KR20000004915A - 오일 평지씨로부터 얻어지는 시스테인 프로테아제 촉진유전자및 식물 생식질의 함유 방법 - Google Patents

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이안 젭슨
앤드류 제임스 그린랜드
디디에 르네 필립 토마스
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사라 엔 람베쓰
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Abstract

본 발명은 기술한 부류 1, 2 또는 6의 오일 평지씨 시스테인 프로테아제 촉진유전자의 DNA 서열을 포함하는 촉진유전자에 관한다. 상기 촉진유전자는 최소한 발아하는 묘종 또는 생장하는 곡물 또는 식물의 조직 또는 조직들(예를들어 뿌리, 떡잎, 잎 및 줄기)에 대한 발현 시스템에 사용할 수 있을 것이다. 바람직한 구체예에서, 발현 시스템은 본 발명 촉진유전자에 융합된 파괴유전자를 포함한다.

Description

오일 평지씨로부터 얻어지는 시스테인 프로테아제 촉진유전자 및 식물 생식질의 함유 방법
본 발명은 촉진유전자 및 이를 함유하는 구조물에 관한다. 본 발명은 또한 식물 생식질의 함유 방법에 관한다.
특히 본 발명은 식물의 특정 조직 또는 조직들에서 대상 유전자(GOI)의 발현을 위한 촉진유전자의 사용에 관한다.
더 구체적으로 본 발명은 시스테인 프로테아제용 촉진제에 관한다. 본 발명은 또한 식물의 특정 조직 또는 조직들에서 GOI를 발현시키기 위하여 이들 시스테인 프로테아제 촉진유전자를 가하는 것에 관한다.
촉진유전자는 전사의 정도를 조정함으로써 유전자의 공간적 및 시간적 발현을 조절한다. 유전공학적으로 얻어지는 농작물에 대한 초기 방법은 이질적인 유전자의 발현을 유도하기 위하여 강한 구성 촉진유전자를 이용하였다. 식물 생명공학에서의 방법이 더 정교해짐에 따라 특정 생장 단계 또는 특정 조직으로의 표적 트랜스진(transgene) 발현에 대한 특이 촉진유전자가 필요하다.
시스테인 프로테아제는 식물(Praekelt등, 1988; Goetting-Minesky 및 Mullin, 1994), 동물(Wiederanders등, 1992) 및 원생동물(Mallinson등, 1994)에서 대형 멀티진(multigene) 군의 멤버이다. 시스테인 프로테아제는 비활성 전구체로서 합성된다(Praekelt등, 1988). 프리-프로-엔자임은 분비경로로 표적되고(Marttila등, 1995) 프로펩티드 단편의 단백질 절단에 의하여 액포내에서 전사후 가공되어 활성 효소가 만들어진다(Hara-Nishimura등, 1993 및 1994).
식물 시스테인 프로테아제는 생리학적으로 중요한 상이한 대사에 참여한다. 종자 발아 및 식물 노화시 이들은 단백질 분해에 포함되어(Jones등, 1995; Valpuesta등, 1995; Smart등, 1995) 발아시 단백질 저장 유통에 주요한 역할을 한다(Boylan 및 Sussex, 1987). 종자 발달시 시스테인 프로테아제는 단백질 전구체의 그 성숙한 형태로의 후-번역 발달을 촉매한다(Hara-Nishimura등, 1995). 또한 지베렐산(Koehler 및 Ho, 1990; Watanabe등 1991) 또는 에틸렌(Cervantes등, 1994; Jones등 1995) 에 의하여 호르몬 조절된다. 다른것들은 상처(Linthorst등, 1993; Lidgett등, 1995), 탈수(Guerrero등, 1990), 추위(Schaffer 및 Fischer, 1988)와 같은 스트레스에 대한 응답으로 유도되며 식물-세균 상호작용에 관련된다(Goetting-Minesky 및 Mullin, 1994).
발아 특이 시스테인 프로테아제는 보리(Marttila등, 1995), 쌀(Watanabe등, 1991), 옥수수(Debarros 및 Larkins, 1994), 이집트콩(Cervantes등, 1994), 살갈퀴(Becker등, 1994)에 대하여 특화되어왔고 오일 평지씨(Comai 및 Harada, 1989)에 대하여 기술되어 왔다. 오일 평지씨에 대하여 공개된 데이터는 모순되어 있다. 또한 이 종은 이배성으로 인하여 연구하기 어렵다. cDNA 라이브러리의 감별 스트리닝 또는 감별 디스플레이 기법과 같은 더 종래의 실험실적 기법을 사용하는 것보다는 발아 종자에서 발현되는 오일 평지씨내 확인되지 않은 잠재 발생 클론, 즉 시스테인 프로테이나제(시스테인 프로테아제)가 연구되었다. 종자 발아 후 독특하게 발현되는 유전자로부터 얻은 촉진유전자를 분리하여 특성화하였다.
따라서, 본 발명의 제1의 양상은 부류 1, 2 또는 6의 오일 평지씨 시스테인 프로테아제 촉진유전자를 제공한다.
본 발명의 제2의 양상은 도 19, 20 또는 21에 도시된 바와 같은 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동성을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하는 촉진유전자를 제공한다.
본 발명의 제3의 양상은 본 발명 촉진유전자의 특질적인 특색 또는 특징을 가지는 촉진유전자를 제공한다.
본 발명의 제4의 양상은 대상 단백질의 유전암호를 지정하는 유전자에 조작하기 용이하도록 결합된 상기 정의한 바와 같은 촉진유전자를 포함하는 재조합 DNA 구조물을 제공한다.
본 발명의 제5의 양상은 세포 작용을 파괴할 수 있는 생성물을 암호화하는 파괴유전자 및 상기 정의된 바와 같은 촉진유전자를 포함하는 식물내 작용하는 재조합 DNA 구조물을 제공하는데 상기 파괴유전자는 화학적인 유도체를 외부적으로 가하여 유도할 수 있는 촉진유전자를 포함하는 외부적으로 통제가능한 유전자 조절 영역에 의하여 관능적으로 결합되거나 조절된다.
본 발명의 제6의 양상은 도 12, 13, 14, 15, 16 또는 17에 도시된 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동성을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하며 시스테인 프로테아제의 유전암호를 지정하는 DNA를 제공한다.
본 발명의 제7의 양상은 촉진유전자에 조작하기 용이하게 결합되어 있는 상기 정의된 바와 같은 DNA를 포함하는 식물에서 작용하는 재조합 DNA 구조물을 제공한다.
본 발명의 제8의 양상은 식물 재료의 조직 또는 조직들에서 발현될 수 있으며 상기 정의된 바와 같은 유전자 촉진유전자에 융합된 해당 유전자를 포함하는, 식물 재료의 조직 또는 조직들을 위한 발현 시스템을 제공한다.
본 발명의 제9의 양상은 상기 정의한 바와 같은 구조물을 포함하는 발현 시스템을 제공한다.
본 발명의 제10의 양상은 상기 정의한 바와 같은 촉진유전자, 상기 정의한 바와 같은 DNA, 상기 정의한 바와 같은 재조합 DNA 구조물 또는 상기 정의한 바와 같은 발현 시스템을 포함하는 재조합 식물 게놈을 제공한다.
본 발명의 제11의 양상은 상기 정의한 바와 같은 재조합 식물 게놈을 가지는 식물, 식물 종자 또는 식물 세포를 제공한다.
본 발명의 제12의 양상은 상기 정의한 바와 같은 재조합 DNA 구조물을 포함하는 보호된 생식질을 제공한다.
본 발명의 제13의 양상은 상기 정의한 바와 같은 재조합 DNA 구조물을 포함하는 성숙시까지 생장할 수 있는 식물 또는 종자를 제공한다.
본 발명의 제14의 양상은 식물 재료의 조직 또는 조직들내에서 촉진유전자에 융합될 경우 해당 유전자의 발현을 유도하는 상기 정의된 바와 같은 촉진유전자의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 재조합 DNA 구조물의 유도성 촉진유전자는 억제 단백질에 관능적으로 연결되어 이를 조절하며 파괴유전자 촉진유전자는 억제 단백질에 의하여 인식되는 작동유전자 서열을 유도하여 유도물질의 존재하에 작동유전자 서열과 상호작용하는 억제 단백질이 만들어짐으로써 제2의 촉진유전자를 무력하게 하고 파괴 유전자의 발현을 억제시킨다.
바람직하게는, 파괴 유전자는 누클레오티드 서열이며 이것은 식물 생장에 필수적인 내재하는 식물 유전자 또는 식물에 의도하는 특성을 부여하는 유전자에 대하여 센스 방향이며 내재하는 식물 유전자의 부분적 센스 서열을 포함한다.
바람직하게는, 파괴유전자는 식물 생장에 필수적인 내재하는 식물 유전자 또는 식물에 의도하는 특성을 부여하는 유전자에 대하여 안티센스 방향인 누클레오티드 서열이다.
바람직하게는, 내재하는 식물 유전자는 종자 발아 또는 초기 묘종 생장에 필수적이다.
바람직하게는, 외부적으로 통제가능한 유전자 조절 영역은 글루타티온 S-전이효소 시스템(우리의 국제 특허 출원 제PCT/GB96/02116호의 주제임), Alc 시스템(우리의 국제 특허 출원 제PCT/GB96/01883호 및 제PCT/GB96/01846호의 주제임) 또는 엑디손 시스템(우리의 국제 특허 출원 제PCT/GB96/01195호의 주제임)으로부터 얻어지는 화학적으로 유도가능한 촉진유전자 서열이다.
바람직하게는, 억제 단백질 유전자는 lac 억제물질 또는 434,P22에 의하여 사용된 억제물질 또는 람다-박테리오파지와 같은 박테리아 억제물질을 암호화한다.
바람직하게는, 파괴유전자 또는 파괴 촉진유전자는 "유사-작동유전자"이다.
바람직하게는, 파괴유전자는 세포독 유전자(cytotoxic gene)이다.
바람직하게는, 파괴유전자는 재조합효소 인식 서열에 의하여 측면공격당한 누클레오티드 서열을 잘라내는데 적용되는 재조합효소 또는 전이효소를 암호화한다.
바람직하게는, 재조합 DNA 구조물은 곡물 또는 묘종 또는 식물의 게놈 DNA내에 합체될 경우, 바람직하게는 안정하게 합체될 경우 발아하는 묘종, 생장하는 곡물 또는 식물의 조직 또는 조직들에서 발현될 수 있다.
바람직하게는, 발현 시스템은 최소한 발아하는 묘종 또는 생장하는 곡물 또는 식물의 조직(예를들어 뿌리, 떡잎, 잎 및 줄기)을 위한 것이다.
바람직하게는, 발현 시스템은 발아하는 묘종의 게놈 DNA 또는 생장하는 곡물의 게놈 DNA 또는 식물의 게놈 DNA내에 합체, 바람직하게는 안정하게 합체된다.
바람직하게는, 촉진유전자는 최소한 발아하는 묘종 또는 생장하는 곡물 또는 식물의 조직 또는 조직들내에서 촉진유전자에 융합되는 해당 유전자의 발현을 유도하는데 사용된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 촉진유전자는 도19에 도시된 바와 같이 클론 pKS12p6의 촉진유전자 영역의 DNA 서열에 해당하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 촉진유전자는 도20에 도시된 바와 같이 클론 pKS25p7의 촉진유전자 영역의 DNA 서열에 해당하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 촉진유전자는 도21에 도시된 바와 같이 클론 pKS66p1의 촉진유전자 영역의 DNA 서열에 해당하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 더 바람직한 구체예는 시스테인 프로테아제 촉진유전자에 융합된 파괴유전자를 포함하고 묘종, 곡물 또는 식물의 게놈 DNA내 합체된, 바람직하게는 안정하게 합체된 구조물을 포함하는 묘종, 곡물 또는 식물로서, 상기에서 촉진유전자는 도 19, 20 또는 21에 도시된 바와 같은 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동성을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하며 파괴유전자는 바나제 리보누클레아제를 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 더 바람직한 구체예는 시스테인 프로테아제 촉진유전자에 융합된 파괴유전자를 포함하고 묘종, 곡물 또는 식물의 게놈 DNA내 합체된, 바람직하게는 안정하게 합체된 구조물을 포함하는 묘종, 곡물 또는 식물로서, 상기에서 촉진유전자는 도 19, 20 또는 21에 도시된 바와 같은 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동성을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하며 파괴유전자는 재조합효소 인식 서열에 의하여 측면공격 받은 누클레오티드 서열을 잘라내는데 적용되는 재조합효소를 암호화하는 유전자이다.
따라서, 본 발명의 매우 바람직한 구체예는
(a) 외인성 화학적 유도체의 존재 또는 부재에 응답하는 유도성 유전자 촉진유전자 서열;
(b) 상기 유도성 유전자 촉진유전자 서열의 조절하에 억제 단백질을 암호화하는 유전자 또는 아래(e)에서 구체적으로 기술한 파괴유전자의 생성물 저해제를 암호화는 유전자;
(c) 상기 억제 단백질에 대한 작동유전자 서열;
(d) 본 발명의 유전자 촉진유전자 서열; 및
(e) 외인성 화학적 유도체의 존재 또는 부재하에 성숙시까지 생장시키거나 생장을 저해 또는 적절한 단계에서 중단시킬 수 있는 식물 생장에 필수적인 식물 특성을 가지는 단백질 파괴유전자를 암호화하는 유전자
를 서열내에 포함하는, 식물 생장을 조절하기 위하여 식물의 게놈내 삽입되는 재조합 DNA 구조물을 제공한다.
본 발명에 사용되는 유도성 촉진유전자는 외인성 화학적 유도체에 의한 자극에 대한 응답으로 억제 단백질의 발현을 촉진함으로써 화학적 유도체 없이는 어떤 억제 단백질도 발현하여 파괴 단백질 유전자의 발현을 허용하는 작동유전자와 상호작용하지 않으며 화학적 유도체의 존재하에 억제 단백질은 발현하여 식물 생장의 저해제를 암호화하는 유전자의 발현을 방해하여 방해받지 않는 식물 생장을 허용할 수 있을 것이다.
"식물 재료"란 발달하는 곡과 또는 발아하는 묘종 또는 발달하는 곡물 또는 식물의 세포와 같은(예를들어 뿌리, 잎 및 줄기) 발달하는 곡과, 발아하는 곡과 또는 곡물 또는 묘종, 묘목 또는 식물 또는 이들 세포의 조직을 포함한다.
본 발명에 관련하여 "대상 유전자" 또는 "GOI"란 대상이 되는 혹종의 유전자를 의미한다. GOI는 그 자연적인 환경에 있을 경우 야생형 기능성 유전자를 제외하고는 해당 식물에 본래적이거나 이질적인 혹종의 유전자일 수 있다.
GOI의 일반적인 예는 세포 작용을 파괴하는 효소 및 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 예를들어, 유전자는 세포독 유전자일 수 있을 것이다. 이와는 다르게, 유전자는 식물 생장에 필수적인 내재성 식물 유전자 또는 식물에 의도하는 특성을을 부여하는 유전자를 저해하도록 개질된 재조합효소, 전이효소 또는 유사한 특성을 갖는 관련 효소를 암호화할 수 있을 것이다.
재조합효소는 특정한 절단 서열 또는 일단의 특정 절단 서열들을 인식하고 특정 절단 서열들 사이에서 DNA를 제거하거나 바꾸는 효소이다. Cre-lox, FLP, SR1 및 SSV1-암호화된 인테그라제 시스템과 같은 제조합효소 시스템을 본 발명에 사용할 수 있을 것이다.
GOI의 다른 예는 제초제, 균류 또는 곤충 저항성을 제공하는 유전자와 같은 방어 또는 보호 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 묘종의 발아시(묘종은 이때 특히 공격받기 쉬움) 발현될 수 있을 것이다. 바람직하게는 유전자는 식물에 생물적 및 환경적인 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 암호화한다.
β-튜불린 및 아데닌 누클레오티드 트랜스로케이터(ANT)를 암호화하는 유전자와 같은 내재성 유전자 또한 포함된다.
"파괴유전자"는 식물 생장의 적당한 단계에서 특별히 발현하거나 억압될 경우 씨를 뿌리거나 식물이 생장하지 못하게 하는 유전자이다. 파괴유전자의 기원은 예를들어 인간 세포, 박테리아 세포, 이스트 세포, 식물 세포, 균류 세포와 같은 여러 가지 자연적으로 발생하는 공급원에서 얻은 것일 수 있거나 전체적으로 약간은 자연에서 발견될 수 있고 약간은 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 DNA 서열 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있는 합성유전자일 수 있다. 파괴유전자는 바람직하게는 DNA 및 RNA 대사, 단백질 합성 및 기타 대사 경로와 같은 필수적인 생화학 작용을 표적으로 할 것이다.
바람직한 구체예에서, 파괴유전자는 바나제 리보누클레아제, β-튜불린 또는 아데신 누클레오티드 트랜스로케이트(ANT)를 암호화하는 유전자이다.
본 발명과 관련하여 "이의 변종"은 얻어지는 서열이 GOI를 발현시킬 수 있도록 하나 이상의 핵산(들)의 혹종의 치환, 변형, 개질, 교체, 삭제 또는 부가를 의미한다. 이 용어는 또한 실질적으로 촉진유전자 서열로 잡종형성될 수 있는 서열을 포함한다. 이것은 또한 시스테인 프로테아제 촉진유전자의 최소한 알부를 암호화하고 본 발명 DNA에 잡종형성되는 DNA를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 잡종형성은 엄격하거나 엄격하지 않은 조건에서 혹은 그 중간에서 일어난다. 일반적인 용어로, 엄격하지 않은 조건은 대략 주위온도 내지 약 65℃에서 3xSSC로 정의될 수 있고 엄격한 조건은 약 65℃에서 0.1xSSC로서 정의될 수 있다. SSC는 0.15M NaCl, 0.015M 트리소듐 시트레이트 완충액의 이름이다. 3xSSC는 SSC의 3배 강도 등등이다.
"실질적으로 상동성"이란 용어는 GOI를 발현시킬 수 있는 예를들어 시스테인 프로테아제 촉진유전자와 같이 촉진유전자로서 작용하는 상동성 서열을 제공하는 촉진유전자 서열의 최소한 본질적인 핵산/핵산 잔기에 대하여 상동성임을 의미한다. 상동성은 일반적으로 60% 이상의 누클레오티드가 본 발명 촉진유전자 서열과 공통일 경우 보여지는데 상동성은 더 일반적으로는 65%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 75%, 훨씬 더 바람직하게는 80% 또는 85%, 특히 바람직하게는 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상이다.
"카세트", "하이브리드" 및 "컨주게이트"와 같은 말과 동의어인 "구조물(construct)"이란 용어는 본 발명 촉진유전자에 직접 또는 간접적으로 결합되어 이를테면 카세트를 형성시키는 GOI를 포함한다. 간접적인 결합 예는 인트론 서열, 매개 촉진유전자 및 GOI와 같은 적당한 스페이서 그룹을 제공한다. 직접 또는 간접 결합을 포함하는, 본 발명에 관련하여 "융합된"이란 용어에도 같은 것이 적용된다.
"발현 시스템"이란 적절한 유기체, 조직, 세포 또는 매질내에서 발현될 수 있는 상기 정의된 시스템을 의미한다. 이런 점에서, 본 발명의 발현 시스템은 촉진유전자를 사용하여 GOI의 발현을 증가시키는 추가의 성분을 포함할 수 있을 것이다.
본 발명의 DNA는 분리된 형태, 바람직하게는 본래 관련이 없는 서열에 효과적으로 결합된 게놈 DNA일 수 있거나 상기 DNA는 합성 DNA 또는 cDNA일 수 있을 것이다.
발아하는 어린 묘종은 공격받기 쉬운 식물 생장 단계이다. 농작물 생산을 개선시키는 방법은 이 단계에서 추위, 염, 중금속, 균류 공격에 대한 저항성과 같은 생물학적 및 환경적인 스트레스에 대하여 묘종의 저향력을 증대시키기 위한 유전자의 발현을 포함한다. 발아 조절 특정 촉진유전자하에 이러한 스트레스에 대하여 최소한 어느 정도의 저항성/내성을 제공하는 단백질, 예를들어 항균 단백질(Cammue등, 1992; Terras등, 1993)을 발현시켜 묘종을 보호하는 것은 상기 단백질이 가장 효과적일 경우 정확한 생장 단계로 발현을 제한하는 것이 될 것이다. 이러한 생장 특이 발현은 먹이 사슬에 들어오는 식물 재료내에서 이들 유전자의 발현을 피하는 것과 같은 추가의 이점을 가진다.
본 발명의 촉진유전자는 또한 식물 생식질 포함 시스템내에서 유리하게 사용될 수 있을 것이다.
농업적으로는 인간이 소비하는 식품의 생산, 인간 소모 산물을 얻는 상업적 공정, 동물의 먹이 생산, 공업제품의 개발 및 기타의 목적을 위하여 다수의 농작물을 사용한다. 본 방법은 종자 제조업체로부터 통상적으로 구입되는 종자를 농부가 심는 것을 포함한다. 농작물에 의해서 얻어지는 산물, 즉 식물 전체일 수도 있겠으나 종자 또는 식물의 열매는 이후 상기 언급된 여러 가지 식품 용도로 사용된다.
공급된 잡종 또는 동종 번식의 종자는 제초제, 해충 및 균에 의한 질병에 대한 내성, 개선된 수율 및/또는 수확되는 산물의 질과 같은 신규한 경종학적 특질 및 식물의 번식을 조절하는 신규한 메카니즘을 제공하는 농작물의 형질전환에 의하여 도입된 신규한 유전 암호를 합체할 수 있을 것이다. 생명공학적인 연구를 통하여 가능해진 이러한 개선점은 식물 품종개량의 질을 개선시키고 농부에 의하여 제공되는 종자의 경종학적인 성능을 개선시킨다.
본 발명이 다루는 문제는 재배지내 농작물을 억제하는 것이다. 재배되는 농작물의 종자는 다수의 루트(새 또는 작은 포유동물에 의해서 또는 단순히 종자 작물의 수확후 운반시 떨어져서)에 의하여 이들이 잡초의 상태인 것으로 사료되어지거나 후년에 차후의 수확에서 자생식물로 남아 있을 수 있는 정해진 생장지 밖으로 운반될 수 있을 것이다. 가능하다면 재배되는 작물을 생장지로 제한하고 야생에서 존속하지 못하게 하는 것이 명백히 적절할 것이다. 상기 언급된 비제한적인 농작물의 문제는 트랜스진 농작물이 포함될 경우 더 정확해질 것이다.
같은 방식으로, 꽃가루는 바람 및/또는 곤충 운반(분산)을 통해서 장거리를 떠돌고 장기간동안 생존가능한 상태로 남아있을 수 있다. 농작물 및 재배되지 않는 이들의 관련 종 사이에 이종 교배가 가능하므로 제2의 관심은 예를들어 제초제에 견디는 농작물과 같이 관련 잡초 종으로의 변형유전자 농작물로부터 얻은 꽃가루를 야생화한 재배 식물이다(Mikkelsen등, 1996). 이러한 잡종번식물의 생존가능성을 감소시키는 방법은 비농작물 종으로의 유전자변형 탈피의 위험을 제한하여 침습성 및 잡초성이 증대된 식물의 확산을 피하는 것이 될 것이다.
본 발명의 묘종 촉진유전자의 사용은 파괴 단백질 유전자의 발현을 적당한 식물 생장 단계로 제한하고 또한 생존가능성을 유지하기 위하여 수명기간내내 식물에 유도 화학물질을 계속하여 공급하는 것이 불필요함을 의미하는 것으로 사료되어질 것이다. 이것은 경제적이고 생태학적인 이점을 모두 가진다.
본 발명은 또한 본 발명 게놈 구조물내 합체된, 바람직하게는 안정하게 합체된 유전적으로 형질전환된 식물 또는 세포 원형질체 및 종자와 같은 이의 부분을 제공한다.
따라서, 본 발명은 식물이 그 게놈내에 상기 정의된 재조합 DNA 구조물을 함유하는, 바람직하게는 안정하게 합체하는 생장 단계에서 가역적으로 억제될 수 있는 식물을 제공한다.
유전자에 의하여 암호화된 단백질의 발현은 유전자의 업스트림이 위치된 영역을 가지는, DNA-결합 단백질로서 공지된 혹종의 규제 단백질의 상호작용에 의하여 조절된다. 촉진유전자내에는 이들 DNA-결합 단백질이 특이적으로 결합하고 있는 특정 올리고누클레오티드 서열을 함유하는 몇가지 작동유전자 영역이 위치되어 있다. 이들 단백질은 유전자 발현의 활성화 또는 억제를 유도할 수 있다. 따라서, 이들은 유전자의 통제된 발현을 조절한다.
본원에서는 사실 유전자 발현의 억제유전자 또는 활성화유전자일 수 있는 DNA-결합 단백질을 간단히 "억제유전자"로서 언급한다.
본 발명은 파괴 유전자 작용의 발현을 조절하는데 박테리아 작동유전자와 이들의 억제유전자 사이의 잘 특성화된 상호작용을 이용한다. 박테리아 억제유전자, 특히 lac 억제유전자 또는 434,P22에 의하여 사용된 억제유전자 및 람다 박테리오파지는 식물 세포내에서 발현을 매우 효과적으로 조절하는데 사용될 수 있다.
제2 작동유전자/억제유전자 시스템은 본원에 참고문헌으로 합체하고 있는 우리의 공개된 국제 특허 출원 제WO90/08827호의 주제이다.
고려할 수 있는 파괴 유전자의 억제에 대한 제3의 방법은 "안티센스", "센스" 또는 "부분적 센스" 기술의 사용이다.
본 발명 DNA 구조물은 "안티센스" RNA를 발생시키는 "안티센스" 구조물이거나 "센스" RNA를 발생시키는 "부분적-센스" 구조물(관능적인 유전자 생성물의 최소한 일부를 암호화함)일 수 있을 것이다.
"안티센스 RNA"는 해당 mRNA에서 염기 서열에 상보적인 즉 안티센스 서열(3′- 5′센스)내 각 염기(또는 대다수의 염기)가 5′- 3′센스내에서 판독되는 mRNA 서열에서 해당 염기와 쌍을 이룰 수 있는(G와 C, A와 U) 의미에서 상보적인 RNA 서열이다. 이러한 안티센스 RNA, 또는 부분적 센스 RNA는 적당한 유전자(또는 이와 실질적인 상동성을 보이는 DNA 서열)의 암호화 균주의 최소한 일부와 동일한 서열을 가지는 전사물을 발생시키기 위하여 정상 배향된 적절한 DNA 구조물로 형질전환에 의하여 세포내에서 생성될 수 있을 것이다.
"센스 RNA"는 해당 mRNA 서열의 최소한 일부에 대하여 실질적으로 상동성인 RNA 서열이다. 이러한 센스 RNA, 또는 부분적 센스 RNA는 적당한 유전자(또는 이와 실질적인 상동성을 보이는 DNA 서열)의 암호화 균주의 최소한 일부와 동일한 서열을 가지는 전사물을 발생시키기 위하여 정상 배향된 적절한 DNA 구조물로 형질전환에 의하여 세포내에서 생성될 수 있을 것이다. 적당한 센스 또는 부분적 센스 구조물은 유전자 발현을 저해하는데 사용될 수 있을 것이다(국제 특허 공개 제WO91/08299호에 기술된 바와 같음).
파괴 유전자를 억제하는데 사용될 수 있는 안티센스 RNA 구조물은 아데닌 누클레오티드 트랜스로케이터를 암호화하는 유전자들을 포함한다.
이용가능한 또는 이용가능하게 되는 기타의 방법들 또한 사용할 수 있을 것이다.
이러한 농작물 억제 시스템에 대한 더 상세한 설명은 본원에 참고문헌으로 합체되어 있는 우리의 공개된 국제 특허 출원 제WO94/03619호에서 찾을 수 있다.
본 발명의 촉진유전자는 외인성 또는 이질적인 유전자에 결합되어 형질변환에 의하여 식물내로 도입될 경우 그 이질적인 유전자의 발현의 통제 수단을 제공한다. 식물 세포의 형질전환에 사용되는 방법은 본 발명에 특히 밀접한 관계는 없으며 표적 식물에 적당한 혹종의 방법을 사용할 수 있을 것이다. 트랜스진 식물은 형질전환된 세포로부터 재발생에 의하여 얻어진다. 다수의 형질전환 절차는 약간 언급하자면 아그로박테리움 투메파키엔스 또는 이의 Ti 플라스미드를 사용하는 농감염, 전기영동, 미세주입 또는 식물 세포 및 원형질체,마이크로투사 형질변환과 같이 문헌으로부터 공지되어 있다. 공지된 방법들의 모든 상세한 설명에 대하여는 문헌을 참조할 수 있을 것이다.
촉진유전자 서열이 삽입되는 긱물종 또한 본 발명에 특별히 밀접한 관계가 있는 것은 아니다. 쌍떡잎 및 외떡잎 식물은 형질전환될 수 있다. 본 발명은 형질전환 기법을 이용할 수 있는 혹종의 식물에 적용될 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 카놀라, 해바라기, 담배, 사탕무 및 면과 같은 밭 농작물, 밀, 보리, 쌀, 옥수수 및 수수와 같은 곡물, 토마토, 망고, 복숭아, 사과, 배, 딸기, 바나나 및 멜론과 같은 과일 및 당근, 상치, 양배추 및 양파와 같은 야채를 포함하는 여러 가지의 유전적으로 개질된 식물에서 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 촉진유전자는 또한 뿌리, 잎, 줄기 및 재생 조직을 포함하는 여러 가지 조직에 사용하기 적당하다.
따라서, 신규한 시스테인 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열을 분리하여 특성화하여왔다. 도 12-17 중 어느 하나에 도시된 서열의 최소한 일부를 포함하는 DNA는 시스테인 프로테아제를 암호화하며 상기 서열의 암호화 영역에 해당한다. 본 발명은 또한 본 발명 서열에 상동성을 보이는 DNA를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 DNA에 잡종형성되며 시스테인 프로테아제의 최소한 일부를 암호화하는 DNA를 포함한다. 이러한 상동성 및 잡종형성은 상기 촉진유전자 서열에 관련하여 상기에 논의하였다.
본 발명은 또한 시스테인 프로테아제를 암호화하고 본 발명의 DNA에 대한 유전 암호의 결과로서 퇴보된 DNA를 포함한다.
실질적으로 본 발명 시스테인 프로테아제 유전자 DNA에 의하여 암호화되는 다른 단백질이 없는 시스테인 프로테아제 또한 본 발명에 의하여 제공된다.
이제 도면을 참고로 하여 본 발명을 비제한적인 실시예만으로 기술하기로 하겠다.
도1은 가역적으로 전사되는 PCR 라이브러리를 사용하는 시스테인 프로테아제 이소폼을 확인하는 대략적인 도면이다.
도2는 아그로즈 겔 전기영동에 의한 RT-PCR의 분석을 도시한다(여기서 DG=DEGCYS1 및 DG2=DEGCYS2 올리고임).
도3A는 RT-PCR 클론 OSR8.401, OSR8.406, OSR8.403, OSR8.404, OSR8.402, OSR8.389 및 OSR8.387의 예비 핵산 서열의 암호화 영역의 배열을 도시한다.
도3B는 RT-PCR 클론 OSR8.389, OSR8.387, OSR8.402 및 OSR8.404의 예비 핵산 서열의 비암호화 영역의 배열을 도시한다.
도4는 클론 OSR8.401, OSR8.402 및 OSR8.389의 예비 핵산 서열을 도시한다.
도5는 종자내 발현을 비교하며 발아시 탐침으로서 랜덤 프라이밍된 전체 RT-PCR 단편을 사용한 2류 클론의 노던 블롯의 결과를 도시한다.
도6은 어느 범위의 생장 단계에서의 발현을 비교한 1류 클론, CDCYS12(탐침으로써 PCR에 의하여 라벨링된 클론의 암호화 영역을 사용함), 2류 클론, CDCYS25(탐침으로써 PCR에 의하여 라벨링된 클론의 비암호화 영역을 사용함) 및 6류 클론, CDCYS66(탐침으로써 PCR에 의하여 라벨링된 클론의 비암호화 영역을 사용함)의 노던 블롯의 결과를 도시한다. 이 도면에서 B=싹, W=전체 식물, L=잎임.
도7은 공개된 서열 COT44(지정된 CYS4.BRANA)을 가지는 클론 OSR8.403, OSR8.404, OSR.402, OSR.389, OSR8.387, OSR8.406 및 OSR8.401의 추정 아미노산 서열의 배열을 도시한다.
도8은 cDNA를 사용하여 시스테인 프로테아제 이소폼을 확인하는 대략적인 도면이다.
도9는 각기 다른 것, COT44(지정된 CYS4.BRANA)를 함유하는 부분 cDNA 2류 클론, CYS2UP6.1, CYS2UP7.1 및 CYS2UP8.2의 아미노산 서열의 배열을 도시한다.
도10은 각기 다른 것, COT44를 함유하는 부분 cDNA 클론, CYS2UP6, CYS2UP7, CYS2UP8, CYS6UP3, CYS6UP5, CYS6UP2 및 CYS6UP4의 아미노산 서열의 배열을 도시한다.
도11은 각기 다른 것, COT44를 함유하는 완전 cDNA 클론, CDCYS66, CDCYS24, CDCYS22, CDCYS25, CDCYS12 및 CDCYS14의 배열을 도시한다.
도12는 cDNA 클론 CDCYS12의 핵산 서열을 도시한다.
도13은 cDNA 클론 CDCYS14의 핵산 서열을 도시한다.
도14는 cDNA 클론 CDCYS22의 핵산 서열을 도시한다.
도15는 cDNA 클론 CDCYS24의 핵산 서열을 도시한다.
도16은 cDNA 클론 CDCYS25의 핵산 서열을 도시한다.
도17은 cDNA 클론 CDCYS66의 핵산 서열을 도시한다.
도18은 cDNA 클론 CDCYS12, CDCYS14, CDCYS22, CDCYS24, CDCYS25 및 CDCYS66의 예견된 아미노산 서열의 배열을 도시하고 식물 시스테인 프로테아제의 특징을 특성화하면서 서열들을 비교한다.
도19는 1류 게놈 클론 pKS12p6으로부터 얻은 촉진유전자의 핵산 서열을 도시한다.
도20은 2류 게놈 클론 pKS25p7로부터 얻은 촉진유전자의 핵산 서열을 도시한다.
도21은 6류 게놈 클론 PKS66P1으로부터 얻은 촉진유전자의 핵산 서열을 도시한다.
도22는 클론 pKS12P6(1류), pKS25P7(2류) 및 pKS66P1(6류)의 추정 TATA 박스의 위치 및 프라이머 확장 실험에 의한 전사 출발의 맵핑을 도시한다. 숫자는 cDNA의 5′말단까지의 거리를 나타낸다.
도23은 담배 형질전환용 벡터 구조물을 도시한다.
도24는 형질전환시 싹-발생 유합조직에서 GUS 발현의 정도를 도시한다.
도25는 1차 형질전환으로부터 얻은 잎에서 GUS 발현의 정도를 도시한다.
도26은 흡수 0-36일후(DAI) 부류별 두 랜덤 1차 형질전환체의 자손에서의 GUS 발현의 시간 경로를 도시한다. NVS는 야생형 음성 대조구를 나타낸다.
도27은 부류 1의 24 랜덤 1차 형질전환체의 자손에서의 GUS 활성을 도시한다. 흡수 0, 14 및 28일후(DAI) 묘종을 평가하였다. 이 도면은 또한 1차 형질전환체로부터 얻은 어린 잎에서의 GUS 활성을 포함한다.
도28은 부류 2의 24 랜덤 1차 형질전환체의 자손에서의 GUS 활성을 도시한다. 흡수 0, 14 및 28일후(DAI) 묘종을 평가하였다. 이 도면은 또한 1차 형질전환체로부터 얻은 어린 잎에서의 GUS 활성을 포함한다.
도29는 부류 6의 24 랜덤 1차 형질전환체의 자손에서의 GUS 활성을 도시한다. 흡수 0, 14 및 28일후(DAI) 묘종을 평가하였다. 이 도면은 또한 1차 형질전환체로부터 얻은 어린 잎에서의 GUS 활성을 포함한다.
일반적으로 상기 도면들에서 클론과 관련하여 CO 또는 COD는 암호화 영역을, NC 또는 NCD는 비암호화 영역을 지시한다.
대략적으로 본 실시예들은 오일 평지씨 RNA 발아시 가역 전사효소 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)에 의한 발아-발현된 시스테인 프로테아제 부분 클론의 증폭에 대하여 기술하고 있다. 노던 블롯팅에 의한 무수 종자에서의 클론 발현 및 발아하는 묘종의 예비 평가 및 선택된 클론에 대한 뒤이은 더 상세한 노던 블롯 실험으로 발현의 시간 경로를 평가하였다. 이들 클론 중에서 높은 발현을 보이는 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 조립한 후 게놈 라이브러리의 선별에 의하여 촉진유전자 영역을 서브클로닝하였다. 클로닝된 촉진유전자의 공간적 및 시간적 규제의 최종 평가는 β-글루쿠로니다제(GUS) 리포터 유전자에 의한 촉진유전자 단편의 전사 융합 및 담베로의 형질전환으로 행하였다.
실시예 1
오일 평지씨 묘종을 발아시켜 얻은 시스테인 프로테아제 가역 전사된 PCR 라이브러리
발아 특이 서열을 확인하기 위하여, 오일 평지씨 묘종에 대한 RT-PCR 방법을 이용하였다. 몇몇 식물 종 사이에 보존된 시스테인 프로테아제 암호화 영역에 설계된 가역 올리고(dT) 프라이머 및 정방향 프라이머를 사용하여 500 bp의 암호화 영역 및 약 250 bp의 비암호화 영역을 커버하는 750 bp RT-PCR 생성물을 증폭시켰다. 5′-말단을 시퀀싱하여 시스테인 프로테아제 관련 클론으로서 RT-PCR 생성물을 확인하였다. 비암호화 영역에 대한 선별 압력이 훨씬 덜하므로 3′-말단 비암호화 영역내 현저한 차이로써 3′-말단 번역되지 않은 영역 차이를 예견할 수 있을 것이다. 이러한 일반적인 방법이 도1에 개략적으로 도시되어 있다.
준비 방법:
식물 재료
변종 Wester로부터 5g의 평지씨(브라시카 나푸스)를 10분동안 1%의 소듐 하이포클로라이트내에서 살균하였다. 살균수내에서 몇차례 세척한 후 4℃의 암실에서 12시간동안 살균수로 종자를 흡수시켜 동시에 발아시켰다. 이것을 젖은 살균 와트만 페이퍼 상에 뿌리고 떡잎을 수확하기 전에 25℃ 암실에서 생장시켰다.
RNA 추출
리튬 클로라이드 방법
Jepson등에 의하여 기술된 변형 프로토콜(1991)을 사용하여 무수 종자 및 3일된 오일 평지씨 묘종으로부터 모든 RNA를 분리하였다. 미세한 분말이 얻어질때까지 막자사발 및 막자로 액화질소로 조직(5g)을 분쇄하였다. 9ml 균질화 완충액[400 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH9.0; 1% SDS; 5 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA); 4 U/ml 헤파린; 1 mM 아우린트리카복실산(ATT); 10 mM 디티오트레이톨(DTT)] 및 균질화 완충액내 포화되고 사용전 10%(v/v) m-크레졸로 보충된 4.0 ml의 페놀을 가한후 미세한 페이스트가 얻어질때까지 다시 조직을 분쇄하였다. 상기 페이스트를 냉 코렉스 튜브에 전달하고 13,000rpm(Sorval, SS34, 4℃)에서 15분동안 원심분리하였다. 상청액을 다른 튜브에 전달하고 5ml의 페놀-클로로포름으로 5분동안 추출한 다음 9,000 rpm(Sorval, SS34, 4℃)에서 30분동안 원심분리하여 수성 상을 회수하였다. 3차례의 페놀-클로로포름 추출 후, 12M 리튬 클로라이드 5분의 1 부피로 얼음 상에서 밤새 상청액을 침전시켜 RNA를 회수하였다. 9,000 rpm(Sorval, SS34, 4℃)에서 30분동안 원심분리한 후, 상청액을 분리하여 마이크로튜브로 옮기기 전에 1ml의 5mM Tris(pH 7.5)내에 펠릿을 재현탁시켰다. 밤새 두 번째로 리튬 클로라이드 침전을 행한 다음 펠릿을 70% 에탄올로 두 번 세척하고 0.2ml DEPC 처리된 물에 재현탁시켜 -70℃에서 저장하였다.
세슘 클로라이드 방법
Okayama 등으로부터 개질된 프로토콜(1979)을 사용하여 한 범위의 생장 단계의 평지씨 묘종으로부터 모든 RNA를 분리하였다. 액화 질소의 존재하에 1g의 AL2O3로 막자와 막자사발내에서 조직(2-4g)을 분쇄하였다. 건조한 얼음속에서 유지시킨 분말을 이후 사용전에 2.5%(v/v) B-머캅토에탄올로 보충한 8ml의 미리 데운(65℃) 균질화 완충액[5M의 티오시아네이트 구아니딘; 0.5%, w/v, 라우릴 사코신 소듐; 0.025M 소듐 시트레이트; pH 7.0]과 코렉스 튜브내에서 혼합시키고 조직이 완전히 해동할때까지 맴돌이 교반하면서 40℃에서 10분동안 인큐베이팅시켰다. 15℃에서 30분동안 12,000rpm(Sorval, SS34, 회전자)에서 원심분리한 후, 상청액을 회수하고 1ml당 0.1g의 CsCl로 보충한 8ml의 균질화 완충액을 가하였다. CsCl이 용해한 후 완충물을 교반시키지 않고 2.5ml의 CsCl 고밀도 완충물[5.7M CsCl; 0.1M EDTA]을 함유하는 12ml의 폴리알로머 튜브에 균질물을 가하였다. 20℃에서 25,000 rpm(Sorval, TH-641, 회전자)에서 24시간동안 원심분리한 후 상청액을 흡입하여 분리하고 300μl의 재현탁 완충액[7M 우레아; 2%, w/v, 라우릴 사코신 소듐]내에 RNA 루프를 재현탁시키기 전에 튜브 벽을 흡습성 페이퍼로 닦았다. 이후 1.5ml의 튜브내로 RNA를 옮기고 동부피의 페놀 및 동부피의 클로로포름/이소아밀 알콜[24:1, v/v]로 추출하였다. 13,000 rpm에서 5분동안 원심분리한 후 수성 상을 회수하고 동부피의 클로로포름으로 다시 추출하였다. 10분의 1 부피의 3M 소듐 아세테이트 및 2.5 부피의 냉 에탄올을 가하여 -20℃에서 밤새 RNA를 침전시켰다. 13,000 rpm,, 4℃에서 15분동안 원심분리한 후 상청액을 버리고 펠릿을 1.5ml의 냉 70% 에탄올로 세척하였다. 10분동안 반복하여 원심분리하고 상청액을 버리고 펠릿을 스피드베이컴에서 3-4분동안 건조시켰다. 살균 DEPC-처리된 물에 펠릿을 재현탁시키고 RNA를 다시 침전시킨 다음 펠릿을 상기 기술한 바와 같이 세척하고 최종적으로 50μl의 DEPC-처리된 물에 재현탁시키고 -70℃에서 저장하였다.
DNA 탐침의 라벨링
말단 교환
30분동안 37℃에서 25μl 반응[30uCi [γ-32P]ATP(Amersham, 5000 Ci/mmol), 1X 키나징 완충액]에서 20 U T4 폴리누클레오티드 키나제(New England Biolabs)를 사용하여 하이드록실화된 5′-말단을 포스포릴화하여 올리고(25-50ng)를 라벨링하였다. 제조자가 추천한 바와 같이 G-25 세파덱스 스펀 칼럼(5프라임->3프라임, Inc™)을 사용하여 합체되지 않은 누클레오티드로부터 올리고를 정제하였다.
PCR
50μl PCR 반응[0.25μM [α-32P]dATP(Amersham, 3000 Ci/mmol); 0.4μMdATP; 50μM 기타 dNTP; 1.5 mM MgCl2; 0.5μM 올리고; 1X PCR 완충액]을 사용하여 플라스미드 DNA(5 ng)를 증폭시켰다[(94℃, 1분; 65℃, 1분; 72℃, 1분)x17회; (72℃, 7분)x1회]. 제조자가 추천한 바와 같이 G-25 세파덱스 스펀 칼럼(Pharmacia Biotech)을 사용하여 합체되지 않은 누클레오티드로부터 탐침을 정제하였다.
랜덤 프라이밍
제조자의 추천에 따라 "올리고라벨링 키트"(Pharmacia)를 사용하여 플라스미드 DNA(25-50ng)를 라벨링하였다.
노던 블롯 잡종형성
Sambrook 등에 따라 노던 블롯 실험을 하였다. 모든 RNA(10μg)를 2.5vol의 로딩 완충액(5프라임->3프라임, Inc™)과 혼합시키고 알카리성 흐르는 완충액[1X MOPS; 7%, v/v, 포름알데하이드]내 1.2%의 아가로즈 변성 젤[1X MOPS(40 mM MOPS, pH 7.0; 10 mM 소듐 아세테이트; 1mM EDTA); 17%, v/v, 포름알데하이드]상에서 전기영동하여 사이징하고 제조자의 추천에 따라 모세관 블롯팅하여 나일론 멤브레인(Hybond N, Amersham)으로 옮겼다. 100 μg/ml의 변성된 연어 정자 DNA로 보충된 잡종형성 완충액[5XSSPE(900mM NaCl; 50mM NaH2PO4.H2O; 5mM EDTA; pH 7.4, NaOH); 0.5% 소듐 도데실 설페이트(SDS); 1% 분말화된 우유]내에서 65℃에서 밤새 잡종형성시켰다. 3X SSC[20X SSC; 450 mM NaCl; 45mM Na3시트레이트.2H2O; pH 7.0, HCl] 및 1% SDS로 65℃에서 1시간동안 블롯을 세척하고 집적 스크린으로 -80℃에서 X-선 필름(X-OMAT AR, Kodak)에 노출시켰다.
RT-PCR 라이브러리 조립 및 스크리닝
제조자의 추천에 따라 "Perkin Elmer GeneAmp™ RNA PCR Kit"를 사용하여 오일 평지씨를 발아시켜 RT-PCR 라이브러리를 조립하였다. 묘종 흡수 3일후 얻은 떡잎으로부터 추출한 모든 RNA(1μg)를 PCR동안 안정화된 올리고(dT) 프라이머(MPRACE1B)를 사용하여 역전사시켰다[65℃, 2분; 42℃, 30분; 99℃, 5분; 6℃, 5분]. 이종중복체 DNA-RNA를 역전사에 대하여 동일한 다운스트림 프라이머 및 대부분의 식물 종 사이에서 보존되는 시스테인 프로테아제 암호화 부분의 모티브[GCNCCLM(NED)]로부터 펩티드 수준으로 설계된 일련의 두 업스트림 최화 프라이머(DEGCYS1 및 DEGCY2)를 사용하여 PCR에 의하여 순차적으로 증폭시켰다. 순환 조건:[(95℃, 2분; 55℃, 2분; 72℃, 1.5분)x2회; (95℃, 2분; 55℃, 1분; 72℃, 1.5분)x33회] 이후 72℃에서 7분.
제조자의 추천에 따라 "TA Cloning™ Kit"(인비트로젠)을 사용하여 이. 콜리를 형질전환시키기 전에 RT-PCR 생성물을 pCRII 벡터내로 리케이팅시켰다. 이 시스템은 PCR에 의하여 제공되는 모든 이중 분자의 3′-말단에 단일한 데옥시아데노신을 가하는 PCR에서 사용되는 온도안정성 폴리머라제의 비-주형 의존 활성을 이용한다. 이것으로써 돌출 데옥시티미딘을 함유하는 pCRII 벡터로의 직접적인 클로닝이 가능해진다. 제조자의 추천에 따라 "Wizare DNA miniprep DNA 정제 시스템"(Promega)플라스미드 DNA를 정제하고 "서열화제 버전 2.0 T7 DNA 폴리머라제"(USB)로 사슬 종결 방법(Sanger등, 1977)으로 시퀀싱하였다.
올리고 서열(5′-> 3′)
MPRACE1B GGC CAC GCG TCG ACT AGT TAC TCG AGTTTT TTT TTT TTT TTT T
DEGCYS1 CGI TG(CT) AA(CT) GGI GGI (CT)T1 ATG
DEGCYS2 GGI TG(CT) AA(CT) GGI GGI (CT)T1 ATG (GA)A
분석
아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의하여 RT-PCR 생성물을 분석하였다. 도2에서 알 수 있는 바와 같이 묘종 RNA가 아닌 떡잎 RNA로부터 증폭된 예상된 크기의 750bp의 두 주요 단편이 발견되었다. 이들은 절단되어 클로닝된 겔이었다. 유사한 방법으로 겔 정제 없이 RT-PCR 생성물의 알리코트를 클로닝하여 400 클론( 22개는 겔 절단에서 유래함)을 함유하는 3일 발현된 시스테인 프로테아제 라이브러리를 생성시켰다. RT-PCR 확인된 250개의 추정 시스테인 프로테아제에 대하여 올리고를 가지고 클론 선별을 하였다. 겔 절단으로부터 얻은 7개의 클론을 무작위로 취하여 완전히 시퀀싱하였는데 이들 모두는 시스테인 프로테아제였고 3류로 나뉘어졌다.
이들 클론에 다음 명칭을 부여하였다:
클론 부류
OSR8.401 1
OSR8.402 2
OSR8.403 2
OSR8.404 2
OSR8.406 6
OSR.387 6
0SR.389 6
이들 클론의 1차 DNA 서열 및 그 배열은 도 3A 및 3B에 도시하였다.
1차 DNA 서열을 도4에 도시한 부류당 하나씩의 이들 클론, OSR8.401(1류); OSR8.402(2류) 및 OSR8.389(6류)를 랜덤 프라이밍에 의하여 라벨링하고 리튬 클로라이드 방법을 사용하여 종자 및 떡잎으로부터 추출된 총 RNA를 함유하는 노던 블롯 상에서 평가하였다. 이들은 발아시 잘 발현되는 것으로 사료되어지나 무수 종자에서는 아니다. 또한 탐침의 성질로 인하여 상이한 부류 사이에 약간의 교차-잡종형성이 관찰되었다. 이것을 도5에 예시하였는데 이것은 탐침으로서 랜덤 프라이밍된 전체 RT-PCR 단편을 이용하여 얻은 2류 클론, OSR8.402에 대한 결과를 도시한다.
이후 랜덤 프라이밍에 의하여 라벨링된 5개의 시스테인 프로테아제 클론을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 신규한 부류는 명백히 확인되지 않았고 온갖 다양한 클론들이 겔-절단된 단편내에 존재하였다. 이들 부류의 클론의 발현형태는 RNA를 가지고 노던 블롯에 의하여 평가하고 도6에 도시된 바와 같은 생장단계로부터 케지움 클로라이드 방법으로 추출하였다. 2류 및 6류에 대하여 각각 클론 OSR8.402 및 OSR8.389의 3′- 비암호화 영역을 사용하여 잡종형성하여 혹종의 교차-잡종형성을 피하였다. 도1에 대하여, RT-PCR 클론에는사용가능한 비암호화 영역이 없으므로 OSR8.401 클론의 암호화 영역의 일부를 탐침으로서 사용하였다. 특이성을 증가시키기 위하여, 2류 및 6류에 대한 올리고(dT) 가역 프라이머(MPRACE1B) 및 내부 가역 프라이머 및 1류에 대한 2개의 내부 프라이머(CYS8.401 및 CYS8.401R)를 사용하여 PCR에 의하여 탐침을 라벨링하였다. 2류 및 6류는 묘종 흡수후 및 초기 묘종 생장의 처음 4-5일간은 발현하고 성숙한 식물이나 생장하고 있는 종자에서는 발현되지 않는다. 1류는 싹 및 잎에서는 약간의 발현을 보이나 이것은 탐침의 성질로 인한 약간의 교차-잡종형성의 결과일 수 있을 것이다. 2류는 평지씨에 대하여 공개된 유일한 시스테인 프로테아제인 COT44에 밀접히 관련되어 있다(Comai 및 Harrada, 1989). 도7은 COT44로 도출된 클론의 아미노산 서열의 배열을 도시한다.
올리고 서열(5′-> 3′)
CYS8.401 TAT CCT TAT CAA GAA CGT GAT GGC A
CYS8.401R CCT ACG ATG AGC ACT GCG TGG T
CYS8.402 GCA GTA ATC AAA TTG GGA TTG TTA TAA
CYS8.389 CGT GGA ACC AGC AGT GTT TGA AGT T
실시예 2
오일 평지씨 묘목의 발아로 부터 얻은 표준 올리고d(t)로 프라이밍된 및 특히 시스테인 프로테아제로 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조
RT-PCR 생성물이 전체 길이가 아님으로써 PCR로 발생되는 변종을 피하였고, 오일 평지씨 cDNA 라이브러리는 흥미로운 세 개의 복제물들이 높은 발현을 나타내는 발생 단계로 부터 제조되었다. 특히 프라이밍된 라이브러리는 올리고(dT) 프라이머를 사용하기 보다는 세 개의 류(class)의 RT-PCR 클론을 기초로 하여 설계된 두 개의 특정 올리고를 사용하여 제조되었다. 결과로서 시스테인 프로테아제 복제물들이 역전사되어, 약 650 bp의 소수 짧은 복제물들을 제공하고, 이들 모두는 5'-말단에 전체 길이를 형성하였다. 이는 올리고의 설계가 전체 길이 복제물들을 위한 표준 올리고(dT) 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 직접적으로 스크리닝하기 위해 사용하는 5'-암호화되지 않는 영역으로 되게 한다. 상기 일반적인 접근법을 도 8에 도식적으로 나타내었다.
준비 방법:
식물 재료
변종 Westar로 부터 얻은 5g의 오일 평지씨 씨앗 (Brassica napus)을 10분 동안 1%의 소듐 하이포클로라이트 내에 소독하였다. 살균수 (sterile water)로 여러번 세척한 후, 씨를 발아시키기 위해 4℃의 어둠속에서 12시간 동안 살균수로 배양시켰다. 이들을 젖은 살균 Whattman 종이 위에 쏟고 이틀 동안 25℃의 어둠속에서 생장시켰더니 떡잎이 얻어졌다.
RNA 추출 및 정제
전술한 바와 같이 세슘 클로라이드 방법을 사용하는 2일-지난 오일 평지씨 묘목으로 부터 전체 RNA를 분리시켰다. 당업자의 추천에 따라, "PolyATract mRNA 분리 시스템" (Promega)를 사용하여 폴리아데닐레이티드 RNA를 전체 RNA (1mg)로 부터 정제하였다. 상기 시스템은 용액 내 고효율로 mRNA의 3'-폴리(A) 영역으로 잡종형성시키기 위해 비오티닐레이티드 올리고(dT) 프라이머를 사용한다.
상기 혼성체를 획득한 후, 이를 물로 용리시키기에 앞서 상자성 입자 및 자성 분리 사슬로 짝지워진 스트렙타비딘을 사용하여 조심스럽게 세척하였다.
cDNA 라이브러리 제조 및 스크리닝 (screening)
표준 올리고(dT)로 프라이밍된 cDNA 라이브러리 및 특히 시스테인 프로테아제로 프라이밍된 라이브러리는 2일-지난 오일 평지씨 폴리(A) RNA (5㎍)로 부터 람다 "ZAP-cDNA Synthesis Kit" (Stratagene)를 사용하여 제조되었다. 제조업자의 추천을 엄격히 준수하여, 비록 이들의 5'-말단에 Xho I을 포함하기위한 개질된 특정 라이브러리에 대한 것 일지라도, 각기 RT-PCR 클론의 2 및 6류, 및 1류에 대하여 두 개의 특정 올리고들 (CDNA8.401R 및 CDNA8.387R)의 혼합물을 사용하여 역전사를 프라이밍시켰다. 제 2의 사슬들은 RNase H를 갖는 헤테로듀플렉스 (헤테로두가닥사슬)의 처리후, DNA 중합효소를 이용한 닉(nick)-전사에 의해 합성되었다. 상기 cDNA를 Klenow로 채우고 EcoR I 수용체들로 결찰시켰으며 XhoI로 소화한 후, EcoRI-XhoI를 Uni-ZAP 벡터 아암 내 함유된 pBluescript 파지미드의 폴리링커 내에 삽입시킴으로써 직접적인 복제 및 Sepharose-400 스펀 칼럼 (Pharmacia)으로 크기-분할시켰다. 람다-ZAP는 Bluescript 파지미드를 함유하기 위해 공업용으로 제조된 치환 람다이며, 이의 폴리링커들은 cDNA를 복제하기 위해 사용된다.
올리고 서열 (5' → 3')
CDNA8.401R GAG AGA GAG AGA GAG AGA GAA CTA GTC TCG AGT CCC ATG GTT TTT AAT
CDNA8.387R GAG AGA GAG AGA GAG AGA GAA CTA GTC TCG AGC CGC CGT TTT TCA T
제조업자의 추천에 따라, Gigapack Ⅱ Gold 충전 추출물 (Stratage)를 사용하여 상기 라이브러리를 실험관 내에 충전시키고, 대장균 (E.coli) 세포 라인 XL1-블루 MRF로 배양시킨 후, 라일론 멤브레인 (Hybond N, Amersham)상에 전이시켰다. 전술한 바와 같이 소식자의 표식(labelling), 잡종형성 및 세척을 수행하였다.
pBluescript SK. E. coli SolR 세포 내 파아지미드가 재조합 람다-ZAP 및 한때 원형이었던, 관능 파아지미들를 제공하는 단일 사슬의 DNA를 합성하기 위해 필요한 단백질을 제공했던 헬퍼파아지로 동시-형질전환됨에 따라 복제된 cDNA를 원상태로 되게 하기 위해 선택된 람다-ZAP 클론들을 생체내에서 분절시켰다.
분석
a) 미소 시스테인 프로테아제에 자극을 받는, 특히 프라이밍된 1.104플라크 형성화 단위 (pfu)를 함유하는 cDNA 라이브러리를 2일-지난 오일 평지씨 떡잎으로 부터 얻었다. 5.103pfu를 평판배양시키고 교차-잡종형성을 체크하기 위해 3개의 복제 멤브레인 상으로 전이시켰다. 멤브레인들을 1, 2류 및 6류의 RT-PCR 복제물의 5'말단으로 각기 설계된 3개의 올리고 (CYS8.401MR, CYS8.402MR, CYS8.406MR)로 스크리닝시키고, 상기 기술한 바와 같이 표식을 붙였다.
5개는 유사하지만 짧은 5'-전사되지 않은 영역 및 650 bp의 암호화된 영역을 함유하는 독특한 5'-말단 시스테인 프로테아제를 얻었고, 생체 내에서 절제하여 배열시켰다. 이들은 2류 및 6류에 속하며 5'-말단 cDNA는 1류에 대해서는 발견되지 않았다. 2류로 부터 얻은 복제물들은 COT44 cDNA (Comai 및 Harrada, 1989)에 상당히 관계됨에도 불구하고 이들의 5'-말단 길이는 160bp 이상이다. 이는 COT44가 시그널 펩티드 및 프로펩티드의 일부에 해당하는 46 아미노산 (aa)을 배제시키고 있음을 나타내는 것이다. COT44와 더불어 2류로 부터 얻은 유도된 아미노산 서열의 cDNA 복제물들 CYS2UP6, CYS2UP7 및 CYS2UP8의 일렬정렬은 도 9에 추가 도시된다.
전체 길이 복제물들에 대해 직접적으로 표준 올리고(dT) 프라이밍된 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 두 개의 올리고 (CYS6B-UP 및 CYS6A-UP)는 각각 2류 및 6류로 부터 얻은 cDNA의 5'-유전암호화되지 않은 영역으로 설계되었다. 각기 다른 것 및 COT44를 갖는 복제물들의 예비 서열 정렬은 도 10에 보여진다.
올리고 서열 (5' → 3')
CYS8.401MR CCC ATG GTT TTT AAT GAC AAA TTG AAA A
CYS8.402MR CCG CCG TTT TTC ATT ATG AAT TGA AA
CYS8.406MR CGC CGT TTT TCA TGA TGA ATT GAA AA
b) 1.107pfu를 함유하는 대표적인 올리고(dT) 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 2일-지난 오일 평지씨의 떡잎으로 부터 얻었다. PCR에 의해 측정된 삽입물의 크기는 0.75 kb - 3 kb의 범위에 속하며, 평균 삽입물의 크기는 1.5 kb이다. 1.106pfu를 평판 배양하고 교차-잡종형성을 체크하기 위해 3개의 복제 멤브레인 상에 전이시켰다. 우선, 2류 및 6류 (1류, 20 양성; 2류, 250 양성; 6류, 130 양성)에 대한 복제물의 전체 길이를 확인하기 위해, 1류 RT-PCR 복제물의 5'-말단 암호화된 영역 및 2류 및 6류의 전사되지 않은 영역으로 각기 설계된 5'-말단 올리고 (CYS8.401MR, CYS6B-UP 및 CYS6A-UP)로 스크리닝하였다.
올리고 서열 (5' → 3')
CYS8.401MR CCC ATG GTT TTT AAT GAC AAA TTG AAA A
CYS6B-UP TAG AAA ACC AAC AAA ACA AAC ATA CAA T
CYS6A-UP GAA CAA CCA AGC CAA ACA TAC AAT AT
확실히 올바른 형태를 선택키 위해 전개 northern 블롯을 이용하여 상기 동일한 멤브레인을 3'-말단 소식자(probe)로 재차 스크리닝하였다. 2류 및 6류에 대해서는, 혹종의 교차 잡종형성을 피하기 위해 PCR에 의해 식별되는 3'-암호화되지 않은 영역을 사용하여 잡종형성을 실행하였다. 1류에 대하여, 암호화되지 않은 영역은 RT-PCR 복제물에 사용될수 없으므로 암호화된 영역의 일부를 소식자로서 사용하였다 (1류, 84 양성; 2류, 205 강한 양성; 6류, 85 강한 양성).
상기 두 특정 소식자 (5' 및 3')가 갖는 동일한 복제물의 수를 비교하여, 대부분의 라이브러리 내에 존재하는 시스테인 프로테아제 cDNA 복제물이 전체 길이임을 확인하였다.
1류 당 10개의 복제물들을 (5' 및 3' 소식자)로 잡종형성시켰지만, 두 개의 상이한 류로 부터 유도된 소식자들로의 잡종형성은 플라크 정제하여, 1류 당 4개의 복제물들을 생체 내에서 절제하였다. RT-PCR 연구로 부터 확인된 3개 류의 시스테인 프로테아제로 분류되는 6개의 전체 길이 시스테인 프로테아제 cDNA 복제물들을 분리하고 완전하게 배열시켰다 (1류에 있어서 2개, 2류에 있어서 3개, 6류에 있어서 1개). 상기 cDNA 복제물들의 정렬은 도 11에 보여지는 바와 같다. 상기물은 파파인 우수 족 (super family)에 관한 CP의 3개 류로 분류되며, 상기 예비-선구효소는 52% (1류), 90% (6류) 및 cot44과 함께 96% 일치(2류)로의 몫을 갖는다. 도 12 - 도 17은 각각의 CDCYS12, CDCYS14, CDCYS22, CDCYS24, CDCYS25 및 CDCYS66 복제물의 핵산 서열을 나타낸다. 펩티드 서열은 복제물 CDCYS12, CDCYS14, CDCYS22, CDCYS24, CDCYS25 및 CDCYS66에 관한 도 18에 도시된 바와 같이, 대부분의 식물 시스테인 프로테아제 내에 존재하는 특성들을 나타내고 추측가능케 하였다.
실시예 3
오일 평지씨 유전자 라이브러리의 스크리닝 및 서브클로닝 및 촉진유전자 영역의 특성화
올리고뉴클레오티드 소식자들은 1류 당 한 개의 cDNA의 5'-단말 암호화되지 않은 영역으로 발생되었으며, 촉진유전자 영역을 이동시키는 복제물들을 분리하기 위해 유전자 라이브러리를 스크리닝시키는데 사용되었다. 각각의 류에 대하여, 유전자 복제물들을 분리하고 보다 정밀한 특성화 및 삭제변이를 위해 촉진유전자를 파아지미드로 서브클로닝시켰다.
유전자 라이브러리 제조 및 스크리닝
오일 평지씨(Brassica napus cv.Bridger)로 부터 얻은 증폭된 λEMBL-3 무작위 유전자 라이브러리(Clontech)를 제조하였다. λEMBL-3 교체 벡터의 BamH I 부위로 복제하기에 앞서, DNA를 Mbo I로 부분 소화시키고 그 조각들을 수크로스 밀도차등을 이용하여 분리시켰더니 크기가 8 - 22kb로 되었다. Sambrook et al.(1989)에 의해 기술된 바와 같이 스크리닝 및 플라크 정제를 수행하였다. 3개류의 cDNA에 해당하는 유전자 복제물들을 분리하고 Grossberger(1987)로 부터 얻은 프로토콜을 사용하여 λDNA 미니프로퍼레이션을 수행하였다. 유전자 복제물들을 이들의 제한 조각 길이 폴리모르피즘 (RFLP)형태를 사용하여 매핑(mapping)시켰다: 잡종형성에 앞서 Sambrook et al., (1989)에 따라, 복제물들을 한 세트의 제한 효소로 소화시켰고 0.8% 아가로스 겔로 분석하는 동시에 두 개의 멤브레인 (Hybond N, Amersham)상으로 전이시켰다.
분석
제 1 스크리닝에 있어서, 20 게놈-등가 (2.106pfu)를 평판배양시켰고 교차 잡종형성에 대해 체크하기 위해 3개의 복제 멤브레인 상에 전이시켰다. 상기 멤브레인들을, 1류, 2류 및 6류의 cDNA 복제물들의 5'-말단에 각각 설계된 3개의 올리고 (CDNA12, CDNA25 및 CDNA66)로 가수분해 시켰더니 촉진유전자 구역에 상당히 근접해 졌다 (1류, 16 강한 양성; 2류, 9 강한 양성; 6류, 8 강한 양성). 3개의 류들 사이에서는 교차-잡종형성이 탐지되지 않았고 제 2 차 스크리닝을 위해 1류 당 10개의 복제물들을 선택하였다.
올리고 서열 (5' → 3')
CDNA12 ATC GTC TTC TTC CTT TGT TTC TCT CA
CDNA25 CTT CGT CAG CGA AAC TCC TCT CTT
CDNA66 CAG AAC TAG AAC AAC CAA GCC AAA C
northern 블롯에 의해 평가된 RT-PCR 복제물들에 상응하는 게놈 복제물들을 명확히 탐지하기 위해 도 6과 관계하여 기술된 3'-말단 PCR 소식자를 사용하여 제 2 차 스크리닝을 수행하였다. 복제물들 중 몇몇은 이 소식자들 (1류에 대하여 1개 및 2류에 대하여 2개)에 의해 확인되지 않았으며, 이들은 이들의 3'-말단 내 짧은 복제물들로 되는 경향이있고 촉진유전자 분리에 용이하므로, 이들은 제 1 차 스크리닝으로 부터 얻은 소식자를 사용하여 보호되었다. 1류 당 10개의 복제물들을제 1 차 스크리닝으로 부터 얻은 소식자를 사용하여 2번 이상 정제함으로써 프라크 정제시켰다. 중복 복제 (증폭된 무작위 라이브러리)를 피하기 위해 1류 당 8개의 게놈 복제물들로 부터 DNA를 제조하여 이를 RFLP로 특성화하였다. 복제물들을 Sal I 및 BamH I로 절단하여 0.8% 아가로스 겔로 분석하고 복제 멤브레인상에 전이하여 두 세트의 소식자로 잡종형성시켰다. 올리고는 각각의 cDNA 복제물들 CDCYS12, CDCYS25 및 CDCYS66의 중간부 암호화된 영역 (CYS8.401MR, CYS8.406MR 및 CYS8.406MR) 및 5'-암호화되지 않은 영역 (CDNA12, CYS6B-UP 및 CYS6A-UP)으로 설계되었다.
1류 당 4개의 남아있는 복제물들은 (12g4, 12g5, 12g6, 12g8; 25g2, 25g4, 25g5, 25g7; 66g1, 66g4, 66g8 및 66g9) 기타의 연이은 소화/잡종형성을 사용하여 추가적으로 특성화되었다. 1류 cDNAs는 변역 개시로 부터 얻은 BglⅡ 부위 500bp를 함유하고, 제 2 류 및 제 3 류 cDNA는 변역 개시로 부터 얻은 HindⅢ 부위 300bp를 함유하며, 이 효소들은 Sal I와 함께 및 배제되어 사용되었고, 이는 삽입물을 방출시켜 서브클로닝에 적당한 게놈 조각을 발생시켰다. 추정상의 인트론을 인식함으로써 촉진유전자 면적의 크기를 예측하기 위하여 게놈 DNA 및 cDNA의 PCR 실험을 수행하였다. 5'-암호화되지 않은 영역 내 전방 프라이머 및 BglⅡ 및 HindⅢ 제한 부위 뒤에 위치하는 역 프라이머를 사용하는 PCR은 1류 cDNA들의 600 bp의 범위 내 400 bp 인트론이 존재하는 반면 제 2 류 및 제 6 류의 300 bp의 범위 내에는 인트론이 존재하지 않는다는 것을 보여주었다. 1류 당 한 개의 게놈 복제물 (12g6, 25g7 및 66g1)에 대해 2 - 5 kb의 범위 내의 크기로 예상되는 촉진유전자 조각들이 확인되었으며, 이를 pBluescript KS+로 서브클로닝할 준비를 갖추었다.
실시예 4
전사 개시의 특성화
촉진유전자를 함유하는 게놈 람다-조각을 보다 정밀하게 특성화하기 위하여 pBluescript KS+로 서브클로닝하였다. 서열화에 있어, 프라이머 확장 장치를 사용하여 실질적인 전사 개시를 메핑하기 이전에 추정상 전사 시그널을 확인하였다. 상기는 전사 개시에 밀접한 영역 내에 설계된 표식된 역 프라이머의 확장을 포함한다. RNA 템플레이트를 분해한 후, 확장 생성물을 폴리아크릴아미드 겔 내에 크기에 따라 배열하였다.
분석
촉진유전자를 함유하는 게놈 조각들을 1류 (pKS12P6)에 관한 BamH I 내에서 복제된 Bgl Ⅱ-2.6kb 삽입물로서, 2류 (pKS25P7)에 관한 Hind Ⅲ-4.2 kb 삽입물로서, 6류 (pKS66P1)에 관한 BamH I-Hind Ⅲ-2.4 kb 삽입물로서 pBluescript 내로 서브클로닝하였다. pUC1 및 pUC4 벡터 올리고 및 cDNA들 (1류에 관한 CDNA14R 및 2류 및 6류에 관한 CDNA66R)의 5'-말단으로 설계된 2개의 내부 역 프라이머를 사용한 서열화는 복제물들의 배향 및 추정상 전사 시그널 (Pautot et al., 1989)의 확인을 가능케하였다. 서브클로닝된 게놈 조각들로 부터 얻은 촉진유전자들의 전체 뉴클레오티드 서열은 각각 1류, 2류 및 6류에 관한 도 19, 20 및 21에 도시되어있다.
올리고 서열 (5' → 3')
CDNA14R GAA GAA ACT AGA AGA AGG GAG AAG AA
CDNA66R TCA CTT CTT CAT CGG TTC TCC A
하기와 같이 개선된 Sambrook et al. (1989)에 의하여 전사 개시를 프라이머 확장 실험들에 의해 추정적으로 메핑하여 왔다. 각기 1류, 2류 및 6류에 대해 설계된 올리고 (CYSGE12R, CYSGE25 및 RCYSGE66R)를 전술한 바와 같이 말단기를 교환함으로써 표식하였다. 세슘 클로라이드 방법을 사용하여 3일-지난 오일 평지씨의 떡잎으로 부터 분리된 전체 RNA (50ug)를 2ng의 프라이머와 함께 침전시켜 30㎕ 잡종형성 완충액 [1mM EDTA; 400mM NaCl; 40mM PIpes; pH 6.4; 70%, v/v, 비이온성 포름아미드] 내에서 재부유시켰다. 32℃에서 밤새도록 어닐링을 수행하고 85℃에서 10분 동안 변성시켰다. 25㎕의 역전사 완충액 [50 mM KCl; 10 mM MgCl2; 1 mM dNTPs; 1 U/ul RNase 억제제] 내에서 침전 및 재부유를 시킨 후, 상기 프라이머들을 2.5 U MuLV 역 전사효소 (Perkin-Elmer)로 42℃하에서 90동안 확장시켰다. 템플레이트 RNA를 20U의 RNase (RNace-it, Stratagene)로 37℃하에서 30분동안 분해하였다. 각 류들에 있어, 프라이머 확장에 관한 동일한 프라이머를 사용하는 게놈 복제물들 (pKS12P6, pKS25P7 및 pKS66P1)로 수행되는 서열화 반응과 병행하여 폴리아크릴아미드 변성화 겔로 확장 생성물들을 분석하였다.
올리고 서열 (5' → 3')
CYSGE12R AGG AAG AAG ACG ATG ATG GTG ACA
CYSGE25R GTA CAA GAG AAG TAA AGA GAG GAG T
CYSGE66R CGT ATA GGA GAA GTA AAG AAA TGA GT
도 22 에 도시한 바와 같이, 1류 전사는 Pautot et al.(1989)에 의해 번역된 49 기타 식물 유전자와 비교되는 양호한 상황 (context)[t27T35C49A78a18C45g8%] 개시된다. 보존된 뉴클레오티드들은 대문자로 기재하고 중요한 것들은 굵게 기재하였으며 전사 개시점은 밑줄을 그엇다. 상기 전사 개시는 가장 긴 cDNA 상부의 152 뉴클레오티드 및 전사 개시에 앞서 추정의 TATA 박스에 위치하는 179 뉴틀레오티드 하부의 22 뉴클레오티드에 메핑되어 왔다.
TATA 박스에 대한 컨센서스가 Pautot et al.(1989)에 의해 번역된 79 기타 식물 유전자들과 비교하여 최적의 [c34a18t32t34a3A97T90A94a47A95a30A71G44%]는 아니지만, 상기 결과는 ATG 하부의 올리고 프라이밍 34 뉴클레오티드를 사용하는 선행 확장 실험에 의해 확증되었다. 전사 개시 및 가장 긴 cDNA 사이의 간격은 임의의 전사 개시점의 유무에 의해 또는 5'-번역되지 않은 영역 내의 인트론의 존재여부로 설명될 수 있다.
2류 전사 개시는 양호한 상황 [a18a20a22A78T49C45A43%]에 있으며, 식물 컨센서스 [T37g11g14t34T96A97T90A94a47A95T63A71G44%] 내에 잘 맞는 추정의 TAYA 박스 후 33 뉴클레오티드에 위치되어 왔다. 상기는 전사 개시 전 53 뉴클레오티드 및 cDNA (도 22)에 해당한다.
6류 전사 개시는 거의 2류와 동일한 상황 [g18a20a22A78T49C45A43%]에 있으며, 2류에 관한 것과 정확히 동일한 컨센서스를 나타내는 추정의 TATA 박스 후 30 뉴클레오티드에 위치해 왔다. 상기는 전사 개시전 51 뉴클레오티드 및 cDNA (도 22)상부 19 뉴클레오티드에 해당한다.
실시예 5
촉진유전자 절제
리포터 유전자와의 퓨전에 앞서, 촉진유전자들은 전사 개시 및 번역 개시 사이에서 정밀하게 절단되어야 한다. 유용한 제한 부위는 2류 및 6류의 게놈 유전자에 사용 불가하기 때문에, 상응하는 내인성 조각들을 교체하기 위해 사용되는 PCR 조각들로 설계하였다.
분석
암호화된 영역의 남아있는 부분을 제거하기 위해, Hind Ⅲ 부위를 번역 개시 전 2 뉴클레오티드, 1류 게롬 복제물에 관한 PCR로 삽입하였다. CYSGE12C 및 CYSG12CR 올리고를 사용하여, pKS12p6DNA에 관한 15 싸이클의 PCR에 의해 270 bp 조각을 발생시켰다.
동일한 방법으로, 각각의 pKS25p7 및 pKS66p1 DNA 상의 2세트의 올리고들(CYSGE25C, CYSG25CR 및 CYSGE66C, CYSG66CR)을 사용하여 2류 및 6류 게놈 복제물들의 번역 개시 이전에 BamH I 부위를 삽입하였더니 165 bp 조각이 생성되었다.
1류에 있어서, Bsm I 및 Hind Ⅲ에 의해 절단된 PCR 조각으로 교체하기에 앞서 900bp 조각을 절제하기 위해 재생된 겔 및 Bsm I 및 Hind Ⅲ로 pKS12p6을 절단하였더니, pKS12p가 생성되었다.
2류에 있어서, 460bp 조각을 절제하기 위해 제생된 겔, Bsm I 및 Hind Ⅲ에 의해 pKS25p7을 절단하고, Sph I 및 BsmH I로 절단된 교체 PCR 조각로 결찰시켰더니, pKS25p가 생성되었다.
6류에 있어서, pKS66p1을 Hind Ⅲ로 절단하고 DNA 폴리메라제 I의 Klenow 조각으로 채운 후 Sph I 및 440bp 조각을 절제하기 위해 제생된 겔로 절단하였다. 상기 PCR 조각들을 T4 DNA 폴리메라제로 무디게 끝처리하고 Sph I로 절단하여 삭제된 pKS66p1으로 복제하였더니, pKS66p가 생성되었다.
올리고 서열 (5' → 3')
CYSGE12C GTA ATG GCC TAG CCT GTC TGG C
CYSG12CR GAT GAT GGT GAC AAG CTT TTT CTT ACA GG
CYSGE25C CTA TCT TGC ATG CCC ATT ATT ACT TT
CYSG25CR ACG AAG CCG GAT CCT ATG TTT GTT TTG TTG
CYSGE66C CAT CTT GCA TGC CCA TTA CTG CAT
CYSG66CR AGG AAG CCG GAT CCT ATG TTT GGC TTG G
실시예 6
촉진유전자-GUS 제조물
상이한 생물 조건 및 환경 조건하 및 이종시스템 내에서 복제된 촉진유전자 영역의 공간 및 시간의 조절을 측정하기 위해, 리포터 유전자를 담배 속으로 주입시켰다. 각각의 촉진유전자 조각 및 β-글루쿠로니다제 (GUS) 유전자 사이의 전사 퓨전(fusion)들을 식물 분석 및 조직화학적 위치측정을 위해 설계하였다. 의심의 여지를 피하고자, 편의상 리포터 유전자를 본원에 사용하여, 포함된 원칙들을 증명하였다. 측정치 않은 상황에서 본발명의 촉진유전자에 의해 조절된 유전자는 의도하는 효과를 발생시키는 유전자일 것이다.
플라스미드 제조
표준 재조합 DNA 방법을 플라스미드 벡터 (Sambrook et al., 1989)를 제조하는데 채택하였다. CP12 Hind Ⅲ-NotI-1.7kb 촉진유전자 조각을 pKS12P로 부터 절제하고, DNA 폴리메라제 I의 Klenow 조각을 사용하여 채운 후 β-글루쿠로니다제 (Jefferson et al., 1987)를 암호화하는 E.coli uidA 유전자를 함유하는 Agrobacterium Ti 벡터 pTAK1의 Sma I 부위로 결찰하였더니 pTAKCP12 2성분 벡터가 생성되었다. 상기와 동일한 방법으로, CP25 Hind Ⅲ-BamH I-3.7 kb 및 CP66 BamH I-1.9 kb 촉진유전자 조각을 각각의 pKS25P 및 pKS66P로 부터 절제하여 상기와 동일한 효소로 절단된 pTAK1로 결찰하였더니 pTAKCP25 및 pTAKCP66 2성분 벡터가 생성되었다. 모든 제조물을 벡터 제조용 중간체 숙주로서 E.coli 균주 DH5α로 형질변환시켰다. 결과로서 얻어진 키메릭 리포터 유전자 제조물의 구조를 PCR, 제한 소화 및 서열 분석에 의해 확인하였다. 도 23은 식물 형질변환을 위한 제조물의 개략도를 나타내는 것이다.
식물 형질변환
플라스미드 pTAKCP12, pTAKCP25 및 pTAKCP66을 Holsters et al. (1978)에 의해 기술된 동결/비틀림 방법을 사용하여 Agrobacteriun tumefaciens LBA4404로 변형시켰다. 담배 (Nicotiana tabacum var. Samsun) 형질전환체를 leaf disc 방법 (Bevan, 1984)에 의해 생성시켰다. 100mg/l 카나마이신 및 200mg/l 카베니실린을 함유하는 배지 상에서 싹을 피웠다. 뿌리 내린 후, 묘목들을 온실에 옮기고 16시간 빛 / 8시간 어둠 조건하에 생장시켰다.
결과
12CP 식물 25CP 식물 66CP 식물
# 자라기 시작한 싹 440 250 404
# 뿌리 내린 싹 130 (30%) 82 ( 33%) 120 (30%)
# 분양용으로 분할된 싹 100 82 100
# 뿌리가 다시 내린 싹 84 (84%) 58 (70%) 71 (71%)
제 1 차 형질전환체 분석
목적
우선 분석용 식물의 수를 감소시키기 위해 제 1 차 형질전환체를 폴리메라제 사슬 반응 (PCR)로 분석하여 완전한 촉진유전자-리포터 유전자 카세트가 함유되어 있는지 확인하였다.
촉진유전자들은 유합조직 내에서 조절되지 않을 수도 있기 때문에, 유합조직의 형질전환을 GUS 분석하여 상기 촉진유전자들이 상기 단계에서 비활성임을 확인하였으며, 이는 이식유전자의 속성에 의존하는 미래 형질전환 효율에 악영향을 미칠수도 있다 (예를 들면, 바르나제 리보헥산 가수분해 효소 유전자가 상기 촉진유전자들 중 하나에 의해 유도될 경우). 또한 제 1 형질전환체로 부터 어린 잎들 내 촉진유전자들을 측정하였더니 상기 단계에서 변위 발현이 생기지 않음을 확인하였다.
중합효소 사슬 반응
이식유전자 식물의 PCR 분석용 게놈 DNA를 Edwards et al. (1992)에 따라 제조하였다. 식물 추출물 DNA (2.5 ul)를 25ul PCR 반응 [200uM dNTPs; 3mM MgCl12; 1uM 올리고; 1×PCR 완충물] 내 2U의 Taq 중합효소를 사용하여 증폭하였다 [80℃ 고온에서 시작; (94℃, 1분; 63℃, 1분; 72℃, 1분)×35 싸이클; (72℃, 7분)×1 싸이클].
결과
1류 당 37 개의 형질전환체 전체를 실험관 내에서 배양균 12CP, 25CP 및 66CP 외식체로 부터 취하여 2개의 세트 프라이머로 분석하였다. 제 1 세트는 NPTⅡ 유전자 (NOSTER1)의 NOS 종결유전자의 5' 말단에 특이적인 한 개의 프라이머 및 상기 복제된 촉진유전자 (CYSGE12R, CYSGE25R 또는 CYSGE66R)의 5' 말단에 특이적인 역-프라이머를 함유한다. 제 2 세트는 촉진유전자 (CYSGE12C, CYSGE25C 또는 CYSGE66C)의 3' 말단에 특이적인 한 개의 프라이머 및 GUS 유전자 (GUS1R)의 5' 부분에 특이적인 역 프라이머를 함유한다. 총 34 개의 외식체들이 6류 (측정된 식물들의 94%)에 대하여 이중 PCR 양성을 나타내었으며, 반면 1류 및 2류에 대해서는 단지 27 개의 식물들이 기대되어지는 결과를 낳았다 (측정된 식물들의 73%). 원상 그대로의 카세트를 포함하는 식물들을 온실로 옮기고 자가-수분시켰다.
올리고 서열 (5' → 3')
CYSGE12RT GGG TTC TTC TGG GTA GCA AAC TG
CYSGE25RT ACT TCA CGT TCT GAA TCT CAT CGA A
CYSGE66RT GGG CCA GAA TGC GGA TTT TAC TAA
GUSIR CGC TTT CCC ACC AAC GCT GAT C
NOSTERI TTG AAT CCT GTT GCC GGT CTT GC
GUS 효소 분석
기질 4-메틸움벨리페릴-D-글루쿠로나이드 (시그마)로 수행된 GUS 활성을 위한 형광분석은 Perkn-Elmer LS-35 형광계 (Jefferson et al., 1987)를 사용하여 실행되었다. 조직 균질화의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석법에 의해 측정되었다 (Bradford, 1976).
결과
각각의 류에 대하여 형질전환 공정에서 얻은 20개의 재발생화 유합조직들을 GUS 분석하였다. 야생잎 및 유합조직 뿐만 아니라 35S-GUS 이식유전자 식물들로 부터 얻은 잎들로 부터 유도된 담배 추출물들을 음성 및 양성 대조구로서 각기 사용하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 35S-GUS 식물들로 부터 얻은 잎들 내 존재하는 정도와 비교하여 유합조직 내의 현저한 GUS 활성은 탐지될 수 없었다.
도 25는 각각 류의 제 1 형질전환체로 부터 얻은 어린 잎들 내의 GUS 활성의 정도를 예비 측정한 것을 도시하는 것이다. 상기 결과는 촉진유전자들이 상기 단계에서 비활성인 것을 나타낸다. 이는 1류와는 다르게 나타난 2류 및 6류로 부터 얻은 northern 블롯의 결과를 확인하는 것이다 (도 6). 1류 CP는 잎들에 있어서의 약간의 발현을 나타내는 것이지만 이는 소극자의 속성에 기한 교차-잡종형성 문제점 때문이라고 생각된다.
종속 (POPULATIONS) 분리의 분석
목적
본목적은 각각의 류에 대하여 저 발현체에서 고 발현체에 이르는, 바람직하게는 라인들간의 비교성 촉진으로 인해 이식유전자의 단일 유전좌위 삽입을 갖는 라인들에 이르는 4개의 GUS 발현화 라인 (line)들을 선택하는 것이다. 제 1 형질전환체들 내 유전좌위들의 수는 후대개체 내 NPTⅡ (내(耐)-카나마이신) 유전자의 분리에 의해 측정되었다.
분리 테스트
씨들을 10% 표백제 내에서 15분동안 살균시켰다. 살균수로 여러번 세척한 후, 약 150개의 씨들을 100mg/l 카나마이신을 함유하는 1/2MS 배지 (2.3g/l MS 염, 1.5% 수크로스, 0.8% Bactoagar, PH 5.9) 상에 뿌렸다. 기록에 앞서 16시간/8시간 빛/어둠에서 26℃로 3주간 씨들을 생장시켰다. 제 1 형질전환체가 한 개의 복제 이식유전자를 함유할 경우, 씨앗 kanR 대 kanS 의 기대되는 비율은 3 대 1이었다 (비록 드문 경우에 있어서는 한 개의 유전좌위가 몇몇의 이식유전자들을 포함할수 도 있음).
결과
실질적으로 다수의 식물들은 혹종의 식물 내 꽃들의 다양한 비율이 꽃잎으로 대체되는 한 개 이상의 정상적인 수술을 갖는 petaloidie 표현형을 나타내고 있다.
상기 식물들 중 몇몇은 매우 악영향을 받아 혹종의 씨들을 복구할 수 없었다.
하기 표는 제 1 형질전환체을 위한 유전자 데이터를 요약한 것이다.
12CP 식물 25CP 식물 66CP 식물
# 온실 내 라인 27 27 34
# 씨들을 제공하는 라인 22 (81%) 22 (81%) 29 (85%)
# petaloidie 표현형 13 (48%) 11 (41%) 5 (15%)
# 단일한 유전좌위 삽입 11 (50%) 9 (41%) 12 (41%)
예비 시간 코스 실험
northern 블롯의 결과에 의하면 씨의 팽윤 (DAI) 후 2 - 3일간 오일 평지씨 내 CP mRNA가 축적된다. 그러나, 담배 내 이형 발현은 생리기능 및 전사경향의 차이로 인해 오일 평지씨 내 내인성 발현과 다르다. 또한, 촉진유전자의 활성은 리포터 단백질을 통해 직접적으로 분석되었으며, 이는 탐지하는 것을 지체시킨다. 그래서, 모든 F1 세대들이 분석될 수 있는 시점에 착수키 위해서는 각각의 촉진유전자로 부터의 GUS 발현의 시간 경과를 확고히하여야 한다.
결과
본실험은 35S-GUS 대조구 라인 및 야생형 뿐만 아니라 1류 당 2개의 무작위 라인들로 수행되었다. 매시각 마다, 대조구 뿐만 아니라 라인들 12CP5, 12P14, 25CP8, 25CP13, 66CP8 및 66CP76 중 40개의 씨를 1/2MS 배지를 함유하는 평판상에서 26℃, 16시간/8시간 빛/어둠하에 생장시켰다. 묘종들을 0, 2, 4, 6, 8, 10, 29 및 36 DAI에서 표본으로 제조하여 -70℃에서 저장하였다. 0 - 10 DAI 시점에서, 10개의 가장 큰 묘종들을 수집하여 이 표본들 중에서 변이성이 증가된 5개 만을 29 DAI 및 36 DAI에서 취하였다.
상기 기술된 조건 하에서 생장한 담배 묘종들에서 3개의 라인들의 6개는 발아 동안 GUS 발현의 유도를 나타내었다 (도 26). 단백질 축적이 명백히 8 DAI 에서 시작되었음에도 불구하고, 약 30 DAI에서 최고를 나타내었다. 따라서, GUS 발현체의 범위를 확인코자 14 및 28 DAI에서 F1 세대를 평가할 수 있었다. 잎들 내의 상대적 가장 높은 수준의 발현은 이식유전자의 위치 효과 때문일 수 있다고 주장되고 있음에도 불구하고, 그 활성의 최고값은 가장 탁월한 발현화 라인 (12CP5) 내 35S-GUS의 약 5%이었다. 평균 수준의 발현은 35S-GUS의 약 1% 이상인 것으로 추정된다.
발아 동안 고 GUS-발현하는 라인들의 확인
결과
묘종들을 전술한 조건하 100 mg/l 카나마이신으로 추가된 1/2M 배지 상에 생장시켰다. 5개의 묘종들을 0 (건조 씨), 14 (2개의 팽창된 잎들) 및 28 DAI (4개의 팽창된 잎들)을 수확하여, 수집하고 전술한 바와 같은 복제물들로 평가하였다.
도 27, 28 및 29는 각각의 1, 2 및 6류에 대한 발현 수준을 요점으로 한다. 상기 예비 데이터는 촉진유전자가 묘종-특정한 방법으로 담배내에서 발현되었음을 나타낸다. 2류 촉진유전자 조각은 상기 단계에서 1류 보다 더 활성적인 반면, 6류는 극히 낮은 수준의 발현을 나타낸다.
GUS 조직화학적 탐지
전체 묘종들의 GUS 조직화학적 스테이닝은 1 mM X-gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-D-글루쿠로나이드, 100 mM NaPO4pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5 mM K3Fe(CN)6, 0.5 mM K4Fe(CN)6, 0.1% Titon X-100, 0.1% DMSO)를 함유하는 용액과 더불어 진공 침투함으로서 달성될 수 있다. 37℃하에서 12시간 배양한 후, 원상 그래로의 묘종을 사진으로 찍었다. 이와는 다르게, 액체 질소로 동결시키기 이전에 스테이닝된 묘종들을 Tissue-Tek OCT 화합물로 진공 침투시켰다. 투명한 저온유지장치 마이트로톰 (모델 5030)을 사용하여 -23℃에서 20㎛ 마디들을 절단하였다.
본 발명의 기타 변경은 본 발명의 영역을 벗어나지 않는 범위 내에서 당업자들에 의해 실시되어질 것이다.
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Claims (36)

1류, 2류 또는 6류의 오일 평지씨 시스테인 프로테아제 촉진유전자의 DNA 서열을 포함하는 촉진유전자.
도19에 도시된 바와 같은 DNA 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동성을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하는 촉진유전자.
도20에 도시된 바와 같은 DNA 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동성을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하는 촉진유전자.
도21에 도시된 바와 같은 DNA 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동성을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하는 촉진유전자.
전기한 항들 중 어느 한 항의 촉진유전자의 특징적인 특색 및 특성을 가지는 촉진유전자.
조작하기 용이하도록 대상 유전자에 결합되어 있는 전기한 항들 중 어느 한 항의 촉진유전자를 포함하는 재조합 DNA 구조물.
세포 작용을 파괴할 수 있는 생성물을 암호화하는 파괴 유전자 및 상기 파괴 유전자에 대한 전기한 항들 중 어느 한 항에 따른 촉진유전자를 포함하는 식물에 작용하는 재조합 DNA 구조물로서 상기 파괴 유전자는 화학적인 유도체를 외부적으로 가하여 유도할 수 있는 촉진유전자를 포함하는 외부적으로 통제가능한 유전자 조절 영역에 가능적으로 연결되고 조절되는 재조합 DNA 구조물.
제7항에 있어서, 유도성 촉진유전자가 억제 단백질에 관능적으로 연결되어 이를 조절하고 파괴유전자 촉진유전자가 억제 단백질에 의하여 인식되는 작동유전자 서열을 포함하여 유도체의 존재하에 작동유전자 서열과 상호작용하는 억제단백질이 생성됨으로써 제2의 촉진유전자를 무력하게 하고 파괴유전자의 발현을 억제하는 재조합 DNA 구조물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 파괴유전자가 누클레오티드 서열이고 식물 생장에 필수적인 내재하는 식물 유전자 또는 상기 식물에 의도하는 특성을 부여하는 유전자에 대하여 센스 방향이거나 내재하는 식물 유전자의 부분적 센스 서열을 포함하는 재조합 DNA 구조물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 파괴유전자가 누클레오티드 서열이고 식물 생장에 필수적인 내재하는 식물 유전자 또는 상기 식물에 의도하는 특성을 부여하는 유전자에 대하여 안티센스 방향인 재조합 DNA 구조물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 내재하는 식물 유전자가 종자 발아 또는 초기 묘종 생장에 필수적인 재조합 DNA 구조물.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 외부적으로 통제가능한 유전자 조절 영역이 글루타티온 S-전이효소 시스템, Alc 시스템 또는 엑디손 시스템으로부터 얻은 화학적으로 유도가능한 촉진유전자 서열인 재조합 DNA 구조물.
제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 억제 단백질 유전자가 박테리아 억제유전자를 암호화하는 재조합 DNA 구조물.
제13항에 있어서, 억제 단백질 유전자가 lac 억제유전자 또는 434,P22에 의하여 사용되는 억제유전자 또는 람다-박테리오파지를 암호화하는 재조합 DNA 구조물.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴유전자 또는 파괴유전자 촉진유전자가 "유사-작동유전자"를 함유하는 재조합 DNA 구조물.
제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴유전자가 세포독 유전자(cytotoxic gene)인 재조합 DNA 구조물.
제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴유전자가 재조합효소 인식 서열에 의하여 측면공격받은 누클레오티드 서열을 절단하는데 적용되는 재조합효소 또는 전달효소를 암호호하는 재조합 DNA 구조물.
도12에 도시된 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하고 시스테인 프로테아제를 암호화하는 DNA.
도13에 도시된 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하고 시스테인 프로테아제를 암호화하는 DNA.
도14에 도시된 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하고 시스테인 프로테아제를 암호화하는 DNA.
도15에 도시된 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하고 시스테인 프로테아제를 암호화하는 DNA.
도16에 도시된 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하고 시스테인 프로테아제를 암호화하는 DNA.
도23에 도시된 서열의 최소한 일부 또는 이와 실질적인 상동을 가지는 서열의 최소한 일부 또는 이의 변종을 포함하고 시스테인 프로테아제를 암호화하는 DNA.
조작하기 용이하도록 촉진유전자에 결합된 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 식물에 작용하는 재조합 DNA 구조물.
제6항 내지 제17항 중 어느 한 항 및 제24항에 있어서, 곡물 또는 묘종 또는 식물의 게놈 DNA내에 합체, 바람직하게는 안정하게 합체될 경우 발아하는 묘종의 조직 또는 조직들 또는 생장하는 곡물 또는 식물에서 발현될 수 있는 재조합 DNA 구조물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 촉진유전자에 융합된 대상유전자를 포함하고 식물 재료의 조직 또는 조직들에서 발현될 수 있는, 식물 재료의 조직 또는 조직들용 발현 시스템.
제26항에 있어서, 발현 시스템이 최소한 발아하는 묘종 또는 생장하는 곡물 또는 식물의 조직(예를들어 뿌리, 떡잎, 잎 및 줄기)에 대한 것인 발현 시스템.
제26항 또는 제27항에 있어서, 발현 시스템이 발아하는 묘종의 게놈 DNA 또는 생장하는 곡물의 게놈 DNA 또는 식물의 게놈 DNA내에 합체, 바람직하게는 안정하게 합체되는 발현 시스템.
제6항 내지 제17항 중 어느 한 항 및 제24항의 구조물을 포함하는 발현 시스템.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 촉진유전자, 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항의 DNA, 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항 또는 제24항의 재조합 DNA 구조물 또는 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항의 발현 시스템을 포함하는 재조합 식물 게놈.
제30항의 재조합 식물 게놈을 가지는 식물, 식물 종자 또는 식물 세포.
제6항 내지 제17항 중 어느 한 항 또는 제24항의 재조합 DNA 구조물을 포함하는 식물을 포함하는 보호된 식물 생식질.
제6항 내지 제17항 중 어느 한 항 또는 제24항의 재조합 DNA 구조물을 포함하는 성숙시까지 생장할 수 있는 식물 또는 종자.
식물 재료의 조직 또는 조직들내에서 촉진유전자와 융합될 경우 대상 유전자의 발현을 유도하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 촉진유전자의 용도.
제34항에 있어서, 촉진유전자가 최소한 발아하는 묘종 또는 생장하는 곡물 또는 식물의 조직 또는 조직들(예를들어 뿌리, 떡잎, 잎 및 줄기)에서 촉진유전자에 융합될 경우 대상 유전자의 발현을 유도하는데 사용되는 용도.
실질적으로 도12 내지 17 및 19 내지 21 중 어느 한 항을 참고로 기술한 바와 같은 촉진유전자, 구조물 또는 발현 시스템.
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