel die Zellen einer sich entwickelnden Karyopse oder die Gewebe eines keimenden Sämlings oder sich entwickelnden Korns oder einer Pflanze (z.B. in der Wurzel, den Blättern und dem Stengel).
  • Der Begriff "interessierendes Gen" oder "GOI" in bezug auf die vorliegende Erfindung bedeutet jedes Gen von Interesse. Ein GOI kann jedes Gen sein, das entweder fremd oder natürlich für die betreffende Pflanze ist, ausgenommen ein funktionelles Gen vom Wildtyp, wenn es in seiner natürlichen Umgebung ist.
  • Typische Beispiele für ein GOI schließen Gene ein, die für Proteine und Enzyme codieren, die die Zellfunktion unterbrechen. Zum Beispiel kann das Gen ein cytotoxisches Gen sein. Alternativ kann das Gen eine Rekombinase, Transposase oder ein verwandtes Enzym mit ähnlichen Eigenschaften codieren, angepaßt zur Inhibierung eines endogenen Pflanzengens, das wesentlich für die Pflanzenentwicklung ist, oder eines Gens, das eine gewünschte Eigenschaft auf die Pflanze überträgt.
  • Eine Rekombinase ist ein Enzym, das eine spezifische Ausschneidesequenz oder einen Satz von Ausschneidesequenzen erkennt und die Entfernung von DNA zwischen spezifischen Ausschneidesequenzen oder deren anderweitige Veränderung bewirkt. Rekombinasesysteme wie das Cre-lox, die FLP-, SRl- und SSVl-codierten Integrasesysteme können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Andere Beispiele für ein GOI schließen defensive oder schützende Gene ein, zum Beispiel Gene, die eine herbizide, pilzliche oder Insektenresistenz ergeben. Solche Gene können während der Keimung von Sämlingen zu dem Zeitpunkt exprimiert werden, an dem die Sämlinge besonders verletzlich sind. Bevorzugt codiert das Gen ein Protein, das Resistenz gegen biotische Belastungen und Umweltstreß auf eine Pflanze verleiht.
  • Auch eingeschlossen sind endogene Gene, zum Beispiel Gene, die β-Tubulin und Adeninnukleotidtranslocator (ANT) codieren.
  • Der Begriff "Unterbrechergen" ist ein Gen, das bei Expression oder spezifischer Repression in einem geeigneten Stadium der Pflanzenentwicklung zum Versagen einer Pflanze im Erreichen der Reife und im Ansetzen von Samen führen wird. Der Ursprung der Unterbrechergene kann aus einer Vielzahl natürlich vorkommender Quellen sein, z.B. humane Zellen, bakterielle Zellen, Hefezellen, Pflanzenzellen, Pilzzellen, oder sie können aus vollständig synthetischen Genen sein, die aus DNA-Sequenzen zusammengesetzt sein können, von denen einige in der Natur gefunden werden, einige normalerweise nicht in der Natur gefunden werden oder einer Mischung aus beiden. Die Unterbrechergene werden bevorzugt auf eine im wesentlichen biochemische Funktion gerichtet sein, zum Beispiel DNA- und RNA-Stoffwechsel, Proteinsynthese und andere Stoffwechselreaktionen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Unterbrechergen ein Gen, das Barnaseribonuklease, β-Tubulin oder Adeninnukleotidtranslocator (ANT) codiert.
  • Der Begriff "Variante davon" in Bezug auf die vorliegende Erfindung bedeutet jede Substitution, Variation, Modifikation, Austausch, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Nukleinsäuren aus oder an der Promotorsequenz, vorausgesetzt die resultierende Sequenz kann ein GOI exprimieren. Der Begriff schließt auch Sequenzen ein, die substantiell mit der Promotorsequenz hybridisieren können. Der Begriff schließt auch DNA ein, die mit der DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert und die für wenigstens einen Teil eines Cysteinprotease-Promotors codiert. Bevorzugt erfolgt eine solche Hybridisierung bei oder zwischen Bedingungen geringer und hoher Stringenz. Allgemein können Bedingung geringer Stringenz als 3 × SSC bei ca. Umgebungstemperatur bis ca. 65°C und hochstringente Bedingungen als 0,1 × SSC bei ca. 65°C definiert werden. SSC ist die Bezeichnung eines Puffers aus 0,15 M NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat. 3 × SSC ist dreimal so konzentriert wie SSC und so weiter.
  • Der Betriff "wesentliche (substantielle) Homologie" deckt eine Homologie in Bezug auf wenigstens die wesentlichen Nukleinsäuren/Nukleinsäurereste der Promotorsequenz ab, vorausgesetzt die homologe Sequenz wirkt als Promotor, zum Beispiel als Cysteinprotease-Promotor, der ein GOI exprimieren kann. Typischerweise wird Homologie gezeigt, wenn 60 % oder mehr der Nukleotide mit der Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung gemein sind, besonders typisch 65 %, bevorzugt 70 %, besonders bevorzugt 75 %, noch mehr bevorzugt 80 oder 85 %, und speziell bevorzugt sind 90, 95, 98 oder 99 % oder mehr Homologie.
  • Der Begriff "Konstrukt" – der synonym mit Begriffen wie "Kassette", "Hybrid" und "Konjugat" ist – schließt ein GOI ein, das direkt oder indirekt an den Promotor der vorliegenden Erfindung gebunden ist, zum Beispiel zur Bildung einer Kassette. Ein Beispiel für eine indirekte Bindung ist die Bereitstellung einer geeigneten Spacer-Gruppe wie einer Intron-Sequenz zwischen dem Promotor und dem GOI. Gleiches gilt für den Begriff "fusioniert" in bezug auf die vorliegende Erfindung, der die direkte oder indirekte Anbindung einschließt.
  • Der Begriff "Expressionssystem" bedeutet, daß das oben definierte System in einem geeigneten Organismus, Gewebe, Zelle oder Medium exprimiert werden kann. In dieser Hinsicht kann das Expressionssystem der vorliegenden Erfindung zusätzliche Komponenten umfassen, die die Erhöhung der Expression des GOI durch Verwendung des Genpromotors sicherstellen.
  • Die erfindungsgemäße DNA kann genomische DNA sein, die in einer isolierten Form ist und bevorzugt an eine Sequenz funktionsfähig gebunden ist, mit der sie normalerweise nicht natürlich assoziiert ist, oder die DNA kann synthetische DNA oder cDNA sein.
  • Junge Sämlinge bei der Keimung stellen ein verletzliches Stadium der Pflanzenentwicklung dar. Strategien zur Verbesserung der Kulturpflanzenproduktion können die Expression von Genen während dieses Stadiums einschließen, um die Resistenz des Sämlings gegen biotische und Umweltbelastungen wie Resistenz Kälte, Salz, Schwermetalle und Pilzbefall zu steigern. Das Schützen von Sämlingen durch Expression von Proteinen, die wenigstens ein gewisses Maß an Resistenz/Toleranz gegenüber solchen Belastungen liefern, zum Beispiel Antipilzproteine (Cammue et al., 1992; Terras et al., 1993) unter der Kontrolle eines keimungsspezifischen Promotors wird die Expression auf eine genaue Phase der Entwicklung beschränken, wenn die Proteine am wirksamsten sein werden. Eine solche entwicklungsspezifische Expression hat weitere Vorteile, zum Beispiel die Vermeidung der Expression dieser Gene in Pflanzenmaterial, das die Nahrungskette betrifft.
  • Die Promotoren der vorliegenden Erfindung können auch vorteilhaft in Pflanzenkeimplasma-Eingrenzungssystemen verwendet werden.
  • Die Landwirtschaft verwendet viele Kulturpflanzen zur Herstellung von Lebensmitteln für den menschlichen Verbrauch, für gewerbliche Prozesse, die Produkte zum menschlichen Verzehr liefern, für die Tierfutterproduktion, für die Entwicklung von industriellen Produkten und für andere Zwecke. Der Prozeß beinhaltet das Auspflanzen von Saatgut durch den Farmer, das gewöhnlich von einem Saatguthersteller erworben wurde. Das durch die Kulturpflanze erzeugte Produkt, sei es die ganze Pflanze, der Samen oder die Frucht der Pflanze, wird geerntet und dann für die verschiedenen, oben genannten Lebensmittelanwendungen verwendet.
  • Der gelieferte Hybrid- oder Inzuchtsamen kann neue genetische Informationen aufnehmen, die durch Transformation der Nutzpflanze eingeführt werden, wodurch neue landwirtschaftliche Merkmale wie Toleranz gegenüber Herbiziden, Insektenschädlingen und/oder Pilzkrankheiten, ein verbesserter Ertrag und/oder eine verbesserte Qualität des geernteten Produkts und neue Mechanismen zur Kontrolle der pflanzlichen Fruchtbarkeit erhalten werden. Solche Verbesserung, die durch biotechnologische Forschung möglich gemacht werden, verbessern die Qualität der Pflanzenzüchtung und verbessern die landwirtschaftliche Leistung des an den Landwirt gelieferten Saatguts.
  • Ein durch die vorliegende Erfindung angegangenes Problem ist die Eingrenzung von Nutzpflanzen innerhalb der Kulturfläche. Samen kultivierter Nutzpflanzen können aus der definierten Anbaufläche auf eine Anzahl von Wegen getragen werden (durch Vögel oder kleine Säugetiere oder einfach dadurch, daß sie während des Nacherntetransports eines Saatgutertrags fallengelassen werden), wo sie den Zustand von Unkraut annehmen, oder sie können als Wildwuchs in einem nachfolgenden Anbau in späteren Jahren verbleiben. Es wäre offensichtlich angemessen, falls es möglich wäre, daß kultivierte Anbauten auf die Anbaufläche beschränkt sind und von ihrem Weiterbestand in der Wildnis abgehalten werden. Man wird einsehen, daß die Probleme der oben erwähnten Anbau-Nichteingrenzung akuter werden, wenn transgene Anbauten involviert sind.
  • Auf die gleiche Weise kann Pollen lange Distanzen durch Wind und/oder Insektentransport (Dispersion) zurücklegen und für eine lange Zeit lebensfähig bleiben. Da die interspezifische Kreuzung zwischen Anbaupflanzen und ihren nicht-kultivierten verwandten Arten möglich ist, besteht ein zweites Bedenken im Entkommen von Pollen aus transgenen Anbauten, zum Beispiel herbizidresistenten Anbauten, zu ihren verwandten Unkrautarten (Mikkelsen et al., 1996). Wege zur Reduzierung der Lebensfähigkeit solcher Hybride wären die Beschränkung des Risikos der Transgenentweichung auf Nicht-Anbauarten, um dadurch das Verbreiten von Pflanzen mit gesteigerter Invasivität oder Verunkrautung zu vermeiden.
  • Man wird einsehen, daß die Verwendung von Sämlingspromotoren der vorliegenden Erfindung die Expression des Unterbrecherproteingens auf ein geeignetes Stadium der Pflanzenentwicklung beschränkt und auch bedeutet, daß es nicht notwendig ist, eine Induktorchemikalie auf die Pflanze während ihrer gesamten Lebenszeit fortgesetzt auszubringen, um ihre Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten. Dies hat sowohl wirtschaftliche als auch ökologische Vorzüge.
  • Die Erfindung stellt auch eine genetisch transformierte Pflanze und Teile davon bereit, zum Beispiel Zellprotoplasten und Samen, die in das Genom das Konstrukt der vorliegenden Erfindung aufgenommen haben, bevorzugt stabil aufgenommen.
  • Somit stellt die Erfindung eine Pflanze bereit, die reversibel in einem geeigneten Entwicklungsstadium gehemmt werden kann, worin die Pflanze das oben definierte rekombinante DNA-Konstrukt enthält, bevorzugt stabil in ihrem Genom aufgenommen.
  • Die Expression eines durch ein Gen codierten Proteins wird durch die Wechselwirkung bestimmter regulatorischer Proteine, die als DNA-Bindungsproteine bekannt sind, mit einer sich stromaufwärts des Gens befindlichen Region kontrolliert. Innerhalb der Promotorregion befinden sich mehrere Operatorregionen, die eine spezifische Oligonukleotidsequenz enthalten, an die diese DNA-Bindungsproteine spezifisch binden. Diese Proteine können entweder zur Aktivierung oder Unterdrückung der Genexpression führen. Somit kontrollieren sie die regulierte Expression von Genen.
  • Diese DNA-Bindungsproteine, die tatsächlich entweder Unterdrücker (Repressoren) oder Aktivatoren der Gen-Expression sein können, werden hier der Einfachheit halber als "Repressoren" bezeichnet.
  • Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von der gut charakterisierten Wechselwirkung zwischen bakteriellen Operatoren mit ihren Repressoren zur Kontrolle der Expression der Unterbrechergenfunktion. Bakterielle Repressoren, insbesondere der Lac-Repressor, oder die von den 434-, P22- und lambda-Bakteriophagen verwendeten Repressoren können zur Kontrolle der Expression in Pflanzenzellen sehr wirksam verwendet werden.
  • Ein zweites Operator/Repressorsystem ist Gegenstand unserer veröffentlichten internationalen Patentanmeldung Nr. WO 90/08827, die hier durch Verweis eingeführt wird.
  • Ein dritter Absatz zur Abregulation der Unterbrechergene, der berücksichtigt werden kann, ist die Verwendung von entweder "antisense"-, "sense"- oder "partieller sense"-Technologie.
  • Ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt kann ein "antisense"-Konstrukt sein, das eine "antisense"-RNA erzeugt, oder ein "partielles sense"-Konstrukt (das wenigstens einen Teil des funktionellen Genprodukts codiert), das "sense"-RNA erzeugt.
  • "Antisense-RNA" ist eine RNA-Sequenz die komplementär zu einer Sequenz von Basen in der entsprechenden mRNA ist: komplementär in dem Sinne, daß jede Base (oder die Mehrzahl der Basen) in der antisense-Sequenz (gelesen in der 3'- zu 5'-Richtung) mit der entsprechenden Base (G mit C, A mit U) in der mRNA-Sequenz, gelesen in der 5'- zu 3'-Richtung, paaren kann. Solche antisense-RNA kann in der Zelle durch Transformation mit einem geeigneten DNA-Konstrukt erzeugt werden, das angeordnet ist, um ein Transkript mit wenigstens einem Teil seiner Sequenz zu erzeugen, der komplementär zu wenigstens einem Teil des codierenden Strangs des relevanten Gens ist (oder einer DNA-Sequenz, die eine substantielle Homologie dazu zeigt).
  • "sense-RNA" ist eine RNA-Sequenz, die im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der entsprechenden mRNA-Sequenz ist. Solche sense-RNA oder partielle sense-RNA kann in der Zelle durch Transformation mit einem geeigneten DNA-Konstrukt erzeugt werden, das in der normalen Orientierung angeordnet ist, um ein Transkript mit einer Sequenz zu erzeugen, die identisch mit wenigstens einem Teil des codierenden Strangs des relevanten Gens ist (oder einer DNA-Sequenz, die eine substantielle Homologie dazu zeigt). Geeignete sense- oder partielle sense-Konstrukte können zur Inhibierung der Genexpression verwendet werden (wie beschrieben in der internationalen Patentveröffentlichung WO 91/08299).
  • antisense-RNA-Konstrukte können zur Abregulation von Unterbrechergenen verwendet werden, einschließlich derjenigen, die den Adeninnukleotidtranslocator codieren.
  • Andere Ansätze, die verfügbar sind oder werden, können auch verwendet werden.
  • Weitere Einzelheiten über solche Anbaueingrenzungssysteme können in unserer veröffentlichten internationalen Patentanmeldung Nr. WO 94/03619 gefunden werden, die hier durch Verweis eingeführt wird.
  • Der erfindungsgemäße Promotor liefert dann, wenn er ein exogenes oder fremdes Gen gebunden und in eine Pflanze durch Transformation eingeführt wird, ein Mittel zur Regulation der Expression des fremden Gens. Das zur Transformation der Pflanzenzelle eingesetzte Verfahren steht in keinem besonderen Zusammenhang mit dieser Erfindung, und jedes für die Zielpflanze geeignete Verfahren kann eingesetzt werden. Transgene Pflanzen werden durch Regeneration aus den transformierten Zellen erhalten. Zahlreiche Transformationsverfahren sind aus der Literatur bekannt, zum Beispiel Agroinfektion unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder seinem Ti-Plasmid, Elektroporation, Mikroinjektion von Pflanzenzellen und Protoplasten, Mikroprojektiltransformation, um nur einige zu nennen. Wir verweisen auf die Literatur für die vollen Einzelheiten der bekannten Verfahren.
  • Auch ist die Pflanzenart, in die die Promotorsequenz inseriert wird, nicht in einem besonderen Zusammenhang mit der Erfindung. Zweikeimblättrige und einkeimblättrige Pflanzen können transformiert werden. Diese Erfindung kann auf jede Pflanze angewendet werden, für die Transformationstechniken erhältlich sind oder werden. Die vorliegende Erfindung kann deshalb zur Kontrolle der Genexpression in einer Vielzahl genetisch modifizierter Pflanzen verwendet werden, einschließlich Feldpflanzen wie Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe und Baumwolle; Getreide wie Weizen, Gerste, Reis, Mais und Sorghum; Früchte wie Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen und Melonen; und Gemüse wie Karotte, Salat, Kohl und Zwiebel. Der Promotor ist auch geeignet zur Verwendung in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Wurzeln, Blättern, Stengeln und Fortpflanzungsgeweben.
  • Somit wurden Nukleinsäuresequenzen isoliert und charakterisiert, die für neue Cysteinproteasen codieren. Die DNA, die wenigstens einen Teil der in einer der 12 bis 17 gezeigten Sequenz umfaßt, codiert für eine Cysteinprotease und entspricht der codierenden Region der Sequenz. Die vorliegende Erfindung schließt auch DNA ein, die Homologie mit den Sequenzen der vorliegenden Erfindung zeigt. Die vorliegende Erfindung schließt auch DNA ein, die mit der DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert und für wenigstens einen Teil einer Cysteinprotease codiert. Solche Homologie und Hybridisierung wird oben in bezug auf die Promotorsequenzen erörtert.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ferner DNA ein, die als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert gegenüber der DNA der vorliegenden Erfindung ist und für eine Cysteinprotease codiert.
  • Auch eingeschlossen in der vorliegenden Erfindung ist eine Cysteinprotease, die im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, mit denen sie gewöhnlich assoziiert ist, und für die durch die Cysteinproteasegen-DNA der vorliegenden Erfindung codiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird jetzt allein als nicht-beschränkendes Beispiel und in bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, worin gilt:
  • 1 zeigt einen schematischen Abriß der Identifizierung von Cysteinprotease-Isoformen unter Verwendung einer revers transkribierten PCR-Bibliothek;
  • 2 zeigt die Analyse von RT-PCR-Produkten durch Agarose-Gelelektrophorese, worin DG1 = DEGCYS1 – und DG2 = DEGCYS2-Oligos sind;
  • 3A zeigt die Angleichung der codierenden Regionen der vorläufigen Nukleinsäuresequenzen der RT-PCR-Klone OSR8.401, OSR8.406, OSR8.403, OSR8.404, OSR8.402, OSR8.389 und OSR8.387;
  • 3B zeigt die Angleichung der nicht-codierenden Regionen der vorläufigen Nukleinsäuresequenzen der RT-PCR-Klone OSR8.389, OSR8.387, OSR8.402 und OSR8.404;
  • 4 zeigt die vorläufige Nukleinsäuresequenz der Klone OSR8.401, OSR8.402 und OSR8.389;
  • 5 zeigt die Ergebnisse eines Northern-Blot des Klasse 2-Klons OSR8.402 im Vergleich der Expression im Samen und während der Keimung unter Verwendung eines statistisch geprimten ganzen RT-PCR-Fragments als Sonde. In dieser Figur bedeutet L = Blatt, C = Keimblätter, S = Samen und B = Knospen;
  • 6 zeigt die Ergebnisse von Northern-Blots des Klasse 1-Klons CDCYS12 (unter Verwendung der codierenden Region des Klons als Sonde, markiert durch PCR), des Klasse 2-Klons CDCYS25 (unter Verwendung der nicht-codierenden Region des Klons als Sonde, markiert durch PCR) und des Klasse 6-Klons CDCYS66 (unter Verwendung der nicht-codierenden Region des Klons als Sonde, markiert durch PCR) im Vergleich der Expression in einem Bereich von Entwicklungsstadien. In dieser Figur bedeutet B = Knospe, W = ganze Pflanzen und L = Blatt;
  • 7 zeigt die Angleichung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Klone OSR8.403, OSR8.404, OSR.402, OSR.389, OSR8.387, OSR8.406 und OSR8.401 mit der veröffentlichten Sequenz von COT44 (bezeichnet als CYS4.BRANA);
  • 8 zeigt einen schematischen Abriß der Identifizierung von Cysteinprotease-Isoformen unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek;
  • 9 zeigt die Angleichung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Klasse 2-DNA-Klone mit partieller Länge CYS2UP6.1 CYS2UP7.1 und CYS2UP8.2 miteinander und mit COT44 (bezeichnet als CYS4.BRANA);
  • 10 zeigt die Angleichung der Nukleinsäuresequenzen der partiellen cDNA-Klone CYS2UP6, CYS2UP7, CYS2UP8, CY56UP3, CYS6UP5, CYS6UP2 und CYS6UP4 miteinander und mit COT44;
  • 11 zeigt die Angleichung der cDNA-Klone voller Länge CDCYS66, CDCYS24, CDCYS22, CDCYS25, CDCYS12 und CDCYS14 miteinander und mit COT44;
  • 12 zeigt die Nukleinsäuresequenz von cDNA-Klon CDCYS12;
  • 13 zeigt die Nukleinsäuresequenz von cDNA-Klon CDCYS14;
  • 14 zeigt die Nukleinsäuresequenz von cDNA-Klon CDCYS22;
  • 15 zeigt die Nukleinsäuresequenz von cDNA-Klon CDCYS24;
  • 16 zeigt die Nukleinsäuresequenz von cDNA-Klon CDCYS25;
  • 17 zeigt die Nukleinsäuresequenz von cDNA-Klon CDCYS66;
  • 18 zeigt die Angleichung der vorhergesagten Aminosäuresequenzen der cDNA-Klone CDCYS12, CDCYS14, CDCYS22, CDCYS24, CDCYS25 und CDCYS66 und vergleicht die Sequenzen mit den charakterisierenden Merkmalen der pflanzlichen Cysteinproteasen.
  • 19 zeigt eine Promotor-Nukleinsäuresequenz aus dem genomischen Klasse 1-Klon pKS12p6.
  • 20 zeigt eine Promotor-Nukleinsäuresequenz aus dem genomischen Klasse 2-Klon pKS25p7.
  • 21 zeigt eine Promotor-Nukleinsäuresequenz aus dem genomischen Klasse 6-Klon pKS66P1.
  • 22 zeigt die Kartierung des Transkriptionsstarts durch Primer-Verlängerungsexperimente sowie die Position der mutmaßlichen TATA-Box der Klone pKS12P6 (Klasse 1), pKS25P7 (Klasse 2) und pKS66P1 (Klasse 6). Die Zahlen geben den Abstand zum 5'-Ende der cDNAs an.
  • 23 zeigt die Vektorkonstrukte für die Tabaktransformation.
  • 24 zeigt die Stärken der GUS-Expression in Schößlinge erzeugenden Kalli während der Transformation.
  • 25 zeigt die Stärken der GUS-Expression in Blättern aus primären Transformanten.
  • 26 zeigt den Zeitverlauf der GUS-Expression in der Nachkommenschaft von zwei statistischen primären Transformanten pro Klasse, 0 bis 36 Tage nach Quellung (DAI). NVS bezeichnet die Negativkontrolle vom Wildtyp.
  • 27 zeigt die GUS-Aktivität der Nachkommenschaft von 24 primären Transformanten der Klasse 1. Die Sämlinge wurden zu 0, 14 und 28 DAI bewertet. Die Figur schließt auch die GUS-Aktivität in jungen Blättern aus den primären Transformanten ein.
  • 28 zeigt die GUS-Aktivität in der Nachkommenschaft von 24 primären Transformanten der Klasse 2. Sämlinge wurden zu 0, 14 und 28 DAI bewertet. Die Figur schließt auch die GUS-Aktivität in jungen Blättern aus den primären Transformanten ein.
  • 29 zeigt die GUS-Aktivität in der Nachkommenschaft von 24 primären Transformanten der Klasse 6. Sämlinge wurden zu 0, 14 und 28 DAI bewertet. Die Figur schließt auch die GUS-Aktivität in jungen Blättern aus den primären Transformanten ein.
  • Im allgemeinen zeigen in den Figuren die Bestimmungen CO oder COD im Zusammenhang mit einem Klon die codierende Region an, und NC oder NCD zeigt die nicht-codierende Region an.
  • Im Abriß beschreiben die Beispiele die Amplifikation einer Reihe von keimungsexprimierten partiellen Cysteinprotease-Klonen durch reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) an RNA aus keimendem Ölraps. Eine vorläufige Bewertung der Expression der Klone in trockenen Samen und keimenden Sämlingen durch Northern Blotting gefolgt von ausführlicheren Northern Blot-Experimenten an selektierten Klonen zur Bewertung ihres Zeitverlaufs der Expression. Eine cDNA-Bibliothek wurde aus Geweben konstruiert, die eine hohe Expression dieser Klone zeigen, gefolgt von Durchmusterung einer genomischen Bibliothek zur Subklonierung der Promotorareale. Die fertige Bewertung der räumlichen und zeitlichen Regulation der klonierten Promotoren wurden durch transkriptionelle Fusion der Promotorfragmente mit dem β-Glucuronidase-(GUS)-Reportergen und Transformation in Tabak durchgeführt.
  • Beispiel 1 – Konstruktion einer revers transkribierten Cysteinprotease-PCR-Bibliothek aus keimenden Ölraps-Sämlingen
  • Zur Identifizierung keimungsspezifischer Sequenzen wurde ein RT-PCR-Ansatz an Ölraps-Sämlings-RNA verwendet. Ein reverser Oligo(dT)-Primer und Vorwärtsprimer, geschaffen für die Cysteinprotease-codierenden Regionen, konserviert zwischen mehreren Pflanzenarten, wurden zur Amplifikation eines 750 bp RT-PCR-Produkts mit einer Abdeckung von 500 bp der codierenden Region und ca. 250 bp der nicht-codierenden Region verwendet. Das 5'-Ende wurde zur Bestätigung der Identität der RT-PCR-Produkte als Cysteinprotease-bezogene Klone sequenziert. Da es viel weniger Selektionsdruck auf nicht-codierende Regionen gibt, können signifikante Unterschiede in den nicht-codierenden Regionen des 3'-Endes Unterschiede in den untranslatierten Regionen des 3'-Endes mit einer Wirkung auf den Promotor vorhersagen. Dieser allgemeine Ansatz ist schematisch in 1 gezeigt.
  • Präparatorische Verfahren:
  • Pflanzenmaterial
  • 5 g Ölrapssamen (Brassica napus) aus der Sorte Westar wurden in 1%igem Natriumhypochlorit für 10 Minuten sterilisiert. Nach mehreren Spülungen in sterilem Wasser wurden die Samen mit sterilem Wasser für 12 Stunden bei 4°C im Dunkeln gequollen, um die Keimung zu synchronisieren. Sie wurden auf nassem sterilem Whattman-Papier ausgesät und bei 25°C im Dunkeln vor dem Ernten der Keimblätter kultiviert.
  • RNA-Extraktion
  • Lithiumchloridmethode
  • Vollständige RNA wurde aus trockenen Samen und 3 Tage alten Ölrapssämlingen unter Verwendung einer Modifikation des von Jepson et al. (1991) beschriebenen Protokolls isoliert. Gewebe (5 g) wurden mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser und Pistill gemahlen, bis ein feines Pulver erhalten wurde. Nach Zugabe von 9 ml Homogenisierungspuffer [400 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 9,0; 1 % SDS; 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); 4 U/ml Heparin; 1 mM Aurintricarbonsäure (ATT); 10 mM Dithiothreit (DTT)] und 4,0 ml Phenol, gesättigt in Homogenisierungspuffer und ergänzt mit 10 (V/V) m-Cresol vor der Verwendung, wurden die Gewebe erneut gemahlen, bis eine feine Paste erhalten wurde. Die Paste wurde in ein kaltes Corex-Röhrchen überführt und für 15 Minuten mit 13 000 U/min zentrifugiert (Sorval, SS34, 4°C). Der Überstand wurde in ein weiteres Röhrchen überrührt, für 5 Minuten mit 5 ml Phenol-Chloroform extrahiert und für 30 Minuten mit 9000 U/min zentrifugiert (Sorval, SS34, 4°C), um die wäßrige Phase zu gewinnen. Nach 3 Phenol-Chloroform-Extraktionen wurde die RNA durch Ausfällen des Überstandes über Nacht auf Eis mit einem Fünftel Volumen von 12 M Lithiumchlorid gewonnen. Nach Zentrifugieren für 30 Minuten mit 9000 U/min (Sorval, SS34, 4°C) wurde der Überstand entfernt und das Pellet in 1 ml 5 mM Tris (pH 7,5) vor der Überführung in ein Mikroröhrchen resuspendiert. Nach einer zweiten Lithiumchlorid-Ausfällung über Nacht wurde das Pellet zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen, in 0,2 ml DECP-behandeltem Wasser resuspendiert und bei –70°C gelagert.
  • Cäsiumchloridmethode
  • Vollständige RNA wurde aus einer Reihe von Entwicklungsstadien von Ölrapssämlingen unter Verwendung eines ausgehend von Okayama et al. (1979) modifizierten Protokolls isoliert. Gewebe (2-4 g) wurden in einem Mörser und Pistill mit 1 g Al2O3 in Gegenwart von flüssigem Stickstoff gemahlen. Das in Trockeneis aufbewahrte Pulver wurde dann in einem Corex-Röhrchen mit 8 ml vorerwärmtem (65°C) Homogenisierungspuffer [5M Thiocyanatguanidin; 0,5 % (G/V) Laurylsarcosinnatrium; 0,025 M Natriumcitrat; pH 7,0], ergänzt vor der Verwendung mit 2,5 % (V/V) β-Mercaptoethanol, vermischt und bei 40°C für 10 Minuten unter Verwirbeln bis zum vollständigen Auftauen der Gewebe inkubiert. Nach Zentrifugieren mit 12 000 U/mim für 30 Minuten bei 15°C (Sorval, SS34-Rotor) wurde der Überstand gewonnen, Homogenisierungspuffer auf 8 ml hinzugegeben und mit 0,1 g CsCl pro ml ergänzt. Nachdem das CsCl aufgelöst war, wurde das Homogenat in ein 12 mol-Polyalomer-Röhrchen, das 2,5 ml eines hochdichten CsCl-Kissens enthielt [5,7 M CsCl; 0,1 M EDTA], ohne Zerstörung des Kissens gegeben. Nach Zentrifugieren mit 25 000 U/min für 24 Stunden bei 20°C (Sorval, TH-641-Rotor) wurde der Überstand durch Abnutschen entfernt und die Wand des Rörchens mit Saugpapier vor der Resuspension des RNA-Rings in 300 μl Resuspensionspuffer [7 M Harnstoff, 2 % G/V Laurylsarcosinnatrium] gereinigt. Die RNA wurde dann in ein 1,5 ml-Röhrchen überführt und mit einem gleichen Volumen Phenol und einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol [24:1, V/V] extrahiert. Nach Zentrifugieren mit 13 000 U/min für 5 Minuten wurde die wäßrige Phase gewonnen und erneut mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die RNA wurde über Nacht bei –20°C durch Zugabe von 1/10 Volumen von 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina kaltem Ethanol ausgefällt. Nach Zentrifugieren mit 13 000 U/min für 15 Minuten bei 4°C wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit 1,5 ml kaltem 70%igem Ethanol gewaschen. Das Zentrifugieren wurde für 10 Minuten wiederholt, der Überstand wurde verworfen und das Pellet für 3-4 Minuten in einem Speedvacuum getrocknet. Das Pellet wurde in sterilem DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert, die RNA erneut ausgefällt und das Pellet gewaschen, wie oben beschrieben, und schließlich in 50 μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert und bei –70°C gelagert.
  • Markierung der DNA-Sonden
  • Terminaler Austausch
  • Die Oligonukleotide (25-50 ng) wurden durch Phosphorylierung ihres hydroxylierten 5'-Endes unter Verwendung von 20 U T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) in einer 25 μl-Reaktion [30 μCi [γ-32P]ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol), 1X Kinasepuffer] bei 37°C für 30 Minuten phosphoryliert. Die Oligonukleotide wurden von den nicht aufgenommenen Nukleotiden unter Verwendung von G-25 Sephadex-Spin-Säulen (5Prime→3Prime, Inc.®) gemäß Herstellerempfehlung gereinigt.
  • PCR
  • Plasmid-DNA (5 ng) wurde amplifiziert [(99°C, 1 Minute; 65°C, 1 Minute; 72°C, 1 Minute) × 17 Cyclen; (72°C, 7 Minuten) × 1 Cyclus] unter Verwendung von 2,5 U Taq-Polymerase (Gibco BRL) in einer 50 μl-PCR-Reaktion [0,25 μM [α-32P]dATP (Amersham, 3000 Ci/mmol); 0,4 μM dATP; 50 μM andere dNTPs; 1,5 mM MgC12; 0,5 μM Oligos; 1 × PCR-Puffer]. Die Sonden wurden von den nicht aufgenommenen Nukleotiden unter Verwendung von G-50 Sephadex-Spin-Säulen (Pharmacia Biotech) gemäß Herstellerempfehlung gereinigt.
  • Statistisches Priming
  • Plasmid-DNA (25-50 ng) wurde unter Verwendung des "Oligolabelling Kit" (Pharmacia) unter Befolgen der Herstellerempfehlungen markiert.
  • Northern Blot-Hybridisierung
  • Northern Blot-Experimente wurden gemäß Sambrook et al. durchgeführt. Gesamte RNA (10 μg) wurde mit 2,5 Volumina Beladungspuffer (SPrime→3Prime, Inc.®) vermischt, durch Elektrophorese an einem 1,2 % Agarose-Denaturierungsgel (1X MOPS (40 mM MOPS, pH 7,0; 10 mM Natriumacetat; 1 mM EDTA); 17 % (V/V) Formaldehyd] in alkalischem Laufpuffer [1X MOPS; 7 % V/V Formaldehyd] der Größe nach aufgetrennt und auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham) durch Kapillarblotting gemäß Herstellerempfehlungen übertragen. Die Hybridisierungen wurden über Nacht bei 65°C in Hybridisierungspuffer [5X SSPE (900 mM NaCl; 50 mM NaH2PO4.H2O; 5 mM EDTA; pH 7,4, NaOH); 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS); 1 % Milchpulver], ergänzt mit 100 μg/ml denatruierter Lachssperma-DNA, durchgeführt. Die Blots wurden in 3X SSC [20X SSC: 450 mM NaCl; 45 mM Na3Citrat.2H2O; pH 7,0, HCl] und 1 % SDS für 1 Stunde bei 65°C gewaschen und auf Röntgenfilen (X-OMAT AR, Kodak) bei –80°C mit einem Verstärkerschirm belichtet.
  • Konstruktion und Durchmusterung der RT-PCR-Bibliothek
  • Eine RT-PCR-Bibliothek wurde aus keimenden Ölrapssämlingen unter Verwendung des "Perkin Elmer GeneAmp® RNA PCR Kit" und unter Befolgen der Herstellerempfehlungen konstruiert. Vollständige RNA (1 μg), extrahiert aus Keimblättern 3 Tage nach der Samenquellung, wurde revers transkribiert [65°C, 2 Minuten; 42°C, 30 Minuten; 99°C, 5 Minuten; 6°C, 5 Minuten] unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers (MPRACElB), der für die PCR stabilisiert war. Die Heteroduplex-DNA-RNA wurde anschlißend durch PCR unter Verwendung des gleichem stromabwärts-Primers wie für die reverse Transkription und eines Satzes von zwei degenerierten stromaufwärts-Primern (DEGCYS1 und DEGCYS2) amplifiziert, die auf der Peptidebene aus einem Motiv von Cysteinprotease codierenden Regionen geschaffen wurden, die unter den meisten Pflanzenarten konserviert sind [GCNCCLM(NED)]. Kreislaufbedingungen: [(95°C, 2 Minuten; 55°C, 2 Minuten; 72°C, 1,5 Minuten) × 2 Durchläufe; (95°C, 2 Minuten; 55°C, 1 Minute; 72°C 1,5 Minuten) × 33 Durchläufe] gefolgt von 7 Minuten bei 72°C.
  • Die RT-PCR-Produkte wurden in einen pCRII-Vektor vor dem Transformieren von E. coli unter Verwendung des "TA Cloning® Kit" (Invitrogen) unter Befolgen der Herstellerempfehlungen ligiert. Dieses System nutzt die nicht-matrizenabhängige Aktivität der in der PCR verwendeten thermostabilen Polymerasen, die ein einzelnes Desoxyadenosin an die 3'-Enden aller durch die PCR bereitgestellten Duplexmoleküle addieren. Dies erlaubt die direkte Klonierung in einen pCRII-Vektor, der überhängendes Desoxythymidin enthält. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des "Wizard DNA-Miniprep DNA Purification System" (Promega) gereinigt und durch das Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., 1977) mit "Sequenaee version 2.0 T7 DNA polymerase" (USB) gemäß den Herstellerempfehlungen sequenziert.
  • Figure 00200001
  • Analyse
  • Die RT-PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese an einem Agarosegel analysiert. Wie aus 2 ersichtlich ist, wurden zwei Hauptfragmente der erwarteten Größe mit 750 bp gefunden, amplifiziert aus Keimblatt-RNA, aber keine aus Samen aus RNA. Diese wurden gelausgeschnitten und kloniert. In einem parallelen Ansatz wurden Teilmengen der RT-PCR-Produkte ohne Gelreinigung kloniert, um eine drei Tage alte exprimierte Cysteinprotease-Bibliothek zu erzeugen, die 400 Klone enthielt, aus denen 22 aus dem Gelausschneiden kamen. Eine Koloniedurchmusterung mit den für die RT-PCR verwendeten Oligonukleotiden identifizierte 250 mutmaßliche Cysteinproteasen. Sieben Klone aus dem Gelausschneiden wurden zufällig genommen und vollständig sequenziert, von denen alle Cysteinproteasen waren, und sie fielen in 3 Klassen.
  • Diesen Klonen wurden die folgenden Bezeichnungen gegeben:
    Figure 00200002
  • Die vorläufigen DNA-Sequenzen dieser Klone und ihre Angleichung sind in den 3A und 3B gezeigt.
  • Drei Klone, einer pro Klasse, OSR8.401 (Klasse 1); OSR8.402 (Klasse 2) und OSR8.389 (Klasse 6), deren vorläufige DNA-Sequenzen in 4 gezeigt sind, wurden durch statistisches Priming markiert und an Northern Blots bewertet, die vollständige RNA enthielten, extrahiert aus Samen und Keimblättern unter Verwendung der Lithiumchloridmethode. Sie schienen gut während der Keimung exprimiert zu werden, aber nicht in trockenen Samen. Ferner wurde etwas Kreuzhybridisierung zwischen den verschiedenen Klassen aufgrund der Natur der Sonde beobachtet. Dies ist in 5 veranschaulicht, die die Ergebnisse für den Klon der Klasse 2, OSR8.402, mit einem statistisch geprimten vollständigen RT-PCR-Fragment als Sonde zeigt.
  • Die Bibliothek wurde dann unter Verwendung der durch statistisches Priming markierten fünf Cysteinprotease-Klone durchmustert. Keine neuen Klassen wurden eindeutig indentifiziert. Die gesamte Vielfalt der Klone war in den gelausgeschnittenen Fragmenten vorhanden. Das Expressionsmuster der drei Klassen von Klonen wurde durch Northern Blots mit RNA, extrahiert mit der Caesiumchloridmethode, aus einer Reihe von Entwicklungsstadien wie in 6 gezeigt bewertet. Für Klasse 2 und 6 wurden die Hybridisierungen unter Verwendung der 3'-nicht-codierenden Regionen der Klone OSR8.402 bzw. OSR8.389 durchgeführt, um jedwede Kreuzhybridisierung zu vermeiden. Für Klasse 1 wurde ein Teil der codierenden Region des OSR8.401-Klons als Sonde verwendet, weil keine nicht-codierende Region in den RT-PCR-Klonen verfügbar war. Zur Erhöhung der Spezifität wurden Sonden durch PCR unter Verwendung des Oligo(dT) reversen Primers (MPRACE1B) und eines internen reversen Primers (CYS8.402 und CYS8.389) für die Klassen 2 und 6 markiert, während zwei interne Primer (CYS8.401 und CYS8.401R) für Klasse 1 verwendet wurden. Die Klassen 2 und 6 werden nach der Samenquellung und für die ersten 4 bis 5 Tage des frühen Sämlingswachstums exprimiert, aber werden nicht in reifen Pflanzenorganen oder im sich entwickelnden Samen exprimiert. Klasse 1 zeigt eine gewisse Expression in Knospen und Blättern, aber dies kann das Ergebnis einer gewissen Kreuzhybridisierung aufgrund der Natur der Sonde sein. Klasse 2 ist eng verwandt mit COT44, der einzigen für Ölraps veröffentlichten Cysteinprotease (Comai und Harrada, 1989). 7 zeigt die Angleichung abgeleiteter Aminosäuresequenzen der Klone mit COT44.
  • Figure 00220001
  • Beispiel 2 – Konstruktion einer Standard-Oligo(dT)-geprimten und einer spezifisch Cysteinprotease-geprimten cDNA-Bibliothek aus keimenden Ölrapssämlingen
  • Da die RT-PCR-Produkte nicht die volle Länge hatten und zur Vermeidung von PCR-erzeugten Mutationen wurde eine Ölraps-cDNA-Bibliothek aus einem Entwicklungsstadium konstruiert, das eine hohe Expression der drei interessierenden Klone zeigt. Eine spezifisch gemprimte Bibliothek wurde unter Verwendung von zwei spezifischen Oligonukleotiden konstruiert, die auf der Basis der drei Klassen der RT-PCR-Klone geschaffen wurden, anstelle der Verwendung eines Oligo(dT)-Primers. Als Ergebnis wurden nur die Cysteinprotease-Klone revers transkribiert, die eine kleine Anzahl von kurzen Klonen mit 650 bp lieferten, die alle eine volle Länge am 5'-Ende aufwiesen. Dies erlaubte die Konstruktion von Oligonukleotiden für die 5'-nicht-codierenden Regionen zur Verwendung in der Durchmusterung einer Standard-Oligo(dT)-geprimten cDNA-Bibliothek direkt auf Klone voller Länge. Dieser allgemeine Ansatz ist schematisch in 8 gezeigt.
  • Präparatorische Methoden:
  • Pflanzenmaterial
  • 5 g Ölrapssamen (Brassica napus) der Sorte Westar wurden in 1%igem Natriumhypochlorit für 10 Minuten sterilisiert. Nach mehreren Spülungen in sterilem Wasser wurden die Samen mit sterilem Wasser für 12 Stunden bei 4°C im Dunkeln gequollen, um die Keimung zu synchronisieren. Sie wurden auf nassem sterilem Whattman-Papier ausgesät und bei 25°C für 2 Tage im Dunkeln vor dem Ernten der Keimblätter kultiviert.
  • RNA-Extraktion und -Reinigung
  • Vollständige RNA wurde aus 2 Tage alten Ölrapssämlingen unter Verwendung der zuvor beschriebenen Cäsiumchloridmethode isoliert. Polyadenylierte RNA wurde aus 1 mg vollständiger RNA unter Verwendung eines "PolyATract mRNA Isolation System" (Promega) gemäß Herstellerempfehlungen gereinigt. Das System verwendet einen biotinylierten Oligo(dT)-Primer zur Hybridisierung mit hoher Effizienz in Lösung an die 3'-Poly(A)-Region der mRNAs. Die Hybride wurden dann eingefangen und mit hoher Stringenz unter Verwendung von an paramagnetische Partikel gekoppeltem Streptavidin und eines magnetischen Trennstranges vor der Elution mit Wasser gewaschen.
  • Konstruktion und Durchmusterung der cDNA-Bibliothek
  • Die Standard-Oligo(dT)-geprimte cDNA-Bibliothek und die spezifisch Cysteinprotease-geprimte Bibliothek wurden aus zwei Tage alter Ölraps-Poly(A)-RNA (5 μg) unter Verwendung eines lambda-"ZAP-cDNA® Synthesis Kit" (Stratagene) konstruiert. Die Herstellerempfehlungen wurden strikt befolgt, obwohl für die spezifische Bibliothek die reverse Transkription unter Verwendung einer Mischung aus zwei spezifischen Oligonukleotiden (CDNA8.401R) und CDNA8.387R) für die Klasse 1 bzw. für die Klassen 2 und 6 der RT-PCR-Klone verwendet wurde, modifiziert zum Einschluß eines XhoI-Ortes an ihrem 5'-Ende. Der zweite Strang wurde durch Nick-Translation unter Verwendung von DNA-Polymerase I nach Behandlung des Heteroduplex mit RNase H synthetisiert. Die cDNAs wurden mit Klenow aufgefüllt, an EcoRI-Adapter ligiert und mit XhoI vor der Größenfraktionierung an Sepharose®-400 Spin-Säulen (Pharmacia) und direktionaler Klonierung als EcoRI-XhoI-Insert in den Polylinker von pBluescript-Phagemid, enthalten innerhalb des Uni-ZAP-Vektorarms, verdaut. lambda-ZAP ist ein Austausch-lambda, das verändert wurde, um pBluescript-Phagemid zu enthalten, wobei der Polylinker zur Klonierung der cDNAs verwendet wird.
  • Figure 00230001
  • Die Bibliothek wurde in vitro unter Verwendung von Gigapack®II Gold Verpackungsextrakt (Stratagene) verpackt, auf die E. coli-Zellinie XL1-Blue MRF' ausplattiert und auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham) gemäß Herstellerempfehlungen übertragen. Die Markierung der Sonden, Hybridisierungen und Spülungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.
  • Ausgewählte lambda-ZAP-Klone wurden in vivo ausgeschnitten, um die klonierte cDNA als Phagemid in pBluescript SK- zu gewinnen. E. coli SolR-Zellen wurden mit dem rekombinanten lambda-ZAP und mit einem Helferphagen cotransfiziert, der die zur Synthese eines einzelnen Strangs von DNA notwendigen Proteine lieferte, die nach Ringbildung ein funktionelles Phagemid lieferten.
  • Analyse
    • a) Eine kleine Cysteinprotease-angereicherte spezifisch geprimte cDNA-Bibliothek, die 1.104 plaquebildende Einheiten (pfu) enthielt, wurde aus 2 Tage alten Ölrapskeimblättern erhalten. 5.103 pfu wurden auf drei replizierte Membranen ausplattiert und übertragen, um auf Kreuzhybridisierung zu überprüfen. Die Membranen wurden mit 3 Oligonukleotiden (CYS8.401MR, CYS8.402MR, CYS8.406MR) durchmustert, die dem 5'-Ende der Klassen 1, 2 bzw. 6 der RT-PCR-Klone zugewiesen und wie oben beschrieben markiert wurden.
  • Fünf ähnliche, aber unterschiedliche 5'-Ende-Cysteinprotease-cDNAs, die eine kurze 5'-untranslatierte Region und 650 bp der codierenden Region enthielten, wurden erhalten, in vivo ausgeschnitten und sequenziert. Sie fallen in Klasse 2 und Klasse 6, aber keine 5'-Ende-cDNA wurde für Klasse 1 gefunden. Obwohl Klone aus der Klasse 2 eng mit COT44-cDNA verwandt sind (Comai und Harrada, 1989), ist ihr 5'-Ende 160 bp länger. Dies weist darauf hin, daß COT44 46 Aminosäure (aa) fehlen, die dem Signalpeptid und einem Teil des Propeptids entsprechen. Die wird ferner durch 9 veranschaulicht, die die Angleichung der abgeleiteten Aminosäuresequenz der cDNA-Klone CYS2UP6, CYS2UP7 und CYS2UP8 aus Klasse 2 mit COT44 zeigt.
  • Zwei Oligonukleotide (CYS6B-UP und CYS6A-UP) wurden für die 5'-nichtcodierende Region der cDNAs aus Klassen 2 bzw. 6 geschaffen, um die Standard-Oligo(dT)-geprimte Bibliothek direkt auf Klone voller Länge zu durchmustern. Die vorläufige Sequenzangleichung der Klone miteinander und COT44 ist in 10 gezeigt.
    Figure 00240001
    • b) Eine repräsentative Oligo(dT)-geprimte cDNA-Bibliothek, die 1.107 pfu enthielt, wurde aus 2 Tage alten Ölraps-Keimblättern erhalten. Die Größe der Insertionen, abgeschätzt durch PCR, ist im Bereich von 0,75 bis 3 kb mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 1,5 kb. 1.106 pfu wurden auf drei replizierte Membranen ausplattiert und übertragen, um auf Kreuzhybridisierung zu überprüfen. Die Membranen wurden zuerst mit einem 5'-Ende-Oligonukleotid (CYS8.401MR, CYS6B-UP und CYS6A-UP) durchmustert, geschaffen für die 5'-Ende-codierende Region der Klasse 1-RT-PCR-Klone bzw. für die 5'-Ende-untranslatierte Region von Klasse 2- und Klasse 6-cDNAs, um
      Figure 00250001
      Klone voller Länge für Klasse 2 und 6 zu indentifizieren (Klasse 1, 20 Positive; Klasse 2, 250 Positives Klasse 6, 130 Positive).
  • Die gleichen Membranen wurden erneut mit den 3'-Ende-Sonden durchmustert, die für die entwicklungsmäßigen Northern-Blots verwendet wurden um sicherzustellen, daß die korrekte Form ausgewählt wurde. Für die Klassen 2 und 6 wurden Hybridisierungen unter Verwendung der 3'-nicht-codierenden Regionen durchgeführt, markiert durch PCR, um eine etwaige Kreuzhybridisierung zu vermeiden. Für Klasse 1 wurde ein Teil der codierenden Region als Sonde verwendet, weil eine nicht-codierende Region im RT-PCR-Klon nicht verfügbar war (Klassl, 84 Positive; Klasse 2, 205 starke Positive; Klasse 6, 85 starke Positive).
  • Ein Vergleich zwischen der Anzahl von identifizierten Klonen mit beiden spezifischen Sonden (5' und 3') bestätigte, daß die meisten der in der Bibliothek vorhandenen Cysteinprotease-cDNA-Klone die volle Länge haben.
  • Zehn Klone pro Klasse, die mit (5'- und 3'-Sonden) hybridisierten, aber nicht mit Sonden aus den zwei anderen Klassen kreuzhybridisierten, wurden plaquegereinigt, und vier Klone pro Klasse wurden in vivo ausgeschnitten. Sechs Cysteinprotease-cDNA-Klone voller Länge, die in die drei Klassen von Cysteinproteasen fallen, identifiziert aus der RT-PCR-Arbeit, wurden isoliert und vollständig sequenziert (zwei für Klasse 1, drei für Klasse 2 und eine für Klasse 6). Die Angleichung der cDNA-Klone ist in 11 gezeigt. Sie fallen in 3 Klassen von CP, verwandt mit der Papain-Superfamilie, und die Prä-Proenzyme teilen 52 % (Klasse 1), 90 % (Klasse 6) und 96 % Identität (Klasse 2) mit cot44. 12 bis 17 zeigen die Nukleinsäuresequenzen der Clone CDCYS12, CDCYS14, CDCYS22, CDCYS14, CDCYS25 bzw. CDCYS66. Die Peptidsequenzen wurden vorhergesagt und zeigten die charakteristischen Merkmale, die in den meisten der pflanzlichen Cysteinproteasen vorhanden sind, wie in 18 für Klone CDCYS12, CDCYS14, CDCYS22, CDCYS14, CDCYS25 und CDCYS66 gezeigt.
  • Beispiel 3 – Durchmusterung einer genomischen Ölraps-Bibliothek und Subklonierung und Charakterisierung der Promotorregionen
  • Oligonukleotidsonden wurden für die 5'-Ende-nicht-codierende Region eines cDNA-Klons pro Klasse erzeugt und zur Durchmusterung einer genomischen Bibliothek verwendet, um Klone zu isolieren, die die Promotorregionen tragen. Für jede Klasse wurden genomische Klone isoliert und der Promotor in ein Phagemid zur genaueren Charakterisierung und Deletion subkloniert.
  • Konstruktion und Durchmusterung der genomischen Bibliothek
  • Eine amplifizierte statistische genomische λEMBL-3-Bibliothek (Clontech) aus Ölraps (Brassica napus cv. Bridger) wurde konstruiert. DNA wurde partiell mit MboI verdaut und die Fragmente an einem Saccharosegradienten getrennt, um einen Größenbereich zwischen 8 und 22 kb zu erzeugen, bevor in den BamHI-Ort eines λEMBL-3-Austauschvektors kloniert wurde. Die Bibliothek wurde auf E. coli-Stamm LE392-Zellen ausplattiert. Durchmusterung und Plaqureinigung wurden wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben durchgeführt. Genomische Klone, die den drei Klassen von cDNAs entsprachen, wurden isoliert, und λDNA-Minipreps wurden unter Verwendung eines Protokolls von Grossberger (1987) durchgeführt. Genomische Klone wurden unter Verwendung ihrer Restriktionsfragmentlängenpolymorphie-(RFLP)-Muster kartiert: Klone wurden mit einem Satz von Restriktionsenzymen verdaut, an einem 0,8%igen Agarosegel analysiert und gleichzeitig auf zwei Membranen (Hybond N, Amersham) gemäß Sambrook et al. (1989) vor der Hybridisierung übertragen.
  • Analyse
  • Für die primäre Durchmusterung wurden 20 Genomäquivalente (2.106 pfu) auf drei replizierte Membranen ausplattiert und übertragen, um auf Kreuzhybridisierung zu überprüfen. Die Membranen wurden mit 3 Oligonukleotiden (CDNA12, CDNA25 und CDNA66) hybridisiert, geschaffen für das 5'-Ende der Klassen 1, 2 bzw. 6 der cDNA-Klone, um so nahe wie möglich an das Promotorgebiet zu gelangen (Klasse 1, 16 starke Positive; Klasse 2, neun starke Positive; Klasse 6, acht starke Positive). Keine Kreuzhybridisierung wurde zwischen den drei Klassen detektiert, und 10 Klone pro Klasse wurden für eine sekundäre Durchmusterung ausgewählt.
  • Figure 00260001
  • Die sekundäre Durchmusterung wurde unter Verwendung von 3'-Ende-PCR-Sonden wie im Zusammenhang mit 6 beschrieben durchgeführt, um spezifisch die genomischen Klone zu detektieren, die den RT-PCR-Klonen entsprachen, bewertet durch Northern Blots. Einige der Klone wurden nicht durch diese Sonden identifiziert (einer für Klasse 1 und zwei für Klasse 6), da diese wahrscheinlich kurze Klone in ihrem 3'-Ende waren, und da sie somit nützlich zur Promotorisolierung waren, wurden sie unter Verwendung der Sonden aus der primären Durchmusterung gerettet. Zehn Klone pro Klasse wurden durch zwei weitere Reinigungsdurchläufe unter Verwendung der Sonden aus der primären Durchmusterung plaquegereinigt. Zur Vermeidung redundanter Klone (amplifiziert, statistische Bibliothek), wurde DNA aus acht genomischen Klonen pro Klasse hergestellt und durch RFLP charakterisiert. Die Klone wurden mit SalI und BamHI geschnitten, an einem 0,8%igen Agarosegel analysiert, auf replizierte Membranen übertragen und mit zwei Sätzen von Sonden hybridisiert. Oligonukleotide wurden für die 5'-nichtcodierende Region (CDNA12, CYS6B-UP und CYS6A-UP) und für die Mitte der codierenden Region (CYS8.401MR, CYS8.406MR und CYS8.406MR) der cDNA-Klone CDCYS12, CDCYS25 bzw. CDCYS66 geschaffen.
  • Vier verbleibende Klone pro Klasse (12g4, 12g5, 12g6, 12g8; 25g2, 25g4, 25g5, 25g7; 66g1, 66g4, 66g8 und 66g9) wurden weiter unter Verwendung einer weiteren Runde von Verdauung/Hybridisierung charakterisiert.
  • Klasse 1-cDNAs enthalten einen BglII-Ort 500 bp entfernt vom Translationsstart, und Klasse 2- und 3-cDNAs enthalten einen HindIII-Ort 300 bp entfernt vom Translationsstart, und diese Enzyme wurden in Verbindung mit und ohne SalI verwendet, das das Insert freisetzt, um zur Subklonierung geeignete genomische Fragmente zu erzeugen. PCR-Experimente wurden an genomischer DNA und cDNAs durchgeführt, um die Größe des Promotorgebiets durch Identifizierung mutmaßlicher Introns vorherzusagen. PCR unter Verwendung eines Vorwärtsprimers in der 5'-nicht-codierenden Region und eines reversen Primers, der sich nach den BglII- und HindIII-Restriktionsorten befand, zeigte die Gegenwart eines 400 bp-Introns innerhalb der ersten 600 bp der Klasse 1-cDNAs, während kein Intron innerhalb der ersten 300 bp von Klasse und Klasse 6 vorhanden war. Promotorfragmente mit einer vorhergesagen Größe im Bereich von 2 bis 5 kb wurden für einen genomischen Klon pro Klasse identifiziert (12g6, 2587 und 66g1), fertig zur Subklonierung in pBluescript KS+.
  • Beispiel 4 – Charakterisierung der Transkriptionsstartpunkte
  • Genomische lambda-Fragmente, die den Promotor enthalten, wurden in pBluescript KS+ zur genaueren Charakterisierung subkloniert. Die Sequenzierung erlaubte die Identifizierung mutmaßlicher Transkriptionssignale vor der Kartierung des tatsächlichen Transkriptionsstarts durch Primerverlängerungsexperimente. Dies beinhaltete die Verlängerung eines markierten reversen Primers, der in einem Gebiet nahe dem Translationsstart geschaffen war. Nach Abbau der RNA-Matrize wurden die Verlängerungsprodukte in einem Polyacrylamidgel nach Größe aufgetrennt.
  • Analyse
  • Genomische Fragmente, die den Promotor enthalten, wurden in pBluescript als BglII-2,6 kb-Insert subkloniert, kloniert in BamHI für Klasse 1 (pKS12P6), als HindIII-4,2 kb-Insert für Klasse 2 (pKS25P7) und als BamHI-HindIII-2,4 kb-Insert für Klasse 6 (pKS66P1). Die Sequenzierung mit pUC1- und pUC4-Vektoroligonukleotiden und mit zwei internen reversen Primern, geschaffen für das 5'-Ende der cDNAs (CDNA14R für Klasse 1 und CDNA66R für Klasse und 6), erlaubte die Orientierung der Klone und die Identifizierung mutmaßlicher Transkriptionssignale (Pautot et al., 1989). Die vollständige Nukleotidsequenz der Promotoren aus den subklonierten genomischen Fragmenten ist in 19, 20 und 21 für Klasse 1, 2 bzw. 6 angegeben.
  • Figure 00280001
  • Transkriptionsstartorte wurden präzise durch Primerverlängerungsexperimente gemäß Sambrook et al. (1989), modifiziert wie folgt, kartiert. Die für die Klasse 1, 2 bzw. 6 geschaffenen Oligonukleotide (CYSGE12R, CYSGE25R und CYSGE66R) wurden durch terminalen Austausch wie zuvor beschrieben markiert. Vollständige RNA (50 μg), isoliert aus 3 Tage alten Ölrapskeimblättern unter Verwendung der Cäsiumchloridmethode, wurde zusammen mit 2 ng Primer ausgefällt und in 30 μl Hybridisierungspuffer [1 mM EDTA; 400 mM NaCl; 40 mM Pipes, pH 6,4; 70 % (V/V) entionisiertes Formamid] resuspendiert. Das Wiederverschmelzen wurde über Nacht bei 32°C nach Denaturieren bei 85°C für 10 Minuten durchgeführt. Nach Ausfällung und Resuspension in 25 μl reversem Transkriptionspuffer [50 mM KCl; 10 mM MgCl2; 1 mM dNTPs; 1 U/μl RNase-Inhibitor] wurden die Primer für 90 Minuten bei 42°C mit 2,5 U MuLV reverser Transkriptase (Perkin-Elmer) verlängert. Matrizen-RNA wurde für 30 Minuten bei 37°C mit 20 U RNase (RNace-it, Stratagene) abgebaut. Für jede Klasse wurden die Verlängerungsprodukte an einem denaturierenden Polyacrylamidgel parallel zu einer Sequenzierungsreaktion analysiert, die an den genomischen Klonen (pKS12P6, pKS25P7 und pKS66P1) durchgeführt wurde, wobei die gleichen Primer wie für die Primerverlängerung verwendet wurden.
  • Figure 00290001
  • Wie in 22 gezeigt wird, ist der Klasse 1-Transkriptionsstart in einem guten Zusammenhang [t27T35C49A78a18C45g8%] verglichen mit 49 anderen Pflanzengenen, die von Pautot et al. (1989) zusammengestellt wurden. Konservierte Nukleotide sind in Großbuchstaben, wichtige in Fettschrift, und der Transkriptionsstartpunkt ist unterstrichen. Dieser Transkriptionsstart wurde 22 Nukleotide stromabwärts einer mutmaßlichen TATA-Box kartiert, die sich 179 Nukleotide vor dem Translationsstart und 152 Nukleotide stromaufwärts der längsten cDNA befindet.
  • Obwohl die Konsensussequenz für die TATA-Box nicht optimal ist [c34a18t32t34a3A97T90A94a47A95a30A71G44%] verglichen mit 79 anderen Pflanzengenen, die von Pautot et al. (1989) zusammengestellt wurden, ist dieses Ergebnis eine Bestätigung des vorhergehenden Primerverlängerungsexperiments unter Verwendung eines Oligonukleotids, das 34 Nukleotide stromabwärts des ATG primt. Der Abstand zwischen dem Transkriptionsstart und der längsten cDNA könnte durch die Gegenwart eines Introns innerhalb der 5'-untranslatierten Region oder durch die Existenz eines alternativen Transkriptionsstartpunktes erklärt werden.
  • Der Klasse 2-Transkriptionsstart ist in einem guten Zusammenhang [a18a20a22A78T49C45A43%] und wurde 33 Nukleotide nach einer mutmaßlichen TATA-Box lokalisiert, was sehr gut in die pflanzliche Konsensus-Sequenz paßt [T37g11g14t34T96A97T90A94a47A95T63A71G44%]. Dies entspricht 53 Nukleotiden vor dem Translationsstart und 26 Nukleotiden stromaufwärts der cDNA (22).
  • Der Klasse 6-Transkriptionsstart ist benahe im gleichen Zusammenhang wie Klasse 2 [g18a20a22A78T49C45A43%] und wurde 30 Nukleotide nach einer mußmaßlichen TATA-Box lokalisiert, wobei genau die gleiche Konsensussequenz wie für Klasse 2 gezeigt wurde. Dies entspricht 51 Nukleotiden vor dem Translationsstart und 19 Nukleotiden stromaufwärts der cDNA (22).
  • Beispiel 5 – Promotorausschneidens
  • Vor der Fusion mit den Reportergenen müssen die Promotoren genau zwischen dem Transkriptionsstart und dem Translationsstart ausgeschnitten werden. Da kein nützlicher Restriktionsort für die genomischen Klone der Klasse 2 und 6 verfügbar war, wurde ein Ort in ein PCR-Fragment konstruiert, das zum Austauschen eines entsprechenden endogenen Fragments verwendet wurde.
  • Analyse
  • Ein HindIII-Ort wurde durch PCR am genomischen Klasse 1-Klon eingeführt, 2 Nukleotide vor dem Translationsstart, um den verbleibenden Teil der codierenden Region zu eliminieren. Das 270 bp-Fragment wurde durch 15 Durchläufe von PCR an pKS12p6-DNA unter Verwendung von CYSGE12C- und CYSGI2CR-Oligonukleotiden erzeugt.
  • In der gleichen Weise wurde ein BamHI-Ort vor dem Translationsstart von genomischen Klonen der Klasse 2 und der Klasse 6 unter Verwendung von 2 Sätzen von Oligonukleotiden (CYSGE25C, CYSG25CR und CYSGE66C, CYSG66CR) an pKS25p7- bzw. pKS66p1-DNA eingeführt, um ein 165 bp-Fragment zu erzeugen.
  • Für Klasse 1 wurde pKS12p6 mit BsmI und HindIII geschnitten und aus Gel gewonnen, um ein 900 bp-Fragment auszuschneiden, vor Austausch mit dem PCR-Fragment, geschnitten durch BsmI und HindIII, um pKS12P zu erzeugen.
  • Für Klasse 2 wurde pKS25p7 mit SphI und BamHI geschnitten, aus Gel gewonnen zum Ausschneiden eines 460 bp-Fragments und ligiert an das Austausch-PCR-Fragment, geschnitten durch SphI und BamHI, um pKS25P zu erzeugen.
  • Für Klasse 6 wurde pKS66p1 mit HindIII geschnitten, mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt, mit SphI geschnitten und aus Gel gewonnen, um ein 440 bp-Fragment auszuschneiden. Das PCR-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft, mit SphI geschnitten und in das deletierte pKS66p1 kloniert, um pKS66P zu erzeugen.
  • Figure 00300001
  • Beispiel 6 – Promotor-GUS-Konstrukte
  • Zur Bewertung der räumlichen und zeitlichen Regulierung der klonierten Promotorregionen in einem heterologen System und unter unterschiedlichen biotischen und Umweltbedingungen wurden sie zum Antreiben eines Reportergens in Tabak verwendet. Transkriptionelle Fusionen zwischen jedem Promotorfragment und dem β-Glucuronidase-(GUS)-Gen wurden für Pflanzenassays und die histochemische Lokalisierung konstruiert. Zur Vermeidung von Zweifeln wird ein Reportergen hier nur der Zweckmäßigkeit halber und zum Aufzeigen der beteiligten Prinzipien verwendet. In Nicht-Testsituationen wird das durch den Promotor der vorliegenden Erfindung kontrollierte Gen dasjenige sein, daß die gewünschte Wirkung erzeugt.
  • Plasmidkonstruktion
  • Standardmäßige rekombinante DNA-Verfahren wurden in der Konstruktion von Plasmidvektoren eingesetzt (Sambrook et al., 1989). Das CP12 HindIII-NotI-1,7 kb-Promotorfragment wurde aus pKS12P ausgeschnitten, mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt und in den SmaI-Ort des Agrobacterium Ti-Vektors pTAK1 ligiert, der das E, coli uidA-Gen enthält, das R-Glucuronidase codiert (Jeffersen et al., 1987), um einem binären pTAKCP12-Vektor zu erzeugen. In der gleichen Weise wurden CP25 HindII-BamHI-3,7 kb- und CP66 BamHI-1,9 kb-Promotorfragmente aus pKS25P bzw. pKS66P ausgeschnitten und in mit den gleichen Enzymen geschnittenes pTAK1 ligiert, um die binären pTAKCP25- pTAKCP66-Vektoren zu erzeugen. Alle Konstrukte wurden in den E. coli-Stamm DHSα als intermediären Wirt für die Vektorkonstruktion transformiert. Die Struktur der resultierenden chimären Reportergenkonstrukte wurde durch PCR, Restriktionsverdau und Sequenzanalyse verifiziert. 23 zeigt ein Schema für die Konstrukte zur Pflanzentransformation.
  • Pflanzentransformation
  • Die Plasmide pTAKCP12, pTAKCP25 und pTAKCP66 wurden in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 unter Verwendung des von Holsters et al. (1978) beschriebenen Gefrier/Auftau-Verfahrens übertragen. Tabak- (Nicotiana tabacum var. Samsun)-Transformanten wurden durch das Blattscheibenverfahren (Bevan, 1984) erzeugt. Schößlinge wurden auf Medium regeneriert, das 100 mg/l Kanamycin und 200 mg/l Carbenicillin enthielt. Nach der Bewurzelung wurden die Jungpflanzen in das Gewächshaus überführt und unter Bedingungen von 16 h Licht/8 h Dunkelheit kultiviert.
  • Ergebnisse
    Figure 00310001
  • Analyse der primären Transformanten
  • Aufgabe
  • Primäre Transformanten wurden zuerst durch Polymerasekettenreaktion (PCR) analysiert, um die Anzahl von Pflanzen zur Analyse zu reduzieren und sicherzustellen, daß sie die intakte Promotor-Reportergen-Kassette enthielten.
  • Da Promotoren in Kallus dereguliert werden können, wurde die GUS-Analyse an Kalli aus der Transformation durchgeführt um sicherzustellen, daß die Promotoren nicht aktiv in diesem Stadium sind, da dies eine nachteilige Wirkung auf die zukünftige Transformationseffizienz hätte haben können, abhängig von der Natur des Transgens (z.B. falls ein Barnaseribunuklease-Gen durch einen dieser Promotoren angetrieben wird). Die Promotoraktivität wurde auch in jungen Blättern aus primären Transformanten bewertet, um die Abwesenheit von ektopischer Expression in diesem Stadium zu bestätigen.
  • Polymerasekettenreaktion
  • Genomische DNA zur PCR-Analyse von transgenen Pflanzen wurde gemäß Edwards et al. (1992) hergestellt. Pflanzenextrakt-DNA (2,5 μl) wurde amplifiziert [heißer Begin bei 80°C; (94°C, 1 min; 63°C, 1 min; 72°C, 1 min) × 35 Zyklen; (72°C, 7 min) × 1 Zyklus] unter Verwendung von 2 U Taq-Polymerase (Gibco BRL) in einer 25 μl-PCR-Reaktion [200 μM dNTPS; 3 mM MgCl2; 1 μM Oligonukleotide; 1X PCR-Puffer].
  • Ergebnisse
  • Insgesamt 37 individuelle Transformanten pro Klasse wurden zufällig aus einer in-vitro-Kultur von 12CP-, 25CP- und 66CP-Explantaten gepickt und mit 2 Sätzen von Primern analysiert. Der erste Satz enthielt einen für das 5'-Ende des NOS-Terminators des NPTII-Gens spezifischen Primer (NOSTER1) und einen für das 5'-Ende der klonierten Promotoren (CYSGE12R, CYSGE25R oder CYSGE66R) spezifischen reversen Primer. Der zweite Satz enthielt einen für das 3'-Ende der Promotoren spezifischen Primer (CYSGE12C, CYSGE25C oder CYSGE66C) und einen für den 5'-Teil des GUS-Gens spezifischen reversen Primer (GUSlR). Insgesamt 34 Explantate wurden als doppelt PCR-positiv für Klasse 6 gefunden (94 % der untersuchten Pflanzen), während für Klasse 1 und Klasse 2 nur 27 Pflanzen das erwartete Ergebnis ergaben (73 % der untersuchten Pflanzen). Pflanzen, die die intakte Kassette enthielten, wurden in das Gewächshaus überführt und selbstbestäubt.
  • Figure 00330001
  • GUS-Enzymassays
  • Fluorimetrische Assays auf GUS-Aktivität, durchgeführt mit dem Substrat 4-Methylumbelliferyl-D-glucuronid (Sigma), wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer LS-35-Fluorometers (Jefferson et al., 1987) durchgeführt. Die Proteinkonzentration von Gewebehomogenaten wurde durch den Bio-Rad-Proteinassay (Bradford, 1976) bestimmt.
  • Ergebnisse
  • GUS-Assays wurden für jede Klasse an 20 regenerierenden Kalli durchgeführt, die aus dem Transformationsprozeß resultierten. Tabakextrakte aus Blättern vom Wildtyp und Kallus sowie aus Blättern aus transgenen 355-GUS-Pflanzen wurden als negative bzw. positive Kontrollen verwendet. Wie in 24 gezeigt ist, konnte keine signifikante GUS-Aktivität in Kalli detektiert werden, verglichen mit den in Blättern aus den 35S-GUS-Pflanzen vorhandenen Niveaus.
  • 25 zeigt eine vorläufige Bewertung der Niveaus von GUS-Aktivität in jungen Blättern aus primären Transformanten jeder Klasse. Die Ergebnisse zeigen, daß die Promotoren in diesem Stadium nicht aktiv sind. Dies ist eine Bestätigung der für die Klasse 2 und 6 erhaltenen Northern-Blot-Ergebnisse, aber widerspricht denjenigen für Klasse 1 (6). Klasse 1-CP zeigte etwas Expression in Blättern, aber es wird angenommen, daß dies auf einem Kreuzhybridisierungsproblem aufgrund der Natur der Sonde beruht. Das GUS-Ergebnis schien die letztere Hypothese zu bestätigen.
  • Analyse von aufspaltenden Populationen
  • Aufgabe
  • Die Aufgabe bestand darin, für jede Klasse vier GUS-exprimierende Linien im Bereich von niedrigen Expressoren bis hin zu hohen Expressoren zu selektieren, vorzugsweise aus Linien mit einer Einzellocusinsertion des Transgens, da dies die Vergleiche zwischen den Linien erleichtert. Die Anzahl von Loci in den primären Transformanten wird durch die Aufspaltung des NPTII-(Kanamycinresistenz)-Gens in der Nachkommenschaft abgeschätzt.
  • Aufspaltungstest
  • Samen wurden in 10 % Bleiche für 15 min sterilisiert. Nach mehreren Spülungen in sterilem Wasser wurden ca. 150 Samen auf 1/2 MS-Medium (2,3 g/1 MS-Salz, 1,5 % Saccharose, 0,8 % Bactoagar, pH 5,9), das 100 mg/l Kanamycin enthielt ausgesät. Die Samen wurden für drei Wochen bei 26°C mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit vor der Bewertung kultiviert. Falls die primären Transformanten eine Kopie des Transgens enthielten, betrug das erwartete Verhältnis für kanR- zu kanS-Samen 3 bis 1 (obwohl in sehr seltenen Fällen ein Locus möglicherweise mehrere Transgene enthalten könnte).
  • Ergebnisse
  • Eine substantielle Anzahl von Pflanzen zeigen einem Petaloidie-Phänotyp, worin in einem variablen Anteil der Blüten in einer Pflanze ein oder mehrere normale Staubblätter durch Blütenblätter ersetzt sind. Einige dieser Pflanzen war so schlimm betroffen, daß wir keine Samen gewinnen konnten.
  • Die nachfolgende Tabelle faßt die genetischen Daten für die primären Transformanten zusammen.
  • Figure 00340001
  • Vorläufiges Zeitverlaufsexperiment
  • Die Northern Blot-Ergebnisse zeigten eine Anreicherung von CP-mRNA in Ölraps 2 bis 3 Tage nach der Samenquellung (DAI). Jedoch kann sich die heterologe Expression in Tabak von der endogenen Expression in Ölraps aufgrund von Unterschieden in der Physiologie und im Transkriptionsmechanismus unterscheiden. Außerdem wurde die Aktivität des Promotors indirekt durch ein Reporterprotein analysiert, das die Detektion verzögert. Somit mußte der Zeitverlauf der GUS-Expression aus jedem Promotor ermittelt werden, um herauszufinden, zu welchem Zeitpunkt alle F1-Generationen analysiert werden sollten.
  • Ergebnisse
  • Das Experiment wurde an zwei zufälligen Linien pro Klasse sowie an Wildtyp- und 35S-GUS-Kontrollinien durchgeführt. Für jeden Zeitpunkt wurden 40 Samen der Linien 12CP5, 12CP14, 25CP8, 25CP13, 66CP8 und 66CP76 sowie der Kontrollen bei 26°C mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit auf Platten kultiviert, die 1/2 MS-Medium enthielten. Proben wurden von den Sämlingen zum Zeitpunkt 0, 2, 4, 6, 8, 10, 29 und 36 DAI entnommen und bei –70°C gelagert. Zum Zeitpunkt 0 bis 10 DAI wurden die 10 kleinsten Sämlinge gesammelt, während nur 5 bei 29 und 36 DAI entnommen wurden, was die Variabilität innerhalb dieser Proben erhöhte.
  • In Tabaksämlingen, die unter den oben beschriebenen Bedingungen kultiviert wurden, zeigten drei Linien von 6 eine Induktion der GUS-Expression während der Keimung (26). Die Aktivität besaß einen Spitzenwert bei etwa 30 DAI, obwohl die Proteinanreicheurng eindeutig bei 8 DAI begann. Somit sollten die F1-Generationen bei 14 und 28 DAI bewertet werden, um eine Reihe von GUS-Expressoren zu identifizieren. Das Maximum der Aktivität war ca. 5 % von 35S-GUS in der am besten exprimierenden Linie (12CP5), obwohl der relativ hohe Expressionsgrad in Blättern nahelegt, daß dies aufgrund eines Positionseffekts des Transgens sein könnte. Normale Expressionsgrade liegen wahrscheinlicher bei etwa 1 % von 35S-GUS.
  • Identifizierung von stark GUS-exprimierenden Linien während der Keimung
  • Ergebnisse
  • Sämlinge wurden auf 1/2 MS-Medien, ergänzt mit 100 mg/l Kanamycin, unter den zuvor beschriebenen Bedingungen kultiviert. Fünf Sämlinge wurden bei 0 (trockene Samen), 14 (2 ausgebreitete Blätter) und 28 DAI (4 ausgebreitete Blätter) geerntet, vereinigt und in doppelter Ausführung wie zuvor beschrieben bewertet.
  • Die 27, 28 und 29 fassen die Expressionsgrade für die Klasse 1, 2 bzw. 6 zusammen. Diese vorläufigen Daten legen nahe, daß die Promotoren in einer sämlingsspezifischen Weise in Tabak exprimiert werden. wie aus der RNA-Untersuchung in Ölraps erwartet wird, sind die Expressionsgrade gering. Das Klasse 2-Promotorfragment ist aktiver als Klasse 1 in diesem Stadium, während Klasse 6 extrem geringe Expressionsgrade ergibt.
  • Histochemische GUS-Detektion
  • Die histochemische GUS-Anfärbung von ganzen Sämlingen wurde durch Vakuumtränkung mit einer Lösung erreicht, die 1 mM X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-glucuronid), 100 mM NaPO4 pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 mM K3Fe(CN)6, 0,5 mM K4Fe(CN)6, 0,1 % Triton X-100 und 0,1 % DMSO enthielt. Nach 12 h Inkubation bei 37°C wurden intakte Sämlinge photographiert. Alternativ wurden angefärbte Sämlinge mit Tissue-Tek OCT-Verbindung vor dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff vakuumgetränkt. Ein klares Kryostat-Mikrotoom (Modell 5030) wurde zum Schneiden von 20 μm-Schnitten bei –23°C verwendet.
  • Andere Modifikationen der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten ohne Abweichen vom Umfang der Erfindung ersichtlich sein.
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Claims (27)

  1. Verfahren zum Exprimieren eines Gens, umfassend das funktionsfähige Binden einer DNA-Sequenz, die einen Cysteinprotease-Genpromotor umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen der 19, 20 oder 21 besteht, an das Gen, so dass das Gen nur nach Saatkeimung exprimiert wird.
  2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Promotor die DNA-Sequenz von 19 umfasst.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Promotor die DNA-Sequenz von 20 umfasst.
  4. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Promotor die DNA-Sequenz von 21 umfasst.
  5. Rekombinantes DNA-Konstrukt, bei Verwendung in einem Verfahren gemäss Anspruch 1, umfassend einen Promotor, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen der 19, 20 oder 21 besteht, funktionsfähig gebunden an ein Gen.
  6. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 5, wobei das Konstrukt in einer Pflanze funktionell ist, worin das Gen ein Unterbrecher-Gen ist, das ein Produkt codiert, das die Zellfunktion unterbrechen kann, wobei das Unterbrecher-Gen funktionell an eine extern regulierbare Genkontrollregion gebunden und durch sie kontrolliert wird, die einen Promotor einschliesst, der durch die äussere Anwendung eines chemischen Induktors induzierbar ist.
  7. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 6, worin der induzierbare Promotor funktionell an ein Repressorprotein-Gen gebunden ist und dieses kontrolliert, und worin der Unterbrecher-Genpromotor eine Operatorsequenz einschliesst, die durch das Repressorprotein erkannt wird, so dass in Gegenwart des Induktors das Repressorprotein erzeugt wird, das mit der Operatorsequenz wechselwirkt, um dadurch den zweiten Promotor zu inaktivieren und die Expression des Unterbrecher-Gens zu inhibieren.
  8. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 6 oder 7, worin das Unterbrecher-Gen eine Nukleotidsequenz ist, die in der sense-Orientierung zu einem endogenen Pflanzengen, das wesentlich für die Pflanzenentwicklung ist, oder zu einem Gen ist, das eine gewünschte Eigenschaft auf die Pflanze überträgt, oder eine partielle sense-Sequenz des endogenen Pflanzengens umfasst.
  9. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 6 oder 7, worin das Unterbrecher-Gen eine Nukleotidsequenz ist, die in der antisense-Orientierung zu einem endogenen Pflanzengen, das wesentlich für die Pflanzenentwicklung ist, oder zu einem Gen ist, das eine gewünschte Eigenschaft auf die Pflanze überträgt.
  10. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 8 oder 9, worin das endogene Pflanzengen wesentlich für die Saatkeimung oder frühe Sämlingsentwicklung ist.
  11. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 6 bis 10, worin die extern regulierbare Genkontrollregion eine chemisch induzierbare Genpromotorsequenz aus dem Glutathion S-Transferasesystem, dem Alc-System oder dem Ecdyson-System ist.
  12. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 8 bis 11, worin das Repressorprotein-Gen einen bakteriellen Repressor codiert.
  13. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 12, worin das Repressorprotein-Gen den Lac-Repressor oder einen von 434-, P22- oder lambda-Bakteriophagen verwendeten Repressor codiert.
  14. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 6 bis 13, worin das Unterbrecher-Gen oder der Unterbrecherpromotor einen "Pseudo-Operator" enthält.
  15. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 6 bis 14, worin das Unterbrecher-Gen ein cytotoxisches Gen ist.
  16. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 6 bis 14, worin das Unterbrecher-Gen eine Rekombinase oder Transposase codiert, die angepasst ist, um eine Nukleotidsequenz auszuschneiden, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen flankiert wird.
  17. Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 5 bis 16, worin das Konstrukt in dem Gewebe oder den Geweben eines keimenden Sämlings oder eines sich entwickelnden Korns oder einer Pflanze exprimiert werden kann, wenn das Konstrukt innerhalb der genomischen DNA des Korns oder des Sämlings oder der Pflanze integriert ist, bevorzugt stabil integriert ist.
  18. Expressionssystem für das Gewebe oder die Gewebe eines Pflanzenmaterials, wobei das Expressionssystem ein interessierendes Gen umfasst, fusioniert an einen Genpromotor, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen der 19, 20 oder 21 besteht, worin das Expressionssystem in dem Gewebe oder den Geweben des Pflanzenmaterials exprimiert werden kann.
  19. Expressionssystem gemäss Anspruch 18, worin das Expressionssystem zumindest für das Gewebe eines keimenden Sämlings oder eines sich entwickelnden Korns oder einer Pflanze ist.
  20. Expressionssystem gemäss Anspruch 18 oder 19, worin das Expressionssystem innerhalb der genomischen DNA eines keimenden Sämlings oder der genomischen DNA eines sich entwickelnden Korns oder der genomischen DNA einer Pflanze integriert ist, bevorzugt stabil integriert ist.
  21. Expressionssystem, das ein Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst.
  22. Rekombinantes Pflanzengenom, das ein rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 5 bis 17 oder ein Expressionssystem gemäss einem der Ansprüche 18 bis 21 umfasst.
  23. Pflanze, Pflanzensamen oder Pflanzenzelle mit einem rekombinanten Pflanzengenom gemäss Anspruch 22.
  24. Geschütztes Pflanzenkeimplasma, das eine Pflanze umfasst, die ein rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 5 bis 17 umfasst.
  25. Pflanze oder Samen, die/der zur Reife wachsen kann, umfassend ein rekombinantes DNA-Konstrukt gemäss einem der Ansprüche 5 bis 17.
  26. Verwendung eines Genpromotors, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen der 19, 20 oder 21 besteht, zur Induzierung der Expression eines interessierenden Gens bei Fusion an den Genpromotor in dem Gewebe oder den Geweben eines Pflanzenmaterials.
  27. Verwendung gemäss Anspruch 26, worin der Genpromotor zur Induzierung der Expression eines interessierenden Gens bei Fusion an den Genpromotor in wenigstens dem Gewebe oder den Geweben eines keimenden Sämlings oder eines sich entwickelnden Korns oder einer Pflanze verwendet wird.
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