DE69937444T2

DE69937444T2 - Isolierte und aufgereinigte nukleinsäuren, welche ein gen enthalten, welches in hopfendrüsen exprimiert wird

Info

Publication number: DE69937444T2
Application number: DE69937444T
Authority: DE
Inventors: Yukio Nitta-gun OKADA; Kazutoshi Nitta-gun ITO
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: ES2296378T3; ATE377083T1; EP1054986A1; JP2002504344A; US6265633B1; PT1054986E; CZ300064B6; CZ20003048A3; AU762297B2; WO1999042599A1; US20020010952A1; US20030192071A1; CN1291234A; AU2301199A; US6639127B2; EP1054986B1; DE69937444D1; US7060815B2; CA2321180A1; NZ506450A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren, welche ein Gen umfassen, das in den Lupulindrüsen von Hopfen spezifisch exprimiert wird, sowie regulatorische Sequenzen hiervon.
Beschreibung des Hintergrundes
Pflanzen produzieren und speichern eine große Vielzahl von niedermolekulargewichtigen organischen Verbindungen einschließlich Terpenoide, Alkaloide, Phenolverbindungen, Saponine, etc. Da früher nicht davon ausgegangen wurde, dass diese Verbindungen direkt an der Unterstützung lebender Materie beteiligt sind, sondern dass sie nur eine untergeordnete biologische Funktion haben, wurden sie herkömmlicherweise als "sekundäre Stoffwechselprodukte" bezeichnet.
Jedoch ist nun aufgeklärt worden, dass diese sekundären Stoffwechselprodukte die Funktion haben, die Zelldifferenzierung zu fördern sowie Zellen vor äußerlichen schädlichen Faktoren zu schützen. Des Weiteren sind diese sekundären Stoffwechselprodukte, welche durch Pflanzen gebildet werden, in einem breiten Bereich allgemein bekannter Nahrungsmittel, Medikamente, Farbstoffe etc. verwendet bzw. verwertet wurden.
Diesen sekundären Stoffwechselprodukten ist im Hinblick auf ihren Nutzen sehr viel Beachtung geschenkt worden, so dass die Produktionswege hierfür in Pflanzenzellen nacheinander aufgeklärt wurden, wobei sich gezeigt hat, dass diese Verbindungen durch eine komplexe biosynthetische Kaskade unter Beteiligung einer Reihe von Enzymen hergestellt werden. Die meisten dieser Verbindungen, welche durch eine Kaskade von enzymatischen Reaktionen biosynthetisiert werden, können durch die direkte Extraktion von Pflanzenmaterialien isoliert werden, wobei aber eine solche direkte Extraktion aus Pflanzen den Anforderungen für eine Produktion im großen Maßstab nicht genügt und auch im Allgemeinen kostspielig ist. Daher ist damit begonnen worden, Verfahren für die Synthese dieser Verbindungen in vitro, z. B. unter Verwendung von gezüchteten Zellen, zu entwickeln.
Unter anderem ist gezeigt worden, dass Hopfen, welcher ein wichtiger Stoff ist, der Bier eine erfrischende Bitterkeit sowie Geschmack verleiht, eine Vielzahl von sekundären Stoffwechselprodukten, welche sehr zur Bitterkeit und zum Geschmack des Bieres beitragen, in den Lupulindrüsen der Zapfen sezerniert.
Auf Grund dieser Tatsache sind verschiedene Züchtungsversuche mit Hopfen unternommen worden, welche sich neben der Verbesserung der landwirtschaftlichen Eigenschaften davon auf die sekundären Stoffwechselprodukte, die in den Lupulindrüsen angereichert werden, wie Bitterstoffe, etherische Öle etc. konzentrierten.
Jedoch handelt es sich bei Hopfen um eine zweihäusige Pflanze, wobei insbesondere die männliche Pflanze, die keine Zapfen trägt, die das Material für Bier darstellen, kommerziell nicht genutzt wird und demgemäß nicht aktiv untersucht worden ist, so dass die genetischen Eigenschaften davon, welche für das Bierbrauen nützlich sind, bisher kaum erforscht worden sind. Daher ist die Züchtung von Hopfensorten durch eine herkömmliche Kreuzung gegenwärtig in hohem Maße von der Erfahrung und der Intuition des Züchters abhängig, wobei insbesondere im Hinblick auf die Qualität der Fermentationsprodukte bis zu dem Zeitpunkt, wenn tatsächlich Zapfen erscheinen, überhaupt keine Voraussage gemacht werden kann.
Demgegenüber stehen heutzutage für verschiedene Pflanzen gentechnische Züchtungsverfahren wie Transformationstechniken und markergestützte Selektionsverfahren zur Verfügung. Diese Verfahren ermöglichen im Vergleich zu den konventionellen Züchtungsverfahren, welche im hohen Maße von der Erfahrung und der Intuition des Züchters abhängig sind, eine objektivere Züchtung. Die Transformationstechnik ist eine Technik für die direkte Einführung einer gewünschten Eigenschaft durch die Übertragung und das Exprimieren eines fremden Gens in Pflanzenzellen. Die Expression eines fremden Gens kann dadurch erreicht werden, dass ein gewünschtes Strukturgen und ein Terminator, der in der Lage ist, in Pflanzenzellen wirksam zu sein, mit einem Promotor, der die Genexpression reguliert und der ebenfalls in der Lage ist, in Pflanzenzellen wirksam zu sein, verbunden werden, und der erhaltene transformierte Promotor in Pflanzenzellen übertragen wird. Promotoren, welche häufig in Experimenten verwendet werden, werden durch den CaMV-35S-Promotor, der in der Lage ist, ein übertragenes Gen in einem beliebigen Gewebe in relativ vielen Pflanzenvarietäten zu exprimieren, und den Promotor für das Nopalin-Synthetase-Gen veranschaulicht (Sanders P.R. et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 1543–1558). Der praktische Gesichtspunkt der genetischen Transformation beinhaltet ferner, dass das übertragene Gen das Pflanzenwachstum etc. beeinträchtigen könnte. Daher bestand auch ein Bedarf an Promotoren, welche in der Lage sind, ein fremdes Gen in einem gewünschten Gewebe, während eines gewünschten Zeitraums und in einer gewünschten Menge zu exprimieren. Der Vorteil des Züchtungsverfahrens mit Hilfe der Transformationstechnik gegenüber der herkömmlichen traditionellen Züchtungsmethode besteht darin, dass das erstere Verfahren in der Lage ist, eine gewünschte Eigenschaft mit einer relativ hohen Genauigkeit innerhalb eines kurzen Zeitraums auf Pflanzen, unabhängig von der Spezies, zu übertragen. Im Hinblick auf Hopfen ist ferner kein Verfahren erforderlich, um die übertragene Eigenschaft aufrechtzuerhalten, da Hopfenpflanzen durch Wurzelteilung vermehrt werden können. Daher ist das Züchtungsverfahren mit Hilfe der Transformationstechnik für Hopfen besonders geeignet.
Die markergestützte Selektion ist ein Beispiel für ein Züchtungsverfahren unter Verwendung eines DNA-Markers wie zum Beispiel eines RFLP(Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-Markers und ist in der Praxis insbesondere bei Reis und Weizen angewendet worden. Es ist allgemein anerkannt, dass Transformationstechniken in der Lage sind, eine Eigenschaft zu übertragen, welche durch ein einziges Gen reguliert wird, aber unfähig sind, eine Eigenschaft zu übertragen, welche durch mehrere Gene reguliert wird. Die markergestützte Selektion kann diese Nachteile der Transformationstechniken kompensieren.
Eine Voraussetzung für ein solches gentechnisches Züchtungsverfahren ist die Identifizierung der Gene, welche mit der gewünschten Eigenschaft in Beziehung stehen, sowie der Regionen, welche diese Gene regulieren. Unter dem Gesichtspunkt, dass Hopfen eine Substanz von Bier ist sowie eine Quelle für wirksame Arzneimittelbestandteile darstellt, ist es insbesondere möglich, dass, falls die Gene, welche mit der Biosynthese von sekundären Stoffwechselprodukten in Beziehung stehen, welche durch Lupulindrüsen, die in den Zapfen der weiblichen Pflanzen enthalten sind, sezerniert werden, identifiziert werden, diese Gene in einem gentechni schen Züchtungsverfahren für Hopfen und zusätzlich auch auf dem Gebiet der medizinischen Behandlung verwendet werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Um Gene zu identifizieren, welche in Lupulindrüsen spezifisch exprimiert werden, bzw. die praktische Anwendung davon zu ermöglichen, beinhaltet die vorliegende Erfindung daher die Aufgabe, sowohl solche Gene als auch regulatorische Sequenzen davon wie Promotoren für diese Gene zu isolieren, aufzureinigen und bereitzustellen.
Wie vorstehend beschrieben, umfassen die Nucleinsäuren, welche im Einklang mit der vorliegenden Erfindung isoliert und aufgereinigt werden, Gene, welche in den Lupulindrüsen von Hopfen spezifisch exprimiert werden, sowie Promotoren, welche spezifisch in Lupulindrüsen wirksam sind, und Teile davon.
Unter Verwendung dieser Nucleinsäuren kann das konventionelle Verfahren für die Züchtung von Hopfen, welches vollkommen von der Erfahrung und der Intuition des Züchters abhängig ist, in ein objektiveres gentechnisches Verfahren umgewandelt werden. Da, wie oben beschrieben, wichtige sekundäre Stoffwechselprodukte wie Substanzen von Bier und wirksame Arzneimittelbestandteile ausschließlich in den Lupulindrüsen der Hopfenzapfen sezerniert werden, stehen die Gene, welche spezifisch exprimiert werden, um in den Lupulindrüsen wirksam zu sein, wahrscheinlich mit der Biosynthese dieser sekundären Stoffwechselprodukte in Beziehung. Daher kann durch die Verwendung von Genen, welche in der Lage sind, an der Biosynthese von sekundären Stoffwechselprodukten mitzuwirken, als ein Marker ein verbessertes markergestütztes Selektionsverfahren für die Züchtung von Hopfen entwickelt werden, welches in der Nahrungsmittel- und Arzneistoffindustrie einen wesentlichen Beitrag leistet. Daneben kann durch die Übertragung der vorstehend beschriebenen Gene auf Hopfen mittels Hilfe einer Transformationstechnik die Züchtung einer industriell verwendbaren Kulturvarietät erreicht werden. Das heißt, dass durch das Züchten von Hopfen mit Hilfe eines gentechnischen Verfahrens unter Verwendung dieser Nucleinsäuren die Zusammensetzung der sekundären Stoffwechselprodukte, welche sich in den Lupulindrüsen anreichern, reguliert werden kann. Des Weiteren erlauben die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung die Beibehaltung und Verbesserung der Hopfenqualität für das Brauen von Bier und die Verwendung von Hopfen bei der Arzneistoffherstellung.
Ein besseres Verständnis der Erfindung sowie der vielen damit verbundenen Vorteile wird ohne Weiteres zugänglich, sowie das Gleiche unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen besser verstanden wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Ein Diagramm, welches den Ablauf der inversen PCR im Falle der Isolierung der regulatorischen Sequenz in dem Lupulin-spezifischen Gen veranschaulicht.
2: Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse von RNAs, welche aus einer Lupulin-reichen Fraktion und einer Lupulin-armen Fraktion gewonnen und unter Verwendung eines Lupulin-spezifischen Gens als eine Sonde einer Elektrophorese unterzogen worden sind. Die Analyseergebnisse zeigen die Spezifität der Lupulinspezifischen Genexpression in den Lupulindrüsen.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Mit dem oben genannten Ausdruck "spezifisch exprimiert" oder "spezifisch wirksam" ist gemeint, dass die Gene nicht nur in Lupulindrüsen allein, sondern auch in diesen Drüsen im Vergleich zu anderen Organen vermehrt exprimiert werden oder wirksam sind. Das heißt, ob die Gene in den Lupulindrüsen "spezifisch" exprimiert werden oder wirksam sind oder nicht, kann durch ihre Expressionsrate und Intensität der Funktion in den Lupulindrüsen im Vergleich zu anderen Organen ermittelt werden.
Ferner ist mit dem Ausdruck "spezifisch exprimiert" oder "spezifisch wirksam" nicht nur gemeint, dass die Gene während der gesamten Entwicklungsperiode etc. so spezifisch sind, wie oben definiert, sondern auch dass die Expression und die Funktion der Gene bedingt durch die spezielle Entwicklungsperiode oder durch äußere Einflüsse im Vergleich zu anderen Organen stärker erhöht bzw. gesteigert ist.
Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren umfassen sowohl DNA als auch RNA. Der Typ der "Gene", die durch die vorstehend beschriebenen Nuclein säuren codiert werden, umfasst beliebige Typen wie eine genomische DNA, cDNA und mRNA.
Im Falle der Verwendung dieser Nucleinsäuren in einem Züchtungsverfahren durch ein auf RFLP basierendes markengestütztes Selektionsverfahren werden die Moleküle zum Beispiel mittels Hybridisierung und PCR identifiziert, wobei die Größe der verwendeten Sonden und PCR-Primer ausreichend ist, wenn sie einen Teil der vorstehend beschriebenen spezifischen Nucleinsäuren, welche aus den Lupulindrüsen abgeleitet wurden, zum Beispiel eine partielle fortlaufende Sequenz mit einer Länge von mehreren Zehn bis mehreren Hundert bp umfassen.
Die vorstehend beschriebenen Gene, welche in den Lupulindrüsen spezifisch exprimiert werden, sind in der vorliegenden Erfindung weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Gene Proteine codieren, die mit der Biosynthese von sekundären Stoffwechselprodukten, welche in den Lupulindrüsen gebildet werden, in Beziehung stehen.
Die hierin verwendeten Proteine schließen zum Beispiel die Aminosäuresequenz ein, welche in SEQ ID NO: 1 beschrieben ist. Gene, welche das Protein codieren, schließen diejenigen ein, welche die in SEQ ID NO: 2 beschriebene Rasensequenz aufweisen, und auch solche mit einer Rasensequenz, welche sich von der Sequenz in SEQ ID NO: 2 teilweise unterscheidet, aber worin die eigentliche Rasensequenz, welche die vorstehend beschriebene Aminosäuresequenz codiert, erhalten ist. Im Falle der Verwendung dieser Rasensequenz als eine Sonde oder ein PCR-Primer kann die Sequenz in einem gewissen Umfang modifiziert werden, sofern die erhaltene Sequenz die gewünschte funktionelle Eigenschaft beibehält. Alle Aminosäuresequenzen, welche die vorstehend beschriebenen Aminosäuresequenzen codieren, sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Spezifische Nucleinsäuresequenzen, welche sich von den vorstehend beschriebenen unterscheiden, werden in einfacher Weise unter Verwendung des gut eingeführten genetischen Codes für Codons, welche die Aminosäurereste der vorstehend beschriebenen Proteine codieren, festgelegt. Der genetische Code ist bei Stryer L., Biochemistry, dritte Auflage, 1988, W.H. Freeman und Co., hierin unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen, dargelegt.
Die isolierten und aufgereinigten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen auch das Gen, welches die Chalcon-Synthetase codiert. Die Chalcon- Synthetase ist ein Enzym, das mit dem Metabolismus von Phenylalanin und Tyrosin in Beziehung steht, und für das genauer gesagt gezeigt worden ist, dass es die Umwandlung von 1 Mol Coumaroyl-CoA und 3 Molen Malonyl-CoA in 4,2,4,6-Tetrahydroxychalcon (Naringenin-Chalcon) bei der Biosynthese der Flavonoide katalysiert. Daher können die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren verwendet werden, um das metabolische System zu regulieren, welches an der Biosynthese der Flavonoide in Pflanzen beteiligt ist, und auch als ein Genmarker für Merkmale, welche mit Flavonoiden in Beziehung stehen. Ferner ist vor kurzem gezeigt worden, dass ein der Chalcon-Synthetase ähnliches Enzym möglicherweise eine Aktivität als eine Valerophenon-Synthetase besitzt, welche die Biosynthese von Phlorisovalerophenon und Phlorisobutyrophenon, welches die Vorläufer der Ritterstoffe α-Säure und β-Säure sind, katalysiert (European Brewery Convention, Proceedings of the 26th Congress, S. 215 (1997)). Diese Fakten zeigen, dass das Protein, welches durch das Gen codiert wird, das im Einklang mit der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, als eine Valerophenon-Synthetase wirksam ist, welche an der Biosynthese von Ritterstoffen beteiligt ist. Demgemäß können die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren für die Regulierung des metabolischen Systems in Bezug auf die Biosynthese der Ritterstoffe im Hopfen und auch als ein Markergen für ein Merkmal, welches mit den Ritterstoffen in Beziehung steht, verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung isolierten und aufgereinigten Nucleinsäuren umfassen auch eine regulatorische Sequenz für die spezifische Expression des Gens in Lupulindrüsen, wobei die Sequenz einen Promotor enthält, welcher in den Lupulindrüsen aktiviert wird. Eine solche Sequenz schließt zum Beispiel eine Sequenz mit der in SEQ ID NO: 7 beschriebenen Rasensequenz ein. Diese regulatorische Sequenz, welche in den Lupulindrüsen spezifisch wirksam ist, kann verwendet werden, um die Expression von Genen, welche stromabwärts davon damit verbunden sind, in Lupulindrüsen zu ermöglichen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Vektors, enthaltend ein Gen, welches in Lupulindrüsen spezifisch exprimiert wird, oder eine regulatorische Sequenz, welche die Expression des Gens in Lupulindrüsen spezifisch reguliert.
Die Züchtung von Pflanzen wie Hopfen kann dadurch erreicht werden, dass Pflanzen einschließlich Hopfen unter Verwendung eines Vektors, der ein Gen trägt, welches in den vorstehend beschriebenen Lupulindrüsen spezifisch exprimierbar ist, transformiert werden. Insbesondere wird ein solcher Vektor für die Züchtung durch die Erhöhung/Unterdrückung der Produktion von sekundären Stoffwechselprodukten wirksam. Ferner kann dieser Vektor nicht nur für die Züchtung von Pflanzen, sondern auch für die Produktion von sekundären Stoffwechselprodukten durch die Expression des Gens, welches mit der Biosynthese der sekundären Stoffwechselprodukte in Beziehung steht, in gezüchteten Zellen verwendet werden. Falls die Produktion von sekundären Stoffwechselprodukten in gezüchteten Zellen möglich wird, kann die Isolierung der sekundären Stoffwechselprodukte auf einfache Weise erreicht werden.
Der vorstehend beschriebene Vektor, welcher eine regulatorische Sequenz trägt, kann nicht nur für die Expression der spezifischen Gene, sondern auch für die spezifische Expression eines gewünschten Gens in den Lupulindrüsen von Hopfen verwendet werden, wobei ein Gen, das von Hopfen oder einer anderen Pflanzenspezies abgeleitet ist, stromabwärts der regulatorischen Sequenz damit verbunden wird. Auf diese Weise kann irgendein gewünschtes Gen in Lupulindrüsen exprimiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Pflanzenzellen, welche mit dem vorstehend beschriebenen Vektor transformiert sind. Die Pflanzenzellen hierin können ohne irgendwelche Einschränkungen in Bezug auf die Morphologie oder das Wachstumsstadium davon verschiedene Typen von Zellen wie gezüchtete Zellen, einen Kallus, Protoplasten, eine Pflanze etc. einschließen. Diese Erfindung kann nicht nur Pflanzenzellen der ersten Generation, sondern auch Pflanzen, welche aus den Pflanzenzellen der ersten Generation erzeugt wurden, einschließen.
Der vorstehend beschriebenen transformierten Pflanzen ermöglichen die Expression von erwünschten Genen, einschließlich solcher Gene, welche sekundäre Stoffwechselprodukte codieren, durch die Übertragung des vorstehend beschriebenen Vektors, wodurch der Nutzen von Pflanzen als Materialien für Nahrungsmittel und Arzneistoffe verbessert wird.
In der folgenden Beschreibung wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen ausführlich beschrieben.
1. Isolierung von Nucleinsäuren, umfassend ein Gen, welches für die Lupulindrüsen im Hopfen spezifisch ist, und die requlatorische Sequenz für die Expression davon
(1) Präparation der Gesamt-RNA und der mRNA
Die Gesamt-RNA kann mit Hilfe eines bestehenden Verfahrens präpariert werden, zum Beispiel eines Verfahrens, das in "Protocols of Plant PCR Experiment" (Shujun-Sha, S. 56 (1995)), hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben ist. Die Präparation der mRNA aus der Gesamt-RNA kann mit Hilfe eines bestehenden Verfahrens, zum Beispiel gemäß dem Protokoll, welches "OligotexdT30 <Super>" beiliegt, erhältlich von Takara-Shuzo, durchgeführt werden.
(2) Herstellung einer cDNA-Bank
Die cDNA-Bank kann mit Hilfe eines bestehenden Verfahrens aus der mRNA hergestellt werden. Die cDNA kann zum Beispiel gemäß dem Protokoll, das dem "cDNA-Synthesemodul", Amersham, beiliegt, hergestellt werden. Die Herstellung einer Genbank aus der auf diese Weise hergestellten cDNA kann auch gemäß den Protokollen, die dem "cDNA Rapid Adaptor Ligation Module" und dem "cDNA Rapid Cloning Module", beide von Amersham, sowie dem "GIGAPACK II Plus Packaging Extract", Stratagene, beiliegen, durchgeführt werden. Alle der vorstehend erwähnten Veröffentlichungen sind hierin unter Bezugnahme eingeschlossen.
(3) Herstellung von Lupulin-spezifischen Sonden
Mit Lupulin-spezifischen Sonden sind Genfragmente gemeint, die zu den Genen komplementär sind, welche in Lupulindrüsen spezifisch exprimiert werden. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform können die Lupulin-spezifischen Sonden durch das folgende Verfahren erhalten werden.
Ungefähr 15 Tage nach dem Aufblühen werden die Zapfen in Fraktionen aufgetrennt, wobei eine Fraktion vorwiegend aus Lupulindrüsen bzw. der Basis der Brakteole, welche dicht mit Lupulindrüsen besetzt ist, besteht (Lupulin-reiche Fraktion), und die andere Fraktion vorwiegend aus der Stipularschuppe („stipular bract"), welche wenig Lupulindrüsen enthält, besteht (Lupulin-arme Fraktion). Von einer Gruppe von Genen, welche in der Lupulin-reichen Fraktion exprimiert werden, wird eine Gruppe von Genen, welche auch in der Lupulin-armen Fraktion exprimiert werden, subtrahiert, wobei die Gruppe der verbleibenden Gene als die Gene angesehen wird, die mit einer hohen Wahrscheinlichkeit in Lupulindrüsen spezifisch exprimiert werden.
Die Subtraktion einer Gruppe von Genen, welche auch in der Lupulin-armen Fraktion exprimiert werden, von einer Gruppe von Genen, welche in der Lupulinreichen Fraktion exprimiert werden, kann mit Hilfe eines bestehenden Verfahrens, zum Beispiel herkömmlicherweise gemäß dem Protokoll, das dem "Subtractor Kit" von Invitrogen beiliegt, durchgeführt werden.
(4) Isolierung einer Lupulin-spezifischen cDNA
Mit "Lupulin-spezifischer cDNA" ist eine cDNA gemeint, die von dem Gen abgeleitet ist, welches in Lupulindrüsen spezifisch exprimiert wird. Die Isolierung einer Lupulin-spezifischen cDNA kann durch das Durchmustern einer cDNA-Bank, welche aus der Lupulin-reichen Fraktion hergestellt wurde, unter Verwendung der Lupulin-spezifischen Sonden erfolgen. Diese Durchmusterung kann mit Hilfe eines bestehenden Verfahrens erfolgen, zum Beispiel durch ein Verfahren, das im "User's Guide for Performing the Hybridization Using DIG System", Boehringer Mannheim, S. 37 (1995), hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben ist.
Die Markierung der Lupulin-spezifischen Sonden kann auch durch ein bestehendes Verfahren, zum Beispiel gemäß dem Protokoll, welches "DIG-High Prime", Boehringer Mannheim, beiliegt, erfolgen.
(5) Präparation der genomischen Hopfen-DNA
Die Präparation der genomischen Hopfen-DNA kann durch ein bestehendes Verfahren erfolgen, zum Beispiel ein Verfahren, das in "Protocols for Plant PCR Experiment" (Shu-Jun Sha, S. 54 (1995)), hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben ist.
(6) Isolierung einer Nucleinsäure, umfassend eine regulatorische Region für die Expression des Lupulin-spezifischen Gens
Mit "Nucleinsäure, umfassend eine regulatorische Region für die Expression des Lupulin-spezifischen Gens" ist eine Nucleinsäure gemeint, welche eine regulatorische Region umfasst, die den Promotor enthält, der in Lupulindrüsen spezifisch wirksam ist. Die Nucleinsäure kann durch ein bestehendes Verfahren mit Hilfe der reversen PCR unter Verwendung der DNA-Sequenz der Lupulin-spezifischen cDNA als Primer isoliert werden, zum Beispiel durch die Verfahren, welche in "Protocols for Plant PCR Experiment" (Shu-Jun Sha, S. 54 (1995), hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben sind.
(7) DNA-Sequenzierung
Die auf diese Weise isolierte DNA-Sequenz kann durch ein bestehendes Verfahren bestimmt werden, zum Beispiel gemäß dem Protokoll, das einem "ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Perkin-Elmer), hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beiliegt. Die auf diese Weise bestimmte DNA-Sequenz kann auf eine Homologie mit der Sequenz von vorhandenen Genen in anderen Pflanzenspezies untersucht werden.
(8) Northern-Hybridisierungsanalyse (nachstehend bezeichnet als Northern-Analyse)
Ob das auf diese Weise isolierte Lupulin-spezifische Gen tatsächlich in Lupulindrüsen spezifisch exprimiert wird und ob die auf diese Weise isolierte Nucleinsäure, welche die regulatorische Region, die das Gen reguliert, für eine Lupulinspezifische Expression umfasst, tatsächlich in Lupulindrüsen spezifisch wirksam ist, kann durch eine Northern-Analyse unter Verwendung des isolierten Lupulin-spezifischen Gen als Sonde ermittelt werden. Die Northern-Analyse kann mit Hilfe eines bestehenden Verfahrens durchgeführt werden, zum Beispiel basierend auf den Verfahren, die in "Protocols for Non-Isotope Experiments – DIG Hybridization" (Shu-Jun Sha, S. 45 (1994)) und im "User's Guide for Performing the Hybridization Using DIG System" (Boehringer Mannheim, S. 40 (1995)), beide hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben sind.
2. Herstellung von Vektoren, welche das vorstehend isolierte Lupulin-spezifische Gen oder die für die Expression von Lupulin-spezifische regulatorische Sequenz tragen
Das Lupulin-spezifische Gen, dessen Spezifität für die Lupulindrüsen bestätigt worden ist, wie vorstehend beschrieben, kann gemäß einem bestehenden Verfahren dadurch exprimiert werden, dass das Gen stromabwärts der regulatorischen Sequenz für die Expression in einen geeigneten Vektor inseriert wird, welcher die regulatorische Sequenz für die Expression trägt, und der transformierte Vektor dann in geeignete Zellen eingeschleust wird. Im Hinblick auf den Typ der Vektoren, welche die regulatorische Sequenz für die Expression tragen, bestehen keine Begrenzungen, wobei der nachstehend beschriebene Vektor, welcher die für die Expression von Lupulin-spezifische regulatorische Sequenz trägt, oder ein im Handel erhältlicher Expressionsvektor (zum Beispiel pB1121 (Clontech)) verwendet werden kann.
Die Konstruktion eines Vektors, welcher die für die Expression von Lupulinspezifische regulatorische Sequenz trägt, kann auf die gleiche Weise erreicht werden, indem ein geeigneter Vektor aus bereits vorhandenen Plasmiden entsprechend dem Verwendungszweck ausgewählt wird und die vorstehend beschriebene regulatorische Sequenz für die Expression, zum Beispiel SEQ ID NO: 7, darin inseriert wird. In diesem Fall kann wahlweise eine Region für die Clonierung, welche verschiedene Restriktionsstellen für die Verknüpfung von Strukturgenen enthält, stromabwärts der regulatorischen Sequenz für die Expression eingeschlossen sein.
3. Anwendungen
Da sekundäre Stoffwechselprodukte in großen Mengen in den Lupulindrüsen von Hopfen sezerniert werden, handelt es sich bei dem vorstehend isolierten Lupulin-spezifischen Genen sehr wahrscheinlich um die Gene, welche mit der Biosynthese der sekundären Stoffwechselprodukte in Beziehung stehen. Daher wird durch die Verwendung der vorstehend erhaltenen Gene in einem Transformationsverfahren oder einem markergestützten Selektionsverfahren zum Beispiel die Züchtung von Hopfen in Bezug auf eine Verbesserung der sekundären Stoffwechselprodukte, die in den Lupulindrüsen gebildet werden, ermöglicht. Für die vorstehend beschriebene Transformationstechnik können gut bekannte Verfahren angewendet werden.
Nach einer allgemeinen Beschreibung wird die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele, welche hierin nur zum Zwecke der Veranschaulichung angegeben werden und nicht als eine Begrenzung davon angesehen werden sollen, sofern nicht anders angegeben, besser verständlich.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung einer Lupulin-reichen Fraktion und einer Lupulin-armen Fraktion
Hopfenzapfen wurden 15 Tage nach dem Aufblühen gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Zapfen wurden auf Trockeneis zergliedert und unter Verwendung einer Präparierpinzette in Fraktionen unterteilt, wobei eine Fraktion vorwiegend Lupulindrüsen und die Endocyten-Basis, welche mit Lupulindrüsen dicht besetzt ist, umfasste, und eine Fraktion vorwiegend die Endocyste, welche wenig Lupulindrüsen enthält, umfasste. Diese Fraktionen wurde als Lupulin-reiche Fraktion bzw. Lupulin-arme Fraktion bezeichnet und bei –80°C aufbewahrt.
Beispiel 2: Präparation der Gesamt-RNA und der mRNA aus der Lupulin-reichen Fraktion und der Lupulin-armen Fraktion
Die Gesamt-RNA und die mRNA der Lupulin-reichen Fraktion und der Lupulin-armen Fraktion wurden wie folgt präpariert. Jede Fraktion wurde tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff zerrieben, dann in einer 2%igen CTAB-Lösung (bestehend aus 2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 0,1 M Tris (pH 9,5), 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl und 1% β-Mercaptoethanol) suspendiert und bei 65°C für 30 min inkubiert. Die Suspension wurde zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Anschließend wurde zu dem Extrakt ein 3/4 Volumen an Isopropanol zugegeben, um die DNA und die RNA auszufällen. Die auf diese Weise gefällte DNA und RNA wurden dann in Wasser gelöst. Anschließend wurde ein 1/3 Volumen an 10 M Lithiumchlorid dazu zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde bei –20°C über Nacht stehen gelassen und dann bei 15.000 UpM für 10 min zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und in einem DNase-Reaktionspuffer (bestehend aus 100 mM Natriumacetat (pH 5,2) und 5 mM Magnesiumchlorid) gelöst. Zu diesem Gemisch wurde DNase zugesetzt, und das so erhaltene Gemisch wurde bei 37°C inkubiert, um die DNA abzubauen. Zu dem Inkubationsgemisch wurde ein 1/3 Volumen an 10 M Lithiumchlorid zugegeben, und das Gemisch wurde bei –20°C über Nacht stehen gelassen und dann bei 15.000 UpM für 10 min zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde in Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde durch eine Extraktion mit Phenol-Chloroform gereinigt und einer Ethanolpräzipitation unterzogen. Das erhaltene Präzipitat wurde in Wasser gelöst und als eine Gesamt-RNA-Präparation verwendet, aus welcher die mRNA unter Verwendung von "Oligotex-dT30 <Super>" (Takara-Shuzo) gemäß dem beiliegenden Protokoll präpariert wurde.
Beispiel 3: Herstellung von Lupulin-spezifischen Sonden
Die Lupulin-spezifischen Sonden wurden hierin durch die Subtraktion der mRNA, welche auch in der Lupulin-armen Fraktion vorhanden war, von der mRNA in der Lupulin-reichen Fraktion hergestellt. Genauer wurden die Lupulin-spezifischen Sonden unter Verwendung eines "Subtractor Kit" (Invitrogen) gemäß dem Protokoll, welches dem Kit beiliegt, hergestellt.
Zuerst wurde unter Verwendung der mRNA in der Lupulin-reichen Fraktion eine cDNA synthetisiert. Auch wurde die mRNA in der Lupulin-armen Fraktion mit Biotin markiert. Anschließend wurde die auf diese Weise hergestellte cDNA der Lupulin-reichen Fraktion mit der biotinylierten mRNA in der Lupulin-armen Fraktion gemischt, um ein Hybrid zu bilden, an welches dann Streptavidin gebunden wurde, das mit der biotinylierten mRNA in dem Hybrid eine Bindung eingeht. Dann wurde die biotinylierte mRNA durch die Extraktion des Hybrids mit Phenol-Chloroform entfernt, wodurch die cDNA, welche von der mRNA stammt, die auch in der Lupulin-armen Fraktion vorhanden ist, von der cDNA der Lupulin-reichen Fraktion abgetrennt wird. Als Ergebnis wurde eine cDNA erhalten, welche ausschließlich von der Lupulinreichen Fraktion stammt, die dann als Sonde verwendet wurde. Die so erhaltenen Lupulin-spezifischen Sonden wurden unter Verwendung von "DIG-High Prime" (Boehringer Mannheim) mit Digoxigenin markiert.
Beispiel 4: Isolierung einer Lupulin-spezifischen cDNA
Unter Verwendung der mRNA in der Lupulin-reichen Fraktion wurde mit Hilfe des "cDNA-Synthesemoduls", des "cDNA Rapid Adaptor Ligation-Moduls" und des "cDNA Rapid Cloning-Moduls – MOSSIox" (Amersham) sowie des "GIGAPACK Plus Packaging Extract" (Stratagene) mit MOSSIox als Vektor eine cDNA-Bank hergestellt. Diese Bank wurde mit Hilfe eines Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung der mit Digoxigenin markierten Lupulin-spezifischen Sonden durchmustert.
Genauer wurde jeder Plaque, welcher von der vorstehend beschriebenen cDNA-Bank erhalten wurde, auf einen Membranfilter übertragen. Die Blockierung fand in mit einem Hybridisierungspuffer (enthaltend 5x SSC, 100 mM Phosphatpuffer, 7% SDS, 2% Blockierungsmittel, 0,1% N-Lauroylsarcosin, 50% Formamid und 50 g/ml Fischsperma-DNA) statt. Dann wurde die vorstehend beschriebene Sonde zu dem Hybridisierungspuffer zugegeben, und die Membran wurde in dem erhaltenen Gemisch bei 42°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal mit einer Spüllösung (enthaltend 1% SDS und 2x SSC) bei 56°C für 5 min und weiterhin zweimal mit einer anderen Spüllösung (enthaltend 0,1% SDS und 0,1x SSC) bei 68°C für 5 min gewaschen. Durch den Nachweis eines positiven Plaques wurde dann die Lupulin-spezifische cDNA isoliert.
Beispiel 5: Bestimmung der DNA-Sequenz der Lupulin-spezifischen cDNA und der Aminosäuresequenz der Translationsprodukte
Anschließend wurde die DNA-Sequenz der so erhaltenen Genfragmente, welche die Lupulin-spezifische cDNA und den Lupulin-spezifischen Promotor enthalten, bestimmt. Für die Sequenzierung wurde jedes Genfragment in den pUC-Vektor oder den pBluescript-Vektor subcloniert. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines "ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" und eines DNA-Sequenzanalysegeräts (Modell ABI373S) (Perkin-Elmer) durchgeführt.
Die so bestimmte DNA-Sequenz der Lupulin-spezifischen cDNA ist in SEQ ID NO: 2 dargestellt. Die mutmaßliche Aminosäuresequenz des Translationsprodukts, welche von der DNA-Sequenz abgeleitet wurde, ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt. In diesem Falle entspricht die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 der DNA-Sequenz beginnend bei dem Initiationscodon (ATG) in Position 36–38 bis zu dem Terminationscodon (TAA) in Position 1218–1220 in SEQ ID NO: 2.
Beispiel 6: Präparation der genomischen Hopfen-DNA
Die genomische Hopfen-DNA wurde wie folgt präpariert. Blätter oder Zapfen von Hopfen wurden tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff zerrieben, dann in einer 2%igen CTAB-Lösung (enthaltend 2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 0,1 M Tris (pH 9,5), 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl und 1% β-Mercaptoethanol) suspendiert und bei 65°C für 30 min inkubiert. Die Suspension wurde zweimal mit Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) extrahiert und ein 3/4 Volumen an Isopropanol wurde zugegeben, um die DNA und die RNA auszufällen. Die auf diese Weise gefällte DNA und RNA wurden in einem TE-Puffer mit hoher Salzkonzentration (enthaltend 1 M NaCl, 10 mM Tris (pH 8,0) und 1 mM EDTA) gelöst. Anschließend wurde eine RNase zugegeben, und das Gemisch wurde bei 60°C inkubiert, um die RNA abzubauen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 2 Volumina an Isopropanol zugegeben, um die DNA auszufällen, welche mit 70%igem Ethanol gewaschen und dann in Wasser gelöst wurde, um eine genomische DNA-Probe zu erhalten.
Beispiel 7: Isolierung der regulatorischen Sequenz für die Expression des Lupulinspezifischen Gens
Die Isolierung der regulatorischen Sequenz für die Expression des Lupulinspezifischen Gens wurde mit Hilfe der inversen PCR-Methode wie folgt durchgeführt. 1 ist ein Diagramm, das die Vorgehensweise in diesem Beispiel 7 wiedergibt.
Zunächst wurde die genomische Hopfen-DNA, welche in Beispiel 6 erhalten wurde, mit dem Restriktionsenzym XhoI gespalten (S1 und S2). Die XhoI-Spaltprodukte wurden gemäß dem Protokoll, das dem "DNA-Ligations Kit Ver. 1" (Takara-Shuzo) beiliegt, einer Selbstzirkularisierung unterzogen (S3).
Anschließen wurde die flankierende Region, welche den Promotor für das Lupulin-spezifische Gen enthält, durch eine PCR unter Verwendung von Primern, welche die Sequenz innerhalb der Lupulin-spezifischen cDNA enthalten, mit einem Teil des erhaltenen Ligierungsreaktionsgemisches als Matrize amplifiziert (S4). Die Sequenzen des hierin verwendeten Primerpaares sind in SEQ ID NO: 3 (Primer 1) und NO: 4 (Primer 2) wiedergegeben. SEQ ID NO: 3 ist eine Sequenz, welche zu der Sequenz von Position 137 bis 166 komplementär ist, und SEQ ID NO: 4 ist eine Sequenz, welche der Position 303 bis 332 von SEQ ID NO: 2 entspricht.
Die vorstehend beschriebene PCR wurde unter Verwendung eines "Expand High-Fidelity PCR System" (Boehringer Mannheim) gemäß dem beiliegenden Protokoll, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: nach 30 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, 55°C für 1 min und 68°C für 4 min wurde das Gemisch zusätzlich bei 72°C für 6 min inkubiert.
Die so erhaltene Reaktionslösung wurde einer Elektrophorese unterzogen, um die PCR-Produkte zu identifizieren. Da neben dem amplifizierten Fragment 1 auch unspezifisch amplifizierte Fragmente in den vorstehenden PCR-Produkten enthalten sein könnten, wurde zusätzlich eine selektive Amplifikation des gewünschten Fragments allein unter Verwendung von anderen Primern durchgeführt (S5). Das heißt, um nur das DNA-Segment selektiv zu amplifizieren, welches den Lupulinspezifischen Promotor umfasst, wurde eine PCR mit einem Teil der vorstehend beschriebenen PCR-Lösung als Matrize unter Verwendung von Primer 3 (SEQ ID NO: 5), welcher zu einer Sequenz weiter stromaufwärts des Lupulin-spezifischen Gens als Primer 1 komplementär ist, und des vorstehend beschriebenen Primers 2 durchgeführt (S6). Der Primer 3 (SEQ ID NO: 5) umfasst eine Sequenz, welche zu der Sequenz von Nr. 114 bis 143 der Lupulin-spezifischen cDNA (SEQ ID NO: 2) komplementär ist. Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen und unter Verwendung derselben Hilfsmittel, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Anschließend wurde unter Verwendung des mittels PCR amplifizierten Fragments, das unter Verwendung der Primer 2 und 3 erhalten wurde, die DNA-Sequenz bestimmt.
Beispiel 8: Bestimmung der DNA-Sequenz der regulatorischen Sequenz für die Expression des Lupulin-spezifischen Gens
Die Rasensequenz des vorstehend beschriebenen amplifizierten Fragments 2 wurde ähnlich wie in dem vorstehend beschriebenen Beispiel 5 durch Subclonierung des amplifizierten Fragments in den pUC-Vektor oder den pBluescript-Vektor und unter Verwendung eines "ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit's" sowie eines DNA-Sequenzanalysegeräts (Typ AB1373S) (Perkin-Elmer) bestimmt. Die Ergebnisse sind in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
Da dieses amplifizierte Fragment durch die inverse PCR-Methode erhalten wurde, ist zu erwarten, dass das amplifizierte Fragment die regulatorische Sequenz für die Expression wie den Promotor innerhalb des Lupulin-spezifischen Gens (eines Teils davon) enthält. Um diese regulatorische Sequenz für die Expression zu identifizieren, wurde daher das DNA-Fragment, welches auf diese Weise amplifiziert wurde, mit der DNA-Sequenz der Lupulin-spezifischen cDNA verglichen. Dieser Vergleich ergab, dass das DNA-Fragment, welches hierin amplifiziert wurde (SEQ ID NO: 6), die Promotorsequenz innerhalb der Lupulin-spezifischen cDNA enthält. Genauer entsprach die Sequenzposition 1–690 von SEQ ID NO: 6 der Sequenzposition 303–992 der Lupulin-spezifischen cDNA (SEQ ID NO: 2), bzw. entsprach die Sequenzposition 3296–3438 von SEQ ID NO: 6 den Sequenznummern 1–143 der Lupulin-spezifischen cDNA (SEQ ID NO: 2). Dadurch ist bestätigt worden, dass die regulatorische Region für die Expression wie der Promotor für das Lupulin-spezifische Gen innerhalb der Region von Position 691 bis 3295 von SEQ ID NO: 6 enthalten ist, welche in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist.
Beispiel 9: Northern-Blot-Analyse der Lupulin-spezifischen cDNA und der regulatorischen Sequenz für die Expression des Lupulin-spezifische Gens
Um zu untersuchen, ob die vorstehend beschriebene Lupulin-spezifische cDNA tatsächlich in Lupulindrüsen exprimiert wird und ob der Promotor für das vorstehend beschriebene Lupulin-spezifische Gen tatsächlich in Lupulindrüsen wirksam ist, wurde eine Northern-Blot-Analyse für die Gesamt-RNA, welche aus der Lupulin-reichen Fraktion bzw. der Lupulin-armen Fraktion extrahiert wurde, unter Verwendung der markierten DNAs, die basierend auf der Lupulin-spezifischen cDNA (SEQ ID NO: 2) in Beispiel 5 hergestellt wurden, durchgeführt.
Zunächst wurde die Gesamt-RNA durch ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel 2 aus der Lupulin-reichen Fraktion und der Lupulin-armen Fraktion präpariert und durch eine denaturierende Agarosegelelektrophorese (1% Agarose, 18% Formaldehyd, 20 mM MOPS, 5 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA (pH 7)) fraktioniert. Die auf diese Weise in dem Agarosegel fraktionierten RNAs wurden auf eine Nylonmembran übertragen und einer Hybridisierung unter Verwendung der vorstehend erhaltenen cDNA als eine Sonde gemäß dem "User's Guide for Hybridization with DIG System" (Boehringer Mannheim, S. 40 (1995)), hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, unterzogen.
Die Hybridisierung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Die vorstehend beschriebene Membran wurde unter Verwendung eines Hybridisierungspuffers, welcher die gleichen Bestandteile wie in Beispiel 4 enthielt, blockiert. Zu dem vorstehend beschriebenen Hybridisierungspuffer wurde die mit Digoxigenin markierte Lupulin-spezifische cDNA als Sonde zugegeben, und die blockierte Membran wurde in dem Gemisch eingeweicht und bei 50°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal mit einer Waschlösung (enthaltend 1% SDS und 2x SSC) bei 56°C für 10 min und weiterhin zweimal mit einer anderen Waschlösung (enthaltend 0,1% SDS und 0,1x SSC) bei 68°C für 30 min gewaschen. Die Membran wurde dann auf Banden untersucht, welche mit der Sonde eine Bindung eingegangen sind. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Wie in 2 wiedergegeben, wurde gezeigt, dass, obwohl einige RNAs für das Gen, wie vorstehend erhalten, auch in der Lupulin-armen Fraktion vorhanden waren, diese RNAs eindeutig in großer Zahl in der Lupulin-reichen Fraktion vorhanden waren, was auf eine starke spezifische Expression dieses Gens in den Lupulindrüsen hinweist. Die Expression dieses Gens wird durch die Nucleinsäure kontrolliert, welche die regulatorische Region für die Expression umfasst, die den Promotor enthält, welcher stromaufwärts des Strukturgens in der genomischen DNA angeordnet ist, wobei die Nucleinsäure, welche die regulatorische Region für die Expression umfasst, die Nucleinsäure ist, welche in dem vorstehend beschriebenen Beispiel isoliert und identifiziert wurde, was auf eine spezifische starke Wirkung der vorstehend beschriebenen isolierten Nucleinsäure, welche die regulatorische Region für die Expression umfasst, in den Lupulindrüsen hinweist. Die Signalbanden, welche auf der niedermolekularen Seite nachgewiesen wurden, sind vermutlich auf Abbauprodukte der mRNA des Gens, wie vorstehend erhalten, zurückzuführen.
Beispiel 10: Untersuchung der Homologie
Die mutmaßliche Aminosäuresequenz, welche von der DNA-Sequenz der auf diese Weise erhaltenen Lupulin-spezifischen cDNA abgeleitet wurde, wurde auf eine Homologie mit bereits vorhandenen Aminosäuresequenzen untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass das Gen eine hohe Homologie zu dem Gen für die Chalcon-Synthetase aufweist, welche die Synthese von Nalingenin in Zusammenhang mit der Biosynthese der Flavonoide in Pflanzen katalysiert. Genauer ergab der Vergleich des Hopfen-Enzyms mit den Chalcon-Synthetasen aus anderen Pflanzen wie Arabidopsis (Plant J. 8 (5) (1995), 659–671), Gerste (Plant Mol. Biol. 16 (1991), 1103–1106), Erbse (EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken X80007), Petunie (J. Biotechnol. 11 (2) (1995), 131–135) und Reis (EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken X92547) eine Homologie von 65–70% auf der DNA-Ebene und eine Homologie von 70–75% auf der Aminosäureebene.
Vor kurzem ist gezeigt worden, dass die Chalcon-Synthetase die Aktivität einer Valerophenon-Synthetase hat, welche Phlorisovalerophenon und Phlorisobutyrophenon, welches die Vorläufer der Ritterstoffe α-Säure und β-Säure sind, katalysiert (European Brewery Convention, Proceedings of the 26th Congress, S. 215 (1997)), was auf die Möglichkeit hindeutet, dass das Translationsprodukt des vorstehend erhaltenen Gens als eine Valerophenon-Synthetase an der Biosynthese der Ritterstoffe beteiligt ist.
Daher, falls das Gen, welches in den Lupulindrüsen spezifisch exprimiert wird, eine Chalcon-Synthetase codiert, kann diese Nucleinsäure verwendet werden, um den Gehalt an Flavonoiden in Pflanzen zu erhöhen. Außerdem, falls dieses Gen eine Valerophenon-Synthetase codiert, kann diese Nucleinsäure verwendet werden, um den Gehalt an Ritterstoffen im Hopfen zu erhöhen. Ferner, da die Ritterstoffe α-Säure und β-Säure im Hopfen eine pharmakologische Aktivität haben (Biosci. Biotech. Biochem. 61 (1) (1997), 158), ist es möglich, dass die vorstehend beschriebene Nucleinsäure bei der Arzneistoffproduktion verwendet werden kann.
Verwendbarkeit in der Industrie
Wie vorstehend beschrieben, ermöglichen Nucleinsäuren, die Gene umfassen, welche in den Lupulindrüsen von Hopfen spezifisch exprimiert werden, die Züchtung von Hopfen durch gentechnische Verfahren im Hinblick auf sekundäre Stoffwechselprodukte, welche in den Lupulindrüsen exprimiert werden. Im Falle der Verwendung von Vektoren, welche die vorstehend beschriebenen Lupulin-spezifischen Gene tragen, ist außerdem zu erwarten, dass die Produktion von sekundären Stoffwechselprodukten außerhalb von Pflanzen wie in gezüchteten Zellen verwirklicht werden kann. Da solche sekundären Stoffwechselprodukte wichtige Stoffe wie Nahrungsmittel und Arzneistoffe einschließen und da außerdem die Chalcon-Synthetase an der Biosynthese von Flavonoiden beteiligt ist und die Valerophenon-Synthetase an der Biosynthese von Ritterstoffen beteiligt ist, wird erwartet, dass die vorliegende Erfindung in hohem Maße zur Entwicklung und Verbesserung von Substanzen für Nahrungsmittel und Arzneimittel beiträgt.
Ferner kann der Lupulin-spezifische Promotor der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um den Gehalt an sekundären Stoffwechselprodukten wie etherischen Ölen und Ritterstoffen, welche sich in den Lupulindrüsen anreichern, zu erhöhen, indem das Gen von Interesse stromabwärts des Promotors inseriert wird. Der Promotor kann auch verwendet werden, um neue andere Merkmale auf Hopfen zu übertragen. Sequenzprotokoll

Claims

Nucleinsäure, die ein Protein codiert, das Chalcon-Synthetase- und/oder Valerophenon-Synthetase-Aktivität hat, und die ein Gen umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Genen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst; und (b) Genen, die die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfassen.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, die spezifisch in Hopfen-Lupulindrüsen exprimiert wird.
Vektor, umfassend die Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2.
Nucleinsäure, die eine regulatorische Sequenz für die spezifische Expression von heterologen Genen in Hopfen-Lupulindrüsen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nucleinsäuren, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 7; und (b) Nucleinsäuren, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO. 6.
Vektor, umfassend die Nucleinsäure nach Anspruch 4.
Pflanzenzelle transformiert durch den Vektor nach Anspruch 3.
Pflanzenzelle transformiert durch den Vektor nach Anspruch 5.
Verfahren zur Herstellung einer transformierten Pflanzenzelle, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach Anspruch 3.
Verfahren zur Herstellung einer transformierten Pflanzenzelle, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach Anspruch 5.
Nucleinsäureprimer umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 3, 4 oder 5.
Kit zum Nachweisen regulatorischer Sequenzen für die spezifische Expression von Lupulin-spezifischen Expressionsgenen, umfassend mindestens eine Nucleinsäure, die die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3, 4 oder 5 hat.