CZ300064B6 - Nukleová kyselina kódující protein, vektor, rostlinná bunka, zpusob prípravy transformovaných rostlinných bunek, primer nukleové kyseliny a souprava pro detekci regulacních sekvencí - Google Patents

Abstract

Nukleová kyselina kódující protein mající chalkonsyntetázovou a/nebo valerofenonsyntetázovou aktivitu a obsahující gen vybraný ze skupiny zahrnující:(a) geny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO : 1; a (b) geny obsahujícíDNA sekvenci SEQ ID NO : 2. Nukleová kyselina obsahující regulacní sekvenci pro specifickou expresiheterologních genu v lupulinových žlázách chmelu sestávající z: (a) nukleových kyselin obsahujícíchDNA sekvenci SEQ ID NO : 7; a (b) nukleových kyselin obsahujících DNA sekvenci SEQ ID NO : 6. Vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu, rostlinné bunky transformované tímto vektorem, zpusob prípravy transformovaných rostlinných bunek, primer nukleové kyseliny a souprava pro detekci regulacních sekvencí pro specifickou expresi lupulinove specifických expresních genu.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nukleových kyselin, které obsahují gen, specificky exprimovány v lupu línových žlázkách chmelu a regulačních sekvencí tohoto genu. Konkrétně se vynález týká in nukleové kyseliny kódující protein mající chaIkonsyntetázovou a/nebo vaIerofenonsyntetázovou aktivitu, dále vektoru obsahujícího tuto nukleovou kyselinu, rostlinné buňky transformované tímto vektorem, způsobu přípravy transformovaných rostlinných buněk, primerů nukleové kyseliny a soupravy pro detekci regulačních sekvencí pro specifickou expresi lupulinově specifických expresních genů.

Dosavadní stav techniky

Rostliny tvoří a akumulují celou řadu nízkomolckulárních organických sloučenin jako jsou napří20 klad terpenoidy. alkaloidy, fenolické sloučeniny, saponiny apod. Jelikož dříve tyto látky nebyly považovány za hlavní látky přímo se podílející na vývoji živé hmoty, ale jen za látky s méně důležitou biologickou funkcí, byly konvenčně zvány „produkty sekundárního metabolismu“.

Avšak nyní bylo zjištěno, že tyto produkty sekundárního metabolismu mají významnou funkci podporující diferenciaci buněk a ochraňují buňky před škodlivými vnějšími vlivy. Kromě toho se produkty sekundárního metabolismu užívají v řadě známých jídel, léčiv a barviv.

Produktům sekundárního metabolismu bylo později věnováno tolik pozornosti, že všechny hlavní metabolické dráhy v rostlinné buňce byly popsány; a ukázalo se, že tyto sloučeniny jsou synteti30 /.ovány prostřednictvím složité biosyntetieké kaskády reakcí a podílí se na nich velký počet enzymů. Většina z těchto sloučenin syntetizovaných kaskádou enzymatických reakcí může být izolována přímo extrakcí z rostlinného materiálu, avšak taková extrakce není vhodná pro výrobu v průmyslovém měřítku a navíc je obecně velmi drahá. Proto probíhá výzkum, jak tyto sloučeniny syntetizovat in vitro prostřednictvím kultivovaných buněk a pod.

Bylo zjištěno, že chmel, hlavní materiál zajištující osvěžující hořkost a chuf piva. secem uje celou řadu produktu sekundárního metabolismu v lupulinových žlázkách na šišticích. a tyto látky přispívají značnou měrou k hořkosti a celkové chuti piva,

Proto byl chmel podroben šlechtitelským pokusům, zaměřeným kromě zlepšení základních agronom iekýeh vlastností především na produkty sekundárního metabolismu akumulované v lupu línových žlázkách, jako jsou hořké látky, esenciální oleje apod.

Chmel je dvoudomá rostlina a zejména samčí rostliny; které nenesou žádné šištice. což je mate45 riál nezbytný pro pivo, nejsou komerčně ceněny, nebyly tudíž důkladně zkoumány a tudíž jejich genetické vlastnosti užitečné pro pivovarnictví bylv sotva poznány. Dnešní šlechtění chmele klasickými metodami spočívá především na šlechtitelově zkušenosti a intuici a tudíž nelze předvídat kvalitu fcrmentačních produktů dokud nedojde kc sklizni šištie.

5o V současné době jsou pro šlechtění různých rostlin k dispozici šlechtitelské metody užívající genové inženýrství, například techniky transformace a selekce s pomocí markérů. Užitím těchto metod lze provádět mnohem objektivnější šlechtění ve srovnání s konvenčním šlechtěním závislým 7 větší části na šlechtitelově zkušenosti a intuici. Technika transformace je technika, která zajišťuje přímé vnesení požadované vlastnosti tím. že se do rostlinné buňky přenese a v ní expri55 mujc cizorodý gen. Takovéto exprese cizorodého genu v rostlinné buňce lze dosáhnout spojením

- I Cl 300064 B6 požadovaného strukturního genu s terminátorem schopných funkce v rostlinné buňce a promotorem regulujícím expresi genu. kterýje schopen funkce v rostlinné buňce a vnesením transformačního vektoru do rostlinné buňky. Příkladem promotoru, který je často užíván, jc promotor CaMV

S. který je schopen exprimovat přenesený gen v řadě druhů rostlin a bez ohledu na druh pletiva, a promotor genu pro nopalinsyntetázu (Sanders, P.R, a kol., Nucleic Acids Res. 15. 1987. 1543-1558). 7 praktického pohledu na genetické transformace, vnesený gen může být škodlivý pro růst rostlin. Tudíž je požadavkem na vhodný promotor, aby exprimová! cizorodý gen v požadovaném pletivu, v požadovaném čase a množství. Výhodou Šlechtění užívajícího techniky genové transformace ve srovnání s tradičním šlechtěním je lo, že nově techniky transformace io umožňuji přenést požadovaný znak do rostliny bez ohledu na druh s relativně vysokou přesností a v krátkém čase. J aké u chmelu, jelikož může být množen kořenovými řízky, není potřeba fixoval přenesený znak. Tudíž šlechtění s využitím transformačních technik jc zvláště účinné li chmelu.

Selekce pomocí markérů je příkladem šlechtitelské metody užívající DNA markéry jako RFLP i? {polymorfismus délky restrikčních fragmentů) a prakticky se využívá zejména při šlechtění pšenice a rýže. Obecně se má za to, že transformačními technikami lze přenášet znaky řízené jediným genem, ale není možné přenášet znaky, řízené mnoha geny. Selekce s pomocí markérů umožňuje kompenzoval tyto nedostatky.

2i) Nutným předpokladem šlechtitelské metody užívající genovou technologii je určit geny související s požadovaným znakem a další geny, které je regulují. Z hlediska toho. že chmel je surovinou pro pivovarnictví, ale také zdrojem účinných látek pro řadu léků je zjevné, že když budou poznány geny týkající sc biosyntézy produktů sekundárního metabolizmu secernovanýeh lupu línovými Žlázkami šištic samicích rostlin chmelu, tyto geny se pak mohou využít ve šlechtění metodami genového inženýrství a také mají medicínský význam,

Podstata vv nálezu '0 Předmětem předkládaného vynálezu je izolace, purifíkace a nakonec poskytnutí genů. společně s jejich regulačními sekvencemi, jako jsou promotory, které jsou specificky exprimované v lupulinových žlázkach a tudíž vhodné k praktickému vy užití.

Předmětem vynálezu je nukleová kyselina kódující protein mající chalkonsyntetázovou a/nebo valero fenonsyntetázovou aktivitu a obsahující gen vybraný ze skupiny zahrnující:

(a) geny kódující protein obsahující aminokysclinovu sekvenci SEQ ID NO : 1; a (b) geny obsahující DNA sekvenci SEQ ID NO : 2.

Mezi výhodná provedení patří tato nukleová kyselina, která je specificky exprimována v lupuli4(i nových žlázách chmelu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor obsahující výše definovanou nukleovou kyselinu.

Předmětem vynálezu je rovněž nukleová kyselina obsahující regulační sekvenci pro specifickou expresi heterologních genů v lupuíinových žlázách chmelu sestávající z;

(a) nukleových kyselin obsahujících DNA sekvenci SEQ ID NO : 7; a (b) nukleových kyselin obsahujících DNA sekvenci SEQ ID NO : 6.

5o Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rostlinná buňka transformovaná některým z výše definovaných vektorů.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy transformovaných rostlinných buněk, jehož podstata spočívá v tom. že obsahuje transformaci rostlinné buňky některým z výše definovaných vektorů.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží primer nukleové kyseliny obsahující DNA sekvenci ID NO : 3, 4 nebo 5.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží souprava pro detekci regulačních sekvencí pro specifickou expresi lupulinově specifických expresních genu. jejíž podstata spočívá v tom. že io obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu mající sekvenci SEQ ID NO ; 3. 4 nebo 5.

Vynález poskytuje izolovanou a purifikovanou nukleovou kyselinu obsahující gen specificky exprimovaný v lupu línových žlázkách chmelu. Chmel jc dvoudomá rostlina a pouze samicí rostliny tvoří šišticc. jejichž lupulinové žlázky obsahují produkty sekundárního metabolismu, které poskytují hořkost a chuf pivu. Tyto produkty sekundárního metabolismu obsahují také farmakologie ky účinné látky. Aby bylo možné šlechtit nové užitečnější kultivary chmele se změněnými znaky jako jsou produkty sekundárního metabolismu, a sice metodami genového inženýrství, předkládaný vynález poskytuje izolovanou a purifikovanou nukleovou kyselinu obsahující gen specificky exprimovaný v lupulinových žlázkách. Pomocí této nukleové k>selin\ je možné vv v i20 nout nové metody pro šlechtění chmelu technikami transformace a molekulární selekce.

Jak bylo již popsáno výše, nukleové kyseliny izolované a purifikovaná podle předkládaného vynálezu obsahují geny specificky exprimované v lupulinových žlázkách chmelu, promotory specificky funkční v lupulinových žlázkách a jejich části.

Užitím těchto nukleových kyselin lze změnit dosavadní šlechtitelské metody šlechtění chmelu, zcela závislé na zkušenosti šlechtitele a jeho intuici, na mnohem objektivnější metodu užívající genové inženýrství. Jak již bylo zmíněno výše, jelikož důležité produkty sekundárního metabolismu, jako jsou látky do piva a účinné látky léků, jsou secernovány výlučně lupulinovýrni žláz3o kam i chmelových šištic, geny specificky exprimované v lupulinových žlázkách souvisí pravděpodobně s biosyntézou těchto produktů sekundárního metabolismu. Takže užitím genů schopných podílet se na biosyntéze produktů sekundárního metabolismu jakožto markérů lze vyvinout zlepšenou selekci za pomoci markérů pro šlechtění chmelu, která bude významným příspěvkem pro potravinářský a farmaceutický průmysl. Kromě toho přenosem výše zmíněných genu do chmelu metodami transformace lze vyšlechtit průmyslově využitelné kultivary. To znamená, že šlechtěním chmelu metodami genového inženýrství s využitím nukleových kyselin podle vynálezu lze regulovat složení produktů sekundárního metabolismu akumuluj ícícb sc v lupulinových žlázkách. Kromě toho nukleové kyseliny podle vynálezu umožňují udržování a zlepšování kvality chmelu pro pivovarnictví a také využití chmelu pro výrobu léčiv.

Podrobněji budou význam a výhody předkládaného vynálezu patrný z následujícího podrobného popisu a připojených obrázku.

Popis obrázků na výkresech

Na přiloženém obr. I je znázorněn diagram představující postup reverzní PCR při izolaci regulační sekvence genu specifického pro lupulin:

a na obr. 2 jsou uvedeny výsledky analýzy RNA northernovou hybridizaeí („Northern blot“), kdy RNA byla izolována z frakce bohaté na lupulin a z frakce chudé na lupulin a jako sonda byl užit gen specifický pro lupulin. Výsledky ukazují spéci ficitu exprese lupulinově specifických genů v lupulinových žlázkách.

- 3 CZ 300064 B6

Podrobný popis vynálezu

Termíny „specificky exprimovaný nebo „specificky funkční v popisu předkládaného vynálezu znamenají nejen to, že geny jsou exprimovaný nebojsou funkční výlučně v lupulinových žláz? kách. ale i to. že jsou v těchto žlázkáeh mnohem aktivnější než v jiných orgánech. Takže to. zda jsou geny exprimovaný nebojsou funkční specificky v lupulinových žlázkáeh nebo nejsou se stanoví na základě jejich exprese a intenzity jejich funkce v lupulinových žlázkáeh ve srovnání s ostatními orgány.

io Kromě toho uvedené termíny „specificky exprimovaný nebo „specificky funkční neznamenají, že geny jsou specifické, jak bylo definováno výše. po celé období růstu rostliny, ale že exprese a funkce těchto genů ve srovnání s jinými orgány je zvýšena ve specifickém vývojovém období nebo působením vnějších vlivů.

i? Nukleové kyseliny podle vynálezu jsou jak DNA tak i RNA. Termín „gen kódovaný nukleovými kyselinami zahrnuje všechny typy genů. tedy genomovou DNA, cDNA nebo mRNA.

Kromě toho se vynález týká i fragmentů výše uvedených nukleových kyselin. V některých aplikacích dokonce i jen částečné sekvence genů podle vynálezu jsou schopné funkce, aniž by

2o byly potřeba geny plné délky, to znamená, že lze použít jen fragmenty mající funkční vlastnosti sekvence plné délky. Tak například při použití tčehto nukleových kyselin ve šlechtitelských metodách selekce s pomocí markérů založených na Rfl.P se molekuly identifikují hybridizaci a PCR (polymerázovou řetězovou reakcí), přičemž velikost sond pro hybridizaci a oligonukleotidový ch primerů pro PCR je dostatečná, jestliže obsahují jen úsek výše uvedených specifických

2? nukleových kyselin získaných z lupulinových žlázek, např. souvislý úsek několika desítek až několika stovek bází.

Kromě toho výše uvedené geny specificky exprimované v lupulinových žlázkáeh jsou charakteristické tím. že tyto geny kódují proteiny související s biosyntézou produktů sekundárního melaso bolismu vytvářených v lupulinových žlázkáeh.

Proteiny zde užité obsahují aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence ID. NO. 1.

Ke genům kódujícím takový protein patří geny obsahující sekvenci popsanou zde jako sekvence

ID. NO. 2 a také geny. jejichž sekvence se částečně liší od sekvence ID. NO. 2. ale zachovává takovou primární sekvenci bází, která kóduje výše uvedenou aminokyselinovou sekvenci. V případě, že tato sekvence se užívá jako sonda nebo primery PCR, lze ji do určité míry modifikovat, dokud si výsledná sekvence uchovává své funkční schopnosti. Všechny nukleotidové sekvence kódující uvedenou aminokyselinovou sekvenci patří do rozsahu předmětného vynálezu. Spécifíc40 ké nukleotidové sekvence odlišné od sekvencí vvše uveden vch lze snadno stanovit na základě v

známého genetického kódu pro kodony kódující aminokyselinové zbytky tvořící výše popsaný protein. Genetický kód je například popsán v publikaci L. Stryer, Biochemistry. třetí vydání, 1988, ÍK H. Freeman and Ca., která je zde uvedena jako odkazový materiál.

B K izolovaným a puri fl kovaným nukleovým kyselinám podle vynálezu patří gen kódující chalkonsyntetázu. Chalkonsyntetáza je enzym související s metabolismem feny lalan inu a tyrosinu. a konkrétně bylo zjištěno, že katalyzuje reakci, kdy se 1 mol kumaroylkoenzymu A a 3 moly malonylkoenzymu A přeměňují na 4,2,4.6-telrahydroxychaIkon (naringeninchalkon) v biosyntetické dráze flavonoidů. Tudíž lze výše uvedenou nukleovou kyselinu užít k regulaci metabolismu flavonoidů v rostlinách a také jako genový markér pro charakteristiky související s flavonoidy. Kromě toho bylo nedávno ukázáno, že enzym podobný ehalkonsyntetáze má také aktivitu valerofenonsyntetázy, která katalyzuje bíosyntézu florizovalerofenonu a florizobutyrofenonu, prckurzorů hořkých látek, a—kyseliny a 13—kyseliny {European Brewery Convention, Proceeding af the 26th Congress, s. 215. 1997). Tyto údaje ukazují, že protein kódovaný genem izolovaným podle vynálezu je funkční jako valerofenonsyntetáza podílející se na biosyntéze hořčin. Výše uvedená

-4CZ 300064 B6 nukleová kyselina tedy muže byt využita pro regulaci metabolismu biosyntézy hořkých látek v chmelu a také jako genový markér pro charakteristiky spojené s hořký mi látkami.

Nukleové kyseliny izolované a purifl kované podle předkládaného vynálezu zahrnují také regulaé5 ní sekvence pro specifickou expresi genu v lupulinových žlázkách a sekvence obsahující promotor, který je aktivován v lupulinových žlázkách. K takovým sekvencím patří např. sekvence uvedená zde jako sekvence ID. NO. 7. Tato regulační sekvence specifická pro lupulinové žlázkv může být využita k tomu, že umožní v lupulinových žlázkách expresi genů ležících po směru transkripce od léto sekvence.

ID

Jak již bylo uvedeno, do rozsahu předmětného vynálezu náleží i vektor obsahující gen specificky exprimovaný v lupulinových žlázkách nebo regulační sekvenci specificky regulující expresi genu v lupulinových žlázkách.

Šlechtění rostlin jako je chmel lze provádět transformováním rostlin pomocí vektoru, který nese gen specificky exprimovaný v lupulinových žlázkách. l akový vektor je zejména vhodný pro šlechtění, když zvyšuje/potlačuje produkci sekundárních metabolítů. Kromě toho takový vektor lze užít nejen pro šlechtění, ale také pro vlastní produkci produktu sekundárního metabolismu tím, že se gen týkající se biosyntézy sekundárního metabolítů exprimuje v kultivovaných buň20 kách. Pokud je tvorba produktu sekundárního metabolismu v kultivovaných buňkách možná, izolace produktů sekundárního metabolismu se pak již provede snadno.

Výše popsané vektory' nesoucí regulační sekvence se mohou užít nejen pro expresi specifických genů. ale také pro specifickou expresi požadovaných genů v lupulinových žlázkách chmelu tím.

že se gen získaný z chmelu nebo z jiného rostlinného druhu spojí v poloze po směru transkripce („downstreaiin) s regulační sekvencí. Takovým způsobem může být jakýkoliv požadovaný gen exprimován v lupulinových žlázkách chmelu.

1. Izolace nuklcových kyselin obsahujících geny specifické pro lupulinové žlá/ky chmelu a jejich

3n regulační sekvence (1) Příprava celkové RNA a mRNA

C elkovou RNA lze připravit jednou ze standardních, odborníkovi známých metod. např. metodou popsanou v publikaci „Protocois of Plant PCR Experiment. Shujuii Sha. s. 56. 1995, která je zahrnula formou odkazu. Stejně tak preparaci mRNA z celkové RNA lze provést jednou ze standardních, odborníkovi známých metod, např. metodou popsanou v protokolu komerčně dostupné soupravy „ol igotex- d l 30 Super od firmy Takara-Shuzo.

io (2) Příprava cDNA knihovny cDNA knihovnu lze připravit jednou ze standardních, odborníkovi známých metod. např. metodou popsanou v protokolu komerčně dostupné soupravy ,.eDNA syntehesis module firmy Amersham. Stejně tak i klonování fragmentů cDNA do cDNA a vlastní vytvoření knihovny lze provést jednou ze standardních, odborníkovi známých metod, např. metodami popsanými v protokolu komerčně dostupných souprav „cDNA rapid adaptor liga li on module a „cDNA rapid cloning module, obě od firmy Amersham, a „GIGAPACK. II Plus Paekaging Extrakt od firmy Stratagene. Všechny výše uvedené publikované protokoly jsou zde zahrnuty formou odkazu, (3) Příprava sond specifických pro lupulin

Sondou specifickou pro lupulin se podle vynálezu míní fragment genu komplementární ke genu. který je specificky exprimován v lupulinových žlázkách. Ve výhodném provedení vynálezu lze sondy specifické pro lupulin získat následujícím způsobem,

5?

C.7. 300064 Bó

Šištice chmelu přibližně 15 dnu po kvetení byly rozděleny na frakci obsahující hlavně lupulinové

Žlázky a báze listencu a nažek bohaté na lupulinové žlázky (frakce bohatá na lupulin) a frakci obsahující hlavně listeny z lodyhy s minimem lupulinových žlázek (frakce chudá na lupulin).

Skupina genů, která zbývá po odečtení genii exprimovaných ve frakci chudé na lupulin od genů exprimovaných ve frakci bohaté na lupulin představuje geny s velkou pravděpodobností specificky exprimované v lupulinových žlázkách.

Toto tzv. odečtení genů (subtrakce genu) exprimovaných ve frakci chudé na lupulin od genů exprimovaných ve frakci bohaté na lupulin lze provést metodou, která je odborníkům známá, io např. způsobem popsaným v protokolu komerčně dostupné soupravy „Subtractor Kit“ firmy lnvitiOgen.

(4) Izolace cDNA specifické pro lupulin cDNA specifickou pro lupulin se podle vynálezu myslí cDNA odvozená z genů, které jsou specificky exprimovaný v lupulinových žlázkách. Izolaci cDNA specifické pro lupulin lze provést sereeningem cDNA knihovny připravené z frakce bohaté na lupulin pomocí sondy specifické pro lupulin. Screening lze provést jednou ze standardních, odborníkovi známých metod, např. metodou popsanou v publikaci „User's Guidc for performing the hybridization using DIG systém“,

2o Boehringer Mannheim, s. 37, 1995. která je zahrnuta formou odkazu.

Značení sond specifických pro lupulin lze provést jednou ze standardních, odborníkovi známých metod. např. metodou popsanou v protokolu komerčně dostupné soupravy „DIG-High Prime firmy Boehringer Mannheim.

(5) Příprava genomové DNA chmelu

Gcnoniovou DNA chmelu lze připravit jednou ze standardních, odborníkovi známých metod, např. metodou popsanou v publikaci „Protocois of Plant PCR Experiment, Slin jun Slia. s. 54,

A) 1995, která je zde zahrnuta formou odkazu.

(6) Izolace nukleové kyseliny obsahující regulační úseky pro genovou expresi specifickou pro lupulin

Termín „nukleové kyseliny obsahující regulační úseky pro lupulinové specifickou genovou expresi“ podle vynálezu označuje regulační úseky obsahující promotor specificky aktivní v lupulínovýcli žlázkách. Izolaci těchto nukleových kyselin lze provést jednou ze standardních, odborníkovi známých metod, např. metodou popsanou v publikaci „Protocois of Plant PCR Experiment. Sbujun-Sha, s. 69. 1995, která je zahrnuta formou odkazu.

(7) Sekvencování DNA

Sekvencování DNA lze provést standardní, odborníkovi známou metodou, např. metodou popsanou v protokolu komerčně dostupné soupravy pro sekvencování nukleových kyselin „AB1

PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaetion Kit firmy Perkin Elmer, který je zahrnut formou odkazu. Požadovaná DNA může býl takto analyzována na homologii s existujícími geny jiných rostlinných druhů.

(8) Northernová hybridizační analýza (dále zkráceně jen northernová analýza)

Zda jsou takto izolované lupulinové specifické geny skutečně specificky exprimovaný v lupulinových žlázkách a zda takto izolované nukleové kyseliny obsahují skutečně regulační úseky specificky aktivní v lupulinových žlázkách lze ověřit northemovou analýzou užívající jako sondy lupulinové specifické geny.

-óCZ 300064 B6

Northemovou analýzu lze provést jednou ze standardních, odborníkovi známých metod. např.

metodou popsanou v publikaci ..Protocois for non-isotopc experiments - DIG hybridi/ation.

Shu jun Sha. s. 45. 1994, a protokolu „User's Guide for performing the hybridízation using DIG systém, Boehringcr Mannheim, s. 40. 1995. přičemž obě publikace jsou zde zahrnuty formou odkazu.

2. Příprava vektorů nesoucích lupu línově specifický gen nebo regulační sekvenci pro lupulinově specifickou expresi la Lupulinově specifický gen. jehož specifická exprese v lupulinovýeh žlázkáeh byla potvrzena metodami popsanými výše může být exprimován vložením genu. a sice užitím odborníkovi známých metod, do místa „downstream“ od regulační sekvence ve vhodném vektoru nesoucím tyto regulační sekvence pro expresi a pak přenést tento transformující vektor do vhodných rostlinných buněk. Typ vektoru nesoucího regulační sekvence pro expresi není nijak omezen, lze užít např. is vektor nesoucí regulační sekvenci pro lupulinově specifickou expresi popsaný dále nebo komerčně dostupný expresní vektor (např. pBI 121. Clonteeh).

Konstrukce vektoru nesoucího regulační sekvenci pro lupulinově specifickou expresi lze realizovat pomocí výběru vhodného vektoru z plazmidů známých ze stavu techniky, do kterého se vloží výše zmíněná regulační sekvence pro lupulinově specifickou expresi, např. sekvence id. é. 7. V takovém případě může být volitelně vložen do vektoru do místa „downstream“ od regulační sekvence klonovací úsek obsahující různá restrikční místa.

3. Využití vynálezu

Jelikož jsou produkty sekundárního metabolismu ve velkém množství vylučovány v lupulinovýeh žlázkáeh, je velmi pravděpodobné, že lupulinově specifické geny podle předkládaného vynálezu jsou geny související s biosyntézou produktu sekundárního metabolismu. Tudíž využití těchto genů pro transformaci rostlin a pro selekci pomocí markérů při šlechtěni chmelu představuje so základ pro zlepšení produktu sekundárního metabolismu produkovaných v lupulinovýeh žlázkáeh. Metody transformace rostlin jsou odborníkům známy.

Pod ro b n čj š í popis vy nálezu po s ky t uj ί n á s 1 e tl uj í e í příklady pro veden í vynálezu, k l e ré j so u pouze ilustrativní a předmět vynálezu nijak neomezují.

Příklady pro vedení vynálezu

Příklad I

Příprava frakce bohaté na lupulin a frakce chudé na lupu 1 in

Šišliee chmelu byly sklizeny 14 dnů po kvetení a zmraženy v kapalném dusíku. Na suchém ledu 45 pak byly š i štice rozebrány a rozděleny pomocí pinzety na frakci obsahující hlavně lupu liliové

Žlázky (listencc a nažky bohaté na lupulinově žlázky), a na frakci obsahující nažky pouze s nepatrným množstvím lupulinovýeh žlázek. Tyto frakce, dále označované jako frakce bohatá na lupulin a frakce chudá na lupulin. byly uloženy v - 80 °C.

so Příklad 2

Příprava celkové RNA a mRNA z frakce bohaté a chudé na lupulin

Celková RNA a mRNA z frakce bohaté a chudé na lupulin byly připraveny následujícím zpuso55 bem:

-7C.7. 300064 B6

Každá frakce byla zmrazená v kapalném dusíku a rozdrcena na prášek a resuspendována ve 2% roztoku CTAB (obsahuje 2% cetyltrimetylamoniumbromid, OJM Iris. pH 9.5. 20mM EDTA.

I.4M NaC'1 a 1% (5-merkaptoetanol) a pak se inkubovala 30 minut v 65 °C. Po opakované extrak5 cí suspenze směsi chloroform/izoamylakohol (24: l) byly přidány 3/4 objemu izopropanolu a

DNA s RNA byla precipitována. DNA a RNA precipitát byl rozpuštěn ve vodě a přidala se 1/3 objemu 10M chloridu lithného a výsledná směs byla ponechána přes noc v teplotě -20 °C. pak centrifugována při 15000 rpm 10 minut. Takto získaný precipitát byl opláchnut v 70% etanolu a rozpuštěn v pufru pro DNázovou reakci (obsahující lOOmM octan sodný, pH 5.2 a 5mM chlorid io horečnatý). Pak byla ke směsí přidána DNáza a směs se inkubovala ve 37 °C, aby se rozložila

DNA. Pak se k inkubační směsi přidala 1/3 objemu 10M chloridu lithného a výsledná směs byla ponechána přes noc v teplotě -20 °C, pak centrifugována při 15 000 rpm 10 minut. Precipitát byl rozpuštěn ve vodě a výsledný roztok by l purifíkován extrakci fenol -chloroformem a pak precipitován etanolem. Takto získaný precipitát byl rozpuštěn ve vodě a použit jako preparát celkové

RNA, ze kterého byla dále izolována mRNA užitím komerční soupravy „Oligo dl 30 Super (Takara-Shuzo) postupem popsaným v soupravě.

Příklad 3

2Ό

Příprava lupulinově specifických sond

Eupulinove specifické sondy byly připraveny subtrakcí mRNA přítomné také ve frakci chudé na lupul in od mRNA ve frakcí bohaté na lupulin. Konkrétně by ly sondy připraveny použitím komerční soupravy „Subtracior Kit (Invitrogen) a protokolu z této soupravy.

Nejdříve byl z mRNA frakce bohaté na lupulin syntetizován první řetězec eDNA a mRNA frakce chudé na lupulin byla označena biotinem. Pak eDNA frakce bohaté na lupulin byla smíchána s mRNA frakce chudé na lupulin označenou biotinem, aby se vytvořily hybridní molekuly, ke kleto rým byl pak přidán streptavidin. aby se navázal na biotinem značenou mRNA \ hybridu. Odstranění biotinem značené mRNA extrakcí fenol-ehloroformem vedlo k odstranění eDNA pocházející také z frakce chudé na lupulin. Výsledkem bylo získání eDNA pocházející pouze z frakce bohaté na lupulin, která byla užita jako sonda. Lupulinově specifické sondy takto získané byly označeny digoxigeninem pomocí komerční soupravy „DIG-lligh Prime (Boebringer Mannheini).

Příklad 4

Izolace lupulinově specifické eDNA

7. mRNA z frakce bohaté na lupulin byla připravena eDNA knihovna užitím soupravy „eDNA syntehesis module a „eDNA rapid clon ing module - MOSSlox. obě od firmy Amcrsbam. a soupravy „G1GAPACK 11 Plus Paekaging Extrakt od firmy Stratagene s vektorem MOSSlox. η lato knihovna byla podrobena sereeningu hybridizační metodou užitím lupulinově specifické sondy značené digoxigeninem.

Podrobněji řečeno, každý plak pocházející z výše uvedené eDNA knihovny byl přenesen na membránový filtr, který byl blokován v hybridizacním pufru (5xSSC. lOOmM fosfátový pufr. 7%

SDS, 2% blokující činidlo, 0.1% laurylsarkosin, 50% formani id a 50g/ml DNA rybího spermatu).

Pak byla k hybridizačnímu pufru přidána výše popsaná sonda a ve výsledné směsi byla membrána inkubována přes noc ve 42 °C. Pak byla membrána dvakrát opláchnuta promývacím roztokem (1% SDS a 2xSSC) 5 minut při 56 °C a dále dvakrát dalším oplachovaeím roztokem (0.1% SDS a O.lxSSC) 5 minut při 68 °C. Pak byly detekovány pozitivní plaky a lupulinově specifická eDNA byla izolována.

-8CZ 3U0U64 B6

Příklad 5

Určení DNA sekvence lupu línově specifické cDNA a určení aminokyselinové sekvence translatovaného produktu.

Byla stanovena DNA sekvence genových fragmentů obsahujících lupulinově specifickou cDNA a lupulinově specifický promotor. Pro sekvencování byl každý genový fragment subklonován do κι vektoru pUC nebo pBlueseript. Sekvencování bylo provedeno pomocí soupravy ,.ΑΒΙ PRISM

Dve Primer Cycle Sequencing Ready reaction Kit a automatického zařízení pro sekvencování

ABI373S firmy Perkin Elmer.

Sekvence DNA lupulinově specifické cDNA takto stanovená je uvedena jako sekvence id. ě. 2. 15 Také aminokyselinová sekvence translaěního produktu byla dedukována ze sekvence DNA a je zde uvedena jako sekvence id. č. I. V tomto případě aminokyselinová sekvence id. č. 1 odpovídá

DNA sekvenci od iniciačního kodonu (ATG) v pozici 36 38 do temiinaěního kodonu (TAA) v pozici 1218 1220 v sekvenci id. ě. 2.

Příklad 6

Příprava genomové DNA chmelu

2? Genomová DNA chmelu byla připravena následujícím způsobem: Listy nebo šištice chmelu byly zmrazený v kapalném dusíku a rozdrceny na prášek a resuspendovány ve 2% roztoku C 1 AB (obsahuje 2% cetyltrimetylamoniumbromid, OJM Tris. pH 9,5, 20mM EDTA, 1,4M NaCI a 1% β-merkaptoetanol) a pak se inkubovala 30 minut v 65 °C. Po opakované extrakci suspenze směsí chloroform/izoamylakoho! (24:1) byly přidány 3/4 objemu izopropanolu a DNA s RNA byla presu cipitována. DNA a RNA preeipitát byl rozpuštěn v pufru TL s vysokým obsahem soli (1M NaCI. lOmM Tris pH 8.0 a I mM LDTA) a přidala se RNáza, směs se pak inkubovala v 60 ^PC, aby se rozložila RNA. K reakční směsi pak byly přidány dva objemy etanolu, aby se DNA preeipitovala. Přeci pito vána DNA byla dvakrát opláchnuta 70% etanolem a pak byla rozpuštěna vc vodě. čímž byl získán vzorek genomové DNA.

Příklad 7

Izolace regulačních sekvencí pro expresí lupulinově specifického genu to

Izolace regulačních sekvencí pro expresi lupulinově specifického genu byla provedena užitím metody inverzní PCR následujícím způsobem. (Na obr. 1 je schematicky znázorněn postup použitý v příkladu 7):

Nejdříve byla genomová DNA chmelu získaná v příkladu 6 naštěpena restrikčními enzymy Xhol (Sl a S2). Fragmenty Xhol byly cirkularizovány selfligaeí podle protokolu soupravy ..DNA Ligation Kil Ver. 1 (Takara-Shuzo) (S3).

Pak byl krajní úsek obsahující promotor lupulinově specifického genu amplifíkován pomocí P('R užitím ohgonukleotidových prnnerů majících specifickou sekvenci pro lupulmovou cDNA, kdy ěást výše uvedené ligaění reakce byla užita jako templát pro PCR (S4). Sekvence použitého páru primerů jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 3 (primer 1) a sekvence id. c. 4 (primer 2). Sekvence id. č. 3 je sekvence komplementární k sekvenci v pozicích 137 až 166 sekvence íd. Č. 2 a sekvence id. č. 4 je úsek v pozicích 303 až 332 sekvence id. ě. 2.

-9CZ 300064 B6

Výše popsaná PCR byla provedena pomocí soupravy ..Expand High-F i děli ty PCR System (Boehringer Mannheim) podle protokolu výrobce, který je zahrnut formou odkazu. Byly užity následující reakční podmínky : 30 cyklů inkubace 1 minutu v 94 1 minutu v 55 °C a 4 minuty v 68 °C. poté inkubace 6 minut v 72 °C.

s

Reakční směs byla po reakci analyzována elektroforézou. aby bylo možné identifikovat reakční produkty. Jelikož kromě ampl ifi kovaného fragmentu 1 mohou býl v PCR produktu nespecifické ampl i Ukované produkty, byla dále provedena specifická amplifikace požadovaného fragmentu pomocí odlišných primerů (S5). ledy aby byl selektivně amplifikován pouze fragment DNA io obsahující lupu li nově specifický promotor, byla provedena PCR s části výše uvedené reakční směsí jako tcmplátein a byly užity primer 3 (sekvence id. č. 5), komplementární k sekvenci ležící dále „upstream v sekvenci lupulinově specifického genu než primer 1 a výše popsaný primer 2 (S6). Primer 3 (sekvence id. č. 5) obsahuje sekvenci komplementární k úseku 1 14 až 143 lupulinově specifické cDNA (sekvence id. ě. 2). PCR byla provedena za stejných podmínek a ve stejI? ném zařízení, jak bylo popsáno výše. Pak byla stanovena DNA sekvence fragmentu amplifikovaného v PCR užitím uvedených primerů 2 a 3.

Příklad 8

Sek ven eo vání regulační sekvence pro lupni i nově specifickou expresi genu

Sekvence bází výše uvedeného PCR amplifikovaného fragmentu by la stanovena podobně jak bylo popsáno v příkladu 5: fragment byl subklonován do vektoru pUC nebo pBluescript. Sekven2? co vání bylo provedeno pomocí soupravy ..ABI PRISM Dye Primer Cyde Sequencing Ready reaction Kit a automatického zařízení pro DNA sek věncování ABI 373S firmy Perkin El mer, Výsledky jsou uvedeny v sekvenci id. ě. 6.

Jelikož byl amplifikovaný fragment získán metodou inverzní PCR, očekávalo se, že obsahuje regulační sekvence exprese jako jc např. promotor lupulinově specifického genu (nebo jeho část). Aby byla tato sekvence identifikována, byla sekvence uvedeného amplifikovaného fragmentu porovnána se sekvencí lupulinově specifické cDNA. Toto srovnání ukázalo, že ampl i Ukovaná DNA fragment (sekvence id. č. 6) obsahuje promotorovou sekvenci v lupulinově specifické cDNA. Konkrétné sekvence v pozicích 1 až 690 sekvence id. č. 6 odpovídá sekvenci v pozicích i? 303 až 992 lupulinově specifické cDNA (sekvence id. č. 2) a sekvence v pozicích 3296 až. 3438 sekvence id. č. 6 odpovídá úseku 1 až 143 lupulinově specifické cDNA {sekvence id. ě. 2). Tudíž bylo ukázáno, že regulační úsek exprese, jako je např. promotor, lupulinově specifického genu, je zahrnut v úseku 69] až 3295 sekvence id. č. 6 a tento úsek je zde uveden jako sekvence id. ě. 7.

41)

Příklad 9

Northernová analýza lupulinově specifické cDNA a regulační sekvence pro lupulinově specifickou genovou expresi.

Zda jsou výše popsané lupulinově specifické cDNA skutečně specificky exprimovány v lupni i nových žlázkách a zda promotory' pro lupulinově specifickou genovou expresi jsou specificky aktivní v lupu li nových žlázkách lze ověřit northernovou analýzou celkové RNA extrahované z frakce bohaté na lupulin a frakce chudé na lupulin užitím sondv značené DNA ořipravené jako kinuli5o nově specifická cDNA (sekvence id. č. 2) v příkladu 5.

Nejdříve byly připraveny celkové RNA /_ frakce bohaté na lupulin a frakce chudé na lupulin obdobným způsobem jako v příkladu 2 a byly rozděleny elektroforézou na dcnaturujíeím aga rózovém gelu (1% agaróza, 18% fórmaldehyd, 20mM MOPS, 5mM octan sodný a ImM EDTA.

pH 7,0). Takto frakci ono váná RNA v gelu byla přenesena na nylonovou membránu („blotting) a . in.

CZ 300064 Bó pak hy brid izována s cDNA získanou jak bylo výše popsáno jakožto sondou podle protokolu „Uscr's Ciuíde for performing the hybridi žati on using DIG systém, s. 40. 1995 (Bochringer

Mannheim), který je zahrnut formou odkazu.

Hybridizace byla provedena \ následujících podmínkách:

Membrána byla blokována v hybridizačním pufru stejného složení jako v příkladu 4. Pak byla k hybridizačnímu pufru přidána jakožto sonda lupulinově specifická cDNA značená digoxigeninem a ve výsledné směsi byla membrána namočena a inkubována přes noc v 50 °C. Pak byla io membrána dvakrát opláchnuta promývaeím roztokem (1% SDS a 2xSSC) 10 minut při 56 °C a dále dvakrát dalším opiachovacím roztokem (0.1% SDS a O.lxSSC) 30 minut při 68 °C a pak byly vyhledány pásy fúzované se sondou. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2.

Jak ukazuje obr. 2. i přesto, že malé množství mRNA specifické pro výše popsané geny bylo i? přítomno i ve frakcí chudé na lupulin, lato mRNA byla přítomna v obrovském nadbytku ve frakci bohaté na lupulin. což ukazuje silnou expresi těchto genů v lupul inových žlázkách. Exprese těchto genů je řízena nukleovou kyselinou obsahující regulační úsek pro genovou expresi obsahující promotor lokalizovaný „upstream od strukturního genu v genomové DNA, a právě nukleová kyselina obsahující regulační úsek je jedna z nukleových kyselin izolovaných ve výše uvedeném zo přikladu, neboť se ukázala její specifická funkce v lupul inových žlázkách. Pozitivní pásy v oblasti nízké molekulové hmotnosti jsou zřejmě degradované úseky RNA výše popsané.

Příklad 10

Vyšetřování homologie

Předpokládaná aminokyselinová sekvence odvozená na základě DNA sekvence získané lupulinově specifické cDNA byla srovnána z hlediska homologie s dosud známými aminokyselinovými sn sekvencemi. Jako výsledek bylo zjištěno, že zkoumaný gen má výraznou homologii s genem pro ehalkonsyntetázii. která katalyzuje syntézu nalingeninu souvisejícího s biosyntézou ťlavonoidů v rostlinách. Konkrétně srovnání chmelu s chalkonsyntetázou z rostlin jako je Arabidopsis (Plant J.

(5) : 659-671, 1995. ječmen (Piant Mol. Biol. 16: 1103-1106, 1991). lirách (databáze EMBL/gcnBank/DDBJ, X80007). petúnie (J. Biotechnol. 11(2):131-123, 1995) a žito (databáze EMBE/55 genBank/DDBJ, X92547) ukázalo 65 až 70% homologii na úrovni DNA a 70 až 75% homologii na úrovni aminokyselinové sekvence.

Nedávno bylo ukázáno, že chalkonsyntetáza má aktivitu val ero fen on syn tet ázv katalyzující florizovalerofenon a florizobulylofenon, prekurzory hořčin, α-kyseliny a B kyseliny (European

Brevvery Convcntion. Procceding of the 26th Congress. s. 215, 1997). Tyto údaje ukazují, že translační produkt genu podle vynálezu se podílí na biosyntéze hořčin jako valerofenonsyntetáza.

Tudíž v případě, že gen specificky exprimovány v lupu li nových žlázkách kóduje cha Ikon sy nic tážu, tato nukleová kyselina může být využita pro zlepšení flavonoidů v rostlinách. Také v případě, i? že tento gen kóduje valerofenonsyntetázu může být tato nukleová kyselina použita ke zlepšení hořčin ve chmelu. Kromě toho, jelikož hořké látky chmelu, α-kyselina a B kyselina, jsou také fannakologicky účinné (Biosci. Biotech. Biochem. 61(1): 158. 1997). jc možné využít výše popsanou nukleovou kyselinu při výrobě léčiv.

5(1

Průmyslová využitelnost

Jak bylo popsáno již výše, nukleové kyseliny obsahující geny specificky exprimované v lupulinových žlázkách chmelu umožňují šlechtění chmelu metodami genového inženýrství se zaměřením na produkty sekundárního metabolismu exprimované v lupulinových Žlázkách. V případě použiti vektorů nesoucích výše popsané lupulínově specifické geny ϊ/e očekávat, že bude možné dosáhnou tvorby produktů sekundárního metabolismu také mimo rostliny, např. v buněčných kulturách, Jelikož k těmto produktům sekundárního metabolismu patří také důležité materiály vhodné jako potraviny nebo léčiva, a také jelikož chalkonsyntáza se podílí na biosyntéze tlavonoidú a valerofenonsyntetáza se účastni biosyntézy hořkých látek, předkládaný vynález značnou měrou přispívá k vývoji a zlepšení surovin pro potravinářský a farmaceutický průmysl.

Navíc lupulínově specifický promotor podle vynálezu může být využit ke zlepšení produktů sekundárního metabolismu jako jsou např. esenciální oleje nebo hořké látkv akumulované v lupuio línových žlázkách, a to tím. že se požadovaný gen vloží do polohy po směru transkripce (..downstreanV) od promotoru. Tento promotor lze také využít k vnesení dalších nových znaků do chmelu.

Odborníkovi je zřejmé, že jsou možné mnohé modifikace a variace vynálezu ve smyslu vyloženě15 ho vynálezu. Spadají však také do předmětu předkládaného vynálezu, který je vymezen následujícími patentovým nároky.

Jato patentová přihláška je založena na japonské patentové přihlášce č. Hei 10 37266 podané 19. února 1998 a č. Hei 10-174235 podané 22. června 1998, které jsou zde v plném znění zahrnuty formou odkazu.

. n.

SEZNAM SEKVENCÍ [2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 394 (B) TYP: aminokyseliny (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:

10 20 MetAlaSerValThrValGluGlnlleArgLysAlaGlnArgAlaGluGlyProAlaThr

40

IleLeuAlalleGlyThrAlaValProAlaAsnCysPheAsnGlnAlaAspPheProAsp

60

TyrTVrPheArgValThrLysSeiOluHisMetThrAspLeuLysLysLysPheGlnArg

80

MetCysGluLysSerThrlleLysLysArgiyrLeuHisLeuThrGluGlufíisLeuLys

100

GlnAsnProHisLeuCysGluTVrAsnAlaProSerLeuAsnThrArgGlnAspMotLeu 110 120

ValValGluValProLysLeuGlyLysGluAlaAlalleAsnAlalleLysGluTrpGly 130 140

GlnProLysSerLysIleThrHisLeuIlePheCysThrGlySerSerlleAspMetPro 150 160

GlyAiaAspTyrGlnCysAlaLysLeuLeuGlyLeuArgProSerValLysArgValMet 170 180

LeuTyrGInLeuGlyCysTyrAlaGlyGlyLysValLeuArglleAlaLysAspTleAla 190 200

GluAsnAsnLysGlyAlaArgValLeuIleValCysSerGluIleThrAlaCysIlePhe 210 220

ArgGlyProSerGluLysHisLeuAspCysLeuValGlyGlnSerLeuPheGlyAspGly 230 240

AlaSerSerValIleValGlyAlaAspProAspAlaSerValGlyGluArgProIlePhe 250 260

GluLeuValSerAlaAlaGlnThrlleLeuProAsnSerAspGlyAlalleAlaGlyHis 270 280

ValThrGluAlaGlyLeuThrPheHisLeuLeuArgAspValProGlyLeuIleSerGln 290 300

AsnIleGluLvsSerLeulleGluAlaPheThrProIleGlylleAsnAspTrpAsnAsn

- 13 Q7. 300064 B6

310 320

IlePheTrpIleAlaHísProGlyGlyProAlalleLeuAspGluIleGluAlaLysLeu

330 340

GluLeuLysLysGluLysMetLysAlaSerArgGluMetLeuSerGluTyrGlyAsnMet

350 360

SerCysAlaSerValPhePhelleValAspGluMetArgLysGlnSerSerLysGluGly

370 380

LysSerThrThrGlyAspGlyLeuGluTrpGlyAlaLeuPheGlyPheGlyProGlyLeu

390 394

ThrValGluThrValValLeuHisSerValProThrAsnVal (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1539 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární o (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:

TTTCACAGTA CTACTAGCTA TATATATATC AGGTAATGGC GTCCGTAACT GTAGAGCAAA 60 TCCGAAAGGC TCAGCGAGCT GAAGGTCCGG CCACCATCCT CGCCATTGGC ACCGCCGTTC 120 CTGCCAACTG TTTCAACCAA GCTGATTTTC CCGACTACTA CTTTCGTGTC ACCAAAAGTG 180 AACACATGAC TGATCTCAAA AAGAAGTTCC AACGAATGTG TGAAAAATCC ACTATAAAAA 240 AGCGTTACTT GCACTTGACC GAAGAGCATC TGAAGCAGAA CCCACATCTG TGCGAGTACA 300 ATGCACCATC TCTGAACACA CGCCAAGACA TGTTGGTGGT TGAAGTTCCC AAGCTTGGGA 360 AGGAGGCTGC AATCAATGCC ATCAAAGAAT GGGGCCAACC CAAGTCCAAG ATCACCCATC 420 TCATCTTCTG CACCGGCTCC TCCATCGACA TGCCAGGAGC CGATTACCAA TGCGCCAAGC 480 TTCTCGGCCT CCGACCCTCG GTGAAGCGAG TGATGCTGTA TCAACTCGGC TGTTATGCCG 540 GTGGAAAAGT TCTTCGCATA GCCAAGGACA TAGCAGAGAA CAACAAGGGC GCTAGAGTTC 600 TCATTGTGTG CTCTGAGATC ACAGCTTGTA TCTTTCGCGG GCCCTCGGAG AAACATTTGG 660 ATTGCTTGGT GGGGCAATCT CTGTTCGGAG ACGGGGCATC TTCGGTCATC GTTGGTGCCG 720 ACCCTGATGC CTCGGTAGGC GAGCGGCCGA TCTTCGAGTT GGTTTCAGCT GCGCAGACGA 780 TTTTGCCTAA CTCGGATGGA GCCATAGCCG GGCACGTAAC GGAAGCCGGG CTGACATTTC 840 ACTTGCTGAG GGACGTGCCA GGGTTGATCT CCCAAAACAT TGAGAAGAGC TTGATTGAGG 900 CCTTCACTCC GATTGGGATT AATGACTGGA ACAACATATT CTGGATTGCA CATCCCGGTG 960 GACCTGCCAT TCTGGACGAG ATAGAGGCCA AGCTCGAGCT GAAGAAGGAG AAGATGAAGG 1020 CGTCTCGTGA AATGCTGAGC GAGTATGGGA ACATGTCATG TGCAAGCGTT TTCTTCATAG 1080 TAGATGAGAT GAGG.AAACAG TCGTCGAAGG AAGGGAAGTC TACCACCGGA GATGGACTGG 1140

- 14 CZ 300064 Bó

AGTGGGGCGC TCTCTTCGGG TTTGGACCGG GTCTGACGGT GGAGACGGTG GTCTTGCACA 1200

GCGTGCCCAC AAACGTCTAA TGAATAATTT GTTATCGCTA GCTTGTCAAA TCAAGCTTTA 1260

CTATGTATTG TGGTCGTTAA TTAGTTTATA CTTTGATGTT GATCAATAAT TATATACCTC 1320

ATCTAATAAA ATGATCAAAT ATATTTTTAT ATAAAAAAA 1359 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

s (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID, Č, 3:

CGAAAGTAGT AGTCGGGAAAATCAGCTTG G 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID, Č, 4:

GCACCATCTC TGAACACACG CCAAGACATG 30 (2) INFORMACI·; PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

i) CHARAKTERISTIKA SEKVENC E:

(A) DÉLKA: 30 (B) TYP: nukleová kyselina (CT TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina 35 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:

AGCTTGGTTG AAACAGTTGG CAGGAACGGC 30 in (d inipormacp PRQ SEKVENCI S !DENT!F!KAČN!M ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3439 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární

- 15 CZ 300064 B6 (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:

GCACCATCTC TGAACACACG CCAAGACATG TTGGTGGTTG AAGTTCCCAA GCTTGGGAAG 60 GAGGCTGCAA TCAATGCCAT CAAAGAATGG GGCCAACCCA AGTCCAAGAT CACCCATCTC 120

ATCTTCTGCA CCGGCTCCTC CATCGACATG CTCGGCCTCC GACCCTCGGT GAAGCGAGTG GGAAAAGTTC TTCGCATAGC CAAGGACATA ATTGTGTGCT CTGAGATCAC AGCTTGTATC TGCTTGGTGG GGC.AATCTCT GTTCGGAGAC CCTGATGCCT CGGTAGGCGA GCGGCCGATC TTGCCTAACT CGGATGGAGC CATAGCCGGG TTGCTGAGGG ACGTGCCAGG GTTGATCTCC TTCACTCCGA TTGGGATTAA TGACTGGAAC CCTGCCATTC TGGACGAGAT AGAGGCCAAG TTCTCCTAGG GTGATCACCA GCTCGATAGT ACCGCACAGC ATCATGGAGG TCGCCTTCAG CGTGGACCGG AATAGAAGGT TTACCGAGCT CCGAATAGCG AGCTGAACTG CTACGACCAG CGCATCTTCT TCTGTAAAAA TGATCGGTTG CTGCTCCGGG ACGAACTCTA CTCCATTATG GGCACCCCTA CTCACGCTAG CTAAATGCGG AATCACTGGA GGAGGGACGT CTTGATCTAT ACTATGTATA AGGTTCATAA ACACATTATA ATGAAAAAAA CTCACCAAAA TTGGTCTAGG AAACCTAAGT TTTGAATTTG GGAGAATGAA CTGGGTGCAC TGTTTGCGTT AGTGGGCAAC AAACTGACGC AAACACACCG TTAGCGTTAG GCATCAGTTG GCCACTGACG CAAACTTCAC CAAATGCCCC TGAATTTGTG GTAGTACTCA GCGTCAGTCA ACTGTGTTGA GTGACGCGTT GTGGAAGATT AACTAAGAAG GTAAAATTGG

CCAGGAGCCG ATTACCAATG CGCCAAGCTT 180 ATGCTGTATC AACTCGGCTG TTATGCCGGT 240 GCAGAGAACA ACAAGGGCGC TAGAGTTCTC 300 TTTCGCGGGC CCTCGGAGAA ACATTTGGAT 360 GGGGCATCTT CGGTCATCGT TGGTGCCGAC 420 TTCGAGTTGG TTTCAGCTGC GCAGACGATT 480 CACGTAACGG AAGCCGGGCT GACATTTCAC 540 CAAAACATTG AG.AAGAGCTT GATTGAGGCC 600 .AACATATTCT GGATTGCACA TCCCGGTGGA 660 CTCGAGGAGT TTGGAGACTG TCCGAGGTCC 720 CCCTATAGCC GTTGATCCTT CTCCCGAAAA 780 CTCGGCGACA GTCAAACCCA TCTTCTCC.AA 840 CCCATTATCG ATCAACACCC TCCTAACCCT 900 AGGGTCGTTA TGAGGGAACT GGACATGGCC 960 CCTCTCCAAT CGCTGCTGCT TTGGCAGACG 1020 CGCCTTGAGT TCGTTTACGT ATCTCTTTTG 1080 ACCTCCAGAG ATTGTGGATA TCTCTCCTCC 1140 CCGAGACCCA GAAATCTATA CAAAAAAAAA 1200 TTCATT.AATT TAACCTTAAA ΑΤΤΑΛΛΑΑΛΑ 1260 AAGTCGGAGA CGCCGCTAGT TCTTGGGAGA 1320 GGGCTTGGGG TCGATGGCTG AGATTTAATA 1380 TGACGCTAAC GGCTTGTTTG CATCAGTGCC 1440 TTGCCCACTG ACGCAAACGG TGCATT.AAGA 1500 CAATTAACAG TGTCAGTGTT ATCACTGATG 1560 ACTTCCACAA ATGCTGATTC TCGGTCAACG 1620 TGACTGACAC AAAATAAGTA TTTTGGTGTA 1680 AGGTTATTGT TATCACTCCT TCATCATTTA 1740

- 16 CZ 300064 B6

TAAAAGTAGA A4TACGTTCC ATTTAATATA CTAACCAACC TTGCTGCCAC ATATCCCCTG 1800 AAAAAAATAA AACA4CAACA ACCTTTCTAC CATAAAATTA GGCATATGAT GATATATAAC 1860 CTAACTATAA CACAAAATTA GGCATATGAT GATATATATA ACCTAACTAT AACACAAAAT 1920 TAGGCATATA TATATACACT CACAAATAGT GGCTGCTATA CCCAACACCT TAATTAATTA 1980 ATAGTTAATG CTCCTCTAGA AGACTGGACG AGATCAAGTG CTATTATGCG GAATCAAGAT 2040 CTCCTATCAA AAAAAGATGT CCCAGCCTAT GTTTAGAAAA TGTTAAATCA AATTCTGTTA 2100 ACTAATTTCT ATATTTCTCA TCCCTACTCC TTTTTTTTTA ACAATCAACA ATTCATTG.AA 2160 AATAATCAAA ATGTAATACA ACTAATAATA AGATGATATA TATAGTAACT ATCCATACAA 2220 GTTCATTATC CACTCT.AAGT GCATGCACAA TTCATGAACG GCCTTATTGG CCAAACGTCA 2280 AACACAAATT AGAGATACCT TAGAAAAATT GGATAATAAA CTTGTTATAT TTTCTAACAA 2340 AGACCCTAAT TCATTACTAC TCCATTAAAT GACGTGTATC TTTCATTTTT TTTTAAAAAT 2400 TTTAGAAACT AATAGAGTAT GGATTGATGC TGCATTATAA GAAATCGATC ACACCTTCAG 2460 TTATGAACTT TCCGGCTAAG CACCATCGGG CATCTATGTC CTCCTCTTTT GCCACATTAT 2520 CATATGAAAT ACCACTGTTT TCCTCCTCTT CCAAGCTTAT GGTCAAGACC GGCCCTGAAC 2580 T.AAGGTGGGT TAGACCCACG CCTAGGGCCT ATTTTTTTTT ACATTTCTTT TAAAAATACT 2640 ATAAATTTTT AAAAAGTTTT TACAAAAAGG GCCCCTAATC ACCAATTTTT CCTAAGGCTC 2700 AAAACTCTTC AGGGCCAGCC CTGCCTATGG TAGCATATCT AGATTCTAAA TCTTGCTTAT 2760 GAGAACTGCT CGATGCCATA ACTTCCTTCG CCACCAAGAC TAATAACACA AACAATAGAG 2820 AACGAACACA CCAATAGCAA TACAAAACAC CTTACGTCAA CTGACCCAAC AGAGAGCTAC 2880 CATGTCAAAA GACAATACTA GTTTGAGACT TCACCACTGT CAAAATTCTA GTTCTCAACA 2940 CTAGCAAAAA AAAAAGTGTT AAACACCATC AATCACATAA CGACATACTT CTTGGCCATA 3000 TTTTTTTTCC CATGTAATCA TGTAAAAGGT GGGGAAAATA AATCAATACA CATAAAGAAC 3060 AATGAAAAAA TAAATAAACA AGTCAAATTA TTATAATTTA ACATTAAT.AA AAAGTTGAGA 3120 ATCACAAACA TTGGTACGTA GGTATTAGGG TTGGTGTTTA CACATATTAT CCATAGGCCA 3180 TGCACACCTT ACCTAACCCA TGCACCACTT TGTACATATT ATATATATAA CTCCAATTTG 3240 GCTTTGCATT TCAACACTTG TAATCATTAC ACTATATTTG TGTATATAGT GT.AAGTTTTC 3300 ACAGTACTAC TAGCTATATA TATATCAGGT AATGGCGTCC GTAACTGTAG AGCAAATCCG 3360 AAAGGCTCAG CGAGCTGAAG GTCCGGCCAC CATCCTCGCC ATTGGCACCG CCGTTCCTGC 3420 CAACTGTTTC AACCAAGCT 3439 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM Č ÍSLEM 7: s (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉI.KA: 2606 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dve··'“ (D) TOPOLOGIE: lineární i' (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:

- 17 CZ 300064 R6

CTCGAGGAGT TTGGAGACTG TCCGAGGTCC TTCTCCTAGG GTGATCACCA GCTCGATAGT 60 CCCTATAGCC GTTGATCCTT CTCCCGAAAA ACCGCACAGC ATCATGGAGG TCGCCTTCAG 120 CTCGGCGACA GTCAAACCCA TCTTCTCCAA CGTGGACCGG AATAGAAGGT TTACCGAGCT 180 CCCATTATCG ATCAACACCC TCCTAACCCT CCGAATAGCG AGCTG.AACTG CTACGACCAG 240 AGGGTCGTTA TGAGGGAACT GGACATGGCC CGCATCTTCT TCTGTAAAAA TGATCGGTTG 300 CCTCTCCAAT CGCTGCTGCT TTGGCAGACG CTGCTCCGGG ACGAACTCTA CTCCATTATG 360 CGCCTTGAGT TCGTTTACGT ATCTCTTTTG GGCACCCCTA CTCACGCTAG CTAAATGCGG 420 ACCTCCAGAG ATTGTGGATA TCTCTCCTCC AATCACTGGA GGAGGGACGT CTTGATCTAT 480 CCGAGACCCA GAAATCTATA CAAAAAAAAA ACTATGTATA AGGTTCATAA ACACATTATA 540 TTCATTAATT TAACCTTAAA ATTAAAAAAA ATGAAAAAAA CTCACCAAAA TTGGTCTAGG 600 AAGTCGGAGA CGCCGCTAGT TCTTGGGAGA AAACCTAAGT TTTGAATTTG GGAGAATGAA 660 GGGCTTGGGG TCGATGGCTG AGATTTAATA CTGGGTGCAC TGTTTGCGTT AGTGGGCAAC 720 TGACGCTAAC GGCTTGTTTG CATCAGTGCC AAACTGACGC AAACACACCG TTAGCGTTAG 780 TTGCCCACTG ACGCAAACGG TGCATTAAGA GCATCAGTTG GCCACTGACG CAAACTTCAC 840 CAATTAACAG TGTCAGTGTT ATCACTGATG CAAATGCCCC TGAATTTGTG GTAGTACTCA 900 ACTTCCACAA ATGCTGATTC TCGGTCAACG GCGTCAGTCA ACTGTGTTGA GTGACGCGTT 960 TGACTGACAC AAAATAAGTA TTTTGGTGTA GTGGAAGATT AACTAAGAAG GTAAAATTGG 1020 AGGTTATTGT TATCACTCCT TCATCATTTA TAAAAGTAGA AATACGTTCC ATTTAATATA 1080 CTAACCAACC TTGCTGCCAC ATATCCCCTG AAAAAAATAA AACAACAACA ACCTTTCTAC 1140 CATAAAATTA GGCATATGAT GATATATAAC CT.AACTAT.AA CACAAAATTA GGCATATGAT 1200 GATATATATA ACCT.AACTAT AACACAAAAT TAGGCATATA TATATACACT CACAAATAGT 1260 GGCTGCTATA CCCAACACCT ΤΑΑΤΤΑΑΤΤΛ ATAGTTAATG CTCCTCTAGA AGACTGGACG 1320 AGATCAAGTG CTATTATGCG GAATCAAGAT CTCCTATCAA AAAAAGATGT CCCAGCCTAT 1380 GTTTAGAAAA TGTT.AAATCA AATTCTGTTA ACTAATTTCT ATATTTCTCA TCCCTACTCC 1440 TTTTTTTTTA ACAATCAACA ATTCATTGAA AATAATCAAA ATGTAATACA ACTAATAATA 1500 AGATGATATA TATAGTAACT ATCCATACAA GTTCATTATC CACTCTAAGT GCATGCACAA 1560 TTCATGAACG GCCTTATTGG CCAAACGTCA AACACAAATT AGAGATACCT TAGAAAAATT 1620 GGATAATAAA CTTGTTATAT TTTCT.UCAA AGACCCTAAT TCATTACTAC TCCATTAAAT 1680

- 1« CZ 300064 Bó

GACGTGTATC TTTCATTTTT TTTTAAAAAT TTTAGAAACT AATAGAGTAT GGATTGATGC 1740 TGCATTATAA GAAATCGATC ACACCTTCAG TTATGAACTT TCCGGCTAAG CACCATCGGG 1800 CATCTATGTC CTCCTCTTTT GCCACATTAT CATATGAAAT ACCACTGTTT TCCTCCTCTT 1860 CCAAGCTTAT GGTCAAGACC GGCCCTGAAC TAAGGTGGGT TAGACCCACG CCTAGGGCCT 1920 ATTTTTTTTT ACATTTCTTT TAAAAATACT ATAAATTTTT AAAAAGTTTT TACAAAAAGG 1980 GCCCCTAATC ACCAATTTTT CCTAAGGCTC AAAACTCTTC AGGGCCAGCC CTGCCTATGG 2040 TAGCATATCT AGATTCTAAA TCTTGCTTAT GAGAACTGCT CGATGCCATA ACTTCCTTCG 2100 CCACCAAGAC TAATAACACA AACAATAGAG AACGAACACA CCAATAGCAA TACAAAACAC 2160

CTTACGTCAA CTGACCCAAC AGAGAGCTAC CATGTCAAAA GACAATACTA GTTTGAGACI 2220 TCACCACTGT CAAAATTCTA GTTCTCAACA CTAGCAAAAA AAAAAGTGTT AAACACCATC 2280 AATCACATAA CGACATACTT CTTGGCCATA TTTTTTTTCC CATGTAATCA TGTAAAAGGT 2340 GGGGAAAATA AATCAATACA CATAAAGAAC AATGAAAAAA TAAATAAACA AGICAAATTA 2400 TTATAATTTA ACATTAATAA AAAGTTGAGA ATCACAAACA TTGGTACGTA GGTATTAGGG 2460 TTGGTGTTTA CACATATTAT CCATAGGCCA TGCACACCTT ACCTAACCCA TGCACCACTT 2520 TGTACATATT ΑΤΑΤΛΤΑΤΑΑ CTCCAATTTG GCTTTGCATT TCAACACTTG TAATCATTAC 2580 ACTATATTTG TGTATATAGT GTAAGT

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Nukleová kyselina kódující protein mající chalkonsyntetázovou a/nebo valero fenou syn tetaio zovou aktivitu a obsahující gen vybraný ze skupiny zahrnuj ící;

   (a) geny kódující protein obsahující aminokyselinovu sekvenci SEQ IL) NO : 1; a (b) geny obsahující DNA sekvenci SEQ ID NO : 2.
2. 2. Nukleová kyselina podle nároku 1, která je specificky exprimován a v lupulinových žlázách b chmelu.
3. 3. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku I nebo 2.
4. 4. Nukleová kyselina obsahující regulační sekvenci pro specifickou expresi heterologních genů 20 v lupulinových žlázách chmelu sestávající z;

   (a) nukleových kyselin obsahujících DNA sekvenci SEQ ID NO : 7; a (b) nukleových kyselin obsahujících DNA sekvenci SEQ ID NO : 6.
5. 5. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 4.
6. 6. Rostlinná buňka transformovaná vokínrem nnrllp nárnkii 3
7. 7. Rostlinná buňka transformovaná vektorem podle nároku 5.

   so
8. 8. Způsob přípravy transformovaných rostlinných buněk, vyznačující se l í m . že zahrnuje transformací rostlinné buňky vektorem podle nároku 3.

   -19CZ 300064 B6
9. 9. Způsob přípravy transformovaných rostlinných buněk, vyznačující se t í m , že zahrnuje transformaci rostlinné buňky vektorem podle nároku 5,
10. 10. Primer nukleové kyseliny obsahující DNA sekvenci ID NO : 3. 4 nebo 5.
11. 11. Souprava pro detekci regulačních sekvencí pro specifickou expresi lupulinově specifických expresních genů vyznačující se t í m , že obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu mající sekvenci SEQ ID NO : 3. 4 nebo 5.