DE60223293T2

DE60223293T2 - Regulatorische Sequenzen aus Reis für die Genexpression in definierten Geweben von Weizen

Info

Publication number: DE60223293T2
Application number: DE60223293T
Authority: DE
Inventors: Martin Crescent Luton Urban; Rebecca Cambridge Stratford; Kim Harpenden Herts Hammond-Kosack; Richard Cambridge Kemp; Pierre Lecocq
Original assignee: Monsanto UK Ltd
Current assignee: Monsanto UK Ltd
Priority date: 2001-08-28
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2022-08-24
Also published as: EP1288302A1; ATE356219T1; US20080271206A1; EP1421196B1; WO2003020937A2; US7375208B2; ATE377085T1; EP1421196A2; US7541452B2; DE60218700T2; WO2003020937A3; EP1548117A1; DE60223293D1; US20070130633A1; EP1548117B1; DE60218700D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nucleinsäuremoleküle, besonders regulatorische Sequenzen, insbesondere Reis-Promotoren, und die Verwendung hiervon zur Kontrolle der Genexpression in einem vorher definierten Weizengewebe wie der Hüllspelze, Deckspelze und/oder Vorspelze. Ein Verfahren zur Isolierung dieser regulatorischen Sequenzen wird ebenfalls offenbart.
Hintergrund der Erfindung
Die Fusarium-Ährenfäule (Fusarium Head Blight) bei kleinen Getreidesorten ("Schorf"), häufig abgekürt durch das Akronym "FHB", nimmt weltweit zu und stellt im Hinblick auf die Produktion und den Ertrag von Weizen ein sehr großes Problem dar. Innerhalb der letzten Dutzend Jahre sind Ausbrüche der FHB in den Staaten des Mittelwestens und Ostens der Vereinigten Staaten, sowie in Mittel- und Ostkanada beobachtet worden. Die längste Episode in jüngster Zeit ist in der Sommergetreide-Region im oberen Mittelwesten im Bereich des Red River Valley in Norddakota, Minnesota und Manitoba beobachtet worden. Hier sind während fünf aufeinanderfolgenden Jahren schwere Ausbrüche der Krankheit beobachtet worden, wobei die Verluste sehr groß gewesen sind und der gehäufte Verlust für viele Farmer den Ruin bedeutete.
Obwohl mehrere Arten des im Boden vorkommenden oder durch Rückstände übertragenen Pilzes Fusarium eine FHB hervorrufen können, ist der größte Teil des Schadens bei neueren Ausbrüchen in den USA und in Kanada auf F. graminearum zurückzuführen gewesen. Neben Getreidenutzpflanzen hat diese Spezies ein breites Wirtsspektrum bei Gräsern. Der Name Fusarium bedeutet in der Tat "auf Gräsern". Diese Spezies war vermutlich bereits auf dem Grünland gegenwärtig, lange bevor Weizen und Gerste in Nordamerika eingeführt wurden. F. graminearum besiedelt auch erfolgreich alternde Pflanzen, insbesondere Getreidehalme. F. graminearum ist auch in einer anderen Hinsicht einzigartig, da es die einzige Weizen infizierende gemeine Fusarium-Spezies ist, welche in der Natur regelmäßig und im Übermaß ein sexuelles Stadium (Gibberella zea) durchläuft. Da die Sporen, welche durch dieses Stadium gebildet werden, mit großer Kraft in die Luft geschleudert werden, wird die Fähigkeit des Pilzes, sich ausgehend von besiedelten Getreiderückständen, auf denen sich die Fruchtkörper (Perithezien) dieses Stadiums bilden, zu verbreiten, außerordentlich verbessert.
F. graminearum hat einen komplexen Lebenszyklus, der einfacher zu beschreiben ist, wenn er in zwei Teile unterteilt wird: einen pathogenen Zyklus und einen 'verborgenen' Zyklus der saprophytischen Besiedlung. Die Auswirkung des pathogenen Zyklus ist als FHB erkennbar. Die Luftsporen landen bei Regen auf den blühenden Ähren, woraus eine FHB resultiert. F. graminearum überlebt auf Rückständen, insbesondere auf infizierten Ähren, und bildet im nächsten Frühling und Sommer Sporen. Während des saprophytischen Zyklus besiedelt das Myzel die Oberfläche der Getreidehalme, häufig ohne Krankheitssymptome. Während der Alterung erfolgt eine invasive Besiedlung, wobei F. graminearum den größten Teil der Getreidehalmrückstände befällt. In einer Studie aus Minnesota wurde gezeigt, dass mehr als 80% der Getreidehalmrückstände im Herbst durch F. graminearum befallen waren, und dass der Pilz im folgenden Frühjahr mehr als 60% davon bedeckt. Die besiedelten Rückstände stellen einen Ort für eine massive Sporenbildung während der nächsten Wachstumsperiode dar. Die durch die Luft übertragenen Sporen können einen neuen saprophytischen Besiedlungszyklus einleiten, oder sie können pathogene Zyklen initiieren, welche eine FHB zur Folge haben. Der saprophytische Besiedlungszyklus ist der Motor, der den pathogenen Teil des Zyklus begünstigt.
Der saprophytische Lebenszyklus von F. graminearum wird durch Getreidehalmrückstände begünstigt. Es gibt eine Reihe von Beobachtungen, dass, wenn die Maisproduktion in ein Gebiet verlagert wird, in dem vorher kleine Getreidesorten angebaut wurden, das Vorkommen von F. graminearum und das Risiko einer FHB ansteigt. Die Ausdehnung der Maisanbaufläche in Gegenden des Weizen- und Gersteanbaus in Kombination mit einer immer geringeren Bodenbearbeitung begünstigt große FHB-Epidemien bei kleinen Getreidesorten, wenn die Wetterbedingungen den Ausbruch der Krankheit begünstigen.
Auf diese Weise kann die Fusarium-Ährenfäule eine Reihe von Getreidenutzpflanzen wie Weizen, Gerste, Reis, Roggen und Mais befallen. Die Krankheit wird durch die phytopathogenen Pilze Fusarium graminearum, F. moniliforme, F. culmorum, F. nivale und Microdochium nivale hervorgerufen. Feuchte Umweltbedingungen während der Blütezeit können Fusarium-Epidemien und immense Verluste in Bezug auf die Getreideerträge zur Folge haben. Die Krankheit hat nicht nur eine Verminderung des Getreideertrags und der Getreidequalität, sondern auch eine Anreicherung von fungalen Mykotoxinen in dem Getreide zur Folge.
Kang et al. (Mycol. Res. 104 (9) (2000), 1083–1093) offenbaren experimentelle Beweise, dass die Penetration des Wirtsgewebes durch Fusarium culmorum bereits 36 Stunden nach der Beimpfung an den Innenflächen der Deckspelze, Hüllspelze und Vorspelze erfolgt, was beweist, dass die Hüllspelze, Deckspelze und/oder Vorspelze die Haupteintrittspunkte für den Beginn des Infektionsprozesses durch Fusarium bei Weizen sind.
Eines der Ziele der Pflanzengentechnik ist die Erzeugung von Pflanzen mit agronomisch wichtigen Eigenschaften oder Merkmalen. Jüngste Fortschritte in der Gentechnik haben die erforderlichen Hilfsmittel für die Transformation von Pflanzen, so dass sie fremde Gene enthalten und exprimieren, bereitgestellt (Kahl et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology 11 (1995), 449–460). Besonders wünschenswerte Merkmale oder Fähigkeiten von Interesse für die Pflanzengentechnik würden eine Resistenz gegen Insekten, Pilzerkrankungen wie die Fusarium-Ährenfäule sowie andere Schädlinge und Krankheiten verursachende Mittel, Toleranzen gegen Herbizide, eine verbesserte Ertragsstabilität oder Lagerfähigkeit, Umwelttoleranzen und Nahrungsverbesserungen einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. Die technologischen Vorteile der Pflanzentransformation und -regeneration haben die Forscher in die Lage versetzt, DNA-Stücke wie ein Gen oder Gene aus einer heterologen Quelle oder einer nativen Quelle zu isolieren und zu modifizieren, so dass sie andere oder verbesserte Eigenschaften besitzen, und die exogene DNA in das Genom einer Pflanze einzuschleusen. Das Gen oder die Gene können dann in der Pflanzenzelle exprimiert werden, um die (das) zusätzliche(n) Eigenschaft(en) oder Merkmal(e) zu zeigen. Bei einem Ansatz kann die Expression eines neuen Gens, welches normalerweise nicht in einer bestimmten Pflanze oder in einem bestimmten Pflanzengewebe exprimiert wird, einen gewünschten phänotypischen Effekt vorsehen. Bei einem anderen Ansatz kann die Transkription eines Gens oder eines Teils eines Gens in einer Antisense-Orientierung einen erwünschten Effekt durch das Verhindern oder das Hemmen der Expression eines endogenen Gens hervorrufen.
Isolierte Pflanzenpromotoren sind für die Modifikation von Pflanzen mit Hilfe der Gentechnik, um gewünschte phänotypische Eigenschaften vorzusehen, nützlich. Um eine solche transgene Pflanze zu erzeugen, wird ein Vektor, umfassend eine heterologe Gensequenz, welche den gewünschten Phänotyp überträgt, wenn sie in der Pflanze exprimiert wird, in die Pflanzenzelle eingeschleust. Der Vektor enthält auch einen Pflanzenpromotor, welcher mit der heterologe Gensequenz funktionell verbunden ist; und häufig einen Promotor, welcher normalerweise nicht mit dem heterologe Gen assoziiert ist. Der Vektor wird dann in eine Pflanzenzelle eingeschleust, um eine transformierte Pflanzenzelle zu erzeugen, und aus der transformierten Pflanzenzelle wird eine transgene Pflanze regeneriert. Der Promotor kontrolliert die Expression der eingeschleusten DNA-Sequenz, mit welcher der Promotor funktionell verbunden ist, und beeinflusst auf diese Weise die gewünschte Eigenschaft, welche durch die DNA-Sequenz übertragen wird.
Da der Promotor ein regulatorisches Element ist, das eine wesentliche Rolle bei der gesamten Expression eines Gens oder mehrerer Gene spielt, wäre es vorteilhaft, eine Vielzahl von Promotoren zur Verfügung zu haben, um die Genexpression derart zu beeinflussen, dass das eine Gen oder die mehreren Gene zum richtigen Zeitpunkt während des (der) Pflanzenwachstums und -entwicklung, an der optimalen Stelle in der Pflanze und in der ausreichenden Menge, um den gewünschten Effekt hervorzurufen, effizient trans kribiert wird. Zum Beispiel kann in einem Fall die konstitutive Expression eines Genprodukts an einer Stelle in der Pflanze vorteilhaft, aber in einem anderen Teil der Pflanze weniger vorteilhaft sein. In anderen Fällen kann es vorteilhaft sein, ein Genprodukt zu erhalten, das in einem bestimmten Entwicklungsstadium der Pflanze oder als Antwort auf bestimmte Umwelt- oder chemische Reize hergestellt wird. Die kommerzielle Entwicklung in Bezug auf ein genetisch verbessertes Keimplasma hat sich auch bis zu dem Stadium weiterentwickelt, dass mehrere Merkmale in Nutzpflanzen eingeführt werden, was häufig als 'Gene Stacking'-Ansatz (gestapelte Gene) bezeichnet wird. Bei diesem Ansatz können mehrere Gene, welche verschiedene Eigenschaften von Interesse übertragen, in eine Pflanze eingeschleust werden. Wenn mehrere Gene in eine Pflanze eingeschleust werden, ist es wichtig, dass jedes Gen moduliert und kontrolliert wird, um eine optimale Expression vorzusehen, und dass die regulatorischen Elemente unterschiedlich sind, um die Möglichkeit einer Gen-Stummschaltung zu verringern, welche durch eine Rekombination von homologen Sequenzen hervorgerufen werden kann. Angesichts dieser und anderer Überlegungen wird deutlich, dass eine optimale Kontrolle der Genexpression und die Diversität der regulatorischen Elemente in der Pflanzenbiotechnologie von großer Wichtigkeit sind.
Im Hinblick auf die DNA-Sequenz von Interesse müssen die geeigneten regulatorischen Sequenzen für die neu inserierte DNA, welche transkribiert werden soll, in der richtigen Position angeordnet sein und gegebenenfalls die Transkription davon in ein Protein in der Pflanzenzelle initiieren. Diese regulatorischen Sequenzen schließen, aber sind nicht begrenzt auf, einen Promotor, eine 5'-nichttranslatierte Leadersequenz und eine 3'-Polyadenylierungssequenz ein. Die Fähigkeit, die Gewebe, in denen eine solche fremde DNA transkribiert werden soll, und den Zeitpunkt während des Pflanzenwachstums, zu dem die Transkription einer solchen fremden DNA erhalten wird, auszuwählen, wird auch durch die Auswahl geeigneter Promotorsequenzen, welche die Transkription dieser Gene kontrollieren, ermöglicht.
Eine Vielzahl von verschiedenen Typen oder Klassen von Promotoren kann in der Pflanzengentechnik verwendet werden. Promotoren können anhand des Bereiches der Gewebespezifität unterteilt werden. Zum Beispiel sind Promotoren, welche als konstitutive Promotoren bezeichnet werden, in der Lage, DNA-Sequenzen, welche damit funktionell verbunden sind, effizient zu transkribieren und die DNA-Sequenzen in mehreren Geweben zu exprimieren. Gewebeverstärkte oder gewebespezifische Promotoren sind stromaufwärts angeordnet und funktionell mit DNA-Sequenzen verbunden, welche normalerweise in bestimmten Pflanzengeweben in höheren Raten oder in bestimmten Pflanzengeweben spezifisch transkribiert werden. Andere Klassen von Promotoren würden induzierbare Promotoren einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt, welche durch äußerliche Reize wie chemische Mittel, Entwicklungsreize oder Umweltreize beeinflusst werden können. Die verschiedenen Typen der gewünschten Promotoren können durch die Isolierung der regulatorischen Regionen von DNA-Sequenzen, welche in einer konstitutiven, gewebe verstärkten oder induzierbaren Art und Weise transkribiert und exprimiert werden, erhalten werden.
Die technologischen Vorteile der Sequenzierung mit einem hohen Durchsatz und der Bioinformatik haben weitere molekulare Hilfsmittel für die Promotor-Entdeckung bereitgestellt. Bestimmte gewünschte Pflanzenzellen, -gewebe oder -Organe in einem bestimmten Entwicklungsstadium oder unter bestimmten chemischen, Umwelt- oder physiologischen Bedingungen können als Ausgangsmaterial verwendet werden, um die mRNA zu isolieren und cDNA-Banken zu konstruieren. Die cDNA-Banken sind schnell sequenziert, und die exprimierten Sequenzen können elektronisch katalogisiert werden. Mit Hilfe einer Sequenzanalyse-Software können Tausende von Sequenzen innerhalb eines kurzen Zeitraums analysiert werden, und die Sequenzen von ausgewählten cDNA-Banken können verglichen werden. Die Kombination von Labor- und computergestützten Subtraktionsverfahren eröffnet den Forschern die Möglichkeit, cDNA-Banken zu durchmustern und zu vergleichen, und Sequenzen mit einem erwünschten Expressionsprofil zu identifizieren. Zum Beispiel können Sequenzen, welche in einem Gewebe bevorzugt exprimiert werden, durch den Vergleich einer cDNA-Bank von einem Gewebe mit cDNA-Banken von anderen Geweben und die elektronische "Subtraktion" der gemeinsamen Sequenzen, um Sequenzen zu finden, welche nur in dem Zielgewebe von Interesse exprimiert werden, identifiziert werden. Die in einem Gewebe verstärkt vorkommende Sequenz kann dann als eine Sonde oder ein Primer verwendet werden, um die entsprechende cDNA in der vollständigen Länge zu clonieren. Im Anschluss daran kann eine Genombank der Zielpflanze verwendet werden, um das entsprechende Gen und die damit verbundenen regulatorischen Elemente, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, die Promotorsequenzen, zu isolieren.
Trotz aller gegenwärtig zur Verfügung stehenden Techniken, sind keine regulatorischen Sequenzen von Monokotyledonen bekannt, welche in der Lage sind, die Transkription einer Nucleinsäuresequenz, welche damit funktionell verbunden ist, in dem Deckspelzen-, Vorspelzen- und/oder Hüllspelzengewebe einer monokotyledonen Pflanze zu regulieren. Insbesondere sind auch unglücklicherweise keine Weizen-Promotoren bekannt, welche die Expression eines Gens in der Vorspelze, Hüllspelze und/oder Deckspelze von Weizen steuern könnten. Da die Vorspelze, Hüllspelze und/oder Deckspelze die Haupteintrittspunkte sind, welche für einen Angriff durch Fusarium anfällig sind, ist es besonders wünschenswert, Zugang zu spezifischen Promotoren zu erhalten, welche zum Beispiel die Expression eines heterologen Gens steuern können, welches in der Lage ist, einen Angriff durch Fusarium und/oder eine damit in Beziehung stehende Krankheit in diesen spezifischen Geweben zu verhindern und/oder zu behandeln.
EMBL-Datenbank {Online}, 20. September 2000 (20.09.2000), "Oryza sativa Genomic DNA, Chromosome X, BAC Clone: H0421H08, Complete Sequence". XP002326381 erneuert aus der EBI-Hinterlegungsnummer EM_PRO: H0421H08. Die Datenbank-Hinterlegungsnummer H0421H08 offenbart eine Reis-Genomsequenz mit einer Identität von 99,677% mit SEQ ID NO: 3.
EP-A-0 913 469 (Japan Tobacco Inc.) offenbart einen blütenspezifischen Promotor, welcher aus Mais isoliert wurde, und Verwendungen hiervon. Weiterhin offenbart wird darin ein Promotor einer monokotyledonen Pflanze (Mais), der bevorzugt in dem Deckspelzen- und Vorspelzengewebe exprimiert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart eine Lösung für die vorstehenden Probleme durch die Bereitstellung einer neuen chimären monokotyledonen regulatorischen Sequenz, umfassend SEQ ID NO: 3 und einen CaMV- oder Reis-Aktin-Minimalpromotor, welche in der Lage ist, die Transkription einer damit funktionell verbundenen Nucleinsäuresequenz in dem Deckspelzen-, Vorspelzen- und/oder Hüllspelzengewebe einer monokotyledonen Pflanze zu regulieren. Um diese neuen monokotyledonen regulatorischen Sequenzen zu isolieren, ist das folgende erfindungsgemäße, nicht offensichtliche Verfahren entwickelt worden. Erstens sind gewebespezifische ESTs identifiziert worden; und zweitens sind spezifische Homologe in anderen Spezies, z. B. Reis, lokalisiert worden. Anschließend ist für diese spezifische Homologe, z. B. in Reis, gezeigt worden, dass sie in der geeigneten gewebespezifischen Weise exprimiert werden. Unter Verwendung der genomischen DNA-Sequenz sind die Promotoren aus den anderen Spezies, z. B. Reis oder Mais, cloniert worden.
Genauer ist die Häufigkeit der 96 häufigsten EST-Clustersequenzen in einer cDNA-Bank der Weizen-Deckspelze/Vorspelze in einer Reihe von cDNA-Banken, welche aus verschiedenen Weizen- und Maisgeweben hergestellt wurden, untersucht worden. 30 cDNA-Sequenzen, welche eine stark erhöhte Häufigkeit in den Deckspelzen-, Vorspelzen- und Hüllspelzengeweben im Vergleich zu dem Blatt-, Stamm-, Embryo-, Endosperm- und Wurzelgewebe zeigen, wurden eine weitere Analyse ausgewählt. Diese Weizen-EST-Clustersequenzen wurden verwendet, um z. B. Reis-cDNA-Homologe zu identifizieren. Die Häufigkeit der Reis-cDNA-Homologe wurde in cDNA-Banken von Reisblatt und -rispe (einschließlich Deckspelze und Vorspelze) verglichen. Reis-cDNAs, welche eine bevorzugte Expression in der Rispe zeigen, wurden dann verwendet, um homologe genomische Reis-DNA-Clone zu identifizieren; und die mutmaßlichen Promotorsequenzen sind identifiziert und cloniert worden.
Die Isolierung von heterologen Promotoren durch eine homologe intermediäre cDNA hat zwei große Vorteile: erstens die Identifizierung von Promotoren mit einem konservierten Genexpressionsmuster unter den Spezies, und zweitens die sichere Identifizierung des richtigen Mitglieds der Genfamilie für die anschließende Promotorisolierung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst folglich einen neuen chimären oder hybriden monokotyledonen Promotor, welcher eine Nucleinsäure von SEQ ID NO: 3 in Kombination mit einen CaMV-35S- oder Reis-Aktin-Minimalpromotor umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch DNA-Konstrukte, welche die offenbarte isolierte Sequenz, wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt, und eine damit funktionell verbundene transkribierbare DNA-Sequenz und eine 3'-nichttranslatierte Region umfasst.
Die vorliegende Erfindung schließt auch eine transgene Pflanzenzelle und transgene Pflanzen, welche das hierin offenbarte DNA-Konstrukt enthalten, ein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Verwendung einer monokotyledonen regulatorischen Sequenz von SEQ ID NO: 3 zur Regulierung der Transkription einer damit funktionell verbundenen Nucleinsäuresequenz in dem Deckspelzen-, Vorspelzen- und/oder Hüllspelzengewebe einer monokotyledonen Pflanze bereit, wobei der Promotor eine erhöhte oder verminderte Expression der damit funktionell verbundenen DNA-Sequenz vorsieht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze durch das Einbringen eines DNA-Konstrukts, umfassend: (i) einen Promotor, umfassend eine Nucleinsäure, welche eine Sequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst, sowie funktionell verbunden mit dem Promotor (ii) eine transkribierbare DNA-Sequenz, und (iii) eine 3'-nichttranslatierte Region, in eine Pflanzenzelle bereit. Für Transformationszwecke kann ferner eine geeignete selektierbare Markerkassette verwendet werden, um transformierte Pflanzen nachzuweisen und zu erkennen. Nützliche Marker werden nachstehend in dieser Anmeldung erläutert.
Die vorliegende Erfindung schließt auch differenzierte Pflanzen, Samen und Nachkommen ein, welche die oben erwähnten transformierten Pflanzenzellen umfassen. Die auf diese Weise erhaltenen Pflanzen zeigen eine gewebespezifische Expression der sogenannten Reportergene. Die Promotoren können daher in einem geeigneten Konstrukt verwendet werden, um die Expression von Kontrollgenen, zum Beispiel gegen die Fusarium-Ährenfäule, in dem richtigen Gewebe zu ermöglichen. Die auf diese Weise erhaltenen transformierten Pflanzen zeigen neue Eigenschaften von landwirtschaftlicher Wichtigkeit.
Die vorhergehenden und die weiteren Aspekte der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der verwendeten Definitionen und Methoden, sowie den beigefügten Zeichnungen deutlicher.
Definitionen und Methoden
Die folgenden Definitionen und Methoden werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung besser zu definieren und um den Fachleute eine Orientierungshilfe für die Durchführung der vorliegende Erfindung zu geben. Sofern nicht anders angegeben, ist selbstverständlich, dass die Begriffe gemäß dem herkömmlichen Gebrauch durch Fachleute des relevanten Fachgebiets verwendet werden. Für Aminosäurereste wird die herkömmliche Ein- und Drei-Buchstaben-Nomenklatur verwendet.
"Nucleinsäure(sequenz)" oder "Polynucleotid(sequenz)" verweist auf eine einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA, welche genomischen oder synthetischen Ursprungs ist, d. h. ein Polymer aus Desoxyribonucleotid- bzw. Ribonucleotidbasen, das vom 5'-Ende (stromaufwärts) zum 3'-Ende (stromabwärts) abgelesen wird. Die Nucleinsäure kann dem Sinnstrang (Sense) oder dem komplementären Strang (Antisense) entsprechen.
"Nativ" verweist auf eine natürlich vorkommende ("Wildtyp") Nucleinsäuresequenz.
"Heterologe" Sequenz verweist auf eine Sequenz, welche einer fremden Quelle oder Spezies entstammt, und welche, falls derselben Quelle entstammend, im Vergleich zu der ursprünglichen Form modifiziert ist.
Eine "isolierte" Nucleinsäuresequenz liegt im Wesentlichen getrennt oder gereinigt von anderen Nucleinsäuresequenzen, mit welchen die Nucleinsäure normalerweise in der Zelle des Organismus, in dem die Nucleinsäure natürlicherweise vorkommt, assoziiert ist, d. h. einer anderen chromosomalen oder extrachromosomalen DNA, vor. Der Begriff umfasst Nucleinsäuren, welche biochemisch gereinigt werden, um kontaminierende Nucleinsäuren und andere Zellkomponenten im Wesentlichen zu entfernen. Der Begriff umfasst auch rekombinante Nucleinsäuren und chemisch synthetisierte Nucleinsäuren.
Der Begriff "im Wesentlichen gereinigt", wie hierin verwendet, verweist auf ein Molekül, das im Wesentlichen von allen anderen Molekülen getrennt vorliegt, mit denen es in seinem nativen Zustand normalerweise assoziiert ist. Mehr bevorzugt ist ein im Wesentlichen gereinigtes Molekül die vorherrschende Spezies in einer Präparation. Ein im Wesentlichen gereinigtes Molekül kann zu mehr als 60%, vorzugsweise 75% und mehr bevorzugt 90% frei von den anderen Molekülen (abgesehen von dem Lösungsmittel), die in dem natürlichen Gemisch vorhanden sind, sein. Der Begriff "im Wesentlichen gereinigt" soll keine Moleküle einschließen, die in ihrem nativen Zustand vorliegen.
Eine erste Nucleinsäuresequenz zeigt eine "wesentliche Identität" mit einer Referenz-Nucleinsäuresequenz, falls bei einer optimalen Ausrichtung (mit geeigneten Nucleotidinsertionen oder -deletionen, welche insgesamt weniger als 20 Prozent der Referenzsequenz über das Vergleichsfenster ausmachen) an der anderen Nucleinsäure (oder dem komplementären Strang davon) die Nucleotidsequenz mindestens etwa 75% Identität, vorzugsweise mindestens etwa 80% Identität, mehr bevorzugt mindestens etwa 85% Identität und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% Identität über ein Vergleichsfenster von mindestens 20 Nucleotidpositionen, vorzugsweise mindestens 50 Nucleotidpositionen, mehr bevorzugt mindestens 100 Nucleotidpositionen und am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der ersten Nucleinsäure aufweist. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen zur Abgleichung eines Vergleichsfensters kann durch den lokalen Homo logie-Algorithmus nach Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2 (1981), 482); durch den Homologie-Abgleichungsalgorithmus nach Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48 (1970), 443); durch die Suche nach Übereinstimmungen nach der Methode von Pearson und Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2444); und vorzugsweise durch computergestützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA) in dem Wisconsin Genetics Software-Paket, Version 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) erfolgen. Die Referenz-Nucleinsäure kann ein Molekül von vollständiger Länge oder ein Teil eines längeren Moleküls sein. Alternativ sind zwei Nucleinsäuren im Wesentlichen identisch, wenn eine Sequenz unter stringenten Bedingungen, wie nachstehend definiert, mit der anderen Sequenz hybridisiert.
Eine erste Nucleinsäuresequenz ist "funktionell verbunden" mit einer zweiten Nucleinsäuresequenz, wenn die Sequenzen derart angeordnet sind, dass die erste Nucleinsäuresequenz die Funktion der zweiten Nucleinsäuresequenz beeinflusst. Vorzugsweise sind die zwei Sequenzen Teil eines einzelnen zusammenhängenden Nucleinsäuremoleküls, und mehr bevorzugt sind sie benachbart. Zum Beispiel ist ein Promotor mit einem Gen funktionell verbunden, falls der Promotor die Transkription des Gens in einer Zelle reguliert oder vermittelt.
Eine "rekombinante" Nucleinsäure wird durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennt vorliegenden Sequenzsegmenten, z. B. durch chemische Synthese oder durch die Manipulation von isolierten Nucleinsäuresegmenten durch DNA-Rekombinationstechniken, hergestellt. Techniken für eine Nucleinsäure-Manipulation sind gut bekannt (vgl. z. B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Bd. 1–3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Sambrook et al., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992, mit regelmäßigen Aktualisierungen, Ausubel et al., 1992; und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Innis et al., 1990). Verfahren für die chemische Synthese von Nucleinsäuren werden zum Beispiel bei Beaucage und Carruthers (Tetra. Letts. 22 (1981), 1859–1862) und Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185) besprochen. Die chemische Synthese von Nucleinsäuren kann zum Beispiel mit kommerziellen automatisierten Oligonucleotid-Synthesegeräten durchgeführt werden.
Eine "synthetische Nucleinsäuresequenz" kann für eine erhöhte Expression in bestimmten Wirtszellen und zum Zwecke der Clonierung in geeignete Vektoren konstruiert und chemisch synthetisiert werden. Synthetische DNAs, welche für eine erhöhte Expression in einen bestimmten Wirt konstruiert sind, sollten daher das Muster des Codongebrauchs in der Wirtszelle wiedergeben. Zu diesem Zweck stehen Computerprogramme, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die 'BestFit'- oder 'Gap'-Programme des Sequenzanalyse-Software-Pakets, Genetics Computer Group, Inc. (University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI, 53711), zur Verfügung.
"Amplifikation" von Nucleinsäuren oder "Nucleinsäure-Reproduktion" verweist auf die Herstellung von zusätzlichen Kopien einer Nucleinsäuresequenz und wird unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion(PCR)-Technologien durchgeführt. Eine Vielzahl von Amplifikationsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden unter anderem in US-Patent Nr. 4,683,195 und 4,683,202 , sowie durch Innis et al. (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990) beschrieben. In Bezug auf eine PCR verweist der Begriff "Primer" auf ein kurzes Oligonucleotid mit einer definierten Sequenz, welches an eine DNA-Matrize angelagert wird, um die Polymerasekettenreaktion zu initiieren.
"Transformiert", "transfiziert" oder "transgen" verweist auf eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ oder einen Organismus, worin eine fremde Nucleinsäure, wie ein rekombinanter Vektor, eingeschleust worden ist. Vorzugsweise wird die eingeschleuste Nucleinsäure in die genomische DNA der (des) Empfängerzelle, -gewebes, -organs oder -organismus integriert, so dass die eingeschleuste Nucleinsäure an spätere Nachkommen vererbt wird. Ein(e) "transgene(r)" oder "transformierte(r)" Zelle oder Organismus schließt auch die Nachkommen der Zelle oder des Organismus und die Nachkommen, welche durch ein Züchtungsprogramm unter Verwendung einer solchen "transgenen" Pflanze als ein Elternteil bei einer Kreuzung erzeugt werden und einen veränderten Phänotyp zeigen, der aus der Anwesenheit eines rekombinanten Konstrukts oder Vektors resultiert, erzeugt werden, ein.
Der Begriff "Gen" verweist auf eine chromosomale DNA, eine Plasmid-DNA, eine cDNA, eine synthetische DNA oder eine andere DNA, welche ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein oder ein RNA-Molekül codiert, sowie Regionen, welche die codierende Sequenz flankieren und an der Regulation der Expression beteiligt sind. Einige Gene können in mRNA transkribiert und in Polypeptide translatiert werden (Strukturgene); andere Gene können in RNA (z. B. rRNA oder tRNA) transkribiert werden; und andere Typen von Genen sind als Regulatoren der Expression wirksam (Regulatorgene).
"Expression" eines Gens verweist auf die Transkription eines Gens, um die entsprechende mRNA herzustellen, und die Translation dieser mRNA, um das entsprechende Genprodukt, d. h. ein Peptid, Polypeptid oder Protein, herzustellen. Die Genexpression wird durch regulatorische Elemente, einschließlich 5'-regulatorische Elemente wie Promotoren, kontrolliert oder moduliert.
"Genetische Komponente" verweist auf eine Nucleinsäuresequenz oder ein genetisches Element, die bzw. das auch eine Komponente oder ein Teil eines Expressionsvektors sein kann. Beispiele für genetische Komponenten schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Promotorregionen, 5'-nichttranslatierte Leadersequenzen, Introns, Gene, 3'-nichttranslatierte Regionen und andere regulatorische Sequenzen, oder Sequenzen, welche die Transkription oder Translation einer oder mehrerer Nucleinsäuresequenzen beeinflussen, ein.
Die Begriffe "rekombinantes DNA-Konstrukt", "rekombinanter Vektor", "Expressionsvektor" oder "Expressionskassette" verweisen auf ein Agens wie ein Plasmid, ein Cosmid, einen Virus, ein BAC (künstliches Bakterienchromosom), eine autonom replizierende Sequenz, einen Phagen oder eine lineare oder ringförmige, einzel- oder doppelsträngige DNA- oder RNA-Nucleotidsequenz, abgeleitet aus einer beliebigen Quelle, welche zur genomischen Integration oder autonomen Replikation befähigt ist, umfassend ein DNA-Molekül, in welchem eine oder mehrere DNA-Sequenzen in einer funktionell wirksamen Art und Weise verknüpft worden sind.
"Komplementär" verweist auf die natürliche Assoziation von Nucleinsäuresequenzen durch Basenpaarung (wobei A-G-T eine Paarung mit der komplementären Sequenz A-C-T eingeht). Die Komplementarität zwischen zwei einzelsträngigen Molekülen kann partiell sein, falls nur einige der Nucleinsäurepaare komplementär sind, oder vollständig, falls alle Basenpaare komplementär sind. Der Grad der Komplementarität beeinflusst die Effizienz und die Stärke von Hybridisierungs- und Amplifikationsreaktionen.
"Homologie" verweist auf den Grad der Übereinstimmung zwischen Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen im Hinblick auf die prozentuale Identität der Nucleotid- bzw. Aminosäurepositionen, d. h. die Sequenzübereinstimmung oder -identität. Homologie verweist auch auf das Konzept von ähnlichen funktionellen Eigenschaften zwischen verschiedenen Nucleinsäuren oder Proteinen.
"ESTs" oder exprimierte Sequenzmarker (Expressed Sequence Tags) sind kurze Sequenzen zufällig ausgewählter Clone aus einer cDNA(oder komplementären DNA)-Bank, welche für die cDNA-Insertionen in diesen zufällig ausgewählten Clonen repräsentativ sind (McCombie et al., Nature Genetics 1 (1992), 124; Kurata et al., Nature Genetics 8 (1994), 365; Okubo et al., Nature Genetics 2 (1992), 173).
Der Begriff "elektronischer Northern" verweist auf eine computergestützte Sequenzanalyse, welche ermöglicht, dass mehrere cDNA-Banken ausgehend von Parametern, welche durch die Forscher festgelegt werden, einschließlich der Häufigkeit in EST-Populationen in mehreren cDNA-Banken oder mit Ausnahme von EST-Gruppen aus einer Bank oder aus Kombinationen von Banken, elektronisch verglichen werden können.
"Unterteilung in Subpopulationen (Subsetting)" verweist auf ein Verfahren zum Vergleich von Nucleinsäuresequenzen aus verschiedenen oder mehreren Quellen, welches angewendet werden kann, um das Expressionsprofil der Nucleinsäuresequenzen zu ermitteln, das die Gentranskriptionsaktivität und Informationsstabilität in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter bestimmten Bedingungen wiedergibt.
"Promotor" verweist auf eine Nucleinsäuresequenz, welche stromaufwärts oder 5' zu einem Translationsstartcodon eines offenen Leseraster (oder einer proteincodierenden Region) eines Gens angeordnet ist und welche an der Erkennung und Bindung der RNA-Polymerase II und anderen Proteinen (trans-wirksamen Transkriptionsfaktoren), um die Transkription zu initiieren, beteiligt sind. Ein "Pflanzenpromotor" ist ein nativer oder nicht-nativer Promotor, welcher in Pflanzenzellen wirksam ist. Konstitutive Promotoren sind in den meisten oder allen Geweben einer Pflanze während der Pflanzenentwicklung wirksam. Gewebe-, organ- oder zellspezifische Promotoren werden lediglich oder vorwiegend in einem bestimmten Gewebe-, Organ- bzw. Zelltyp exprimiert. Anstatt "spezifisch" in einem bestimmten Gewebe-, Organ- oder Zelltyp exprimiert zu werden, kann ein Promotor eine "verstärkte" Expression, d. h. eine höhere Expressionsrate, in einem Teil (z. B. einem Zelltyp, Gewebe oder Organ) der Pflanze im Vergleich zu den anderen Teilen der Pflanze zeigen. Zeitlich regulierte Promotoren sind lediglich oder vorwiegend während bestimmten Zeiträumen der Pflanzenentwicklung oder zu bestimmten Tageszeiten, wie im Falle von Genen, welche zum Beispiel mit dem Tagesrhythmus in Zusammenhang stehen, wirksam. Induzierbare Promotoren exprimieren selektiv eine damit funktionell verbundene DNA-Sequenz als Antwort auf das Vorhandensein eines endogenen oder exogenen Reizes, zum Beispiel durch chemische Verbindungen (chemische Induktoren), oder als Antwort auf umweltbedingte, hormonale, chemische oder entwicklungsbedingte Signale. Induzierbare oder regulierte Promotoren schließen zum Beispiel Promotoren ein, welche durch Licht, Hitze, Stress, Überschwemmung oder Trockenheit, Phytohormone, eine Verletzung oder Chemikalien wie Ethanol, Jasmonat, Salicylsäure, 'Safener'-Verbindungen, Schädlinge oder Pathogene reguliert werden.
Jeder Pflanzenpromotor kann als eine 5'-regulatorische Sequenz für die Modulation der Expression oder bestimmten Gens oder bestimmter Gene verwendet werden. Ein bevorzugter Promotor wäre ein Pflanzenpromotor, welcher RNA-Polymerase II erkennt und bindet. Diese RNA-Polymerase-Typ II-Pflanzenpromotoren haben wie alle anderen Promotoren von höheren Eukaryonten eine komplexe Struktur und sind aus mehreren verschiedenen Elementen zusammengesetzt. Ein solches Element ist die TATA-Box oder Goldberg-Hogness-Box, welche für die fehlerlose Expression eukaryontischer Gene in vitro sowie die genaue und effiziente Initiation der Transkription in vivo erforderlich ist. Die TATA-Box ist typischerweise bei etwa –25 bis –35 angeordnet, das heißt an der Position von 25 bis 35 Basenpaare (bp) stromaufwärts (5') der Transkriptionsinitiationsstelle oder Cap-Stelle, welche als Position +1 definiert ist (Breathnach und Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50 (1981), 349–383; Messing et al., in: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., Hrsg., S. 211–227, 1983). Ein anderes verbreitetes Element, die CCAAT-Box, ist zwischen –70 und –100 bp angeordnet. In Pflanzen kann die CCAAT-Box eine andere Konsensussequenz als die funktionell analoge Sequenz von Säugerpromotoren aufweisen (das Analog in Pflanzen ist als "AGGA-Box" bezeichnet worden, um es von seinem Gegenstück in Tieren zu unterscheiden; Messing et al., in: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., Hrsg., S. 211–227, 1983). Daneben enthalten praktisch alle Promotoren weitere stromaufwärts angeordnete aktivierende Sequenzen oder Enhancer (Benoist und Chambon, Nature 290 (1981), 304–310; Gruss et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78 (1981), 943–947; und Khoury und Gruss, Cell 27 (1983), 313–314), welche sich über den Bereich von etwa –100 bp bis –1000 bp oder mehr stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle erstrecken. Enhancer sind ebenfalls 3' zu der Transkriptionsstartstelle gefunden worden.
Bei einer Fusion mit heterologen DNA-Sequenzen bewirken solche Promotoren typischerweise, dass die damit fusionierte Sequenz in einer ähnlichen Art und Weise transkribiert wird, wie die Gensequenz, mit welcher der Promotor normalerweise verbunden ist. Promotorfragmente, welche regulatorische Sequenzen einschließen, können eingefügt werden (zum Beispiel fusioniert mit dem 5'-Ende oder inseriert innerhalb eines aktiven Promotors, welcher eigene regulatorische Sequenzen, entweder teilweise oder vollständig, enthält (Fluhr et al., Science 232 (1986), 1106–1112; Ellis et al., EMBO J. 6 (1987), 11–16; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 8986–8990; Poulsen und Chua, Mol. Gen. Genet. 214 (1988), 16–23; Comai et al., Plant Mol. Biol. 15 (1991), 373–381). Alternativ können heterologe regulatorische Sequenzen in die 5'-Stromaufwärtsregion eines inaktiven, verkürzten Promotors, z. B. eines Promotors, welcher lediglich die TATA-Kernsequenz und zuweilen die CCAAT-Elemente enthält, eingefügt werden (Fluhr et al., Science 232 (1986), 1106–1112; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 8986–8990; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 65–71).
Pflanzenpromotoren können Promotoren einschließen, welche durch die Manipulation von bekannten Promotoren zur Herstellung von synthetischen, chimären oder hybriden Promotoren erhalten werden. Chimäre Promotoren sind unter Einfügen einer heterologen regulatorischen Sequenz in die 5'-Stromaufwärtsregion eines inaktiven, verkürzten Promotors, d. h. eines Promotors, welcher lediglich die TATA-Kernsequenz und wahlweise die CCAAT-Elemente einschließt, entwickelt worden (Fluhr et al., Science 232 (1986), 1106–1112; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 8986–8990; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 65–71).
Die Promotorsequenzen sind in der Lage, funktionell damit verbundene DNA-Sequenzen in spezifischen, hinreichend definierten Weizengeweben wie der Deckspelze, Vorspelze oder Hüllspelze zu transkribieren, und können daher die Expression solcher Gene in diesen Geweben selektiv regulieren.
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung sind zur Regulierung der Genexpression in Weizengeweben wie der Deckspelze, Vorspelze oder Hüllspelze nützlich. Für eine Reihe von agronomischen Merkmalen ist die Transkription eines Gens oder mehrerer Gene von Interesse in mehreren Gewebe wünschenswert, um die gewünschte(n) Eigenschaft(en) zu übertragen. Die Verfügbarkeit geeigneter Promotoren, welche die Transkription von Genen, welche damit funktionell verbunden sind, in ausgewählten Zielgeweben von Interesse regulieren, ist wichtig, da es nicht wünschenswert sein kann, dass die Expression eines Gens in jedem Gewebe, sondern lediglich in bestimmten Geweben erfolgt. Daher ist es wichtig, dass es eine große Vielzahl von Wahlmöglichkeiten in Bezug auf 5'-regulatorische Elemente für eine beliebige Strategie der Pflanzenbiotechnologie gibt.
Das Aufkommen der Genomforschung, welche Molekular- und Bioinformatiktechniken umfasst, hatte die schnelle Sequenzanalyse einer großen Anzahl von DNA-Proben aus einer sehr großen Zahl von Zielorganismen einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Pflanzenarten von landwirtschaftlicher Wichtigkeit, zur Folge. Der erste Schritt bei der Identifizierung der Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in einer Datenbank oder einer Sammlung von cDNA-Sequenzen beinhaltet die Konstruktion von cDNA-Banken aus spezifischen Zielgeweben einer Pflanze. Kurz zusammengefasst werden zuerst die cDNA-Banken aus diesen Geweben konstruiert, welche in einem bestimmten Entwicklungsstadium oder unter bestimmten Umweltbedingungen gewonnen wurden. Durch die Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen in Pflanzengeweben in verschiedenen Entwicklungsstadien oder unter unterschiedlichen Bedingungen können die entsprechenden regulatorischen Sequenzen solcher Gene identifiziert und isoliert werden. Das 'Trancript Imaging'-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Sequenzen, die bevorzugt in einem Gewebe vorkommen, anhand eines spezifischen Abbildungsverfahrens der Nucleinsäuresequenzen in einer cDNA-Bank. Mit 'Trancript Imaging', wie hierin verwendet, ist eine Analyse gemeint, wobei die Häufigkeit der exprimierten Gene in einer oder mehreren Banken verglichen wird. Die in einer cDNA-Bank enthaltenen Clone werden sequenziert, und die Sequenzen werden mit Sequenzen aus öffentlich zugänglichen Datenbanken verglichen. Computergestützte Verfahren erlauben dem Forscher das Bereitstellen von Abfragen, welche Sequenzen von mehreren Genbanken vergleichen. Das Verfahren ermöglicht eine schnelle Identifizierung der Clone von Interesse im Vergleich zu herkömmlichen Subtraktionsverfahren mittels Hybridisierung, welche den Fachleuten bekannt sind.
Unter Anwendung herkömmlicher Methodiken können aus der mRNA (Boten-RNA) eines bestimmten Gewebes oder Organismus mit Hilfe von Poly-dT-Primern und einer reversen Transkriptase cDNA-Banken konstruiert werden (Efstratiadis et al., Cell 7 (1976), 279; Higuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1976), 3146; Maniatis et al., Cell 8 (1976), 163; Land et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2251; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 161; Gubler et al., Gene 25 (1983), 263).
Mehrere Methoden können angewendet werden, um cDNA-Konstrukte in einer vollständigen Länge zu erhalten. Zum Beispiel kann eine terminale Transferase verwendet werden, um homopolymere Schwänze von dC-Resten an die freien 3'-Hydroxylgruppen anzuhängen (Land et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2251). Dieser Schwanz kann dann mit einem Poly-dG-Oligonucleotid hybridisiert werden, welches als ein Primer für die Synthese der vollständigen Länge der Sekundärstrang-cDNA fungieren kann. Okayama und Berg beschrieben ein Verfahren zum Erhalt von cDNA-Konstrukten in vollständiger Länge (Mol. Cell Biol. 2 (1982), 161). Dieses Verfahren ist durch die Verwendung von synthetischen Primer-Adaptoren vereinfacht worden, die sowohl homopolymere Schwänze für die Initiierung der Synthese des ersten und des zweiten Strangs als auch Restriktionsstellen für die Clonierung in Plasmide (Coleclough et al., Gene 34 (1985), 305) und Bakteriophagenvektoren (Krawinkel et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1913; Han et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 6304) aufweisen.
Diese Strategien können in Verbindung mit ergänzenden Strategien für die Isolierung von seltenen mRNA-Populationen angewendet werden. Zum Beispiel enthält eine typische Sängerzelle zwischen 10.000 und 30.000 verschiedene mRNA-Sequenzen (Davidson, Gene Activity in Early Development, 2. Auflage, Academic Press, New York, 1976). Die Anzahl der Clone, welche erforderlich ist, um eine bestimmte Wahrscheinlichkeit zu erreichen, dass eine mRNA mit geringer Häufigkeit in einer cDNA-Bank vorliegt, beträgt N = (ln(1 – P))/(ln(1 – 1/n)), worin N die Anzahl der erforderlichen Clone ist, P die erwünschte Wahrscheinlichkeit ist, und 1/n der fraktionelle Anteil an der gesamten mRNA ist, welcher durch eine einzelne seltene mRNA repräsentiert wird (Sambrook et al., 1989).
Ein Verfahren zur Anreicherung von mRNA-Präparationen in Bezug auf Sequenzen von Interesse ist die Größenfraktionierung. Ein solches Verfahren umfasst die Fraktionierung durch eine Elektrophorese auf einem Agarosegel (Pennica et al., Nature 301 (1983), 214). Ein anderes Verfahren beinhaltet eine Sucrosegradientenzentrifugation in Gegenwart eines Mittels wie Methylquecksilberhydroxid, welches die Sekundärstruktur der RNA denaturiert (Schweinfest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 4997–5000).
ESTs können durch eine Reihe von Verfahren sequenziert werden. Zwei grundlegende Methoden können bei der DNA-Sequenzierung angewendet werden: die Kettenterminationsmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463) und die chemische Abbaumethode (Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560). Eine Automatisierung sowie Fortschritte in der Technologie, wie zum Beispiel das Ersetzen von Radioisotopen durch eine auf Fluoreszenz basierende Sequenzierung, haben den Aufwand verringert, der erforderlich ist, um eine DNA zu sequenzieren (Craxton, Methods 2 (1991), 20; Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 4347; Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 6339). Automatisierte Sequenzanalysegeräte sind von einer Reihe von Herstellern einschließlich Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey (Pharmcia ALF); LI-COR, Inc., Lincoln, Nebraska (LI-COR 4000); und Millipore, Redford, Massachusetts (Millipore BaseStation) erhältlich.
Es ist gezeigt worden, das ESTs mit einer Länge von mehr als 150 bp bei Ähnlichkeitssuchen und Kartierungen nützlich sind (Adams et al., Science 252 (1991), 1651). EST-Sequenzen umfassen normalerweise 150 bis 450 Basen. Dies entspricht der Länge der Sequenzinformation, welche routinemäßig und zuverlässig mit einem einzigen Sequenzdaten-Programmlauf generiert wird. Typischerweise wird nur ein einziger Sequenzdaten-Programmlauf von der cDNA-Bank erhalten (Adams et al., Science 252 (1991), 1651). Eine automatisierte Sequenzierung in einem einzigen Programmlauf hat typischerweise eine Fehlerrate oder Basen-Mehrdeutigkeitsrate von ungefähr 2–3% zur Folge (Boguski et al., Nature Genetics 4 (1993), 332).
EST-Datenbanken sind zum Beispiel von C. elegans (McCombrie et al., Nature Genetics 1 (1992), 124); der menschlichen Leberzelllinie HepG2 (Okubo et al., Nature Genetics 2 (1992), 173); menschlicher Hirn-RNA (Adams et al., Science 252 (1991), 1651; Adams et al., Nature 355 (1992), 355); Arabidopsis (Newman et al., Plant Physiol. 106 (1994), 1241) und Reis (Kurata et al., Nature Genetics 8 (1994), 365) konstruiert oder teilweise konstruiert worden. Die vorliegende Erfindung verwendet ESTs aus einer Reihe von cDNA-Banken, welche aus Weizengeweben, vorzugsweise aus der Hüllspelze, Deckspelze oder Vorspelze, konstruiert wurden, als ein Hilfsmittel für die Identifizierung von Genen, welche in diesen Zielgeweben exprimiert werden, wodurch dann die Isolierung von 5'-regulatorischen Sequenzen wie Promotoren, welche die Gene regulieren, erleichtert wird. Daneben sind auch EST-Banken aus Blütengeweben von Reis erforderlich, um die Identifizierung des genspezifischen Homologs vor der Promotorisolierung zu unterstützen, ebenso wie auch EST-Banken aus anderen Geweben als Hintergrund-Banken erforderlich sind.
Die ESTs, welche bei der Sequenzierung einer Reihe von cDNA-Banken generiert werden, werden in einer Computer-Datenbank gespeichert, und diese "unbearbeiteten" ESTs werden in einem Prozess, der als 'Clustering' (Gruppierung) bekannt ist, in Gruppen von zusammenhängenden ESTs gruppiert, d. h. in ESTs, die von homologen mRNA-Transkripten stammen.
Ein "Cluster" ist auf eine Gruppe von Sequenzen, welche eine Identität von mindestens 90% über ein Fenster von 100 Basenpaaren gemeinsam haben. Durch die Abgleichung der Mitglieder eines Clusters und die Berechnung der Übereinstimmung kann eine einzelne repräsentative Sequenz für den Cluster abgeleitet werden.
Computergestützte Sequenzanalysen können verwendet werden, um unterschiedlich exprimierte Sequenzen zu identifizieren, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, solche Sequenzen, welche in einem Gewebe im Vergleich zu einem anderen Gewebe exprimiert werden. Zum Beispiel kann eine unterschiedliche Gruppe von Sequenzen in einer aus Wurzelgewebe isolierten cDNA im Vergleich zu dem Blattgewebe identifiziert werden. Demgemäß können Sequenzen von cDNA-Banken, die aus Pflanzen konstruiert wurden, die unter verschiedenen Umwelt- oder physiologischen Bedingungen gezüchtet wurden, miteinander verglichen werden. Sobald die bevorzugten Sequenzen in der cDNA-Bank von Interesse identifiziert werden, können die genomischen Clone aus einer Genombank isoliert werden, welche aus dem Pflanzengewebe hergestellt wurde, und können die entsprechenden regulatorischen Sequenzen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die 5'-regulatorischen Sequenzen, identifiziert und isoliert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsformn werden die exprimierten Sequenzmarker(EST)-Sequenzen einer Vielzahl von cDNA-Banken in einer Sequenzdatenbank katalogisiert. Diese Datenbank wird verwendet, um Promotor-Zielsequenzen in einem bestimmten Gewebe von Interesse zu identifizieren. Die Auswahl der exprimierten Sequenzmarker für die anschließende Promotorisolierung reflektiert das Vorhandensein einer oder mehrerer Sequenzen unter den repräsentativen ESTs durch eine zufällige Abfrage einer einzelnen cDNA-Bank oder einer Sammlung von cDNA-Banken.
Zum Beispiel beinhaltet die Identifizierung von regulatorischen Sequenzen, welche die Expression von Transkripten in dem Gewebe von Interesse steuern, die Identifizierung von ESTs, welche in den Geweben von Interesse, wie der Deckspelze, Vorspelze oder Hüllspelze, vorkommen und in anderen cDNA-Banken in der Datenbank fehlen oder mit geringer Häufigkeit vorkommen. Die identifizierten EST-Ableitungen werden dann verwendet, um die entsprechenden regulatorischen Sequenzen, welche damit funktionell verbunden sind, in genomischen DNA-Sequenzen zu identifizieren.
Mit Häufigkeit, wie hierin verwendet, ist die Anzahl gemeint, wie oft ein Clon oder ein Cluster von Clonen in einer Bank vorkommt. Die Sequenzen, welche vermehrt oder mit einer hohen Häufigkeit in einem spezifischen Gewebe oder Organ vorkommen, welches ein gewünschte Expressionsprofil repräsentiert, werden auf diese Weise identifiziert, und ausgehend von den identifizierten EST-Sequenzen können Primer konstruiert werden. Ein PCR-basierender Ansatz kann verwendet werden, um flankierende Regionen in einer genomischen Bank der Zielpflanze von Interesse zu amplifizieren. Eine Reihe von Methoden sind den Fachleuten bekannt, um unbekannte DNA-Sequenzen zu amplifizieren, welche an eine Kernregion mit einer bekannten Sequenz angrenzen. Die Methoden schließen, aber sind nicht begrenzt auf, eine inverse PCR (IPCR), eine Vektorett-PCR, eine Y-förmige PCR sowie 'Genome Walking'-Ansätze ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine genomische DNA, welche mit einem Adaptor ligiert ist, einer ersten PCR-Amplifikationsrunde mit einem Gen-spezifischen Primer und einem Primer, welcher mit der Adaptorsequenz hybridisiert, unterworfen. Das PCR-Produkt wird dann als Matrize in einer Amplifikationsrunde durch eine verschachtelte PCR (nested PCP) mit einem zweiten Gen-spezifischen Primer und einem zweiten Adaptor verwendet. Die aus der verschachtelten PCR-Reaktion erhaltenen Fragmente werden dann isoliert, gereinigt und in einen geeigneten Vektor subcloniert. Die Fragmente werden sequenziert, und die Translationsstartstellen können identifiziert werden, wenn die EST von einer verkürzten cDNA abgeleitet wird. Die Fragmente können als transkriptionelle oder translationelle Fusionsprodukte mit einem Reportergen wie β-Glucuronidase (GUS) in Pflanzenexpressionsvektoren cloniert werden. Die Konstrukte können in transienten Analysen getestet werden, und anschließend werden die 5'-regulatorischen Regionen mit anderen Genen und regulatorischen Sequenzen von Interesse in einem geeigneten Pflanzentransformationsvektor funktionell verbunden, und die transfor mierten Pflanzen werden mit Hilfe einer Reihe von Verfahren, welche den Fachleuten bekannt sind, auf die Expression des Gens oder der Gene von Interesse untersucht.
Jede Pflanze kann für die Identifizierung von Genen und regulatorischen Sequenzen gewählt werden. Beispiele geeigneter Zielpflanzen für die Isolierung von Genen und regulatorischen Sequenzen würden einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt: Acadia, Alfalfa, Apfel, Aprikose, Arabidopsis, Artischocke, Rucola, Spargel, Avocado, Banane, Gerste, Bohnen, Rüben, Brombeere, Blaubeere, Brokkoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Cantaloupe-Melone, Karotte, Maniok, Rhizinussamen, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicorée, Koriander, Zitrusgewächse, Clementinen, Nelke, Kokosnuss, Kaffee, Mais, Baumwolle, Gurke, Douglasfichte, Aubergine, Endiviensalat, Winterendivie, Eukalyptus, Fenchel, Feigen, Knoblauch, Flaschenkürbis, Traube, Grapefruit, Honigtau, Jicama, Kiwi, Kopfsalat, Lauch, Zitrone, Lilie, Limone, Weihrauch-Kiefer, Leinsamen, Mango, Melone, Pilze, Nektarine, Nüsse, Hafer, Ölpalme, Rapsölsamen, Okra, Olive, Zwiebel, Orange, Zierpflanzen, Palmen, Papaya, Petersilie, Pastinake, Erbse, Pfirsich, Erdnuss, Birne, Pfeffer, Khakifrucht, Kiefer, Ananas, Kochbanane, Pflaume, Granatapfel, Pappel, Kartoffel, Hokkaidokürbis, Quitte, Radiatakiefer, Radicchio, Rettich, Rapssamen, Himbeere, Reis, Roggen, Sorghum, Gelbkiefer, Sojabohne, Spinat, Speisekürbis, Erdbeere, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume, Süßkartoffel, Amberbaum, Mandarine, Tee, Tabak, Tomate, Tritical, Rasengräser, Steckrübe, Wein, Wassermelone, Weizen, Yamswurzel und Zucchini. Besonders bevorzugte Zielpflanzen würden Mais, Baumwolle, Reis, Roggen, Gerste, Sorghum, Hafer, Sojabohne und Weizen, am meisten bevorzugt Weizen, einschließen.
Jede Methode, welche einen differenziellen Vergleich zwischen verschiedenen Typen oder Klassen von Sequenzen ermöglicht, kann angewendet werden, um Gene oder regulatorische Sequenzen von Interesse zu isolieren. Zum Beispiel kann in einem Ansatz für ein differenzielles Screening eine cDNA-Bank von mRNA, die aus einem bestimmten Gewebe isoliert wurde, unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Clonierungskits in einem Bakteriophagenwirt hergestellt werden. Die Plaques werden auf Platten mit einem Rasen des Bakterienwirtes wie E. coli ausgestrichen, um Bakteriophagen-Plaques zu erzeugen. Etwa 10⁵–10⁶ Plaques können mit DNA-bindenden Membranen abgehoben werden. Membranduplikate wurden unter Verwendung von Sonden abgesucht, welche aus der mRNA des Zielgewebes und eines Nicht-Zielgewebes oder eines Hintergrundgewebes entworfen wurden. Die Sonden werden markiert, um den Nachweis davon nach der Hybridisierung und Entwicklung zu erleichtern. Plaques, welche mit Sonden des Zielgewebes, aber nicht mit Sonden des Nicht-Zielgewebes hybridisieren, und welche ein gewünschtes differenzielles Expressionsmuster zeigen, können für eine weitere Analyse ausgewählt werden. Genomische DNA-Banken einer ausgewählten Spezies können auch durch eine partielle Spaltung mit einem Restriktionsenzym und einer Selektion der DNA-Fragmente nach Größe innerhalb eines bestimmten Größenbereichs hergestellt werden. Die genomische DNA kann in einen geeigneten Vektor, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, einen Bakteriophagen, cloniert werden und unter Verwendung eines geeigneten Vektors, wie eines Bakteriophagen, unter Verwendung eines geeigneten Clonierungskits von einer Reihe von Anbietern (vgl. zum Beispiel Stratagene, La Jolla, CA, oder Gibco BRL, Gaithersburg, MD), präpariert werden.
Differenzielle Hybridisierungstechniken, wie beschrieben, sind den Fachleuten gut bekannt, und können angewendet werden, um eine gewünschte Klasse von Sequenzen zu isolieren. Mit Klassen von Sequenzen, wie hierin verwendet, sind Sequenzen gemeint, welche basierend auf einem gemeinsamen Marker in Gruppen eingeteilt werden können, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Sequenzen, welche aus einer gemeinsamen Zielpflanze, einer gemeinsamen Genbank oder einem gemeinsamen Pflanzengewebetyp isoliert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Sequenzen von Interesse basierend auf Sequenzanalysen und der Abfrage einer Sammlung von unterschiedlichen cDNA-Sequenzen aus Genbanken von verschiedenen Gewebetypen identifiziert. Das offenbarte Verfahren stellt ein Beispiel für einen differenziellen Screening-Ansatz basierend auf elektronischen Sequenzanalysen von Pflanzen-ESTs, welche aus verschiedenen cDNA-Banken abgeleitet wurden, bereit.
Eine Reihe von Verfahren, welche angewendet werden, um die Genexpression abzuschätzen, basieren auf der Messung des mRNA-Spiegels in einer Organ-, Gewebe- oder Zellprobe. Typische Verfahren schließen, aber sind nicht begrenzt auf, RNA-Blots, Ribonuclease-Schutz-Tests und eine RT-PCR ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren mit hohem Durchsatz angewendet, wobei regulatorische Sequenzen durch einen 'Transcript Profiling'-Ansatz identifiziert werden. Die Entwicklung der cDNA-Microarray-Technologie ermöglicht die systematische Überwachung von Genexpressionsprofilen für Tausende von Genen (Schena et al., Science 270 (1995), 467). Bei dieser auf einem DNA-Chip basierenden Technologie werden Tausende von cDNA-Sequenzen auf einer Trägeroberfläche in Arrays angeordnet. Diese Arrays werden mit mehreren markierten cDNA-Sonden, die aus RNA-Proben von verschiedenen Zell- oder Gewebetypen hergestellt wurden, gleichzeitig hybridisiert, wodurch eine direkte vergleichende Analyse der Expression ermöglicht wird. Diese Technologie wurde erstmals durch die Analyse von 48 Arabidopsis-Genen auf eine differenzielle Expression in Wurzeln und Sprossen veranschaulicht (Schena et al., Science 270 (1995), 467). Vor kurzem wurden die Expressionsprofile von mehr als 1400 Genen unter Verwendung von cDNA-Microarrays überwacht (Ruan et al., The Plant Journal 15 (1998), 821). Microarrays sehen ein quantitatives und reproduzierbares Verfahren mit einem hohen Durchsatz für die Analyse der Genexpression und die Charakterisierung der Genfunktion bereit. Der 'Transcript Profiling'-Ansatz unter Verwendung von Microarrays sieht daher ein anderes nützliches Hilfsmittel für die Isolierung von regulatorischen Sequenzen, wie Promotoren, die mit solchen Genen assoziiert sind, bereit.
Bei der vorliegende Erfindung werden Sequenzanalysen mit hohem Durchsatz angewendet, welche die Grundlage für eine schnelle computergestützte Identifizierung der Sequenzen von Interesse zu bilden. Den Fachleuten sind die Hilfsmittel bekannt, welche für Sequenzanalysen zur Verfügung stehen. Sequenzvergleiche können durch das Ermitteln der Ähnlichkeit der Test- oder Abfragesequenz zu Sequenzen in öffentlich zugänglichen oder firmeneigenen Datenbanken ("Ähnlichkeitsanalyse") oder durch die Suche nach bestimmten Motiven ("spezifische Sequenzanalyse") (z. B. cis-Elemente) erfolgen (Coulson, Trends in Biotechnology 12 (1994), 76; Birren et al., Genome Analysis 1 (1977), 543).
Die in SEQ ID NO: 3 bereitgestellte Nucleotidsequenz kann auf einer Vielzahl von Medien "bereitgestellt" werden, um eine Verwendung zu ermöglichen. Ein solches Medium kann auch eine Untergruppe davon in einer Form bereitstellen, welche dem Fachmann erlaubt, die Sequenzen zu untersuchen.
Bei einer Anwendung dieser Ausführungsform kann eine Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung auf computerlesbaren Medien erfasst werden. Wie hierin verwendet, verweist "computerlesbares Medium" auf ein Medium, das durch einen Computer gelesen und direkt aufgerufen werden kann. Solche Medien schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Magnetspeichermedien wie Disketten, Festplatten, Speichermedien und Magnetstreifen; optische Speichermedien wie CD-ROM; elektronische Speichermedien wie RAM und ROM; sowie Hybride dieser Kategorien, wie zum Beispiel magnetische/optische Speichermedien, ein. Ein Fachmann kann ohne Weiteres einschätzen, wie irgendeines der gegenwärtig bekannten computerlesbaren Medien verwendet werden kann, um ein Erzeugnis herzustellen, welches ein computerlesbares Medium umfasst, auf dem eine Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung gespeichert ist.
Durch die Bereitstellung einer oder mehrerer Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können die Fachleute für eine Vielzahl von Zwecken regelmäßig auf die Sequenzinformation zugreifen. Es gibt eine öffentlich zugängliche Computer-Software, welche dem Fachmann erlaubt, auf eine auf einem computerlesbaren Medium bereitgestellte Sequenzinformation zuzugreifen. Beispiele für öffentliche Datenbanken würden die DNA-Datenbank von Japan (DDBJ) (http://www.ddbj.nig.ac.jp/); Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/Index.html); und die European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db.html) oder Versionen davon einschließlich, aber sind nicht darauf begrenzt. Eine Reihe von unterschiedlichen Suchalgorithmen sind entwickelt worden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die als BLAST-Programme bezeichnete Programmfolge. Es gibt fünf Implementierungen von BLAST, wobei drei für Nucleotidsequenz-Abfragen (BLASTN, BLASTX und TBLASTX) und zwei für Proteinsequenz-Abfragen (BLASTP und TBLASTN) entwickelt wurden (Coulson, Trends in Biotechnology 12 (1994), 76–80; Birren et al., Genome Analysis 1 (1997), 543).
BLASTN verwendet eine Nucleotidsequenz (die Abfragesequenz) und das reverse Komplement davon und überprüft diese mit einer Nucleotidsequenz-Datenbank. BLASTN wurde im Hinblick auf Schnelligkeit, aber nicht bezüglich einer maximalen Empfindlichkeit entwickelt und kann entfernt verwandte codierende Sequenzen nicht entdecken. BLASTX verwendet eine Nucleotidsequenz, übersetzt sie in drei Vorwärts-Leseraster und drei reverse Komplement-Leseraster und vergleicht dann die sechs Translationen mit einer Proteinsequenz-Datenbank. BLASTX ist für eine empfindlichen Analyse von vorläufigen(Einzeldurchgang-)Sequenzdaten nützlich und toleriert Sequenzierungsfehler (Gish und States, Nature Genetics 3 (1993), 266–272). BLASTN und BLASTX können gemeinsam für die Analyse von EST-Daten verwendet werden (Coulson, Trends in Biotechnology 12 (1994), 76–80; Birren et al., Genome Analysis 1 (1997), 543–559).
Bei einer vorgegebenen codierenden Nucleotidsequenz und dem dadurch codierten Protein wird oft bevorzugt, das Protein als Abfragesequenz zu verwenden, um eine Datenbank zu durchsuchen, weil dadurch die Empfindlichkeit stark erhöht wird, feinere Beziehungen nachzuweisen. Dies ist auf das größere Alphabet der Proteine (20 Aminosäuren) im Vergleich zu dem Alphabet der Nucleinsäuresequenzen (4 Basen) zurückzuführen, wo es weitaus einfacher ist, eine zufällige Übereinstimmung zu erhalten. Zusätzlich wird bei Nucleotid-Abgleichungen (Nucleotid-'Alignments') nur eine Übereinstimmung ('positiver Score') oder keine Übereinstimmung ('negativer Score') erhalten, während bei Proteinen das Vorhandensein von konservativen Aminosäuresubstitutionen berücksichtigt werden kann. Hierbei kann eine Fehlpaarung einen 'positiven Score' ergeben, falls der nicht identische Rest physikalische/chemische Eigenschaften besitzt, welche dem Rest ähneln, der dadurch ersetzt wird. Verschiedene 'Scoring'-Matrizen werden verwendet, um die 'Substitution-Scores' für alle mögliche Aminosäurepaare bereitzustellen. Ein allgemeines 'Scoring'-System ist die BLOSUM62-Matrix (Henikoff und Henikoff, Proteins 17 (1993), 46–91), welche gegenwärtig die Standardwahl für BLAST-Programme ist. BLOSUM62 ist auf Abgleichungen von mäßig divergierenden Sequenzen zugeschnitten, daher können nicht unter allen Bedingungen die besten Ergebnisse erhalten werden. Altschul, J. Mol. Biol. 36 (1993), 290–300, verwendet eine Kombination aus drei Matrizen, um alle Möglichkeiten abzudecken. Dadurch kann die Empfindlichkeit verbessert werden, aber zu Kosten von langsameren Suchdurchläufen. In der Praxis wird häufig eine einzige BLOSUM62-Matrix verwendet, wobei andere (PAM40 und PAM250) ausprobiert werden können, wenn eine weitere Analyse erforderlich ist. Niedrige PAM-Matrizen sind auf den Nachweis von sehr großen, aber lokalisierten Sequenzübereinstimmungen ausgerichtet, während hohe PAM-Matrizen auf den Nachweis von langen, aber schwachen Abgleichungen zwischen sehr entfernt verwandten Sequenzen ausgerichtet ist.
Homologe in anderen Organismen sind zugänglich, welche für eine vergleichende Sequenzanalyse verwendet werden können. Es werden multiple Abgleichungen durchgeführt, um Übereinstimmungen und Unterschiede in einer Gruppe von verwandten Se quenzen zu untersuchen. CLUSTAL W ist ein erhältliche Programmpaket für eine multiple Sequenzabgleichung, welches basierend auf der Methode nach Feng und Doolittle, J. Mol. Evol. 25 (1987), 351–360, progressive multiple Sequenzabgleichungen durchführt. Jedes Paar von Sequenzen wird ausgerichtet, und der Abstand zwischen jedem Paar wird berechnet; aus dieser Abstandsmatrix wird ein 'Guide Tree' (Führungsbaum) berechnet, und alle Sequenzen werden basierend auf diesen Baum abschnittsweise abgeglichen. Eine Besonderheit des Programms ist seine Empfindlichkeit für den Effekt von Lücken auf die Abgleichung; wobei die 'Gap Penalties' variiert werden, um die Einführung von Lücken in mutmaßliche 'Loop'-Regionen anstatt in die Mitte von strukturierten Regionen zu begünstigen. Die Anwender können die 'Gap Penalties' vorgeben, aus einer Reihe von 'Scoring'-Matrizen auswählen oder ihre eigenen 'Scoring'-Matrizen für sowohl die paarweisen Abgleichungen als auch die multiplen Abgleichungen eingeben. CLUSTAL W für UNIX- und VMS-Systeme ist unter: ftp.ebi.ac.uk erhältlich. Ein anderes Programm ist MACAW (Schuler et al., Proteins, Struct. Func. Genet. 9 (1991), 180–190, für das sowohl Macintosh- als auch Microsoft Windows-Versionen erhältlich sind. MACAW verwendet eine graphische Oberfläche, stellt eine Auswahl von mehreren Abgleichungsalgorithmen bereit und ist auf einem Anonymen FTP-Server unter ncbi.nlm.nih.gov(directory/pub/macaw) zugänglich.
Jedes Programm, welches für eine Motivsuche entwickelt wurde, ist bei der vorliegenden Erfindung ebenfalls von Nutzen. Für die Motivsuche entwickelte Sequenzanalyse-Programme können bei der Identifizierung von cis-Elementen angewendet werden. Bevorzugte Computerprogramme würden MEME, SIGNALSCAN und GENESCAN einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. MEME ist ein Programm, das konservative Motive (entweder eine Nucleinsäure oder ein Peptid) in einer Gruppe von nicht ausgerichteten Sequenzen identifiziert. MEME speichert diese Motive in Form einer Reihe von Profilen. Diese Profile können verwendet werden, um eine Datenbank nach Sequenzen zu durchsuchen. Ein MEME-Algorithmus (Version 2.2) ist in der Version 10.0 des GCG-Pakets zu finden. MEME (Bailey und Elkan, Machine Learning 21 (1–2) (1995), 51–80) ist unter der Website-Adresse http://www.sdsc.edu/MEME/meme/website/ COPYRIGI-IT.html. zu finden. SIGNALSCAN ist ein Programm, das bekannte Motive in den Testsequenzen unter Verwendung der Information aus anderen Motiv-Datenbanken identifiziert (Prestridge, CABIOS 7 (1991), 203–206). Informationen zu SIGNALSCAN Version 4.0 sind auf der folgenden Website zugänglich: http://biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. Die FTP-Seite für SIGNALSCAN ist ftp://biosci.cbs.umn.edu/ software/sigscan.html. Die Datenbanken, welche in Verbindung mit SIGNALSCAN verwendet werden, schließen PLACE (http://www.dna.affrc.go.ip/htdocs/PLACE; Higo et al., Nucleic Acids Research 27 (1) (1999), 297–300) und TRANSFAC (Heinemeye X. et al., Nucleic Acids Research 27 (1), 318–322) ein, welche auf der folgenden Website zu finden sind: http://transfac.gbf.de/, ein. GENESCAN ist ein anderes geeignetes Programm für die Motivsuche (Burge und Karlin, J. Mol. Biol. 268 (1977), 78–94), und Informationen zu Version 1.0 sind auf der folgenden Website erhältlich: http://gnomic.stanford.edu/ GENESCANW.html. So wie hierin verwendet, verweist "ein Ziel-Strukturmotiv" oder "Zielmotiv" auf eine rational gewählte Sequenz oder Kombination von Sequenzen, wobei die Sequenz oder die Sequenzen basierend auf einer dreidimensionalen Anordnung ausgewählt werden, welche bei der Faltung des Zielmotivs gebildet wird. Es gibt eine Vielzahl von Zielmotiven, welche den Fachleuten bekannt sind. Protein-Zielmotive schließen, aber sind nicht begrenzt auf, enzymatisch aktive Stellen und Signalsequenzen ein. Bevorzugte Zielmotive der vorliegenden Erfindung würden Promotorsequenzen, cis-Elemente, Haarnadelstrukturen und andere Expressionselemente wie Proteinbindungssequenzen einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt.
So wie hierin verwendet, verweist "Suchmittel" auf ein oder mehrere Programme, welche auf einem computergestützten System implementiert werden, um eine Zielsequenz oder ein Ziel-Strukturmotiv mit der Sequenzinformation, welche auf dem Datenspeichermittel gespeichert ist, zu vergleichen. Suchmittel werden verwendet, um Fragmente oder Regionen der Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu identifizieren, welche mit einer bestimmten Zielsequenz oder einem bestimmten Zielmotiv übereinstimmen. Es können auch mehrere Sequenzen verglichen werden, um gemeinsame Regionen oder Motive zu identifizieren, welche für spezielle Funktionen verantwortlich sein können. Zum Beispiel können cis-Elemente oder Sequenzdomänen, welche ein spezifisches Expressionsprofil vorsehen, identifiziert werden, wenn mehrere Promotorregionen ähnlicher Klassen von Promotoren ausgerichtet und durch bestimmte Software-Pakete analysiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Systeme, insbesondere computergestützte Systeme, bereit, welche die hierin beschriebene Sequenzinformation beinhalten. So wie hierin verwendet, verweist ein "computergestütztes System" auf die Hardwaremittel, Softwaremittel und Datenspeichermittel, welche verwendet werden, um die Nucleotidsequenz-Information der vorliegenden Erfindung zu analysieren. Das minimale Hardwaremittel der computergestützten Systeme der vorliegenden Erfindung umfasst eine zentrale Recheneinheit (CPU), Eingabemittel, Ausgabemittel und Datenspeichermittel. Den Fachleuten ist bewußt, dass jedes der verfügbaren computergestützten Systeme zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die flankierenden Sequenzen, welche die 5'-regulatorischen Elemente der vorliegenden Erfindung enthalten, mit Hilfe eines 'Genome Walking'-Ansatzes isoliert (Universal GenomeWalker^TM Kit, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Kurz zusammengefasst, wird die gereinigte genomische DNA einen Restriktionsenzymverdau unterworfen, wodurch genomische DNA-Fragmente erzeugt werden, wobei die Enden davon mit GenomeWalker^TM Adaptoren ligiert sind. GenomeWalker^TM Primer werden zusammen mit Gen-spezifischen Primern in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen (einer primären und einer verschachtelten PCR-Reaktion) verwendet, um PCR-Produkte, enthaltend die 5'-regulatorischen Sequenzen, herzustellen, welche dann cloniert und sequenziert werden.
Zusätzlich zu ihrer Verwendung bei der Modulation der Genexpression, sind die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung auch als Sonden oder Primer in Nucleinsäure-Hybridisierungsexperimenten nützlich. Die Nucleinsäure-Sonden und -Primer der vorliegenden Erfindung können unter stringenten Bedingungen mit einer DNA-Zielsequenz hybridisieren. Der Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" ist definiert als Bedingungen, unter denen eine Sonde oder ein Primer mit einer oder mehreren Zielsequenzen und nicht mit Nicht-Zielsequenzen hybridisiert, wie empirisch ermittelt werden kann. Der Begriff "stringente Bedingungen" ist im Hinblick auf die Hybridisierung einer Nucleinsäuresonde mit einer Ziel-Nucleinsäure (d. h. mit einer bestimmten Nucleinsäuresequenz von Interesse) durch das spezifische Hybridisierungsverfahren funktionell definiert (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., 1989, in 9.52–9.55 und 9.47–9,52, 9.56–9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 203–213; Wetmur und Davidson, J. Mol. Biol. 31 (1968), 349–370). Geeignete Stringenzbedingungen, welche die DNA-Hybridisierung begünstigen, sind zum Beispiel 6,0× Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem Waschschritt mit 2,0× SSC bei 50°C. Sie sind den Fachleuten bekannt oder sind in Laborhandbüchern einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1989, 6.3.1–6.3.6, zu finden. Zum Beispiel kann die Salzkonzentration in dem Waschschritt im Hinblick auf eine niedrige Stringenz von etwa 2.0× SSC bei 50°C bis zu einer hohen Stringenz von etwa 0,2× SSC bei 50°C gewählt werden. Daneben kann die Temperatur in dem Waschschritt von Bedingungen einer niedrigen Stringenz bei Raumtemperatur, etwa 22°C, auf Bedingungen einer hohen Stringenz bei etwa 65°C erhöht werden. Sowohl die Temperatur als auch die Salzkonzentration können variiert werden, oder kann entweder die Temperatur oder die Salzkonzentration konstant gehalten werden, während die andere Variable verändert wird. Zum Beispiel kann die Hybridisierung unter Verwendung von DNA- oder RNA-Sonden oder -Primern für eine hohe Stringenz bei 65°C in 6× SSC, 0,5% SDS, 5× Denhardt-Lösung, 100 μg/ml unspezifische DNA (z. B. beschallte Lachssperma-DNA) unter Waschen mit 0,5× SSC, 0,5% SDS bei 65°C durchgeführt werden.
Es wird in Betracht gezogen, dass Hybridisierungsbedingungen mit einer niedrigeren Stringenz, wie zum Beispiel niedrigere Hybridisierungs- und/oder Waschtemperaturen, verwendet werden können, um verwandte Sequenzen zu identifizieren, welche einen geringeren Grad an Sequenzübereinstimmung zeigen, falls die Spezifität der Bindung der Sonde oder des Primers an die Zielsequenz(en) beibehalten wird. Demgemäß können die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung auf Grund ihrer Fähigkeit, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Bereichen von DNA-Fragmenten zu bilden, verwendet werden. Der Nachweis von DNA-Segmenten mittels Hybridisierung ist den Fachleuten gut bekannt. So können abhängig von der in Betracht gezogenen Anwendung vorzugsweise variierende Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, um unterschiedliche Grade der Selektivität der Sonde gegenüber der Zielsequenz zu erreichen, wobei die Methode der Wahl von den gewünschten Ergebnissen abhängt.
Die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3 ist in der Lage, unter geeignet gewählten Stringenzbedingungen mit anderen Nucleinsäuresequenzen zu hybridisieren. So wie hierin verwendet, sind zwei Nucleinsäuremoleküle in der Lage, miteinander spezifisch zu hybridisieren, falls die zwei Moleküle fähig sind, eine antiparallele doppelsträngige Nucleinsäurestruktur auszubilden. Ein Nucleinsäuremolekül ist das "Komplement" eines anderen Nucleinsäuremoleküls, falls sie eine Komplementarität zeigen. So wie hierin verwendet, zeigen Moleküle eine "vollständige Komplementarität", wenn jedes Nucleotid eines der Moleküle zu einen anderen Nucleotid des anderen Moleküls komplementär ist. Zwei Moleküle sind "minimal komplementär", falls sie mit einer ausreichenden Stabilität miteinander hybridisieren können, so dass sie zumindest unter herkömmlichen Bedingungen einer "niedrigen Stringenz" hybridisiert bleiben. In gleicher Weise sind die Moleküle "komplementär", falls sie mit einer ausreichenden Stabilität miteinander hybridisieren können, so dass sie unter herkömmlichen Bedingungen einer "hohen Stringenz" hybridisiert bleiben. Herkömmliche Stringenzbedingungen werden durch Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) und durch Haymes et al. (Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985), beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3 in Hybridisierungstests für andere Pflanzengewebe verwendet werden, um eng verwandte oder homologe Gene und damit assoziierte regulatorische Sequenzen zu identifizieren. Diese schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Southern- oder Northern-Hybridisierungstests auf einem beliebigen Substrat, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, ein geeignet vorbehandeltes Pflanzengewebe, Cellulose, Nylon oder ein Kombinationsfilter, ein Chip oder ein Objektträger, ein. Solche Methodiken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind in Form eines Kits oder einer Zubereitung erhältlich, welche über kommerzielle Anbieter bezogen werden können.
Selbstverständlich können Nucleinsäurefragmente auch durch andere Techniken erhalten werden, wie zum Beispiel durch die direkte Synthese des Fragments mit chemischen Mitteln, wie es üblicherweise unter Verwendung eines automatisierten Oligonucleotid-Synthesegerätes praktiziert wird. Fragmente können auch unter Anwendung einer Nucleinsäure-Reproduktionstechnologie wie der PCR^TM-Technologie (Polymerasekettenreaktion) oder durch DNA-Rekombinationstechniken, welche den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie im Allgemeinen bekannt sind, erhalten werden. Im Hinblick auf die Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäuresequenz (z. B. mittels PCR) unter Verwendung eines spezifischen Primerpaares für die Amplifikation verweist "stringente PCR-Bedingungen" auf solche Bedingungen, welche ermöglichen, dass das Primerpaar nur mit der Ziel-Nucleinsäuresequenz hybridisiert, an die ein Primer mit der entsprechenden Wildtyp-Sequenz (oder dem Komplement davon) binden würde, und vorzugsweise ein spezifisches Amplifikationsprodukt erzeugt.
Die Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können auch als Sonden und Primer verwendet werden. Nucleinsäuresonden und -Primer können basierend auf einer nativen Gensequenz hergestellt werden. Eine "Sonde" ist eine isolierte Nucleinsäure, woran ein herkömmliches nachweisbares Marker- oder Reportermolekül, z. B. ein radioaktives Isotop, Ligand, chemilumineszierendes Mittel oder Enzym, gebunden ist. "Primer" sind isolierte Nucleinsäuren, welche sich an einen komplementären DNA-Zielstrang durch eine Nucleinsäurehybridisierung unter Ausbildung eines Hybrids zwischen dem Primer und dem DNA-Zielstrang anlagern und dann entlang des DNA-Zielstrangs durch eine Polymerase, z. B. eine DNA-Polymerase, verlängert werden. Primerpaare können für die Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz, z. B. durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder andere herkömmliche Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, verwendet werden.
Sonden und Primer hybridisieren spezifisch mit einer DNA- oder RNA-Zielsequenz unter Hybridisierungsbedingungen einer hohen Stringenz und hybridisieren spezifisch mit einer nativen Zielsequenz einer anderen Spezies unter Bedingungen einer niedrigeren Stringenz. Vorzugsweise zeigen die erfindungsgemäßen Sonden und Primer eine vollständige Sequenzübereinstimmung mit der nativen Sequenz, obwohl sich Sonden von der nativen Sequenz unterscheiden, wodurch die Fähigkeit beibehalten wird, mit nativen Zielsequenzen zu hybridisieren. Sonden und Primer können durch herkömmliche Verfahren konstruiert werden. Verfahren für die Herstellung und Verwendung von Sonden und Primer sind beschrieben (vgl. Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; und Innis et al. 1990). PCR-Primerpaare können zum Beispiel unter Verwendung von Computerprogrammen, welche zu diesem Zweck entwickelt wurden, wie Primer (Version 0.5,^© 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA), von einer bekannten Sequenz abgeleitet werden.
Native oder synthetische Nucleinsäuren im Einklang mit der vorliegenden Erfindung können in rekombinante Nucleinsäurekonstrukte, typischerweise DNA-Konstrukte, welche zur Einschleusung und Replikation in eine(r) Wirtszelle geeignet sind, eingebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt, in eine Expressionsvektorkassette eingebracht, welche die Promotorregionen der vorliegenden Erfindung in funktioneller Verbindung mit einer genetischen Komponente, wie einem selektierbaren, nachweisbaren oder quantifizierbaren Markergen, umfasst. Die offenbarte Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise mit einer genetischen Komponente wie einer Nucleinsäure, welche eine wünschenswerte Eigenschaft in Zusammenhang mit der Morphologie, der Physiologie, dem Wachstum und der Entwicklung der Pflanze, dem Ertrag, der Nahrungsverbesserung, einer Krankheit wie der Fusarium-Ährenfäule oder einer Schädlingsresis tenz, sowie einer Umwelt- oder chemischen Toleranz überträgt, funktionell verbunden. Diese genetischen Komponenten wie Markergene oder agronomische Gene von Interesse können in der Identifizierung einer transformierten Pflanzenzelle bzw. Pflanze oder der Herstellung eines Produkts von agronomischem Wert wirksam sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform erzeugt eine genetische Komponente ein Produkt, welches als eine Selektionseinheit wirksam ist und in einem regenerierbaren Pflanzengewebe dazu dient, eine Verbindung herzustellen, welche für das Pflanzengewebe eine Resistenz gegen eine ansonsten toxische Verbindung vorsehen würde. Gene von Interesse für die Verwendung als einen selektierbaren, nachweisbaren oder quantifizierbaren Marker würden GUS (codierende Sequenz für β-Glucuronidase), GFP (codierende Sequenz für das grün fluoreszierende Protein), LUX (codierendes Gen für Luciferase), Antibiotikaresistenzgene und Herbizidtoleranzgene einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. Beispiele für Transposons und damit assoziierte Antibiotikaresistenzgene schließen die Transposons Tns (bla), Tn5 (nptII), Tn7 (dhfr), Penicilline, Kanamycin (und Neomycin, G418, Bleomycin), Methotrexat (und Trimethoprim), Chloramphenicol und Tetracyclin ein.
Die für selektierbare Marker in Pflanzen nützlichen Eigenschaften sind in einem Bericht über die Verwendung von Mikroorganismen dargelegt worden (Advisory Committee an Novel Foods and Processes, Juli 1994). Diese schließen die stringente Selektion mit einer minimalen Anzahl von nichttransformierten Geweben, eine große Zahl von unabhängigen Transformationsereignissen ohne eine wesentliche Beeinflussung der Regeneration, die Anwendung auf eine große Zahl von Spezies und die Verfügbarkeit eines Tests zur Untersuchung der Gewebe auf die Anwesenheit des Markers ein.
Eine Reihe von selektierbaren Markergenen ist auf denn Fachgebiet bekannt, wobei mehrere Antibiotikaresistenzmarker diese Kriterien erfüllen, einschließlich solche, welche eine Resistenz gegen Kanamycin (nptII), Hygromycin B (aph IV) und Gentamycin (aac3 und aaC4) verleihen. Nützliche dominante selektierbare Markergene schließen Gene ein, welche Antibiotikaresistenzgene (z. B. eine Resistenz gegen Hygromycin, Kanamycin, Bleomycin, G418, Streptomycin oder Spectinomycin) und Herbizidresistenzgene (z. B. Phosphinothricin-Acetyltransferase) codieren. Eine nützliche Strategie für die Selektion von Transformanten auf eine Herbizidresistenz ist z. B. bei Vasil (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Bd. I-III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, New York, 1984) beschrieben. Besonders bevorzugte selektierbare Markergene für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung würden Gene einschließen, welche eine Resistenz gegen Verbindungen wie Antibiotika wie zum Beispiel Kanamycin und Herbizide wie Glyphosat übertragen (Della-Cioppa et al., Bio/Technology 5 (6), 1987); US-Patent 5,463,175 ; US-Patent 5,633,435 ). Andere Selektionseinheiten können ebenfalls verwendet werden und sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung werden herkömmliche Zusammensetzungen und Verfahren für die Herstellung und Verwendung von Vektoren und Wirtszellen verwendet, wie sie unter anderem bei Sambrook et al., 1989, besprochen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle. Eine Reihe von Vektoren, welche zur stabilen Transfektion von Pflanzenzellen oder für die Begründung von transgenen Pflanzen geeignet sind, sind z. B. bei Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Ergänzung 1987); Weissbach und Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989); Gelvin et al. (Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990); und Groy (Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993) beschrieben worden. Pflanzenexpressionsvektoren können zum Beispiel ein oder mehrere clonierte Pflanzengene unter der transkriptionellen Kontrolle von 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen enthalten. Sie können auch einen selektierbaren Marker, wie beschrieben, enthalten, um Wirtszellen zu selektieren, welche den Expressionsvektor enthalten. Solche Pflanzenexpressionsvektoren enthalten auch eine regulatorische Promotorregion (z. B. eine regulatorische Region, welche die Expression induzierbar oder konstitutiv, umweltbedingt oder entwicklungsbedingt oder zell- oder gewebespezifisch kontrolliert bzw. reguliert), eine Transkriptionsinitiationsstelle, eine Ribosomenbindungsstelle, ein RNA-Prozessierungssignal, eine Transkriptionsterminationsstelle und ein Polyadenylierungssignal. Andere Sequenzen, welche bakteriellen Ursprungs sind, können ebenfalls eingeschlossen sein, um die Clonierung des Vektors in einen Bakterienwirt zu ermöglichen. Der Vektor enthält auch typischerweise einen prokaryontischen Replikationsursprung, um einen großen Wirtsbereich vorzusehen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle, und umfasst der Pflanzenexpressionsvektor eine Promotorregion, wie in SEQ ID NO: 3 offenbart, eine damit funktionell verbundene transkribierbare Sequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz. Andere regulatorische Sequenzen, die als genetische Komponenten in einem Expressionsvektor in Betracht gezogen werden, schließen eine nichttranslatierte Leadersequenz ein, aber sind nicht darauf begrenzt, welche mit dem Promotor verbunden sein kann. Pflanzenexpressionsvektoren können auch zusätzliche Sequenzen umfassen, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Restriktionsenzymstellen, welche für Clonierungszwecke nützlich sind.
Eine Reihe von Promotoren sind für die Genexpression eines Gens von Interesse, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, selektierbare Markergene, quantifizierbare Markergene, Gene für eine Schädlingstoleranz, Krankheitstoleranz oder Nahrungsverbesserungen, sowie irgendeines anderen Gens, das ein wünschenswertes Merkmal oder eine gewünschte Eigenschaft überträgt, in einer Pflanze von Nutzen. Beispiele für konstitutive Promotoren, welche für die Genexpression in einer Pflanze nützlich sind, schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, den Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-35S-Promotor, der eine konstitutive hohe Expressionsrate in den meisten Pflanzengeweben (vgl. z. B. Odel et al., Nature 313 (1985), 810), einschließlich Monokotyledonen (vgl. z. B. Dekeyser et al., Plant Cell 2 (1990), 591; Terada und Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220 (1990), 389), vorsieht; den Nopalinsynthase-Promotor (An et al., Plant Physiol. 88 (1988), 547); den Octopinsynthase-Promotor (Fromm et al., Plant Cell 1 (1989), 977); und den Braunwurzmosaikvirus(FMV)-Promotor, wie in US-Patent Nr. 5,378,619 beschrieben, ein.
Eine Vielzahl von Pflanzengen-Promotoren, welche in Antwort auf umweltbedingte, hormonale, chemische und/oder entwicklungsbedingte Signale reguliert werden, können verwendet werden, um ein Gen, welches damit funktionell verbunden ist, in Pflanzenzellen zu exprimieren, einschließlich Promotoren, welche reguliert werden durch (1) Hitze (Callis et al., Plant Physiol. 88 (1988), 965), (2) Licht (z. B. der rbcS-3A-Promotor der Erbse, Kuhlemeier et al., Plant Cell 1 (1989), 471; der rbcS-Promotor von Mais, Schaffner und Sheen, Plant Cell 3 (1991), 997; oder der Chlorophyll a/b-Bindungsprotein-Promotor, Simpson et al., EMBO J. 4 (1985), 2723), (3) Hormone wie Abszisinsäure (Marcotte et al., Plant Cell 1 (1989), 969), (4) Verletzungen (z. B. wunI, Siebertz et al., Plant Cell 1 (1989), 961), oder (5) Chemikalien wie Methyljasmonat, Salicylsäure oder 'Safener'-Verbindungen. Es kann auch vorteilhaft sein, (6) organspezifische Promotoren zu verwenden (z. B. Roshal et al., EMBO J. 6 (1987), 1155; Schernthaner et al., EMBO J. 7 (1988), 1249; Bustos et al., Plant Cell 1 (1989), 839).
Pflanzenexpressionsvektoren können RNA-Prozessierungssignale, z. B. Introns, einschließen, welche stromaufwärts oder stromabwärts einer Polypeptid-codierenden Sequenz in dem Transgen angeordnet sein können. Daneben können die Expressionsvektoren zusätzliche regulatorische Sequenzen aus der 3'-nichttranslatierten Region von Pflanzengenen einschließen (Thornburg et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 84 (1987), 744; An et al., Plant Cell 1 (1989), 115), z. B. eine 3'-Terminatorregion, um die mRNA-Stabilität der mRNA zu erhöhen, wie die PI-II-Terminatorregion der Kartoffel oder die Octopin- oder Nopalinsynthase-3'-Terminatorregion. Nichttranslatierte Regionen am 5'-Ende einer mRNA können eine wichtige Rolle bei der Translationsinitiation spielen und können auch als eine genetische Komponente in einem Pflanzenexpressionsvektor wirksam sein. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass nichttranslatierte 5'-Leadersequenzen, welche von Hitzeschockproteinen abgeleitet sind, die Genexpression in Pflanzen verstärken (vgl. zum Beispiel US-Patent 5,362,865 ). Diese zusätzlichen stromaufwärts und stromabwärts angeordneten regulatorischen Sequenzen können aus einer Quelle stammen, welche im Hinblick auf die anderen Elemente, welche auf dem Expressionsvektor vorliegen, nativ oder heterolog ist.
Die Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um die Genexpression in Zellen einer monokotyledonen Pflanze, insbesondere in Getreidepflanzen und noch genauer in definierten Weizenzellen zu kontrollieren. Die offenbarten Promotorsequenzen sind genetische Komponenten, welche Bestandteil von Vektoren sind, die bei der Pflanzentransformation verwendet werden. Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit einem geeigneten Plasmid oder Vektor, enthaltend einen selektierbaren oder nachweisbaren Marker und damit assoziierte regulatorische Elemente, wie beschrieben, zusammen mit einer oder mehreren Nucleinsäuren, welche in einer ausreichenden Weise exprimiert werden, um ein besonders wünschenswertes Merkmal zu übertragen, für die Pflanzentransformation verwendet werden. Beispiele geeigneter Strukturgene von agronomischem Interesse, welche durch die vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, würden ein oder mehrere Gene für eine Insektentoleranz, wie ein Gen, das ein Bt-Endotoxin codiert; für eine Schädlingstoleranz, wie Gene zur Kontrolle einer Pilzerkrankung, insbesondere zur Kontrolle der Fusarium-Ährenfäule; für eine Herbizidtoleranz, wie Gene, welche eine Glyphosat-Toleranz übertragen; sowie Gene für eine Qualitätsverbesserung, zum Beispiel im Hinblick auf den Ertrag, die Physiologie, die Verwendung von Düngemitteln, das Wachstum, die Entwicklung, die Morphologie oder das (die) Pflanzenprodukt(e), einschließen.
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können in Weizengewebe verwendet werden, um die Genexpression in Zusammenhang mit einer Ertragssteigerung oder der Abwehr eines Angriffs durch Pilze und Mikroorganismen, z. B. Fusarium, Microdochium, Stagnospora und Blumeria, zu kontrollieren. Die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen können bei der Kontrolle der Expression solcher Gene, welche gegen eine Insektenschädigung an Getreide, welche normalerweise einen Austrieb vor der Ernte zur Folge hat, da in das durch Insekten geschädigte Getreide Feuchtigkeit eindringt, wirksam sind, verwendet werden. Weiterhin können die Promotorsequenzen der Erfindung bei der Kontrolle der Expression solcher Gene, die einen Einfluss auf Pflanzenstress, z. B. Hitze- oder Wasserstress, ausüben, verwendet werden.
Alternativ können die DNA codierenden Sequenzen diese Phänotypen bewirken, wobei sie ein nicht-transkribierbares RNA-Molekül codieren, das die gezielte Inhibition der Expression eines endogenen Gens, zum Beispiel über Antisense- oder Cosuppression-Mechanismen, herbeiführt (vgl. zum Beispiel Bird et al., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9 (1991), 207). Die RNA könnte auch ein katalytisches RNA-Molekül sein (d. h. ein Ribozym), weiches so verändert wurde, dass es ein gewünschtes endogenes mRNA-Produkt spaltet (vgl. zum Beispiel Gibson und Shilitoe, Mol. Biotech. 7 (1997), 125). Daher ist ein beliebiges Gen, welches ein Protein oder eine mRNA produziert, welche(s) eine Phänotyp- oder Morphologieveränderung von Interesse vorsieht, für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich.
Zusätzlich zu den regulatorischen Elementen oder Sequenzen, welche stromaufwärts (5') oder innerhalb einer DNA-Sequenz angeordnet sind, sind stromabwärts (3') Sequenzen vorhanden, welche die Genexpression beeinflussen, und daher verweist der Begriff "regulatorische Sequenz", wie hierin verwendet, auf eine beliebige Nucleotidsequenz, die stromaufwärts, innerhalb oder stromabwärts einer DNA-Sequenz, welche die Expression eines Genprodukts in Verbindung mit dem Proteinsyntheseapparat der Zelle kontrolliert, vermittelt und beeinflusst, angeordnet ist.
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können modifiziert werden, beispielsweise für die Expression in anderen Pflanzensystemen. Bei einem anderen Ansatz können neue Hybridpromotoren konstruiert oder manipuliert werden, wobei eine Reihe von Verfahren angewendet werden können. Viele Promotoren enthalten stromaufwärts angeordnete Sequenzen, welche die Stärke und/oder Spezifität des Promotors aktivieren, verstärken oder bestimmen (Atchison, Arm. Rev. Cell Biol. 4 (1988), 127). T-DNA-Gene enthalten zum Beispiel "TATA"-Boxen, welche die Transkriptionsinitiation genau festlegen, sowie andere stromaufwärts angeordnete Elemente, die stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle vorliegen und die Transkriptionsraten modulieren (Gelvin, in Transgenic Plants, Kung und Us, Hrsg., San Diego, Academic Press, S. 49–87, 1988). Für einen chimären Promotor, umfassend ein Trimer, welches aus dem Octopinsynthase(ocs)-Aktivator, dem Mannopinsynthase(mas)-Aktivator und einem Promotor besteht, ist berichtet wurden, dass er die Expression eines Reportergens verstärkt (Min Ni et al., The Plant Journal 7 (1995), 661). Die stromaufwärts angeordneten regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Konstruktion von solchen chimären oder hybriden Promotoren verwendet werden. Verfahren zur Konstruktion von verschiedenen Promotoren der vorliegenden Erfindung schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, die Kombination von Kontrollelementen verschiedener Promotoren oder die Wiederholung von Teilen oder Regionen eines Promotors ein (vgl. zum Beispiel US-Patent 5,110,732 und US-Patent 5,097,025 ). Fachleute sind mit dem Lehrmittelstandardmaterial vertraut, das spezifische Bedingungen und Verfahren für die Konstruktion, Manipulation und Isolierung von Makromolekülen (z. B. DNA-Molekülen, Plasmiden, etc.), die Erzeugung von rekombinanten Organismen sowie das Screening und die Isolierung von Genen beschreibt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: Band 1: Analyzing DNA (1997), Band 2: Detecting Genes (1998), Band 3: Cloning Systems (1999), Band 4: Mapping Genomes (1999), Cold Spring Harbor, New York).
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von nachweisbaren oder quantifizierbaren Markern, wie beschrieben, in einen Expressionsvektor eingeschleust und durch transiente Analysen, welche Hinweise auf eine Genexpression in stabilen Pflanzensystemen ergeben, getestet werden. Verfahren zur Überprüfung der Genexpression durch transiente Tests sind den Fachleuten bekannt. Die transiente Expression von Markergenen ist unter Verwendung einer Vielzahl von Pflanzen, Geweben und DNA-Übertragungssystemen beschrieben worden. Zum Beispiel können die Typen einer transienten Analyse die direkte Genübertragung mittels Elektroporation oder den Partikelbeschuss von Geweben bei einem transienten Pflanzentest unter Verwendung einer beliebigen Pflanzenspezies von Interesse einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. Solche transienten Systeme würden Protoplasten aus Suspensionskulturen bei Weizen (Zhou et al., Plant Cell Reports 12 (1993), 612); eine Elektroporation bei Blattprotoplasten von Weizen (Sethi et al., J. Crop. Sci. 52 (1983), 152); eine Elektroporation bei aus Maisgewebe präparierten Protoplasten (Sheen, The Plant Cell 3 (1991), 225); oder den Partikelbeschuss der spezifischen Gewebe von Interesse einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines beliebigen transienten Expressionssystems zur Beurteilung der regulatorischen Sequenzen, welche mit ausgewählten Reportergenen, Markergenen oder agronomischen Genen von Interesse funktionell verbunden sind. Beispiele für Pflanzengewebe, welche für einen transienten Test mittels eines geeigneten Übertragungssystems in Betracht gezogen werden, würden Gewebe der Blattbasis, einen Kallus, Keimblätter, Wurzeln, das Endosperm, Embryonen, Blütengewebe, Pollen und Epidermisgewebe einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt.
Jeder quantifizierbare oder nachweisbare Marker kann in einem transienten Test verwendet werden. Bevorzugte Markergene für transiente Analysen der Promotoren oder 5'-regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung schließen ein GUS-Gen oder ein GFP-Gen ein. Die Expressionsvektoren, welche die 5'-regulatorischen Sequenzen in funktioneller Verbindung mit einem Markergen enthalten, werden in die Gewebe eingeschleust, und die Gewebe werden mittels eines geeigneten Mechanismus, welcher von dem Marker abhängt, analysiert. Die quantitativen oder qualitativen Analysen werden als ein Hilfsmittel verwendet, um das potenzielle Expressionsprofil der 5'-regulatorischen Sequenzen einzuschätzen, wenn sie mit Genen von agronomischem Interesse in stabilen Pflanzen funktionell verbunden sind. Schließlich werden die 5'-regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung direkt in geeignete Expressionsvektoren für die Pflanzentransformation, umfassend die 5'-regulatorischen Sequenzen, welche mit einer transkribierbaren DNA-Sequenz von Interesse funktionell verbunden sind, eingeführt und in Pflanzen eingeschleust, und die stabil transformierten Pflanzen und die Nachkommen davon werden auf das gewünschte Expressionsprofil, das durch die 5'-regulatorischen Sequenzen übertragen wird, untersucht.
Fachleuten sind die Vektoren bekannt, welche für eine Pflanzentransformation geeignet sind. Geeignete Vektoren würden attenuierte Ti-Plasmide für Agrobacterium-vermittelte Verfahren einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. Diese Vektoren können einen Resistenzmarker, 1–2 T-DNA-Grenzen und Replikationsursprünge für E. coli und Agrobacterium zusammen mit einem oder mehreren Genen von Interesse und damit verbundenen regulatorischen Regionen enthalten. Den Fachleuten ist bekannt, dass für Agrobacterium-vermittelte Ansätze eine Reihe von Stämmen und Verfahren verfügbar sind. Solche Stämme würden die Agrobacterium-Stämme C58, LBA4404, EHA101 und EHA105 einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. Besonders bevorzugte Stämme sind Agrobacterium tumefaciens-Stämme. Andere DNA-Übertragungssysteme für die Pflanzen transformation sind den Fachleuten ebenfalls bekannt und schließen, aber sind nicht begrenzt auf, den Partikelbeschuss von ausgewählten Pflanzengeweben ein.
Beispielhafte Nucleinsäuren, welche durch die Verfahren, die durch die vorliegende Erfindung umfasst sind, eingeschleust werden können, schließen zum Beispiel DNA-Sequenzen oder Gene einer anderen Spezies ein, oder auch Gene oder Sequenzen, welche derselben Spezies entstammen oder darin vorkommen, aber durch gentechnische Verfahren, anstatt durch klassische Reproduktions- oder Züchtungstechniken, in die Empfängerzellen eingeschleust werden. Der Begriff "exogen" soll jedoch auch auf Gene verweisen, welche normalerweise nicht in der Zelle vorkommen, die transformiert wird, oder möglicherweise einfach nicht in der Form, Struktur, etc. vorliegen, so wie sie in dem transformierenden DNA-Segment oder Gen vorkommen, oder auf Gene, die normalerweise bereits vorhanden sind und nun z. B. überexprimiert werden sollen. Daher soll der Begriff "exogene(s)" oder alternativ "heterologe(s)" Gen oder DNA auf ein Gen oder ein DNA-Segment verweisen, das bzw. die in eine Empfängerzelle eingeschleust wird, unabhängig davon, ob ein ähnliches Gen bereits in einer solchen Zelle vorhanden sein kann. Der DNA-Typ, welcher in der exogenen DNA enthalten ist, kann eine DNA einschließen, welche bereits in der Pflanzenzelle vorhanden ist, sowie eine DNA aus einer anderen Pflanze, eine DNA aus einem anderen Organismus oder eine extern erzeugte DNA, wie eine DNA-Sequenz, die eine Antisense-Information eines Gens enthält, oder eine DNA-Sequenz, welche die eine synthetisch hergestellte oder modifizierte Version eines Gens codiert.
Die Pflanzentransformationsvektoren, enthaltend die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung, können durch ein beliebiges Pflanzentransformationsverfahren in Pflanzen eingeschleust werden. Mehrere Verfahren sind für die Einschleusung von DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen verfügbar und sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Geeignete Verfahren schließen, aber sind nicht begrenzt auf, eine Bakterieninfektion, binäre künstliche Bakterienchromosom-Vektoren, die direkte Übertragung von DNA (z. B. durch PEG-vermittelte Transformation, Austrocknung/Inhibition-vermittelte DNA-Aufnahme, Elektroporation, Schütteln mit Siliconcarbidfasern) und die Beschleunigung von DNA-beschichteten Partikeln ein (zusammengefasst bei Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42 (1991), 205).
Verfahren für eine spezifische Transformation von Dikotyledonen verwenden vorwiegend Agrobacterium tumefaciens. Beispielsweise schließen beschriebene transgene Pflanzen Baumwolle ( US-Patent Nr. 5,004,863 ; US-Patent Nr. 5,159,135 ; US-Patent Nr. 5,518,908 ; WO 97/43430 ), Sojabohne ( US-Patent Nr. 5,569,834 ; US-Patent Nr. 5,416,011 ; McCabe et al., Bio/Technology 6 (1988), 923; Christou et al., Plant Physiol. 87 (1988), 671); Brassica-Gewächse ( US-Patent Nr. 5,463,174 ) und Erdnuss (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15 (1996), 653) ein, aber sind nicht darauf begrenzt.
Ähnliche Verfahren sind für die Transformation von Monokotyledonen beschrieben worden. Die Transformation und die Pflanzenregeneration mittels dieser Verfahren sind für eine Reihe von Nutzpflanzen beschrieben worden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Spargel (Asparagus officinalis; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345); Gerste (Hordeum vulgarae; Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37); Mais (Zea mays; Rhodes et al., Science 240 (1988), 204; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990), 603; Fromm et al., Bio/Technology 8 (1990), 833; Koziel et al., Bio/Technology 11 (1993), 194); Hafer (Avena sativa; Somers et al., Bio/Technology 10 (1992), 1589); Wiesen-Knäuelgras (Dactylis glomerata; Horn et al., Plant Cell Rep. 7 (1988), 469); Reis (Oryza sativa, einschließlich Indische und Japanische Varietäten; Toriyama et al., Bio/Technology 6 (1988), 10; Zhang et al., Plant Cell Rep. 7 (1988), 379; Luo und Wu, Plant Mol. Biol. Rep. 6 (1988), 165; Zhang und Wu, Theor. Appl. Genet. 76 (1988), 835; Christou et al., Bio/Technology 9 (1991), 957); Sorghum (Sorghum bicolor; Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 11212); Zuckerrohr (Saccharum spp.; Bower und Birch, Plant J. 2 (1992), 409); Rohrschwingel (Festuca arundinacea; Wang et al., Bio/Technology 10 (1992), 691); Turfgras (Agrostis palustris; Zhong et al., Plant Cell Rep. 13 (1993), 1); Weizen (Triticum aestivum; Vasil et al., Bio/Technology 10 (1992), 667; Weeks et al., Plant Physiol. 102 (1993), 1077; Becker et al., Plant J. 5 (1994), 299); und Alfalfa (Masoud et al., Transgen. Res. 5 (1996), 313). Den Fachleuten ist bewußt, dass eine Reihe von Transformationsmethodiken zur Erzeugung von stabilen transgenen Pflanzen aus einer Reihe von möglichen Nutzpflanzen von Interesse angewendet und modifiziert werden können.
Die transformierten Pflanzen werden auf das Vorhandensein der Gene von Interesse sowie die Expressionsrate und/oder das Expressionsprofil, welche durch die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung übertragen werden, untersucht. Den Fachleuten sind die zahlreichen Verfahren bekannt, welche für die Analyse von transformierten Pflanzen verfügbar sind. Eine Vielzahl von Verfahren werden angewendet, um die Genexpression abzuschätzen und zu bestimmen, ob das eine oder die mehreren eingeschleusten Gene integriert sind, in richtiger Art und Weise wirksam sind und vererbt werden, wie erwartet wurde. Bei der vorliegenden Erfindung können die Promotoren beurteilt werden, indem die Expressionsraten der Gene, mit welchen die Promotoren funktionell verbunden sind, ermittelt werden. Eine vorläufige Beurteilung der Promotorfunktion kann durch ein transientes Testverfahren unter Verwendung von Reportergenen erhalten werden, wobei aber eine genauere Beurteilung des Promotors durch die Analyse von stabilen Pflanzen erhalten werden kann. Verfahren zur Pflanzenanalyse schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Southern-Blots oder Northern-Blots, PCR-basierende Ansätze, biochemische Analysen, Phänotyp-Screening-Verfahren, Feldbeurteilungen und immundiagnostische Tests ein.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die cDNA-Bank-Herstellung, Genombank-Herstellung, Sequenzierung, Sequenzanaly sen, PCR-Technologien, Vektorkonstruktion, transienten Tests und Pflanzentransformationsverfahren, sind den Fachleuten gut bekannt und werden gemäß Standardtechniken oder Modifikationen davon durchgeführt.
Die folgenden Beispiele sind beigefügt, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen.
Beispiele
Beispiel 1 – Pflanzenmaterial, RNA-Isolierung und cDNA-Bank-Konstruktion
Das Gewebe für die Konstruktion der Zielbank von Deckspelze/Vorspelze (LIB3399) wird wie folgt gewonnen. Samen von Triticum aestivum (Var. Bobwhite) werden zum Keimen gebracht und in einer Wachstumskammer angezogen (Feuchtigkeit – 65%; Temperatur/Lichtzyklus – 16 h Licht [18°C]/8 h Dunkelheit [16°C]; Lichtintensität – 43 kLux). Die Gewinnung des Gewebes erfolgt nach einem etwa 8-wöchigen Wachstum, sobald die Pflanzen das Stadium 65 auf der BBCH-Wachstumsskala erreichen (gemeinschaftlich entwickelt durch die Deutschen Agrarinstitute), wenn 50% der Staubbeutel ausgebildet sind. Das Deckspelzen- und Vorspelzengewebe wird entnommen, unmittelbar in Flüssigstickstoff überführt und dann bei –80°C gelagert.
Die gesamte RNA wird unter Verwendung von Trizol (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA), im Wesentlichen wie durch den Hersteller empfohlen, aus dem Deckspelzen- und Vorspelzengewebe aufgereinigt. Die PolyA+-RNA (mRNA) wird unter Verwendung von magnetischen Oligo-dT-Kügelchen, wie durch den Hersteller (Dynabeads, Dynal Corporation, Lake Success, New York, USA) empfohlen, gereinigt.
Die Konstruktion von Pflanzen-cDNA-Banken ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, und es gibt eine Reihe von Clonierungsstrategien. Eine Reihe von cDNA-Bank-Konstruktionskits sind im Handel erhältlich. Das Superscript^TM Plamsid-System für die cDNA-Synthese und die Plasmidclonierung (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA) wurde unter Einhaltung der Bedingungen, welche durch den Hersteller vorgeschlagen werden, verwendet. Die cDNA wird synthetisiert, unter Verwendung einer Sephacryl-Säule (500 bis einschließlich 2000 bp) nach Größe selektiert und in pSPORT1 (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA) gerichtet cloniert.
Die cDNA-Banken werden auf LB-Agar, enthaltend die geeigneten Antibiotika für eine Selektion, plattiert und für einen ausreichenden Zeitraurn bei 37°C inkubiert, um das Wachstum einzelner Kolonien zu ermöglichen. Einzelne Kolonien werden in einzelne Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, enthaltend LB-Flüssigmedium einschließlich die selektiven Antibiotika, eingebracht. Die Platten werden über Nacht bei etwa 37°C unter vorsichtigem Schütteln inkubiert, um das Wachstums der Kulturen zu begünstigen. Die Plasmid-DNA wird unter Verwendung von Qiaprep-Plasmid-Isolierungs kits bei den Bedingungen, welche durch den Hersteller (Qiagen Inc., Santa Clara, Kalifornien, USA) empfohlen werden, aus jedem Clon isoliert.
Die Matrizen-Plasmid-DNA-Clone werden durch die Initiation ausgehend von dem 5'-Ende eines jeden cDNA-Clons sequenziert, und die erhaltenen Sequenzen werden als exprimierte Sequenzmarker (ESTs) bezeichnet. Dann werden die Matrizen-Plasmid-DNA-Clone sequenziert. Die cDNAs werden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Sequenzierungskits, wie dem ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktion Kit mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase, bei den Bedingungen, welche durch den Hersteller (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) empfohlen werden, sequenziert.
Eine Reihe von Sequenzierungstechniken sind auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich auf Fluoreszenz basierende Sequenzierungsmethodiken. Diese Verfahren besitzen im Hinblick auf den Nachweis, die Automatisierung und die Geräteausstattung die erforderliche Kapazität, welche für die Analyse von großen Mengen an Sequenzdaten notwendig ist. Das DNA-Sequenzanalysegerät 377 (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div., Foster City, CA) ermöglicht gegenwärtig die schnellste Elektrophorese und Datenerfassung. Mit Hilfe dieser automatisierten Systemtypen werden die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sequenzreaktionsprodukte nachgewiesen, und die Daten werden direkt in den Computer eingegeben, der ein Chromatogramm erzeugt, das anschließend betrachtet, gespeichert und unter Verwendung der entsprechenden Software-Programme analysiert wird. Diese Verfahren sind den Fachleuten bekannt und sind beschrieben und rezensiert worden (Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA 1, Cold Spring Harbor, New York).
Beispiel 2 – EST-Clustering
Die durch Sequenzierung einer Reihe von T. asetivum-cDNA-Banken generierten ESTs werden in einer Computer-Datenbank gespeichert. Die 'unbearbeiteten' ESTs werden in einem Prozess, der als 'Clustering' (Gruppierung) bekannt ist, in Gruppen von zusammenhängenden ESTs, d. h. ESTs, die von homologen mRNA-Transkripten stammen, gruppiert.
Der 'Clustering'-Prozess umfasst drei Hauptschritte:

1. Die Banken werden auf eine Vektor-Kontamination sowie auf Sequenzen mit einer unzureichenden Qualität durchmustert.
2. Die Sequenzen werden miteinander verglichen. Solche Sequenzen, die 90% Identität über einen Bereich von 100 Basenpaaren aufweisen, werden als zu der gleichen Gruppe "bin" gehörend angesehen.
3. Alle Sequenzen in jeder Gruppe "bin" werden ausgerichtet, um eine Konsensussequenz zu generieren, welche als EST-Clustersequenz bekannt ist. Die Sequenzen in einer Gruppe "bin", welche sich nicht ausrichten lassen, werden in eine neue Gruppe "bin" verschoben.

Die cDNA-Bank der Deckspelze und der Vorspelze (LIB3399) umfasst 5856 Clone, welche jeweils sequenziert werden, um eine EST zu erzeugen. Diese ESTs werden dann zusammen mit anderen erhältlichen ESTs aus weiteren T. asetivum-cDNA-Banken in Gruppen eingeteilt, um einen Satz von T. asetivum-EST-Clustersequenzen zu erzeugen. Tabelle 1 (im Anhang) zeigt die 40 häufigsten EST-Clustersequenzen in LIB3399. Die Häufigkeit wird als Zielzahl (Anzahl der ESTs von LIB3399, welche den Cluster ausmachen) und prozentuale Häufigkeit (Zielzahl als Prozentsatz der Gesamtzahl an ESTs in LIB3399) ausgedrückt.
Beispiel 3 – Bestimmung der Häufigkeit von EST-Clustern mittels BLAST
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) umfasst eine Reihe von Ähnlichkeitssuchprogrammen, welche entwickelt wurden, um DNA- und Protein-Sequenzdatenbanken abzufragen. Die BLAST-Programme sind im Hinblick auf Schnelligkeit entwickelt worden, wodurch die Empfindlichkeit für entfernte Sequenzbeziehungen in geringem Maße beeinträchtigt wird. Die bei einer BLAST-Suche zugeordneten 'Scores' mit einer hinreichend definierten statistischen Interpretation erleichtern die Unterscheidung der tatsächlichen Übereinstimmungen von zufälligen Hintergrundtreffern. BLAST verwendet einen heuristischen Algorithmus, mit dem im Gegensatz zu globalen Abgleichungen eine lokal Suche durchgeführt, und ist daher in der Lage, Beziehungen unter Sequenzen nachzuweisen, welche nur isolierte Regionen mit einer Ähnlichkeit gemeinsam haben (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3), 403–410).
Die Zahl der ESTs, die aus einer bestimmten Genbank hervorgehen, welche einen bestimmten EST-Cluster umfasst, sieht eine Maßeinheit für die Häufigkeit des entsprechenden mRNA-Transkripts in dem Gewebe, das für die Herstellung der Bank verwendet wurde, vor.
Die 96 häufigsten EST-Cluster von LIB3399 wurden als Abfragesequenzen verwendet, um eine Reihe von cDNA-Banken (vgl. Tabelle 2 im Anhang) unter Verwendung des BLAST-Algorithmus abzusuchen. Die Zahl der 'Treffer' mit einem E-Wert <= 1 × 10^–7 und einem 'Bit-Score' >= 100 (unter Verwendung der Standardparameter, außer der Grenzwerterweiterung von >= 100) wurde für jede cDNA-Bank zusammengetragen, woraus die Zahl der 'Treffer' in jedem Gewebetyp berechnet wurde (vgl. Tabelle 3 im Anhang).
Die ausgewählten EST-Cluster umfassten diejenigen, worin die Gesamtzahl der Treffer im Stängel, Blatt, Embryo, Endosperm und in der Wurzel < 5 betrug. 37 der 96 analysierten EST-Cluster erfüllten dieses Kriterium. Diese wurden weiterhin auf 30 Cluster verringert, indem eine Selektion nach dem Kriterium einer sehr geringen Expression (<= 1 Treffer) im Stängel, Blatt, Embryo, Endosperm und in der Wurzel durchgeführt wurde. Falls jedoch eine Expression in den Staubbeuteln erkennbar war, wurde eine höhere Expressionsrate im Stängel, Blatt, Embryo, Endosperm und in der Wurzel toleriert (<= 5 Treffer). Vgl. das Diagramm (1 im Anhang) für einen Vergleich des Expressions musters von 3 EST-Clustern (3849_1, 17859_1 bzw. 88_3) mit dem gewünschten Expressionsmuster und weiteren 4 EST-Clustern mit einem unerwünschten Expressionsmuster.
Beispiel 4 – Identifizierung homologer Reis-cDNAs und Expressionsanalyse
Die 30 Weizen-EST-Cluster wurden dann als Abfragesequenzen gegen eine O. sativa-Unigene-Datenbank (gruppierte und zusammengestellte EST-Datei von Vollreis-Spezies, 21. September 2000 (seq VersionCollection-Oryza_sativa_Unigene 20000921), letztes Update: 19. Oktober 2000, 11:55 AM) verwendet, um nach homologen Reis-cDNAs zu suchen. Reis-cDNA-Homologe wurden für 25 der 30 Weizen-EST-Cluster identifiziert (vgl. Tabelle 5).
Die 25 homologen Reis-cDNA-Sequenzen wurden dann als Abfragesequenzen gegen eine Auswahl von O. sativa-EST-Datenbanken von Blattgewebe/vegetativem Gewebe verwendet (vgl. Tabelle 4 im Anhang). Die Zahl der Treffer (E-Wert <= 1 × 10^–7, 'Bit-Score' >= 100, und Grenzwerterweiterung >= 100) wurden für den Gewebetyp zusammengestellt, wodurch der Vergleich des Gewebetyp-Expressionsmusters ermöglicht wird.
Vgl. Tabelle 5 (im Anhang) für eine Zusammenfassung der 30 Weizen-EST-Cluster in Verbindung mit dem Reis-cDNA-Homolog und der genomischen Reis-DNA-Sequenz.
Die Reis-cDNA 5842_1.R2011 (bezeichnet als LP4) zeigte eine bevorzugte Expression in der Reisrispe im Vergleich zu Blattgewebe. Eine stringentere Analyse der Abfrage/Zielsequenz-Abgleichung deutete darauf hin, dass die cDNA sogar noch häufiger in den Rispen-Banken vorhanden war, als die ursprünglichen Suchbedingungen nahelegten (vgl. Tabelle 6 im Anhang).
Beispiel 5 – Identifizierung und Clonierung vermutlicher Promotorregionen
Die 25 identifizierten Reis-cDNA-Homolog-Sequenzen wurden als Abfragesequenzen gegen eine O. sativa-DNA-Genombank verwendet, um entsprechende genomische DNA-Sequenzen zu identifizieren (vgl. die Zusammenfassung in Tabelle 5).

Mit der Reis-Unigene-cDNA LP4 wurde eine BLASTX-Suche (alle Leseraster mit sechs Nucleotiden) in der GenPeptPRT-Datenbank (öffentlich zugängliche Proteinsequenz) durchgeführt. Die 'Besten Treffer' sind nachstehend angegeben, wobei die cDNA/gDNA-Abgleichungen in der Tabelle 6 im Anhang folgen.

ID	Weizen-EST-Cluster	Reis-cDNA-Homolog	Reis-BAC-Homolog	Anmerkung 'Bester Tre
				Hinterlegung	Beschreibung
LP4	TRIAS-CLUSTER88_3	5842_1.R2011	OSM12402	CAA59800	Z. mays-mRNA Plasmamembra H⁺-ATPase.

Die Reis-DNA-Sequenzen wurden an ihrer entsprechenden genomischen Reis-Sequenz ausgerichtet, und die genomische Reis-Sequenz wurde in ein Leseraster übersetzt, welches dem cDNA-Leseraster entsprach, das die obigen Treffer ergab. Dies ermöglichte die Ableitung der Position der mutmaßlichen 'TATA'-Box und des ATG-Translationsstartcodons für die genomische Sequenz (vgl. 2). Weitere Beweise für die Position des Translationsstartcodons wurden durch den Vergleich der aminoterminalen Aminosäuresequenz von anderen eng verwandten Proteinsequenzen gesammelt.
Für die genomische Reis-DNA-Sequenz wurden verschachtelte Paare von Oligonucleotid-PCR-Primern konstruiert. Eine 'äußeres' Primerpaar wurde unter Verwendung einer Primer-Design-Computer-Software(PrimerSelect – DNAStar) konstruiert, um eine Region von ungefähr 1700 bp stromaufwärts des mutmaßlichen Translationsstartcodons bis zu 200 bp stromabwärts des mutmaßlichen Translationsstartcodons zu amplifizieren. Dieses Paar von Primern wurde zusammen mit einer genomischen DNA-Matrize von Reis (Nipponbare) verwendet, um primäre PCR-Produkte herzustellen.
Das 'innere' zweite Paar von Primern wurde manuell entworfen. Der Vorwärtsprimer umfasste entweder eine SalI-Stelle oder lagerte sich an eine Region unmittelbar stromaufwärts einer SalI-Stelle innerhalb des vermutlichen Promotors, ungefähr 1500 bp stromaufwärts des mutmaßlichen Translationsstartcodons, an. Der reverse Primer wurde derart konstruiert, dass er sich an die Region des mutmaßlichen ATG-Translationsstartcodons anlagert und dabei das ATG in dem amplifizierten Produkt durch die Substitution eines Basenpaares zerstört. Eine NotI-Restriktionsstelle wurde ebenfalls unmittelbar stromabwärts des zerstörten ATG-Codons eingeführt. Das zweite Paar von Primern wurde verwendet, um den vermutlichen Promotor unter Verwendung des primären PCR-Produkts als Matrize mittels PCR zu amplifizieren.
Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden ungefähr 1500 bp eines jeden vermutlichen Promotors, einschließlich der Nucleotide unmittelbar stromaufwärts des mutmaßlichen ATG-Translationsstartcodons, amplifiziert und unter Verwendung der SalI- und NotI-Restriktionsstellen in einen geeigneten Clonierungsvektor cloniert.
Beispiel 6 – Promotoranalyse in Pflanzen
Für eine stabile Pflanzentransformation wird die 5'-regulatorische Sequenz in den Pflanzentransformationsvektor pMON-CAM1 (in 3 gezeigt) cloniert. Dies ist ein binärer Pflanzentransformationsvektor mit zwei Grenzen (einer rechten und einer linken T-DNA-Grenze) und enthält die folgenden genetischen Komponenten: RACT ist das erste Intron des Reis-Aktin-Gens; GUS ist die codierende Region für das Reportergen β-Glucoronidase; NOS ist das 3'-Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens; Spec/Strep ist die codierende Region für eine Spectinomycin- und Streptomycin-Resistenz; ori-pUC und ori-V sind Replikationsursprünge; NPTII ist die codierende Region für eine Kanamycin-Resistenz; HSP70 ist ein Intron des Mais-Hitzeschockprotein 70-Gens, wie in US-Patent Nr. 5,593,874 und 5,859,347 beschrieben; und CaMV35S ist der Promotor für die 35S- RNA des Blumenkohlmosaikvirus, der eine Wiederholung der Region von –90 bis –300 enthält.
Der Promotor wird zusammen mit anderen regulatorischen Sequenzen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, nichttranslatierte Leadersequenzen und Terminatoren, wie vorstehend beschrieben, funktionell mit dem GUS-Reportergen verbunden und mit Hilfe eines geeigneten Übertragungssystems, wie einer Agrobacterium-vermittelten Transformation (vgl. zum Beispiel US-Patent Nr. 5,569,834 , US-Patent Nr. 5,416,011 , US-Patent Nr. 5,631,152 , US-Patent Nr. 5,159,135 und US-Patent Nr. 5,004,863 ) oder Partikelbeschussverfahren (vgl. zum Beispiel Patentanmeldung WO 92/15675 und WO 97/48814 , Europäische Patentanmeldung 586,355 und US-Patent Nr. 5,120,657 , 5,503,998 , 5,830,728 und 5,015,580 ), in eine Zielnutzpflanze von Interesse eingeschleust.
Eine Vielzahl von Transformations- und Regenerationssystemen sowie -verfahren sind verfügbar und den Fachleuten gut bekannt. Die stabil transformierten Pflanzen und die Nachkommen davon werden dann mit Hilfe einer Reihe von molekularen, immundiagnostischen, biochemischen und/oder Feldbeurteilungsverfahren, welche den Fachleuten bekannt sind, auf die Expression des Gens in den Geweben von Interesse untersucht.
Mit verschiedenen Promotor-Reporter-Konstrukten transformierte Weizenpflanzen wurden auf eine GUS-Aktivität in der Hüllspelze, Deckspelze, Vorspelze bzw. dem Fahnenblatt untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7: Vergleich der GUS-Aktivität in Weizenpflanzen, welche mit verschiedenen Promotor-Reporter-Konstrukten transformiert wurden

Promotor Hüllspelze Deckspelze Vorspelze Fahnenblatt

LP4 +++ +++ +++ -

PER1 - - - -

ScBV – Promotor des Zuckerrohr-Badnavirus, der die konstitutive Expression reguliert (Tzafrir et al., Plant Mol. Biol. 38 (1998), 347). PER1 – Promotor des Hordeum vulgare-Peroxiredoxin-Gens, das in Embryo- und Aleurongewebe exprimiert wird (Stacy et al., Plant Mol. Biol. 31 (1996), 1205). Für LP4 vgl. SEQ ID NO: 3.

Für jedes Konstrukt wurden die Gewebe zahlreicher Pflanzen präpariert, welche jeweils gemäß dem Protokoll von Jefferson (Plant Mol. Biol. Rep. 5 (1987), 387) auf eine GUS-Aktivität histochemisch angefärbt wurden. Die GUS-Aktivität wurde durch Beurteilung der Intensität der blauen Färbung mit dem Auge abgeschätzt, wobei die folgenden Werte zugeordnet wurden:

– für nicht nachweisbar, + für nachweisbar und ++ für gering, +++ für mäßig und ++++ für hoch.

LP4 wurde aufgrund seines besseren Expressionsmusters im Vergleich zu LP1 und LP3 für eine weitere Analyse ausgewählt. Ein LP4-GUS-Fusion-Reporter-Konstrukt, ohne das RACT-Intron (= Reis-Aktin-Intron) wurde durch Subclonieren des LP4-Promotors in die SalI- und SmaI-Stellen von pMON-CAM2 konstruiert (4).
Weizenpflanzen wurden mit dem pMON-CAM2-Konstrukt transformiert, und die Pflanzen wurden zusammen mit Kontrollpflanzen, die mit LTP1:GUS-(ebenfalls in pMON-CAM2 konstruiert) und ScBV:GUS-Promotor-Reporter-Konstrukten transformiert wurden, herangezogen. Für jedes Konstrukt wurden die Gewebe zahlreicher Pflanzen präpariert (ScBV: n = 9; LP4: n = 22; und LTP1: n = 31), welche jeweils gefärbt und auf eine GUS-Aktivität untersucht wurden, wie vorstehend beschrieben.
Eine einzelne Pflanze, welche mit LP4 transformiert wurde, zeigte das nachstehend angegebene Expressionsmuster (Tabelle 8). Bei den restlichen LP4-Pflanzen war in allen Geweben keine nachweisbare GUS-Expression erkennbar, wie es auch der Fall war bei allen Pflanzen, die mit dem LTP1-Promotor transformiert wurden. Der LP4-Promotor bewirkte eine spezifische Expression in dem Hüllspelzengewebe von Weizen.
Eine vergleichbare Expression wäre für das Hüllspelzengewebe der männlichen Blüte bei Mais zu erwarten; wobei die weibliche Blüte eine verkümmerte Hüllspelze aufweisen kann, aber anscheinend der Hüllspelze von Weizen anatomisch weniger ähnlich ist, als die männliche Blütenstruktur. Tabelle 8: Vergleich der GUS-Aktivität in Weizenpflanzen, welche mit verschiedenen Promotor-Reporter-Konstrukten transformiert wurden.

Promotor Hüllspelze Deckspelze Vorspelze Staubbeutel Narbe Fruchtknoten Blattspindel Fahnenblatt

ScBV +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

LP4 + + - - - - - -

LTP1 - - - - - - - -

ScBV – Promotor des Zuckerrohr-Badnavirus, der die konstitutive Expression reguliert (Tzafrir et al., Plant Mol. Biol. 38 (1998), 347). LTP1 – Lipidtransferprotein 1-Promotor von Hordeum vulgare, das in der Aleuronschicht sich entwickelnder und keimender Samen exprimiert wird (Skriver et al., Plant. Mol. Biol. 18 (1992), 585). Für LP4 vgl. SEQ ID NO: 3.

Claims

Chimäre monokotyledone regulatorische Sequenz, umfassend SEQ ID NO: 3 und einen CaMV- oder Reis-Aktin-Minimalpromotor.
Chimäre monokotyledone regulatorische Sequenz nach Anspruch 1, wobei der Minimalpromotor ein CaMV-355-Minimalpromotor ist.
DNA-Konstrukt, umfassend eine isolierte Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3, sowie in funktioneller Verbindung damit eine transkribierbare DNA-Sequenz und eine 3'-nichttranslatierte Region.
Pflanzenzelle, umfassend ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 3.
Pflanzengewebe, umfassend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 4.
Transgene Pflanze, umfassend ein DNA-Konstrukt, umfassend eine isolierte Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3, sowie in funktioneller Verbindung damit eine transkribierbare DNA-Sequenz und eine 3'-nichttranslatierte Region.
Verwendung einer monokotyledonen regulatorischen Sequenz von SEQ ID NO: 3 zur Regulierung der Transkription einer damit funktionell verbundenen Nucleinsäuresequenz in dem Deckspelzen-, Vorspelzen- und/oder Hüllspelzengewebe einer monokotyledonen Pflanze.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die SEQ ID NO: 3 ein Bestandteil eines chimären Promotors ist.
Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze, umfassend das Einbringen eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 3 in eine Pflanzenzelle.