JPH06509465A - 植物におけるリグニン生合成の変性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物におけるリグニン生合成の変性 本発明はリグニン生合成の変性（αｏｄｊｆ’ｆｃａｔｌｏｎ）による植物の改 善に関する：特に、本発明は、これに限定されるものではないが、飼料用作物（ ｒｏｄｄｅｒ　ｃｒｏｐ）の消化性（ｄｉｇｅｓｔａｂ４１１ｔｙ）の改善に関 する。

牧草栽培農家及び他の飼料用作物栽培農家は、毎年、その作物を貯蔵するのため に刈取る時期を決定するという困難な間通に直面する。農業において重要な全て の種の草は、成長と共に通常の乾燥物収量が増加する際に、消化性が減少すると いう不利益を有する。従って、農家は消化性の高い作物をより低い収量で収穫す るか又は消化性の低い作物をより高い収量で収穫するかで妥協しなければならな い。別の制限は、最適な成熟時期に収穫することが不順な天候により阻害され得 ることである。消化性の低下を制御するか又は遅延させることができれば、消化 性のより高い飼料用作物をより高い収量で収穫することか可能であり、また、周 囲の天候条件が収穫した作物の品質を決定するのに重要な役割をすることがない であろう。

飼料用作物の消化性は、他の要因の内、植物の生長中に生起した水化（Ｉ　１ｇ ｎ１ｆｉｃａｔｉｏｎ）の量及び沈着したリグニンの二次変性の程度によって決 定される。セルロースと他の多糖類の他に、リグニンは維管束植物（ｖａｓｃｕ ｌａｒ　ｐｌａｎｔ）の厚膜組織（ｓｃ　ｌ　ｅｒｅｎｃｈｙｇａ）及び木部（ ｘｙｌｅｍ）と同様、組織（ｔｉｓｓｕｅ）の細胞壁の必須成分である。リグニ ンは細胞壁の水に対する透過性を低減させることにより、木部の伝導機能（ｃｏ ｎｄｕｃｔｊｎｇ　ｆｔｏ＋ｃｔｉｏｎ）において重要な役割をする。更にリグ ニンは細胞壁に剛性を付与する働きをし、木質組織においては、リグニンは細胞 の間で結合剤としての働きを行って、植物に衝撃、圧縮及び屈曲に対する抵抗性 を付与する。最後に、リグニンは病原性物質（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎ ｔ）の侵入又は伝播を阻止することにより、病原体に対する抵抗性の機構に関係 する。

リグニンは野外作物の生産性と性能において重要であるたけてなしに、製紙用木 材においても非常に重要である。製紙に必要とされるセルロース繊維からリグニ ンを遊離させ、溶解させそして除去するのにかなりのエネルギーと機械的な人力 を必要とする。

リグニンにより作物植物の用途が束縛されるこれらの場合の他に、リグニンはフ ェノールのごとき、化学合成において先駆体として使用され得る特殊な化学薬品 の製造のための原料としても使用される。

従って、リグニンとその生物学的及び化学的変性物は重要である。

本発明の一つの目的は植物におけるリグニン含量とリグニン組成の両者を変性す るための生物工学的方法を提供することである。

リグニンは３種の一次先駆体（ｐｒｉｍａｒｙ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）　：　ト ランスーコニフエリル（ｔｒａｎｓ−ｃｏｎｉｆｅｒｙｌ）　、トランス−シナ ビル（ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｙｌ）及びトランス−クマリル（ｔｒａｎｓ−ｃ ｕｓａｒｙｌ）アルコールの脱水素重合の生成物である。これらの単量体は種々 の割合でリグニン中に出現し、かつ、これらの単量体同志及びこれらの単量体と 周囲の細胞壁の多糖類とは種々の形式で結合しており、かくして、多数の種類の 重合体が形成される。これらの重合体、即ち、“リグニンコア”（”１１ｇｎ１ ｎ　ｃｏｒｅ”）は、常に、ヘミセルロースを共有結合により随伴している。大 部分のリグニンは種々の量の芳香族カルボン酸もエステル状の組合せて含有して いる。かかるリグニンの構造における相違は植物種内において通常見出だされる 。しかしながら、リグニンの組成における相違、及び、−次及び二次細胞壁との 結合における相違は、同一の植物内において、異なる組織間或いは異なる樹齢間 で見出だされる。リグニン単量体の生合成は、フラボノイド色素、イソフラボノ イド、クマリンフィトアレキシン及び細胞分割促進デヒドロジコニフエリルグル コシドを包含する広範囲の化合物も生成させる、フェニルプロパノイド（ｐｈｅ ｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｊｄ）生合成経路の一部である。

フェニルアラニンか脱アミノ化されることにより桂皮酸か生成する。ついて、こ の酸かヒドロキシル化されついてメチル化されることにより、芳香族環上に置換 基を有する種々の酸が生成される。ついて、ヒドロキシ桂皮酸塩　Ｃｏ＾リガー ゼの作用により、補酵素Ａ１（ｐ）−クマリン酸、フェルラ酸及びシナピン酸の チオエステルが生成される。その後、これらの化合物かシンナミル−ＣｏＡレダ クターゼ（ＣＣＲ）により還元されてシンナムアルデヒドが生成し、最後に、こ のシンナムアルデヒドがシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）によ りシンナミルアルコールに転化される。最後の２つの反応だけがリグニンの生合 成について特異的である。ついてシンナミルアルコールは細胞壁に移入され、こ こで過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼにより重合すると考えられる。

細胞の表面生長が停止したとき、続いて細胞壁の厚さの増加工程（二次細胞壁形 成）が行われる。水化は主としてこの工程中に生起する。水化は細胞の端部にお いて開始し、中間のラメラ（ｌａｍｅｌｌａ）に沿って、−次細胞壁から、最後 に二次細胞壁へと進展する。外部要因（ｅｘｔｅｒｎａｌ　ｆａｃｔｏｒ）によ り水化における定性的及び定量的変性が誘導され得る。しばしば、通常は水化さ れない組織における、新規な種類のリグニンの合成は病原性微生物の感染によっ て誘導され得る。水化は光により、並びに、低いカルシウム濃度により、硼素に より、機械的なストレスにより及び感染により刺激され得る。

シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ：　（ＣＡＤ、Ｅ、Ｃ，１，１，１，１ ９５）はシンナムアルデヒドのシンナミルアルコールへの転化を触媒する。

［ボプルス　ユーラメリカナ（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｒａｓｅｒｉｃａｎａ）　 ］及びユーカリ（ｅｕｃａｌ　ｙｐｔｕｓ）についてのＣＡＤの特性が決定され ている。

大部分の場合、各々の種について一つの形のＣＡＤシか検出されていないが、ダ イスは２種のイソ酵素、即ち、４３，０００ダルトンのものと６９．０００ダル トンのものを有する。第一のダイスイソ酵素はコニフエリルアルコールに対して 特異的であり、一方、６９，０００ダルトンのダイズーイソ酵素と他の全てのＣ ＡＤは全てのシンナミルアルコール（即ち、コニフェリル、シナビル及びクマリ ルアルコール）の形成を触媒する。しかしながら、種々のシンナミルアルコール についてのＣＡＤの藷は、異なる種からの酵素の間で変化する。この変化は、種 が異なる場合にリグニンコアの組成が異なることを説明し得る。

実際に、リグニン単量体は植物内ではＣＡＤ及びＣＣＲを包含していない生合成 経路においては合成され得ない。従って、ＣＡＤ並びにＣＣＲは水化の制御にお けるキー酵素であり得る。これらの酵素に対して特異的な抑制剤の使用すること により、これらの抑制剤はリグニンの組成よりも、その量を制御することが示さ れている。しかしながら、種々のシンナミルアルコールについてのダイズＣＡＤ イソ酵素のｋｍ値は、ＣＡＤイソ酵素かある種のリグニンの組成を制御し得るこ とを示している。他のアルコールデヒドロゲナーゼについてのごとく、ＣＡＤの 活性のためにはＺｎ２＋の存在か必要である。ＮＡＤＰの代わりにＮＡＤか存在 する場合には、シンナムアルデヒドの還元はＣＡＤにより触媒され得ない。ＣＡ Ｄの普通のサブユニット構造は約８０．０００ダルトンのダイマーであると考え られる（各々の単量体は約４０，０００の分子量を有する）。しかしながら、ダ イス酵素は、ｃＤＮ＾クローンの分析に基づいて、８５．０００の分子量を有す る単量体であると報告されている。マメ細胞懸濁培地を、ダイズ病原体コレクト ロトリクムリンデムンアヌム（Ｃｏｌｌｅｃｔｒｏｔｒｉｃｈｕａ　ｌｉｎｄｅ ｍｕｔｈｉａｎｕｍ）の菌糸細胞壁（ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌνａｌ　ｌ） から熱遊離させた高分子量エリジター製剤（ｈｉｇｈ−ｓｏｌｅｃｕｌａｒ−ａ ＋ａｓｓ−ｅｌ＋ｃｉｔｏｒ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）で処理することにより 、ＣＡＤの抽出性活性（ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）か増大す る。ＣＡＤ活性の増大は病原性微生物に対する防御反応と見做され得るが、これ は、この酵素の活性の増大は感染した細胞の細胞壁におけるリグニンの沈着又は 防御応答に関係する細胞外リグニン状物質及び他のフェノール化合物の合成に関 係し得るという理由によるものである。

Ｗａｌｔｅｒ等（１９ｆ１８）はエリジター処理マメ細胞からラムダｇｔｌｌ　 ｃＤＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーを極性（ｐｏｌａｒ）ＣＡ Ｄ酵素に対して生じた抗体を使用してスクリーンして、ＣＡＤ　ｃＤＮＡクロー ンを同定した。１．２　ｋｂの長さのｃＤＮ＾クローンを単離し、クローン４ａ と命名した。しかしながら、その後の実験はこのクローンはＣＡＤをエンコード せずに、リンゴ酸酵素をエンコードすることを示した（　Ｑａｌｔｅｒ等１９９ ０）。

従って、ＣＡＤは作物植物の変性のための有用な標的ではあるけれども、実際に は、これを使用する方法を入手される情報を使用して実施することは不可能であ る。本発明を導くための研究により、等質性（ｈｏｓｏｇｅｎｅｉ　ｔｙ）のた めのＣＡＤ酵素及び種々の種からのＣＡＤ　ｃＤＮ＾の新規な単離方法であって 、今や、作物植物の水化の変性に使用し得る方法か提供される。

例えば、減少した量のリグニン又は変性されたリグニン組成を有する植物はラン の飼料としてより効率的に使用されるであろう。従って、乳及び肉の収量が増大 するであろう。更に、リグニ＞ｉ、を植物の生長に負の効果を有し得る。例えば 、コムギ、アブラナ（ＯｌｌＳｅｅｄｒａｐｅ）　、テンサイ又はトウモロコシ のごとき作物における水化の減少により、恐らく、穀粒の収量が増大し得る。減 少したリグニン含有量又は変更されたリグニン構造を有する樹木は、パルプ化の 際により少ない量のリグニンを除去することになるので、紙の価格を低減させる であろう。一方、セルロース繊維の純度のため、他の方法ては製造し得なかった 新規な紙を製造し得る。

本発明の主要な用途は飼料作物の消化性の改善、セルロース繊維抽出のための木 材原料中のリグニンの減少、病原体の攻撃に対する作物植物の応答の改善及び木 材品質（ｔｉｍｂｅｒ　ｑｕａｌｉｔｙ）の改善である。

これらの用途のあるものにおいては、リグニンの全体的な量か減少することが要 求され得る。他の用途においては、リグニンの量を増大させることが要求され得 る。特定の用途においては、リグニン重合体の化学的組成の変更により利益がも たらされる場合もあり得る。

木材原料からセルロース繊維を抽出するための工業的方法は、本質的にリグニン を除去するための化学的抽出法に相当する。リグニンが木材原料から除去された 後、セルロース繊維を回収し、紙を製造するか又は他の方法で使用し得る；例え ば、セルロース繊維を更にセルロースフィルムに加工するか又は織成するか又は 編成して布にし得る。木材原料として使用される植物、通常、樹木によって合成 されるリグニンの減少はかかる抽出法において要求される薬品とネルギーを低減 させるという直接的な効果を有しかつ主要な環境汚染源として十分に認忠されて いる、そして、処理することが困難でかつ費用を要する廃棄物質の量を減少させ るであろう。リグニンの化学的組成の変更は、使用される化学的抽出剤中でのリ グニンの溶解特性を潜在的に変化させるであろう。同様に、リグニンの化学的組 成の変化は薬品の使用量の低減とエネルギーの必要量の低減とを直接的にもたら す。最後に、現在は不適当な植物種のリグニン品質の変化は、製紙工業及び切断 木材工業用の別の原料を提供し得る。

水化の減少は植物に化学的抑制剤を適用することにより達成し得る。しかしなが ら、リグニンの沈着と構造を制御するためのより効果的な方法はアンチセンスＲ Ｎ＾を使用してＣＡＤ遺伝子の発現を抑制することである。アンチセンスＲＮＡ 技術は、水化の抑制のための適当な分子生物学的方法である。アンチセンス技術 は非コーディング（ｎｏｎ−ｃｏｄ　ｉｎｇ）ＤＮＡ鎖（ナンセンス）の転写に よって形成されるＲＮＡである。従って、アンチセンスＩ？ＮＡはコーディング ＤＮＡ鎖と同一の配列を有しかつ特定の遺伝子の＋ｌＲＮ＾生成物と相補的であ る。

周知のごとく、細胞によるタンバーク質の製造はこのタンパク質についての遺伝 子のＤＮＡを転写してＲＮＡを形成し、ついでこのＲＮＡを加工して（例えば、 イントロンの除去により）メツセンジャーＲＮ＾とし、最後に、リポソームによ りタンパク質に翻訳するとにより行われる。このプロセスは細胞中に“アンチセ ンスＲＮ＾”が存在することにより抑制される。従って、本明細書中で使用され るごとく、“アンチセンスＲＮＡ”という用語は、５ＲＮＡ中の塩基の配列と相 補的なＲＮＡ配列を意味するユニの相補的という用語は、アンチセンス配列（３ °〜５°センス中で読まれる）中の各塩基（又は大部分の塩基）が、５゛〜３° センス中で読まれるｍＲＮＡ中の対応する塩基と対になることができるというこ とを意味する（ＧとＣ，ＡとＵ）。この阻害はＲＮＡの２本の相補鎖（ｃｏｍｐ ｌｅｍｅｎｔａｒｙ　５ｔｒａｎｄ）の間で複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成さ れ、タンパク質の形成が阻害されることにより生ずると考えられる。この複合体 がどのように作用するかは明らかではない：複合体は更に転写、プロセッシング 、輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）又は翻訳を阻害し、或いは、ｍＲＮＡを分解しく ｄｅｇｒａｄｅ）　、或いは、これらの作用の二つ以上を有し得る。かかるアン チセンスＲＮ＾は、関連する遺伝子（又はこれと実質的な相同性（ｈｏ＊ｏ　ｌ 　ｏｇｙ）を示すＤＮＡ配列）の、（鋳型鎖と反対の）コーディング鎖の後方部 分を転写するために配置された適当なりＮＡ構築物を用いる形質転換により細胞 内で製造し得る。

特定の植物遺伝子の発現をダウンレギュレートさせる（減少させる）　（ｄｏｖ ｎｒｅｇｕｌａｔｅ）ためのこの技術の使用は、例えば、ＩＣ１社の欧州特許公 開第２７１９８８号に記載されている。遺伝子の発現の減少により植物の表現型 （ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に変化が生ずる：この表現型の変化は全体的な可視表現 型の相違（ｇｒｏｓｓ　ｖｉｓｉｂｌｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｒｒｅｒ ｅｎｃｅ）の水準において生ずる１例えば、トマトの果実内でのリコペンの合成 か行われなくなり、赤色果実の代わりに黄色の果実が産生されるという形で生ず る。或いは、表現型の変化は、より微妙な（ｓｕｂｔｌｅ）生化学的な水準で生 ずる１例えば、トマトの果実の熟成中におけるポリ力うクツロナーセの量の変化 及びペクチンの解重合の減少として生ずる（Ｓｍｉｔｈ等、　Ｎａｔｕｒｅ、３ ３４．７２４−７２６．１９８８；　Ｓｍ１ｔｈ等、　ＰｌａｎｔＭｏｌ、Ｂｉ ｏｌ、１４．３８９−３８０．１９９０）　、従って、アンチセンスＲＮＡは植 物の遺伝子の発現のダウンレギュレーションを達成するのに有用であることが証 明されている。

本発明の目的はリグニンを合成するための変更された能力を有する植物を提供す ることである。

本発明によれば、遺伝子プロモーター配列、コーディング領域及び遺伝子ターミ ネータ−を順次に有する植物ＤＮＡからなる組換え体ＤＮＡであって、上記コー ディング領域は、リグニンの生合成に必要な酵素をエンコードする内在植物遺伝 子又はその一部によってエンコードされるｌｌＲＮＡと実質的に相同性であるか 又は相補性であるｍＲＮＡをエンコードするヌクレオチド配列からなり、従って 、形質転換により植物ゲノム中に組込まれた場合、上記コーディング領域から転 写されたｍＲＮＡは内在植物遺伝子からの前記酵素の産生を抑制するものである 、組換え体ＤＮＡか提供される。

コープインク領域は前記の内在遺伝子によってエンコードされるｍＲＮＡとアン チセンス配向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にあるｍＲＮＡ をエンコードする二とか好ましい。かかるアンチセンス配列は前記内在遺伝子を エンコードするＤＮＡの非転写鎖（ｕｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　５ｔｒａｎｄ ）から単離（ｉｓｏｌａｔｅ）　Ｌ得る。

しかし、なから、コーディング領域は、別の場合においては、前記の内在遺伝子 と同一の配向てあり得る。かかる構造は内在酵素（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｅ ｎｚｙｍｅ）の過剰産生（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔ　１ｏｎ）を導くか又は内在 酵素の産生を抑制し得る。

コーディング領域は５０塩基の最小寸法を有することか好ましい。

リグニンの産生を制御するための標的酵素はシンナミルアルコールデヒドロゲナ ーゼ（ＣＡＤ）　、シンナモイル（ｃｉｎｎａｓｏｙｌ　）・Ｃｏ＾レダクター ゼ（ＣＣｌ２）及びカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）か らなる群から選択し得る。

プロモーターは植物内で作動することが知られているプロモーターから選択し得 るが、ＣａＭＶ３５ｓ　、　ＧＰＡＬ２　、ＧＰＡＬ３及び内在標的酵素の発現 を制御する内在植物プロモーター、例えば、ＣＡＤ遺伝子のプロモーターからな る群から選択することが好ましい。

本発明によれば、更に、遺伝子プロモーター配列、コーディング領域及び遺伝子 ターミネータ−を順次に有する植物ＤＮＡからなる組換え体ＤＮＡであって、上 記コーディング領域は、リグニンの生合成に必要な酵素をエンコードする内在植 物遺伝子又はその一部によってエンコードされる１ＲＮＡと実質的に相同性であ るか又は相補性であるｍＲＮＡをエンコードするヌクレオチド配列からなり、従 って、形質転換により植物ゲノム中に組込まれた場合、上記コーディング領域か ら転写されたｍＲＮＡは内在植物遺伝子からの前記酵素の産生を抑制するもので ある組換え体ＤＮＡを、形質転換により植物のゲノム中に安定に組込むことから なる、植物内でのリグニンの生合成を抑制するか又は変更する方法が提供される 。

更に、本発明によれば、リグニンを生成する通常の能力より低い能力を有する形 質転換植物であって、上記植物はそのゲノム中に前記したごとき組換え体ＤＮＡ が安定に組込まれていることを特徴とする形質転換植物が提供される。かく形質 転換され得る植物の例はトウモロコン、ユーカリ、アスベン、ポプラ及びタバコ である。しかしながら、本発明はこれらの作物に限定されるものではなく、適当 な一次的用途はアルファルファ、ロリウム（Ｉｏｌｉｕｍ）及びフェスツカ（ｒ ｅｓｔｕｃａ）のごとき飼料作物にあるであろうと考えられる。しかしながら、 リグニン合成の制御は多数の作物において広範囲の重要な用途を有する。

本発明によれば、更に、組換え体ＤＮＡの構築に使用するのに適当な遺伝子の、 下記のごとき供給源が提供される。

（ｉ）プラスミドｐＴｃＡＤ１４又はｐＴｃＡＤ１９　（タバコＣＡＤ）　：こ れらは、英国、アハーディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）所在のＴｈｅ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔ［ｏｎｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉ ｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに、Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＸＬＩ　Ｂｌｕｅを宿主（ｈｏｓ 　ｔ　）として、それぞれ、１９９１年４月１７日に４０４０４の寄託番号で、 また、１９９１年４月８日に４０４０１の寄託番号で寄託されている。

（ｌｉ）プラスミドｐＺｃＡＤｌ　（トウモロコシＣＡＤ）　：これは英国、ア バーディーン所在のＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　 １ｎｄｕｓｔｒ［ａｌ　ａｎｄＭａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに、Ｅ、ｃｏｌ ｉ菌株ＸＬＩ　Ｂｌｕｅを宿主として、１９９２年４月２日に４０５０１の寄託 番号で寄託されている。

（Ｎｉ）プラスミドｐＰＯＰｃＡＤｌ　（ポプラＣＡＤ）　＋これは英国、アバ ーディーン所在のＴｈｅ　ＮａＬＩＯｎａｌ　Ｃ０１ｌｅＣｊｌＯｎ　０ｒＩｎ ｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄＭａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに、Ｅ、ｃｏｌｉ菌 株ＸＬＩ　Ｂｌｕｅを宿主として、１９９２年４月２日に４０５００の寄託番号 で寄託されている。

（ｉｖ）プラスミドｐＥＵｃＡＤｌ　これは英国、アバーディーン所在の丁ｈｅ 　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａ ｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　に、Ｅ、ｃｏｌｉ閑株ＸＬＩ　Ｂｌｕ ｅを宿主として、１９９２年４月２日に４０５０２の寄託番号で寄託されている 。

これらのプラスミドは特許出願を目的とする微生物の寄託に関するブダペスト条 約の規定に基づいて寄託されている。

従って、本発明はクローンｐＴＣＡＤ１４、ｐＴＣＡＤ１９、ｐｚｃＡｏｔ、ｐ ＰＯＰｃＡＤｌ及びｐＥＵｃＡＤｌ、及び、遺伝コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒ ａｃｙ）によって許容されるごときその変種又はその機能的均等物中に含有され るＤＮＡインサートも包含する。本発明によれば、更に、植物内て作動する転写 調節配列の制御下にある前記ＤＮＡを含有する、従って、通常のｍＲＮＡに関し て完全な長さくｆｕｌ　ｌ−ｌｅｌ−１ｅｎであるか又は部分的な長さくｐａｒ ｔｉａｌ　ｌｅｎｇｔｈ＞であり得るｍＲＮＡを植物内で生成し得る組換え体Ｄ ＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）が°提供される。

リグニン合成のダウンレギュレーンヨンのためには、前記ＤＮＡはアンチセンス 又は”センス”配向である。

リグニン生合成の増幅（ａｐｉｐｌｉｆｉｅａｔｉｏｎ）のためには、前記ＤＮ Ａはセンス配向てあり、従って、植物ゲノム内で前記ＤＮＡの一つ又はそれ以上 の追加のコピーが提供される。この場合、ＤＮＡは完全な長さのＤＮＡである。

従って、別の要旨においては、本発明によれば、ｐＴＣＡＤ１４、ｐＴｃＡＤ１ ９　、ｐＺｃＡＤｌ、ｐＰＯＰｆ４Ｄｌ及びｐＥＵｃＡＤｌ中の遺伝子によって 生成されるタンパク質をエンコードするｍＲＮＡと実質的な相同性を示す塩基の 実質的な連続部分（ｒｕｎ）と相補的なＲＮＡをエンコードするＤＮＡ配列の転 写のために配置された、植物内で作動する転写開始領域を含有するＤＮＡ構築物 か提供される。

本発明によれば、更に、ゲノム中に前記ＤＮＡがセンス又はアンチセンス配向で 安定に組込まれている植物細胞及びこれに由来する植物及びかかる植物の果実及 び種子か提供される。

本発明は主としてリグニンの形成の抑制に関するものであり、その場合、挿入遺 伝子はアンチセンス配向てあろう、しかしながら、例えば、植物の茎の長さを改 善し、植物の高さを減少させかつその結果として倒木（ｌｏｄｇｉｎｇ）を減少 させるため及び病害に対する抵抗性を改善するためには、リグニンの過剰産生は 有利な効果を有し得る；従って、本発明によれば、植物のリグニン生合成能力の 増幅を達成する手段が提供される。

従って本発明は一般的には植物のリグニン合成経路の調節に関する：この場合、 本発明の主題であるＣＡＤ遺伝子の余分なコピー（ｅｘｔｒａ　ｃｏｐｙ）を供 給することによりＣＡＤの産生及びリグニンの生成を増大させるために、或いは 、ＣＡＤ遺伝子又はその一部（通常、５０塩基又はそれ以上）をアンチセンス配 向て挿入し、その結果、リグニン合成を触媒するＣＡＤの量を減少させることに よりＣＡＤの産生及び従ってリグニンの生成を減少させるために、ＣＡＤが主要 な役割をする。

本発明の構築物を植物中の挿入することによりＣＡＤ酵素の産生を調節し得る。

構築物の種類に応じて、タンパク質の生成か植物の寿命の全体に亘って或いは特 定の段階において増大し或いは減少する。

表皮、木部、根等のごとき植物の特定の種類の細胞に特異的な遺伝子の発現を標 的とすることもできる。

本発明を適用し得る植物とし、ではアルファルファ、トウモロコシ、アブラナ、 牧草（「ｏｒａｇｅ　ｇｒａｓｓ）及びヒマワリのごとき商業的に重要な食料用 及び飼料用植物及び更にユーカリ（ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、マツ種（ｐｉｎｅ 　５ｐｅｃｉｅｓ）及びポプラのごとき樹木が挙げられる。

本発明によるＤＮＡ１築物はｐＴｃＡＤ１９又はｐＴＣＡＤ１４中の挿入物のＤ ＮＡとｔ目間性の、少なくとも５０塩基の配列を含有することか好ましい。塩基 配列には理論的な−Ｌ限値はない一塩基配列は細胞によって生成される関連する ｍＲＮＡのことき長さて在り得るーしかしながら、便宜であるためには、一般的 に、長さか１００〜１０００塩基の配列を使用することが適当であることが見出 たされるであろう。かかる構築物の調製は以下においてより詳細に説明する。

本発明で使用するだめのアンチセンスＩ？ＮＡの好ましい供給源はクローンｐＴ ｃＡＤ１９及びｐ丁ＣＡＤ１４から誘導されるＤＮＡである。アンチセンスＲＮ ＾をニジコードする所要のＤＮＡは種々の方法により取得し得る：即ち、ｐＴｃ ＡＤ１９又はｐＴｃＡＤ１４　（又はＣＡＤ遺伝子の他の任意の供給源）からの ＤＮＡの適当な配列を切断することにより：アンニールしついて各々の端部に適 当な制限部位か形成されるように連結した合成オリゴヌクレオチドを使用してＤ ＮＡ断片を合成することにより。

ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）において合成オリゴヌクレオチドを使用して各々 の端部に適当な制限部位を有する所要の断片を形成させることにより取得し得る 。ついてＤＮＡを上流側プロモーター配列と下流側ターミネータ−を含有するベ クター中にクローンする：クローニングはＤＮＡ配列がその配向に関して該ＤＮ Ａ配列を切出たした鎖中のプロモーターに対して反対になるように行われる。新 規なヘクグーにおいては、以前は鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ　５ｔｒａｎｄ）で あった鎖かコーディング鎖になるか、又は、その逆である。従って、新規なヘク ターはｐＴｃＡＤ１９及びｐＴｃＡＤ１４の塩基配列と相補性である塩基配列中 のＲＮＡをエンコードするであろう。従って、２種のＲＮＡ鎖はその塩基配列に おいてたけてなしに、その配向（５゛〜３°）においても相補性である。

転写のためのＤＮＡ塩基配列の供給源としてはｐＴｃＡＤ１９及びｐＴｃＡＤ１ ４のごときｃＤＮ＾ＤＮＡンを使用することか好都合である。

ｐＴＣＡＤ１９の塩基配列は第３図に示されており、ｐＴＣＡＤ１４の塩基配列 は第４図に示されている。

転写のための塩基配列についてのＤＮＡの供給源は、ＣＡＤ遺伝子自体のプロモ ーター、又は、フェニルアラニンアンモニア１１アーセ遺伝子又は木質部組織に おける発現を可能にするその変性物（ｍｏｄｉｒｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏｎ）のプ ロモーターごとき、本化に関係する他の遺伝子のプロモーターである。かかる遺 伝子はイントロンか存在し得ることにおいてｐＴＣＡＤ１９又はｐＴＣＡＤ１４ のｃＤＮＡとト目違する。イントロンは１ＲＮＡ中に転写されない（或いは、転 写された場合には、後に切断、除去される）。転写を行うための塩基配列の供給 源としてかかる遺伝子の部分を使用する場合には、イントロン領域又はエクソン 領域を使用し得る。

転写を行うための適当なりＮＡ塩基配列を得るための別の方法は適当な塩基から 最初から（ａｂ　１ｎｉｔｉｏ）合成することである。本発明による組換え体Ｄ ＮＡ及びベクターは以下のごとくして調製し得る。転写を行うだめの所望の塩基 配列を含有する適当なベクター（例えば、ｐＴｃＡＤ１９　）を制限酵素で処理 して塩基配列を切断する。かく得られたＤＮＡ鎖を、所望のプロモーター配列（ 例えば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ　ＲＮ＾プロモーター又はマメＰ ＡＬプロモーターーＢｅｖａｎ等、ＥＭＢＯＪ、８．１８９９−１９０８１９８ ８）と、所望のターミネータ−３：・とを含有する第２のベクター中に（逆の配 向て）クローンする。

本発明によれば、環境に応して、構成プロモーター（ｃｏｎｓｔ＋ｔｕｔ＋ｖｅ 　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）　（例えば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ　ＲＮ Ａ）及び誘導性の（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）又は展開的に（ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅ ｎｔａｌ　ｌｙ）制御されるプロモーター（例えば、ＦＡＩ、遺伝子プロモータ ー又は内在ＣＡＤ遺伝子プロモーター）の両者の使用が提案される。構成プロモ ーターの使用は植物の全ての部分の機能に影響を与えるであろうニ一方、組織特 異的プロモーターを使用することにより、機能をより選択的に制御し得る。組織 特異的プロモーターを使用することは、アンチセンス又はセンスＲＮＡがその作 用が要求される組織においてたけ生成されるという利点を有する。

本発明によるベクターは所望されるごとき植物を形質転換して、本発明による植 物を製造するのに使用し得る。アルファルファ、アブラナのごとき双子葉植物は 、例えば、Ｂｅｖａｎ　（１９８４）により〜ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、　１２．８７１１−８７２１に記載されるごとき方法でアクロバク テリウムＴｉプラスミド技術により形質転換し得る。かかる形質転換植物は有性 的に（ｓｅｘｕａｌ　ｌｙ＞、又は、細胞又は組織培養により再生産し得る。

植物細胞内でのＲＮＡの生成の程度はプロモーター配列を適当に選択することに より、又は、植物ゲノム中に導入される、本発明によるＤＮＡ配列のコピーの数 又は組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）の部位を選択することにより制御し得る 。この方法においては、水化をより大きな又はより小さな程度に変化させること ができる。

本発明による構築物は当業者に周知の種々の方法により単子葉及び双子葉植物の 両者の細胞を形質転換するのに使用し得る。多くの場合、かかる植物細胞（特に 、植物細胞が双子葉植物の細胞である場合）を培養して全植物を再生させ、つい で、この植物を再生産して遺伝的に修飾された植物の連続的な世代を得ることが できる。本発明に従って遺伝的に修飾された植物の例としては、アルファルファ 、アブラナ、ヒマワリ、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｓ）　、）ウモトコシ、フエス ツカ及びユーカリ、ポプラ及びマツのごとき樹木が挙げられる。

本発明においてはアンチセンス及びセンス発現ベクターを使用することにより、 変性された、即ち、増大した又は減少したｐＴＣＡＤ１９又はｐＴｃＡＤＬ４の 発現を示すトランスジェニック植物の表現型を決定するためにアンチセンスＲＮ Ａを使用する。

本発明を添付図面を参照して更に説明する。

第１図は精製されたタバコＣＡＤタンパク質から決定された部分的アミノ酸配列 を示す。

第２図はＣＡＤクローンを同定するために使用されたオリゴヌクレオチドの塩基 配列を示す。

第３図はｐＴＣＡＤ１９の完全塩基配列を示す。

第４図はｐＴＣＡＤ１４タバコｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す。

第５図はｐＴｃＡＤ１９／ｐＴｃＡＤ１４のＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ 断片を使用するアンチセンス及びセンスベクターの構築を示す。

第６図は完全タバコＣＡＤ　ｃＤＮＡクローンを含有する発現ベクターの構築を 示す。

第７図はｐＰＯＰｃＡＤｌの完全塩基配列を示す。

第８図はｐＥＵｃＡＤｌの完全塩基配列を示す。

第９図はＰＣＲによりトウモロコシＣＡＤクローンを生成させるために使用した プライマーの塩基配列を示す。

第１Ｏ図はｐＺｃＡＤｌ、トウモロコシゲノムＤＮＡからの２００ｂｐ生成物の 塩基配列を示す。

第１１図は対照植物とアンチセンス植物のＣＡＤ活性を示す。

本発明を実例として以下の実施例により説明する。

ＣＡＤを精製するために改良方法を開発した。この新規方法はすてに公表されて いる方法よりも簡単であり、下記の工程に基づいている。

６週齢のタバコの茎を液体窒素中で凍結させ、ノ１ンマーて粉砕し次いてワーリ ング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレングー中において緩衝液Ａ中でホモシナイスした。得 られたホモジネートを４５０００　Ｘ　ｇで３０分間遠心分離した。得られた上 清に固体硫酸アンモニウムを添加して上清を７０９６硫酸アンモニウム飽和濃度 に上次いてタンパク質類を４℃で３０分間沈殿させた。沈殿物を１０．０００ｒ ｐｓで１時間遠心分離することにより採取した。得られたペレットを、５％エチ レングリコールを補足した最少限の容量の緩衝液中に再懸濁して、硫酸アンモニ ウム濃度を約４００６飽和濃度にまで下げた。再懸濁しなかった物質を遠心分離 により除去した。

２　ブルーセファ０−ス上でのアフィニティークロマトクラフィー得られた上清 を脱塩し、ブルーセファロース（Ｂｌｕｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムにかけ た。このカラムを、４　ｍＭ　ＮＡＤを補足した１カラム容量の緩衝液を含めて 少なくとも６カラム容量の緩衝液中で洗浄した。この洗浄により、他のアルコー ルデヒドロゲナーゼ類が溶出される。

ＣＡＤの特異的溶出を、緩衝液Ｂ中のＮＡＤＰ　Ｏ〜４　ｍＭの濃度勾配で行っ た。ＣＡＤ−含有画分を溜めておき、５％エチレングリコールを加えた。

３、ＭｏｎｏＱ上でのイオン交換ＦＰＬＣブルーセファロースカラムから溶出さ せて溜めておいた画分を、ＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｑカラムにかけた。このカラムを 、吸光度がベースラインレベルに下がるまで洗浄した。タンパク質類は、２０〜 ４００１Ｍトリス−ｔ（ＣＩ、　ｐＨ７，５を用いて緩衝液の直線勾配で溶出さ せた。

恥ｎｏＱ画分を２°５′＾ＤＰ−セファロースのカラムにかけた。このカラムを 、４　ＩＩＭ　ＮＡＤを補足した１カラム容量の緩衝液を含めて少なくとも６カ ラム容量の緩衝液中で洗浄した。特異的溶出を、０〜４　ａＭＮＡＤＰを用いて 緩衝液の直線濃度勾配で行った。

この方法を使用して、タバコのＣＡＤを均質性になるまで精製した。

４　Ｋｇの材料から６００μｇを得た。これは０．０５％全可溶性タンパク質に 相当する。これは約２０００倍の精製に相当する。精製された酵素は、１７３ｎ Ｋａｔ／ａ＋ｇタンパク質の特異活性を有する。得られた純粋な酵素はＮＡＤＰ に特異的であり、コニフエリルアルコールについて１２μモル／ｇのＫｔａを示 す。

精製したＣＡＤは分子量約４２．５　ｋＤａと４４　ｋＤａの２つのサブユニッ トからなる。上記ＣＡＤタンパク質（銀染色により２つの別々のハンドとして同 定された）を含有する天然（ｎａｔｉｖｅ）ゲルから別々に中離した切片を、Ｓ ＤＳゲルに移し、ＳＤＳゲル上を流す（ｒｕｎ）と、それぞれの天然型（ｎａｔ ｉｖｅ　ｆｏｒｍ）は両方のポリペプチドを含有しているように思われる。純粋 なタンパク質を逆相ＨＰＬＣカラム上に流し、おそらくは前記の２つのポリペプ チドと思われる十分に分離された２つのタンパク質ピークを得た。それぞれのポ リペプチドについてのＮ−クロロコハク酸イミド／尿素を用いたペプチドマツピ ングと、精製した２つのサブユニットのアミノ酸分析とにより、これらのポリペ プチドが非常に類似していることか示唆される。

２つのペプチドをトリゾ〉ンで消化し、得られた断片の配列を決定した。得られ たペプチドの配列を図１に示す。

図１はＣＡＤが２つの密接に関連したポリペプチドによって代表される（ｒｅｐ ｒｅｓｅｎｔｅｄ＞ことを明確に示している。

６週齢のタバコの茎から抽出したＩ？Ｎ＾を使用して、ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを 作成した。ポリＡ　ＲＮＡ　２０　ｕｇを調製し、ｃＤＮ＾を合成した。この一 部分をλ−ＺＡＰ　ＩＩベクター（商業的に入手し得るクローニングベクター） 中にクローン化した。これにより組換え体８６０．０００個が得られ、そのうち の７００６は、無作為に選択した２４個のクローンについてＰｃｔ？によってＭ １定すると、ｌｋｂ又はそれよりも大きい挿入断片ｅｏｏ、ｏｏｏ個の組換え体 を、図２に示したオリゴヌクレオチドプローブ（ＣＡＤｌ、１６）を使用して選 別した。このオリゴヌクレオチドは、図１からのペプチド配列４と反対方向に設 計した。

強くハイブリダイスする１つのクローンを同定し、精製し、特性決定【７た。こ のクローンｐＴｃＡＤ１９は、１４＋９　ｈｐのｃＤＮ＾ＤＮＡ片を有する。こ のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列の分析により、幾っがの領域が、４２．５　ｋ Ｄａのペプチド（Ｒ１（ＰＬＣから得られたピーク２）を表わす図１に認められ る複数個のペプチド配列と同一の複数個のＤＮＡ配列由来アミノ酸配列を示すこ とから、該ＤＮＡ配列由来アミノ酸配列かＣＡＤクローンを表わすことが明らか に例証される。

タバコの茎のｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを代表するクローン８００，０００個を、ｐ ＴＣＡＤ１９のＥｃｏｆｉ　Ｉ挿入断片を使用して再選別した。追加のクローン ５個を同定し、精製し、特性決定した。

これらのクローンの配列決定は、ｐＴｃＡＤＩ９と異なる２個のｃＤＮ＾ＤＮＡ ンてあってＲＨＰＬＣから得られたピーク１に認められるペプチドをエンコード する２個のｃＤＮ＾ＤＮＡンの同定を可能にした。代表的なりローンをｐＴＣＡ Ｄ１４と呼び、その配列を図５に示した。図５は、このクローンがｐＴｃＡＤ１ ９と異なること及び該クローンがピーク１のタンパク質に由来するペプチド配列 を含んでいることを証明している。

ｐＴｃＡＤ１９とｐＴＣＡＤ１４とを、ＥｃｏＲＩと旧ｎｄＩＩＩを用いて切断 し、得られた塩基９８１個をもつ断片をアガロースゲル電気泳動により単離した 。得られた断片をフレナラ断片Ａを使用して平滑末端化した。次いでこの断片を 、５Ｉｌａｌて切断したｐＪＲ１中にクローン化した。該挿入断片をアンチセン ス配向で含有するクローン類をｐＪＴ１９Ａ及びｐＪＴ１４Ａと呼ふ。該断片を センス配向て含有するクローン類をｐＪＴ１９ｓ及びｐＪＴ１４ｓと呼ぶ。これ らのベクターの組立てを図５に示す。

ｐＴｃＡＤＩ９をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、得られた塩基９ １１１１個をもつ断片をアガロースケル電気泳動により単離した。得られた断片 をフレナラ断片Ａを使用して平滑末端化した。次いてこの断片を、Ｈｊｎｃ■で 切断したｐＭＫＪ中にクローン化した。ｐＭＫ４は発現ベクターであり、豆（ｂ ｅａｎ）のフェニルアラニンアンモニアリアーゼプロモーターのＤｒａｌ断片と 、多数のクローニング部位と、ｎｏｓ　３°末端とを含有する。該挿入断片をア ンチセンス配向て含有するクローン類を、９ＭＴ１９Ａ及びｐＭＴＩ４＾と呼ふ 。該挿入断片をセンス配向て含有するクローン類をｐＭＴ１９ｓ及びｐＭＴＩ４ ｓと呼ぶ。これらのベクターの組立てを図ｐＴｃＡＤ１９の完全な挿入断片を、 前記プラスミド類をＥｃｏＲＩて制限することにより切除した。得られた複数個 の断片を平滑末端化し、ｐＪｌ？ｌ及びｐＭＫ４中にクローン化した。得られた ベクター類を下記のよｒ＋ｊＴ１９Ｉ’ｓ及びｐＪＴ１４ＦＳ　（センス）１） ＪＴ１９Ｐ＾及びｐＪＴ１４ＦＡ　（アンチセンス）ＩＩＨＫ４に基づくベクタ ー類。

ｐＭＴ１９Ｆｓ及びｐＭＴ１４Ｆｓ　（センス）ｐＭＴ１９ＦＡ及びｐＭＴ＋４ １？＾　（アンチセンス）これらのへフタ−類の組立てを図６に示す。

アンチセンス組立て体及びセンス組立て体を、公表されている方法に従って直接 に形質転換することにより、アグロバクテリウム・ツメ７７シエンス（Ａ、　ｔ ｕｍｅｒａｃｉｅｎｓ）　ＬＢＡ４４０４中に導入した。

アンチセンス組立て体の存在と完全な状！！（ｉｎｔｅｇｒｉ　Ｌｙ）とを、制 限酵素消化実験とサザンプロット実験とにより調べて、ベクター類をアグロバク テリウムに伝達する間に組換えが起こっていなかったことを確認した。

（ｂ）円盤状のタバコの葉の形質転換 円盤状のタバコ（Ｎ、　ｔａｂａｃｃｕｇｌ、品種Ｓａｍｓｕｓ）の葉を、十分 に確立され、すてに公表されている方法を使用して形質転換した。前記のＣＡＤ アンチセンス組立て体を含んた植物をＰＣＲにより同定し、さらに分析するため に選択した。

形質転換植物及び形質転換されていない対照植物の両方から得た植物材料を、Ｃ ＡＤ酵素測定に使用した。２００ｓＭｈリス／ＨＣＩ（ｐＨ７，５）と、０５％ （重量／８承）　ＰＥＧ　６０００と、５％（重量／容ｆｉ）　ＰＶＰと、β− メルカプトエタノール（５００μｍ）とを含有するＣＡＤ抽出緩衝液と共に茎材 料を粉砕した。粗ホモジネートを遠心分離し、上清を酵素の供給源として使用し た。検定反応液（ｒｅａｃｔ　ｔｏｎ）は、１０　ｍＭコニフエリルアルコール （５０μｇ）　、１０　ｍＭ　ＮＡＤＰ”　（５０μｇ）、１００１１Ｍトリス ／Ｉ（ＣＩ　（ｐＨ８，８）　（８００μｇ）を含有していた。これを３０℃で ｌＯ分間インキュベートし、次いて酵素抽出物（１００μｇ）を加え、混合物全 部を３０℃でさらに１０分間インキュベートした。水を補足したブランクに対し て（ａｇａｉｎｓｔ）ＯＤ　４００が記録された。各植物から試料１個を取り出 した。分析は重複して（ｉｎ　ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行った。これらの酵素１１ Ｆ＋定の分析結果を図１１に示す。図１１は、形質転換植物が広範なＣＡＤ酵素 活性を示すことを明確に示している。最も低いＣＡＤ酵素活性値を有する植物は 、対照ＣＡＤ酵素値の約１０％を示す。

ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によるアンチセンス遺伝子の存在のＭ１定選択した植 物からＤＮＡを抽出した。ＣａＭＶ又はＰ＾１．プロモーター及びｎｏｓ　３タ ーミネータ−中の配列に対してオリゴヌクレオチド類を、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）におけるプライマーとして使用した。

生成物かＣＡＤ配列であることを確認するために、これら生成物のサザンプロッ トを、ＣＡＤ配列を示す第３のオリゴヌクレオチドを用いて探査した（ｐｒｏｂ ｅｄ）。二の分析により、図１０に示した分析に使用した植物が全てアンチセン ス組立て体を含有していることか証明された。

低いＣＡＤ活性をもつ植物は、戻し交雑し、０殖した（ｓｅｌｆｅｄ）。子孫植 物を、ＣＡＤアンチセンス遺伝子及び低ＣＡＤ酵素表現型の相続可能性について 詳細に分析した。これにより、低ＣＡＤ表現型かアンチセンス遺伝子と分離する （ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）ことが示される。

ｐｕｃ　ｔａ中に構築したポプラｃＤＮＡライブラリーから得た８０，０００個 のコロニーを、ｐＴＣＡＤ　１９から得られた完全なＥｃｏＲＩ挿入断片を用い て探査した。ハイブリダイゼーションを３　Ｘ５ＳＣ、０，５％粉乳中で６０℃ で行った。洗浄を、３　Ｘ５ＳＣ、０，５％ＳＤＳ中て、６０℃で３ｘＯ，５時 間行った。１個のクローンを単離腰ｐＰＯＰｃＡＤｌと命名した。このクローン は１３７１１ｂｐの挿入断片を含有し、ｐＴＣＡＤ　１９に対して７０％の相同 性であった。ｐＰＯＰｃＡＤｌの配列を図７に示す。

ｐＰＯＰｃＡＤｌの挿入断片をＢａｍＨＩ断片として切除し、植物発現ヘクター ｐＧｓＪ７８０Ａ中にアンチセンス配向及びセンス配向でクローン化した。

これらのベクターを使用してポプラとヤマナラシとを形質転換した。

ユーカリからのｃＤＮ＾ライブラリーの確立日齢細胞懸濁培養液から抽出したＲ ＮＡを使用して、ｃＤＮ＾ライブラリーを作成した。ポリＡ＋ＲＮ＾５μｇ−゛ を調製し、これを使用してｃＤＮＡを合成した。これをλｇｔ　１１（商業的に 入手し得るクローニングベクター）のＥｃｏＲＩ制限部位にり０−ン化した。こ れにより組換え体１０６個を得た。そのうちの６０９６は、無作為に選択した２ ４個のクローンについてＰＣＲによって測定すると、ｌｋｂ又はそれよりも大き い挿入断片を有する。

確認した。これは、ＴａｂｏｒとＲ４ｃｈａｒｄｓｏｎによる論文、Ｐｒｏｃｅ ｅｄｉｎｇｓｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｓｙ　ｏｆ’　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　８２．１９１１５年に記載されたようにして、発現ベクターｐＴ？−７中 にユーカリＣＡＤ　ｃＤＮＡをクローニングし、商業的に入手し得る大腸菌（Ｅ 、ｃｏｌｉ）溶原株ＢＬ２１を形質転換させ、Ｔ７プロモーターの制御下でＩ　 ＰＴＧを用いてクローン化遺伝子の発現を誘導し、次いて細胞抽出物全部をＣＡ Ｄ活性について検定することにより達成した。得られた結果により、上記クロー ンが酵素ＣＡＤを特定する（ｓｐｅｃｉ　ｆｙｉｎｇ）ものとして明白に同定さ れた。

増幅させたライブラリー（組換え体り、Ｓ　１０６個）から得られた組換え体ｅ ｏｏ、ｏｏｏ個を、ｐＴｃＡＤ１９のＥｃｏＲＩ挿入断片を使用して選別した。

６個の陽性クローンをプラーク精製した；最も大きいクローンを、ｐＧＥＭ３　 （商業的に入手し得るクローニングベクター）中にサブクローン化し、特性決定 し次いて配列決定した。この完全な長さのクローン（１３９１，ｂｐ）は、アミ ノ酸３５６個をもつタンノ々り質をエンコード腰該タンパク質はツノ１コＣＡＤ の配列と極めて高い相同性を有するし前記アミノ酸の７６４％か同一であり、１ １％か十分に保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）　〕。

このクローンｐＥＵｃＡＤｌの配列を図８に示す。

実施例１６ トモロコンから得た部分ＣＡＤクローンのクローニングｐＴｃＡＤＩ９とｐＰＯ ＰｃＡＤｌとの間で高度に保存された配列から誘導されたＰＣＲＣラプライマー 類９）を適当な条件下で使用してトウモロコンゲノムＤＮＡからＰＣＲ生成物を 生成させた。この生成物をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＩ／−中にクローン化し 、次いてそのヌクレオチド配列を決定した（図１０）。このクローンは、ＤＮＡ 配列を、Ｉ］ＴＣＡＤＩ４／１９の夕／くコＣＡＤ配列と比較することにより、 トウモロコシＣＡＤ遺伝子の一部をエンコードするものと明確に同定された。

実施例１７ アンチセンスタバコＣＡＤを用いて形質転換させたタノ＼コ埴物中の結合された 細胞壁（ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｂｏｕｎｄ）及び可溶性フェノール類の分析 ＣＡＤはリグニン生合成の調節において鍵的役割を果たすと思われ、本実施例は 、ＣＡＤに対してアンチセンスの遺伝子を含有する形質転換細胞中におけるリグ ニンダウンレギュレーンヨンの効果の確認を報告するものである。

リグニンかチオグリコール酸（ＴＧ＾）と反応することは知られておりＣＦｒｅ ｕｎｄｅｎｂｅｒｇらの著作、”Ｃｏｎ５ｔｉｔｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｓ ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｒＬｉｇｎｉｎ（リグニンの構成と生合成）”、Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　（Ｂｅｒｌｉｎ）発行、■９６８年：ｌ　、ＴＧＡＧ グニン抽出を用いる方法が過去において、ｆｉｌ（ｗｏｕｎｄｉｎｇ）後の植物 中に存在するリグニンの量を測定するのに用いられている。しかしながら、簡単 なＴＧ八油抽出、植物組織のある種の別の諸成分が一緒に抽出されるという理由 から、リグニンの量を過大評価する傾向がある。この簡単な方法は、ＴＧ八油抽 出先立って細胞壁のメタノール不溶性成分を一次鹸化する工程を含めるのに適合 させ得る［Ｃａ１ｐｂｅｌ　ＩとＥｌ　ｌ　ｉｓの論文、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｓ、 ３１，７３７（１９９２）〕。

８週齢の試料植物から得た茎節（５ｃｍ）を凍結乾燥し、師部と皮層と表皮とか らなる“グリーン（ｇｒｅｅｎ）組織゛と、木質部と木髄とからなる“木質組織 ”とに分けた。

対照植物及び形質転換植物の１０個の試料それぞれを、Ｃａ１ｐｂｅｌｌとＥＩ ｌｊＳによって報告された方法により、ＴＧ＾抽出（ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ） 細胞壁複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）について盲目的に（ｂｌｉｎｄ）分析し、 Ｆｅｒｒａｒｉｓらの論文、Ｊ、Ｄｊｓｅａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｃｔ、９４，６２ ４（１９８７）に一般的に記載された方法によりメタノール及びアルカリ抽出物 のフェノール類含有量についても分析した。

得られた結果を下記の表１、表２及び表３に報告する。

上記の単位はＡ２８０７ｍｇ乾燥重量であり、括弧内は標準誤差である。

表２ 対照植物と形質転換植物とから得た凍結乾燥某組織から得られたメタノール抽出 フェノール類の含有量の直接的な数値比較上記の単位は乾燥重量ｉｇ当たりのフ ェルラ酸同等物（ｆｅｒｕｌａｔｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）のμｇであり、括 弧内は標準誤差である。

上記の単位は乾燥重量ＩＩｇ当たりのフェルラ酸同等物のμｇであり、括弧内は 標準誤差である。

表３に示した結果はＣＡＤ−アンチセンス植物中のＴＧＡ−抽出複合体の量の増 大を示すものであるが、この増大は、化学組成が変化しているという示唆により 説明でき、しかもこのことは、合成経路におけるＣＡＤ触媒化工程の下流で正常 に合成され且つ上流のフェノール性の酸先駆体の蓄積をもたらす典型的リグニン 重合体の合成をＣＡＤの阻害が阻害するということから、全く意外なことてはな い。

リグニンの性質におけるこの変化は、対照植物と形質転換植物から得られたＴＧ ＡＦｊｉ合体のＵＶスペクトルを比較することにより確認された。別の確認は、 形質転換植物中の付加成分の存在を明らかにするアルカリ性ニトロベンゼン酸化 分析によって得られており、しかもクロマトグラフィー分析はこれら−がフェノ ール性の酸であることを示す。

従って、ＣＡＤのダウンレギュレーションが“リグニン”をより多く除去処理で きるようにし、しかもこの性質はセルロース抽出プロセスの簡便化に反映される であろうということが、ＴＧＡ抽出分析により示される。

同じ特徴は、表２及び表３に報告した分析結果によっても示される。飼料作物を 貯蔵牧草として貯蔵することは普通の農業習慣であす、シかもこれはアルカリ（ 通常はアンモニア）の添加を伴う場合が多いということにおいてアルカリ抽出は さらに重要であり、ＣＡＤアンチセンスを用いて形質転換した飼料作物から調製 した貯蔵牧草が、普通のリグニン濃度よりも低い濃度を有し、向上した消化性を もたらすことが期待し得る。

ｆ：ｌ（３，７Ｐｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒ ｏｍ　ｔｏｂａｃｃ。

ＣＡＤ　ｔｒｙ　ｔｉｃ　ｐｅｏｔｉｄｅｓ。

Ｐｅａｋ　Ｌ　（４４ｋＤａ）　Ｐｅａｋ　２　（４２ｋＤａ）Ｋ／５ＸＬＸＶ 　Ｋ／５ＬＸＶ ＩＮＴＥＲＮＡＬ　５ＥＱＵＥＮＣＥ ’　ＴＴ工ＧＸＡＡ工ＶＫ　ＴＡ工ＧＱＡＡ工Ｖ２　ＦＰＳＤＶＬＲＰＹＴＹＴ ＬＤ　ＰＳＧＬＬＳＰＹＴＹＴＬＶ３　ＦＶＶＤＶ工ＧＫ　ＦＶ’、’ＤＶＡＧ Ｄ４　ドＤＹ工ＮＧＡＭＥＲＤＹＩＮＴＡＭＧ／Ｅ５　ＲＴＬＧ）ＩｓＮ　ＮＤ ＬＧＭＳＮＹＰ６　ＡＭＧＸＸＶＸＶエ フ　ＡＶ／工ＴＰＹＦＤ／Ｙ ８　５Ｇ工ＬＧＬ Ｓｅａｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｏｌｉ　ｏｎｕｃｌｅｏ℃ｉｄｅ　ｕｓｅｃｉ　ｔ。

１ｄｅｎｔｉｆｖ　ａ　ｔｏｂａｃｃｏ　ＣＡＤ　ｃｌｏｎｅＡＴＧ　ＧＡＴ／ ＣＴＡＴ／ＣＡＴＴ／Ｃ／Ａ　ＡＡＴ、’ＣＧＧ工ＧＣｍ　ＡＴＧ　ＧＡ１　０ ロロ １ヘロ ＣＡＤ　ｍｓｓ工ＯＮ　ＩＮ　［５ＫＮＳＲＡＮＤ　Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ　ＰＬＡＮ ＴＳ５ｕｕ４ｏ）Ｉｄ　ｕｏＨｓｓａ」ｃｉｘｅ　り０：）国際調査報告 、　、　Ｎ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１００７７４ｍｙｗｌ１ｍＡ＋＋ｌｌｅｍ＋ Ｎ＋　ＰＣＴ／Ｇ日９２１００７７４フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ （７２）発明者　スコッチ、ヴオルフガング、ヴオルターイギリス国、バークシ ャー・アルシイ１１・６テイゼツト、クラウソーン、ヒースレーク・パーク、グ リーンフインチ・クロス。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．遺伝子プロモーター配列、コーディング領域及び遺伝子ターミネーターを順 次に有する植物ＤＭからなる組換え体ＤＮＡであって、上記コーディング領域は 、リグニンの生合成に必要な酵素をエンコードする内在植物遺伝子又はその一部 によってエンコードされるｍＲＮＡと実費的に相同性であるか又は相補性である ｍＲＮＡをエンコードするヌクレオチド配列からなり、従って、形質転換により 植物ゲノム中に組込まれた場合、上記コーディング領域から転写されたｍＲＮＡ は内在植物遺伝子からの前記酵素の産生を抑制するものである、組換え体ＤＮＡ 。
2. ２．コーディング領域は前記の内在遺伝子によってエンコードされるｍＲＮＡに 対してアンチセンス配向にあるｍＲＮＡをエンコードする、請求の範囲１に記載 の組換え体ＤＮＡ。
3. ３．コーディング領域は前記内在遺伝子をエンコードするＤＮＡの非転写鎖から 単離される、請求の範囲２に記載の組換え体ＤＮＡ。
4. ４．コーディング領域は前記の内在遺伝子と同一の配向である、請求の範囲１に 記載の組換え体ＤＮＡ。
5. ５．コーディング領域は５０塩基の最小寸法を有する、請求の範囲１〜４のいず れかに記載の組換え体ＤＮＡ。
6. ６．前記酵素はシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイ ル：ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）及びカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラ ーゼ（ＣＯＭＴ）からなる群から選択される、請求の範囲１〜５のいずれかに記 載の組換え体ＤＮＡ。
7. ７．プロモーターはＣａＭＶ３５Ｓ、ＧＰＡＬ２、ＧＰＡＬ３及び内在ＣＡＤ遺 伝子の発現を制御する内在植物プロモーターからなる群から選択される、請求の 範囲１〜６のいずれかに記載の組換え体ＤＮＡ。
8. ８．遺伝子プロモーター配列、コーディング領域及び遺伝子ターミネーターを順 次に有する植物ＤＮＡからなる組換え体ＤＮＡであって、上記コーディング領域 は、リグニンの生合成に必要な酵素をエンコードする内在植物遺伝子又はその一 部によってエンコードされるｍＲＮＡと実質的に相同性であるか又は相補性であ る，ｍＲＮＡをエンコードするヌクレオチド配列からなり、従って、形質転換に より植物ゲノム中に組込まれた場合、上記コーディング領域から転写されたｍＲ ＮＡは内在植物遺伝子からの前記酵素の産生を抑制するものである組換え体ＤＮ Ａを、形質転換により植物のゲノム中に安定に組込むことからなる、植物内での リグニンの生合成を抑制するか又は変更する方法。
9. ９．リグニンを形成するための通常の能力より低い能力を有する形質転換植物で あって、上記植物はそのゲノム中に請求の範囲１〜７のいずれかに記載の組換え 体ＤＮＡが安定に組込まれていることを特徴とする形質転換植物。
10. １０．植物内はアルファルファ、トウモロコシ、アブラナ、ユーカリ、ポプラ、 ロリウム又はフェスツカである、請求の範囲９に記載の形質転換植物。
11. １１．英国、アバーデイーン所在のＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ に、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株　ＸＬ１　Ｂｌｕｅを宿主として、それぞれ、１９９１年 ４月１７日に４０４０４の寄託番号で、１９９１年４月８日に４０４０１の寄託 番号で寄託されているプラスミドｐＴＣＡＤ１４又はｐＴＣＡＤ１９から誘導さ れたタバコＣＡＤ遺伝子及びこれを含有する組換え体ＤＮＡ。
12. １２．英国、アバーデイーン所在のＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ に、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株　ＸＬ１　Ｂｌｕｅを宿主として、１９９２年４月２日に ４０５０１の寄託番号で寄託されているプラスミドｐＺＣＡＤ１から誘導された トウモロコシＣＡＤ遺伝子及びこれを含有する組換え体ＤＮＡ。
13. １３．英国、アバーデイーン所在のＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＣｏＨｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに 、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株　ＸＬ１　Ｂｌｕｅを宿主として、１９９２年４月２日に４ ０５００の寄託番号で寄託されているプラスミドｐＰＯＰＣＡＤ１から誘導され たポプラＣＡＤ遺伝子及びこれを含有する組換え体ＤＮＡ。
14. １４．英国、アバーデイーン所在のＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ に、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株　ＸＬ１　Ｂｌｕｅを宿主として、１９９２年４月２日に ４０５０２の寄託番号で寄託されているプラスミドｐＥＵＣＡＤ１から誘導され たユーカリＣＡＤ遺伝子及びこれを含有する組換え体ＤＮＡ。
15. １５．プロモーターＧＰＡＬ２の制御下にあるアンチセンスＣＡＤ遺伝子を含有 する組換え体ＤＮＡ。
16. １６．プロモーターＣＰＡＬ３の制御下にあるアンチセンスＣＡＤ遺伝子を含有 する組換え体ＤＮＡ。
17. １７．プロモーターＣａＭＶ３５Ｓの制御下にあるアンチセンスＣＡＤ遺伝子を 含有する組換え体ＤＮＡ。
18. １８．内在ＣＡＤ遺伝子を制御する内在植物プロモーター制御下にあるアンチセ ンスＣＡＤ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡ。