CN113016623A

CN113016623A - 用于甜菊的单核苷酸多态性(snp)标志物

Info

Publication number: CN113016623A
Application number: CN202110226481.8A
Authority: CN
Inventors: 阿韦季克·马尔科斯雅恩; 王雄祥; 黄琬诒; 卜宇成; 陈建宁
Original assignee: PureCircle USA Inc
Current assignee: PureCircle USA Inc
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2021-06-25
Also published as: US20210207159A1; US20170283819A1; US10370673B2; EP3197269A1; US10975381B2; CN107205353A; US20190330648A1; ECSP17025497A; WO2016049531A1; CN107205353B

Abstract

本申请涉及用于甜菊的单核苷酸多态性(SNP)标志物.公开了具有高含量RebD、高含量RebM以及高含量RebD和RebM的包含多种SNP标志物和UGT同种型的的甜菊品种.还公开了筛选SNP的方法以及将SNP用于标志物辅助育种中.还提供了通过如下方式将公开的与高RebD和高RebM有关的SNP基因渗入甜菊植物的方法：选择包含一种或更多种SNP的植物并用这样的植物进行育种以将该期望的农艺学表型赋予植物后代。

Description

用于甜菊的单核苷酸多态性(SNP)标志物

本申请是申请号为201580051948.2的中国专利申请的分案申请，原申请是2015年 9月25日提交的PCT国际申请PCT/US2015/052366于2017年3月24日进入中国国家阶段的申请.

相关申请的交叉引用

本发明是以下申请的非临时专利申请并要求其优先权权益：于2014 年9月26日提交的美国临时申请第62/071,567号；于2014年9月26日提交的美国临时申请第62/071,566号；于2014年9月26日提交的美国临时申请第62/071,568号；于2014年10月16日提交的美国临时专利申请第62/064,601号；于2015年1月23日提交的中国专利申请第201510036580.4号；于2015年1月23日提交的中国专利申请第 201510037435.8号；于2015年1月23日提交的中国专利申请第 201510036668.6号；以及于2015年2月16日提交的美国临时申请第 62/116,893号；其全部内容出于所有目的通过引用并入本文.

序列表的提交

与本申请相关的序列表通过EFS-Web以电子形式提交并且在此通过引用整体并入本说明书中.

技术领域

本申请涉及用于甜菊的单核苷酸多态性(SNP)标志物领域。

背景技术

甜菊是用于生产甜味剂、糖替代品和其他可食用成分的重要且有价值的田间作物。因此，甜菊植物育种者的持续目标是开发甜菊品种的农学上可靠的稳定高产的甜菊栽培种。这个目标的原因在于使甜味剂、糖替代品和其他可消耗成分的量和质量最大化.为了实现这个目标，甜菊育种者必须选择并开发具有导致优良栽培种的特性的植物.

开发新的甜菊栽培种需要评估和选择亲本并且使这些亲本杂交.缺乏可预测成功的给定杂交需要育种者在任何给定年份中进行具有相同或不同育种目的的数次杂交.

相关领域的前述实例和与其相关的限制旨在是说明性而非排他性的。在阅读本说明书后，相关领域的其他限制对于本领域技术人员将变得明显.

发明内容

结合产品和方法来描述和示出以下实施方案和方面，这些产品和方法意在为示例性和说明性的，而不限制范围.在多种实施方案中，已经减少或消除上述问题中的一个或更多个，而另一些实施方案涉及另一些改进.

本公开内容提供了包含以下单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)的甜菊植物，其中所述SNP以纯合形式存在：SNP2，其包含SEQ ID NO：1中位置号225处的G至C核苷酸替换；SNP10，其包含SEQ ID NO：2中位置号187处的G至A核苷酸替换；SNP12，其包含SEQ ID NO：3中位置号345处的C至T核苷酸替换；SNP17，其包含SEQID NO：4中位置号129处的A至C核苷酸替换；SNP19，其包含SEQ ID NO：5中位置号173处的A至T核苷酸替换；SNP20，其包含SEQ ID NO：6中位置号221处的G至A核苷酸替换；SNP22，其包含SEQ ID NO：7中位置号160处的T至G核苷酸替换；以及SNP24，其包含SEQ ID NO：8中位置号325处的G至A核苷酸替换。

另一个实施方案公开了甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶具有8％至 38％的莱鲍迪苷(rebaudioside)D/总甜菊糖苷百分比和0％至14％的莱鲍迪苷M/总甜菊糖苷百分比，并且还包含纯合形式的以下SNP：SNP17，其包含SEQ ID NO：4中位置号129处的A至C核苷酸替换；SNP19，其包含SEQ ID NO：5中位置号173处的A至T核苷酸替换；以及SNP20，其包含SEQ ID NO：6中位置号221处的G至A核苷酸替换。

另一个实施方案公开了用于生产具有高莱鲍迪苷D和高莱鲍迪苷M 含量的甜菊植物的方法，所述方法包括：(a)针对以下SNP中的至少一种筛选甜菊植物群体：SNP2，其包含SEQ ID NO：1中位置号225处的G 至C核苷酸替换；SNP10，其包含SEQ ID NO：2中位置号187处的G 至A核苷酸替换；SNP12，其包含SEQ ID NO：3中位置号345处的C 至T核苷酸替换；SNP17，其包含SEQ ID NO：4中位置号129处的A 至C核苷酸替换；SNP19，其包含SEQ ID NO：5中位置号173处的A 至T核苷酸替换；SNP20，其包含SEQ ID NO：6中位置号221处的G 至A核苷酸替换；SNP22，其包含SEQ ID NO：7中位置号160处的T 至G核苷酸替换；以及SNP24，其包含SEQ ID NO：8中位置号325处的G至A核苷酸替换；(b)选择具有至少一种所述SNP的第一甜菊植物； (c)将具有至少一种所述SNP的所述第一选择的甜菊植物与具有至少一种所述SNP的第二甜菊植物杂交；(d)重复步骤(b)和(c)以获得所有所述SNP 均为纯合的甜菊植物；以及(e)筛选所有所述SNP均为纯合的所述甜菊植物以确认所有所述SNP以纯合形式存在以产生甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶具有高莱鲍迪苷D含量、高莱鲍迪苷M含量或者高莱鲍迪苷D 和高莱鲍迪苷M含量.

序列表的简要说明

SEQ ID NO：1公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_5090958) 的CC基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP2.

SEQ ID NO：2公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_3488333) 的AA基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP 10。

SEQ ID NO：3公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_4414800) 的TT基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP12。

SEQ ID NO：4公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_6262256) 的CC基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP17.

SEQ ID NO：5公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_6645712) 的TT基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP19.

SEQ ID NO：6公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_6647386) 的AA基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP20。

SEQ ID NO：7公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_4704641) 的GG基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP22.

SEQ ID NO：8公开了所有RebD和RebM品系(stv_snp_5387123) 的AA基因型(纯合隐性)并鉴定为SNP24.

SEQ ID NO：9公开了814011的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊 _转录本_185827_2127)。

SEQ ID NO：10公开了814011(参考_甜菊_转录本_185828_2195) 的UGT76G1同种型序列.

SEQ ID NO：11公开了814011的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185829_807)。

SEQ ID NO：12公开了814011的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185830_799).

SEQ ID NO：13公开了814011的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185831_875)。

SEQ ID NO：14公开了807086的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185827_2127).

SEQ ID NO：15公开了807086的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185828_2195).

SEQ ID NO：16公开了807086的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185829_807).

SEQ ID NO：17公开了807086的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185830_799).

SEQ ID NO：18公开了807086的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185831_875).

SEQ ID NO：19公开了817096的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185827_2127)。

SEQ ID NO：20公开了817096的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185828_2195).

SEQ ID NO：21公开了817096的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185829_807)。

SEQ ID NO：22公开了817096的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185830_799)。

SEQ ID NO：23公开了817096的UGT76G1同种型序列(参考_甜菊_转录本_185831_875)。

SEQ ID NO：24公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203252_1370).

SEQ ID NO：25公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203253_1205)。

SEQ ID NO：26公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203254_1266).

SEQ ID NO：27公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203255_1292).

SEQ ID NO：28公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203256_1213)。

SEQ ID NO：29公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203257_1280)。

SEQ ID NO：30公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203258_1288)。

SEQ ID NO：31公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203259_1283)。

SEQ ID NO：32公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203260_1379)。

SEQ ID NO：33公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203261_1197).

SEQ ID NO：34公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203262_573)。

SEQ ID NO：35公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203263_1281)。

SEQ ID NO：36公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203264_1275)。

SEQ ID NO：37公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203265_1307)。

SEQ ID NO：38公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203266_1208).

SEQ ID NO：39公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203267_1341).

SEQ ID NO：40公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203268_1289).

SEQ ID NO：41公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203269_1279).

SEQ ID NO：42公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203270_1322).

SEQ ID NO：43公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203271_674).

SEQ ID NO：44公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203272_1360).

SEQ ID NO：45公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203273_539)。

SEQ ID NO：46公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203274_1332).

SEQ ID NO：47公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203275_1284).

SEQ ID NO：48公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203276_1297)。

SEQ ID NO：49公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203277_1194).

SEQ ID NO：50公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203278_575)。

SEQ ID NO：51公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203279_1232).

SEQ ID NO：52公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203280_1310).

SEQ ID NO：53公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_2032811316).

SEQ ID NO：54公开了817096的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203282_1272).

SEQ ID NO：55公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203252_1370).

SEQ ID NO：56公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203253_1205)。

SEQ ID NO：57公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203254_1266)。

SEQ ID NO：58公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203255_1292).

SEQ ID NO：59公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203256_1213).

SEQ ID NO：60公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203257_1280).

SEQ ID NO：61公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203258_1288)。

SEQ ID NO：62公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203259_1283).

SEQ ID NO：63公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203260_1379).

SEQ ID NO：64公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203261_1197).

SEQ ID NO：65公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203262_573).

SEQ ID NO：66公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203263_1281)。

SEQ ID NO：67公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203264_1275).

SEQ ID NO：68公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203265_1307).

SEQ ID NO：69公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203266_1208).

SEQ ID NO：70公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203267_1341)。

SEQ ID NO：71公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203268_1289)。

SEQ ID NO：72公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203269_1279).

SEQ ID NO：73公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203270_1322).

SEQ ID NO：74公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203271_674).

SEQ ID NO：75公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203272_1360)。

SEQ ID NO：76公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203273_539)。

SEQ ID NO：77公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203274_1332).

SEQ ID NO：78公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203275_1284).

SEQ ID NO：79公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203276_1297).

SEQ ID NO：80公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203277_1194)。

SEQ ID NO：81公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203278_575).

SEQ ID NO：82公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203279_1232).

SEQ ID NO：83公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203280_1310)。

SEQ ID NO：84公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203281_1316).

SEQ ID NO：85公开了807086的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203282_1272).

SEQ ID NO：86公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203252_1370).

SEQ ID NO：87公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203253_1205).

SEQ ID NO：88公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203254_1266).

SEQ ID NO：89公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203255_1292).

SEQ ID NO：90公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203256_1213).

SEQ ID NO：91公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203257_1280).

SEQ ID NO：92公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203258_1288)。

SEQ ID NO：93公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203259_1283)。

SEQ ID NO：94公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203260_1379)。

SEQ ID NO：95公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203261_1197)。

SEQ ID NO：96公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203262_573)。

SEQ ID NO：97公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203263_1281)。

SEQ ID NO：98公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203264_1275).

SEQ ID NO：99公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203265_1307).

SEQ ID NO：100公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203266_1208).

SEQ ID NO：101公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203267_1341).

SEQ ID NO：102公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203268_1289).

SEQ ID NO：103公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203269_1279)。

SEQ ID NO：104公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203270_1322).

SEQ ID NO：105公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203271_674).

SEQ ID NO：106公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203272_1360)。

SEQ ID NO：107公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203273_539).

SEQ ID NO：108公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203274_1332).

SEQ ID NO：109公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203275_1284).

SEQ ID NO：110公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203276_1297).

SEQ ID NO：111公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203277_1194)。

SEQ ID NO：112公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203278_575).

SEQ ID NO：113公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203279_1232).

SEQ ID NO：114公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203280_1310).

SEQ ID NO：115公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本_203281_1316).

SEQ ID NO：116公开了814011的UGT91D2同种型序列(参考_甜菊_转录本203282_1272).

SEQ ID NO：117公开了SNP2的正向引物.

SEQ ID NO：118公开了SNP2的反向引物.

SEQ ID NO：119公开了SNP10的正向引物。

SEQ ID NO：120公开了SNP10的反向引物.

SEQ ID NO：121公开了SNP12的正向引物.

SEQ ID NO：122公开了SNP12的反向引物.

SEQ ID NO：123公开了SNP17的正向引物。

SEQ ID NO：124公开了SNP17的反向引物.

SEQ ID NO：125公开了SNP19的正向引物.

SEQ ID NO：126公开了SNP19的反向引物.

SEQ ID NO：127公开了SNP20的正向引物.

SEQ ID NO：128公开了SNP20的反向引物.

SEQ ID NO：129公开了SNP22的正向引物。

SEQ ID NO：130公开了SNP22的反向引物。

SEQ ID NO：131公开了SNP24的正向引物.

SEQ ID NO：132公开了SNP24的反向引物。

SEQ ID NO：133公开了SNP17探针的正向引物。

SEQ ID NO：134公开了SNP17探针的反向引物。

SEQ ID NO：135公开了SNP19探针的正向引物。

SEQ ID NO：136公开了SNP19探针的反向引物。

SEQ ID NO：137公开了SNP20探针的正向引物.

SEQ ID NO：138公开了SNP20探针的反向引物.

附图说明

并入本文并形成说明书一部分的附图示出了一些但不是唯一或排他性的示例实施方案和/或特征.本文公开的实施方案和附图旨在被认为是说明性的而不是限制性的。

图1示出了显示用于鉴定推定SNP标志物所涉及的阶段的流程图。

图2示出了显示在30种具有差异明显的甜菊糖苷组成的甜菊植物中用于这些48种推定SNP标志物验证所涉及的阶段的流程图。

图3示出了SNP2的PCR扩增以及G核苷酸替换为C的位置。

图4示出了SNP10的PCR扩增以及G核苷酸替换为A的位置.

图5示出了SNP12的PCR扩增以及C核苷酸替换为T的位置.

图6示出了SNP17的PCR扩增以及A核苷酸替换为C的位置.

图7示出了SNP19的PCR扩增以及A核苷酸替换为T的位置。

图8示出了SNP20的PCR扩增以及G核苷酸替换为A的位置。

图9示出了SNP22的PCR扩增以及T核苷酸替换为G的位置.

图10示出了SNP24的PCR扩增以及G核苷酸替换为A的位置.

图11示出了品种‘814011’的育种方案.‘814011’来源于2013年9月在中国江西省赣州进行的三元杂交，所述杂交为来源于雌性甜菊品种 ‘Eirete’(未获得专利权)和专有雄性甜菊品种‘AKHL1’(美国植物专利第23,164号)的杂交的F₁的专有雄性甜菊品种‘YF001’(未获得专利权) 与专有雌性品种‘PC Star 2’(未获得专利权)的杂交。

图12示出了品种‘807086’的育种方案。‘807086’是由在中国江西省赣州进行的三元杂交产生的选择，所述杂交为专有F₁雄性甜菊品系‘YF003’ (未获得专利权)(来自母本‘AKH EMI’(未获得专利权)与父本‘AKH L4’ (美国植物专利23,728)的杂交)和雌性甜菊品系‘PC Star 2’(未获得专利权)的杂交.

图13示出了品种‘817096’、‘801094’、‘804038’、‘801105’、‘816055’、 ‘804075’、‘830098’、‘806058’、‘810103’、‘803071’、‘805061’、‘813081’、 ‘806034’和’803065’的育种方案。这些品种由在中国江西省赣州进行的回交产生.使专有F₁雄性甜菊品系‘YF002’(未获得专利权)(来源于母本 ‘AKH/G.8.D’(未获得专利权)与父本‘AKH L1’(美国植物专利第23，164 号)的杂交)与母本‘AKH/G.8.D’回交.

图14公开了来自814011植物的多种UGT76G1同种型的多重序列比对.(1＝参考_甜菊_转录本_185827_2127)，(2＝参考_甜菊_转录本 _185828_2195)，(3＝参考_甜菊_转录本_185829_807)，(4＝参考_甜菊_转录本_185830_799)以及(5＝参考_甜菊_转录本_185831_875).

图15公开了在(1)＝814011、(2)＝807086和(3)＝817096中多种 UGT76G1参考_甜菊_转录本_185827_2127同种型的多重序列比对.所有这些同种型共享99％的核苷酸同一性，具有很少的SNP.

图16公开了在(1)＝814011、(2)＝807086和(3)＝817096中多种 UGT76G1参考_甜菊_转录本_185828_2195同种型的多重序列比对.所有这些同种型共享99％的核苷酸同一性，具有很少的SNP。

图17公开了在(1)＝814011、(2)＝807086和(3)＝817096中多种 UGT76G1参考_甜菊_转录本_185829_807同种型的多重序列比对。所有这些同种型共享99％的核苷酸同一性，具有很少的SNP.

图18公开了在(1)＝814011、(2)＝807086和(3)＝817096中多种 UGT76G1参考_甜菊_转录本_185830_799同种型的多重序列比对。所有这些同种型共享99％的核苷酸同一性，具有很少的SNP.

图19公开了在(1)＝814011、(2)＝807086和(3)＝817096中多种 UGT76G1参考_甜菊_转录本_185831_875同种型的多重序列比对。所有这些同种型共享99％的核苷酸同一性，具有很少的SNP.

图20公开了来自817096的多种UGT91D2同种型的多重序列比对。 (1＝＞参考_甜菊_转录本_203252_1370)，(2＝＞参考_甜菊_转录本 _203253_1205)，(3＝＞参考_甜菊_转录本_203254_1266)，(4＝＞参考_甜菊 _转录本_203255_1292)，(5＝＞参考_甜菊_转录本_203256_1213)，(6＝＞参考_甜菊_转录本_203257_1280)，(7＝＞参考_甜菊_转录本_203258_1288)， (8＝＞参考_甜菊_转录本_203259_1283)，(9＝＞参考_甜菊_转录本 _203260_1379)，(10＝＞参考_甜菊_转录本_203261_1197)，(11＝＞参考_甜菊_转录本_203262_573)，(12＝＞参考_甜菊_转录本_203263_1281)，(13＝＞参考_甜菊_转录本_203264_1275)，(14＝＞参考_甜菊_转录本 _203265_1307)，(15＝＞参考_甜菊_转录本_203266_1208)，(16＝＞参考_甜菊_转录本_203267_1341)，(17＝＞参考_甜菊_转录本_203268_1289)， (18＝＞参考_甜菊_转录本_203269_1279)，(19＝＞参考_甜菊_转录本 _203270_1322)，(20＝＞参考_甜菊_转录本_203271_674)，(21＝＞参考_甜菊_转录本_203272_1360)，(22＝＞参考_甜菊_转录本_203273_539)，(23＝＞参考_甜菊_转录本_203274_1332)，(24＝＞参考_甜菊_转录本 _203275_1284)，(25＝＞参考_甜菊_转录本_203276_1297)，(26＝＞参考_甜菊_转录本_203277_1194)，(27＝＞参考_甜菊_转录本_203278_575)，(28＝＞参考_甜菊_转录本_203279_1232)，(29＝＞参考_甜菊_转录本 _203280_1310)，(30＝＞参考_甜菊_转录本_203281_1316)，(31＝＞参考_甜菊_转录本_203282_1272).

图21公开了在814011、807086和817096中多种UGT91D2＞参考_ 甜菊_转录本_203252_1370同种型的多重序列比对.所有这些同种型共享 99％的核苷酸同一性，具有很少的SNP.

定义

在后续的说明书和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括给出这些术语的范围)的清楚和一致的理解，提供了以下定义。所有莱鲍迪苷的含量表示为叶干重的百分比.

高莱鲍迪苷A：如本文所使用的描述为具有高莱鲍迪苷A的植物具有大于或等于9％的莱鲍迪苷A含量、小于或等于0.3％的莱鲍迪苷D含量以及小于或等于0.2％的莱鲍迪苷M含量。

高莱鲍迪苷D：如本文所使用的描述为具有高莱鲍迪苷D的植物具有大于或等于0.6％的莱鲍迪苷D含量和大于或等于8％的莱鲍迪苷D/总甜菊糖苷.

高莱鲍迪苷D和高莱鲍迪苷M：如本文所使用的描述为具有莱鲍迪苷D和高莱鲍迪苷M含量的植物具有大于或等于0.6％的莱鲍迪苷D含量和大于或等于8％的莱鲍迪苷D/总甜菊糖苷以及大于或等于0.5％的莱鲍迪苷M含量.

高莱鲍迪苷M：如本文所使用的描述为具有高莱鲍迪苷M的植物具有大于或等于0.5％的莱鲍迪苷M含量.

高甜菊苷：如本文所使用的描述为具有高甜菊苷的植物具有大于或等于7％的甜菊苷含量、小于或等于0.3％的莱鲍迪苷D含量以及小于或等于0.2％的莱鲍迪苷M含量。

高甜菊苷和高莱鲍迪苷A：如本文所使用的描述为具有高甜菊苷和高莱鲍迪苷A的植物具有小于或等于7.60％的莱鲍迪苷D/总甜菊糖苷以及小于或等于1.9％的莱鲍迪苷M/总甜菊糖苷。

标志物：如本文所使用的“标志物”是存在至少一种多态性的指示，因此，标志物可以是例如核苷酸序列本身或探针.

植物：如本文所使用的术语“植物”包括提及未成熟或成熟的完整植物，包括已经为甜菊糖苷而被加工的植物.将产生植物的种子或植物部分也被认为是植物。

植物部分：如本文所使用的术语“植物部分”包括叶、茎、根、种子、胚、花粉、胚珠、花、根尖、花药、组织、细胞等.

莱鲍迪苷A(RebA)：如本文所使用的“莱鲍迪苷A”或“RebA”是仅含有葡萄糖作为其单糖部分的甜菊糖苷.其总共含有四个葡萄糖分子，包括在其羟基处与主要甜菊醇结构连接的三联体中心葡萄糖和在其羧基处形成酯键的剩余葡萄糖。

莱鲍迪苷D(RebD)：如本文所使用的“莱鲍迪苷D”或“RebD”是从甜菊中分离的对映贝壳杉烷(ent-kaurane)二萜糖苷.

莱鲍迪甙M(RebM)：如本文所使用的“莱鲍迪甙M”或“RebM”是从甜菊(Steviarebaudiana)中分离的对映贝壳杉烷二萜糖苷.

SNP：如本文所使用的术语“SNP”应指单核苷酸多态性。

甜菊苷含量：如本文所使用的甜菊苷是来源于甜菊植物的糖苷百分比。

具体实施方式

本文所述的实施方案提供了包含8(8)种纯合形式的SNP标志物的甜菊植物：SNP2、SNP12、SNP17、SNP19、SNP20、SNP22和SNP24。如以下将详细描述的，显示包含这8种SNP的甜菊植物表达高RebD或高RebM，或者具有所有8种SNP的植物可以同时表达高RebD和高 RebM。本文所述的实施方案还提供了用于筛选包含这8种SNP的甜菊植物的方法以及在标志物辅助育种中使用这些SNP以产生表达高RebD或 RebM的甜菊植物，或者可以同时表达高RebD和高RebM的具有所有8 种SNP的植物的方法和步骤.本文还描述了用于通过如下方式将与高 RebD和高RebM有关的所有8种SNP基因渗入(introgress)甜菊植物的方法：选择包含一种或更多种SNP的植物并用这样的植物进行育种以将该期望的农艺学表型赋予植物后代.

甜菊(Bertoni)是菊科(由约230种草本、灌木和半灌木植物组成) 的多年生草本植物.已知甜菊产生二萜类甜菊糖苷(SG)，其比蔗糖甜约 300倍.已经在甜菊的叶组织中鉴定了21种二萜糖苷(US2011/0183056)。其中，在甜菊的叶中合成的四种主要甜菊糖苷是甜菊苷(stevioside， STEV)、RebA、莱鲍迪苷C(RebC)和莱鲍迪苷F(RebF).STEV占叶干重的5％至10％，而RebA占2％至4％(Pande和Priyanka 2013).

全世界种植的所有甜菊的估计2GB基因组的97％至99％在遗传学上相同.在不同的甜菊植物中，遗传差异仅构成该2GB基因组的2％至3％并且是甜菊适应性、生长性能、叶片尺寸、抗病性、甜菊糖苷组成变化等的关键属性.

本公开内容一般地涉及甜菊品种，并且更具体地涉及用于具有高含量的RebD和莱鲍迪苷M的甜菊品种的SNP标志物和UGT同种型。

尽管已经记录了SG生物合成的途径酶，但关于该SG生物合成中涉及的调节网络仍然存在许多不确定性.通过连续选择和杂交，产生具有非常低RebD和RebM的新甜菊品种.在若干次选择和使优良亲本杂交循环后，获得了具有更高量的特定Reb D和RebM糖苷的新品种‘817096’、 ‘814011’和‘807086’。

发现用于高RebD和RebM的鉴定的SNP标志物

如图1的流程图中所概述的，本公开内容提供了用于鉴定具有高 RebD含量、高RebM含量的甜菊品种或者RebD和RebM含量都高的品种的八种标志物(SEQ ID NO：1-8中鉴定的SNP).用于育种和选择具有高RebD和RebM含量的新甜菊品种的方法也在下文进一步详细描述. 简言之，如步骤102所示，通过连续选择和杂交，已产生了新甜菊品种。在步骤104中，研究了10种具有差异明显的糖苷组成(3种高甜菊苷 (‘805028’、‘803066’和‘805003’)；3种高RebA(‘817075’、‘805126’和 ‘805082’)；2种高RebD(‘801094’和‘817096’)以及2种高RebM(‘814011’ 和‘807086’))(104)的甜菊叶样品的遗传背景。使用图13所示的育种流程图产生两种高RebD品系，而使用图11和12所示的育种流程图产生两种高RebM品系。简言之，如图11所示，将亲本品种‘Eirete’和‘AKHL1’ 杂交以产生‘YF001’.使该选择与‘PC Star 2’进行异型杂交以产生高RebM 品系‘814011’。如图12所示，将亲本品种‘AKH EM1’和‘AKHL4’杂交以产生‘YF003’。使该选择与‘PC Star 2’进行异型杂交以产生高RebM品系 ‘807086’。如图13所示，将亲本品种‘AKH/G.8.D’和‘AKHL1’杂交以产生‘YF002’.使该选择与亲本品系‘AKH/G.8.D’回交以产生14种高RebD品系，包括‘817096’和‘801094’.

如图1的步骤106所示，随机选择报道具有高甜菊苷和高莱鲍迪苷A 的品种.在这些品种中的每一个中使用基因组测序以获得每个约10X的目标覆盖度.使用NucleospinPlant II试剂盒(Macherey-Nagel)根据制造商的方案从这些品种/品系的每一个的叶中分离基因组DNA.使用 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)和Qubit2.0 DNA 宽范围测定(Invitrogen，USA)测量提取的DNA的质量和数量.还使样品在1％琼脂糖凝胶上跑胶以确定基因组DNA的完整性。TruSeq文库制备需要至少1μg的高质量DNA(如通过Qubit测量).使用Covaris S220 (Covaris Inc，USA)将分离的基因组DNA样品片段化至400-700bp的目标大小.然后使用TruSeq DNA样品制备试剂盒(Illumina，USA)根据制造商的方案，将片段化的DNA进行末端修复，连接至Illumina TruSeq 接头，并进行PCR富集.使用KAPA试剂盒(KAPA Biosystem，USA) 在Agilent Strategene Mx-3005p定量PCR(Agilent，USA)上量化最终测序文库，并使用Agilent生物分析仪高灵敏度DNA芯片(Agilent，USA) 确认文库大小。使用具有202个循环的Illumina HiSeq2000平台(Illumina，USA)的Illumina流动池对所得文库进行测序.测序运行生成总计235.4GB的原始数据.

在图1的步骤108中，使用“MGRC Assembler Pipeline”软件(版本 1.4)分别组装(assemble)来自10种甜菊植物的所有10个甜菊基因组. 还使用内部组装管道工具(in-house assembly pipeline tool)进行泛基因组混合组装方法学(pan genome pooledassembly methodology)。合并的序列产生1.02Gbp的基因组组装草图。存在总计269,395个重叠群，最小重叠群大小为1kbp.

在步骤110中，使用Samtools由针对基因组组装草图数据库的单个样品读取映射(mapping)鉴定SNP。在10个基因组中鉴定出约780万个SNP.在步骤112中，在这780万个SNP中，仅48个SNP是推定的用于RebD和RebM鉴定的SNP.NCBI(National Centre ofBiotechnological Information，国家生物技术信息中心)blast分析表明这些SNP未曾在公共数据库中报道.

图2的流程图概述了高RebD和高RebM的8种SNP是如何鉴定的. 简言之，在另外育种之后(步骤202中所示)，在步骤204中，通过HPLC (高效液相色谱法)分析具有差异明显的糖苷组成的叶样品.在步骤206 中设计SNP引物，并在步骤208中提取DNA用于SNP区域的PCR扩增 (步骤210中所示).在步骤212中，对PCR产物进行测序以确定等位基因.在步骤214中，鉴定了高RebD和高RebM的8种SNP.

如图2的流程图所示，选择总共30个具有差异明显的糖苷组成(9 种高莱鲍迪苷A、5种高甜菊苷、14种高RebD和2种高RebM)的叶样品用于48种推定的SNP标志物的HPLC验证(204)。随机选择据报道具有高甜菊苷或高莱鲍迪苷A的甜菊品种。使用图13中所示的育种流程图产生14种高RebD品系，而使用图11和12中所示的育种流程图产生两种高RebM品系.下表1示出了选择用于SNP验证的这30种品系的 HPLC数据.

对于HPLC分析，将甜菊叶样品风干/烘干，之后使用杵和研钵研磨成细粉末.对于每种样品，用15ml 60℃蒸馏水提取叶粉末(100mg)18 小时。将混合物离心，并且过滤和收集上清液用于通过HPLC(Agilent， USA)进行甜菊糖苷组成分析.使用配备有AgilentPoroshell 120 SB-C18 2.7μm，4.6×150mm的Agilent Technologies 1200系列(USA)HPLC进行甜菊糖苷的分析.使用设置在210nm处的二极管阵列作为检测器。所有糖苷(包括莱鲍迪苷E、RebD、RebM、莱鲍迪苷N和莱鲍迪苷O) 的参考标准购自ChromaDex Inc.(USA).使用以下方法来分析莱鲍迪甙 E(RebE)、RebD、RebM、莱鲍迪苷N(RebN)和莱鲍迪苷O(RebO)：柱温：40℃，流动相：溶剂A 10mM磷酸二氢钠pH 2.6：乙腈，75％∶25％ (v/v)，溶剂B水：乙腈，50％∶50％(v/v)，梯度程序％v/v：在0.0和 14.0分钟时100％A和0％B，在14.5和25.0分钟时100％B和0％A，流速：0.5mL/分钟，注射：5μL，自动进样器温度：环境温度.为了分析莱鲍迪苷A(RebA)、甜菊苷(Stev)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷 C(RebC)、杜尔可苷A(Dulcoside A，DulA)、甜茶苷(Rubusoside，Rub)、莱鲍迪苷B(RebB)和甜菊双糖甙(Steviolbioside，Stev)，使用与上述相同的方法，除了流动相由等度10mM磷酸二氢钠pH2.6：乙腈， 68％∶32％(v/v)组成，流速为1.0mL/分钟，运行时间为20分钟.鉴定了13种化合物RebA、RebD、RebM、莱鲍迪苷E、甜菊苷、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷C、杜尔可苷A、甜茶苷、莱鲍迪苷 B和甜菊双糖甙.

表1提供了30种甜菊品种中甜菊糖苷的分析.表1的顶行示出了各种糖苷组，并且第一列示出了甜菊品种和高RebD、高RebM、高 RebD/RebM、高RebA、高Stev或高RebA/Stev品系的分类.表1中的数字表示特定甜菊品种中特定莱鲍迪苷组的百分比.高RebD品系被定义为具有≥0.6％的RebD含量和≥8％的RD/TSG。高RebM品系被定义为具有≥0.5％的RebM含量.高RebA品系被定义为具有≥9％的RebA含量， ≤0.3％的RebD含量和≤0.2％的RebM含量.高Stev品系被定义为具有 ≥7％的Stev含量，≤0.3％的RebD含量和≤0.2％的RebM含量。TSG＝总甜菊糖苷.保藏的品种‘817096’、‘814011’和‘807086’以粗体显示.

表2示出了表1中所示的前16个品种的描述性统计分析，全部指定为高RebD.该组的最后两个品种‘814011’和‘807086’也被指定为高RebM. Min＝最小，Max＝最大，Sv＝样本方差，SD＝标准差，SE＝标准误差。

如上表1和表2所示，分类为高RebD的16个甜菊品种具有约0.6％至3.3％的RebD含量和约9.2％至38％的RD/TSG(参见表2).在这16 个品种中，两个品种也被分类为具有高RebM(参见表1，以粗体字标记为‘814011’和‘807086’的品种).RebM含量为约0％至1.15％，而RM/TSG 为约0％至14％.本发明考虑了具有甚至更高含量的RebD、RebM或 RebD和RebM以及SEQ ID NO：1-8的其他品种.

如图2的流程图中进一步概述的，针对48种推定SNP标志物中的每一种设计引物(步骤206中所示)，并将其用于提取的DNA的SNP扩增 (如步骤208中所示).在随机选择的30种具有差异明显的甜菊糖苷组成的甜菊植物(参见表1)中使用SNP基因扩增来选择从SNP发现阶段(图 1)鉴定的48种SNP标志物用于进一步验证。这30种植物通过三个不同的亲本群杂交获得(图11、12和13)，因此，包含用于推定的SNP验证的最佳遗传物质.使用引物3软件设计总共48对SNP引物，并通过 Integrated DNA Technologies(IDT；Coralville，IA)合成。

使用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Germany)或Nucleospin Plant II试剂盒(Macherey-Nagel)从30种具有差异明显的糖苷组成的不同甜菊植物(参见表1)的冷冻叶中提取DNA(步骤208).使用荧光 dsDNA测定测量提取的DNA量，并使用1％琼脂糖糖胶(75伏，60分钟)分析质量。选择浓度为约10ng的良好质量的DNA用于使用每个SNP 引物组的PCR扩增(步骤210)。

使用以下34次循环方案进行PCR(步骤210)：在94℃下初始3分钟变性，随后进行在94℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃ 下延伸1分钟的循环，最终延伸10分钟.

获得的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶(60分钟，75伏)上跑胶，以检查扩增产物的特异性.将扩增产物纯化并用自动ABI 3730测序仪测序。在这30种样品中使用SequenceScanner v1.0(Applied Biosystems)软件分析SNP位置(步骤212)，并且测序验证表明仅8种SNP(SNP2、SNP10、 SNP12、SNP17、SNP19、SNP20、SNP22和SNP24)是用于高RebD和 RebM鉴定的真正SNP标志物(步骤214).对于8种SNP中的每一种， PCR引物和以碱基对(base pair，bp)表示的产物长度及其位置示于表3 中.

如图3所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP2(SEQ ID NO：1)的基因组区域.PCR产物在凝胶电泳图像上显示为481个碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置225处的G至C SNP 加了下划线.

如表4的数据和图3所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性GG等位基因或杂合GC等位基因.等位基因G对于等位基因C为显性的，等位基因C对于等位基因G为隐性的。具有这种纯合显性GG等位基因组合的任何甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的.由于等位基因G对于等位基因C为显性的，故具有GC基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因G掩盖了隐性等位基因C的作用.在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性CC等位基因(对应于SNP2)的后代。具有该CC基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系.

如图4所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP10(SEQ ID NO：2)的基因组区域.PCR产物在凝胶电泳图像上显示为359个碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置187处的G至A SNP 加了下划线.

如表4的数据和图4所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性GG等位基因或杂合AG等位基因.等位基因G对于等位基因A为显性的，等位基因A对于等位基因G为隐性的.具有这种纯合显性GG等位基因组合的任何甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的.由于等位基因G对于等位基因A为显性的，故具有AG基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因G掩盖了隐性等位基因A的作用.在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性AA等位基因(对应于SNP 10)的后代.具有该AA基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系.

如图5所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP12(SEQ ID NO：3)的基因组区域.PCR产物在凝胶电泳图像上显示为681个碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置345处的C至T SNP 加了下划线.

如表4的数据和图5所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性CC等位基因或杂合CT等位基因.等位基因C对于等位基因T为显性的，等位基因T对于等位基因C为隐性的.具有这种纯合显性CC等位基因组合的任何甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的。由于等位基因C对于等位基因T为显性的，故具有CT基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因C掩盖了隐性等位基因T的作用。在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性TT等位基因(对应于SNP12)的后代. 具有该TT基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系。

如图6所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP17(SEQ ID NO：4)的基因组区域。PCR产物在凝胶电泳图像上显示为285个碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置129处的A至C SNP 加了下划线。

如表4的数据和图6所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性AA等位基因或杂合AC等位基因.等位基因A对于等位基因C为显性的，等位基因C对于等位基因A为隐性的.任何具有这种纯合显性AA等位基因组合的甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的.由于等位基因A于等位基因C为显性的，故具有AC基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因A掩盖了隐性等位基因C的作用.在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性CC等位基因(对应于SNP17)的后代。具有该CC基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系.

如图7所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP19(SEQ ID NO：5)的基因组区域。PCR产物在凝胶电泳图像上显示为396个碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置173处的A至T SNP 加了下划线.

如表4的数据和图7所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性AA等位基因或杂合AT等位基因。等位基因A对于等位基因T为显性的，等位基因T对于等位基因A为隐性的.具有这种纯合显性AA等位基因组合的任何甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的.由于等位基因A对于等位基因T为显性的，故具有AT基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因A掩盖了隐性等位基因T的作用.在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性TT等位基因(对应于SNP19)的后代。具有该TT基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系.

如图8所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP20(SEQ ID NO：6)的基因组区域.PCR产物在凝胶电泳图像上显示为500碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置221处的G至A SNP 加了下划线。

如表4的数据和图8所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性GG等位基因或杂合GA等位基因.等位基因G对于等位基因A为显性的，等位基因A对于等位基因G为隐性的。具有这种纯合显性GG等位基因组合的任何甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的.由于等位基因G对等位基因A为显性的，故具有GA基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因G掩盖了隐性等位基因A的作用。在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性AA等位基因(对应于SNP20)的后代. 具有该AA基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系。

如图9所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP22(SEQ ID NO：7)的基因组区域.PCR产物在凝胶电泳图像上显示为486个碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置160处的T至G SNP 加了下划线.

如表4的数据和图9所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性TT等位基因或杂合TG等位基因。等位基因T对于等位基因G为显性的，等位基因G对于等位基因T为隐性的.具有这种纯合显性TT等位基因组合的任何甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的。由于等位基因T对于等位基因G为显性的，故具有TG基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因T掩盖了隐性等位基因G的作用.在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性GG等位基因(对应于SNP22)的后代. 具有该GG基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系.

如图10所示，已使用上表3中引用的引物序列扩增包含SNP24(SEQ ID NO：8)的基因组区域.PCR产物在凝胶电泳图像上显示为500个碱基对长度带，并且凝胶图像下方的序列中碱基对位置325处的G至A SNP 加了下划线.

如表4的数据和图10所示，具有高Stev和高RebA的任何甜菊植物可以是纯合显性GG等位基因或杂合GA等位基因。等位基因G对于等位基因A为显性的，等位基因A对于等位基因G为隐性的.具有这种纯合显性GG等位基因组合的任何甜菊植物对于高Stev和RebA品种是稳定的.由于等位基因G对于等位基因A为显性的，故具有GA基因型的任何个体可以是高Stev或高RebA品种，因为显性等位基因G掩盖了隐性等位基因A的作用.在那些高Stev和高RebA品种或几代后的后代中的等位基因分类导致产生具有隐性AA等位基因(对应于SNP24)的后代. 具有该AA基因型的任何后代将被鉴定为高RebD和RebM品系.

如图3至10所示并且概述于下表4中，具有高含量的RebD和RebM 的甜菊品种具有SNP2(CC基因型)、SNP10(AA基因型)、SNP12(TT 基因型)、SNP17(CC基因型)、SNP19(TT基因型)、SNP20(AA基因型)、SNP22(GG基因型)和SNP24(AA基因型).

本申请的一个实施方案公开了包含以下单核苷酸多态性(SNP)的甜菊植物，其中所述SNP以纯合形式存在：SNP2，其包含SEQ ID NO：1 中位置号225处的G至C核苷酸替换；SNP10，其包含SEQ ID NO：2 中位置号187处的G至A核苷酸替换；SNP12，其包含SEQ ID NO：3中位置号345处的C至T核苷酸替换；SNP17，其包含SEQ ID NO：4 中位置号129处的A至C核苷酸替换；SNP19，其包含SEQ ID NO：5 中位置号173处的A至T核苷酸替换；SNP20，其包含SEQID NO：6 中位置号221处的G至A核苷酸替换；SNP22，其包含SEQ ID NO：7 中位置号160处的T至G核苷酸替换；以及SNP24，其包含SEQ ID NO： 8中位置号325处的G至A核苷酸替换.

另一个实施方案公开了甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的RebD含量为干重的0.6％至3.3％.

另一个实施方案公开了甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的RebM含量为干重的0.5％至1.15％.

另一个实施方案公开了甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的RebD含量为干重的0.6％至3.3％，RebM含量为干重的0.5％至1.15％。

另一个实施方案公开了用于生产高RebD和高RebM甜菊植物的方法，包括：(a)针对以下SNP中的至少一种筛选甜菊植物群体：SNP2，其包含SEQ ID NO：1中位置号225处的G至C核苷酸替换；SNP10，其包含SEQ ID NO：2中位置号187处的G至A核苷酸替换；SNP12，其包含SEQ ID NO：3中位置号345处的C至T核苷酸替换；SNP17，其包含SEQ ID NO：4中位置号129处的A至C核苷酸替换；SNP19，其包含SEQ ID NO：5中位置号173处的A至T核苷酸替换；SNP20，其包含SEQ ID NO：6中位置号221处的G至A核苷酸替换；SNP22，其包含SEQ ID NO：7中位置号160处的T至G核苷酸替换；以及SNP24，其包含SEQ ID NO：8中位置号325处的G至A核苷酸替换；(b)选择具有至少一种SNP的第一甜菊植物；(c)将具有至少一种SNP的第一选择的甜菊植物与具有至少一种SNP的第二甜菊植物杂交；(d)重复步骤 (b)和(c)以获得所有SNP均为纯合的甜菊植物；以及(e)筛选所有 SNP均为纯合的甜菊植物以确认所有SNP以纯合形式存在以产生甜菊植物，其中甜菊植物的叶具有高RebD含量、高RebM含量或高RebD和高 RebM含量.

本文提供的另一个实施方案公开了通过上述育种方法产生的甜菊植物，其中叶的RebD含量为干重的至少0.6％.

本文提供的另一个实施方案公开了通过上述育种方法产生的甜菊植物，其中叶的RebM含量为干重的至少0.5％。

本文提供的另一个实施方案公开了通过上述育种方法产生的甜菊植物，其中叶的RebD含量为干重的至少0.6％，并且其中叶的RebM含量为干重的至少0.5％.

本文提供的另一个实施方案公开了筛选甜菊品种的方法，包括PCR 反应，然后是DNA测序，其中PCR反应使用以下引物序列中的至少一种：SEQ ID NO：117、SEQ、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID No：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQID NO：136、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138.

来自高RebD和RebM品种的转录组测序的UGT76G1和UGT91D2同种型发现

几种关键的UDP-葡糖基转移酶(UGT)被报道在多种甜菊糖苷的生物合成中起重要作用.例如，UGT76G1催化甜菊的C-13-O葡萄糖的1-3 β-糖基化，这导致RebA产生.UGT91D2催化RebA向RebD转化.由 RebD，UGT76G1催化转化为RebM.申请人的研究已显示，UGT76G1 在Stev向RebA转化和RebD向RebM转化中起重要作用.UGT91D2被报道将RebA转化为RebD.

使用RNA-Seq(转录组测序)来发现属于高RebD和RebM甜菊叶的多种UGT76G1和UGT91D2同种型.从‘814011’、‘807086’和‘817096’ 的叶中分离总RNA.分离信使RNA并合成cDNA文库。使用两种提取方法，使用Trizol或MRIP缓冲液来产生良好的质量和收率的RNA。使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)，Qubit 2.0 RNA 宽范围测定(Invitrogen，USA)和Agilent生物分析仪RNA纳米芯片检查提取的RNA.选择具有RIN 7及以上的RNA样品用于文库制备。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina，USA)和Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)根据制造商的方案进行信使RNA分离和cDNA合成.使用Qubit 2.0 DNA宽范围测定(Invitrogen，USA)来量化合成的cDNA。使用CovarisS220(Covaris Inc，USA)将最小20ng的cDNA 片段化至200-300个碱基对的目标大小.然后使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina，USA)根据制造商的方案，将片段化的cDNA进行末端修复，连接至Iuumina TruSeq接头，并进行PCR富集.使用KAPA 试剂盒(KAPABiosystem，USA)在Agilent Stratagene Mx-3005p定量 PCR(Agilent，USA)上量化最终测序文库，并使用Agilent生物分析仪高灵敏度DNA芯片(Agilent，USA)确认大小.使用Iuumina流动池对所得测序文库进行测序，并在Illumina HiSeq 2000平台(Illumina，USA) 上进行209个循环.测序运行产生总计128GB的原始数据.使用NCBI (NationalCentre of Biotechnological Information，美国国家生物技术信息中心)blast分析工具搜索获得的序列的同一性。

生物信息学渠道分析显示存在5种不同的UGT76G1同种型和31种不同的UGT91D2同种型.使用CLUSTAL W(1.83)软件的多重序列比对显示，分离的UGT76G1和UGT91D2同种型具有不同的长度，并且通过序列插入、缺失和突变彼此区分。单核苷酸多态性(SNP)和选择性剪接在产生这些变体中起重要作用.类似的同种型家族在多种研究品系中是相同的(99％).

对于UGT76G1，从每种RebD(‘817096’)和RebM品系(‘807086’、 ‘814011’)中分离总共5个主要同种型家族.对于‘814011’，这些对应于 SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12 和SEQ ID NO：13.对于‘807086’，这些对应于SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。对于 ‘817096’，这些对应于SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO： 21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。

由‘814011’(图14)获得的5种主要UGT76G1同种型的多重序列比对显示这5种主要不同的同种型通过序列缺失、插入和突变而区分。然而，在‘814011’、‘807086’和‘817096’(图15至图19)中，这些相同的同种型中的每一种的多重序列比对表明仅SNP在区分这种同种型中起主要作用.图15示出了UGT76G1同种型序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：19(分别标记为1、2和3的序列)的序列比对。图 16示出了UGT76G1同种型序列SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15和 SEQ ID NO：20(分别标记为1、2和3的序列)的序列比对.图17示出了UGT76G1同种型序列SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO： 21(分别标记为1、2和3的序列)的序列比对.图18示出了UGT76G1 同种型序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22(分别标记为1、2和3的序列)的序列比对.图19示出了UGT76G1同种型序列SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：23(分别标记为1、 2和3的序列)的序列比对.

对于UGT91D2，从每个RebD(‘817096’)和RebM品系(‘807086’、 ‘814011’)中分离出31种主要同种型.对于甜菊品种‘817096’，这些同种型对应于SEQ ID NO：24-54.对于甜菊品种‘807086’，这些同种型对应于SEQ ID NO：55-85.对于甜菊品种‘814011’，这些同种型对应于SEQ ID NO：86-116.由‘817096’获得的31种同种型的多重序列比对显示这些不同的同种型中的一些通过序列缺失、插入和突变(SNP)而区分(图20， SEQ ID NO：24-54分别标记为1-31)。然而，在‘814011’、‘807086’和 ‘817096’中，这些相同的同种型中的每一种的多重序列比对表明仅SNP在区分这种同种型中起主要作用(图21，来自‘817096’的SEQID NO：24，来自‘807086’的SEQ ID NO：55和来自‘814011’的SEQ ID NO：86的比对).

这些UGT同种型显示出公共数据库(美国国家生物技术信息中心) 中已知的那些的变化。它们对高RebD和RebM品系具有特异性.UGT 同种型序列由于多代亲本系的杂交后的基因组重排而经历一些选择性剪接.与已公布的序列相比，UGT同种型序列在各自的核苷酸中也具有一些突变.

因此，本公开内容的另一个实施方案是还包含UDP-葡糖基转移酶 76G1(UGT76G1)的同种型的甜菊植物，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：19-23，并且其中所述甜菊植物还包含UDP-葡糖基转移酶91D2 (UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：24-54，并且其中所述甜菊植物具有高RebD含量。

另一个实施方案公开了还包含UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1) 的同种型的甜菊植物，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：9-13，并且其中所述甜菊植物还包含UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：86-116，并且其中所述甜菊植物具有高RebM含量。

另一个实施方案公开了还包含UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1) 的同种型的甜菊植物，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：14-18，并且其中所述甜菊植物还包含UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：55-85，并且其中所述甜菊植物具有高RebM含量.

另一个实施方案公开了还包含UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1) 的同种型的甜菊植物，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：9-13，并且其中所述甜菊植物还包含UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：86-116，并且其中所述甜菊植物具有高RebD含量.

另一个实施方案公开了还包含UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1) 的同种型的甜菊植物，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：14-18，并且其中所述甜菊植物还包含UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：55-85，并且其中所述甜菊植物具有高RebD含量.

另一个实施方案公开了生产商品植物产品的方法，包括获得具有 SNP2、SNP10、SNP12、SNP17、SNP19、SNP20、SNP22和SNP24的植物或其一部分，并由所述植物或其一部分生产商品植物产品，其中所述商品植物产品是糖苷组合物。

实施例

提供以下实施例以进一步说明各种应用，并且不旨在在所附权利要求中所阐述的限制之外限制本发明。

实施例1.SNP 17、SNP 19和SNP20成功预测高RebD和RebM含量

使用基于探针的基因分型，设计用于SNP17、SNP19和SNP20的SNP 探针，并用其在2014年从不同遗传背景并在2015年从1,000个另外的品系中筛选了38个品系.探针由Integrated DNA Technologies(IDT； Coralville，IA)设计和合成.探针由连接在5′末端的荧光报道物和连接在3′末端的非荧光(淬灭剂)组成(表5A)。引物序列在表5B中引用.

使用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Germany)从具有差异明显的糖苷组成的1,000种不同甜菊植物的冷冻叶中提取DNA。使用1％琼脂糖凝胶(75伏，60分钟)分析提取的DNA量.选择浓度为约2ng的良好质量的DNA用于使用每种SNP引物和探针组的基因分型.

使用以下45个循环的方案进行基因分型：(a)初始5分钟在95℃变性，随后为在95℃变性15秒的循环；(b)在Rotor-Gene Q 5 plex HRM 系统(Qiagen，Germany)中在60℃退火/延伸30秒.对于每个反应，使用以下：10μl Type-it Fast SNP Probe PCR MasterMix，2x；1μl的20x 引物-探针混合物，1μl基因组DNA，并且添加dH₂O直至体积达到20μl. 使用Rotor-Gene Q Series Software进行散点图分析，以分组所有纯合显性、纯合隐性和杂合品系.

从这1000个甜菊品系中，随机选择120个植物与2014年的38个品系一起用于HPLC分析(表6)。基于这些SNP的存在或不存在，预测植物在两个组中之一中：高RebA和/或高Stev，或高RebD和/或高RebM. 在HPLC分析之后，基于甜菊糖苷含量将植物分配到以下组之一中：ST、 RA、ST/RA、RD、RM、RD/RM(第2列，表6)。

如上所述通过HPLC分析植物的莱鲍迪苷含量，并且每个品种的莱鲍迪苷的百分比含量示出在表6的第3至15列中.表6的第1列示出了品种，表6的第2列示出了基于甜菊糖苷含量的组.高RebD品系定义为具有≥0.6％的RebD含量和≥8％的RebD/TSG。高RebM品系定义为具有 ≥0.5％的RebM含量.高RebA品系定义为具有≥9％的RebA含量，≤0.3％的RebD含量和≤0.2％的RebM含量。高Stev品系定义为具有≥7％的Stev 含量，≤0.3％的RebD含量和≤0.2％的RebM含量.标记为RD和RM的列以粗体示出.保藏品种‘817096’、‘814011’和‘807086’用粗体和下划线示出。RE＝莱鲍迪苷E，RO＝莱鲍迪苷O，RD＝RebD，RN＝莱鲍迪苷N， RM＝RebM，RA＝莱鲍迪苷A，ST＝甜菊苷，RF＝莱鲍迪苷F，RC＝莱鲍迪苷C，DA＝杜尔可苷A，RU＝莱鲍迪苷U，RB＝莱鲍迪苷B，并且 SB＝甜菊双糖苷。ND＝未确定。

下表7总结了来自表6的HPLC数据.TSG＝总甜菊糖苷，RA/TSG 是总甜菊糖苷中莱鲍迪苷A的百分比，RD/TSG是总甜菊糖苷中RebD 的百分比，RM/TSG是总甜菊糖苷中RebM的百分比，而ST/TSG是总甜菊糖苷中甜菊苷的百分比。标记为RD/TSG和RM/TSG的列以粗体示出.保藏品种‘817096’、‘814011’和‘807086’用粗体和下划线示出。

SNP17、SNP19和SNP20的SNP标志物成功地预测了具有高RebD 和/或高RebM的甜菊植物，因为基于这些SNP的存在而置于该组中的所有植物基于HPLC分析显示出高RebD和/或高RebM(上表6和表7). 此外，该基因分型方法可以成功筛选出100％的RA/ST组的甜菊植物，从而促进仅具有高RebD和RebM的植物的育种.

如下表8所示，将来自表7和6的数据组合并总结.第1列列出了 RD/TSG和RM/TSG的平均值、最小值和最大值，第2列和第3列出了组。例如，RA/ST组中RD/TSG的平均值为3.08％，相比于RD/RM组中的19.89％.此外，RD/RM组中RD/TSG表现出8.38％至34.37％的范围，相比于RA/ST组中0％至7.57％的范围.类似地，RD/RM组中 RM/TSG表现出0％至11.61％的范围，相比于RA/ST组中的0％至1.89％的范围。

如上表6-8中所示，SNP17、SNP19和SNP20的SNP探针基因分型表明在特异性SNP和甜菊糖苷组成之间存在相关性.SNP 17、SNP 19和 SNP20成功地预测了具有高RebD和高RebM的甜菊植物。此外，该基因分型方法可以成功筛选100％的RA/ST组中的甜菊植物，从而促进仅具有高RebD和RebM的植物的育种.

因此，本申请的另一个实施方案公开了甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶具有8％至38％的RebD/总甜菊糖苷百分比和0％至14％的RebM/ 总甜菊糖苷百分比，并且还包含纯合形式的以下SNP：SNP 17，其包含 SEQ ID NO：4中位置编号129处的A至C核苷酸替换，SNP 19，其包含 SEQ ID NO：5中位置编号173处的A至T核苷酸替换，以及SNP20，其包含SEQID NO：6中的位置编号221处的G至A核苷酸替换.

另一个实施方案公开了甜菊植物，其中RebD/总甜菊糖苷百分比按干重计为8％至17％，并且其中RebM/总甜菊糖苷百分比按干重计为0％至 4％。

另一个实施方案公开了甜菊植物，其中RebD/总甜菊糖苷百分比按干重计为17.1％至27％，并且其中RebM/总甜菊糖苷百分比按干重计为 4.1％至8％.

另一个实施方案公开了甜菊植物，其中RebD/总甜菊糖苷百分比按干重计为27.1％至38％，并且其中RebM/总甜菊糖苷百分比按干重计为 8.1％至14％.

检测用于标志物辅助育种的SNP的其他方法

除了上述位点和探针的直接或间接测序之外，本文公开的SNP还可以通过本领域熟知的多种有效方法来检测，包括美国专利No.5,468,613 和5,217,863、5,210,015、5,876,930、6,030,787、6,004,744、6,013,431、 5,595,890、5,762,876、5,945,283、5,468,613、6,090,558、5,800,944和5,616,464中公开的那些.特别地，DNA序列中的多态性可以通过与美国专利No.5,468,613和5,217,863中公开的等位基因特异性寡核苷酸 (allele-specific oligonucleotide，ASO)探针杂交来检测.设计ASO探针的核苷酸序列以形成完全匹配杂交体或在可变核苷酸残基的位点含有错配的碱基对。匹配杂交体和错配杂交体之间的区分是基于杂交体在杂交或洗涤期间使用的条件中的热稳定性的差异、通过变性梯度电泳分析的杂交体稳定性差异或在错配位点的化学切割。

如果SNP产生或破坏限制性内切核酸酶切割位点，其将改变通过用该限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段的大小或谱。因此，可以通过限制性片段分析将具有变体序列的植物与具有原始序列的植物区分开。可以以这种方式鉴定的SNP称为“限制性片段长度多态性”(“RFLP”). RFLP已经广泛用于人和植物遗传分析中(Glassberg，英国专利申请2135774；Skolnick等，Cytogen.Cell Genet.32：58-67(1982)；Botstein等，Ann.J.Hum.Genet.32：314-331(1980)；Fischer等，PCT申请WO 90/13668；Uhlen，PCT申请WO90/11369).

确定SNP的替选方法是基于切割的扩增多态性序列(cleaved amplifiedpolymorphic sequence，CAPS)(Konieczny，A.和F.M.Ausubel， Plant J.4：403-410(1993)；Lyamichev等，Science 260：778-783(1993)). 被称为dCAP的CAP的修饰版本是用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术.dCAPS技术通过使用含有与模板DNA有一个或更多个错配的引物来引入或破坏限制酶识别位点。然后对以这种方式修饰的PCR产物进行限制酶消化，并通过所得限制性模式确定SNP的存在或不存在.该技术可用于已知突变的基因分型和分离的DNA的遗传作图(Neff MM，Neff JD，Chory J，Pepper AE.dCAPS，a simpletechnique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms：experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.Plant J.1998年5月；14(3)：387-92).

SNP也可以通过单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)分析来鉴定.SSCP技术是能够鉴定长度通常在 150至250个核苷酸之间的DNA单链中的大多数序列变异的方法(Elles， Methods in Molecular Medicine：MolecularDiagnosis of Genetic Diseases， Humana Press(1996)；Orita等，Genomics 5：874-879(1989)).在变性条件下，DNA的单链将采用独特的依赖于其序列的构象.即使仅一个碱基改变，这种构象通常也将不同.据报道大多数构象改变物理构型或大小，使得足以通过电泳检测。已经描述了许多用于SSCP的方案，包括但不限于 Lee等，Anal.Biochem.205：289-293(1992)；Suzuki等，Anal.Biochem. 192：82-84(1991)；Lo等，Nucleic Acids Research20：1005-1009(1992)； Sarkar等，Genomics 13：441-443(1992).

还可以使用称为扩增片段长度多态性(amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)的DNA指纹技术检测SNP，其基于来自基因组 DNA的总消化物的限制性片段的选择性PCR扩增以分析所述DNA。Vos 等，Nucleic Acids Res.23：4407-4414(1995)。该方法允许许多限制性片段的特异性共扩增，其可以在不知道核酸序列的情况下进行分析.AFLP基本上采用三个步骤.最初，用限制酶切割基因组DNA的样品，并将寡核苷酸接头连接到DNA的限制性片段.然后通过使用接头和限制性序列作为引物退火的靶位点使用PCR来扩增限制性片段。通过使用延伸到限制性片段中的引物来实现选择性扩增，仅扩增其中引物延伸与限制性位点侧翼的核苷酸匹配的那些片段.然后将这些扩增的片段在变性聚丙烯酰胺凝胶上可视化(Beismann等，Mol.Ecol.6：989-993(1997)；Janssen等，Int.J. Syst.Bacteriol 47：1179-1187(1997)；Huys等，Int.J.Syst.Bacteriol.47：1165-1171(1997)；McCouch等，Plant Mol.Biol.35：89-99(1997)；Nandi 等，Mol.Gen.Genet.255：1-8(1997)；Cho等Genome 39：373-378(1996)； Simons等，Genomics44：61-70(1997)；Cnops等，Mol.Gen.Genet. 253：32-41(1996)；Thomas等，Plant J.8：785-794(1995))。

也可以使用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)检测SNP(Williams等，Nucl.Acids Res.18：6531-6535 (1990)).

可以通过如美国专利No.5,210,015、5,876,930和6,030,787中公开的方法检测SNP，其中具有报道物和淬灭剂分子的寡核苷酸探针与靶多核苷酸杂交.探针被核酸聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性降解.

也可以通过美国专利No.6,004,744、6,013,431、5,595,890、5,762,876 和5,945,283中所公开的标志物碱基延伸方法检测SNP.这些方法基于引物延伸和可检测的核苷三磷酸的掺入.引物设计成与紧邻可变核苷酸的序列退火，其可以在掺入少至一个标志物的核苷三磷酸后检测.美国专利 No.5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中核酸序列中的单个或多个核苷酸变异可以通过以下方法在核酸中检测，其中扩增含有核苷酸变异的序列，印在膜上并用标记的序列特异性寡核苷酸探针处理.

除了上述那些之外，用于鉴定和检测SNP的另一些方法还包括使用限制酶(Botstein等，Am.J.Hum.Genet.32：314-331(1980)；和Konieczny 和Ausubel，Plant J.4：403-410(1993))，酶和化学错配测定(Myers等， Nature 313：495-498(1985))，等位基因特异性PCR(Newton等，Nucl. Acids Res.17：2503-2516(1989)；和Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2757-2760(1989))，连接酶链式反应(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991))，单链构象多态性分析(Labrune等，Am.J.Hum. Genet.48：1115-1120(1991))，单碱基引物延伸(Kuppuswamy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1143-1147(1991)；和Goelet，美国专利No. 6,004,744和5,888,819)，基于固相ELISA的寡核苷酸连接测定(Nikiforov 等，Nucl.Acids Res.22：4167-4175(1994))，双脱氧指纹法(Sarkar等， Genomics 13：441-443(1992))，寡核苷酸荧光淬灭测定(Livak等，PCR Methods Appl.4：357-362(1995))，5′-核酸酶等位基因特异性杂交TaqMan^TM测定(Livak等，Nature Genet.9：341-342(1995))，模板引导的染料终止物渗入(template-directed dye-terminator incorporation，TDI) 测定(Chen和Kwok，Nucl.Acids Res.25：347-353(1997))，等位基因特异性分子信标测定(allele-specificmolecular beacon assay)(Tyagi等， Nature Biotech.16：49-53(1998))，精确定点测定(PinPoint assay)(Haff 和Smirnov，Genome Res.7：378-388(1997))，dCAPS分析(Neffetal.，Plant J.14：387-392(1998))，焦磷酸测序(pyrosequencing)(Ronaghi 等，Analytical Biochemistry 267：65-71(1999)；Ronaghi等PCT申请WO 98/13523；和Nyren等PCT申请WO 98/28440)，使用质谱，例如 Masscode^TM系统(Howbert等WO 99/05319；Howber等WO 97/27331)，质谱(美国专利No.5,965,363)，寡核苷酸探针的侵入性切割(Lyamichev等Nature Biotechnology 17：292-296)以及使用高密度寡核苷酸阵列(Hacia 等NatureGenetics 22：164-167)。

尽管本文描述了用于检测SNP的某些方法，但是可以利用其他检测方法.例如，另外的方法是已知的并且在以下中给出：Birren等，Genome Analysis，4：135-186，ALaboratory Manual.Mapping Genomes，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1999)； Maliga等，Methods in Plant Molecular Biology.ALaboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y. (1995)；Paterson，Biotechnology Intelligence Unit：Genome Mapping inPlants，R.G.Landes Co.，Georgetown，Tex.，and Academic Press，San Diego，Calif.(1996)；The Maize Handbook，Freeling和Walbot编辑， Springer-Verlag，New York，N.Y.(1994)；Methods in Molecular Medicine： Molecular Diagnosis of GeneticDiseases，Elles编辑，Humana Press， Totowa，N.J.(1996)；Clark编辑，Plant MolecularBiology：A Laboratory Manual，Clark编辑，Springer-Verlag，Berlin，Germany(1997).

用于检测和测量甜菊糖苷的另一些方法

除了HPLC之外，还可以通过本领域众所公知的多种方法检测和测量甜菊糖苷。

高RebD和高RebM甜菊植物的育种

选择不同的亲本品系Eirete、AKHL1、AKH EMI、AKHL4、 AKH/G.8.D和PC Star 2，并相应分组以用于在中国江西省赣州进行的杂交.进行了三组不同的杂交.高RebA甜菊植物(‘817075’、‘805082’、 ‘805126’、‘815034’、‘802057’、‘801025’、‘813057’、‘812051’和‘805068’) 和高Stev甜菊植物(‘805028’、‘803066’、‘805003’、‘43-2’和‘49-58’)用于SNP基因分型和HPLC分析.高RebD和高RebM品系‘814011’和 ‘807086’来源于不同组的亲本杂交(参见图11和12).其他高RebD品系 (‘817096’、‘801094’、‘804038’、‘801105’、‘816055’、‘804075’、‘830098’、 ‘806058’、‘810103’、‘803071’、‘805061’、‘813081’、‘806034’和‘803065’) 都来自相同的亲本杂交(图13).

可以与SNP标志物选择相组合的育种方法

在开发任何期望的植物种质中有许多步骤。植物育种开始于分析和确定当前种质的问题和弱点，制定项目目标，并且确定具体的育种目的.下一步是选择具有满足项目目标的性状的种质.目标是在单栽培种中合并来自亲本种质的期望性状的改进的组合。在甜菊中，重要性状是叶产量、早熟、改善的叶质量、莱鲍迪苷含量、甜菊苷含量、对疾病和昆虫的抗性、对干旱和热的抗性，以及改善的农艺性状.育种或筛选方法的选择取决于植物的繁殖模式、所改良性状的可遗传性以及商业上使用的栽培种的类型 (例如，F₁杂交栽培种、纯品栽培种等)。对于高度可遗传的性状，在单个位置进行评价的优良个体植物选择将是有效的，而对于低遗传性的性状，选择应基于从相关植物家族的重复评价获得的平均值。常用的选择方法通常包括谱系选择、改进的谱系选择、混合选择(mass selection)和轮回选择.

遗传的复杂性影响育种方法的选择.回交育种用于将高度可遗传性状的一个或几个有利基因转移到期望的栽培种中.这种方法已广泛用于抗病栽培种的育种。各种轮回选择技术用于定量改善由许多基因控制的遗传性状.在自花授粉作物中使用轮回选择取决于授粉的容易性、每次授粉成功杂交的频率以及每次成功杂交的杂交后代的数量。

每个育种项目应包括对育种程序的效率的定期的客观评价.评价标准根据目标和目的而变化，但应包括从每年选择获得的，其基于与适当标准的比较、高级育种品系的总体价值和每单位投入产生的成功栽培种数(例如，每年、每美元花费等).

在代表商业目标区域的环境中，对有前途的高级育种品系进行彻底测试并与流行栽培种进行比较三年或更长时间.优于流行栽培种的品系是新的商业栽培种的候选.将少数性状仍然缺陷的那些品系丢弃或用作亲本以产生用于进一步选择的新群体.

导致最终的营销和分销步骤的这些过程从进行第一次杂交的时间开始通常需要七至十二年。因此，新栽培种的开发是需要精确预先规划、有效利用资源以及使方向的改变最小化的耗时过程.

最困难的任务是鉴定遗传上优良的个体，因为对于大多数性状，真实基因型值被其他混杂的植物性状或环境因素掩盖.鉴定优良植物的一种方法是观察其相对于其他实验品系和广泛生长的标准栽培种的性能。对于许多性状，单次观察是非决定性的，而需要随时间和空间重复观察以提供对品系遗传价值的良好估计。

商业甜菊育种项目的目标是开发新的、独特的和优良的甜菊栽培种. 育种者最初选择和杂交两个或更多个亲本品系，随后是世代的前进和选择，从而产生许多新的遗传组合。育种者理论上可以通过该程序产生数十亿种不同的遗传组合.在生长的有限种群大小中，育种者无法直接控制出现的遗传组合.因此，两个育种者将永远不会开发具有相同性状的相同品系。

每年，植物育种者选择种质以推进到下一代.该种质在独特且不同的地理、气候和土壤条件下生长，然后在生长季节期间和结束时进行进一步选择。所开发的品系是不可预测的。这种不可预测性是因为育种者的选择发生在独特的环境中，在DNA水平上没有控制(使用常规育种程序)，并且产生数百万种不同的可能的遗传组合.本领域普通技术的育种者不能预测他所开发的最终所得品系，除非可能以非常粗略和一般的方式.同一育种者不能通过使用完全相同的原始亲本和相同的选择技术以任何合理的可能性两次产生相同的栽培种.这种不可预测性导致大量研究资金的支出，以开发出优良的新甜菊栽培种.

甜菊的纯品系栽培种通常通过两个或更多个亲本的杂交然后选择来繁殖。遗传的复杂性、育种目的和可用资源影响育种方法.谱系育种 (Pedigree breeding)、轮回选择育种和回交育种是通常用于自花授粉作物如甜菊的育种方法.这些方法涉及制备育种池或种群以便组合来自两个或更多个栽培种或各种广泛来源的期望性状的方式。通常用于选择期望的个体或个体群体的程序称为混合选择(mass selection)、株行选择 (plant-to-row selection)、单种子传代(single seed descent)或改进的单种子传代(modifiedsingle seed descent).这些选择方法中的一种或组合可用于开发来自育种种群的栽培种.

谱系育种主要用于将有利的基因组合到全新的栽培种中，所述栽培种在许多性状方面不同于在原始杂交中使用的任一亲本.其通常用于改良自花授粉作物。具有有利的互补性状的两个亲本杂交以产生F₁(杂交后代 1).F₂种群通过F₂植物自交产生.期望的个体植物的选择可早在其中发生最大基因分离的F₂代开始.个体植物选择可以发生一代或更多代.接下来，可以将来自每个所选植物的种子种植在单独识别的行或丘(hill) 中，称为后代行或后代丘，以评价品系并增加种子数量，或进一步选择单个植物.一旦将后代行或后代丘选择为具有期望的性状，其成为与来源于相同原始群的其他育种品系可特别区分的育种品系.在晚期阶段(即，F₅或更高)，在重复测试中评价个体品系的种子.在晚期阶段，测试来自相同原始杂交的最佳品系或表型相似品系的混合物用于潜在发布新栽培种.

严格意义上的单种子传代程序是指种植分离种群，从每株植物收获一个种子，并将这些种子组合成群体，将其作为下一代种植.当种群已经进展到期望的近亲繁殖水平时，从其中得到品系的植物将各自追踪到不同的 F₂个体。种子传代程序的主要优点是延迟选择直到在个体植物中达到高水平的纯合性(例如缺少基因分离)，并且通常通过使用冬季苗圃快速通过这些早期世代。

改进的单种子传代程序包括从种群中的每株植物收获多个种子(即单个锁或简单蒴)并将其组合以形成群体。群体中的一部分用于种植下一代，一部分用于储备。该程序已用于节省收获时的劳动力，并保持种群的足够种子数量.

期望性状的选择可以发生在任何分离代(F₂及以上).通过在其中期望性状最大限度地表达的环境中生长种群来对种群施加选择压力，并且可以鉴定具有该性状的个体或品系。例如，当植物或品系在自然或人工诱导的疾病环境中生长时，可以针对疾病抗性进行选择，并且育种者仅选择具有很少或没有疾病的那些个体，并因此被假定具有抗性.

除了表型观察外，还可以检查植物的基因型。有许多基于实验室的技术可用于分析、比较和表征植物基因型.其中包括同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹法(DAF)、序列表征扩增区域 (SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR，也称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。

利用分子技术育种

靶向基因组编辑可以通过使用工程核酸酶来实现。在细菌中， CRISPR(聚集的规则间隔的短回文重复序列)是包含碱基序列的短重复的原核DNA的片段.每个重复之后是来自之前暴露于细菌病毒或质粒的 “间隔DNA”的短片段。其发音为“crisper”.随后暴露于病毒时，细菌能够识别、靶向并破坏外来DNA。CRISPR系统可用于通过使用Cas9核酸酶进行基因编辑，所述核酸酶使用引导性RNA分子导向到其靶DNA上，然后在DNA中诱导双链断裂以破坏基因或所需序列.然后通过非同源修复系统或同源依赖性修复系统修复DNA。在后一种情况下，可以使用人工寡核苷酸将新序列插入切割位点.还参见US20100076057A1、WO2010075424A2、WO2013126794A1、WO2013142578、WO2013169398、 WO2013176772A1、US2013181440A1、US20140017214A1、WO20140 11237A1、WO2014022702A2、WO2014071219A1、US8697359B1和 WO2014018423A2.

同工酶电泳和RFLP已经广泛用于确定遗传组成。Shoemaker和 Olsen，(MolecularLinkage Map of Soybean(Glycine max L.Merr.)第 6.131-6.138页，S.J.O′Brien(编辑)，Genetic Maps：Locus Maps of Complex Genomes中，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1993))开发了由具有约365个RFLP、11个RAPD、三个经典标志物和四个同功酶基因座的25个连锁群组成的分子遗传连锁图谱。还参见Shoemaker，R.C，RFLP Map of Soybean，第299-309页，Phillips，R.L.和Vasil，I.K.(编辑)，DNA-Based Markers in Plants中， Kluwer Academic Press，Dordrecht，theNetherlands(1994).

SSR技术是目前最有效和实用的标志物技术；与RFLP相比，使用 SSR可以常规使用更多的标志物基因座，并且每个标志物基因座中可以找到更多等位基因.例如，Diwan和Cregan描述了在具有多达26个等位基因的大豆中的高度多态性微卫星基因座.Diwan，N.和Cregan，P.B.， Theor.Appl.Genet.，95：22-225(1997).本文所述的其他SNP也可用于鉴定本发明的独特遗传组成和保留该独特遗传组成的后代品种。各种分子标志物技术可以组合使用以增强总体分辨率。

可以在植物育种中使用分子标志物，包括通过使用技术如同工酶电泳、RFLP、RAPD、AP-PCR、DAF、SCAR、AFLP、SSR和SNP鉴定的标志物.分子标志物的一种用途是数量性状基因座(Quantitative Trait Loci，QTL)作图.QTL作图是使用已知与对数量性状具有可测量作用的等位基因紧密连锁的标志物.育种过程中的选择是基于与与来自植物基因组的正效应等位基因连锁的标志物的积累和/或负效应等位基因连锁的标志物的消除。

分子标志物也可以在育种过程中用于选择定性性状.例如，在回交育种过程期间，可以使用与等位基因紧密连锁的标志物或在实际的目的等位基因内含有标志物的序列来选择含有目的等位基因的植物.例如，在大豆育种中使用分子标志物来选择对大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode) 具有抗性的性状，参见美国专利No.6,162,967.标志物也可以用于选择轮回亲本的基因组并且针对供体亲本的标志物来反选.使用该程序可以试图使来自供体亲本的基因组的量最小化地保留在所选植物中.其还可以用于减少回交程序中需要与轮回亲本回交的数目。在选择过程中使用分子标志物通常称为遗传标志物增强的选择.通过提供手段来追踪通过杂交的遗传图谱，分子标志物还可以用于鉴定和排除某些来源的种质作为植物的亲本品种或祖先，如下文更充分讨论的.

突变育种

突变育种是将新性状引入甜菊品种的另一种方法。自发或人工诱导的突变对于植物育种者来说可以是变异的有用来源。人工诱变的目标是增加用于期望特性的突变率.突变率可以通过许多不同的手段增加，包括温度、长期种子储存、组织培养条件、辐射(例如X射线、γ射线、中子、β辐射或紫外辐射)、化学诱变剂(例如碱基类似物如5-溴-尿嘧啶)、抗生素、烷化剂(例如硫芥、氮芥、环氧化物、乙烯胺、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐、砜或内酯)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶.一旦通过诱变观察到期望的性状，则可以通过传统的育种技术将性状引入现有的种质中.突变育种的细节可参见Fehr的Principles ofCultivar Development，Macmillan Publishing Company(1993).

双单倍体(double haploid)的产生

双单倍体的产生也可用于在育种程序中开发纯合品种.通过将来自杂合植物的一组染色体加倍以产生完全纯合的个体来产生双单倍体。例如，参见Wan等，Theor.Appl.Genet.，77：889-892(1989).

通常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可以在多个参考书之一中找到(例如，Allard(1960)；Simmonds(1979)；Sneep等(1979)； Fehr(1987)).

合适的测试应检测任何重大缺陷并建立相对于当前栽培种的优势或改进水平.除了表现出优越的性能，必须对于符合行业标准或产生新市场的新栽培种有需求.引入新的栽培种会给种子生产者、种植者、加工者和消费者带来额外的成本，用于特殊广宣、营销和商业生产实践和新产品利用。在发布新栽培种之前的测试应考虑研究和开发成本以及最终栽培种的技术优势。对于种子繁殖的栽培种，必须能够容易和经济地产生种子.

甜菊花是雌雄同体的，其中雄性结构和雌性结构在同一花中.杂交或杂种种子通过所选亲本之间的手工杂交产生.在花开放之前，通过手工除去雄性花药对将成为的雌性亲本的花芽进行去雄.在开花时，将来自指定为雄性的亲本植物的花的花粉手工放置在先前去雄的花的柱头上.从杂交发育的种子称为第一代(F₁)杂种种子.这种种子的种植产生了F₁杂种植物，其一半遗传组分来自雌性亲本，另一半来自雄性亲本.基因的分离开始于减数分裂，从而产生第二代(F₂)种子.假设原始亲本之间存在多重遗传差异，每个F2种子具有独特的基因组合。

其他实施方案

随着允许分离和表征编码特定蛋白质产物的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家对改造植物基因组以包含和表达外来基因，或者天然或内源基因(可能由不同启动子驱动)的额外或修饰形式，以便以特定方式改变植物的性状产生了强烈的兴趣。这样的外来的额外和 /或修饰的基因在本文中统称为“转基因”.在过去的十五到二十年中，已经开发了用于产生转基因植物的多种方法，在具体实施方案中，还涉及要求保护的栽培种的转化形式.

植物转化涉及在植物细胞中构建起作用的表达载体。这种载体包含含有在调节元件(例如启动子)控制下或与其有效连接的基因的DNA。表达载体可以包含一个或更多个这种有效连接的基因/调节元件组合.载体可以是质粒的形式，并且可以单独使用或与其他质粒组合使用，以提供转化的甜菊植物，使用如下所述的转化方法将转基因引入甜菊植物的遗传物质中。

用于甜菊转化的表达载体：标志物基因

表达载体包括与调节元件(例如启动子)有效连接的至少一个遗传标志物，其允许通过负选择(即，抑制不含选择标志物基因的细胞的生长) 或通过正选择(即筛选由遗传标志物编码的产物)来回收包含标志物的转化细胞.用于植物转化的许多常用选择性标志物基因在转化领域中是公知的，并且包括例如编码对选择性化学试剂(其可以是抗生素或除草剂)代谢性解毒的酶的基因，或编码对抑制剂不敏感的改变的靶标的基因.一些正选择方法也是本领域已知的.

一种用于植物转化的常用选择性标志物基因是新霉素磷酸转移酶II (nptII)，其在植物调节信号的控制下赋予卡那霉素抗性.Fraley等， PNAS，80：4803(1983).另一种常用的选择性标志物基因是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予抗生素潮霉素抗性.VandenElzen等，Plant Mol.Biol.， 5：299(1985)。

细菌来源的赋予抗生素抗性的其他选择标志物基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶和氨基糖苷-3′-腺嘌呤转移酶、博来霉素抗性决定簇.Hayford等，Plant Physiol，86：1216(1988)；Jones等，Mol.Gen. Genet.，210：86(1987)；Svab等，PlantMol.Biol.，14：197(1990)；Hille等， Plant Mol.Biol.，7：171(1986).另一些选择性标志物基因赋予对除草剂如草甘膦、草铵膦或溴苯腈的抗性。Comai等，Nature，317：741-744(1985)； Gordon-Kamm等，Plant Cell，2：603-618(1990)；和Stalker等，Science， 242：419-423(1988)。

非细菌来源的用于植物转化的另一些选择性标志物基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶.Eichholtz等，Somatic Cell Mol.Genet.，13：67(1987)；Shah等，Science，233：478(1986)；Charest等，Plant Cell Rep.，8：643(1990).

另一类用于植物转化的标志物基因需要筛选假定转化的植物细胞，而不是对有毒物质(例如抗生素)具有抗性的转化细胞进行直接遗传选择。这些基因特别可用于定量或可视化特定组织中基因表达的空间模式，并且经常被称为报道基因，因为其可以与基因或基因调节序列融合以用于基因表达的研究.用于筛选假定转化的细胞的常用基因包括β-葡糖醛酸酶 (GUS)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶。Jefferson，R.A.，Plant Mol.Biol.Rep.，5：387(1987)；Teeri等，EMBO J.，8：343(1989)；Koncz 等，PNAS，84：131(1987)；DeBlock等，EMBO J.3：1681(1984).

用于可视化GUS活性而不需要破坏植物组织的体内方法是可获得的.MolecularProbes Publication 2908，IMAGENE GREEN，第1-4页 (1993)和Naleway等，J.Cell Biol.，115：151a(1991).然而，由于低灵敏度、高荧光背景和与使用荧光素酶基因作为选择性标志物相关的限制，用于可视化GUS活性的这些体内方法尚未被证明可用于回收转化细胞。编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因已经用作原核和真核细胞中基因表达的标志物. Chalfie等，Science，263：802(1994).GFP和GFP的突变体可以用作选择性标志物.

用于甜菊转化的表达载体：启动子

包含在表达载体中的基因必须由包含调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动.多种类型的启动子现在是转化领域中公知的，可以单独使用或与启动子组合使用的其他调节元件也是公知的.

如本文所用，“启动子”包括在转录起始点上游的DNA区域，并参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以启动转录.“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中启动转录的启动子.这样的启动子称为“组织优选的”。仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性”.“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或更多个器官中的某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞中。“诱导型”启动子是在环境控制下的启动子.可能通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在.组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。

A.诱导型启动子：

诱导型启动子与用于在甜菊中表达的基因有效连接。任选地，诱导型启动子与编码信号序列的核苷酸序列有效连接，后者与用于在甜菊中表达的基因有效连接.使用诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而增加。

任何诱导型启动子都可以用于本发明.参见Ward等，Plant Mol.Biol， 22：361-366(1993).示例性诱导型启动子包括但不限于来自ACEI系统的响应于铜的启动子(Mett等，PNAS，90：4567-4571(1993))；来自玉米的响应苯磺酰胺除草剂安全剂的In2基因(Hershey等，Mol.Gen.Genet.， 227：229-237(1991)和Gatz等，Mol.Gen.Genet.，243：32-38(1994))；或来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz等，Mol.Gen.Genet.，227：229-237(1991)). 示例性诱导型启动子是响应于植物通常不响应的诱导剂的启动子.示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性由糖皮质激素诱导(Schena等，PNAS，88：0421(1991)).

B.组成型启动子：

组成型启动子与用于在甜菊中表达的基因有效连接，或组成型启动子与编码信号序列的核苷酸序列有效连接，后者与用于在甜菊中表达的基因有效连接.

许多不同的组成型启动子可以用于本发明.示例性组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的启动子，例如来自CaMV的35S启动子(Odell 等，Nature，313：810-812(1985))和来自以下的启动子，例如水稻肌动蛋白(McElroy等，Plant Cell，2：163-171(1990))；泛素(Christensen等，Plant Mol.Biol，12：619-632(1989)和Christensen等，Plant Mol Biol，18：675-689 (1992))；pEMU(Last等，Theor.Appl Genet.，81：581-588(1991))；MAS (Velten等，EMBO J.，3：2723-2730(1984))；和玉米H3组蛋白(Lepetit 等，Mol Gen.Genet.，231：276-285(1992)和Atanassova等，Plant Journal，2 (3)：291-300(1992))的这样的基因。

欧洲油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5′的Xbal/Ncol片段(或与所述Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)ALS启动子代表特别有用的组成型启动子.参见PCT申请号WO96/30530.

C.组织特异性或组织优选的启动子：

组织特异性启动子与用于在甜菊中表达的基因有效连接。任选地，组织特异性启动子与编码信号序列的核苷酸序列有效连接，后者与用于在甜菊中表达的基因有效连接.用与组织特异性启动子有效连接的目的基因转化的植物仅在或优先在特定组织中产生转基因的蛋白质产物.

任何组织特异性或组织优选的启动子可用于本发明.示例性的组织特异性或组织优选的启动子包括但不限于根优选启动子，例如来自菜豆蛋白基因的启动子(Murai等，Science，23：476-482(1983)和Sengupta-Gopalan 等，PNAS，82：3320-3324(1985))；叶特异性和光诱导启动子，例如来自cab 或rubisco的启动子(Simpson等，EMBO J.，4(11)：2723-2729(1985)和 Timko等，Nature，318：579-582(1985))；花药特异性启动子，例如来自LAT52的启动子(Twell等，Mol.Gen.Genet.，217：240-245(1989))；花粉特异性启动子，例如来自Zm13的启动子(Guerrero等，Mol.Gen.Genet.， 244：161-168(1993))；或小孢子优选的启动子，例如来自apg的启动子 (Twell等，Sex.Plant Reprod.，6：217-224(1993))。

将蛋白质靶向亚细胞区室的信号序列

将由转基因产生的蛋白质转运到亚细胞区室例如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体或分泌到质外体中是通过将编码信号序列的核苷酸序列有效连接到编码目的蛋白的基因的5′和/或3′区域实现的.在蛋白质合成和加工过程中，结构基因的5′和/或3′末端的靶向序列可以决定编码的蛋白质最终区室化地点.

信号序列的存在引导多肽到达细胞内细胞器或亚细胞区室或分泌至质外体.许多信号序列是本领域已知的.参见，例如，Becker等，Plant Mol. Biol，20：49(1992)；Close，P.S.，硕士论文，Iowa State University(1993)； Knox，C等，Plant Mol.Biol，9：3-17(1987)；Lerner等，Plant Physiol，91： 124-129(1989)；Fontes等，Plant Cell，3：483-496(1991)；Matsuoka等， PNAS，88：834(1991)；Gould等，J.Cell Biol，108：1657(1989)；Creissen 等，Plant J.，2：129(1991)；Kalderon等，Cell，39：499-509(1984)；Steifel 等，Plant Cell，2：785-793(1990)。

外来蛋白基因和农业基因

利用转基因植物，可以以商业量生产外来蛋白质。因此，本领域公知的用于转化植物的选择和繁殖的技术产生多种转基因植物，其以常规方式收获，然后可以从目的组织或从总生物质中提取外来蛋白质。从植物生物质提取蛋白质可以通过已知的所讨论的方法完成，例如Heney和Orr， Anal.Biochem.，114：92-6(1981)。

根据一个实施方案，提供用于商业生产外来蛋白质的转基因植物是甜菊植物。在另一个实施方案中，目的生物质是种子.对于相对较少数目的表现较高表达水平的转基因植物，可以主要通过常规RFLP、PCR和SSR 分析产生遗传图谱，其鉴定完整DNA分子的大概染色体位置.关于这方面的示例性方法，参见Glick和Thompson，Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，269：284(1993).关于染色体位置的图谱信息可用于本发明转基因植物的专有保护.如果进行未授权的繁殖并与其他种质杂交，则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱相比较，以确定后者是否与本发明植物具有共同的亲本.图谱比较将涉及杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，所有这些都是常规技术。

同样，农业基因可以在转化的植物中表达.更具体地，植物可以被遗传改造以表达有农业利益的各种表型.在这方面涉及的示例性基因包括但不限于以下分类的那些：

A.赋予害虫或疾病抗性的基因，并且编码：

1.植物疾病抗性基因.植物防御通常由植物中的疾病抗性基因(R) 产物与病原体中相应非病原性(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。植物品种可以用克隆的抗性基因转化以改造成对特定病原体株有抗性的植物.参见例如Jones等，Science，266：789(1994)(对番茄叶霉病 (Cladosporium fulvum)具有抗性的番茄Cf-9基因的克隆)；Martin等， Science，262：1432(1993)(对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato)具有抗性的番茄Pto基因编码蛋白激酶)；Mindrinos 等，Cell，78：1089(1994)(对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)具有抗性的拟南芥(Arabidopsis)RSP2基因).

2.赋予害虫(例如线虫)抗性的基因。参见例如PCT申请号WO 96/30517；PCT申请号WO 93/19181。

3.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白，其衍生物或模拟其的合成多肽。参见例如Geiser等，Gene，48：109(1986)，其公开了Bt δ- 内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自American Type Culture Collection，Manassas，Va.，例如ATCC的保藏号40098、67136、31995和31998.

4.凝集素。参见，例如，Van Damme等，Plant Molec.Biol.，24：25(1994) 的公开内容，其公开了多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列.

5.维生素结合蛋白，例如抗生物素蛋白。参见PCT申请号US 93/06487.该申请教导了使用抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为对害虫的杀幼虫剂.

6.酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见，例如，Abe等，J.Biol.Chem.，262：16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列)；Huub等，Plant Molec.Biol.，21：985(1993)(编码烟草蛋白酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等，Biosci.Biotech. Biochem.，57：1243(1993)(Streptomyces nitrosporeus的α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)；和美国专利No.5,494,813(Hepher和Atkinson，1996年2月27日授权).

7.昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素、其变体、基于其的模拟物或其拮抗剂或激动剂.参见例如Hammock等，Nature， 344：458(1990)，baculovirusexpression of cloned juvenile hormone esterase，an inactivator of juvenilehormone的公开内容.

8.昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时破坏受影响害虫的生理机能. 例如，参见Regan，J.Biol.Chem.，269：9(1994)(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)和Pratt等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，163：1243 (1989)(在太平洋折翅蠊(Diplopterapuntata)中鉴定的抑咽侧体神经肽 (allostatin))的公开内容，还参见Tomalski等的美国专利No.5,266,317，其公开了编码昆虫特异性麻痹神经毒素的基因。

9.由蛇、黄蜂等自然产生的昆虫特异性毒液.例如，参见Pang等， Gene，116：165(1992)，公开了编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达.

10.负责单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀虫活性的另外的非蛋白分子的过度积累的酶.

11.参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶.例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是合成的.参见Scott等的PCT申请No.WO 93/02197，其公开了callase基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的 DNA分子可以例如从ATCC保藏号39637和67152获得。也参见Kramer 等，InsectBiochem.Molec.Biol，23：691(1993)，其教导编码烟草天蛾几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，和Kawalleck等，Plant Molec.Biol，21：673 (1993)，其提供了欧芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列.

12.刺激信号转导的分子.例如，参见Botella等，Plant Molec.Biol， 24：757(1994)，nucleotide sequences for mung bean calmodulin cDNA clones的公开内容，以及Griess等，Plant Physiol，104：1467(1994)，其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列.

13.疏水力矩肽.参见PCT申请号WO 95/16776(公开了抑制真菌植物病原体的Tachyplesin的肽衍生物)和PCT申请号WO 95/18855(教导了赋予抗病性的合成抗微生物肽).

14.膜通透酶，通道形成物或通道阻断剂.例如，参见Jaynes等，Plant Sci.，89：43(1993)的公开内容，其公开了天蚕杀菌肽-β-裂解肽类似物的异源表达，以赋予转基因烟草植物青枯假单孢杆菌(Pseudomonas solanacearum)抗性.

15.病毒侵入性蛋白或由其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对由外壳蛋白基因来源的病毒以及相关病毒引起的病毒感染和/或疾病发生的抗性。参见，Beachy等，Ann.Rev. Phytopathol，28：451(1990)。已经赋予了转化植物对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯病毒X、马铃薯病毒Y、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性.Id.

16.昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道中的关键代谢功能的抗体将使受影响的酶灭活，杀死昆虫.参见Taylor等，摘要#497，分子植物-微生物相互作用的第七次国际研讨会(Edinburgh， Scotland)(1994)(通过产生单链抗体片段的转基因烟草中的酶失活).

17.病毒特异性抗体.参见例如Tavladoraki等，Nature，366：469 (1993)，其表明表达重组抗体基因的转基因植物免受病毒攻击.

18.由自然界中由病原体或寄生虫产生的发育阻滞蛋白.因此，真菌内-α-1，4-D-聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶促进真菌定殖和植物营养物释放。参见Lamb等，Bio/technology，10： 1436(1992)。编码豆聚半乳糖醛酸内切酶抑制蛋白的基因的克隆和表征描述于Toubart等，Plant J.，2：367(1992)中.

19.由植物天然产生的发育阻滞蛋白。例如，Logemann等，Bio/technology，10：305(1992)已经表明，表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病的抗性增加.

B.赋予除草剂抗性的基因：

1.抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮或磺酰脲。该类别中的示例性基因编码突变ALS和AHAS酶，例如，分别由Lee等，EMBO J.，7：1241(1988)和Miki等，Theor.Appl.Genet.，80：449(1990)描述.其他除草剂如麦草畏增加植物生长.

2.草甘膦(分别由突变5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和 aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase，PAT)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)PAT bar基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACCase 抑制剂编码基因).参见，例如，Shah等的美国专利No.4,940,835，其公开了可以赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列.编码突变aroA基因的DNA分子可以在ATCC登录号39256下获得，并且该突变基因的核苷酸序列公开在Comai的美国专利No.4,769,061中.Kumada等的欧洲专利申请No.0333033和Goodman等的美国专利No.4,975,374公开了谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，其赋予除草剂如L-草丁膦或环己二酮抗性.PAT基因的核苷酸序列在Leemans等的欧洲专利申请No.0242246中提供.DeGreef等，Bio/technology，7：61(1989)描述了表达编码PAT 活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予对苯氧基丙酸和环己酮 (例如稀禾定和吡氟氯禾灵)抗性的基因的实例是Marshall等，Theor. Appl.Genet.，83：435(1992)中描述的Accl-S1、Accl-S2和Accl-S3基因.

3.抑制光合作用的除草剂，例如三嗪(psbA和gs+基因)溴苯腈或苄腈(腈水解酶基因).Przibila等，Plant Cell，3：169(1991)描述了用编码突变psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas).腈水解酶基因的核苷酸序列公开于Stalker的美国专利No.4,810,648中，含有这些基因的 DNA分子可以在ATCC登录号53435、67441和67442下获得.编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达描述于Hayes等，Biochem.J.，285： 173(1992)中.

4.抑制原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂，包括许多不同结构类型的分子(Duke等，Weed Sci.39：465(1991)；Nandihalli等Pesticide Biochem.Physiol 43：193(1992)；Matringe等，FEBS Lett.245：35(1989)； Yanase和Andoh，Pesticide Biochem.Physiol35：70(1989))，包括二苯基醚{例如氟锁草醚(acifluorifen)，5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸；其甲酯；或乙氧氟草醚(oxyfluorfen)，2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-(三氟苯)}，oxidiazole(例如，oxidiazon，3-[2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1，1-二甲基乙基)-l，3，4-

二唑-2-(3H)-酮)、环状亚胺(例如， S-23142，N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基氧基苯基)-3，4，5，6-四氢邻苯二甲酰亚胺； chlorophthalim，N-(4-氯苯基)-3，4，5，6-四氢邻苯二甲酰亚胺)，苯基吡唑(例如，TNPP-乙基，2-[1-(2，3，4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基]丙酸乙酯； M&B 39279)，吡啶衍生物(例如，LS 82-556)，和phenopylate及其O- 苯基吡咯烷基和哌啶基氨基甲酸酯类似物.

C.赋予或贡献于值增加的性状的基因，例如：

1.改进的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以增加植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等，PNAS，89：2624 (1992)。

2.降低的植酸含量：(a)植酸酶编码基因的引入将增强植酸的分解，向转化的植物添加更多的游离磷酸盐.参见例如Van Hartingsveldt等， Gene，127：87(1993)，其公开了黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因的核苷酸序列；和(b)可以引入并且降低植酸盐含量的基因.例如，在玉米中，这可以通过克隆然后重新引入与单个等位基因相关的DNA来实现，所述单个等位基因导致以低水平的植酸为特征的玉米突变体.参见， Raboy等，Maydica，35：383(1990)。

3.改进的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉分支模式的酶的基因转化植物实现.参见，Shiroza等，J.Bacteol.，170：810(1988)(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等，Mol.Gen. Genet.，20：220(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen等，Bio/technology，10：292(1992)(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的生产)；Elliot等， Plant Molec.Biol.，21：515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sorgaard等，J.Biol.Chem.，268：22480(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)；和Fisher等，Plant Physiol.，102：1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。

4.改进的纤维特性，例如纤维质量表示可在甜菊品种中修饰的性状的另一个实例.例如，美国专利No.6,472,588描述了用蔗糖磷酸合酶核酸转化以改变纤维特性例如强度、长度、纤维细度、纤维成熟度比、未成熟纤维含量、纤维均匀性和马克隆值(micronaire)的转基因甜菊植物.包含编码选自用于改善甜菊纤维特性的内切葡聚糖转移酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的酶的一个或更多个基因的甜菊植物也描述于美国专利No. 6,563,022.使用优先指导卵巢组织中基因表达(特别是在非常早期的果实发育中)的卵巢组织转录因子，用于在甜菊胚珠组织中表达编码异戊烯基转移酶的基因，改变甜菊植物中棉铃组的特征并改变纤维质量特性(包括纤维尺寸和强度)的甜菊纤维修饰在美国专利No.6,329,570中进行了讨论.控制甜菊植物中的纤维形成机理的基因描述于美国专利No.6,169,174 中。参与木质素生物合成的基因描述于美国专利No.5,451,514中.

用于甜菊转化的方法

已经开发了许多用于植物转化的方法，包括生物和物理植物转化方案.参见例如Mild等，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”中，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和 Thompson(编辑)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67-88页(1993).此外，可获得用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法.参见，例如，Gruber等，“Vectors for PlantTransformation”中，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson(编辑)， CRC Press，Inc.，Boca Raton，第89-119页(1993).

A.土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化：

用于将表达载体引入植物中的一种方法是基于土壤杆菌 (Agrobacterium)的天然转化系统.参见例如Horsch等，Science，227： 1229(1985).根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A. rhizogenes)是遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因.参见，例如，Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant Sci.，10：1(1991).用于土壤杆菌介导的基因转移的土壤杆菌载体系统和方法的描述由Gruber等，同上，Miki等，同上和Moloney等，PlantCell Rep.，8：238(1989)提供.也参见，1996年 10月8日授权的美国专利No.5,563,055(Townsend和Thomas).

B.直接基因转移：

已经开发了统称为直接基因转移的多种植物转化方法，作为土壤杆菌介导的转化的替代方法.植物转化的通常可应用的方法是微粒介导的转化，其中DNA携带在测量为1μm至4μm的微粒表面上。将表达载体用生物弹道装置(biolistic device)引入到植物组织中，所述装置将微粒加速至300m/s至600m/s的速度，其足以穿透植物细胞壁和膜。Sanford等，Part.Sci.Technol.，5：27(1987)；Sanford，J.C，Trends Biotech.，6：299 (1988)；Klein等，Bio/technology，6：559-563(1988)；Sanford，J.C，Physiol Plant，7：206(1990)；Klein等，Bio/technology，10：268(1992)。还参见，1991 年5月14日授权的美国专利No.5,015,580(Christou等)；1994年6月 21日授权的美国专利No.5,322,783(Tomes等).

将DNA物理递送至植物的另一种方法是靶细胞的超声处理.Zhang 等，Bio/technology，9：996(1991).或者，脂质体和原生质球融合已经用于将表达载体引入植物中.Deshayes等，EMBO J.，4：2731(1985)；Christou 等，PNAS，84：3962(1987)。也已经报道了使用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚 -L-鸟氨酸将DNA直接摄取到原生质体中.Hain等，Mol.Gen.Genet.，199： 161(1985)和Draper等，Plant Cell Physiol.23：451(1982)。也已经描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔.Donn等，植物细胞和组织培养物第七次国际IAPTC摘要中，A2-38，第53页(1990)；D′Halluin等，Plant Cell， 4：1495-1505(1992)；和Spencer等，Plant Mol.Biol，24：51-61(1994)。

在转化甜菊靶组织后，上述选择性标志物基因的表达允许使用本领域现在公知的再生和选择方法优先选择转化的细胞、组织和/或植物.

前述转化方法通常用于产生转基因品种.然后可以使转基因品种与另一种(非转化或转化的)品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，可以使用植物育种领域熟知的传统回交技术将使用前述转化技术已工程化改造到特定甜菊栽培种中的遗传性状移入另一栽培种.例如，回交方法可以用于将工程化性状从公共的非优良品种移动到优良品种中，或从其基因组中含有外来基因的品种移动到不含有该基因的品种中。如本文所使用的， “杂交”可以指简单的X与Y杂交，或回交的过程，这取决于上下文.

C.单基因转化

当本文使用术语“甜菊植物”时，这也包括该品种的任何单基因转化。本文所用的术语“单基因转化的植物”是指通过称为回交的植物育种技术开发的那些甜菊植物，其中通过回交技术，除了将单基因转移到品种中之外，还恢复了该品种的基本上所有期望的形态学和生理学特征.回交方法可以在本文中用于改进品种或将特征引入品种中。如本文所用的术语“回交”是指杂种后代重复杂交回轮回亲本，即与轮回亲本回交1、2、3、4、 5、6、7、8、9或更多次。为期望特性贡献基因的亲本甜菊植物称为“非回交”或“供体亲本”.该术语是指非回交亲本在回交方案中使用一次，因此不再发生的事实.转移来自非轮回亲本的一个或更多个基因的亲本甜菊植物被称为轮回亲本，因为其在回交方案中用于几轮(Poehlman&Sleper (1994)；Fehr(1987)).在典型的回交方案中，将原始目标品种(轮回亲本) 与携带待转移的目标单个基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后将来自该杂交的所得后代再次与轮回亲本杂交，并重复该过程，直到获得甜菊植物，其中除了来自非轮回亲本的单个转移的基因外，轮回亲本的基本上所有的期望形态和生理特征都在转化植物中恢复，如以在相同的环境条件下生长时5％的显著性水平所测定的。

合适的轮回亲本的选择是成功回交程序的重要步骤.回交方案的目标是改变或替代原始品种中的单个性状或特征.为了实现这一点，轮回品种的单个基因被来自非轮回亲本的期望基因修饰或替换，同时保留原始品种的基本上所有其余的期望遗传，并因此保留期望的生理和形态学构成.特定非轮回亲本的选择将取决于回交的目的.一个主要目的是向植物添加一些商业上需要的、农艺学上重要的性状。确切的回交方案将取决于改变的特性或性状以确定适当的测试方案.虽然当所转移的特征是显性等位基因时，回交方法是简化的，但是也可以转移隐性等位基因.在这种情况下，可能需要引入子代的测试以确定是否已经成功地转移了期望的特性。

已经鉴定了许多单基因性状，其在新品种的开发中没有被常规选择，但是可以通过回交技术来改进.单基因性状可以是或不是转基因的.这些性状的实例包括但不限于雄性不育、蜡质淀粉、除草剂抗性，细菌、真菌或病毒病抗性，昆虫抗性、雄性能育性、增强的营养品质、工业用途、产量稳定性和产量增强.这些基因通常通过核进行遗传.这些单基因性状中的几种描述于美国专利No.5,959,185、5,973,234和5,977,445中，其公开内容特别地通过引用并入本文。

通过组织培养和再生可以进行品种的进一步繁殖。甜菊的各种组织的组织培养和来自其的植物再生是公知的并且广泛公开.例如，可参考 Komatsuda，T.等，Crop Sci，31：333-337(1991)；Stephens，P.A.等，Theor. Appl.Genet，82：633-635(1991)；Komatsuda，T.等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，28：103-113(1992)；Dhir，S.等Plant Cell Rep.，11：285-289 (1992)；Pandey，P.等，Japan J.Breed.，42：1-5(1992)；和Shetty，K.等，Plant Science，81：245-251(1992)；以及1991年6月18日授予Collins等的美国专利No.5,024,944，1991年4月16日授予Ranch等的美国专利No. 5,008,200.因此，本发明的另一方面是提供在生长和分化时产生具有高 RebD和RebM的甜菊植物以及本文公开的标志物SNP的细胞。

如本文所用，术语“组织培养物”表示包含相同或不同类型的分离细胞或组织成植物部分的这些细胞的集合的组合物.组织培养物的示例性类型是原生质体、愈伤组织、植物簇和植物细胞，其可以产生植物或植物部分中完整的组织培养物，例如胚、花粉、花、种子、叶、茎、根、花药、雌蕊等.用于制备和维持植物组织培养物的手段是本领域公知的。例如，包含器官的组织培养物已用于产生再生植物。美国专利No.5,959,185、 5,973,234和5,977,445描述了某些技术.

糖苷的提取和纯化方法

使用水或有机溶剂从甜菊植物中提取和纯化甜性糖苷的方法描述于例如美国专利No.4,361,697、4,082,858、4,892,938、5,972,120、5,962,678、 7,838,044和7,862,845中。用于提取RebD的方法描述于美国专利No. 9,029,426中，并且RebM的提取在美国申请No.14/254,653中提供.

所述组合物可用作各种食品和饮料产品中的甜味增强剂、风味增强剂和甜味剂.食品和饮料产品的实例包括但不限于碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料、零热量饮料、运动饮料、茶、水果和蔬菜汁、果汁饮料、乳饮料、酸奶饮料、酒精饮料、粉状饮料(powdered beverage)、烘焙产品、饼干、小面包、烘焙混合物、谷类食品、蜜饯、糖果、咖啡、口香糖、乳制品、调味乳、酸奶、调味酸奶、发酵乳、酱油和其他基于酱油的产品、沙拉酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉制品、鱼肉制品、瓶装和罐头食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜.此外，所述组合物可用于药物或药物制剂和化妆品中，包括但不限于牙膏、漱口水、止咳糖浆、咀嚼片、锭剂、维生素制剂等。组合物可以“原样”使用或与其他甜味剂、调味剂和食品成分组合使用.

保藏信息

以上公开的和在所附权利要求中所述的名为“807086”的甜菊品种的活植物组织的保藏已经由中国朝阳区100101大屯路中国科学院微生物研究所中国通用微生物培养物收集中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)完成。保藏日期为2014年9月22 日。CGMCC登录号为CGMCC No.9702。对保藏的所有限制均已移除，保藏的目的是满足37 C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。

上文公开的和在所附权利要求中所述的名为“817096”的甜菊品种的活植物组织的保藏已经由中国朝阳区100101大屯路中国科学院微生物研究所中国通用微生物培养物收集中心(CGMCC)完成。保藏日期为2014 年9月22日。CGMCC登录号为CGMCC No.9703。对保藏的所有限制已移除，保藏旨在满足37 C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。

上文公开的和在所附权利要求中所述的名为“814011”的甜菊品种的活植物组织的保藏已经由中国朝阳区100101大屯路中国科学院微生物研究所中国通用微生物培养物收集中心(CGMCC)完成。保藏日期为2014 年9月22日。CGMCC登录号为CGMCC No.9701。对保藏的所有限制已移除，保藏旨在满足37 C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。

虽然上面已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换、添加和子组合.因此，旨在将所附权利要求和下文的权利要求解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改、置换、添加和子组合。

本申请母案申请的权利要求作为本申请说明书的一部分在此并入：

1.甜菊植物，其包含8种单核苷酸多态性(SNP)，其中所述SNP以纯合形式存在，其中所述8种SNP包括：SNP2，其包含SEQ ID NO：1 中位置号225处的G至C核苷酸替换；SNP10，其包含SEQ ID NO：2 中位置号187处的G至A核苷酸替换；SNP12，其包含SEQ ID NO：3 中位置号345处的C至T核苷酸替换；SNP17，其包含SEQ ID NO：4 中位置号129处的A至C核苷酸替换；SNP19，其包含SEQ ID NO：5 中位置号173处的A至T核苷酸替换；SNP20，其包含SEQ IDNO：6 中位置号221处的G至A核苷酸替换；SNP22，其包含SEQ ID NO：7 中位置号160处的T至G核苷酸替换；以及SNP24，其包含SEQ ID NO： 8中位置号325处的G至A核苷酸替换.

2.根据权利要求1所述的甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的莱鲍迪苷D含量为干重的0.6％至3.3％.

3.根据权利要求1所述的甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的莱鲍迪苷M含量为干重的0.5％至1.15％.

4.根据权利要求1所述的甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的莱鲍迪苷D含量为干重的0.6％至3.3％，且莱鲍迪苷M含量为干重的0.5％至1.15％。

5.甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的莱鲍迪苷D/总甜菊糖苷百分比按干重计为8％至38％，且莱鲍迪苷M/总甜菊糖苷百分比按干重计为 0％至14％，并且其中所述甜菊植物还包含3种纯合形式的SNP，其中所述SNP包括：SNP17，其包含SEQ ID NO：4中位置号129处的A至C 核苷酸替换；SNP19，其包含SEQ ID NO：5中位置号173处的A至T 核苷酸替换；以及SNP20，其包含SEQ ID NO：6中位置号221处的G 至A核苷酸替换.

6.根据权利要求5所述的甜菊植物，其中所述莱鲍迪苷D/总甜菊糖苷百分比为8％至17％，并且其中所述莱鲍迪苷M/总甜菊糖苷百分比为 0％至4％。

7.根据权利要求5所述的甜菊植物，其中所述莱鲍迪苷D/总甜菊糖苷百分比为17.1％至27％，并且其中所述莱鲍迪苷M/总甜菊糖苷百分比为4.1％至8％。

8.根据权利要求5所述的甜菊植物，其中所述莱鲍迪苷D/总甜菊糖苷百分比为27.1％至38％，并且其中所述莱鲍迪苷M/总甜菊糖苷百分比为8.1％至14％.

9.用于生产甜菊植物的方法，其包括：

(a)针对以下SNP中的至少一种筛选甜菊植物群体：SNP2，其包含 SEQ ID NO：1中位置号225处的G至C核苷酸替换；SNP10，其包含 SEQ ID NO：2中位置号187处的G至A核苷酸替换；SNP12，其包含 SEQ ID NO：3中位置号345处的C至T核苷酸替换；SNP17，其包含 SEQID NO：4中位置号129处的A至C核苷酸替换；SNP19，其包含 SEQ ID NO：5中位置号173处的A至T核苷酸替换；SNP20，其包含 SEQ ID NO：6中位置号221处的G至A核苷酸替换；SNP22，其包含 SEQ ID NO：7中位置号160处的T至G核苷酸替换；以及SNP24，其包含SEQ ID NO：8中位置号325处的G至A核苷酸替换；

(b)选择具有至少一种所述SNP的第一甜菊植物；

(c)将具有至少一种所述SNP的所述第一选择的甜菊植物与具有至少一种所述SNP的第二甜菊植物杂交；

(d)重复步骤(b)和(c)以获得所有所述SNP均为纯合的甜菊植物；以及

(e)筛选所有所述SNP均为纯合的所述甜菊植物以确认所有所述SNP以纯合形式存在以产生甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶具有高莱鲍迪苷D含量、高莱鲍迪苷M含量或者高莱鲍迪苷D和高莱鲍迪苷M 含量。

10.通过权利要求9所述的方法生产的甜菊植物，其中叶的所述莱鲍迪苷D含量为至少0.6％。

11.通过权利要求9所述的方法生产的甜菊植物，其中叶的所述莱鲍迪苷M含量为至少0.5％.

12.通过权利要求9所述的方法生产的甜菊植物，其中叶的所述莱鲍迪苷D含量为至少0.6％，并且其中所述叶的莱鲍迪苷M含量为至少 0.5％.

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述筛选包括PCR反应，随后是DNA测序，其中所述PCR反应使用以下引物序列中的至少一种： SEQ ID NO：117、SEQ、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO： 120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ IDNO： 124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO： 128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO： 132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO： 136、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138.

14.根据权利要求1所述的甜菊植物，其还包含UDP-葡糖基转移酶 76G1(UGT76G1)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：19-23，以及UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：24-54，并且其中所述甜菊植物具有高的莱鲍迪苷D 含量。

15.根据权利要求1所述的甜菊植物，其还包含UDP-葡糖基转移酶 76G1(UGT76G1)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：9-13，以及UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：86-116，并且其中所述甜菊植物具有高的莱鲍迪苷 M含量.

16.根据权利要求1所述的甜菊植物，其还包含UDP-葡糖基转移酶 76G1(UGT76G1)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：14-18，以及UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)的同种型，其中所述同种型对应于SEQ ID NO：55-85，并且其中所述甜菊植物具有高的莱鲍迪苷M 含量.

17.根据权利要求15所述的甜菊植物，其中所述甜菊植物还包含高莱鲍迪苷D含量.

18.根据权利要求16所述的甜菊植物，其中所述甜菊植物还包含高莱鲍迪苷D含量。

19.生产商品植物产品的方法，其包括获得权利要求1所述的植物或其一部分，以及由所述植物或其一部分生产所述商品植物产品，其中所述商品植物产品是糖苷组合物。

Claims

1.对应于SEQ ID NO：19-23的UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1)同种型，以及对应于SEQ ID NO：24-54的UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)同种型，其中表达所述UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1)同种型和所述UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)同种型的甜菊植物具有高的莱鲍迪苷D含量。

2.对应于SEQ ID NO：9-13的UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1)同种型，以及对应于SEQID NO：86-116的UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)同种型，其中表达所述UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1)同种型和所述UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)同种型的甜菊植物具有高的莱鲍迪苷M含量。

3.对应于SEQ ID NO：14-18的UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1)同种型，以及对应于SEQ ID NO：55-85的UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)同种型，其中表达所述UDP-葡糖基转移酶76G1(UGT76G1)同种型和所述UDP-葡糖基转移酶91D2(UGT91D2)同种型的甜菊植物具有高的莱鲍迪苷M含量。

4.根据权利要求2所述的同种型，其中所述甜菊植物还包含高莱鲍迪苷D含量。

5.根据权利要求3所述的同种型，其中所述甜菊植物还包含高莱鲍迪苷D含量。

6.预测具有高莱鲍迪苷A含量的甜菊植物的方法，所述方法包括鉴定和检测选自以下的一种或更多种SNP：SEQ ID NO：1中的SNP2、SEQ ID NO：2中的SNP10、SEQ ID NO：3中的SNP12、SEQ ID NO：4中的SNP17、SEQ ID NO：5中的SNP19、SEQ ID NO：6中的SNP20、SEQ IDNO：7中的SNP22和SEQ ID NO：8中的SNP24。