ES2238697T3 - Secuencias de adn que codifican una cinamoil coa-reductasa, y sus aplicaciones en el campo de la regulacion de los contenidos de ligninas en las plantas. - Google Patents
Secuencias de adn que codifican una cinamoil coa-reductasa, y sus aplicaciones en el campo de la regulacion de los contenidos de ligninas en las plantas.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CUALQUIER SECUENCIA DE ADN QUE COMPRENDA, COMO REGION CODIFICANTE, LA TOTALIDAD O PARTE DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA UN ARNM CODIFICANTE PARA UNA CINNAMOIL COA REDUCTASA (CCR) EN LA ALFALFA O EN EL MAIZ, O LA TOTALIDAD O PARTE DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA COMPLEMENTARIA DE ESTAS ULTIMAS Y QUE CODIFICA PARA UN ARNM ANTISENTIDO SUSCEPTIBLE DE HIBRIDACION CON EL ARNM MENCIONADO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA UTILIZACION DE LAS MENCIONADAS SECUENCIAS PARA LA APLICACION DE PROCEDIMIENTOS DE REGULACION DE LA BIOSINTESIS DE LIGNINAS EN LAS PLANTAS.
Description
Secuencias de ADN que codifican una cinamoil
CoA-reductasa, y sus aplicaciones en el campo de la
regulación de los contenidos de ligninas en las plantas.
La presente invención tiene por objeto la
utilización de secuencias de ADN que codifican una cinamoil
CoA-reductasa (CCR) en las plantas, o de cualquier
fragmento de estas secuencias, o también de cualquier secuencia que
deriva de estas últimas, o de sus secuencias complementarias, en el
ámbito de la realización de procedimientos para la regulación del
porcentaje de lignina en las plantas.
La lignina es un polímero aromático heterogéneo
complejo que impermeabiliza y refuerza las paredes de ciertas
células de las plantas.
La lignina se forma mediante polimerización de
radicales libres que derivan de monolignoles tales como los
alcoholes p-cumarílicos, coniferílicos y sinapílicos
(Higuchi, 1985, en Biosynthesis and degradation of wood components
(T. Higuchi, ed.), Academic Press, Orlando, FL, p.
141-160).
Las ligninas presentan una gran variación en su
contenido en relación con los monolignoles, en función de las
especies, y de los diferentes tejidos en una misma planta.
Esta variación se debe y se controla
probablemente por las diferentes actividades y especificidades de
los sustratos, las enzimas necesarias para la biosíntesis de los
monómeros de la lignina (Higuchi, 1985, susodicho).
Más allá de su papel en la estructura y el
desarrollo de las plantas, la lignina representa un componente
principal de la biomasa terrestre, y supone una gran importancia
económica y ecológica (Brown, 1985, J. Appl. Biochem. 7,
371-387; Whetten y Sederoff, 1991, Forest Ecology
and Management, 43, 301-316).
Con respecto a la explotación de la biomasa,
conviene ante todo señalar que la lignina es un factor limitante de
la digestibilidad y del rendimiento nutricional de las plantas
forrajeras. En efecto, se demuestra claramente que la
digestibilidad de las plantas forrajeras por los rumiantes es
inversamente proporcional al contenido de ligninas de estas
plantas, siendo igualmente la naturaleza de las ligninas un factor
determinante de este fenómeno (Buxton y Roussel, 1988, Crop. Sci.,
28, 553-558; Jung y Vogel, 1986, J. Anim.,
Sci., 62, 1703-1712).
Entre las principales plantas forrajeras en las
que sería interesante disminuir los contenidos de ligninas, se
pueden citar: alfalfa, festuca, maíz, forraje utilizado en
ensilado, etc.
Se señala igualmente que los contenidos elevados
de ligninas son responsables en parte de la calidad limitada de las
tortas de girasol destinadas a la alimentación del ganado, y de la
disminución de las capacidades de germinación de ciertas semillas
en el campo de la horticultura.
Se puede subrayar igualmente que la lignificación
intensa que se produce durante la conservación de los componentes
vegetales, después de la cosecha, hace rápidamente impropios para
el consumo productos tales como el espárrago, el ñame, las
zanahorias, etc.
Por otra parte, es conveniente igualmente señalar
que se extraen más de 50 millones de toneladas de ligninas de la
materia leñosa, cada año, en el campo de la producción de pasta de
papel en la industria papelera. Esta operación de extracción,
necesaria para la obtención de la celulosa, es energéticamente
costosa y secundariamente contaminante a través de los compuestos
químicos utilizados para la extracción, y que se reencuentran en el
medioambiente (Dean y Eriksson, 1992, Holzforshung, 46,
135-147; Whetten y Sederoff, 1991, susodicho).
Reducir las proporciones de ligninas (que, según
las especies, representan de 20 a 30% de la materia seca) en unos
pocos porcentajes (2 a 5%) representaría una ganancia de
rendimiento, un ahorro sustancial (productos químicos), y
contribuiría a la mejora del medioambiente (disminución de
contaminaciones). Dada la magnitud de uso de la materia leñosa,
estas resultados tendrían repercusiones extremadamente importantes.
En este caso, las especies implicadas podrían ser el álamo, el
eucalipto, el Acacia mangium, el género Casuarina y
el conjunto de las angiospermas y gimnospermas utilizados para la
producción de pasta para papel.
Obviamente, en los dos campos considerados, la
reducción de los porcentajes de ligninas se debe moderar para
conservar a la planta (o al árbol) sus características de rigidez y
su arquitectura normal, puesto que las ligninas que refuerzan las
paredes celulares tienen un papel importante en el mantenimiento
del aspecto recto de los vegetales.
Las variaciones naturales en los contenidos de
ligninas observadas en la naturaleza para una misma especie
(pudiendo ser la diferencia hasta 6-8% de la masa
seca entre individuos) permiten las reducciones sugeridas más
arriba.
La resistencia a la degradación de la lignina, al
igual que las dificultades que se encuentran en el ámbito de su
extracción, se debe probablemente a la estructura compleja de este
polímero, constituido por enlaces éter y
carbono-carbono entre los monómeros, así como a los
numerosos enlaces químicos que existen entre la lignina y otros
componentes de la pared celular (Sarkanen y Ludwig, 1971, en
Lignins: Occurrence, Formation, Structure and Reactions (K. V.
Sarkanen y C.H. Kudwig eds.) Nueva York: Wiley - Interscience, p.
1-18).
Partiendo de las cinamoil CoA, la biosíntesis de
las ligninas en las plantas se efectúa de la manera siguiente:
Un enfoque, por vía genética, para intentar
reducir el porcentaje de ligninas en las plantas, consistiría en
inhibir la síntesis de una de las enzimas de la cadena de la
biosíntesis de estas ligninas indicadas aquí arriba.
Una técnica particularmente apropiada en el
ámbito de tal enfoque es la del uso de ARNm antisentido susceptible
de hibridarse con el ARNm que codifica estas enzimas, y en
consecuencia, impedir, por lo menos parcialmente, la producción de
estas enzimas a partir su ARNm correspondiente.
Tal estrategia antisentido, realizada con la
ayuda del gen que codifica la CAD en la planta del tabaco, ha sido
el objeto de la solicitud de patente europea nº 584.117, que
describe la utilización de ARNm antisentido susceptible de inhibir
la producción de ligninas en las plantas, al hibridarse con el ARNm
que codifica la CAD en estas plantas.
Los resultados al nivel de las plantas así
transformadas demuestran una reducción de la actividad de la CAD,
pero paradójicamente los contenidos de ligninas no muestran ninguna
evolución. Estudios complementarios indican que las ligninas de
plantas transformadas son diferentes de las ligninas del control,
porque los aldehídos cinamílicos se incorporan directamente en el
polímero de lignina.
Uno de los objetivos de la presente invención es
precisamente el de proporcionar un procedimiento que permite regular
eficazmente los contenidos de ligninas en las plantas, bien en el
sentido de una disminución sensible de estos contenidos con
respecto a los contenidos normales en las plantas, o bien en el
sentido de un aumento de estos contenidos.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar las herramientas para la realización de tal
procedimiento, y más particularmente de las construcciones
utilizables para la transformación de plantas.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar plantas transformadas genéticamente, especialmente
plantas forrajeras susceptibles de ser digeridas mejor que las
plantas no transformadas, o también plantas o árboles transformados
para la producción de pasta de papel, a partir de los cuales se
facilitaría la extracción de las ligninas, y sería menos
contaminante que en el caso de árboles no transformados.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar plantas transformadas más resistentes a las ataques del
medioambiente, especialmente a las ataques parasitarios, que las
plantas no transformadas; o también plantas transformadas de tamaño
más grande, o de tamaño más pequeño (que las plantas no
transformadas).
La presente invención tiene por objeto el uso de
secuencias nucleotídicas recombinantes que contienen una (o varias)
regiones codificantes, estando constituida estas regiones
codificantes de una secuencia nucleotídica elegida entre las
siguientes:
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 1, que codifica un ARNm, codificando este mismo ARNm la cinamoil CoA-reductasa (CCR) de alfalfa, representada por SEC ID nº 2,
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 3, que codifica un ARNm, codificando este mismo ARNm la CCR de maíz representada por SEC ID nº 4,
- -
- un fragmento de la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 1, o de la representada por SEC ID nº 3, codificando este fragmento un fragmento de la CCR representada por SEC ID nº 2 o un fragmento de la CCR representada por SEC ID nº 3, respectivamente, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de las dos CCR susodichas,
- -
- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm codificado por las secuencias SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3, respectivamente,
- -
- un fragmento de la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3, codificando este fragmento de secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 2, o con el ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 4, respectivamente,
- -
- la secuencia nucleotídica que deriva de la secuencia representada por SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3, especialmente por mutación y/o adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4, respectivamente, o un fragmento o una proteína que deriva de estas últimas, presentando este fragmento o proteína derivada una actividad enzimática equivalente a la de dichas CCR en las plantas,
- -
- la secuencia nucleotídica que deriva de la secuencia nucleotídica complementaria susodicha, o del fragmento de esta secuencia complementaria tal como se describe aquí arriba, por mutación y/o adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm susodichos,
para la transformación de células
vegetales con vistas a la obtención de plantas transgénicas en las
que la biosíntesis de las ligninas se regula en el sentido de un
aumento o bien en el sentido de una disminución de los contenidos de
ligninas producidas, con respecto a los contenidos normales de
ligninas producidas en las plantas, y/o en el sentido de una
modificación de la composición de las ligninas producidas por
dichas plantas transgénicas, con respecto a las ligninas producidas
en las plantas no transformadas, especialmente mediante realización
de uno de los procedimientos, descritos a continuación, para
regular la cantidad de lignina en las
plantas.
Por "secuencia nucleotídica derivada", en lo
anterior y en lo siguiente, se entiende cualquier secuencia que
presenta por lo menos aproximadamente 50% (preferentemente por lo
menos 70%) de nucleótidos homólogos a los de la secuencia de la
cual deriva.
Por "proteína derivada", en lo anterior y en
lo siguiente, se entiende cualquier proteína que presenta por lo
menos aproximadamente 50% (preferentemente por lo menos 70%) de
aminoácidos homólogos a los de la proteína de la cual deriva.
La presente invención tiene más particularmente
por objeto cualquier secuencia de ADN, caracterizada porque
comprende como región codificante:
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 1, que codifica un ARNm, codificando este mismo ARNm la CCR representada por SEC ID nº 2, o
- -
- un fragmento de la secuencia nucleotídica susodicha, codificando este fragmento un fragmento de la CCR representada por SEC ID nº 2, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR susodicha, o
- -
- cualquier secuencia nucleotídica que deriva de la secuencia representada por SEC ID nº 1 susodicha, o de un fragmento tal como se describe aquí anteriormente de esta secuencia, especialmente por mutación y/o adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 2, o una proteína que deriva de esta última y que presenta una actividad enzimática equivalente a la de dicha CCR en las plantas.
La presente invención tiene más particularmente
por objeto cualquier secuencia de ADN, caracterizada porque
comprende como región codificante:
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 3, que codifica ARNm, codificando este mismo ARNm la CCR representada por SEC ID nº 4, o
- -
- un fragmento de la secuencia nucleotídica susodicha, codificando este fragmento un fragmento de la CCR representada por SEC ID nº 4, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR susodicha, o
- -
- cualquier secuencia nucleotídica que deriva de la secuencia representada por SEC ID nº 3, susodicha, o de un fragmento tal como se describe aquí arriba de esta secuencia, especialmente por mutación y/o adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 4, o una proteína que deriva de esta última y que presenta una actividad enzimática equivalente a la de dicha CCR en las plantas.
Por proteína que presenta una actividad
enzimática equivalente a la de las CCR presentes en las plantas, y
más particularmente de las CCR representadas por SEC ID nº 2 y SEC
ID nº 4, se entiende cualquier proteína que posea una actividad CCR
tal como se mide según el método de Luderitz y Grisebach publicado
en Eur. J. Biochem. (1981), 119:
115-127.
A título ilustrativo, este método se realiza
mediante medida espectrofotométrica de la actividad reductora de la
proteína (CCR o derivada), siguiendo la desaparición de las
cinamoil CoA a 366 nm. La reacción se desarrolla a 30ºC, durante 2
a 10 minutos. La composición del medio de reacción es la siguiente:
tampón fosfato de 100 mM, pH 6,25, 0,1 mM NADPH, 70 \muM
feruloil-CoA, 5 a 100 \mul de extracto enzimático
en un volumen total de 500 \mul.
La invención tiene igualmente por objeto
cualquier secuencia de ADN, caracterizada porque comprende como
región codificante:
- -
- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEC ID nº 1, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 2, a saber, el ARNm codificado por la secuencia representada por SEC ID nº 1, o codificado por una secuencia que deriva de esta última, tal como se define aquí arriba, o
- -
- un fragmento de la secuencia complementaria susodicha, codificando este fragmento de secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 2, tal como se define aquí arriba, o
- -
- cualquier secuencia nucleotídica que deriva de la secuencia complementaria susodicha, o del fragmento de esta secuencia complementaria tal como se describe aquí arriba, especialmente por mutación y/o adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm susodicho.
La presente invención tiene más particularmente
por objeto cualquier secuencia de ADN, caracterizada porque
comprende como región codificante:
- -
- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEC ID nº 3, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 4, a saber, el ARNm codificado por la secuencia representada por SEC ID nº 3, o codificado por una secuencia que deriva de esta última, tal como se define aquí arriba, o
- -
- un fragmento de la secuencia complementaria susodicha, codificando este fragmento de secuencia un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 4, tal como se define aquí arriba, o
- -
- cualquier secuencia nucleotídica que deriva de la secuencia complementaria susodicha, o del fragmento de esta secuencia complementaria tal como se describe aquí arriba, especialmente por mutación y/o adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm susodicho.
Está claro que las secuencias representadas por
SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3, las secuencias complementarias, las
secuencias derivadas y los fragmentos de secuencias de la invención
mencionados aquí arriba, se deben de considerar como representados
en el sentido 5'\rightarrow3'.
Así, el primer nucleótido de una secuencia
complementaria en el sentido 5'\rightarrow3' tal como se describe
aquí arriba, es el complemento del último nucleótido de la
secuencia en el sentido 5'\rightarrow3' que codifica una CCR (o
un fragmento de CCR o una proteína derivada); el segundo nucleótido
de esta secuencia complementaria es el complemento del penúltimo
nucleótido de la secuencia que codifica una CCR; y así en lo
sucesivo, hasta el último nucleótido de dicha secuencia
complementaria, que es el complemento del primer nucleótido de la
secuencia que codifica una CCR.
El ARNm codificado por la secuencia
complementaria susodicha es tal que, cuando este ARNm se representa
en el sentido 5'\rightarrow3', su primer nucleótido corresponde
al último nucleótido de la secuencia que codifica una CCR, y por lo
tanto se híbrida con el último nucleótido del ARNm codificado por
esta última, mientras que su último nucleótido corresponde al primer
nucleótido de la secuencia que codifica una CCR, y por lo tanto se
híbrida con el primer nucleótido del ARNm codificado por esta
última.
Así, se entiende por ARNm antisentido, en lo
anterior y en lo siguiente, cualquier ARNm codificado por la
susodicha secuencia complementaria y representado en el sentido
inverso (3'\rightarrow5') del sentido en el que se representa el
ARNm codificado por la secuencia que codifica una CCR (o fragmento
de CCR o proteína derivada), siendo también este último ARNm
denominado ARNm sentido (5'\rightarrow3').
El término de ARN antisentido se refiere por lo
tanto a una secuencia de ARN complementaria de la secuencia de bases
del ARN mensajero, debiéndose comprender el término complementario
en el sentido de que cada base (o una mayoría de las bases) de la
secuencia antisentido (leída en el sentido 3'\rightarrow5') es
capaz de emparejarse con las bases correspondientes (G con C, A con
U) del ARN mensajero (secuencia leída en el sentido
5'\rightarrow3').
La estrategia de los ARN antisentido, en el
ámbito de la presente invención, es un enfoque molecular
particularmente adaptado con el objetivo de modular los porcentajes
de ligninas en las plantas. El ARN antisentido es un ARN producido
mediante transcripción de la hebra de ADN no codificante (hebra no
sentido).
Esta estrategia antisentido se describe más
particularmente en la patente europea nº 240.208.
Se piensa que la inhibición de la síntesis de una
proteína según la estrategia antisentido, en este caso de la CCR, es
la consecuencia de la formación de un par entre los dos ARN
complementarios (sentido y antisentido), impidiendo así la
producción de la proteína. Sin embargo, el mecanismo sigue siendo
oscuro. El complejo ARN-ARN puede interferir con
una transcripción posterior, o bien con la maduración, el
transporte o la traducción, o también puede conducir a una
degradación del ARNm.
Es posible igualmente una combinación de estos
efectos.
La invención se refiere igualmente a cualquier
ARNm codificado por una secuencia de ADN según la invención, y más
particularmente:
- -
- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEC ID nº 1, o codificado por un fragmento o una secuencia derivada, tales como se definen aquí arriba, siendo dicho ARNm susceptible de codificar la CCR presente en la alfalfa, tal como se representa por SEC ID nº 2, o un fragmento de esta CCR o una proteína derivada, tales como se definen aquí arriba,
- -
- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEC ID nº 3, o codificado por un fragmento o una secuencia derivada tales como se describen aquí arriba, siendo dicho ARNm susceptible de codificar la CCR presente en el maíz, tal como se representa por SEC ID nº 4, o un fragmento de esta CCR o una proteína derivada, tales como se describen aquí arriba.
La invención tiene igualmente por objeto
cualquier ARNm antisentido, tal como se define aquí arriba,
caracterizado porque comprende nucleótidos complementarios de la
totalidad o de sólo una parte de los nucleótidos que constituyen un
ARNm tal como se describe aquí arriba según la invención, siendo
dicho ARNm antisentido susceptible de hibridarse (o de emparejarse)
con este último.
Con este fin, la invención se refiere más
particularmente a los ARNm antisentido codificados por secuencias de
ADN según la invención, que comprenden por lo menos una región de
50 bases homólogas a las de una región de las secuencias
complementarias de las secuencias de ADN susodichas de la
invención.
No hay límite superior de tamaño para las
secuencias de ADN que codifican un ARN antisentido según la
invención; pueden ser tan largas como las del mensajero normalmente
producido en las células, o de hecho tan largas como la secuencia de
ADN genómico que codifica el ARNm de la CCR.
Ventajosamente, tales secuencias de ADN que
codifican un ARN antisentido según la invención comprenden entre
aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 pares de bases.
La invención tiene más particularmente por objeto
cualquier secuencia antisentido que comprende uno (o varios) ARNm
antisentido tal(es) como se describe(n) aquí arriba,
o fragmento(s) de este(estos) ARNm antisentido, y una
(o varias) secuencia(s) que corresponden a uno (o varios)
dominio(s) catalítico(s) de una ribozima.
Con este fin, la invención se refiere más
particularmente a cualquier secuencia antisentido tal como se
describe aquí arriba, que comprende el dominio catalítico de una
ribozima flanqueado a ambos lados por brazos de aproximadamente 8
bases complementarias de las secuencias que bordean un motivo GUX
(X representando C, U o A) comprendidas en uno de los ARNm de la
invención descritos aquí arriba (también denominados ARN dianas)
(Haseloff J., y Gerlach W. L., 1988, Nature, 334:
585-591).
La invención se refiere igualmente a cualquier
secuencia de ADN susceptible de codificar una secuencia antisentido,
tal como se describe aquí arriba, que comprende por lo menos un
dominio catalítico de una ribozima enlazado a uno o varios ARNm
antisentido de la invención, o fragmento(s) de ARNm
antisentido (ventajosamente, fragmentos de aproximadamente 8 bases,
tales como se describen aquí arriba).
La invención tiene más particularmente por
objeto:
- -
- cualquier ARNm antisentido, tal como se describe aquí arriba, caracterizado porque es codificado por la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEC ID nº 1, siendo dicho ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEC ID nº 1,
- -
- cualquier ARNm antisentido, tal como se describe aquí arriba, caracterizado porque es codificado por la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEC ID nº 3, siendo dicho ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEC ID nº 3.
La invención se refiere igualmente a los
polipéptidos recombinantes codificados por las secuencias de ADN de
la invención, presentando dichos polipéptidos recombinantes una
actividad enzimática equivalente a la de las CCR en las plantas, y
más particularmente las CCR recombinantes codificadas por las
secuencias representadas por SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3, o por
secuencias que derivan de estas últimas según la invención.
La invención tiene más particularmente por objeto
los polipéptidos recombinantes, y especialmente las CCR
recombinantes, tales como los obtenidos mediante transformación de
células vegetales integrando de manera estable en su genoma una
secuencia nucleotídica recombinante tal como se define en lo
siguiente, que contiene una secuencia de ADN según la invención,
especialmente con la ayuda de un vector tal como se describe a
continuación.
Por la expresión "polipéptidos
recombinantes", se entiende cualquier molécula que posee una
cadena polipeptídica susceptible de ser producida mediante
ingeniería genética, por medio de una fase de transcripción del ADN
del gen correspondiente, lo que lleva a la obtención de ARN que, a
continuación, se transforma en ARNm (mediante supresión de los
intrones), siendo después este último traducido por los ribosomas,
en forma de proteínas, efectuándose el conjunto bajo control de los
elementos de regulación apropiados, en el interior de una célula
hospedante. En consecuencia, la expresión "polipéptidos
recombinantes" utilizada no excluye la posibilidad de que dichos
polipéptidos comprendan otros agrupamientos, tales como los
agrupamientos glicosilados.
Por supuesto, el término "recombinante"
indica que el polipéptido se ha producido mediante ingeniería
genética, porque resulta de la expresión, en un hospedante celular
apropiado, de la secuencia nucleotídica correspondiente que se ha
introducido anteriormente en un vector de expresión utilizado para
transformar dicho hospedante celular. Sin embargo, este término
"recombinante" no excluye la posibilidad de que el polipéptido
se produzca mediante un procedimiento diferente, por ejemplo
mediante síntesis química clásica según los métodos conocidos
utilizados para la síntesis de proteínas, o mediante ruptura
proteolítica de moléculas de mayor tamaño.
La invención se refiere más particularmente a la
CCR tal como se presenta en las células de alfalfa y representada
por SEC ID nº 2, o la CCR tal como se presenta en las células de
maíz y representada por SEC ID nº 4, siendo dichas CCR las
obtenidas en forma esencialmente pura, mediante extracción y
purificación, a partir de alfalfa o de maíz, o cualquier proteína
derivada de estas últimas, especialmente por adición, y/o
supresión, y/o sustitución de uno o varios aminoácidos, o cualquier
fragmento que proviene de dichas CCR o de sus secuencias derivadas,
siendo dichos fragmentos y secuencias derivadas susceptibles de
tener una actividad enzimática equivalente a la de las CCR
susodichas.
La invención tiene igualmente por objeto las
secuencias nucleotídicas que codifican la CCR representada por SEC
ID nº 2 o SEC ID nº 4, o cualquier secuencia derivada o fragmento de
estas últimas, tales como se definen aquí arriba, estando dichas
secuencias nucleotídicas caracterizadas porque corresponden a todo
o parte de las secuencias representadas por SEC ID nº 1 o SEC ID nº
3, respectivamente, o a cualquier secuencia derivada de estas
últimas mediante degeneración del código genético, y siendo sin
embargo susceptibles de codificar las CCR o secuencia derivada o
fragmento de estas últimas, tales como se definen aquí arriba.
La invención se refiere igualmente a los
complejos formados entre los ARNm antisentido, tales como se
describen aquí arriba, y los ARNm según la invención, susceptibles
de codificar todo o parte de una CCR en las plantas.
La invención tiene más particularmente por objeto
el complejo formado entre el ARNm codificado por la secuencia SEC ID
nº 1 y el ARNm antisentido codificado por la secuencia
complementaria de la secuencia SEC ID nº 1, así como el complejo
formado entre el ARNm codificado por la secuencia SEC ID nº 3 y el
ARNm antisentido codificado por la secuencia complementaria de la
secuencia SEC ID nº 3.
La invención tiene más particularmente por objeto
cualquier secuencia nucleotídica recombinante (o ADN recombinante),
caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de ADN
según la invención, elegida entre las descritas aquí arriba, siendo
dicha secuencia de ADN insertada en una secuencia heteróloga.
La invención se refiere más particularmente a
cualquier secuencia nucleotídica recombinante tal como se describe
aquí arriba, que comprende, como región codificante, la secuencia
nucleotídica representada por SEC ID nº 1, o por SEC ID nº 3, o
cualquier fragmento o una secuencia nucleotídica derivada de estas
últimas, tales como se definen aquí arriba, siendo dichas secuencias
nucleotídicas o dicho fragmento insertados en una secuencia
heteróloga, y siendo susceptibles de codificar la CCR representada
por SEC ID nº 2, o por SEC ID nº 4, respectivamente, o un
fragmento de estas CCR, o una proteína derivada de estas últimas,
tales como se definen aquí arriba.
La invención se refiere más particularmente aún a
cualquier secuencia nucleotídica recombinante que comprende, como
región codificante, una secuencia nucleotídica complementaria de la
representada por SEC ID nº 1, o por SEC ID nº 3, o cualquier
fragmento o cualquier secuencia nucleotídica derivada de esta
secuencia complementaria, tales como se definen aquí arriba, siendo
dichas secuencias complementarias o dicho fragmento insertados en
una secuencia heteróloga, y siendo susceptibles de codificar un
ARNm antisentido capaz de hibridarse con todo o parte del ARNm que
codifica una CCR en las plantas, y más particularmente con todo o
parte del ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 2, o
por SEC ID nº 4.
Los ADN recombinantes según la invención se
caracterizan aún más porque comprenden los elementos necesarios para
regular la expresión de la secuencia nucleotídica que codifica una
CCR, o de su secuencia complementaria que codifica un ARNm
antisentido según la invención, especialmente un promotor y un
terminador de la transcripción de estas secuencias.
Entre los diferentes promotores susceptibles de
ser utilizados en las construcciones de ADN recombinantes según la
invención, se pueden citar:
- -
- el promotor endógeno que controla la expresión de la CCR en la planta, especialmente el promotor situado en dirección 5' de la secuencia de ADN representada por SEC ID nº 5 que codifica, en el eucalipto, la CCR representada por SEC ID nº 6, o
- -
- promotores de tipo constitutivo con fuerte expresión, ejemplos: ^{35}S CAMV (descrito en Benfey et al. (1990), EMBO J., 9 (6), 1677-1684), EF1\alpha (promotor del gen de un factor de alargamiento en la síntesis proteica, descrito por Curie et al. (1991), Nucl. Acids. Res., 19, 1305-1310),
- -
- promotores de tipo específico con expresión particular en tejidos individuales, ejemplos: promotor CAD (descrito por Feuillet C. (1993), tesis de la Universidad de Toulouse III), promotor GRP 1-8 (descrito por Keller y Baumgartner, (1991), Plant Cell., 3, 1051-1061) con expresión en tejidos vasculares específicos.
La invención se refiere igualmente a cualquier
secuencia nucleotídica recombinante tal como se describe aquí
arriba, y que comprende igualmente como región codificante por lo
menos una secuencia nucleotídica que codifica todo o parte de un
ARNm que codifica una enzima distinta a la CCR, que se encuentra
implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las
plantas, especialmente el ARNm que codifica el alcohol cinamílico
deshidrogenasa (CAD), o que comprende igualmente como región
codificante por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica
todo o parte de un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con
el ARNm susodicho, especialmente con el ARNm que codifica la
CAD.
Las secuencias nucleotídicas recombinantes
susodichas de la invención se obtienen ventajosamente a partir de
vectores en los que se insertan las secuencias de ADN que codifican
una enzima necesaria para la biosíntesis de las ligninas en las
plantas.
Los vectores susodichos se digieren con la ayuda
de enzimas de restricción apropiadas, a fin de recuperar dichas
secuencias de ADN que están insertadas en ellos.
Después, estas secuencias se insertan en
dirección 3' de un promotor apropiado, y en dirección 5' de un
terminador apropiado de la expresión, en el seno de los ADN
recombinantes según la invención.
La invención se refiere más particularmente a los
ADN recombinantes que comprenden la secuencia representada por SEC
ID nº 1 o la representada por SEC ID nº 3, tales como se obtienen
mediante digestión de los vectores susodichos, recuperación de la
secuencia de ADN de la invención, e inserción de esta última en el
sentido 5'\rightarrow3', en el seno de una secuencia de ADN
heteróloga que comprende un promotor y un terminador de la
expresión de dicha secuencia.
La invención tiene igual y más particularmente
por objeto los ADN recombinantes que comprenden la secuencia
complementaria de la secuencia representada por SEC ID nº 1, o de
la representada por SEC ID nº 3, tales como se obtienen mediante
digestión de los vectores susodichos, recuperación de la secuencia
de ADN de la invención, e inserción de esta última en sentido
inverso, es decir, en el sentido 3'\rightarrow5', en el seno de
una secuencia de ADN heteróloga que comprende un promotor y un
terminador de la expresión de la secuencia complementaria.
A título de ejemplo de terminador utilizable en
tales construcciones, se puede citar el extremo 3' del gen de la
nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.
Así, de manera general, las secuencias
nucleotídicas recombinantes según la invención, que contienen una
secuencia de ADN que codifica una CCR (o fragmento de CCR o
proteína derivada), y/u otras enzimas necesarias para la biosíntesis
de las ligninas, se obtienen por recuperación de dicha secuencia de
ADN a partir de los vectores susodichos, e inserción de esta
secuencia en la secuencia heteróloga, mientras que las secuencias
nucleotídicas recombinantes, que contienen una secuencia de ADN que
codifica un ARNm antisentido según la invención, se obtienen por
recuperación de la secuencia de ADN susodicha e inserción en
sentido contrario de esta última en dicha secuencia heteróloga.
A título ilustrativo, se puede utilizar todo o
parte del ADN complementario (ADNc), representado por SEC ID nº 1 o
SEC ID nº 3, para la construcción de los ADN recombinantes
susodichos, o bien todo o parte del clon genómico que corresponde a
una CCR (que corresponde a los ADNc susodichos + eventuales
intrones). Este clon genómico se puede obtener utilizando los ADNc
como sondas para cribar un banco genómico, siendo este último
obtenido siguiendo el método descrito por Sambrook, Fritsch y
Maniatis, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, 1989.
La invención tiene igualmente por objeto
cualquier vector recombinante, utilizable para la transformación de
plantas, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica
recombinante elegida entre las descritas aquí arriba, según la
invención, integrada en uno de los sitios de su genoma no esenciales
para su replicación.
Entre los vectores recombinantes susodichos,
utilizables para la transformación de plantas, se pueden citar: los
vectores binarios derivados de pBIN 19 (Bevan et al.,
(1984), Nucl. Acids. Res., 12 (22),
8711-8721).
Se describen ejemplos de construcción de vectores
recombinantes según la invención en la siguiente descripción
detallada de la invención.
La presente invención tiene igualmente por objeto
un procedimiento de regulación de la biosíntesis de las ligninas en
las plantas, bien por disminución o bien por aumento de las
cantidades de ligninas producidas, con respecto a las cantidades
normales de ligninas en las plantas, comprendiendo dicho
procedimiento una etapa de transformación de células de estas
plantas con la ayuda de un vector que contiene:
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 1 o por SEC ID nº 3, o un fragmento de las secuencias nucleotídicas susodichas, codificando este fragmento un ARNm, codificando este ARNm un fragmento de una CCR en las plantas, presentando este fragmento de CCR una actividad enzimática equivalente a la de la CCR representada por SEC ID nº 2 o por SEC ID nº 4, o de una secuencia nucleotídica derivada de las secuencias nucleotídicas susodichas, o derivada del fragmento susodicho, especialmente por mutación y/o adición, y/o supresión, y/o sustitución de uno o varios nucleótidos, codificando esta secuencia derivada un ARNm, codificando este ARNm una proteína derivada que presenta una actividad enzimática equivalente a la de una por lo menos de las CCR susodichas, o
- -
- una secuencia nucleotídica complementaria de todo o parte de las secuencias nucleotídicas representadas por SEC ID nº 1 o por SEC ID nº 3 que codifican un ARNm, o del fragmento de estas secuencias, o de la secuencia derivada de estas últimas, tales como se definen aquí arriba, codificando esta secuencia complementaria un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con uno de los ARNm susodichos,
efectuándose dicha transformación
especialmente con la ayuda de un vector tal como se describe aquí
arriba.
La invención tiene más particularmente por objeto
un procedimiento de disminución de la cantidad de ligninas
producidas por biosíntesis en las plantas, efectuándose este
procedimiento por transformación del genoma de estas plantas,
incorporando en él:
- -
- por lo menos una secuencia de ADN según la invención tal como se describe aquí arriba, que codifica un ARNm antisentido susceptible de hibridarse con todo o parte del ARNm que codifica la CCR representada por SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4, o una proteína que deriva de estas últimas tal como se define aquí arriba,
- -
- y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica una enzima distinta a la CCR, que está implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, especialmente el ARNm que codifica la CAD,
realizándose dicha
transformación:
- -
- bien con la ayuda de un vector recombinante tal como se describe aquí arriba, que contiene una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR, o una proteína derivada, tal como se define aquí arriba, y, llegado el caso, que contiene una o varias secuencia(s) de ADN que codifican un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica una enzima distinta a la CCR tal como se define aquí arriba,
- -
- o bien con la ayuda de varios vectores recombinantes, de los cuales por lo menos uno contiene una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con el ARNm que codifica la CCR, o una proteína derivada, tal como se define aquí arriba, mientras que el(los) otro(s) vector(es) recombinante(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica una enzima distinta a la CCR, tal como se define aquí arriba.
Otro procedimiento de disminución de la cantidad
de ligninas producidas por biosíntesis en la plantas es el realizado
mediante transformación del genoma de estas plantas, incorporando
en él:
- -
- por lo menos una secuencia de ADN según la invención por SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen aquí arriba,
- -
- y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica todo o parte de una enzima distinta a la CCR, que se encuentra implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, especialmente una secuencia de ADN que codifica todo o parte de la CAD,
realizándose dicha
transformación:
- -
- bien con la ayuda de un vector recombinante tal como se describe aquí arriba, que contiene una secuencia de ADN según la invención susodicha, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen aquí arriba, y, llegado el caso, que contiene una o varias secuencia(s) de ADN que codifica(n) todo o parte de una enzima distinta a la CCR, tal como se define aquí arriba,
- -
- o bien con la ayuda de varios vectores recombinantes, de los cuales por lo menos uno contiene una secuencia de ADN según la invención susodicha, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen aquí arriba, mientras que el(los) otro(s) vector(es) recombinant(es) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica todo o parte de una enzima distinta a la CCR, tal como se define aquí arriba.
Este último método utiliza el mecanismo de
cosupresión. Se ha observado cosupresión cuando se han introducido
copias del gen endógeno en el genoma. Aunque el mecanismo de la
cosupresión no se conoce actualmente, una de las hipótesis más
frecuentemente adoptada es que la regulación negativa de la
expresión del gen vendría de la producción de una proporción pequeña
de ARN antisentido derivada de un transgen a través de una lectura
de la hebra "mala" del transgen (Grierson et al.,
Trends Biotech., 9: 122-123).
La invención tiene igualmente por objeto un
procedimiento de disminución de la cantidad de ligninas producidas
por biosíntesis en las plantas, realizándose este procedimiento por
transformación del genoma de esta plantas e incorporando en él una
secuencia de ADN, tal como se describe aquí arriba según la
invención, que codifica una secuencia antisentido que comprende uno
(o varios) dominio(s) catalítico(s) de una ribozima
enlazado(s) a uno (o varios) ARNm antisentido, o
fragmento(s) de ARNm antisentido de la invención,
realizándose dicha transformación con la ayuda de un vector
recombinante que comprende una secuencia nucleotídica recombinante
según la invención la cual contiene la secuencia de ADN
susodicha.
Es importante señalar que los métodos susodichos
permiten llegar a plantas transformadas que presentan niveles
diferentes de reducción de la actividad CCR (según el nivel de
inserción de la secuencia de ADN que codifica el ARNm antisentido,
el número de copias de esta secuencia de ADN integrada en el
genoma, etc.), y por lo tanto de los contenidos de ligninas.
\newpage
Por lo tanto, la elección de los transformantes
permitirá una modulación controlada de los contenidos de ligninas
compatible con un desarrollo normal de la planta.
De manera general, si se considera que el
contenido medio normal de ligninas de una planta varía entre
aproximadamente 15% y aproximadamente 35% en peso de materia seca,
la reducción del contenido de ligninas que resulta de la
realización de uno de los procedimientos susodichos es
ventajosamente tal que las plantas así transformadas presentan un
contenido medio de ligninas que varía de aproximadamente 10% y
aproximadamente 30%, o también de aproximadamente 12% y
aproximadamente 32%.
A título ilustrativo, el contenido de ligninas de
una planta se puede medir según una variante del método de Johnson
et al., (1961), T.A.P.P.I., 44,
793-798, que se describe detalladamente en Alibert y
Boudet (1979), Physiol., Veg., 17 (1),
67-74, y cuyas principales etapas son las
siguientes: tras obtener un polvo de alcohol bencénico, que
contiene las ligninas del material vegetal, las ligninas se
solubilizan con bromuro de acetilo y se miden en función de su
absorción en el ultravioleta.
La invención se dirige más particularmente a la
aplicación de los procedimientos susodichos de disminución de los
contenidos de ligninas en las plantas, a la obtención de plantas
forrajeras transformadas genéticamente, que presentan contenidos de
ligninas reducidos con respecto a los contenidos normales de
ligninas en estas plantas, y cuya digestibilidad se mejora así con
respecto a estas mismas plantas no transformadas.
Entre las principales plantas forrajeras
susceptibles de ser transformadas en el ámbito de la presente
invención, se pueden citar: la alfalfa, la festuca, el maíz
destinado al ensilado, etc.
La invención se refiere igualmente a la
aplicación de los procedimientos susodichos de disminución de los
contenidos de ligninas en las plantas, a la obtención de plantas, y
más particularmente de árboles, transformados genéticamente, que
presentan contenidos de ligninas reducidos, con respecto a los
contenidos normales de ligninas en estas plantas, siendo estas
plantas o árboles particularmente ventajosos para utilizar en el
ámbito de la producción de pasta para papel.
Un tercer campo potencial de aplicación de los
procedimientos susodichos de regulación negativa de la expresión del
gen de la CCR se refiere a la estimulación del crecimiento de las
plantas transformadas. Diversos argumentos subrayan (Sauter y
Kende, 1992, Plant and Cell Physiology, 33 (8): 1089) que
una lignificación precoz y rápida es un freno al crecimiento celular
y, por lo tanto, al crecimiento de los vegetales. Así, el uso de
los procedimientos susodichos permite, para las plantas así
transformadas con lignificación reducida, un mejor crecimiento y
por lo tanto mejores rendimientos.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de aumento de la cantidad de ligninas producidas por
biosíntesis en las plantas, efectuándose este procedimiento por
transformación del genoma de estas plantas, e incorporando en
él:
- -
- por lo menos una secuencia de ADN según la invención, representada por SEC ID nº 1º SEC ID nº 3, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen aquí arriba,
- -
- y, llegado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica todo o parte de una enzima distinta a la CCR, que está implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, especialmente una secuencia de ADN que codifica todo o parte de la CAD,
realizándose dicha
transformación:
- -
- bien con la ayuda de un vector recombinante tal como se describe aquí arriba, que contiene la secuencia de ADN según la invención susodicha, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen aquí arriba, y, llegado el caso, que contiene una o varias secuencia(s) de ADN que codifica(n) todo o parte de una enzima distinta a la CCR, tal como se define aquí arriba,
- -
- o bien con la ayuda de varios vectores recombinantes, de los cuales por lo menos uno contiene una secuencia de ADN según la invención susodicha, o un fragmento o una secuencia derivada de esta última, tales como se definen aquí arriba, mientras que el(los) otro(s) vector(es) recombinante(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica todo o parte de una enzima distinta a la CCR, tal como se define aquí arriba.
De manera general, siempre considerando que el
contenido medio normal de ligninas de una planta varía entre
aproximadamente 15% y aproximadamente 35% en peso de materia seca,
el aumento del contenido de ligninas que resulta de la realización
del procedimiento susodicho es ventajosamente tal que las plantas
así transformadas presentan un contenido medio de ligninas que varía
entre aproximadamente 20% y aproximadamente 40%, o también entre
aproximadamente 18% y aproximadamente 38%.
La invención se refiere más particularmente a la
aplicación del procedimiento susodicho para aumentar los contenidos
de ligninas en las plantas (también denominado procedimiento de
sobre-expresión del gen de la CCR), para obtener
plantas transformadas genéticamente, que presentan contenidos de
ligninas aumentados con respecto a los contenidos normales de
ligninas en estas plantas, y cuyas propiedades de resistencia a
ataques del medioambiente, especialmente a ataques parasitarios, se
encuentran así mejoradas con respecto a estas misma plantas no
transformadas. Es particularmente ventajoso, en este último caso,
utilizar en asociación con el gen CCR, o una secuencia derivada, en
los vectores susodichos, promotores específicos particularmente
expresados en los tejidos de superficie y/o en respuesta al
daño.
Por otra parte, la invención se refiere
igualmente a la aplicación del procedimiento susodicho de
sobre-expresión del gen de la CCR para mejorar el
crecimiento de las plantas así transformadas genéticamente,
especialmente en algunos campos tales como la horticultura o la
arboricultura, en los que es deseable obtener plantas de dimensión
reducida.
Finalmente, los ciclos bencénicos de la lignina
tienen una energía intraseca mayor que las cadenas alifáticas de
los residuos de glucosa de la celulosa. Así, el aumento de la
proporción de ligninas en los vegetales utilizados como
combustibles, según el procedimiento susodicho de la invención,
permite mejorar el potencial energético de estos vegetales
combustibles así transformados.
En los dos casos de regulación negativa o de
sobre-expresión de la CCR, se puede prever
perfectamente que la modulación de esta actividad tiene
repercusiones sobre el contenido de ligninas de las plantas
transformadas. En efecto, la CCR, cuyo nivel de actividad es muy
bajo en la planta, parece constituir la enzima reguladora de la
síntesis de las ligninas.
Con respecto a las técnicas de transformación
utilizadas para la realización de uno de los procedimientos
descritos aquí arriba de la invención, se recurrirá ventajosamente
a las técnicas siguientes:
- A)
- La tecnología de transformación mediante el intermedio del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, descrita por Bevan (1984) Nucleic Acid Research, 12: 8711-8721. Se refiere esencialmente al método de cocultivo, y hace intervenir una cotransformación con un gen de selección para poder identificar los transformantes.
Es particularmente aplicable a las
dicotiledóneas, por ej.: tabaco, alfalfa, colza.
- B)
- La técnica de transferencia directa de genes mediante biolística, descrita en detalle por (Zumbrum et al., 1989, Technique 1, 204-216; Sanford et al., 1991, Technique 3, 3-16).
Esta técnica implica la asociación del ADN
recombinante según la invención con micropartículas de oro o de
wolframio que son propulsadas con la ayuda de un cañón de
partículas sobre el tejido a transformar. Se aplicará
particularmente para la transformación de especies refractarias a
las agrobacterias.
En los dos casos susodichos, la verificación de
la presencia del ADN recombinante según la invención se realizará
mediante experimentos de hibridación de tipo southern y de
amplificación génica (reacción en cadena de polimerasa; polymerase
chain reaction, en inglés), con la ayuda de sondas y de cebadores
oligonucleotídicos que provienen especialmente de la secuencia SEC
ID nº 1 o SEC ID nº 3.
La invención se refiere igualmente a las células
de plantas transformadas mediante un vector según la invención,
especialmente mediante las técnicas descritas aquí arriba, y que
comprenden una secuencia de ADN según la invención integrada de
manera estable en sus genomas.
La invención se refiere igualmente a las plantas
transformadas tales como se obtienen mediante cultivo de las células
transformadas susodichas.
Después, las plantas transformadas se pueden
reproducir por vía sexual o por vía vegetativa in vitro o
in natura.
La invención tiene igualmente por objeto los
fragmentos de plantas, especialmente frutos, semillas, polen,
transformados mediante incorporación en sus genomas de una
secuencia de ADN según la invención, con la ayuda de los vectores
recombinantes susodichos.
La invención se refiere igualmente a los
anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos recombinantes de la
invención, y más particularmente los dirigidos contra las CCR
recombinantes susodichas.
Tales anticuerpos se pueden obtener mediante
inmunización de un animal con estos polipéptidos, seguido de la
recuperación de los anticuerpos formados.
Está claro que esta producción no se limita a los
anticuerpos policlonales.
Se aplica también a cualquier anticuerpo
monoclonal producido mediante cualquier hibridoma susceptible de ser
formado, mediante métodos clásicos, a partir de las células
pancreáticas de un animal, especialmente de ratón o de rata,
inmunizado contra uno de los polipéptidos purificados de la
invención, por una parte, y de las células de un mieloma apropiado,
por otra parte, y de ser seleccionado por su capacidad para
producir anticuerpos monoclonales que reconocen el polipéptido
susodicho, inicialmente utilizado para la inmunización de los
animales.
La invención se dirige igualmente a la
utilización de los anticuerpos susodichos dirigidos contra los
polipéptidos recombinantes de la invención, para la realización de
un método de detección o de medición de las CCR en las plantas, a
partir de muestras tomadas de estas últimas.
Es conveniente precisar que se excluyen de las
secuencias nucleotídicas de la invención y de sus utilizaciones
susodichas, las secuencias nucleotídicas representadas por SEC ID
nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 y SEC ID nº 11, que codifican,
respectivamente, la CCR de eucalipto representada por SEC ID nº 6,
la CCR de chopo representada por SEC ID nº 8, la CCR de festuca
representada por SEC ID nº 10, y la CCR de tabaco representada por
SEC ID nº 12, así como la secuencia representada por SEC ID nº 13
que codifica la proteína representada por SEC ID nº 14 derivada de
la susodicha CCR de eucalipto.
Además, se excluyen de las secuencias
nucleotídicas de la invención y de sus utilizaciones susodichas, las
secuencias complementarias de las secuencias nucleotídicas SEC ID
nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11 y SEC ID nº 13, así
como los fragmentos o secuencias derivadas de estas secuencias
nucleotídicas o de sus secuencias complementarias, en la medida en
la que estos fragmentos y secuencias derivadas son idénticos a los
fragmentos y secuencias derivadas, tales como se definen aquí
arriba, de las secuencias nucleotídicas representadas por SEC ID nº
1 y SEC ID nº 3, o de sus secuencias complementarias.
Se excluyen igualmente del ámbito de la presente
invención:
- -
- los ARNm codificados por las secuencias de ADN representadas por SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11 y SEC ID nº 13, o codificados por un fragmento o una secuencia derivada de estas secuencias de ADN, en la medida en la que este fragmento o secuencia derivada son idénticos a los fragmentos y secuencias derivadas, tales como se definen aquí arriba, de las secuencias representadas por SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3,
- -
- los ARNm antisentido constituidos de nucleótidos complementarios de los ARNm susodichos,
- -
- los polipéptidos representados por SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10, SEC ID nº 12 y SEC ID nº 14, así como cualquier fragmento o secuencia derivada de los polipéptidos susodichos, en el medida en la que este fragmento o secuencia derivada son idénticos a los fragmentos y secuencia derivada, tales como se definen aquí arriba, de las secuencias polipeptídicas representadas por SEC ID nº 2 y SEC ID nº 4.
La invención se detallará adicionalmente en la
siguiente descripción de obtención de la CCR en forma purificada en
el eucalipto, y del ADNc que codifica la CCR de eucalipto, de
alfalfa y del maíz.
La CCR ha sido el objeto de un número limitado de
estudios. Entre algunas de las publicaciones a la que se hace
referencia, se pueden citar:
- Wengenmayer H., Ebel J., Grisebach H., 1976 - Enzymatic synthesis of lignin precursors, purification and properties of a cinnamoyl CoA: NaDPH reductase from cell suspension cultures from soybean (Glycine max), Eur. J. Biochem., 65: 529-536.
- Luderitz T., Grisebach H., 1981 - Enzymatic synthesis of lignin precursors, comparison of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamyl alcohol dehydrogenase: NADP dehydrogenase from spruce (Picea abies L.) and soybean (Glycine max L.), Eur. J. Biochem., 119: 115-127.
- Sarni F.,
Grand C., Boudet A.M., 1984 - Purification and
properties of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamyl alcohol
dehydrogenase from poplar stems (Populus x euramericana),
Eur. J. Biochem.,
\hbox{ 139 : 259-265.}
El trabajo descrito a continuación ha contribuido
en la definición de un protocolo de purificación original, simple y
rápido de la CCR de eucalipto. Este protocolo es igualmente más
eficaz que los descritos anteriormente en la bibliografía. En
efecto, ha permitido, por primera vez, la obtención de cantidades
de enzima purificada hasta homogeneidad, suficientes para obtener
secuencias peptídicas internas y llevar a término la clonación del
ADNc correspondiente.
Todas las etapas de purificación de la CCR se han
realizado a 4ºC.
El material vegetal se ha obtenido
"raspando" una fracción de tejido enriquecida en xilema de
ramas de Eucalyptus gunii de 5 años.
Se han reducido a polvo 300 g de xilema,
anteriormente congelado en nitrógeno líquido, con la ayuda de un
molino de café. El material molido así obtenido se homogeneizó en un
litro de tampón de extracción (100 mM de Tris-HCl,
pH 7,6, 2% de PEG 6000, 5 mM de DTT, 2% de PVPP), se filtró sobre
dos capas de Miracloth, y se llevó hasta 30% de saturación en
sulfato de amonio. Después de una centrifugación de 30 minutos a
15000 xg, el sedimento obtenido se resuspende en 60 ml de tampón 1
[20 mM de Tris-HCl pH 7,5, 5 mM de DTT
(ditiotreitol), 5% de etilenglicol]. El extracto así obtenido se
"aclara" mediante una centrifugación de 15 min a 10000 xg, y
después se desala haciéndola pasar sobre una Sephadex G25
equilibrada en el tampón 1.
El extracto bruto desalado se deposita sobre una
columna de afinidad "Red Sepharose" (1,5 X 19 cm, Pharmacia),
equilibrada en el tampón 1. Después de un primer aclarado de la
columna mediante 50 ml de tampón 1, las proteínas se eluyen
mediante un gradiente lineal de Tris de 20 mM hasta 1,5 M de
Tris-HCl pH 7,5, que contiene 5 mM de DTT, 5% de
etilenglicol. El volumen total del gradiente es de 200 ml y el
caudal de 36 ml/h, las fracciones que presentan una actividad CCR
se agrupan y se desalan haciéndolas pasar sobre una columna de
Sephadex G25, equilibrada en el tampón 1.
Las fracciones así agrupadas y desaladas se
cromatografían sobre una columna de intercambio de aniones MonoQ (HR
5/5, Pharmacia). La elución de las proteínas se efectúa mediante
aplicación de un gradiente lineal de 20 hasta 300 mM de
Tris-HCl pH 7,5, que contiene 5% de etilenglicol y 5
mM de DTT. El volumen total del gradiente es de 50 ml y el caudal
de 1 ml/min. Como en la etapa anterior, las fracciones que
contienen la enzima CCR activa se agrupan y se desalan, pero en
este caso el tampón para equilibrar las columnas de Sephadex G25 es
un tampón de fosfato de 20 mM pH 7,6, que contiene 5 mM de DTT
(tampón 2).
El grupo de fracciones CCR así obtenido se
deposita sobre una columna Mimetic Red 2 A6XL (ACL, Cambridge). La
columna se lava previamente con 30 ml de tampón 2, que contiene 8 mM
de NAD. Este lavado tiene por objeto eliminar las enzimas que
funcionan específicamente con el NAD como cofactor, tal como la
malato deshidrogenasa, que se copurifica con la CCR en las etapas
anteriores. La elución específica de la CCR se obtiene por
aplicación de un gradiente (15 ml) de NADP 0-8 mM
en el tampón 2. Las fracciones que contienen la CCR pura y activa
se conservan a -80ºC tras la adición de un estabilizador
(etilenglicol, con una concentración final de 5%).
La enzima purificada así obtenida presenta una
actividad específica de 451 nKat/mg de proteína,
utilizando el feruloil-CoA como sustrato. El
rendimiento obtenido (36 \mug de proteína pura por 300 g de
material vegetal de partida) no refleja la proporción de CCR in
planta, y, en efecto, en un esfuerzo importante para eliminar
el máximo de contaminantes en cada etapa de purificación, sólo las
fracciones que presentan una muy fuerte actividad CCR se tratan en
la etapa siguiente. El factor de purificación obtenido mediante este
protocolo es de 282.
La CCR de eucalipto es un monómero de 38 kD, como
demuestran los resultados convergentes obtenidos para el tamaño de
la enzima nativa, mediante cromatografía de exclusión sobre
Superose 6 (Pharmacia), y para el tamaño de la subunidad monómera,
sobre gel de electroforesis desnaturalizante. El punto
isoeléctrico, estimado mediante cromatografía sobre MonoP
(Pharmacia), es próximo a 7.
La búsqueda del pH y del tampón óptimos indica
que la medida de la actividad CCR, tal como se ha descrito
inicialmente (Luderitz y Grisebach, 1981), se adapta perfectamente
a la medida de la actividad CCR de eucalipto (tampón de fosfato de
100 mM, pH 6,25).
La pureza de la CCR, presente en el estado de una
banda única sobre gel de electroforesis monodimensional (SDS PAGE),
se ha confirmado mediante la obtención de una sola mancha
("spot") tras electroforesis bidimensional y tinción con
plata.
A fin de evitar cualquier problema eventual de
contaminación residual no detectable, la enzima pura se ha sometido
a una electroforesis preparativa en condiciones
semi-desnaturalizantes, y se ha digerido in
situ en el gel. La digestión se ha realizado con la ayuda de
endolisina C, que corta específicamente las proteínas después de
los restos de lisina, permitiendo la obtención de péptidos
relativamente largos. Los péptidos resultantes de la digestión se
han separado en fase inversa sobre HPLC, y algunos de ellos se han
secuenciado con la ayuda de un microsecuenciador de proteínas
(Applied Biosystems 470). Las secuencias de estos péptidos internos
figuran a continuación:
representando X cualquier
aminoácido
El ADNc que codifica la CCR se ha obtenido
mediante detección sistemática con la ayuda de oligonucleótidos de
un banco de ADN construido en el fago \lambda ZAPII (vector
comercialmente disponible, Stratagène) a partir de mensajeros
extraídos de xilema de Eucalyptus gunii. Se han identificado
600.000 fagos con la ayuda de un grupo de oligonucleótidos
degenerados marcados en el extremo 3' con fósforo 32, con la ayuda
de una transferasa terminal. Las secuencias de los oligonucleótidos
utilizados para la detección sistemática se han determinado a
partir de las secuencias peptídicas internas susodichas. Puesto que
estos péptidos se generaron mediante corte con endolisina C, se ha
añadido una lisina en primera posición para permitir la elaboración
de oligonucleótidos con baja degeneración. En efecto, este
aminoácido, que se puede codificar tan sólo por dos codones,
pertenece a los aminoácidos cuyo código es el menos degenerado y,
por consiguiente, es perfectamente adecuado para la elaboración de
oligonucleótidos a partir de secuencias peptídicas.
A continuación se indican las secuencias de los
oligonucleótidos utilizados para la detección sistemática del banco
de ADNc de eucalipto, que derivan de los aminoácidos subrayados (I
= inosina):
Las condiciones de hibridación utilizadas para la
detección sistemática son las siguientes: la
pre-hibridación se efectúa durante 6 a 7 horas en
5XSSPE, 0,25% de polvo de leche desnatada, 0,05% de SDS
(dodecilsulfato de sodio), a 42ºC. La hibridación se realiza en
esta misma disolución, en presencia de 4 oligonucleótidos marcados
en 3' mediante ddATP\alpha^{32}P, durante 24 horas a 42ºC. Al
final de estas 24 horas de hibridación, los filtros se lavan tres
veces durante 15 minutos en 2XSSC, 0,1% de SDS, y después se ponen
en contacto con una película autoradiográfica durante 24 horas a
-80ºC. Los fagos que se hibridan con el grupo de oligonucleótidos
se han purificado mediante 2 ciclos suplementarios de detección
sistemática ("placa de purificación"). Una vez purificados, los
seis clones positivos se han ensayado con cada uno de los
oligonucleótidos tomados independientemente. Un fago reaccionó
positivamente con los 4 oligonucleótidos, y se trató a fin de
"cortar" el plásmido Bluescript recombinante siguiendo las
indicaciones del fabricante (Stratagène). El mapa de restricción
del inserto (que codifica la CCR), contenido en este plásmido, se
esquematiza en la Figura 1.
La secuencia de aminoácidos (representada por SEC
ID nº 6), deducida de la secuencia nucleotídica (representada por
SEC ID nº 5), codifica una proteína de 335 aminoácidos cuyo peso
molecular es de 36,5 kD, y el punto isoeléctrico es de
aproximadamente 5,8. Es importante subrayar que todas las secuencias
peptídicas obtenidas a partir de la CCR purificada se reencuentran
en la secuencia peptídica deducida de la secuencia nucleotídica del
ADNc.
Se han efectuado búsquedas de homologías con
clones ya existentes, utilizando los programas BLAST y FASTA en
todos los bancos proteicos y nucleicos disponibles. Se ha
encontrado una homología significativa con otra reductasa del
metabolismo de los compuestos fenólicos, la dihidroflavonol
reductasa (DFR). La identidad es de aproximadamente 40% y la
similitud cerca de 20% entre la secuencia peptídica deducida del
ADNc de la CCR y las secuencias de las diversas dihidroflavonol
reductasa catalogadas en los bancos, lo que confirma que el clon
identificado es diferente de un clon que codifica una DFR.
Para ir más allá en la identificación del ADNc de
la CCR, la proteína recombinante se ha producido en E. Coli,
y se ha buscado su actividad enzimática. A continuación se
describen los detalles experimentales de este enfoque.
A fin de poder clonar el ADNc en el vector de
expresión pT7-7 (disponible comercialmente), bajo
control del promotor de la T7 polimerasa, se ha debido introducir
un sitio Ndel en el ATG del ADNc. Esto se ha realizado con la ayuda
de una Taq polimerasa durante una reacción de amplificación génica
mediante PCR (reacción en cadena de polimerasa (Polymerase Chain
reaction, en inglés)) entre un oligonucleótido mutado y un cebador
comercial, T7, situado sobre Bluescript en dirección 3' del extremo
3' del ADNc. El producto de amplificación obtenido se digiere
mediante Kpnl; después, este sitio se repara con la ayuda del
fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, antes de someter el
fragmento a una digestión mediante Ndel; después, el fragmento
obtenido, que contiene un sitio Ndel en 5' y un extremo libre en
3', se inserta con la ayuda de una ADN T4 ligasa en el vector
pT7-7, previamente abierto mediante Ndel y Smal.
A continuación se indica la secuencia del
oligonucleótido mutado susodicho.
Las bases subrayadas y en itálica han sido
modificadas con respecto a la secuencia inicial, permitiendo la
creación de un sitio Ndel (CATATG):
5'GGCAATCCC CAT ATGCCCGTCGACGC3'
La construcción así obtenida se introduce en la
cepa BL21 de E. coli (disponible comercialmente), que lleva
sobre su cromosoma el gen de la T7 polimerasa bajo control del
promotor lac UV5, promotor inducible mediante IPTG. El cultivo
recombinante se cultiva a 37ºC hasta obtener una DO medida de 1 a
600 nm; después, se induce la producción de la CCR mediante adición
de IPTG (0,25% final) en el medio de cultivo. Se toman muestras a
diferentes tiempos después de la inducción, y las células se lisan
según el protocolo descrito por Grima-Pettenati
et al. (1993). Después de la centrifugación, el sobrenadante
que contiene las proteínas solubles se utiliza para medir la
actividad CCR y para visualizar la producción de CCR, después de la
electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Se observa la
aparición de un polipéptido de aproximadamente 38 kD cuya intensidad
crece con el tiempo post-inducción, y que no existe
en los testigos negativos (cepa BL21 que contiene sólo el vector
pT7-7 sin inserto). Además, la prueba final de la
identidad del clon de CCR se proporciona mediante la medida de una
actividad CCR (aproximadamente 7 nKat/ml de cultivo después de 3 h
de inducción a 37ºC) en los extractos proteicos que provienen de
las cepas BL21 que contienen solamente el pT7-7 +
ADNc CCR.
El vector denominado pEUCCR (representado en la
figura 2), que comprende la secuencia representada por SEC ID nº 5
clonada en el vector Bluescript, se ha depositado en cultivo en
células de E. coli DH5\alpha en la Colección Nacional de
Cultivo de Micro-organismos (CNCM) del Instituto
Pasteur en París (Francia), el 17 de marzo de 1994, con el nº
I-1405.
Figura 1: mapa de restricción del ADNc que
codifica la CCR de eucalipto.
Figura 2: representación esquemática del plásmido
pEUCCR que contiene la secuencia representada mediante SEC ID nº 5
(e identificada mediante CCR en el plásmido pEUCCR).
Figura 3: representación esquemática de la
construcción de un vector que contiene una secuencia de ADN que
codifica la CCR de eucalipto según la invención (o vector CCR
sentido).
Figura 4: representación esquemática de la
construcción de un vector que contiene una secuencia de ADN que
codifica un ARN antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm
que codifica la CCR de eucalipto según la invención (o vector CCR
antisentido).
El ARN antisentido deriva preferentemente de la
secuencia contenida en el clon pEUCCR. Esta secuencia se puede
obtener de diferentes maneras:
- 1)
- cortando con enzimas de restricción apropiadas la secuencia de ADN (ADNc) de la CCR contenida en pEUCCR,
- 2)
- realizando una amplificación génica (PCR) con la ayuda de oligonucleótidos definidos, a fin de sintetizar el fragmento de ADN deseado.
El fragmento de ADN así obtenido se clona en un
vector de expresión de las plantas, en dirección 3' de un promotor y
en dirección 5' de un terminador. La clonación se realiza de tal
manera que el fragmento de ADN se inserta en orientación inversa
con respecto al promotor. En este nuevo vector, la hebra que era
inicialmente la hebra matriz se convierte en la hebra
codificante, y viceversa.
El nuevo vector codifica un ARN cuya secuencia es
complementaria de la secuencia del ARN mensajero deducido de la
secuencia contenida en pEUCCR.
Así, los 2 ARN son complementarios mediante sus
secuencias, pero también mediante sus orientaciones
(5'-3').
Como fuente de ADN, para la transcripción del ARN
antisentido, es práctico utilizar un clon de ADNc, tal como el
contenido en pEUCCR.
El ADNc de la CCR se obtiene mediante una doble
digestión (BamHI y KpnI) a partir del vector pEUCCR. El fragmento de
ADN así liberado se separa físicamente del vector de clonación
mediante electroforesis en gel de agarosa (Bluescript).
La parte de gel que contiene este fragmento de
ADN se corta y se trata a fin de obtener el ADN purificado (se
pueden utilizar varios métodos, incluyendo la "agarosa de bajo
punto de fusión", descrita en Sambrook et al., citado; y
el Gene Clean, cuyo kit está disponible comercialmente).
El fragmento que porta los extremos BamHI y KpnI
se "liga" con un vector de expresión de plantas previamente
digerido por estas mismas enzimas, elegidas de manera que el ADNc se
inserte en orientación inversa con respecto al promotor ^{35}S.
La hebra que se transcribirá en las plantas será, en este caso, la
hebra no codificante.
En este caso, no existen sitios de restricción
"prácticos" para realizar una fusión de traducción con el
promotor ^{35}S del vector de expresión. Se han insertado nuevos
sitios más convenientes con la ayuda de la técnica de amplificación
génica (PCR). Se han definido dos oligonucleótidos en 5' y en 3'
del ADNc, a los cuales se le han añadido las secuencias de los
sitios reconocidos por KpnI y BamHI (PD.: son los mismos sitios que
se han utilizado para la clonación antisentido susodicha, pero
posicionados diferentemente con respecto a la orientación
5'-3').
La amplificación génica conduce a la obtención de
un fragmento que contiene la totalidad de la secuencia codificante
del ADNc flanqueada mediante 2 sitios de restricción. La
continuación del procedimiento es idéntica a la descrita para la
construcción antisentido.
Sin embargo, en este caso, se ha realizado una
fusión del promotor en fase con el ATG de la CCR, lo que debe
conducir a una sobreexpresión del ARN mensajero y, por lo tanto, de
la proteína CCR.
\newpage
Los ejemplos de clonación de las secuencias
sentido y antisentido descritos aquí arriba, en el caso de la CCR de
eucalipto, son igualmente aplicables al caso de la CCR de alfalfa y
del maíz.
El banco utilizado se ha construido a partir de
ARN totales extraídos de raíces de Medicago truncatula, en
el vector \lambdaZAPH (kit "ZAP-cDNA
synthesis" de Stratagène).
Sonda:
La detección sistemática del banco de alfalfa se
ha efectuado con la ayuda del ADNc que codifica la CCR de eucalipto.
Como sonda, sirvió un fragmento de 800 pb (Xho-Xho)
de pEUCCR marcado mediante la técnica de cebado aleatorio.
Se han presentado 300.000 clones, y después se
han transferido al filtro de nitrocelulosa (Schleicher &
Schuell). Para ello, los filtros se colocaron 5 min. sobre las
cajas de cultivo, y después se sumergieron sucesivamente en las
disoluciones siguientes:
| 1,5M de NaCl/0,5 M de NaOH | 5 min. |
| 1,5M de NaCl/0,5 M de Tris pH 8 | 5 min. |
| 3x SSC | 2 min. |
| cocción 2 horas a 80ºC. |
Los filtros se han pre-hibridado
durante 12 horas, y después se han hibridado durante 24 horas a 37ºC
en el medio siguiente:
- Formamida 20%
- Dextrano 10%
- NaCl 1M
- ADN de esperma de salmón (1 mg/ml)
- 0,2% de polivinilpirrolidona
- 0,2% de BSA
- 0,2% de ficoll
- 0,05M de Tris-HCl pH 7,5
- 0,1% de pirofosfato de sodio
- 1% de SDS.
Después de la hibridación, los filtros se lavaron
2 veces durante 10 min. a temperatura ambiente en 2x
SSC-1% de SDS, y después 2x 30 min. a 55ºC en la
misma disolución.
Después de la exposición autorradiográfica de los
filtros, se han identificado 15 áreas de lisis positivas. Esta
áreas de lisis se purificaron mediante 2 ciclos suplementarios de
detección sistemática, en las condiciones de hibridación descritas
aquí arriba.
A partir de los clones positivos, el plásmido
Bluescript del fago \lambda se ha escindido según el protocolo de
escisión in vivo del kit "ZAP-cDNA
Synthesis".
El ADNc que codifica la CCR de alfalfa, de un
tamaño de 1404 pbs, se inserta entre los sitios EcoRI (lado 5') y
Xho (lado 3') del vector Bluescript. Esta constituido de las
siguientes partes:
- una parte 5' transcrita no traducida de 167
pbs,
- una región de 1028 pbs que codifica una
proteína de 342 aminoácidos,
- una parte 3' transcrita no traducida de 209
pbs.
El ADNc obtenido se representa mediante SEC ID nº
1, y la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se representa
mediante SEC ID nº 2.
El banco utilizado se ha construido a partir de
ARN totales extraídos de raíces de maíz (variedad AMO 406), con
carencia de hierro, en el vector \lambdaZAP (kit
"ZAP-cDAN Synthesis" de Stratagène).
Sonda:
La detección sistemática del banco de maíz se ha
efectuado con la ayuda del ADNc CCR de eucalipto. Como sonda, sirvió
un fragmento de 800 pb (Xho-Xho) de pEUCCR marcado
mediante la técnica de cebado aleatorio.
Se han presentado 500.000 clones, y después se
han transferido al filtro de nitrocelulosa (Schleicher &
Schuell). Para ello, los filtros se han colocado 5 min. sobre las
cajas de cultivo, y después se han sumergido sucesivamente en las
disoluciones siguientes:
| 1,5M NaCl/0,5 M de NaOH | 5 min. |
| 1,5M NaCl/0,5 M de Tris pH 8 | 5 min. |
| 3x SSC | 2 min. |
| cocción 2 horas a 80ºC. |
Los filtros se han pre-hibridado
durante 12 horas, y después se han hibridado durante 24 horas a 55ºC
en el medio siguiente:
- 3x SSC
- 0,5% de SDS
- 0,1% de leche en polvo
- ADN de esperma de salmón (1 mg/ml).
Después de la hibridación, los filtros se lavaron
dos veces durante 10 min. a temperatura ambiente en 3x
SSC-0,5% de SDS, y después 2x 45 min. a 60ºC en la
misma disolución.
Después de la exposición autorradiográfica de los
filtros, se han identificado 20 áreas de lisis positivas. Estas
áreas de lisis se han purificado mediante 3 ciclos suplementarios
de detección sistemática, en las condiciones de hibridación
descritas aquí arriba.
A partir de los clones positivos, el plásmido
Bluescript del fago \lambda se ha escindido según el protocolo de
escisión in vivo del "kit ZAP-cDNA
Synthesis".
El ADNc obtenido se representa mediante SEC ID nº
3, y la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se representa
mediante SEC ID nº 4.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 3, rue Michel-Ange
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS 75016
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: F-75016
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN LA CINAMOIL CoA REDUCTASA, Y SUS APLICACIONES EN EL CAMPO DE LA REGULACIÓN DEL PORCENTAJE DE LIGNINA EN LAS PLANTAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: DISQUETE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1568 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ANDc para ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSITICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 278..1306
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 342 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1556 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ANDc para ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSITICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 195..1310
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 371 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1297 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ANDc para ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSITICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 136..1140
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 335 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1376 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ANDc para ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSITICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 99..1112
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 338 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1273 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ANDc para ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSITICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 66..1091
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 342 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1293 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ANDc para ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSITICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 95..1108
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 338 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1297 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ANDc para ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSITICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 136..1140
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 335 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
Claims (20)
1. Uso de secuencias nucleotídicas recombinantes
que contienen una (o varias) región(es)
codificante(s), estando esta(s) región(es)
codificante(s) constituida(s) por una secuencia
nucleotídica seleccionada entre las siguientes:
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 1, que codifica un ARNm, codificando éste la cinamoil CoA-reductasa (CCR) de alfalfa, representada por SEC ID nº 2,
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC ID nº 3, que codifica un ARNm, codificando éste la CCR de maíz representada por SEC ID nº 4,
- -
- la secuencia nucleotídica complementaria de la representada por SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3,
para la transformación de células
vegetales destinadas a la obtención de plantas transgénicas en las
que la biosíntesis de las ligninas se regula tanto en el sentido de
un aumento como en el sentido de una disminución de los contenidos
de ligninas producidas, con respecto a los contenidos normales de
ligninas producidas en las
plantas.
2. Secuencia de ADN, caracterizada porque
comprende como región codificante la secuencia nucleotídica
representada por SEC ID nº 1, que codifica un ARNm, codificando
éste la CCR representada por SEC ID nº 2.
3. Secuencia de ADN, caracterizada porque
comprende como región codificante la secuencia nucleotídica
representada por SEC ID nº 3, que codifica un ARNm, codificando
éste la CCR representada por SEC ID nº 4.
4. Secuencia de ADN, caracterizada porque
comprende como región codificante la secuencia nucleotídica
complementaria de la representada por SEC ID nº 1.
5. Secuencia de ADN, caracterizada porque
comprende como región codificante la secuencia nucleotídica
complementaria de la representada por SEC ID nº 3.
6. ARNm codificado por una secuencia de ADN según
una de las reivindicaciones 2 a 5, seleccionado entre:
- -
- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEC ID nº 1, siendo dicho ARNm susceptible a su vez de codificar la CCR presente en la alfalfa, tal como se representa por SEC ID nº 2,
- -
- el ARNm codificado por la secuencia de ADN representada por SEC ID nº 3, siendo dicho ARNm susceptible a su vez de codificar la CCR presente en el maíz, tal como se representa por SEC ID nº 4.
7. ARNm antisentido que tiene por efecto modular
la biosíntesis de las ligninas en las plantas, caracterizado
porque comprende nucleótidos complementarios de los nucleótidos que
constituyen un ARNm según la
\hbox{reivindicación
6.} 8. CCR recombinante de alfalfa o de maíz,
representada por SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4, respectivamente.
9. Secuencias nucleotídicas que codifican las CCR
representadas por SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4, estando dichas
secuencias nucleotídicas caracterizadas porque corresponden
a las secuencias representadas por SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3,
respectivamente, o a cualquier secuencia derivada de estas últimas
mediante degeneración del código genético, y siendo sin embargo
susceptibles de codificar una CCR susodicha.
10. Complejos formados entre un ARNm antisentido
según la reivindicación 7, y un ARNm según la reivindicación 6.
11. Secuencia nucleotídica recombinante,
caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de
ADN según una de las reivindicaciones 2 y 3, susceptible de
codificar un ARNm, susceptible a su vez de codificar una CCR en la
alfalfa o el maíz, estando dicha secuencia insertada según una de
las reivindicaciones 2 y 3 en una secuencia heteróloga.
12. Secuencia nucleotídica recombinante,
caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de
ADN complementaria según una de las reivindicaciones 4 y 5,
insertada en una secuencia heteróloga, codificando dicha secuencia
de ADN complementaria un ARNm antisentido según la reivindicación
7.
13. Secuencia nucleotídica recombinante según la
reivindicación 11 o la reivindicación 12, caracterizada
porque comprende los elementos necesarios para regular la expresión
de la secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 2 y
3, o de su secuencia complementaria según una de las
reivindicaciones 4 y 5, especialmente un promotor y un terminador de
la transcripción de estas secuencias, y, dado el caso, por lo menos
una secuencia de ADN que codifica una enzima distinta a la CCR, que
está implicada en una etapa de biosíntesis de las ligninas en las
plantas, especialmente el ARNm que codifica a su vez el alcohol
cinamílico deshidrogenasa (CAD), o por lo menos una secuencia que
codifica el ARNm antisentido susceptible de hibridarse con el ARNm
susodicho, especialmente con el ARNm que codifica la CAD.
14. Vector recombinante, caracterizado
porque comprende una secuencia nucleotídica recombinante según una
de las reivindicaciones 11 a 13, integrada en uno de sus sitios de
su genoma no esenciales para su replicación.
15. Procedimiento para la regulación de la
biosíntesis de ligninas en las plantas, bien por disminución o bien
por aumento de los contenidos de ligninas producidas, con respecto
a los contenidos normales de ligninas producidas en plantas,
comprendiendo dicho procedimiento una etapa de transformación de
células de estas plantas con la ayuda de un vector según la
reivindicación 14.
16. Procedimiento para la disminución de la
biosíntesis de lignina en las plantas, y por lo tanto para la
disminución de los contenidos de ligninas producidas con respecto a
los contenidos normales de ligninas producidas en las plantas,
caracterizado porque se realiza mediante transformación del
genoma de estas plantas, incorporando en él:
- -
- por lo menos una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 4 y 5,
- -
- y, dado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica una enzima distinta a la CCR, que se encuentra implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, especialmente el ARNm que codifica la CAD,
siendo dicha transformación
realizada:
- -
- bien con la ayuda de un vector recombinante según la reivindicación 14, que contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 12 o la reivindicación 13,
- -
- o bien con la ayuda de varios vectores recombinantes, de los cuales por lo menos uno contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 12, mientras que el (los) otro(s) vector(es) recombinan- te(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica un ARNm antisentido capaz de hibridarse con un ARNm que codifica una enzima distinta a la CCR, tal como se define anteriormente.
17. Procedimiento para la disminución de la
biosíntesis de lignina en las plantas, y por lo tanto para la
disminución de los contenidos de ligninas producidas con respecto a
los contenidos normales de ligninas producidas en las plantas,
caracterizado porque se efectúa mediante transformación del
genoma de estas plantas, incorporando en él:
- -
- por lo menos una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 2 y 3,
- -
- y, dado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica una enzima distinta a la CCR, que está implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, especialmente una secuencia de ADN que codifica la CAD,
siendo dicha transformación
realizada:
- -
- bien con la ayuda de un vector recombinante según la reivindicación 14, que contiene la secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 11 o la reivindicación 13,
- -
- o bien con la ayuda de varios vectores recombinantes, de los cuales por lo menos uno contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 11, mientras que el (los) otro(s) vector(es) recombinan- te(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica una enzima distinta a la CCR, tal como se define anteriormente.
18. Procedimiento para el aumento de la
biosíntesis de lignina en las plantas, y por lo tanto para el
aumento de los contenidos de ligninas producidas con respecto a los
contenidos normales de ligninas producidas en las plantas,
caracterizado porque se realiza mediante transformación del
genoma de estas plantas, incorporando en él:
- -
- por lo menos una secuencia de ADN según una de las reivindicaciones 2 y 3,
- -
- y, dado el caso, por lo menos una secuencia de ADN que codifica una enzima distinta a la CCR, que está implicada en una etapa de la biosíntesis de las ligninas en las plantas, especialmente una secuencia de ADN que codifica la CAD,
siendo dicha transformación
realizada:
- -
- bien con la ayuda de un vector recombinante según la reivindicación 14, que contiene la secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 11 o la reivindicación 13,
- -
- o bien con la ayuda de varios vectores recombinantes, de los cuales por lo menos uno contiene una secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 11, mientras que el(los) otro(s) vector(es) recombinan- te(s) contiene(n) una secuencia de ADN que codifica una enzima distinta a la CCR, tal como se define aquí arriba.
19. Plantas o fragmentos de plantas,
especialmente células, frutos, semillas, polen, transformados
mediante incorporación en su genoma de por lo menos una secuencia
nucleotídica según una de las reivindicaciones 2 a 5.
20. CCR recombinantes representadas por SEC ID nº
2 o SEC ID nº 4, tales como las obtenidas mediante transformación de
células vegetales integrando, de manera estable en su genoma, una
secuencia nucleotídica recombinante según una de las
reivindicaciones 11 a 13, especialmente con la ayuda de un vector
según la reivindicación 14.
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