JP3162072B2

JP3162072B2 - 植物におけるリグニン生合成の変性

Info

Publication number: JP3162072B2
Application number: JP50863692A
Authority: JP
Inventors: ボーデ，アラン，ミシエル; インゼ，デイルク，グスタフ; スコツチ，ヴオルフガング，ヴオルター
Original assignee: ゼネカ・リミテツド
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1992-04-27
Publication date: 2001-04-25
Anticipated expiration: 2016-04-25
Also published as: DE69232667D1; WO1993005159A1; ES2174832T3; EP0584117A1; GB9109063D0; CA2109222C; US6066780A; JPH06509465A; ATE220102T1; US5451514A; DE69232667T2; BR9205934A; CA2109222A1; AU669106B2; EP0584117B1; AU1658192A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はリグニン生合成の変性（modification）によ
る植物の改良に関する；特に、本発明は、これに限定さ
れるものではないが、飼料用作物（fodder crop）の消
化性（digestibility）の改善に関する。

牧草栽培農家及び他の飼料用作物栽培農家は、毎年、
その作物を貯蔵するためにいつ刈取るべきかその時期を
決定しなければならないという困難な問題に直面する。
農業において重要な全ての種の草は、成長と共に通常の
乾燥物収量が増加する際に、消化性が低下するという不
都合を有する。従って、農家は消化性の高い作物をより
低い収量で収穫するか又は消化性の低い作物をより高い
収量で収穫するかで妥協しなければならない。別の制限
は、最適な成熟時期に収穫することが不順な天候により
阻害され得ることである。消化性の低下を制御するか又
は遅延させることができれば、消化性のより高い飼料用
作物をより高い収量で収穫することが可能であり、ま
た、周囲の天候条件が収穫した作物の品質を決定するの
に重要な役割をすることがないであろう。

飼料用作物の消化性は、他の要因の内、植物の生長中
に生起した木化（lignification）の量及び沈着したリ
グニンの二次変性の程度によって決定される。セルロー
スと他の多糖類の他に、リグニンは維管束植物（vascul
ar plant）の厚膜組織（sclerenchyma）及び木部（xyle
m）と同様、組織（tissue）の細胞壁の必須成分であ
る。リグニンは細胞壁の水に対する透過性を低減させる
ことにより、木部の伝導機能（conducting function）
において重要な役割をする。更にリグニンは細胞壁に剛
性を付与する働きをし、本質組織においては、リグニン
は細胞の間で結合剤としての働きを行って、植物の衝
撃、圧縮及び屈曲に対する抵抗性を付与する。最後に、
リグニンは病原性物質（pathogenic agent）の侵入又は
伝播を阻止することにより、病原体に対する抵抗性の機
構に関係する。

リグニンは野外作物の生産性と性能において重要であ
るだけでなしに、製紙用木材においても非常に重要であ
る。製紙に必要とされるセルロース繊維からリグニンを
遊離させ、溶解させそして除去するのにかなりのエネル
ギーと化学薬品の投入を必要とする。

リグニンにより作物植物の用途が束縛されるこれらの
場合の他に、リグニンはフェノールのごとき、化学合成
において先駆体として使用され得る特殊な化学薬品の製
造のための原料としても使用される。従って、リグニン
とその生物学的及び化学的変性物は重要である。

本発明の一つの目的は植物におけるリグニン含量とリ
グニン組成の両者を変性するための生物工学的方法を提
供することである。

リグニンは、３種の一次先駆体（primary precurso
r）：トランス−コニフェリル（trans−coniferyl）ア
ルコール、トランス−シナピル（trans−sinapyl）アル
コール及びトランス−クマリル（trans−cumaryl）アル
コールの脱水素重合の生成物である。これらの単量体は
種々の割合でリグニン中に出現し、かつ、これらの単量
体同志及びこれらの単量体と周囲の細胞壁の多糖類とは
種々の形式で結合しており、かくして、多数の種類の重
合体が形成される。これらの重合体、即ち、“リグニン
コア”（“lignin core"）は、常に、ヘミセルロースを
共有結合により随伴している。大部分のリグニンは種々
の量の芳香族カルボン酸もエステル状の組合せで含有し
ている。かかるリグニンの構造における相違は植物種内
において通常見出だされる。しかしながら、リグニンの
組成における相違、及び、一次及び二次細胞壁との結合
における相違は、同一の植物内において、異なる組織間
或いは異なる樹齢間で見出だされる。リグニン単量体の
生合成は、フラボノイド色素、イソフラボノイド、クマ
リンフィトアレキシン及び細胞分割促進デヒドロジコニ
フェリルグルコシドを包含する広範囲の化合物も生成さ
せる、フェニルプロパノイド（phenylpropanoid）生合
成経路の一部である。

フェニルアラニンが脱アミノ化されることにより桂皮
酸が生成する。ついで、この酸がヒドロキシル化されつ
いでメチル化されることにより、芳香族環上に置換基を
有する種々の酸が生成される。ついで、ヒドロキシ桂皮
酸塩:CoAリガーゼの作用により、（ｐ）−クマリン酸、
フェルラ酸及びシナピン酸の補酵素Ａチオエステルが生
成される。その後、これらの化合物がシンナミル−CoA
レダクターゼ（CCR）により還元されてシンナムアルデ
ヒドが生成し、最後に、このシンナムアルデヒドがシン
ナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（CAD）によりシン
ナミルアルコールに転化される。最後の２つの反応だけ
がリグニンの生合成について特異的である。ついでシン
ナミルアルコールは細胞壁に移入され、ここで過酸化水
素の存在下、ペルオキシダーゼにより重合すると考えら
れる。

細胞の表面生長が停止したとき、続いて細胞壁の厚さ
の増加工程（二次細胞壁形成）が行われる。木化は主と
してこの工程中に生起する。木化は細胞の端部において
開始し、中間のラメラ（lamella）に沿って、一次細胞
壁から、最後に二次細胞壁へと進展する。外部要因（ex
ternal factor）により木化における定性的及び定量的
変性が誘導され得る。しばしば、通常は木化されない組
織における、新規な種類のリグニンの合成は病原性微生
物の感染によって誘導され得る。木化は光により、並び
に、低いカルシウム濃度により、硼素により、機械的な
ストレスにより及び感染により刺激され得る。

シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ：（CAD,E.C.
1.1.1.195）はシンナムアルデヒドのシンナミルアルコ
ールへの転化を触媒する。種々の異なる種：フォルシシ
アサスペンサ（Forsythia suspensa）、ダイズ［グ
リシンマックス（Glycine max）］、トウヒ（spruc
e）［ピセアアビエス（Pisea abies）、ポプラ［ポ
プルスユーラメリカナ（Populus euramericana）］
及びユーカリ（eucalyptus）についてのCADの特性が決
定されている。

大部分の場合、各々の種について一つの形のCADしか
検出されていないが、ダイズは、２種のイソ酵素、即
ち、43,000ダルトンのものと69,000ダルトンのものを有
する。第一のダイズイソ酵素はコニフェリルアルコール
に対して特異的であり、一方、69,000ダルトンのダイズ
−イソ酵素と他の全てのCADは全てのシンナミルアルコ
ール（即ち、コニフェリルアルコール、シナピルアルコ
ール及びクマリルアルコール）の形成を触媒する。しか
しながら、種々のシンナミルアルコールについてのCAD
のKmは、異なる種からの酵素の間で変化する。この変化
は、種が異なる場合にリグニンコアの組成が異なること
を説明し得る。実際に、リグニン単量体は植物内では、
CAD及びCCRを包合していない生合成経路においては合成
され得ない。従って、CAD並びにCCRは木化の制御におけ
るキー酵素であり得る。これらの酵素に対して特異的な
抑制剤を使用することにより、これらの抑制剤はリグニ
ンの組成よりも、その量を制御することが示されてい
る。しかしながら、種々のシンナミルアルコールについ
てのダイズCADイソ酵素のkm値は、CADイソ酵素がある種
のリグニンの組成を制御し得ることを示している。他の
アルコールデヒドロゲナーゼについてのごとく、CADの
活性のためにはZn²⁺の存在が必要である。NADPの代わり
にNADが存在する場合には、シンナムアルデヒドの還元
はCADにより触媒され得ない。CADの普通のサブユニット
構造は約80,000ダルトンのダイマーであると考えられる
（各々の単量体は約40,000の分子量を有する）。しかし
ながら、ダイズ酵素は、cDNAクローンの分析に基づい
て、65,000の分子量を有する単量体であると報告されて
いる。マメ細胞懸濁培地を、ダイズ病原体コレクトロト
リクムリンデムシアヌム（Collectrotrichum lindemut
hianum）の菌糸細胞壁（mycelial cell wall）から熱遊
離させた高分子量エリシター製剤（high−molecular−m
ass−elicitor preparation）で処理することにより、C
ADの抽出性活性（extractable activity）が増大する。
CAD活性の増大は病原性微生物に対する防御反応と見做
され得るが、これは、この酵素の活性の増大は感染した
細胞の細胞壁におけるリグニンの沈着又は防御応答に関
係する細胞外リグニン状物質及び他のフェノール化合物
の合成に関係し得るという理由によるものである。

Walter等（1988）はエリシター処理マメ細胞からλgt
ll cDNAライブラリーを作成した。このライブラリーを
ポプラ（poplar）CAD酵素に対して生じた抗体を使用し
てスクリーニングして、CAD cDNAクローンを同定した。
1.2kbの長さのcDNAクローンを単離し、クローン4aと命
名した〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85（15）,5546−5550
（1988）参照〕。しかしながら、その後の実験はこのク
ローンはCADをエンコードせずに、リンゴ酸酵素をエン
コードすることを示した（Walter等1990;Plant Molecul
ar Biology,15:525−526（1990）参照。

従って、CADは作物植物の変性のための有用な標的で
はあるけれども、実際には、これを使用する方法を入手
される情報を使用して実施することは不可能である。本
発明を導くための研究により、等質性（homogeneity）
のためのCAD酵素及び種々の種からのCAD cDNAの新規な
単離方法であって、今や、作物植物の木化の変性に使用
し得る方法が提供される。

例えば、減少した量のリグニン又は変性されたリグニ
ン組成を有する植物はウシの飼料としてより効率的に使
用されるであろう。従って、乳及び肉の収量が増大する
であろう。更に、リグニンは植物の生長に負の効果を有
し得る。例えば、コムギ、アブラナ（oilseedrape）、
テンサイ又はトウモロコシのごとき作物における木化の
減少により、恐らく、穀粒の収量が増大し得る。減少し
たリグニン含有量又は変更されたリグニン構造を有する
樹木は、パルプ化の際により少ない量のリグニンを除去
することになるので、紙の価格を低減させるであろう。
一方、セルロース繊維の純度のため、他の方法では製造
し得なかった。新規な紙を製造し得る。

本発明の主要な用途は飼料作物の消化性の改善、セル
ロース繊維抽出のための木材原料中のリグニンの減少、
病原体の攻撃に対する作物植物の応答の改善及び木材品
質（timber quality）の改善である。これらの用途のあ
るものにおいては、リグニンの全体的な量が減少するこ
とが要求され得る：他の用途においては、リグニンの量
を増大させることが要求され得る。特定の用途において
は、リグニン重合体の化学的組成の変更により利益がも
たらされる場合もあり得る。

木材原料からセルロース繊維を抽出するための工業的
方法は、本質的にリグニンを除去するための化学的抽出
法に相当する。リグニンが木材原料から除去された後、
セルロース繊維を回収し、紙を製造するか又は他の方法
で使用し得る；例えば、セルロース繊維を更にセルロー
スフィルムに加工するか又は織成するか又は編成して布
にし得る。木材原料として使用される植物、通常、樹木
によって合成されるリグニンの減少はかかる抽出法にお
いて要求される薬品とエネルギーを低減させるという直
接的な効果を有しかつ主要な環境汚染源として十分に認
識されている。そして、処理することが困難でかつ費用
を要する廃棄物質の量を減少させるであろう。リグニン
の化学的組成の変更は、使用される化学的抽出剤中での
リグニンの溶解特性を潜在的に変化させるであろう。同
様に、リグニンの化学的組成の変化は薬品の使用量の低
減とエネルギーの必要量の低減とを直接的にもたらす。
最後に、現在は不適当な植物種のリグニン品質の変化
は、製紙工業及び切断木材工業用の別の原料を提供し得
る。

木化の減少は植物に化学的抑制剤を適用することによ
り達成し得る。しかしながら、リグニンの沈着と構造を
制御するためのより効果的な方法はアンチセンスRNAを
使用してCAD遺伝子の発現を抑制することである。アン
チセンスRNA技術は、木化の抑制のための適当な分子生
物学的方法である。アンチセンス技術は非コーデイング
（non−coding）DNA鎖（ナンセンス）の転写によって形
成されるRNAである。従って、アンチセンスRNAはコーデ
イングDNA鎖と同一の配列を有しかつ特定の遺伝子のmRN
A生成物と相補的である。

周知のごとく、細胞によるタンパク質の製造はこのタ
ンパク質についての遺伝子のDNAを転写して、RNAを形成
し、ついでこのRNAを加工して（例えば、イントロの除
去により）メッセジャーRNAとし、最後に、リボソーム
によりタンパク質に翻訳することにより行われる。この
プロセスは細胞中に“アンチセンスRNA"が存在すること
により抑制される。従って、本明細書中で使用されるご
とく、“アンチセンスRAN"という用語は、mRNA中の塩基
の配列と相補的なRNA配列を意味する：この相補的とい
う用語は、アンチセンス配列（３′〜５′の方向に読ま
れる）中の各塩基（又は大部分の塩基）が、５′〜３′
の方向に読まれるmRNA中の対応する塩基と対になること
ができるということを意味する（ＧとＣ、ＡとＵ）。こ
の抑制はRNAの２本の相補鎖（complementary strand）
の間で複合体（complex）が形成され、タンパク質の形
成が阻害されることにより生ずると考えられる。この複
合体がどのように作用するかは明らかではない：複合
体は更に転写、プロセッシング、輸送（transport）又
は翻訳を阻害し、或いは、mRNAを分解し（degrade）、
或いは、これらの作用の二つ以上を有し得る。かかるア
ンチセンスRNAは、関連する遺伝子（又はこれと実質的
な相同性（homology）を示すDNA配列）の、（鋳型鎖と
反対の）コーデイング鎖の後方部分を転写するために配
置された適当なDNA構築物を用いる形質転換により細胞
内で製造し得る。

特定の植物遺伝子の発現をダウンレギュレートさせる
（減少させる）（downregulate）ためのこの技術の使用
は、例えば、ICI社の欧州特許公開第271988号に記載さ
れている。遺伝子の発現の減少により植物の表現型（ph
enotype）に変化が生ずる：この表現型の変化は全体的
な可視表現型の相違（gross visible phenotypic diffe
rence）の水準において生ずる；例えば、トマトの果実
内でのリコペンの合成が行われなくなり、赤色果実の代
わりに黄色の果実が産生されるという形で生ずる；或い
は、表現型の変化は、より微妙な（subtle）生化学的な
水準で生ずる；例えば、トマトの果実の熟成中における
ポリガラクツロナーゼの量の変化及びペクチンの解重合
の減少として生ずる（Smith等,Nature,334,724−726,19
88;Smith等,Plant Mol.Biol.14,369−380,1990）。従っ
て、アンチセンスRNAは植物の遺伝子の発現のダウンレ
ギュレーションを達成するのに有用であることが証明さ
れている。

本発明の目的はリグニンを合成するための変更された
能力を有する植物を提供することである。

本発明によれば、遺伝子プロモーター配列と、遺伝子
ターミネーターと、mRNAをエンコードするヌクレオチド
配列を含有する挿入領域とからなる組換え体DNAであっ
て、前記mRNAが、前記ヌクレオチド配列が発現される際
に内在性シンナミルアルコールデヒドゲグナーゼ遺伝子
の発現を阻害するように、シンナミルアルコールデヒロ
ゲナーゼをエンコードするものであり、前記のヌクレオ
チド配列が配列表の配列番号:1、２、３、４及び５の配
列の中から選択されるものであることを特徴とする組換
え体DNAが提供される。

挿入領域は前記の内在性遺伝子によってエンコードさ
れるmRNAとアンチセンス配向（antisense orientatio
n）にあるmRNAをエンコードすることが好ましい。かか
るアンチセンス配列は前記内在遺伝子をエンコードする
DNAの非転写鎖（untranscribed strand）から単離（iso
late）し得る。

しかしながら、挿入領域は、別の場合においては、前
記の内在性遺伝子と同一の配向であり得る。かかる構造
は内在酵素（endogeneous enzyme）の過剰産生（overpr
oduction）を導くか又は内在酵素の産生を抑制し得る。

挿入領域は50塩基の最小寸法を有することが好まし
い。

プロモーターは植物内で作動することが知られている
プロモーターから選択し得るが、CaMV35s、GPAL2、GPLA
3及び内在標的酵素の発現を制御する内在植物プロモー
ター、例えば、CAD遺伝子のプロモーターからなる群か
ら選択することが好ましい。

本発明によれば、更に、植物のゲノム中に形質転換に
よって組換え体DNAを安定的に挿入することからなる植
物中のリグニンの含有量又は組成を変化させる方法であ
って、前記組換え体DNAが遺伝子プロモーター配列と、
遺伝子ターミネーターと、mRNAをエンコードするヌクレ
オチド配列を含有する挿入領域とからなるものであり、
前記mRNAが、前記ヌクレオチド配列が発現される際に内
在性シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発
現を阻害するように、シンナミルアルコールデヒドロゲ
ナーゼをエンコードするものであり、前記のヌクレオチ
ド配列が配列表の配列番号:1、２、３、４及び５の配列
の中から選択されるものであることを特徴とする、植物
中のリグニンの含有量又は組成を変化させる方法が提供
される。

かく形質転換され得る植物の例はトウモロコシ、ユー
カリ、アスペン、ポプラ及びタバコである。しかしなが
ら、本発明はこれらの作物に限定されるものではなく、
適当な一次的用途はアルファルファ、ロリウム（loliu
m）及びフェスツカ（festuca）のごとき飼料作物にある
であろうと考えられる。しかしながら、リグニン合成の
制御は多数の作物において広範囲の重要な用途を有す
る。

本発明の組換え体DNAの構築に使用するのに適した遺
伝子の供給源としては、下記のごとき供給源が挙げられ
る：（ｉ）プラスミドpTCAD14又はpTCAD19（タバコCAD）：
これらは、英国、アバーデイーン（Aberdeen）所在のTh
e National Collection of Industrial and Marine Bac
teriaに、E.coli菌株XL1 Blueを宿主（host）として、
それぞれ、1991年４月17日に40404の寄託番号で、ま
た、1991年４月８日に40401の寄託番号で寄託されてい
る。

（ii）プラスミドpZCAD1（トウモロコシCAD）：これは
英国、アバーデイーン所在のThe National Collection
of Industrial and Marine Bacteriaに、E.coli菌株XL1
Blueを宿主として、1992年４月２日に40501の寄託番号
で寄託されている。

（iii）プラスミドpPOPCAD1（ポプラCAD）：これは英
国、アバーデイーン所在のThe National Collection of
Industrial and Marine Bacteriaに、E.coli菌株XL1 B
lueを宿主として、1992年４月２日に40500の寄託番号で
寄託されている。

（iv）プラスミドpEUCAD1:これは英国、アバーデイーン
所在のThe National Collection of Industrial and Ma
rine Bacteriaに、E.coli菌株XL1 Blueを宿主として、1
992年４月２日に40502の寄託番号で寄託されている。

これらのプラスミドは特許出願を目的とする微生物の
寄託に関するブタペスト条約の規定に基づいて寄託され
ている。

従って、本発明はクローンpTCAD14、pTCAD19、pZCAD
1、pPOPCAD1及びpEUCAD1、及び、遺伝コードすなわち遺
伝暗号の縮重（degeneracy）によって許容されるごとき
その変種又はその機能的均等物中に含有されるDNAイン
サートすなわちDNA挿入断片も包含する。本発明によれ
ば、更に、植物内で作動する転写調節配列の制御下にあ
る前記DNAを含有する、従って、通常のmRNAに関して完
全な長さ（full−length）であるか又は部分的な長さ
（partial length）であり得るmRNAを植物内で生成し得
る組換え体DNA構築物（construct）が提供される。

リグニン合成のダウンレギュレーションのためには、
前記DNAはアンチセンス又は“センス”配向である。

リグニン生合成の増幅（amplification）のために
は、前記DNAはセンス配向であり、従って、植物ゲノム
内で前記DNAの一つ又はそれ以上の追加のコピーが提供
される。この場合、DNAは完全な長さのDNAである。

従って、別の要旨においては、本発明によれば、pTCA
D14、pTCAD19、pZCAD1、pPOPCAD1及びpEUCAD1中の遺伝
子によって生成されるタンパク質をエンコードするmRNA
と実質的な相同性を示す塩基の実質的な連続部分（ru
m）と相補的なRNAをエンコードするDNA配列の転写のた
めに配置された、植物内で作動する転写開始領域を含有
するDNA構築物が提供される。

本発明は主としてリグニンの形成の抑制に関するもの
であり、その場合、挿入遺伝子はアンチセンス配向であ
ろう；しかしながら、例えば、植物の茎の長さを改善
し、植物の高さを減少させかつその結果として倒木（lo
dging）を減少させるため及び病害に対する抵抗性を改
善するためには、リグニンの過剰産生は有利な効果を有
し得る；従って、本発明によれば、植物のリグニン生合
成能力の増幅を達成する手段が提供される。

従って本発明は一般的には植物のリグニン生合成経路
の調節に関する；この場合、本発明の主題であるCAD遺
伝子の余分なコピー（extra copy）を供給することによ
りCADの産生及びリグニンの生成を増大させるために、
或いは、CAD遺伝子又はその一部（通常、50塩基又はそ
れ以上）をアンチセンス配向で挿入し、その結果、リグ
ニン合成を触媒するCADの量を減少させることによりCAD
の産生及び従ってリグニンの生成を減少させるために、
CADが主要な役割をする。

本発明の構築物を植物中に挿入することによりCAD酵
素の産生を調節し得る。構築物の種類に応じて、タンパ
ク質の生成が植物の寿命の全体に亘って或いは特定の段
階において増大し或いは減少する。表皮、木部、根等の
ごとき植物の特定の種類の細胞に特異的な遺伝子の発現
を標的とすることもできる。

本発明を適用し得る植物としてはアルファルファ、ト
ウモロコシ、アブラナ、牧草（forage grass）及びヒマ
ワリのごとき商業的に重要な食料用及び飼料用植物及び
更にユーカリ（eucalyptus）、マツ種（pine species）
及びポプラのごとき樹木が挙げられる。

本発明によるDNA構築物はpTCAD19又はpTCAD14中の挿
入断片のDNAと相同性の、少なくとも50塩基の配列を含
有することが好ましい。塩基配列には理論的な上限値は
ない−塩基配列は細胞によって生成される関連するmRNA
のごとき長さで在り得る−しかしながら、便宜であるた
めには、一般的に、長さが100〜1000塩基の配列を使用
することが適用であることが見出だされるであろう。か
かる構築物の調製は以下においてより詳細に説明する。

本発明で使用するためのアンチセンスRNAの好ましい
供給源はクローンpTCAD19及びpTCAD14から誘導されるDN
Aである。アンチセンスRNAをエンコードする所要のDNA
は種々の方法により取得し得る：即ち、pTCAD19又はpTC
AD14（又はCAD遺伝子の他の任意の供給源）からDNAの適
当な配列を切断することにより；アニーリングしついで
各々の端部に適当な制限部位が形成されるように連結し
た合成オリゴヌクレオチドを使用してDNA断片を合成す
ることにより；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において
合成オリゴヌクレオチドを使用して各々の端部に適当な
制限部位を有する所要の断片を形成させることにより取
得し得る。ついでDNAを上流側プロモーター配列と下流
側ターミネーターを含有するベクター中にクローン化す
る；クローニングはDNA配列がその配向に関して該DNA配
列を切出した鎖中のプロモーターに対して反対になるよ
うに行われる。新規なベクターにおいては、以前は鋳型
鎖（template strand）であった鎖がコーデイング鎖に
なるか、又は、その逆である。従って、新規なベクター
はpTCAD19及びpTCAD14の塩基配列と相補性である塩基配
列中のRNAをエンコードするであろう。従って、２種のR
NA鎖はその塩基配列においてだけでなしに、その向き
（５′〜３′）においても相補性である。

転写のためのDNA塩基配列の供給源としてはpTCAD19及
びpTCAD14のごときcDNAクローンを使用することが好都
合である。pTCAD19の塩基配列は第３図及び配列表の配
列番号:1に示されており、pTCAD14の塩基配列は第４図
及び配列表の配列番号:2に示されている。

転写のための塩基配列についてのDNAの供給源は、CAD
遺伝子自体のプロモーター、又は、フェニルアラニンア
ンモニアリアーゼ遺伝子又は木質部組織における発現を
可能にするその変性物（modified version）のプロモー
ターのごとき、木化に関係する他の遺伝子のプロモータ
ーである。かかる遺伝子はイントロンが存在し得ること
においてpTCAD19又はpTCAD14のcDNAと相違する。イント
ロンはmRNA中に転写されない（或いは、転写された場合
には、後に切断、除去される）。転写を行うための塩基
配列の供給源としてかかる遺伝子の部分を使用する場合
には、イントロン領域又はエクソン領域を使用し得る。

転写を行うための適当なDNA塩基配列を得るための別
の方法は適当な塩基から最初から（ab initio）合成す
ることである。本発明による組換え体DNA及びベクター
は以下のごとくして調製し得る。転写を行うための所望
の塩基配列を含有する適当なベクター（例えば、pTCAD1
9）を制限酵素で処理して塩基配列を切断する。かく得
られたDNA鎖を、所望のプロモーター配列（例えば、カ
リフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター又は
マメPALプロモーター−Bevan等、EMBO J.8,1899−1906
1988）と、所望のターミネーター配列［例えば、アグロ
バクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium fum
efaciens）ノパリンシンターゼ遺伝子の３′］とを含有
する第２のベクター中に（逆の向きで）クローンする。

本発明によれば、環境に応じて、構成プロモーター
（constitutive promoter）（例えば、カリフラワーモ
ザイクウイルス35S RNA）及び誘導性の（inducible）又
は展開的に（developementally）制御されるプロモータ
ー（例えば、PAL遺伝子プロモーター又は内在CAD遺伝子
プロモーター）の両者の使用が提案される。構成プロー
モーターの使用は植物の全ての部分の機能に影響を与え
るであろう；一方、組織特異的プロモーターを使用する
ことにより、機能をより選択的に制御し得る。組織特異
的プロモーターを使用することは、アンチセンス又はセ
ンスRNAがその作用が要求される組織においてだけ生成
されるという利点を有する。

本発明によるベクターは所望されるごとき植物を形質
転換して、本発明による植物を製造するのに使用し得
る。アルファルファ、アブラナのごとき双子葉植物は、
例えば、Bevan（1984）によりNucleic Acid Research,1
2,8711−8721に記載されるごとき方法でアグロバクテリ
ウムTiプラスミド技術により形質転換し得る。かかる形
質転換植物は有性的に（sexually）、又は、細胞又は組
織培養により再生産し得る。

植物細胞内でのRNAの生成の程度はプロモーター配列
を適当に選択することにより、又は、植物ゲノム中に導
入される、本発明によるDNA配列のコピーの数又は組込
み（integration）の部位を選択することにより制御し
得る。この方法においては、木化をより大きな又はより
小さな程度に変化させることができる。

本発明による構築物は当業者に周知の種々の方法によ
り単子葉及び双子葉植物の両者の細胞を形質転換するの
に使用し得る。多くの場合、かかる植物細胞（特に、植
物細胞が双子葉植物の細胞である場合）を培養して全植
物を再生させ、ついで、この植物を再生産して遺伝的に
修飾された植物の連続的な世代を得ることができる。本
発明に従って遺伝的に修飾された植物の例とては、アル
ファルファ、アブラナ、ヒマワリ、モロコシ（sorghu
m）、トウモロコシ、フェスツカ及びユーカリ、ポプラ
及びマツのごとき樹木が挙げられる。

本発明においてはアンチセンス及びセンス発現ベクタ
ーを使用することにより、変性された、即ち、増大した
又は減少したpTCAD19又はpTCAD14の発現を示すトランス
ジェニック植物の表現型を決定するためにアンチセンス
RNAを使用する。

本発明を添付図面を参照して更に説明する。

第１図は精製されたタバコCADタンパク質から決定さ
れた部分的アミノ酸配列を示す。

第２図はCADクローンを同定するために使用されたオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

第３図はpTCAD19の完全塩基配列（配列番号:1）を示
す。

第４図はpTCAD14タバコcDNAクローンの塩基配列（配
列番号:2）を示す。

第５図はpTCAD19/pTCAD14のEcoR1−Hind III断片を使
用するアンチセンス及びセンスベクターの構築を示す。

第６図は完全タバコCAD cDNAクローンを含有する発現
ベクターの構築を示す。

第７図はpPOPCAD1の完全塩基配列（配列番号:3）を示
す。

第８図はpEUCAD1の完全基配列（配列番号:4）を示
す。

第９図はPCRによりトウモロコシCADクローンを生成さ
せるために使用したプライマーの塩基配列を示す。

第10図はpZCAD1、トウモロコシゲノムDNAからの200bp
生成物の塩基配列（配列番号:5）を示す。

第11図は対照植物とアンチセンス植物のCAD活性を示
す。

本発明を実例として以下の実施例により説明する。

実施例１ CAD酵素用の効率的精製法の開発 CADを精製するために改良方法を開発した。この新規
方法はすでに公表されている方法よりも簡単であり、下
記の工程に基づいている。

1. ホモジナイゼーションと70〜40％硫酸アンモニウム
沈殿とによるタバコの茎抽出物の調製６週齢のタバコの茎を液体窒素中で凍結させ、ハンマ
ーで粉砕し次いでワーリング（Waring）ブレンダー中に
おいて緩衝液Ａ中でホモジナイズした。得られたホモジ
ネートを45000×ｇで30分間遠心分離した。得られた上
清に固体硫酸アンモニウムを添加して上清を70％硫酸ア
ンモニウム飽和濃度にし、次いでタンパク質類を４℃で
30分間沈殿させた。沈殿物を10,000rpmで１時間遠心分
離することにより採取した。得られたペレットを、５％
エチレングリコールを補足した最小限の容量の緩衝液中
に再懸濁して、硫酸アンモニウム濃度を約40％飽和濃度
にまで下げた。再懸濁しなかった物質を遠心分離により
除去した。

2. ブルーセファロース上でのアフィニティークロマト
グラフィー得られた上清を脱塩し、ブルーセファロース（Blue S
epharose）カラムにかけた。このカラムを、4mM NADを
補足した１カラム容量の緩衝液を含めて少なくとも６カ
ラム容量の緩衝液中で洗浄した。この洗浄により、他の
アルコールデヒドロゲナーゼ類が溶出される。CADの特
異的溶出を、緩衝液Ｂ中のNADP0〜4mMの濃度勾配で行っ
た。CAD−含有画分を溜めておき、５％エチレングリコ
ールを加えた。

3. Mono Q上でのイオン交換FPLC ブルーセファロースカラムから溶出させて溜めておい
た画分を、FPLC Mono Qカラムにかけた。このカラム
を、吸光度がベースラインレベルに下がるまで洗浄し
た。タンパク質類は、20〜400mMトリス−HCl,pH7.5を用
いて緩衝液の直線勾配で溶出させた。

4. ２′５′ADPセファロース上でのアフィニティーク
ロマトグラフィー Mono Q画分を２′５′ADP−セファロースのカラムに
かけた。このカラムを、4mM NADを補足した１カラム容
量の緩衝液を含めて少なくとも６カラム容量の緩衝液中
で洗浄した。特異的溶出を、０〜4mM NADPを用いて緩衝
液の直線濃度勾配で行った。

この方法を使用して、タバコのCADを均質性になるま
で精製した。4kgの材料から600μｇを得た。これは0.05
％全可溶性タンパク質に相当する。これは約2000倍の精
製に相当する。精製された酵素は、173nKat/mgタンパク
質の特異活性を有する、得られた純粋な酵素はNADPに特
異的であり、コニフェリルアルコールについて12μモル
／のKmを示す。

実施例２ CAD酵素の特性決定精製したCADは分子量約42.5kDaと44kDaの２つのサブ
ユニットからなる。上記CADタンパク質（銀染色により
２つの別々のバンドとして同定された）を含有する天然
（native）ゲルから別々に単離した切片を、SDSゲルに
移し、SDSゲル上を流す（run）と、それぞれの天然型
（native form）は両方のポリペプチドを含有している
ように思われる。純粋なタンパク質を逆相HPLCカラム上
に流し、おそらくは前記の２つのポリペプチドと思われ
る十分に分離された２つのタンパク質ピークを得た。そ
れぞれのポリペプチドについてのＮ−クロロコハク酸イ
ミド／尿素を用いたペプチドマッピングと、精製した２
つのサブユニットのアミノ酸分析とにより、これらのポ
リペプチドが非常に類似していることが示唆される。

２つのペプチドをトリプシンで消化し、得られた断片
の配列を決定した。得られたペプチドの配列を図１に示
す。

図１はCADが２つの密接に関連したポリペプチドによ
って代表される（represented）ことを明確に示してい
る。

実施例３タバコから得た茎特異的cDNAライブラリーの確立６週齢のタバコの茎から抽出したRNAを使用して、cDN
Aライブラリーを作成した。ポリA RAN 20ugを調製し、c
DNAを合成した。この一部をλ−ZAP IIベクター（商業
的に入手し得るクローニングベクター）中にクローン化
した。これにより組換え体860,000個が得られ、そのう
ちの70％は、無作為に選択した24個のクローンについて
PCRによって測定すると、1kb又はそれよりも大きい挿入
断片を有する。

実施例４ CAD cDNAの同定 600,000個の組換え体を、図２に示したオリゴヌクレ
オチドプローブ（CAD116）を使用して選別した。このオ
リゴヌクレオチドは、図１からのペプチド配列４と反対
方向に設計した。

強くハイブリダイズする１つのクローンを同定し、精
製し、特性決定した。このクローンpTCAD19は、1419bp
のcDNA挿入断片を有する。このDNA配列由来のアミノ酸
配列の分析により、幾つかの領域が、42.5kDaのペプチ
ド（RHPLCから得られたピーク２）を表わす図１に認め
られる複数個のペプチド配列と同一の複数個のDNA配列
由来アミノ酸配列を示すことから、該DNA配列由来アミ
ノ酸配列がCADクローンを表わすことが明らかに例証さ
れる。

実施例５ pTCAD19の挿入断片を用いたタバコcDNAライブラリーの
再選別タバコの茎のcDNAライブラリーを代表するクローン60
0,000個を、pTCAD19のEcoR I挿入断片を使用して再選別
した。追加のクローン５個を同定し、精製し、特性決定
した。

これらのクローンの配列決定は、pTCAD19と異なる２
個のcDNAクローンであってRHPLCから得られたピーク１
に認められるペプチドをエンコードする２個のcDNAクロ
ーンの同定を可能にした。代表的なクローンをcTCAD14
と呼び、その配列を図５に示した。図５は、このクロー
ンがpTCAD19と異なること及び該クローンがピーク１の
タンパク質に由来するペプチド配列を含んでいることを
証明している。

実施例６ CADアンチセンスベクターの生成 A.pJR1に基づいたベクター類 pTCAD19とpTCAD14とを、EcoR IとHind IIIを用いて切
断し、得られた塩基981個をもつ断片をアガロースゲル
電気泳動により単離した。得られた断片をクレナウ断片
Ａを使用して平滑末端化した。次いでこの断片を、Sam
Iで切断したpJR1中にクローン化した。該挿入断片をア
ンチセンス配向で含有するクローン類をpJT19A及びpJT1
4Aと呼ぶ。該断片をセンス配向で含有するクローン類を
pJT19S及びpJT14Sと呼ぶ。これらのベクターの組立てを
図５に示す。

B. pMK4に基づいたベクター類 pTCDA19をEcoR IとHind IIIを用いて切断し、得られ
た塩基981個をもつ断片をアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。得られた断片をクレナウ断片Ａを使用して
平滑末端化した。次いでこの断片を、Hinc IIで切断し
たpMK4中にクローン化した。pMK4は発現ベクターであ
り、豆（bean）のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ
プロモーターのDra I断片と、多数のクローニング部位
と、nos 3′末端とを含有する。該挿入断片をアンチセ
ンス配向で含有するクローン類を、pMT19A及びpMT14Aと
呼ぶ。該挿入断片をセンス配向で含有するクローン類を
pMT19S及びpMT14Sと呼ぶ。これらのベクターの組立てを
図５に示す。

実施例７ CAD発現ベクターの生成 pTCAD19の完全な挿入断片を、前記プラスミド類をEco
R Iで制限することにより切除した。得られた複数個の
断片を平滑末端化し、pJR1及びpMK4中にクローン化し
た。得られたベクター類を下記のように呼ぶ。

pJR1に基づくベクター類： pJT19FS及びpJT14FS（センス） pJT19FA及びpJT14FA（アンチセンス） pMK4に基づくベクター類： pMT19FS及びpMT14FS（センス） pMT19FA及びpMT14FA（アンチセンス）これらのベクター類の組立てを図６に示す。

実施例９この出願に記載のベクター類を用いたタバコの形質転換（ａ）ベクター類のアグロバクテリウムへの伝達アンチセンス組立て体及びセンス組立て体を、公表さ
れている方法に従って直接に形質転換することにより、
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefacien
s）LBA4404中に導入した。

アンチセンス組立て体の存在と完全な状態（integrit
y）とを、制限酵素消化実験とサザンブロット実験とに
より調べて、ベクター類をアグロバクテリウムに伝達す
る間に組換えが起こっていなかったことを確認した。

（ｂ）円盤状のタバコの葉の形質転換円盤状のタバコ（N.tabaccum,品種Samsum）の葉を、
十分に確立され、すでに公表されている方法を使用して
形質転換した。前記のCADアンチセンス組立て体を含ん
だ植物をPCRにより同定し、さらに分析するために選択
した。

実施例10 形質転換植物の分析ａ）形質転換植物から得た組織についてのCAD酵素測定形質転換植物及び形質転換されていない対照植物の両
方から得た植物材料を、CAD酵素測定に使用した。200mM
トリス/HCl（pH7.5）と0.5％（重量／容量）PEG 6000
と、５％（重量／容量）PVPと、β−メルカプトエタノ
ール（500μ）とを含有するCAD抽出緩衝液と共に茎材
料を粉砕した。粗ホモジネートを遠心分離し、上清を酵
素の供給源として使用した。検定反応液（reaction）
は、10mMコニフェリルアルコール（50μ）、10mM NAD
P⁺（50μ）、100mMトリス/HCl（pH8.8）（800μ）
を含有していた。これを30℃で10分間インキュベート
し、次いで酵素抽出物（100μ）を加え、混合物全部
を30℃でさらに10分間インキュベートした。水を補足し
たブランクに対して（against）OD 400が記録された。
各植物から試料１個を取り出した。分析は重複して（in
duplicate）行った。これらの酵素測定の分析結果を図
11に示す。図11は、形質転換植物が広範なCAD酵素活性
を示すことを明確に示している。最も低いCAD酵素活性
値を有する植物は、対照CAD酵素値の約10％を示す。

ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によるアンチセンス遺伝子の
存在の測定選択した植物からDNAを抽出した。CaMV又はPALプロモ
ーター及びnos 3′ターミネーター中の配列に対してオ
リゴヌクレオチド類を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
におけるプライマーとして使用した。生成物がCAD配列
であることを確認するために、これら生成物のサザンブ
ロットを、CAD配列を示す第３のオリゴヌクレオチドを
用いて探査した（probed）。この分析により、図10に示
した分析に使用した植物が全てアンチセンス組立て体を
含有していることが証明された。

低いCAD活性をもつ植物は、戻し交雑し、自殖した（s
elfed）。子孫植物を、CADアンチセンス遺伝子及び低CA
D酵素表現型の相続可能性について詳細に分析した。こ
れにより、低CAD表現型がアンチセンス遺伝子と分離す
る（segregate）ことが示される。

実施例11 ポプラCADをエンコードするcDNAクローンの単離 pUC 18中に構築したポプラcDNAライブラリーから得た
80,000個のコロニーを、pTCAD 19から得られた完全なEc
oR I挿入断片を用いて探査した。ハイブリダイゼーショ
ンを３×SSC、0.5％粉乳中で60℃で行った。洗浄を、３
×SSC、0.5％SDS中で、60℃で３×0.5時間行った。１個
のクローンを単離し、pPOPCAD1と命名した。このクロー
ンは1378bpの挿入断片を含有し、pTCAD 19に対して70％
の相同性であった。pPOPCAD1の配列を図７及び配列表の
配列番号:3に示す。

実施例12 センスベクター／アンチセンスベクターの組立て pPOPCAD1の挿入断片をBamH I断片として切除し、植物
発現ベクターpGSJ780A中にアンチセンス配向及びセンス
配向でクローン化した。これらのベクターを使用してポ
プラとヤマナラシとを形質転換した。

実施例13 ユーカリからのcDNAライブラリーの確立ユーカリ（Eucalyptus gunnii）（クローン832、Afo
cel）の７日齢細胞懸濁培養液から抽出したRNAを使用し
て、cDNAライブラリーを作成した。ポリＡ＋RNA 5μｇ
を調製し、これを使用してcDNAを合成した。これをλgt
11（商業的に入手し得るクローニングベクター）のEco
R I制限部位にクローン化した。これにより組換え体10⁶
個を得た。そのうちの60％は、無作為に選択した24個の
クローンについてPCRによって測定すると、1kb又はそれ
よりも大きい挿入断片を有する。

実施例14 ユーカリCADクローンの機能同定ユーカリCADクローンの本質（identity）を、形質転
換大腸菌（E.coli）宿種中で触媒的に活性なCAD酵素を
発現させることによって確認した。これは、TaborとRic
hardsonによる論文、Proceedings of National Academy
of Science,82,1985年に記載されたようにして、発現
ベクターpT7−７中にユーカリCAD cDNAをクローニング
し、商業的に入手し得る大腸菌（E.coli）溶原株BL21を
形質転換させ、T7プローモーターの制御下でIPTGを用い
てクローン化遺伝子の発現を誘導し、次いで細胞抽出物
全部をCAD活性について検定することにより達成した。
得られた結果により、上記クローンが酵素CADを特定す
る（specifying）ものとして明白に同定された。

実施例15 ユーカリCADクローンのクローニングと特性決定増幅させたライブラリー（組換え体1.6×10⁶個）から
得られた組換え体600,000個を、pTCAD19のEcoR I挿入断
片を使用して選別した。６個の陽性クローンをプラーク
精製した；最も大きいクローンを、pGEM3（商業的に入
手し得るクローニングベクター）中にサブクローン化
し、特性決定し次いで配列決定した。この完全な長さの
クローン（1391bp）は、アミノ酸356個をもつタンパク
質をエンコードし、該タンパク質はタバコCADの配列と
極めて高い相同性を有する〔前記アミノ酸の76.4％が同
一であり、11％が十分に保存されている（conserve
d）〕。

このクローンpEUCAD1の配列を図８及び配列表の配列
番号:4に示す。

実施例16 トモロコシから得た部分CADクローンのクローニング pTCAD19とpPOPCAD1との間で高度に保存された配列か
ら誘導されたPCRプライマー類（図９）を適当な条件下
で使用してトウモロコシゲノムDANからPCR生成物を生成
させた。この生成物をBluescript SK＋／−中にクロー
ン化し、次いでそのヌクレオチド配列を決定した（図10
及び配列表の配列番号:5）。このクローンは、DNA配列
を、pTCAD14/19のタバコCAD配列と比較することによ
り、トウモロコシCAD遺伝子の一部をエンコードするも
のと明確に同定された。

実施例17 アンチセンスタバコCADを用いて形質転換させたタバコ
植物中の細胞壁に結合したフェノール類及び可溶性フェ
ノール類の分析 CADはリグニン生合成の調節において鍵的役割を果た
すと思われ、本実施例は、CADに対してアンチセンスの
遺伝子を含有する形質転換細胞中におけるリグニンダウ
ンレギュレーションの効果の確認を報告するものであ
る。

リグニンがチオグリコール酸（TGA）と反応すること
は知られており〔Freundenbergらの著作、“Constituti
on and Biosynthesis of Lignin（リグニンの構成と生
合成）",Springer Verlag（Berlin）発行、1968年〕、T
GAリグニン抽出を用いる方法が過去において、損傷（wo
unding）後の植物中に存在するリグニンの量を測定する
のに用いられている。しかしながら、簡単なTGA抽出
は、植物組織のある種の別の諸成分が一緒に抽出される
という理由から、リグニンの量を過大評価する傾向があ
る。この簡単な方法は、TGA抽出に先立って細胞壁のメ
タノール不溶性成分を一次鹸化する工程を含めるのに適
合させ得る〔CampbellとEllisの論文、Phytochem,31,73
7（1992）〕。

８週齢の試料植物から得た茎節（5cm）を凍結乾燥
し、師部と皮層と表皮とからなる“グリーン（green）
組織”と、木質部と木髄とからなる“木質組織”とに分
けた。

対照植物及び形質転換植物の10個の試料それぞれを、
CampbellとEllisによって報告された方法により、TGA抽
出（extractable）細胞壁複合体（complexes）について
盲目的に（blind）分析し、Ferrarisらの論文、J.Disea
se Protect,94,624（1987）に一般的に記載された方法
によりメタノール及びアルカリ抽出物のフェノール類含
有量についても分析した。

得られた結果を下記の表１、表２及び表３に報告す
る。

上記の単位はA280/mg乾燥重量であり、括弧内は標準
誤差である。

上記の単位は乾燥重量mg当たりのフェルラ酸同等物
（ferulate equivalents）のμｇであり、括弧内は標準
誤差である。

上記の単位は乾燥重量mg当たりのフェルラ酸同等物の
μｇであり、括弧内は標準誤差である。

表３に示した結果はCAD−アンチセンス植物中のTGA−
抽出複合体の量の増大を示すものであるが、この増大
は、化学組成が変化しているという示唆により説明で
き、しかもこのことは、合成経路におけるCAD触媒化工
程の下流で正常に合成され且つ上流のフェノール性の酸
先駆体の蓄積をもたらす典型的リグニン重合体の合成
が、CADを阻害することにより抑制されるということか
ら、全く意外なことではない。

リグニンの性質におけるこの変化は、対照植物と形質
転換植物から得られたTGA複合体のUVスペクトルを比較
することにより確認された。別の確認は、形質転換植物
中の付加成分の存在を明らかにするアルカリ性ニトロベ
ンゼン酸化分析によって得られており、しかもクロマト
グラフィー分析はこれらがフェノール性の酸であること
を示す。

従って、CADのダウンレギュレーションが“リグニ
ン”をより多く除去処理できるようにし、しかもこの性
質はセルロース抽出プロセスの簡便化に反映されるであ
ろうということが、TGA抽出分析により示される。

同じ特徴は、表２及び表３に報告した分析結果によっ
ても示される。飼料作物を貯蔵牧草として貯蔵すること
は普通の農業習慣であり、しかもこれはアルカリ（通常
はアンモニア）の添加を伴う場合が多いということにお
いてアルカリ抽出はさらに重要であり、CADアンチセン
スを用いて形質転換した飼料作物から調製した貯蔵牧草
が、普通のリグニン濃度よりも低い濃度を有し、向上し
た消化性をもたらすことが期待し得る。

フロントページの続き微生物の受託番号ＮＣＩＭＢ４０５０２ (72)発明者スコツチ，ヴオルフガング，ヴオルターイギリス国．バークシヤー・アルジイ 11・６テイゼツト．クラウソーン，ヒースレーク・パーク．グリーンフインチ・クロス．14 (56)参考文献ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，114，ａｂｓｔｒａｃｔＮｏ. 222827（1991) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，85（15），5546−5550 （1988) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子プロモーター配列と、遺伝子ターミ
ネーターと、mRNAをエンコードするヌクレオチド配列を
含有する挿入領域とからなる組換え体DNAであって、前
記mRNAが、前記ヌクレオチド配列が発現される際に内在
性シンナミルアルコールデヒドログナーゼ遺伝子の発現
を阻害するように、シンナミルアルコールデヒドロゲナ
ーゼをエンコードするものであり、前記のヌクレオチド
配列が配列表の配列番号:1、２、３、４及び５の配列の
中から選択されるものであることを特徴とする組換え体
DNA。
【請求項２】植物のゲノム中に形質転換によって組換え
体DNAを安定的に挿入することからなる植物中のリグニ
ンの含有量又は組成を変化させる方法であって、前記組
換え体DNAが遺伝子プロモーター配列と、遺伝子ターミ
ネーターと、mRNAをエンコードするヌクレオチド配列を
含有する挿入領域とからなるものであり、前記mRNAが、
前記ヌクレオチド配列が発現される際に内在性シンナミ
ルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を阻害する
ように、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼをエン
コードするものであり、前記のヌクレオチド配列が配列
表の配列番号:1、２、３、４及び５の配列の中から選択
されるものであることを特徴とする、植物中のリグニン
の含有量又は組成を変化させる方法。
【請求項３】英国、アバーディーン所在のThe National
Collection of Industrial and Marine Bacteriaに199
1年４月８日に40401の寄託番号で寄託されているプラス
ミドpTCAD19又は1991年４月17日に40404の寄託番号で寄
託されているプラスミドpTCAD14から誘導されたタバコC
AD遺伝子であって、配列表の配列番号:1又は配列番号:2
のヌクレオチド配列を有するタバコCAD遺伝子。
【請求項４】英国、アバーディーン所在のThe National
Collection of Industrial and Marine Bacteriaに199
2年４月２日に40501の寄託番号で寄託されているプラス
ミドpZCAD1から誘導されたトウモロコシCAD遺伝子であ
って、配列表の配列番号:5のヌクレオチド配列を有する
トウモロコシCAD遺伝子。
【請求項５】英国、アバーディーン所在のThe National
Collection of Industrial and Marine Bacteriaに199
2年４月２日に40500の寄託番号で寄託されているプラス
ミドpPOPCAD1から誘導されたポプラCAD遺伝子であっ
て、配列表の配列番号:3のヌクレオチド配列を有するポ
プラCAD遺伝子。
【請求項６】英国、アバーディーン所在のThe National
Collection of Industrial and Marine Bacteriaに199
2年４月２日に40502の寄託番号で寄託されているプラス
ミドpEUCAD1から誘導されたユーカリCAD遺伝子であっ
て、配列表の配列番号:4のヌクレオチド配列を有するユ
ーカリCAD遺伝子。
【請求項７】英国、アバーディーン所在のThe National
Collection of Industrial and Marine Bacteriaに199
1年４月８日に40401の寄託番号で寄託されているプラス
ミドpTCAD19又は1991年４月17日に40404の寄託番号で寄
託されているプラスミドpTCAD14から誘導されたタバコC
AD遺伝子であって配列表の配列番号:1又は配列番号:2の
ヌクレオチド配列を有するタバコCAD遺伝子を含有する
組換え体DAN。
【請求項８】英国、アバーディーン所在のThe National
Collection of Industrial and Marine Bacteriaに199
2年４月２日に40501の寄託番号で寄託されているプラス
ミドpZCAD1から誘導されたトウモロコシCAD遺伝子であ
って配列表の配列番号:5のヌクレオチド配列を有するト
ウモロコシCAD遺伝子を含有する組換え体DNA。
【請求項９】英国、アバーディーン所在のThe National
Collection of Industrial and Marine Bacteriaに199
2年４月２日に40500の寄託番号で寄託されているプラス
ミドpPOPCAD1から誘導されたポプラCAD遺伝子であって
配列表の配列番号:3のヌクレオチド配列を有するポプラ
CAD遺伝子を含有する組換え体DNA。
【請求項１０】英国、アバーディーン所在のThe Nation
al Collection of Industrial and Marine Bacteriaに1
992年４月２日に40502の寄託番号で寄託されているプラ
スミドpEUCAD1から誘導されたユーカリCAD遺伝子であっ
て配列表の配列番号:4のヌクレオチド配列を有するユー
カリCAD遺伝子を含有する組換え体DNA。