DE69814629T2

DE69814629T2 - Verfahren und verbindungen zur analysierung von nukleinsaeuren durch massenspektrometrie

Info

Publication number: DE69814629T2
Application number: DE69814629T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Van Ness; C. John TABONE; Jeffry Howbert; T. John MULLIGAN
Original assignee: Qiagen Genomics Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2018-07-23
Also published as: EP0990047B1; EP0990047A2; PT990047E; NZ501919A; CA2297158C; AU8576598A; WO1999005319A9; WO1999005319A3; JP2009159985A; JP2001511359A; ATE240408T1; WO1999005319A2; JP4414086B2; DK0990047T3; CN1270598A; CA2297158A1; DE69814629D1; JP4870791B2; AU738237B2; ES2200355T3

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Zusammensetzungen zum Analysieren von Nukleinsäuremolekülen und, genauer gesagt, Markierungen, die in einer breiten Vielfalt von Nukleinsäurereaktionen eingesetzt werden können, bei denen die Abtrennung von Nukleinsäuremolekülen auf der Grundlage ihrer Größe erforderlich ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nachweis und Analyse von Nukleinsäuremolekülen sind mit die wichtigsten Techniken in der Biologie. Solche Techniken sind wesentlich in der Molekularbiologie und spielen eine sich schnell erweiternde Rolle im Rest der Biologie.
Im allgemeinen umfaßt eine Art von Analyse von Nukleinsäurereaktionen die Abtrennung von Nukleinsäuremolekülen auf der Grundlage ihrer Länge. Zum Beispiel ist eine im breiten Umfang verwendete Technik, die Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe U.S.-Patente Nrn. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159), eine im breiten Umfang eingesetzte Technik geworden, um sowohl in einer Probe vorliegende Sequenzen zu identifizieren als auch DNA-Moleküle für weitere Manipulation zu synthetisieren.
Kurz gesagt, werden bei der PCR DNA-Sequenzen durch eine enzymatische Reaktion amplifiziert, die neue DNA-Stränge in entweder einer geometrischen oder linearen Art und Weise synthetisiert. Im Anschluß an die Amplifikation müssen die DNA-Sequenzen nachgewiesen und identifiziert werden. Wegen nicht-spezifischer Amplifikationen, die ansonsten die Analyse durcheinanderbringen würden, oder einer Reinheitsanforderung werden die PCR-Reaktionsprodukte im allgemeinen vor dem Nachweis einer Trennung unterzogen. Die Trennung auf der Grundlage der Größe (d. h. Länge) der Produkte liefert die nützlichste Information. Das Verfahren, das die höchste Auflösung von Nukleinsäuremolekülen ergibt, ist die elektrophoretische Trennung. Bei diesem Verfahren wird jede einzelne PCR-Reaktion auf ein geeignetes Gel aufgebracht und einem Spannungspotential ausgesetzt. Die Anzahl von Proben, die verarbeitet werden können, ist durch die Anzahl von Näpfen im Gel beschränkt. Auf den meisten Gelvorrichtungen können ungefähr 10 bis 64 Proben in einem einzigen Gel getrennt werden. Somit ist die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben sowohl arbeits- als auch materialintensiv.
Elektrophoretische Trennung muß mit irgendeinem Nachweissystem gekoppelt werden, um Daten zu erhalten. Nachweissysteme für Nukleinsäuren verwenden im allgemeinen, und fast ausschließlich, einen Einlagerungsfarbstoff oder eine radioaktive Markierung und weniger häufig eine nicht-radioaktive Markierung. Einlagerungsfarbstoffe, wie etwa Ethidiumbromid, sind einfach zu verwenden. Der Farbstoff wird während der Elektrophorese in die Gelmatrix einbezogen oder das Gel wird, im Anschluß an die Elektrophorese, in einer farbstoffhaltigen Lösung getränkt. Der Farbstoff kann in einigen Fällen direkt sichtbar gemacht werden, wird aber häufiger, und insbesondere für Ethidiumbromid, mit Licht (z. B. UV) angeregt, um zu fluoreszieren. Trotz dieser offensichtlich einfachen Anwendung haben solche Farbstoffe einige merkbare Nachteile. Erstens sind die Farbstoffe unempfindlich und es muß eine große Menge an Nukleinsäuremolekülen vorliegen, um die Produkte sichtbar zu machen. Zweitens sind die Farbstoffe typischerweise mutagen oder karzinogen.
Eine empfindlichere Nachweistechnik als Farbstoffe verwendet eine radioaktive (oder nicht-radioaktive) Markierung. Typischerweise wird entweder ein radioaktiv markiertes Nukleotid oder ein radioaktiv markierter Primer in die PCR-Reaktion einbezogen. Im Anschluß an die Trennung wird die radioaktive Markierung durch Autoradiographie "sichtbar gemacht". Obgleich empfindlicher leidet der Nachweis an Filmbeschränkungen, wie etwa Abweichung vom Reziprozitätsgesetz und Nicht-Linearität. Diese Beschränkungen können überwunden werden, indem die Markierung durch Phosphorbildanalyse nachgewiesen wird. Radioaktive Markierungen haben jedoch hohe Anforderungen an die Sicherheit, was die Ausnutzung von Resourcen erhöht und spezialisierte Ausrüstung und Personaltraining erfordert. Aus solchen Gründen hat die Verwendung von nicht-radioaktiven Markierungen zunehmend an Popularität gewonnen. In solchen Systemen enthalten Nukleotide eine Markierung, wie etwa ein Fluorphor, Biotin oder Digoxin, die durch einen Antikörper oder ein anderes Molekül (z. B. anderes Teil eines Ligandenpaares) nachgewiesen werden kann, der (das) mit einem Enzym markiert ist, das mit einem chromogenen Substrat reaktiv ist. Diese Systeme haben nicht die Sicherheitsbedenken, wie oben beschrieben, verwenden aber Komponenten, die oft labil sind und nicht-spezifische Reaktionen liefern können, was zu einem hohen Hintergrund führt (d. h. niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis).
US-A-5118605 betrifft Verfahren zum Testen eines Nukleinsäureanalyten. WO-A-9504160 betrifft ein Markierungsreagenz und ein Testverfahren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Kurz gesagt stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Verfügung, die in einer breiten Vielfalt von Ligandenpaarreaktionen eingesetzt werden können, bei denen die Trennung von interessierenden Molekülen, wie etwa Nukleinsäuremolekülen; auf der Grundlage ihrer Größe erforderlich ist. Repräsentative Beispiele für Verfahren, die mit dem Hintergrund der hierin zur Verfügung gestellten Offenbarung verbessert werden können, schließen PCR, Differential Display, RNA-Fingerprinting, PCR-SSCP, Oligo-Ligationsassays, Nukleaseverdauungsverfahren (z. B. Assays auf der Basis von Exo- und Endonuklease) und Didesoxy-Fingerprinting ein. Die hierin beschriebenen Verfahren können in einem weiten Bereich von Feldern eingesetzt werden, einschließlich z. B. bei der Entwicklung von Diagnostika für klinische Anwendung oder Forschung, der Bestimmung von Polymorphismen und der Entwicklung genetischer Karten.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel: T^ms-L-X'
Zur Verfügung gestellt, worin T^ms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, umfassend Kohlenstoff, mindestens eines von Wasserstoff und Fluor, und gegebenenfalls Atome, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Jod;
L ist eine organische Gruppe, die es einer einmaligen T^ms-enthaltenden Gruppe ermöglicht, von dem Rest der Verbindung abgespalten zu werden, wobei die T^ms-enthaltende Gruppe eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterzogen wird, und die tertiäres Amin, quaternäres Amin oder organische Säure ist; und
X ist eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Phosphoramidit und H-Phosphonat.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Single Nukleotide Polymorphismus in einem Nukleinsäureziel zur Verfügung, umfassend:

a) Amplifizieren einer Sequenz eines Nukleinsäureziels, das einen Single Nukleotide Polymorphismus enthält;
b) Erzeugen einer Einzelstrangform des Ziels;
c) Kombinieren einer markierten Nukleinsäuresonde, die die Struktur T^ms-L-X' aufweist mit den amplifizierten Zielnukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Hybridisierung der markierten Nukleinsäuresonde an komplementäre amplifizierte ausgewählte Zielnukleinsäuremoleküle zu ermöglichen, wobei die Markierung mit einem bestimmten Single Nukleotide Polymorphismus korrelierbar ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist;
d) Abtrennen von nicht hybridisierter markierter Probe von hybridisierter markierter Probe durch eine Größenbestimmungs-Methodologie;
e) Abspalten des Markers von der Sonde; und
f) Nachweisen des Markers durch Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Anwesenheit des Single Nukleotide Polymorphismus.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Single Nukleotide Polymorphismus in einem Nukleinsäureziel zur Verfügung, umfassend:

a) Amplifizieren einer Sequenz eines Nukleinsäureziels, das einen Single Nukleotide Polymorphismus enthält;
b) Kombinieren eines markierten Nukleinsäureprimers, der die Struktur T^ms-L-X' aufweist, mit den amplifizierten Zielnukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um ein Annealing des markierten Nukleinsäureprimers an komplementäre amplifizierte ausgewählte Zielnukleinsäuremoleküle zu ermöglichen, wobei der Oligonukleotidprimer eine zu der Wildtyp-Sequenz oder dem Single Nukleotide Polymorphismus komplementäre äußerst 3'-liegende Base aufweist, wobei der Marker mit einem bestimmten Single Nukleotide Polymorphismus korrelierbar ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist;
c) Verlängern des Primers, wobei ein zu dem Ziel komplementärer Strang synthetisiert wird, wenn die am weitesten 3'-liegende Base des Primers mit dem Ziel komplementär ist;
d) Abtrennen von nicht verlängertem markierten Primer von verlängertem markierten Primer durch eine Größenbestimmungs-Methodologie;
e) Abspalten des Markers von den Primern oder verlängerten Primern; und
f) Nachweisen des Markers durch Spektrometrie oder Potentiometrie, und daraus Bestimmen daraus der Anwesenheit des Single Nukleotide Polymorphismus.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Menge eines spezifischen mRNA-Moleküls in einer Nukleinsäurepopulation zur Verfügung, umfassend:

a) Überführen einer RNA-Population in eine cDNA-Population;
b) Hinzufügen einer einzelsträngigen Nukleinsäure (interner Standard), die eine Vielzahl von Single Nukleotide Polymorphismen enthält, die ansonsten identisch zu dem cDNA-Ziel ist;
c) Amplifizieren einer spezifischen Sequenz des cDNA-Ziels;
d) Coamplifizieren des internen Standards, wobei der interne Standard dieselbe Länge aufweist, wie das cDNA-Amplicon;
e) Erzeugen einer einzelsträngigen Form des Ziels;
f) Kombinieren eines Sets von markierten Nukleinsäuresonden, die die Struktur T^ms-L-X' aufweisen, mit der amplifizierten Ziel-cDNA und dem amplifizierten internen Standard unter Bedingungen für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Hybridisierung der markierten Nukleinsäuresonde an komplementäre ausgewählte Ziel-cDNA und interne Standardsequenzen zu erlauben, wobei der Marker mit einer bestimmten cDNA-Sequenz korrelierbar ist und ein zweiter Marker ist mit dem internen Standard korrelierbar, und ist durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar;
g) Abtrennen von nicht hybridisierter markierter Sonde von hybridisierter markierter Sonde durch eine Größenbestimmungs-Methodologie;
h) Abspalten des Markers von den Sonden;
i) Nachweisen der Marker durch Spektrometrie oder Potentiometrie; und
j) Nehmen des Verhältnisses von Marker, der zu cDNA korreliert ist, gegenüber Marker, der mit dem internen Standard korreliert ist und daraus bestimmen der Menge der cDNA, wodurch die Menge der spezifischen mRNA in einer Nukleinsäurepopulation bestimmt wird.

In den oben genannten Verfahren weist die markierte Nukleinsäure die Struktur T^ms-L-X' auf, wobei X' die Nukleinsäure ist und T^ms und L wie oben definiert sind.
Innerhalb eines Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen von (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem oder mehreren ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekülen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Nukleinsäurefragment korrelativ und durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Größe, (c) Abspalten der Markierungen von den markierten Fragmenten und (d) Nachweisen der Markierungen durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Identität der Nukleinsäuremoleküle daraus.
In einem verwandten Aspekt der Erfindung werden Verfahren zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren markierter Nukleinsäuresonden mit Target-Nukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung einer markierten Nukleinsäuresonde an eine komplementäre ausgewählte Target-Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen, wobei eine markierte Nukleinsäuresonde durch Nicht-Fluoreszenzspektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Verändern der Größe hybridisierter markierter Sonden, nicht-hybridisierter Sonden oder Target-Moleküle oder der Sonden:Target-Hybride, (c) Abtrennen der markierten Sonden nach Größe, (d) Abspalten der Markierungen von den markierten Sonden und (e) Nachweisen der Markierungen durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Nachweisen des ausgewählten Nukleinsäuremoleküls daraus.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem ausgewählten Target-Molekül, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Moleküle nach Sequenzlänge, (c) Abspalten der Markierung vom markierten Molekül und (d) Nachweisen der Markierung durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.
In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren eines markierten Nukleinsäuremoleküls mit einem ausgewählten Target-Molekül unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung des markierten Moleküls an das Target-Molekül zu ermöglichen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge, (c) Abspalten der Markierung vom markierten Fragment und (d) Nachweisen der Markierung durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung sollte "biologische Proben" so verstanden werden, daß diese nicht nur Proben einschließen, die von lebenden Organismen erhalten werden (z. B. Säugern, Fischen, Bakterien, Parasiten, Viren, Pilzen und dergleichen) oder aus der Umwelt (z. B. Luft, Wasser oder Feststoffproben), sondern auch biologische Materialien, die künstlich oder synthetisch hergestellt sein können (z. B. Phagenbibliotheken, Bibliotheken organischer Moleküle, Pools genomischer Klone, cDNA-Klone, RNA-Klone oder dergleichen). Repräsentative Beispiele für biologische Proben schließen biologische Flüssigkeiten (z. B. Blut, Samen, Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Urin), biologische Zellen (z. B. Stammzellen, B- oder T-Zellen, Leberzellen, Fibroblasten oder dergleichen) und biologische Gewebe ein. Schließlich schließen repräsentative Beispiele für Organismen, die genotypisiert werden können, praktisch jeden einzelligen oder mehrzelligen Organismus ein, wie etwa Warmblüter, Säuger oder Wirbeltiere (z. B. Menschen, Schimpansen, Makaken, Pferde, Kühe, Schweine, Schafe, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse sowie Zellen von irgendeinem dieser), Bakterien, Parasiten, Viren, Pilze und Pflanzen.
In verschiedenen Ausführungsformen der oben beschriebenen Verfahren können die Nukleinsäuresonden und/oder -moleküle der vorliegenden Erfindung durch z. B. einen Ligations-, Spaltungs- oder Extensions(z. B: PCR)-Reaktion erzeugt werden. In weiteren verwandten Aspekten können die Nukleinsäuresonden oder -moleküle mit nicht-3'-markierten Oligonukleotid-Primern (z. B. 5'-markierten Oligonukleotid-Primern) oder Didesoxynukleotidterminatoren markiert sein.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450 oder mehr als 500 unterschiedliche und einzigartig markierte Moleküle in einer gegebenen Reaktion gleichzeitig eingesetzt werden, wobei jede Markierung für ein ausgewähltes Nukleinsäuremolekül oder -fragment, oder -sonde, einzigartig ist und separat identifiziert werden kann.
Die Markierungen) werden durch Massenspektrometrie nachgewiesen. Repräsentative Beispiele für schließen time-of-flight-Massenspektrometrie, Quadrapol-Massenspektrometrie, Magnetsektor-Massenspektrometrie und Elektrosektor-Massenspektrometrie ein. Spezifische Ausführungsformen solcher Techniken schließen Ionenfallen-Massenspektrometrie, Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie, Ionenspray-Massenspektrometrie, Flüssigionisations-Massenspektrometrie, Atmosphärendruckioni-sations-Massenspektrometrie, Elektronenionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Beschuß mit schnellen Atomen, MALDI-Massenspektrometrie, Photoionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie, Laser-Tröpfchen-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-Massenspektrometrie, APCI-Massenspektrometrie, Nanospray-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation zerstäubten Sprays, Massenspektrometrie mit chemischer Ionisation, Resonanzionisations-Massenspektrometrie, Sekundärionisations-Massenspektrometrie und Thermospray-Massenspektrometrie ein.
In noch weiteren Ausführungsformen der Erfindung können die Target-Moleküle, hybridisierten markierten Sonden, nicht-hybridisierten Sonden oder Target-Moleküle, Sonden:Target-Hybride oder markierten Nukleinsäuresonden oder -moleküle von anderen Molekülen unter Verwendung von Verfahren abgetrennt werden, die zwischen der Größe von Molekülen unterscheiden (entweder tatsächliche lineare Größe oder dreidimensionale Größe). Repräsentative Beispiele solcher Verfahren schließen Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Mikrokanalelektrophorese, HPLC, Ausschlußchromatographie, Filtration, Polyacrylamidgelelektrophorese, Flüssigchromatographie, Umkehrausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenflüssigchromatographie, Pulsfeldelektrophorese, Feldinversionselektrophorese, Dialyse und Fluoreszenz-aktivierte Flüssigtröpfchensortierung. Alternativ können die Target-Moleküle, hybridisierten markierten Sonden, nicht-hybridisierten Sonden oder Target-Moleküle, Sonden:Target-Hybride oder markierten Nukleinsäuresonden oder -moleküle an einen festen Träger (z. B. Hohlfasern (Amicon Corporation, Danvers, Mass.), Perlen (Polysciences, Warrington, Pa.), Magnetperlen (Robbin Scientific, Mountain View, Calif.), Platten, Schalen und Kolben (Corning Glass Works, Corning, N.Y.), Maschengitter (Becton Dickinson, Mountain View, Calif.), Siebe und feste Fasern (siehe Edelman et al., U.S.-Patent Nr. 3,843,324; siehe auch Kuroda et al., U.S.-Patent Nr. 4,416,777), Membranen (Millipore Corp., Bedford, Mass.) und Tauschstäbchen) gebunden sein. Wenn das erste oder zweite Teil oder freiliegende Nukleinsäuren an einen festen Träger sind, können die hierin offenbarten Verfahren in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung außerdem den Schritt umfassen, daß nicht-gebundenes Material vom Träger abgewaschen wird.
In weiteren Ausführungsformen können die markierten Nukleinsäuremoleküle oder -sonden mit solchen Verfahren gespalten werden, wie chemischen, Oxidations-, Reduktions-, säurelabilen, basenlabilen, enzymatischen, elektrochemischen, wärme- und photolabilen Verfahren. In weiteren Ausführungsformen können die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen in einer kontinuierlichen Art und Weise durchgeführt werden, z. B. auf einer einzigen Vorrichtung, die automatisiert sein kann.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die Größe der hybridisierten markierten Sonden, nicht-hybridisierten Sonden oder Targetmoleküle oder Sonden:Target-Hybride mit einem Verfahren verändert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Polymerase-Extension, Ligation, Exonuklease-Verdau, Endonuklease-Verdau, Restriktionsenzym-Verdau, ortsspezifischem Rekombinase-Verdau, Ligation, Mismatch-Verdau mit spezifischer Nuklease, Methylierungs-spezifischer Nuklease-Verdau, kovalente Bindung von Sonde an Target und Hybridisierung besteht.
Die Verfahren und Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, können in einer breiten Vielfalt von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich z. B. Identifizieren von PCR-Amplikons, RNA-Fingerprinting, Differentialdisplay, Einzelstrangkonformationspolymorphismusnachweis, Didesoxy-Fingerprinting, Restriktionskarten- und Restriktionsfragment längenpolymorphismen, DNA-Fingerprinting, Genotypisierung, Mutationsnachweis, Oligonukleotidligationsassay, Sequenz-spezifische Amplifikationen, für Diagnose, Forensik, Identifikation, Entwicklungsbiologie, Biologie, Molekularmedizin, Toxikologie, Tierzüchtung.
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese von Pentafluorphenylestern chemisch spaltbarer Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäureamid-Endgruppen freizusetzen.
2 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese von Pentafluorphenylestern chemisch spaltbarer Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäure-Endgruppen freizusetzen.
3-6 und 8 zeigen das Flußdiagramm für die Synthese von Tetrafluorphenylestern eines Satzes von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen.
7 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese eines Satzes von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen mit Amin-Endgruppen.
9 zeigt die Synthese von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopie-markierten Oligonukleotiden, hergestellt aus dem entsprechenden Satz von 36 Tetrafluorphenylestern photochemisch spaltbarer Massenspektroskopiemarkierungssäuren.
10 zeigt die Synthese von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopie-markierten Oligonukleotiden, hergestellt aus dem entsprechenden Satz von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen mit Amin-Endgruppen.
11 veranschaulicht den gleichzeitigen Nachweis von mehreren Markierungen durch Massenspektrometrie.
12 zeigt das Massenspektrogramm der Alpha-Cyano-Matrix allein.
13 zeigt ein modular konstruiertes markiertes Nukleinsäurefragment.
14A–14I zeigen die Abtrennung von DNA-Fragmenten durch HPLC unter der Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Pufferlösungen.
15 zeigt eine schematische Darstellung von genetischem Fingerprinting- und Differential-Display-Systemen in Übereinstimmung mit einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
16 zeigt eine schematische Darstellung von genetischem Fingerprinting- und Differential-Display-Systemen in Übereinstimmung mit einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
17 zeigt eine schematische Darstellung von Testsystemen in Übereinstimmung mit einer exemplarischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
18 ist eine schematische Darstellung von Assay-Systemen in Übereinstimmung mit einer exemplarischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
19A und 19B zeigen die Herstellung eines abspaltbaren Markers der vorliegenden Erfindung.
20A und 20B illustrieren die Herstellung eines abspaltbaren Markers der vorliegenden Erfindung.
21 zeigt die Herstellung einer intermediären Verbindung; die bei der Herstellung eines spaltbaren Markers der Erfindung brauchbar ist.
22A, 22B und 22C zeigen die Synthese-Methodologie für die Herstellung eines photo-abspaltbaren Massenspektrometrie-nachweisbaren Markers gemäß der vorliegenden Erfindung.
23 zeigt die Ergebnisse aus einem Assay, der die Genexpression mit CMST-markierten ODNs verfolgte.
24-28 zeigen Phosphoramidit-Chemie, die in einem Beispiel hier vollständiger beschrieben wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung, bei denen die Trennung von Nukleinsäuremolekülen auf der Grundlage ihrer Größe erforderlich ist. Die vorliegenden Verfahren ermöglichen den gleichzeitigen Nachweis von interessierenden Molekülen, die Nukleinsäuren und Fragmente, Proteine, Peptide, usw. einschließen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von Markern für genomische Messungen zur Verfügung, die eine Assay-Plattform zur Verfügung stellen, die mit dem Ausmaß von Messungen kompatibel ist, die für die Analyse von komplexen Genomen erforderlich ist. Diese neue Markertechnologie ist aus Massenspektrometrie, Markern, die mit einem Standard-Quadrapol-Massenspektrometerdetektor (MSD) unter der Verwendung von atmosphärischem Druck chemischer Ionisierung (positiver Modus) nachgewiesen werden, zusammengesetzt. Die Technologieplattform verwendet einen MSD zum Nachweis der bekannten Molekulargewichts-Massenspektrometermarkern, ganz ähnlich einem Dioden-Array-Detektor. Die Macker können durch kombinatorische Chemie-Ansätze unter der Verwendung eines primären Gerüsts synthetisiert werden, auf das spezifische Masse-Einsteller angefügt sind. Die Marker sind so aufgebaut, um reversibel an Oligonukleotide angebracht zu sein, die entweder als Primer im PCR-Ansatz verwendet werden können oder als Sonden in Hybridisierungsassays verwendet werden. Bei der Vervollständigung jeder Zahl von Assay-Schritten wird der Marker/die Sonde oder Marker/Primer einer Abspaltungsreaktion unterzogen, bevorzugterweise Photoabspaltung, und wenn die Marker-Massenspektrometrie-nachweisbar sind, werden die Macker durch APCI ionisiert und die Massenidentität des Markers wird durch Massenspektrometrie nachgewiesen. Die Macker können dazu verwendet werden, um die Identität einer Sequenz und die Probenidentifizierung zu kartieren.
Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt Verbindungen zur Verfügung, bei denen ein interessierendes Molekül, oder eine Vorstufe dazu, über eine labile Bindung (oder labile Bindungen) an eine Markierung gebunden ist. So können Verbindungen der Erfindung so betrachtet werden, daß sie die allgemeine Formel: T^ms-L-X
Aufweisen, in der T die Markierungskomponente ist, L die Linkerkomponente ist, die entweder eine labile Bindung ist oder enthält, und X entweder die Komponente "Interessierendes Molekül" (MOI) oder eine Komponente mit einer funktionellen Gruppe (L_h), durch die das MOI mit T-L verknüpft werden kann, ist. Verbindungen der Erfindung können daher durch die spezifischeren allgemeinen Formeln dargestellt werden: T-L-MOI und T-L-L_h
Aus unten genauer beschriebenen Gründen können Sätze von T-L-MOI-Verbindungen gezielt Bedingungen unterworfen werden, die bewirken, daß die labile(n) Bindungen) bricht (brechen), wodurch eine Markierungseinheit vom Rest der Verbindung freigesetzt wird. Die Markierungseinheit wird dann durch eine oder mehrere analytische Techniken charakterisiert, um dadurch direkte Information über die Struktur der Markierungseinheit zu liefern und (am wichtigsten) indirekte Information über die Identität des entsprechenden MOI.
Als ein einfaches veranschaulichendes Beispiel für eine repräsentative Verbindung der Erfindung, bei der L eine direkte Bindung ist, wird Bezug genommen auf die folgende Struktur (i):
In Struktur (i) ist T eine stickstoffhaltige polycyclische aromatische Einheit, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist, X ist ein MOI (und spezifisch ein Nukleinsäurefragment, das in einer Amingruppe endet) und L ist die Bindung, die eine Amidgruppe bildet. Die Amidbindung ist relativ zu den Bindungen in T labil, weil eine Amidbindung, wie im Stand der Technik anerkannt, durch saure oder basische Bedingungen chemisch gespalten (gebrochen) werden kann, die die Bindungen in der Markierungskomponente unverändert lassen. So kann eine Markierungseinheit (d. h. das Spaltprodukt, das T enthält) freigesetzt werden, wie unten dargestellt:
Der Linker L kann jedoch mehr sein als lediglich eine direkte Bindung, wie in dem folgenden veranschaulichenden Beispiel gezeigt, in dem Bezug genommen wird auf eine weitere repräsentative Verbindung der Erfindung der unten dargestellten Struktur (ii):
Es ist gut bekannt, daß Verbindungen mit einer ortho-Nitrobenzylamin-Einheit (siehe eingerahmte Atome in Struktur (ii)) photolytisch insofern instabil sind, als die Einwirkung aktinischer Strahlung einer spezifizierten Wellenlänge auf solche Verbindungen eine selektive Spaltung der Benzylamin-Bindung (siehe Bindung, die in Struktur (ii) mit einer dicken Linie bezeichnet ist) bewirkt. So hat Struktur (ii) dieselben T- und MOI-Gruppen wie Struktur (i) die Linker-Gruppe enthält jedoch mehrere Atome und Bindungen, innerhalb derer sich eine besonders labile Bindung befindet. Photoyse von Struktur (ii) setzt somit eine Markierungseinheit (T-enthaltende Einheit) vom Rest der Verbindung frei, wie unten dargestellt.
Die Erfindung stellt somit Verbindungen zur Verfügung, die, bei Einwirkung geeigneter Spaltungsbedingungen, eine Spaltungsreaktion durchlaufen, so daß eine Markierungseinheit vom Rest der Verbindung freigesetzt wird. Verbindungen der Erfindung können als die Markierungseinheit, das MOI (oder eine Vorstufe dazu, L_h) und die labile(n) Bindung(en), die die zwei Gruppen miteinander verbindet (verbinden), beschrieben werden. Alternativ können die Verbindungen der Erfindung als die Komponenten beschrieben werden, aus denen sie gebildet sind. So können die Verbindungen wie folgt als das Reaktionsprodukt eines Markierungs-Reaktanten, eines Linker-Reaktanten und eines MOI-Reaktanten beschrieben werden.
Der Markierungs-Reaktant besteht aus einem chemischen Griff (T_h) und einer variablen Komponente (T_vc), so daß der Markierungs-Reaktant so betrachtet wird, daß er die allgemeine Struktur hat: T_vc-T_h
Um diese Nomenklatur zu veranschaulichen, kann Bezug genommen werden auf Struktur (iii), die einen Markieiungs-Reaktanten zeigt, der verwendet werden kann, um die Verbindung von Struktur (ii) herzustellen. Der Markierungs-Reaktant mit Struktur (iii) enthält eine variable Markierungskomponente und einen Markierungsgriff, wie unten dargestellt:
In Struktur (iii) liefert der Markierungsgriff (-C(=O)-A) nur einen Weg für die Reaktion des Markierungs-Reaktanten mit dem Linker-Reaktanten, um eine T-L-Einheit zu bilden. Die Gruppe "A" in Struktur (iii) zeigt, daß die Carboxylgruppe sich in einem chemisch aktiven Zustand befindet, so daß sie für Kopplung mit anderen Griffen bereitsteht. "A" kann z. B. eine Hydroxylgruppe oder Pentafluorphenoxy sein, unter vielen anderen Möglichkeiten. Die Erfindung liefert eine große Anzahl möglicher Markierungsgriffe, die an eine variable Markierungskomponente gebunden werden können, wie im Detail unten diskutiert. Die variable Markierungskomponente ist somit ein Teil von "T" in der Formel T-L-X und wird auch Teil der Markierungseinheit sein, die sich aus der Reaktion bildet, die L spaltet.
Wie ebenfalls unten genauer diskutiert, wird die variable Markierungskomponente so genannt, weil es bei der Herstellung von Sätzen von Verbindungen gemäß der Erfindung erwünscht ist, daß Mitglieder eines Satzes einzigartige variable Komponenten aufweisen, so daß die einzelnen Mitglieder voneinander mit einer analytischen Technik unterschieden werden können. Als ein Beispiel kann die variable Markierungskomponente von Struktur (iii) Mitglied des folgenden Satzes sein, in dem die Mitglieder des Satzes durch ihre UV- oder Massenspektren unterschieden werden können:
In ähnlicher Weise kann der Linker-Reaktant anhand seiner chemischen Griffe (es gibt notwendigerweise wenigstens zwei, von denen jeder als L_h bezeichnet werden kann), beschrieben werden, die eine labile Linkerkomponente flankieren, wobei die labile Linkerkomponente aus der erforderlichen labilen Einheit (L²) und fakultativen labilen Einheiten (L¹ und L³) besteht, wobei die fakultativen labilen Einheiten effektiv dazu dienen, L² von den Griffen L_h zu trennen, und die erforderliche labile Einheit dazu dient, eine labile Bindung innerhalb der labilen Linkerkomponente bereitzustellen. So kann der Linker-Reaktant so betrachtet werden, daß er die allgemeine Formel hat: L_h-L¹-L²-L³-L_h
Die Nomenklatur, die verwendet wird, um den Linker-Reaktanten zu beschreiben, kann im Hinblick auf Struktur (iv) veranschaulicht werden, die sich wieder von der Verbindung von Struktur (ii) ableitet:
Wie Struktur (iv) veranschaulicht, können Atome in mehr als eine funktionelle Rolle erfüllen. So dient, in Struktur (iv), der Benzylstickstoff als ein chemischer Griff, um zu ermöglichen, daß der Linker-Reaktant sich an den Markierungs-Reaktanten über eine Amidbildungsreaktion bindet, und dient anschließend auch insofern als ein notwendiger Teil der Struktur der labilen Einheit L², als die Benzyl-Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung besonders anfällig ist für photolytische Spaltung. Struktur (iv) veranschaulicht auch, daß ein Linker-Reaktant eine L³-Gruppe aufweisen kann (in diesem Fall eine Methylengruppe), obgleich er keine L¹-Gruppe hat. In ähnlicher Weise können Linker-Reaktanten eine L¹-Gruppe aufweisen, aber keine L³-Gruppe, oder können L¹- und L³-Gruppen aufweisen oder können weder L¹- noch L³-Gruppen aufweisen. In Struktur (iv) zeigt das Vorhandensein der Gruppe "P" neben der Carbonylgruppe, daß die Carbonylgruppe vor der Reaktion geschützt ist. Bei Vorgabe dieser Konfiguration kann die aktivierte Carboxylgruppe des Markierungs-Reaktanten (iii) sauber mit der Amingruppe des Linker-Reaktanten (iv) reagieren, um eine Amidbindung zu bilden und eine Verbindung der Formel T-L-L_h, zu ergeben.
Der MOI-Reaktant ist eine in geeigneter Weise reaktive Form eines interssierenden Moleküls. Wenn das interessierende Molekül ein Nukleinsäurefragment ist, ist ein geeigneter MOI-Reaktant ein Nukleinsäurefragment, das durch seine 5'-Hydroxylgruppe an eine Phosphodiestergruppe gebunden ist und anschließend an eine Alkylen-Kette, die in einer Aminogruppe endet. Diese Aminogruppe kann dann mit der Carbonylgruppe von Struktur (iv) reagieren (natürlich nach Entfernen der Schutzgruppe der Carbonylgruppe und vorzugsweise nach anschließender Aktivierung der Carbonylgruppe für die Reaktion mit der Amingruppe), um dadurch das MOI an den Linker zu binden.
Wenn sie in einer chronologischen Reihenfolge betrachtet wird, kann die Erfindung so gesehen werden, daß sie einen Markierungs-Reaktanten (mit einem chemischen Markierungsgriff und einer variablen Markierungskomponente), einen Linker-Reaktanten (mit zwei chemischen Linkergriffen, einer erforderlichen labilen Einheit und 0–2 fakultativen labilen Einheiten) und einen MOI-Reaktanten (mit einer Komponente "Interessierendes Molekül" und einem chemischen Griff des interessierenden Moleküls) nimmt, um T-L-MOI zu bilden. So werden, um T-L-MOI zu bilden, entweder der Markierungs-Reaktant und der Linker-Reaktant zunächst miteinander umgesetzt, um T-L-L_h, zu liefern, und anschließend wird der MOI-Reaktant mit T-L-L_h umgesetzt, um T-L-MOI zu liefern, oder (weniger bevorzugt) werden der Linker-Reaktant und der MOI-Reaktant zunächst miteinander umgesetzt, um Lh-L-MOI zu liefern, und anschließend wird Lh-L-MOI mit dem Markierungs-Reaktanten umgesetzt, um T-L-MOI zu liefern. Aus Gründen der Bequemlichkeit werden Verbindungen mit der Formel T-L-MOI als der Markierungs-Reaktant, der Linker-Reaktant und der MOI-Reaktant beschrieben werden, die verwendet werden können, um solche Verbindungen zu bilden. Dieselben Verbindungen von Formel T-L-MOI könnten natürlich mit anderen (typischerweise aufwendigeren) Verfahren hergestellt werden und würden immer noch unter den Schutzumfang der erfinderischen T-L-MOI-Verbindungen fallen.
In jedem Falle sorgt die Erfindung dafür, daß eine T-L-MOI-Verbindung Spaltungsbedingungen unterworfen wird, so daß eine Markierungseinheit vom Rest der Verbindung freigesetzt wird. Die Markierungseinheit wird wenigstens die variable Markierungskomponente umfassen und wird typischerweise zusätzlich einige oder alle Atome vom Markierungsgriff, einige oder alle Atome vom Linkergriff, die verwendet wurden, um das Markierungs-Reaktant an den Linker-Reaktanten zu binden, die fakultative labile Einheit L¹, wenn diese Gruppe in T-L-MOI vorhanden war, umfassen und wird vielleicht einen Teil der erforderlichen labilert Einheit L² enthalten, in Abhängigkeit von der genauen Struktur von L² und der Natur der Spaltungschemie. Aus Gründen der Bequemlichkeit kann die Markierungseinheit als die T-enthaltende Einheit bezeichnet werden, weil T typischerweise den Hauptteil (im Hinblick auf die Masse) der Markierungseinheit ausmachen wird.
Nach dieser Einführung in einen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die verschiedenen Komponenten T, L und X im Detail beschrieben werden. Diese Beschreibung beginnt mit den folgenden Definitionen bestimmter Begriffe, die im weiteren bei der Beschreibung von T, L und X verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Nukleinsäurefragment" ein Molekül, das komplementär zu einem ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekül ist (d. h. komplementär zu dem gesamten Molekül oder einem Teil desselben) und aus der Natur gewonnen oder synthetisch oder rekombinant hergestellt werden kann, einschließlich nicht natürlich vorkommender Moleküle, und kann je nach Eignung in doppel- oder einzelsträngiger Form vorliegen; und schließt ein Oligonukleotid (z. B. DNA oder RNA), einen Primer, eine Sonde, ein Nukleinsäureanalog (z. B. PNA), ein Oligonukleotid, das in einer 5'-nach-3'-Richtung mit einer Polymerase verlängert ist, eine Nukleinsäure, die chemisch oder enzymatisch gespalten ist, eine Nukleinsäure, die mit einem Didesoxyterminator endet oder am 3'- oder 5'-Ende mit einer Verbindung abgedeckt ist, die Polymerisation am 5'- oder 3'-Ende verhindert, oder Kombinationen derselben ein. Die Komplimentarität eines Nukleinsäurefragments zu einem ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekül bedeutet im allgemeinen, daß wenigstens etwa 70% spezifische Basenpaarung über die gesamte Länge des Fragments gezeigt wird. Vorzugsweise zeigt das Nukleinsäurefragment wenigstens etwa 80% spezifische Basenpaarung; und am bevorzugtesten wenigstens etwa 90%. Assays zum Bestimmen des prozentualen Mismatch (und somit der prozentualen spezifischen Basenpaarung) sind im Stand der Technik gut bekannt und beruhen auf dem prozentualen Mismatch als einer Funktion des Tm, wenn bezogen auf eine Kontrolle mit vollständiger Basenpaarung.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Alkyl", allein oder in Kombination, auf einen gesättigten, geradekettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest, der von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 6 und bevorzugter von 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele für solche Reste schließen Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, iso-Amyl, Hexyl, Decyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Alkylen" bezieht sich auf einen gesättigten, geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffdirest, der von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 6 und bevorzugter von 1 bis 4 Kohlenstoffe enthält. Beispiele für solche einen Direst schließen Methylen, Ethylen (-CH₂-CH₂-), Propylen und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkenyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Reste schließen Ethenyl, E- und Z-Propenyl, Isopropenyl, E- und Z-Butenyl, E- und Z-Isobutenyl, E- und Z-Pentenyl, Decenyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Alkenylen" bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffdirest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Direste schließen Methyliden (=CH₂), Ethyliden (-CH=CH-), Propyliden (-CH₂-CH=CH-) und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkinyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen geradekettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Reste schließen Ethinyl (Acetylenyl), Propinyl (Propargyl), Butinyl, Hexinyl, Decinyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Alkinylen", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffdirest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Reste schließen Ethinylen (-C≡C-), Propinylen (-CH₂-C≡C-) und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Cycloalkyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf eine gesättigte cyclische Anordnung von Kohlenstoffatomen, mit einer Anzahl von 3 bis 8 und vorzugsweise von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Cycloalkylreste schließen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Cycloalkylen" bezeichnet eine Direstform eines Cycloalkyls.
Der Begriff "Cycloalkenyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen cyclischen Kohlenstoffring, der von 4 bis 8, vorzugsweise 5 oder 6, Kohlenstoffatome und eine oder mehrere Doppelbindungen enthält. Beispiele für solche Cycloalkenylreste schließen Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cyclopentadienyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Cycloalkenylen" bezieht sich auf eine Direstform eines Cycloalkenyls.
Der Begriff "Aryl" bezieht sich auf eine carbocyclische (vollständig aus Kohlenstoff und Wasserstoff bestehende) aromatische Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Phenyl, Naphthyl, Indenyl, Indanyl, Azulenyl, Fluorenyl und Anthracenyl besteht; oder eine heterocyclische aromatische Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Furyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, 2-Pyrazolinyl, Pyrazolidinyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1,3,5-Triazinyl, 1,3,5-Trithianyl, Indolizinyl, Indolyl, Isoindolyl, 3H-Indolyl, Indolinyl, Benzo[b]furanyl, 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Benzo[b]thiophenyl, 1H-Indazolyl, Benzimidazolyl, Benzthiazolyl, Purinyl, 4H-Chinolizinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, 1,8-Naphthyridinyl, Pteridinyl, Carbazolyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl und Phenoxazinyl besteht.
"Aryl"-Gruppen, wie in dieser Anmeldung definiert, können unabhängig einen bis vier Substituenten enthalten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cyano, Carboxy, Carboalkoxy, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino, Alkinylamino, aliphatischem oder aromatischem Acyl, Alkoxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, Morpholinocarbonylamino, Thiomorpholinocarbonylamino, N-Alkylguanidino, Aralkylaminosulfonyl; Aralkoxyalkyl; N-Aralkoxyharnstoff; N-Hydroxylharnstoff; N-Alkenylharnstoff; N,N-(Alkyl, Hydroxyl)harnstoff Heterocyclyl; Thioaryloxy-substituiertem Aryl; N,N-(Aryl, Alkyl)hydrazino; Ar'-substituiertem Sulfonylheterocyclyl; Aralkyl-substituiertem Heterocyclyl; Cycloalkyl- und Cycloalkenyl-substituiertem Heterocyclyl; Cycloalkyl-kondensiertem Aryl; Arlyoxy-substituiertem Alkyl; Heterocyclylamino; aliphatischem oder aromatischem Acylaminocarbonyl; aliphatischem oder aromatischem Acyl-substituiertem Alkenyl; Ar'-substituiertem Aminocarbonyloxy; Ar', Ar'-disubstituiertem Aryl; aliphatischem oder aromatischem Acyl-substituiertem Acyl; Cycloalkylcarbonylalkyl; Cycloalkyl-substituiertem Amino; Aryloxycarbonylalkyl; Phosphorodiamidylsäure oder -ester besteht.
"Ar" ist eine carbocyclische oder heterocyclische Arylgruppe, wie oben definiert, mit einem bis drei Substituenten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, 1,2-Dioxymethylen, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Alkylcarbonyloxy, aliphatischem oder aromatischem Acyl, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, N-Alkyl- oder N,N-Dialkylharnstoff besteht.
Der Begriff "Alkoxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf ein Alkyletherrest, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist. Beispiele für geeignete Alkyletherreste schließen Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy, iso-Butoxy, sec.-Butoxy, tert.-Butoxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkenoxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkenyl-O-, wobei der Begriff "Alkenyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Enolether ist. Beispiele für geeignete Alkenoxyreste schließen Allyloxy, E- und Z-3-Methyl-2-propenoxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkinyloxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkinyl-O-, wobei der Begriff "Alkinyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Inolether ist. Beispiele für geeignete Alkinoxyreste schließen Propargyloxy, 2-Butinyloxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Thioalkoxy" bezieht sich auf einen Thioetherrest der Formel Alkyl-S-, wobei Alkyl wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Mono- oder Dialkyl-substituierten Aminorest (d. h. einen Rest der Formel Alkyl-NH- oder (Alkyl)₂-N-), wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist. Beispiele für geeignete Alkylaminoreste schließen Methylamino, Ethylamino, Propylamino, Isopropylamino, tert.-Butylamino, N,N-Diethylamino und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkenylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkenyl-NH- oder (Alkenyl)₂N-, wobei der Begriff "Alkenyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Enamin ist. Ein Beispiel für solche Alkenylaminoreste ist der Allylaminorest.
Der Begriff "Alkinylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkinyl-NH- oder (Alkinyl)₂N-, in der der Begriff "Alkinyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Inamin ist. Ein Beispiel für solche Alkinylaminoreste ist der Propargylaminorest.
Der Begriff "Amid" bezieht sich entweder auf -N(R¹)-C(=O)- oder -C(=O)-N(R¹)-, wobei R¹ hierin so definiert ist, daß es Wasserstoff sowie andere Gruppen einschließt. Der Begriff "substituiertes Amid" bezieht sich auf die Situation, in der R¹ nicht Wasserstoff ist, während der Begriff "unsubstituiertes Amid" sich auf die Situation bezieht, in der R¹ Wasserstoff ist.
Der Begriff "Aryloxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-O-, wobei Aryl wie oben definiert ist. Beispiele für Aryloxyreste schließen Phenoxy, Naphthoxy, Pyridyloxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Arylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-NH-, in der Aryl wie oben definiert ist. Beispiele für Arylaminoreste schließen Phenylamino (Anilido), Naphthylamino, 2-, 3- und 4-Pyridylamino und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Aryl-kondensiertes Cycloalkyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Cycloalkylrest, der zwei benachbarte Atome mit einem Arylrest teilt, wobei die Begriffe "Cycloalkyl" und "Aryl" wie oben definiert sind. Ein Beispiel eines Aryl-kondensierten Cycloalkylrestes ist der Benzo-kondensierte Cyclobutylrest.
Der Begriff "Alkylcarbonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-CONH, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkoxycarbonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-OCONH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkylsulfonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-SO₂NH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Arylsulfonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-SO₂NH-, wobei der Begriff "Aryl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "N-Alkylharnstoff", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-NH-CO-NH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "N-Arylharnstoff", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-NH-CO-NH-, wobei der Begriff "Aryl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Begriff "Kohlenwasserstoffrest" bezieht sich auf eine Anordnung von Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen, die nur ein einziges Wasserstoffatom benötigt, um ein unabhängiges stabiles Molekül zu sein. Somit hat ein Kohlenwasserstoffrest eine offene Valenzstelle an einem Kohlenstoffatom, durch die der Kohlenwasserstoffrest an ein anderes Atom (andere Atome) gebunden werden kann. Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, etc. sind Beispiele für Kohlenwasserstoffreste.
Der Begriff "Kohlenwasserstoffdirest" bezieht sich auf eine Anordnung von Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen, die zwei Wasserstoffatome benötigt, um ein unabhängiges stabiles Molekül zu sein. Somit hat ein Kohlenwasserstoffrest zwei offene Valenzstellen an einem oder zwei Kohlenstoffatomen, durch die der Kohlenwasserstoffrest an ein anderes Atom (andere Atome) gebunden werden kann. Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Cycloalkylen, etc. sind Beispiele für Kohlenwasserstoffdireste.
Der Begriff "Hydrocarbyl" bezieht sich auf jede stabile Anordnung, die vollständig aus Kohlenstoff und Wasserstoff besteht, mit einer einzelnen Valenzstelle, an der sie an eine andere Einheit gebunden ist, und schließt somit Reste ein, die als Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl (ohne Einbeziehung von Heteroatomen in den Arylring), Arylalkyl, Alkylaryl und dergleichen ein. Kohlenwasserstoffrest ist ein anderer Name für Hydrocarbyl.
Der Begriff "Hydrocarbylen" bezieht sich auf jede stabile Anordnung, die vollständig aus Kohlenstoff und Wasserstoff besteht, mit zwei Valenzstellen, an der sie an andere Einheiten gebunden ist, und schließt somit Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Cycloalkylen, Cycloalkenylen, Arylen (ohne Einbeziehung von Heteroatomen in den Arylring), Arylalkylen, Alkylarylen und dergleichen ein. Kohlenwasserstoffdirest ist ein anderer Name für Hydrocarbylen.
Der Begriff "Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen" bezieht sich auf eine Hydrocarbyl-Gruppe, die an ein Sauerstoffatom gebunden ist, wobei das Sauerstoffatom in ähnlicher Weise an eine Hydrocarbylen-Gruppe an einer der zwei Valenzstellen gebunden ist, an der die Hydrocarbylen-Gruppe an andere Einheiten gebunden ist. Die Begriffe "Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen", "Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen" und "Hydrocarbyl-Amid-hydrocarbylen" haben äquivalente Bedeutungen, wobei Sauerstoff durch Schwefel, -NH- bzw. eine Amidgruppe ersetzt worden ist.
Der Begriff N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen bezieht sich auf eine Hydrocarbylen-Gruppe, wobei eine der zwei Valenzstellen an ein Stickstoffatom gebunden ist und dieses Stickstoffatom gleichzeitig an einen Wasserstoff und eine Hydrocarbyl-Gruppe gebunden ist.
Der Begriff N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen bezieht sich auf eine Hydrocarbylengruppe, wobei eine der zwei Valenzstellen an ein Stickstoffatom gebunden ist und dieses Stickstoffatom gleichzeitig an zwei Hydrocarbyl-Gruppen gebunden ist.
Der Begriff "Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen" bezieht sich auf eine Hydrocarbyl-Gruppe, die durch eine Acyl(-C(≡O)-)-Gruppe an eine der zwei Valenzstellen einer Hydrocarbylen-Gruppe gebunden ist.
Die Begriffe "Heterocyclylhydrocarbyl" und "Heterocyclyl" beziehen sich auf eine stabile cyclische Anordnung von Atomen, die Kohlenstoffatome und bis zu vier Atome (als Heteroatome bezeichnet) einschließt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel. Die cyclische Anordnung kann in der Form eines monocyclischen Ringes mit 3–7 Atomen oder eines bicyclischen Ringes mit 8–11 Atomen vorliegen. Die Ringe können gesättigt oder ungesättigt sein (einschließlich aromatischer Ringe) und können fakultativ Benzo-kondensiert sein. Stickstoff- und Schwefelatomen im Ring können in jeder oxidierten Form vorliegen, einschließlich der quaternisierten Form von Stickstoff. Ein Heterocyclylhydrocarbyl kann an irgendeinem endocyclischen Kohlenstoff oder Heteroatom gebunden sein, das zur Schaffung einer stabilen Struktur führt. Bevorzugte Heterocyclylhydrocarbyle schließen 5- bis 7-gliedrige monocyclische Heterocyclen ein, die ein oder zwei Stickstoff-Heteroatome enthalten.
Ein substituiertes Heterocyclylhydrocarbyl bezieht sich auf ein Heterocyclyhydrocarbyl, wie oben definiert, wobei wenigstens ein Ringatom davon an einen angegebenen Substituenten gebunden ist, der sich vom Ring weg erstreckt.
Bei Bezugnahme auf Hydrocarbyl- und Hydrocarbylen-Gruppen bezieht sich der Begriff "Derivate von irgendeinem der vorstehenden, wobei ein oder mehr Wasserstoffe durch eine gleiche Anzahl Fluoride ersetzt ist" auf Moleküle, die Kohlenstoff-, Wasserstoff- und Fluoridatome enthalten, aber keine anderen Atome.
Der Begriff "aktivierter Ester" ist ein Ester, der eine "Abgangsgruppe" enthält, die leicht durch ein Nukleophil verdrängbar ist, wie etwa ein Amin und Alkohol oder ein Thiol-Nukleophil. Solche Abgangsgruppen sind gut bekannt und schließen, ohne Beschränkung, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, Halogen (Halogenide), Alkoxy einschließlich Tetrafluorphenolaten, Thioalkoxy und dergleichen ein. Der Begriff "geschützter Ester" bezieht sich auf eine Estergruppe, die maskiert oder in anderer Weise unreaktiv ist. Siehe z. B. Greene, "Protecting Groups In Organic Synthesis".
Angesichts der obigen Definitionen können weitere chemische Begriffe, die in dieser Anmeldung verwendet werden, von den Fachleuten leicht verstanden werden. Begriffe können allein oder in irgendeiner Kombination derselben verwendet werden. Die bevorzugten und weiter bevorzugten Kettenlängen der Reste gelten für alle solche Kombinationen.
A. ERZEUGUNG MARKIERTER NUKLEINSÄUREFRAGMENTE
Wie oben angegeben, stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein allgemeines Schema zur DNA-Sequenzierung bereit, das die Verwendung von mehr als 16 Markierungen in jeder Spur ermöglicht; bei kontinuierlichem Nachweis können die Markierungen nachgewiesen und die Sequenz gelesen werden, wenn die Trennung nach Größe abläuft, ebenso wie bei herkömmlicher Sequenzierung auf Fluoreszenz-Basis. Dieses Schema ist anwendbar auf alle DNA-Sequenzierungstechniken, die auf Trennung der markierten Moleküle nach Größe beruhen. Geeignete Markierungen und Linker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren sind unten detaillierter diskutiert.
1. Markierungen
"Markierung", wie hierin verwendet, bezieht sich allgemein auf eine chemische Einheit, die verwendet wird, um ein "interessierendes Molekül" in eindeutiger Weise zu identifizieren, und bezieht sich, genauer gesagt, auf die variable Markierungskomponente sowie auf alles, was in dem Markierungs-Reaktanten, der Markierungs-Komponente und/oder der Markierungs-Einheit am dichtesten daran gebunden ist.
Eine Markierung, die in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, besitzt mehrere Eigenschaften:

1) Sie kann von allen anderen Markierungen unterschieden werden. Diese Unterscheidung von anderen chemischen Einheiten basiert auf ihren spektroskopischen Eigenschaften d. h. in der Massenspektroskopie.
2) Die Markierung kann nachgewiesen werden, wenn sie mit 10^–22 bis 10^–6 Mol vorliegt.
3) Die Markierung besitzt einen chemischen Griff, durch den sie an das MOI gebunden werden kann, welches die Markierung in eindeutiger Weise identifizieren soll. Die Bindung kann direkt an das MOI erfolgen oder indirekt durch eine "Linker"-Gruppe.
4) Die Markierung ist chemisch stabil gegenüber allen Manipulationen, denen sie unterworfen wird, einschließlich Bindung und Spaltung vom MOI, und allen Manipulationen des MOI, während die Markierung daran gebunden ist.
5) Die Markierung beeinflußt die Manipulationen, die am MOI durchgeführt werden, während die Markierung daran gebunden ist, nicht in signifikanter Weise. Wenn die Markierung z. B. an ein Oligonukleotid gebunden ist, darf die Markierung irgendwelche Hybridisierungs- oder enzymatischen Reaktionen (z. B. PCR-Sequenzierungsreaktionen), die am Nukleotid durchgeführt werden, nicht signifikant beeinflussen. In ähnlicher Weise darf, wenn die Markierung an einen Antikörper gebunden ist, sie die Antigen-Erkennung durch den Antikörper nicht signifikant beeinflussen.

Eine Markierungs-Einheit, die mit einem bestimmten spektroskopischen oder potentiometrischen Verfahren nachgewiesen werden soll, sollte Eigenschaften besitzen, die die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises mit diesem Verfahren erhöht. Typischerweise wird die Markierungs-Einheit diese Eigenschaften haben, weil sie in die variable Markierungs-Komponente hineinkonstruiert worden sind, die typischerweise den Hauptteil der Markierungs-Einheit darstellen wird. In der folgenden Diskussion bezieht sich die Verwendung des Wortes "Markierung" typischerweise auf die Markierungs-Einheit (d. h. das Spaltprodukt, das die variable Markierungs-Komponente enthält), kann jedoch auch so betrachtet werden, daß es die variable Markierungs-Komponente selbst bezeichnet, weil diese der Teil der Markierungs-Einheit ist, der typischerweise dafür verantwortlich ist, die eindeutig nachweisbaren Eigenschaften bereitzustellen. In Verbindungen der Formel T-L-X wird der "T"-Teil die variable Markierungs-Komponente enthalten, der mit Massenspektrometrie charakterisiert wird, der "T"-Teil von T-L-X wird daher als T^ms bezeichnet. In ähnlicher Weise kann das Spaltprodukt von T-L-X, das T enthält, als die T^ms-enthaltende Einheit bezeichnet werden. Die folgenden spektroskopischen und potentiometrischen Verfahren können verwendet werden, um T^ms-enthaltende Einheiten zu charakterisieren.
a. Eigenschaften von MS-Markierungen
Der Marker ist durch Massenspektrometrie analysierbar (d. h. ist eine MS-lesbare Markierung, hierin auch als eine MS-Markierung oder "T^ms-enthaltende Einheit" bezeichnet). Das wesentliche Merkmal der Markierung ist, daß sie ionisiert werden kann. Es ist somit ein bevorzugtes Element bei der Konstruktion von MS-lesbaren Markierungen, darin eine chemische Funktionalität einzubauen, die unter Ionisationsbedingungen im MS eine positive oder negative Ladung tragen kann. Dieses Merkmal verleiht verbesserte Effizienz der Ionenbildung und höhere Gesamtempfindlichkeit des Nachweises, insbesondere bei Elektrosprayionisation. Die chemische Funktionalität, die eine ionisierte Ladung unterstützt, kann sich von T^ms oder L oder beiden ableiten. Faktoren, die die relative Empfindlichkeit eines durch Massenspektrometrie nachzuweisenden Analyten erhöhen kann, sind in z. B. Sunner, J., et al., Anal. Chem. 60: 1300–1307 (1988), diskutiert.
Eine bevorzugte Funktionalität, um das Tragen einer negativen Ladung zu erleichtern, ist eine organische Säure, wie etwa phenolisches Hydroxyl, Carbonsäure, Phosphonat, Phosphat, Tetrazol, Sulfonylharnstoff Perfluoralkohol und Sulfonsäure.
Bevorzugte Funktionalität, um das Tragen einer positiven Ladung unter Ionisationsbedingungen zu erleichtern, sind aliphatische oder aromatische Amine. Beispiele für funktionelle Amingruppen, die erhöhte Nachweisbarkeit von MS-Markierungen ergeben, schließen quartäre Amine (d. h. Amine, die vier Bindungen, jede zu Kohlenstoffatomen, aufweisen, siehe Aebersold, U.S.-Patent Nr. 5,240,859) und tertiäre Amine ein (d. h. Amine, die drei Bindungen, jede zu Kohlenstoffatomen, aufweisen, was C=N-C-Gruppen einschließt, wie sie in Pyridin vorhanden sind, siehe Hess et al., Anal. Biochem. 224: 373, 1995; Bures et al., Anal. Biochem. 224–364, 1995). Gehinderte tertiäre Amine sind besonders bevorzugt. Tertiäre und quartäre Amine können Alkyl oder Aryl sein. Eine T^ms-enthaltende Einheit muß wenigstens eine ionisierbare Spezies tragen, kann aber mehr als eine ionisierbare Spezies besitzen. Der bevorzugte Ladungszustand ist eine einzelne ionisierte Spezies pro Markierung.
Demgemäß ist es bevorzugt, daß jede T^ms-enthaltende Einheit (und jede variable Markierungs-Komponente) nur ein einziges gehindertes Amin oder eine einzige organische Säuregruppe enthält.
Geeignete Amin-enthaltende Reste, die Teil der T^ms-enthaltenden Einheit bilden können, schließen die folgenden ein:
Die Identifizierung einer Markierung durch Massenspektrometrie beruht vorzugsweise auf ihrem Verhältnis Molekülmasse zu Ladung (m/z). Der bevorzugte Molekülmassenbereich für MS-Markierungen ist von etwa 100 bis 2.000 Daltons, und vorzugsweise hat die T^ms-enthaltende Einheit eine Masse von wenigstens etwa 250 Daltons, bevorzugter wenigstens etwa 300 Daltons und noch bevorzugter wenigstens etwa 350 Daltons. Es im allgemeinen schwierig für Massenspektrometer, zwischen Einheiten zu unterscheiden, die Molekülionen unter etwa 200–250 Daltons haben (in Abhängigkeit von dem genauen Instrument), und so haben bevorzugte T^ms-enthaltende Einheiten der Erfindung Massen oberhalb dieses Bereiches.
Wie oben erklärt, kann die T^ms-enthaltende Einheit andere Atome als diejenigen enthalten, die in der variablen Markierungs-Komponente vorhanden sind und tatsächlich ändere als in T^ms selbst vorhanden sind. Demgemäß kann die Masse von T^ms selbst niedriger sein als etwa 250 Daltons, so lange die T^ms-enthaltende Einheit eine Masse von wenigstens etwa 250 Daltons hat. So kann die Masse von T^ms von 15 (d. h. einem Methylrest) bis etwa 10.000 Daltons reichen und reicht vorzugsweise von etwa 100 bis etwa 5.000 Daltons und reicht bevorzugter von etwa 200 bis etwa 1.000 Daltons.
Es ist relativ schwierig, Markierungen durch Massenspektrometrie zu unterscheiden, wenn diese Markierungen Atome enthalten, die mehr als ein Isotop in signifikanter Menge aufweisen. Demgemäß enthalten T-Gruppen, die für massenspektroskopische Identifizierung (T^ms-Gruppen) gedacht sind, Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod. Obgleich weitere Atome im T^ms vorhanden sein können, kann ihr Vorhandensein die Analyse der Massenspektrometerdaten etwas schwieriger machen. Vorzugsweise haben die T^ms-Gruppen nur Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffatome, zusätzlich zu Wasserstoff und/oder Fluorid.
Fluorid ist ein fakultatives, aber bevorzugtes Atom für die Einbeziehung in eine T^ms-Gruppe. Im Vergleich zu Wasserstoff ist Fluorid natürlich viel schwerer. So führt das Vorhandensein von Fluoridatomen statt Wasserstoffatomen zu T^ms-Gruppen mit höherer Masse, wodurch ermöglicht wird, daß die T^ms-Gruppe eine Masse von mehr als 250 Daltons erreicht und übersteigt, was wünschenswert ist, wie oben erläutert. Zusätzlich verleiht der Ersatz von Wasserstoff durch Fluorid der T^ms-enthaltenden Einheit größere Flüchtigkeit, und größere Flüchtigkeit des Analyten erhöht die Empfindlichkeit, wenn Massenspektrometrie als das Nachweisverfahren verwendet wird.
Die Molekülformel von T^ms fällt in den Bereich C_1-5 ₀₀N₀ _-100O_0-100O_0- ₁₀P₀ _- ₁₀H_αF_βI_δ, wobei die Summe von α, β und δ ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen. Die Bezeichnung C_1-500N_0-100O_0-100O_0- ₁₀P _0- ₁₀H_αF_βI_δ bedeutet, daß T^ms wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält und jede Zahl von 1 bis 500 Kohlenstoffatome enthalten kann, zusätzlich dazu, daß es so viel wie 100 Stickstoffatome ("N_0-" bedeutet, daß T^ms keinerlei Stickstoffatome enthalten muß), und so viel wie 100 Sauerstoffatome und so viel wie 10 Schwefelatome und so viel wie 10 Phosphoratome enthält. Die Symbole α, β und δ stellen die Anzahl von Wasserstoff-, Fluorid- und Iodidatomen in T^ms dar, wobei jeweils zwei dieser Zahlen Null sein können und wobei die Summe dieser Zahlen der Gesamtheit der sonst ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome entspricht. Vorzugsweise hat T^ms eine Molekülformel, die in den Bereich C_1-50N_0-10 O _0-10H_αF_β fällt, wobei die Summe von α und β der Anzahl von Wasserstoff- bzw. Fluoridatomen entspricht, die in der Einheit vorhanden sind.
Zusätzlich zu den obigen Eigenschaften ist es bevorzugt, daß die Markierung eine modulare chemische Struktur besitzt. Dies hilft bei der Konstruktion einer großen Anzahl von strukturell verwandten Markierungen unter Verwendung der Techniken der kombinatorischen Chemie. Die T^ms-Gruppe hat z. B. wünschenswerterweise mehrere Eigenschaften. Sie enthält wünschenswerterweise eine funktionelle Gruppe, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die T^ms-enthaltende Einheit Massenspektrometrie unterzogen wird (einfacher als eine "Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärker"-Gruppe oder MSSE bezeichnet). Auch kann sie wünschenswerterweise als ein Mitglied in einer Familie von T^ms-enthaltenden Einheiten dienen, in der die Mitglieder der Familie jedes ein unterschiedliches Masse/Ladungs-Verhältnis haben, jedoch ungefähr dieselbe Empfindlichkeit im Massenspektrometer aufweisen. Mitglieder der Familie haben somit wünschenswerterweise denselben MSSE. Um die Schaffung von Familien von Verbindungen zu ermöglichen, hat es sich als geeignet erwiesen, Markierungs-Reaktanten über ein modulares Syntheseschema zu erzeugen, so daß die Markierungs-Komponenten selbst als Module-umfassend angesehen werden können.
In einem bevorzugten modularen Ansatz für die Struktur der T^ms-Gruppe hat T^ms die Formel T²-(J-T³-)_n wobei T² eine organische Einheit ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet wird, mit einem Massebereich von 15 bis 500 Daltons; T³ eine organische Einheit ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet wird, mit einem Massebereich von 50 bis 1.000 Daltons; J eine direkte Bindung oder eine funktionelle Gruppe ist, wie etwa Amid, Ester, Amin, Sulfid, Ether, Thioester, Disulfid, Thioether, Harnstoff, Thioharnstoff, Carbamat, Thiocarbamat, Schiff'sche Base, reduzierte Schiff'sche Base, Imin, Oxim, Hydrazon, Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Sulfonat, Sulfonamid oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung; und n eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, jedes T³ und J unabhängig ausgewählt wird.
Die modulare Struktur T²-(J-T³)_n- liefert einen geeigneten Zugang zu Familien von T-L-X-Verbindungen, in denen jedes Mitglied der Familie eine verschiedene T-Gruppe besitzt. Wenn T z. B. T^ms ist und jedes Familienmitglied wünschenswerterweise denselben MSSE besitzt, kann eine der T³-Gruppen diese MSSE-Struktur liefern. Um für Variabilität zwischen Mitgliedern einer Familie im Hinblick auf die Masse von T^ms zu sorgen, kann die T²-Gruppe unter den Familienmitgliedern variiert werden. Ein Familienmitglied kann z. B. T² = Methyl haben, während ein anderes T² = Ethyl hat und ein anderes T² = Propyl hat, etc.
Um "grobe" oder große Sprünge in der Masse bereitzustellen, kann eine T³-Gruppe konstruiert werden, die in signifikantem Maße (z. B. eine oder mehrere hundert) Masseeinheiten zu T-L-X hinzufügt. Solch eine T³-Gruppe kann als eine Molekulargewichtsbereicheinstellungsgruppe ("WRA") bezeichnet werden. Eine WRA ist ziemlich nützlich, wenn man mit einem einzigen Satz von T²-Gruppen arbeitet, die Massen haben werden, die sich über einen beschränkten Bereich erstrecken. Ein einzelner Satz von T²-Gruppen kann verwendet werden, um T^ms-Gruppen mit einem weiten Massebereich zu schaffen, einfach indem eine oder mehrere WRA-T³-Gruppen in die T^ms einbezogen werden. Als ein einfaches Beispiel liefert somit, wenn ein Satz von T²-Gruppen einen Massebereich von 250–340 Daltons für die T^ms bereitstellt, das Hinzufügen einer einzigen WRA mit einer beispielhaften Zahl von 100 Daltons, als eine T³-Gruppe Zugang zum Massebereich 350–440 Daltons, während derselbe Satz von T²-Gruppen verwendet wird. In ähnlicher Weise stellt das Hinzufügen von zwei MWA-Gruppen mit 100 Daltons (jede als eine T³-Gruppe) Zugang zum Massebereich von 450–540 Daltons bereit, wobei dieses inkrementale Hinzufügen von WRA-Gruppen fortgesetzt werden kann, um Zugang zu einem sehr großen Massebereich für die T^ms-Gruppe zu liefern. Bevorzugte Verbindungen der Formel T²-(J-T³-)_n-L-X haben die Formel R_VWC-(R_WRA)_w-R_MSSE-L-X, in der VWC eine "T²"-Gruppe ist und jede der WRA- und MSSE-Gruppen "T³"-Gruppen sind. Diese Struktur ist in 12 veranschaulicht und stellt einen modularen Ansatz für die Herstellung von T^ms dar.
In der Formel T²-(J-T³-)_n- sind T² und T³ vorzugsweise ausgewählt aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-amid-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl hydrocarbylen, N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen, Hydrocarbylacylhydrocarbylen, Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, substituiertem Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor und die Substituenten ausgewählt sind aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N-Di(hydrocarbyl)hydro'carbylen und Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen. Zusätzlich kann T² und/oder T³ ein Derivat irgendeiner der zuvor aufgelisteten potentiellen T²/T³-Gruppen sein, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe durch Fluoride ersetzt sind.
Ebenfalls im Hinblick auf die Formel T²-(J-T³-)_n- hat ein bevorzugtes T³ die Formel -G(R²)-, in der G eine C_1-6-Alkylenkette mit einem einzelnen R²-Substituenten ist. So kann, wenn G Ethylen (-CH₂-CH₂-) ist, einer der zwei Ethylen-Kohlenstoffe einen R²-Substituenten tragen und R² ist ausgewählt aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl-kondensiertem Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Aryl-substituiertem Alkenyl oder Alkinyl, Cycloalkyl-substituiertem Alkyl, Cycloalkenyl-substituiertem Cycloalkyl, Biaryl, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Aralkoxy, Aryl-substituiertem Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryl-substituiertem Alkylamino, Aryl-substituiertem Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryloxy, Arylamino, N-Alkylharnstoff-substituiertem Alkyl, N-Arylharnstoff-substituiertem Alkyl, Alkylcarbylamino-substituiertem Alkyl, Aminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclyl, Heterocyclyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclyl-substituiertem Amino, Carboxyalkyl-substituiertem Aralkyl, Oxocarbocyclyl-kondensiertem Aryl und Heterocyclylalkyl; Cycloalkenyl, Aryl-substituiertem Alkyl und Aralkyl, Hydroxy-substituiertem Alkyl, Alkoxy-substituiertem Alkyl, Aralkoxy-substituiertem Alkyl, Alkoxy-substituiertem Alkyl, Aralkoxy-substituiertem Alkyl, Amino-substituiertem Alkyl, (Aryl-substituiertem Alkyloxycarbonylamino)-substituiertem Alkyl, Thiol-substituiertem, Alkylsulfonyl-substituiertem Alkyl, (Hydroxy-substituiertem Alkylthio)-substituiertem Alkyl, Thioalkoxy-substituiertem Alkyl, Hydrocarbylacylamino-substituiertem Alkyl, Heterocyclylocylamino-substituiertem Alkyl, Hydrocarbyl-substituiertem-heterocyclylacylamino-substituiertem Alkyl, Alkylsulfonylamino-substituiertem Alkyl, Arylsulfonylamino-substituiertem Alkyl, Morpholinoalkyl, Thiomorpholinoalkyl, Morpholinocarbonyl-substituiertem Alkyl, Thiomorpholinocarbonyl-substituiertem Alkyl, [N-(Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl)- oder N,N-[Dialkyl, Dialkenyl, Dialkinyl oder (Alkyl, Alkenyl)-amino]carbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclylaminocarbonyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonyl, Heterocyclylaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbonyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonylalkyl, Carboxyl-substituiertem Alkyl, Dialkylamino-substituiertem Acylaminoalkyl und Aminosäureseitenketten, ausgewählt aus Arginin, Asparagin, Glutamin, S-Methylcystein, Methionin und entsprechenden Sulfoxid- und Sulfonderivaten davon, Glycin, Leucin, Isoleucin, allo-Isoleucin, tert.-Leucin, Norleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Prolin, Alanin, Ornithin, Histidin, Glutamin, Valin, Threonin, Serin, Asparaginsäure, beta-Cyanoalanin und allo-Threonin; Alinyl und Heterocyclylcarbonyl, Aminocarbonyl, Amido, Mono- oder Dialkylaminocarbonyl, Mono- oder Diarylaminocarbonyl, Alkylarylaminocarbonyl, Diarylaminocarbonyl, Mono- oder Diacylaminocarbonyl, aromatischem oder aliphatischem Acyl, Alkyl, fakultativ substituiert mit Substituenten, die ausgewählt sind aus Amino, Carboxy, Hydroxy, Mercapto, Mono- oder Dialkylamino, Mono- oder Diarylamino, Alkylarylamino, Diarylamino, Mono- oder Diacylamino, Alkoxy, Alkenoxy, Aryloxy, Thioalkoxy, Thioalkenoxy, Thioalkinoxy, Thioaryloxy und Heterocyclyl.
Eine bevorzugte Verbindung der Formel T²-(J-T³-)_n-L-X hat die Struktur:
in der G(CH₂)_1-6 ist, so daß ein Sauerstoff an einer und nur einer der CH₂-Gruppen, die durch ein einziges "G" dargestellt werden, ersetzt ist durch -(CH₂)_c-Amid-T⁴; T² und T⁴ organische Einheiten der Formel C_2–25N₀ _–9O_0–9H_αF_β sind, so daß die Summe von α und β ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; Amid
ist; R¹ Wasserstoff oder C_1-10-Alkyl ist; c eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0 bis 4 ist; und n eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, G, c, Amid, R¹ und T⁴ unabhängig ausgewählt werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform hat eine Verbindung der Formel T²-(J-T³-)_n-L-X die Struktur:
in der T⁵ eine organische Einheit der Formel C_1-25N₀ _-9O_0-9H_αF_β ist, so daß die Summe von α und β ausreichend ist, um die sonst ungesätigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; und T⁵ ein tertiäres oder quartäres Amin oder eine organische Säure einschließt; m eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0–49 ist und T², T⁴, R¹, L und X zuvor definiert worden sind.
Eine weitere bevorzugte Verbindung mit der Formel T²-(J-T³-)_n-L-X hat die besondere Struktur:
in der T⁵ eine organische Einheit der Formel C_1-25N₀ _-9O_0-9H_αF_β ist, so daß die Summe von α und β ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; und T⁵ ein tertiäres oder quartäres Amin oder eine organische Säure einschließt; m eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0–49 ist und T², T⁴, c, R¹, "Amid", L und X zuvor definiert worden sind.
In den obigen Strukturen, die eine T⁵-Gruppe besitzen, ist -Amid-T⁵ vorzugsweise eine der folgenden Gruppen, die geeigneterweise hergestellt werden, indem organische Säuren mit freien Aminogruppen umgesetzt werden, die an "G" gebunden sind:
Wenn die obigen Verbindungen eine T⁵-Gruppe besitzen und die "G"-Gruppe eine freie Carboxylgruppe besitzt (oder ein reaktives Äquivalent davon), dann sind die folgenden Gruppen die bevorzugte -Amid-T⁵-Gruppen, die geeigneterweise hergestellt werden können, indem das geeignete organische Amin mit einer freien Carboxylgruppe umgesetzt wird, die an eine "G"-Gruppe gebunden ist:
In drei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung hat T-L-MOI die Struktur:
in denen T² und T⁴ organische Einheiten der Formel C_1-25N_0-9O_0-9S_0-3P₀ _-3H_αF_βI_δ sind, so daß die Summe von α, β und δ ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen; G(CH₂)_1-6 ist, wobei ein und nur ein Wasserstoff auf den CH₂-Gruppen, die durch jedes G dargestellt werden, durch -(CH₂)_c-Amid-T⁴ ersetzt ist; Amid
ist; R¹ Wasserstoff oder C_1-10-Alkyl ist; c eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0 bis 4 ist; "C₂-C₁₀" eine Hydrocarbylengruppe mit von 2 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt, "ODN-3'-OH" ein Nukleinsäurefragment mit einer endständigen 3'-Hydroxylgruppe darstellt (d. h. ein Nukleinsäurefragment, das an (C₁-C₁₀) am anderen als dem 3'-Ende des Nukleinsäurefragments gebunden ist); und n eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, dann G, c, Amid, R¹ und T⁴ unabhängig ausgewählt werden. Vorzugsweise sind nicht drei Heteroatome an ein einziges Kohlenstoffatom gebunden.
In Strukturen, wie oben angegeben, die eine T²-C(=O)-N(R¹)-Gruppe enthalten, kann diese Gruppe dadurch gebildet werden, daß ein Amin der Formel HN(R¹)- mit einer organischen Säure umgesetzt wird, die aus den folgenden ausgewählt ist, die nur beispielhaft sind und keine erschöpfende Liste möglicher organischer Säuren darstellen: Ameisensäure, Essigsäure, Propiolsäure, Propionsäure, Fluoressigsäure, 2-Butinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Buttersäure, Methoxyessigsäure, Difluoressigsäure, 4-Pentinsäure, Cyclobutancarbonsäure, 3,3-Dimethylacrylsäure, Valeriansäure, N,N-Dimethylglycin, N-Formyl-Gly-OH, Ethoxyessigsäure, (Methylthio)essigsäure, Pyrrol-2-carbonsäure, 3-Furancarbonsäure, Isoxazol-5-carbonsäure, trans-3-Hexensäure, Trifluoressigsäure, Hexansäure, Ac-Gly-OH, 2-Hydroxy-2-methylbuttersäure, Benzoesäure, Nicotinsäure, 2-Pyrazincarbonsäure, 1-Methyl-2-pyrrolcarbonsäure, 2-Cyclopenten-1-essigsäure, Cyclopentylessigsäure, (S)-(–)-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure, N-Methyl-L-prolin, Heptansäure, Ac-b-Ala-OH, 2-Ethyl-2-hydroxybuttersäure, 2-(2-Methoxyethoxy)essigsäure, p-Tolylsäure, 6-Methylnicotinsäure, 5- Methyl-2-pyrazincarbonsäure, 2,5-Dimethylpyrrol-3-carbonsäure, 4-Fluorbenzoesäure, 3,5-Dimethylisoxazol-4-carbonsäure, 3-Cyclopentylpropionsäure, Octansäure, N,N-Dimethylsuccinamidsäure, Phenylpropiolsäure, Zimtsäure, 4-Ethylbenzoesäure, p-Anissäure; 1,2,5-Trimethylpyrrol-3-carbonsäure, 3-Fluor-4-methylbenzoesäure, Ac-DL-Propargylglycin, 3-(Trifluormethyl)buttersäure, 1-Piperidinpropionsäure, N-Acetylprolin, 3,5-Difluorbenzoesäure, Ac-L-Val-OH, Indol-2-carbonsäure, 2-Benzofurancarbonsäure, Benzotriazol-5-carbonsäure, 4-n-Propylbenzoesäure, 3-Dimethylaminobenzoesäure, 4-Ethoxybenzoesäure, 4-(Methylthio)benzoesäure, N-(2-Furoyl)glycin, 2-(Methylthio)nicotinsäure, 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure, Tfa-Gly-OH, 2-Naphthoesäure, Chinaldinsäure, Ac-L-Ile-OH, 3-Methylinden-2-carbonsäure, 2-Chinoxalincarbonsäure, 1-Methylindol-2-carbonsäure, 2,3,6-Trifluorbenzoesäure, N-Formyl-L-Met-OH, 2-[2-(2-Methoxyethoxy)ethoxy]essigsäure, 4-n-Butylbenzoesäure, N-Benzoylglycin, 5-Fluorindol-2-carbonsäure, 4-n-Propoxybenzoesäure, 4-Acetyl-3,5-dimethyl-2-pyrrolcarbonsäure, 3,5-Dimethoxybenzoesäure, 2,6-Dimethoxynicotinsäure, Cyclohexanpentansäure, 2-Naphthylessigsäure, 4-(1H-Pyrrol-1-yl)benzoesäure, Indol-3-propionsäure, m-Trifluormethylbenzoesäure, 5-Methoxyindol-2-carbonsäure, 4-Pentylbenzoesäure, Bz-b-Ala-OH, 4-Diethylaminobenzoesäure, 4-n-Butoxybenzoesäure, 3-Methyl-5-CF3-isoxazol-4-carbonsäure, (3,4-Dimethoxyphenyl)essigsäure, 4-Biphenylcarbonsäure, Pivaloyl-Pro-OH, Octanoyl-Gly-OH, (2-Naphthoxy)essigsäure, Indol-3-buttersäure, 4-(Trifluormethyl)phenylessigsäure, 5-Methoxyindol-3-essigsäure, 4-(Trifluormethoxy)benzoesäure, Ac-L-Phe-OH, 4-Pentyloxybenzoesäure, Z-Gly-OH₁4-Carboxy-N-(fur-2-ylmethyl)pyrrolidin-2-on, 3,4-Diethoxybenzoesäure, 2,4-Dimethyl-5-CO₂Et-pyrrol-3-carbonsäure, N-(2-Fluorphenyl)succinamidsäure, 3,4,5-Trimethoxybenzoesäure, N-Phenylanthranilsäure, 3-Phenoxybenzoesäure, Nonanoyl-Gly-OH, 2-Phenoxypyridin-3-carbonsäure, 2,5-Dimethyl-l-phenylpyrrol-3-carbonsäure, trans-4-(Trifluormethyl)zimtsäure, (5-Methyl-2-phenyloxazol-4-yl)essigsäure, 4-(2-Cyclohexenyloxy)benzoesäure, 5-Methoxy-2-methylindol-3-essigsäure, trans-4-Cotinincarbonsäure, Bz-5-Aminovaleriansäure, 4-Hexyloxybenzoesäure, N-(3-Methoxyphenyl)succinamidsäure, Z-Sar-OH, 4-(3,4-Dimethoxyphenyl)buttersäure, Ac-o-Fluor-DL-Phe-OH, N-(4-Fluorphenyl)glutaminsäure, 4'-Ethyl-4-biphenylcarbonsäure, 1,2,3,4-Tetrahydroacridincarbonsäure, 3-Phenoxyphenylessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)succinamidsäure, N-Decanoyl-Gly-OH, (+)-6-Methoxy-a-methyl-2-naphthalinessigsäure, 3-(Trifluormethoxy)zimtsäure, N-Formyl- DL-Trp-OH, (R)-(+)-a-Methoxy-a-(trifluormethyl)phenylessigsäure, Bz-DL-Leu-OH, 4-(Trifluormethoxy)phenoxyessigsäure, 4-Heptyloxybenzoesäure, 2,3,4-Trimethoxyzimtsäure, 2,6-Dimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionsäure, 2,3,4,5,6-Pentafluorphenoxyessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)glutaminsäure, N-Undecanoyl-Gly-OH, 2-(4-Fluorbenzoyl)benzoesäure, 5-Trifluormethoxyindol-2-carbonsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)diglycolamidsäure, Ac-L-Trp-OH, Tfa-L-Phenylglycin-OH, 3-Iodbenzoesäure, 3-(4-n-Pentylbenzoyl)propionsäure, 2-Phenyl-4-chinolincarbonsäure, 4-Octyloxybenzoesäure, Bz-L-Met-OH, 3,4,5-Triethoxybenzoesäure, N-Lawoyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)benzoesäure, Ac-5-Methyl-DL-Trp-OH, 2-Iodphenylessigsäure, 3-Iod-4-methylbenzoesäure, 3-(4-n-Hexylbenzoyl)propionsäure, N-Hexanoyl-L-Phe-OH, 4-Nonyloxybenzoesäure, 4'-(Trifluormethyl)-2-biphenylcarbonsäure, Bz-L-Phe-OH, N-Tridecanoyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)phenylessigsäure, 3-(4-n-Heptylbenzoyl)propionsäure, N-Heptanoyl-L-Phe-OH, 4-Decyloxybenzoesäure, N-(α,α,α-Trifluor-m-tolyl)anthranilsäure, Nifluminsäure, 4-(2-Hydroxyhexafluorisopropyl)benzoesäure, N-Myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-Octylbenzoyl)propionsäure, N-Octanoyl-L-Phe-OH, 4-Undecyloxybenzoesäure, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionyl-Gly-OH, 8-Iodnaphthoesäure, N-Pentadecanoyl-Gly-OH, 4-Dodecyloxybenzoesäure, N-Palmitoyl-Gly-OH und N-Stearoyl-Gly-OH. Diese organischen Säuren sind von einer der folgenden Firmen erhältlich: Advanced ChemTech, Louisville, KY; Bachem Bioscience Inc., Tonance, CA; Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA; Farchan Laboratories Inc., Gainesville FL; Lancaster Synthesis, Windham, NH; und MayBridge Chemical Company (c/o Ryan Scientific), Columbia, SC. Die Kataloge dieser Firmen verwenden die Abkürzungen, die oben verwendet werden, um die Säuren zu identifizieren.
f. Kombinatorische Chemie als ein Mittel zur Herstellung von Markierungen
Kombinatorische Chemie ist eine Art von Synthesestrategie, die zur Herstellung großer chemischer Bibliotheken führt (siehe z. B. PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 94/08051). Diese kombinatorischen Bibliotheken können als Markierungen zur Identifizierung von interessierenden Molekülen (MOIs) verwendet werden. Kombinatorische Chemie kann definiert werden als die systematische und wiederholte, kovalente Verknüpfung eines Satzes unterschiedlicher "Bausteine" variierender Struktur miteinander, um eine große Anzahl verschiedener Moleküleinheiten zu liefern. Bausteine können viele Formen annehmen, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, wie etwa Nukleophile, Elektrophile, Diene, Alkylierungs- oder Acylierungsmittel, Diamine, Nukleotide, Aminosäuren, Zucker, Lipide, organische Monomere, Synthons und Kombinationen der obigen. Chemische Reaktionen, die verwendet werden, um die Bausteine zu verknüpfen, können Alkylierung, Acylierung, Oxidation, Reduktion, Hydrolyse, Substitution, Elimination, Addition, Zyklisierung, Kondensation und dergleichen einschließen. Dieser Prozeß kann Bibliotheken von Verbindungen erzeugen, die oligomer, nicht-oligomer oder Kombinationen davon sind. Wenn oligomer, können die Verbindungen verzweigt, unverzweigt oder zyklisch sein. Beispiele für oligomere Strukturen, die mit kombinatorischen Verfahren hergestellt werden können, schließen Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Polylipide, Polyester, Polyamide, Polyurethane, Polyharnstoffe, Polyether, Poly(phosphorderivate), z. B. Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide, Phosphite, Phosphinamide, etc., und Poly(schwefelderivate), z. B. Sulfone, Sulfonate, Sulfate, Sulfonamide, Sulfenamide, etc., ein.
Ein üblicher Typ von oligomerer kombinatorischer Bibliothek ist die kombinatorische Peptid-Bibliothek. Kürzliche Innovationen in der Peptidchemie und Molekularbiologie haben Bibliotheken ermöglicht, die aus einigen zehn bis einigen hundert von Millionen verschiedenen Peptidsequenzen bestehen, die hergestellt und verwendet werden. Solche Bibliotheken können in drei große Kategorien unterteilt werden. Eine Kategorie von Bibliotheken umfaßt die chemische Synthese von löslichen, nicht an einen Träger gebundenen Peptidbibliotheken (z. B. Houghten et al., Nature 354: 84, 1991). Eine zweite Kategorie umfaßt die chemische Synthese von trägergebundenen Peptidbibliotheken, präsentiert auf festen Trägern, wie etwa Kunststoffnadeln, Harzperlen oder Baumwolle (Geysen et al., Mol. Immunol. 23: 709, 1986; Lam et al., Nature 354: 82, 1991; Eichler und Houghten, Biochemistry 32: 11035, 1993). In diesen ersten zwei Kategorien sind die Bausteine typischerweise L-Aminosäuren, D-Aminosäuren, nicht-natürliche Aminosäuren oder irgendeine Mischung oder Kombination davon. Eine dritte Kategorie verwendet molekularbiologische Ansätze, um Peptide oder Proteine auf der Oberfläche filamentöser Phagenteilchen oder Plasmide herzustellen (Scott und Craig, Curr. Opinion Biotech. 5: 40, 1994). Lösliche, nicht an Träger gebundene Peptidbibliotheken scheinen für eine Reihe von Anwendungen geeignet zu sein, einschließlich Verwendung als Markierungen. Das verfügbare Repertoire von chemischen Diversitäten in Peptidbibliotheken kann durch solche Schritte wie Permethylierung ausgedehnt werden (Ostresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 11138, 1994).
Zahlreiche Varianten von kombinatorischen Peptidbibliotheken sind möglich, in denen die Peptid-Rückgratkette modifiziert wird und/oder die Amidbindungen durch mimetische Gruppen ersetzt worden sind. Amid-mimetische Gruppen, die verwendet werden können, schließen Harnstoffe, Urethane und Carbonylmethylengruppen ein. Die Umstrukturierung der Rückgratkette, so daß Seitenketten von den Amid-Stickstoffen jeder Aminosäure statt von den Alpha-Kohlenstoffatomen ausgehen, ergeben Bibliotheken von Verbindungen, die als Peptoide bekannt sind (Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 9367, 1992).
Ein weiterer üblicher Typ von oligomerer kombinatorischer Bibliothek ist die kombinatorische Oligonukleotidbibliothek, in der die Bausteine irgendeine Form von natürlich vorkommenden oder nicht-natürlichen Nukleotid- oder Polysaccharid-Derivaten sind, einschließlich die Fälle, in denen verschiedene organische und anorganische Gruppen die Phosphatverknüpfung ersetzen können und Stickstoff oder Schwefel Sauerstoff in einer Etherverknüpfung ersetzen können (Schneider et al., Biochem. 34: 9599, 1995; Freier et al., J. Med. Chem. 38: 344, 1995; Frank, J. Biotechnology 41: 259, 1995; Schneider et al., veröffentlichte PCT WO 942052; Ecker et al., Nucleic Acids Res. 21: 1853, 1993).
Vor kurzem ist die kombinatorische Herstellung von Sammlungen nicht-oligomerer, kleiner Molekülverbindungen beschrieben worden (DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 690, 1993; Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 4708, 1994). Strukturen, die für die Einstellung von Kleinmolekül-Bibliotheken geeignet sind, umfassen eine breite Vielfalt organischer Moleküle, z. B. Heterozyklen, Aromaten, Alizyklen, Aliphaten, Steroide, Antibiotika, Enzyminhibitoren, Liganden, Hormone, pharmazeutische Wirkstoffe, Alkaloide, Opioide, Terpene, Porphyrine, Toxine, Katalysatoren sowie Kombinationen davon.
g. Spezifische Verfahren zur kombinatorischen Synthese von Markierungen

Zwei Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines unterschiedlichen Satzes Amin-enthaltender MS-Markierungen sind unten umrissen. In beiden Verfahren wird Festphasensynthese eingesetzt, um simultane parallele Synthese einer großen Anzahl markierter Linker zu ermöglichen, unter Verwendung der Techniken der kombinatorischen Chemie. Beim ersten Verfahren führt die letztendliche Abspaltung der Markierung vom Oligonukleotid zur Freisetzung eines Carbonsäureamids. Beim zweiten Verfahren erzeugt die Abspaltung der Markierung eine Carbonsäure. Die chemischen Komponenten und Verknüpfungselemente, die in diesen Verfahren verwendet werden, werden wie folgt abgekürzt:

R	Harz
FMOC	Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe
All	Allyl-Schutzgruppe
CO₂H	Carbonsäuregruppe
CONH₂	Carbonsäureamidgruppe
NH₂	Aminogruppe
OH	Hydroxylgruppe
CONH	Amidverknüpfung
COO	Esterverknüpfung
NH₂-Rink-CO₂H	4-[(α-Amino)-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxybuttersäure( Rink-Linker)
OH-1MeO-CO₂H	(4-Hydroxymethyl)phenoxybuttersäure
OH-2MeO-CO₂H	(4-Hydroxymethyl-3-methoxy)phenoxyessigsäure

NH₂-A-COOH	Aminosäure mit aliphatischer oder aromatischer Aminfunktionalität in der Seitenkette
X1 . . . Xn-COOH	Satz von n verschiedenen Carbonsäuren mit einzigartigen relativen Molekülmassen
Oligo1 . . . Oligo(n)	Satz von n Oligonukleotiden
HBTU	O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat

Die Abfolge der Schritte in Verfahren 1 ist wie folgt:
Die Abfolge der Schritte in Verfahren 2 ist wie folgt:
h. Phosphoramidit und verwandte Verfahren zur Marker-Synthese
Festphasesynthese von natürlichen Polymeren wurde ursprünglich gleichzeitig durch Merrifield (Merrifield, 1963) und für Peptidchemie entwickelt und anschließend durch Letsinger (Letsinger und Mahadevan 1965) an die Oligonukleotidsynthese angepaßt. Das Konzept weist vier grundsätzliche Aspekte auf: I. Das Oligonukleotid wird synthetisiert, während es kovalent an einen festen Träger gebunden ist; II. Überschüssige lösliche geschützte Nukleotide und Kopplungsreagenz können eine Reaktion fast bis zur Vervollständigung antreiben; III. Die Reaktion wird in einem einzelnen Reagenz durchgeführt, um mechanische Verluste aufgrund der festen Träger-Manipulation zu verringern, was eine Synthese mit geringen Mengen an Ausgangsmaterialien ermöglicht; und IV. Die heterogenen Reaktionen werden standardisiert und diese Verfahren werden leicht automatisiert.
Das am meisten verbreitete Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden ist der Phosphit-Triester-Ansatz. Ein weiteres jedoch weniger verbreitetes Verfahren der Synthese ist der H-Phosphonat-Ansatz.
Der Phosphit-Triester-Ansatz zur Oligonukleotid-Synthese
Die Entwicklung dieses Verfahrens wurde 1975 begonnen, als Letsinger (Letsinger et al. 1975) das symmetrische Posphit-Reagenz Methoxyphospodichloridit einführten. Obwohl die Kopplungszeiten dramatisch verringert wurden, weist diese Verbindung den Nachteil auf, daß sie zu reaktiv ist, was die Handhabung bei Raumtemperatur sehr schwierig macht und die Lagerung von Phophitmonomeren sogar bei –10°C unmöglich macht. Die Reaktion mit geschützten Nukleotiden führt zu der Herstellung von großen Mengen von symmetrischem 3'-3'-Dimer (Letsinger et al., 1982).
1981 löste die Einführung des neuen phosphitylierenden Mittels N,N-Dimethylaminomethoxyphosphin (Beaucage und Caruthers 1981) nicht nur das Problem der Bildung von 3'-3'-Dimeren während der Phophitylierung, sondern führte auch zur Erzeugung von Desoxyribonukleosid-Phosphitderivaten, die bis zu einem bestimmten Ausmaß stabil gegenüber Sauerstoff und atmosphärischer Luftfeuchtigkeit bei Raumtemperatur sind. Als die am meisten brauchbare Verbindung erwies sich N,N-Diisopropylamin (Adams et al. 1983, McBride und Caruthers 1983) das leicht auf Silicagelsäulen gereinigt werden kann und das als trockene Pulver bei Raumtemperatur stabil ist.
Die durch dieses Verfahren verwendete 5'-Schutzgruppe ist das Dimethoxytrityl (DMT). Diese Gruppe wird vollständig durch Behandlung mit Trichloressigsäure (1–3% w/v) in Dichlormethan in weniger als einer Minute abgespalten. Sobald die Schutzgruppe entfernt ist, ist das freie 5'-Hydroxyl zur Kopplung an den nächsten Nukleosidbaustein erhältlich.
Anders als die Phosphodichloridite in Letsingers Ansatz und das Posphomonochloridit/Tetrazol in der Ursprungsarbeit von Caruthers (Caruthers et al. 1980) können die Phosphoramidite nicht direkt mit einer freien 5'-Hydroxylfunktion auf einer wachsenden Kette reagieren. Sie müssen zunächst durch Behandlung mit einer schwachen Säure, wie zum Beispiel Tetrazol, aktiviert werden. Tetrazol wurde als eine zweifache Rolle spielend gezeigt (Berner et al., 1990; Dahl et al., 1990): sie protoniert die Dialklyaminogruppe der Phosphoramiditfunktion und wirkt als nächstes als ein Nukleophil wodurch ein sehr reaktives Tetrazolphosphan-Intermediat erzeugt wird. Die Kopplungsreaktionen mit diesen Desoxynukleosid-Phosphoramiditreagenzien sind sehr schnell (weniger als 2 Minuten) und fast quantitativ.
Weil die Kopplungsreaktion in einer begrenzten Zeitdauer nicht quantitativ sein kann, wird bei jedem Kopplungsschritt ein kleiner Prozentsatz von verkürzten Sequenzen hergestellt. Diese Reaktionsfehlschläge enthalten 5'-Hydroxyle. Falls diesen falschen Sequenzen ermöglicht würde, weiter zu reagieren, wäre es schwierig, das Produkt aus dem Sequenzgemisch zu isolieren. Dieses Problem wird größtenteils durch maskieren der verbleibenden freien 5'-Hydroxyle durch Acetylierung überwunden. Dieser Maskierungsschritt wird mit dem starken Acetylierungsreagenz N-Acetyldimethylaminopyridiniumion erreicht, das sich bei Reaktion von äquimolaren Mengen von Essigsäureanhydrid und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) bildet. Die Reaktion ist in 0,5 Minuten fast quantitativ. Unter der Verwendung von N-Methylimidazol anstelle von DMAP wird das Oligonukleotid verbesserte biologische Eigenschaften aufweisen (Fenance et al., 1989).
Die neu gebildete Phosphit-Internukleotidverbindung ist instabil und sowohl gegenüber saurer als auch basischer Spaltung empfindlich. Daher wird der trivalente Phosphitester nach der Maskierung zu einem stabilen pentavalenten Phosphattriester oxidiert. Jod wird als ein mildes Oxidationsmittel in basischer Tetrahydrofwanlösung mit Wasser als dem Sauerstoff-Donor verwendet. Die Reaktionen sind extrem schnell, wobei sie in 30 Sekunden quantitativ ist. Die Oxidation vervollständigt den Nukleotidadditionszyklus. Die Kettenverlängerung kann nach Entfernen der Dimethoxytritylgruppe und dem 5'-Ende der wachsenden Kette und dem wiederholen eines weiteren Zyklus von der Nukleotidaddition fortschreiten. Die Vervollständigung der Abspaltung von dem Träger und die gleichzeitige Phasen- und Phosphatentschützung werden durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxyd erreicht.
H-Phosphonat-Verfahren der Oligonukleotid-Synthese
Die Verwendung eines Nukleosid-H-Phosphonats wurde zuerst durch Todd und Mitarbeiter berichtet (Hall et al. 1957). Danach blieb die H-Phosphonat-Chemie bis in die 80er Jahre unerforscht. 1985 und 1986 wurde das Wiederaufleben dieses Ansatzes durch Garegg et al. (1985, 1986a, 1986b) und Froehler et al. (1986a und 1986b) eingeführt.
In diesem Verfahren ist das aktivierbare Monomer ein 5'-DNT-Base-geschütztes-Nukleosid-3'-Hydrogenphosphonat. In diesen Monomeren macht die Anwesenheit der H-Phosphonatgruppe den Phosphatschutz überflüssig.
Die selben Basenschutzgruppen werden verwendet, wie im Phosphat-Triester-Ansatz. Daher ist die Schutzstrategie dieselbe für die Hydroxyl- und die exocyclischen Amine auf den Heterocyclen der Entschützung.
H-Phosphonat-Synthese-Zyklus. Es gibt keinen Oxidationsschritt während der Kettenverlängerung in der Oliognukleotid-Synthese gemäß den H-Phosphonat-Verfahren. Die Oxidation wird am Ende der Synthese durchgeführt.
Der Kopplungsprozess der H-Phosphonat-Synthese wird durch ein gehindertes Acylchlorid aktiviert und das gebildete Anhydrid wird dazu verwendet, um mit einem freien Oligonukleotid 5'-Hydroxylende zu reagieren, wobei ein H-Phosphonat-Analog der Internukleotid-Brücke gebildet wird. Die Ausbeuten sind ungefähr 96–99%. Von Pivaloylchlorid und 1-Adamantancarbonylchlorid (Andrus et al., 1988) wurde berichtet, daß dies die besten Aktivatoren sind. Jedoch werden einige Nebenreaktionen zwischen den kondensierende Reagenzien und den Ausführungsmaterial während der Kondensation beobachtet und dies führt zu abnehmenden Ausbeuten der gewünschten Verbindung. Insbesondere führte die Präaktivierung eines nukleosidischen 3'-H-Phosphonats, gefolgt von der Addition an einer OH-Komponente, die gewöhnlicherweise bei der Synthese auf Polymerträgern stattfindet, zu geringeren Ausbeuten der H-Phosphonat-Diester. Die andere Seite der Reaktion ist eine Modifikation von heterozyklischen Basen von Nukleotiden (Acylierung oder Phosphitylierung von Guanin und Thymin), während der Kondensation). Das Maskierungsreagenz der Phosphoramidit-Chemie (Essigsäureanhydrid/N- Methylimidazol) ist für den H-Phosphonat-Ansatz nicht geeignet. Cyanoethyl-H-Phosphonat (Gaffney und Jones, 1988) oder Iso-Propyl-H-Phosphonat (Andres et al., 1988), aktiviert durch Acetylchlorid oder PFPC, kann verwendet werden.
Nach Vervollständigung der Sequenz werden alle H-Phosphonat-Bindungen gleichzeitig zu Phosphodiesterverbindungen oxidiert. Anstelle der Oxidation mit Jod sind H-Phosphonat-Desoxyribonukleotide in der Lage, in DNA-Analoga zu Phosphorthioaten, Phosphoramidaten oder Phosphotriestern konvertiert zu werden (Froehler, 1986c, Froehler et al., 1988). Die Vorteile dieses Verfahrens sind eine erhöhte Monomerstabilität, die Präparation von ³⁵Smarkierten Oligonukleotiden (Stein et al., 1990) und die Möglichkeit der Wiederverwendung des Überschusses von aktiviertem Nukleosid, das nicht reagiert hat (Seliger und Rösch, 1990). H-Phosphonate sind käuflich erhältlich von Glen Research (Herndon, VA).
Die vorliegender Erfindung stellt Marker zur Verfügung die leicht in die oben beschriebenen Standardoligonukleotidsynthesen inkorporiert werden können. Die vorliegende Erfindung stellt einen CMST-Marker zur Anbringung an eine Nukleinsäure während der Festphase-Synthese zur Verfügung. Der CMST-Marker ist ein Phosphoramidit eines CMST.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung schließt die Anbringung eines CMST-Markers an eine Nukleinsäure während Festphase-Synthese ein. Genauer gesagt wird ein Phosphoramidit eines CMST an ein Träger-gebundenes Oligodesoxynukleotid kondensiert. Die Anpassung von Festphase-Phosphoramidit-Chemie an CMST-Technologie vereinfacht die Reinigung und erleichtert die Automatisierung des Verfahrens, wodurch der Durchsatz erhöht wird. Dieses ermöglicht die einfache Herstellung der markierten Moleküle.
Wie oben beschrieben wurde das Phosphoramiditverfahren der Oligonukleotid-Synthese automatisiert und wird weit verwendet. Ein Phosphoramidit eines CMST-Markers stellt ein bequemes Verfahren der Markierung von Oligonukleotiden mit CMST-Markern zur Verfügung. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Phosphoramidit eines CMST- Markers an eine Oligonukleotidkette kondensiert, die an einen festen Träger gebunden wurde. Der Träger kann von jeder für die Festphase von Nukleinsäuren geeigneten Art sein. Das Polynukleosid kann ein Ribonukleosid- oder ein Desoxyribonuklosid-Phosphodiester sein. Auch können Polynuklosid-Analoga, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Phosphorthioate, Methylphosphonate, usw., verwendet werden.
Ein CMST-Phosphoamidid gemäß der vorliegenden Erfindung kann von der generellen Struktur T^MS-L-X sein, wobei T^MS durch Massenspektrometrie nachgewiesen wird, L ein photochemischer Linker ist und x eine Gruppe ist, die ein Koppeln an Polynukleosid an einem festen Träger ermöglicht.
Die automatisierte Synthese von Oligonukleotiden verwendete Phosphoramidit-Chemie¹ und eine Vielzahl von Phosphoamidit-Reagenzien (z. B. Biotin²) wurden entwickelt, die vorteilhafterweise auf dieser Chemie beruhen, um Oligonukleotide zu markieren (siehe 24)³. Die Anpassung dieser Chemie, um eine Massenmarkierung von Festphase-getragenen Oligonukleotiden zu ermöglichen, vereinfacht die Reinigung und erleichtert die Automatisierung des Verfahrens, wodurch der Durchsatz erhöht wird.
Ein vorgeschlagenes Schema, das von der bereits hergestellten Markersäure ausgeht, ist in 25 gezeigt.
2. Linker
Eine "Linker"-Komponente (oder L), wie hierin verwendet, bedeutet entweder eine direkte kovalente Bindung oder eine organische chemische Gruppe, die verwendet wird, um eine "Markierung" (oder T) an ein "interessierendes Molekül" (oder MOI) durch kovalente chemische Bindungen zu binden. Zusätzlich ist die direkte Bindung selbst oder eine oder mehrere Bindungen innerhalb der Linker-Komponente unter Bedingungen spaltbar, die ermöglichen, daß T vom Rest der T-L-X-Verbindung (einschließlich der MOI-Komponente) freigesetzt (mit anderen Worten abgespalten) wird. Die variable Markierungskomponente, die innerhalb von T vorhanden ist, sollte gegenüber den Spaltungsbedingungen stabil sein. Vorzugsweise kann die Spaltung schnell durchgeführt werden; innerhalb weniger Minuten und vorzugsweise innerhalb etwa 15 Sekunden oder weniger.
Im allgemeinen wird ein Linker verwendet, um jede aus einem großen Satz von Markierungen mit jedem aus einem ähnlich großen Satz von MOIs zu verknüpfen. Typischerweise wird eine einzige Markierungs-Linker-Kombination mit jedem MOI verknüpft (um verschiedene T-L-MOI zu ergeben), aber in einigen Fällen kann mehr als eine Markierungs-Linker-Kombination mit jedem individuellen MOI verknüpft werden (um verschiedene (T-L)n-MOI zu ergeben). In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwei oder mehr Markierungen an einen einzigen Linker durch mehrere, unabhängige Stellen auf dem Linker gebunden, und diese Mehrfachmarkierungs-Linker-Kombination wird dann an ein einzelnes MOI gebunden (um verschiedene (T)n-L-MOI zu ergeben).
Nach verschiedenen Manipulationen des Satzes markierter MOIs werden spezielle chemische und/oder physikalische Bedingungen verwendet, um eine oder mehrere kovalente Bindungen im Linker zu spalten, was zur Freisetzung der Markierungen von den MOIs führt. Die spaltbare(n) Bindungen) kann (können) einige derselben Bindungen sein, die gebildet wurden, als die Markierung, der Linker und das MOI miteinander verknüpft wurden, oder nicht. Die Konstruktion des Linkers wird zum großen Teil die Bedingungen bestimmen, unter denen die Spaltung durchgeführt werden kann. Demgemäß können Linker durch die Spaltungsbedingungen identifiziert werden, gegenüber denen sie besonders empfindlich sind. Wenn ein Linker photolabil ist (d. h. zur Spaltung durch Einwirkung von aktinischer Strahlung neigt), kann dem Linker die Bezeichnung L^hυ gegeben werden. In ähnlicher Weise können die Bezeichnungen L^Säure, L^Base, L^[O], L^[R], L^enz, L^elc, L^Δ und L^ss verwendet werden, um Linker zu bezeichnen, die besonders empfindlich sind gegenüber der Spaltung durch Säure, Base, chemische Oxidation, chemische Reduktion, die katalytische Aktivität eines Enzyms (einfacher "Enzym"), elektrochemische Oxidation oder Reduktion, erhöhte Temperatur ("thermisch") bzw. Thiolaustausch.
Bestimmte Linker-Typen sind gegenüber einem einzigen Typ von Spaltungsbedingung labil, wohingegen andere gegenüber mehreren Typen von Spaltungsbedingungen labil sind. Zusätzlich kann jede der Markierungs-Bindungsstellen in Linkern, die mehrere Markierungen binden können (um (T)n-L-MOI-Strukturen zu ergeben), gegenüber unterschiedlichen Spaltungsbedingungen labil sein. Bei einem Linker mit zwei daran gebundenen Markierungen kann z. B. eine der Markierungen nur gegenüber Base labil sein und die andere nur gegenüber Photolyse.
Ein Linker, der in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, besitzt mehrere Eigenschaften:

1) Der Linker besitzt einen chemischen Griff (L_h), durch den er mit einem MOI verknüpft werden kann.
2) Der Linker besitzt einen zweiten, separaten chemischen Griff (L_h), durch den die Markierung an den Linker gebunden wird. Wenn mehrere Markierungen an einen einzigen Linker gebunden werden ((T)n-L-MOI-Strukturen), dann existiert für jede Markierung ein separater Griff.
3) Der Linker ist gegenüber allen Manipulationen stabil, denen er unterworfen wird, mit Ausnahme der Bedingungen, die eine Spaltung ermöglichen, so daß eine T-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung, einschließlich MOI, freigesetzt wird. Somit ist der Linker während der Bindung der Markierung an den Linker, der Bindung des Linkers an das MOI und allen Manipulationen des MOIs, während die Markierung und der Linker (T-L) daran gebunden sind, stabil.
4) Der Linker beeinflußt die Manipulationen, die am MOI durchgeführt werden, während das T-L daran gebunden ist, nicht signifikant. Wenn das T-L z. B. an ein Oligonukleotid gebunden ist, darf das T-L irgendwelche Hybridisierungs- oder enzymatischen Reaktionen (z. B. PCR), die am Oligonukleotid durchgeführt werden, nicht signifikant beeinflussen. In ähnlicher Weise darf, wenn das T-L an einen Antikörper gebunden ist, es nicht die Antigen-Erkennung durch den Antikörper beeinflussen.
5) Die Abspaltung der Markierung vom Rest der Verbindung tritt in einer in hohem Maße kontrollierten Art und Weise ein, unter Verwendung physikalischer oder chemischer Verfahren, die die Nachweisbarkeit der Markierung nicht nachteilig beeinflussen.

Für jeden gegebenen Linker ist es bevorzugt, daß der Linker mit einer breiten Vielfalt von MOIs verknüpfbar ist und daß eine breite Vielfalt von Markierungen mit dem Linker verknüpfbar ist. Eine solche Flexibilität ist vorteilhaft, weil sie erlaubt, daß eine Bibliothek von T-L-Konjugaten, wenn sie erst einmal hergestellt ist, mit verschiedenen unterschiedlichen Sätzen von MOIs verwendet werden kann.
Wie oben erläutert, hat ein bevorzugter Linker die Formel L_h-L¹-L²-L³-L_h
in der jedes L_h ein reaktiver Griff ist, der verwendet werden kann, um den Linker mit einem Markierungs-Reaktanten und einem Reaktanten aus einem interessierenden Molekül zu verknüpfen. L² ist ein wesentlicher Teil des Linkers, weil L² dem Linker Labilität verleiht. L¹ und L³ sind fakultative Gruppen, die wirkungsvoll dazu dienen, L² von den Griffen L_h zu trennen.
L¹ (das definitionsgemäß näher an T ist als L³) dient dazu, T von der erforderlichen labilen Einheit L² zu trennen. Diese Trennung kann nützlich sein, wenn die Spaltungsreaktion besonders reaktive Spezies (z. B. freie Radikale) erzeugt, die zufällige Veränderungen in der Struktur der T-enthaltenden Einheit bewirken könnten. Da die Spaltungsstelle weiter von der T-enthaltenden Einheit getrennt wird, besteht eine verringerte Wahrscheinlichkeit, daß reaktive Spezies, die an der Spaltungsstelle gebildet werden, die Struktur der T-enthaltenden Einheit aufbrechen werden. Auch können, da die Atome in L¹ typischerweise in der T-enthaltenden Einheit vorhanden sein werden, diese L¹-Atome der T-enthaltenden Einheit eine wünschenswerte Qualität verleihen. Wenn die T-enthaltende Einheit z. B. eine T^ms-enthaltende ist und ein gehindertes Amin wünschenswerterweise als Teil der Struktur der T^ms-enthaltenden Einheit vorhanden ist (um z.B. als ein MSSE zu dienen), kann das gehinderte Amin in der labilen L¹-Einheit vorhanden sein.
In anderen Fällen können L¹ und/oder L³ in einer Linkerkomponente vorhanden sein, weil der kommerzielle Lieferant eines Linkers sich entschieden hat, den Linker in einer Form mit solch einer L¹- und/oder L³-Gruppe zu vertreiben. In solch einem Fall besteht kein Nachteil darin, Linker mit L¹- und/oder L³-Gruppen zu verwenden (so lange diese Gruppen die Spaltungsreaktion nicht hemmen), selbst dann, wenn sie den Verbindungen, die sie umfassen, keine besonderen Leistungsvorteile verleihen. Somit erlaubt die vorliegende Erfindung, daß L¹- und/oder L³-Gruppen in der Linkerkomponente vorhanden sind.
L¹- und/oder L³-Gruppen können eine direkte Bindung sein (wobei in diesem Falle die Gruppe effektiv nicht vorhanden ist), eine Hydrocarbylen-Gruppe (z. B. Alkylen, Arylen, Cycloalkylen, etc.), -O-Hydrocarbylen (z. B. -O-CH₂-, O-CH₂CH(CH₃)-, etc.) oder Hydrocarbylen-(O-hydrocarbylen)_w , wobei w eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis etwa 10 ist (z. B. -CH₂-O-Ar-, -CH₂-(O-CH₂CH₂)₄-, etc.).
Mit dem Auftauchen der Festphasensynthese ist eine große Menge an Literatur zu Linkem entstanden, die gegenüber spezifischen Reaktionsbedingungen labil sind. Bei der typischen Festphasensynthese wird ein fester Träger durch einen labilen Linker an eine reaktive Stelle gebunden, und ein zu synthetisierendes Molekül wird an der reaktiven Stelle erzeugt. Wenn das Molekül vollständig synthetisiert ist, wird das Konstrukt aus festem Träger, Linker und Molekül Spaltungsbedingungen unterworfen, die das Molekül vom festen Träger freisetzen. Die labilen Linker, die zur Verwendung in diesem Zusammenhang entwickelt worden sind (oder die in diesem Zusammenhang verwendet werden können), können auch ohne weiteres als der Linker-Reaktant in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Lloyd-Williams, P., et al., "Convergent Solid-Phase Peptide Synthesis", Tetrahedron Report Nr. 347, 49(48): 11065–11133 (1993) liefert eine ausführliche Diskussion von Linkern, die gegenüber aktinischer Strahlung (d. h. Photolyse) sowie sauren, basischen und anderen Spaltungsbedingungen labil sind. Zusätzliche Informationsquellen über labile Linker sind leicht erhältlich.
Wie oben beschrieben, werden unterschiedliche Linkerkonstruktionen unter unterschiedlichen spezifischen physikalischen oder chemischen Bedingungen Spaltbarkeit ("Labilität") verleihen. Beispiele für Bedingungen, die dazu dienen, verschiedene Linkerkonstruktionen zu spalten, schließen saure, basische, Oxidations-, Reduktions-, Fluorid-, Thiolaustausch-, Photolyse- und enzymatische Bedingungen ein.
Beispiele für spaltbare Linker, die die allgemeinen Kriterien für Linker erfüllen, die oben aufgelistet sind, werden den Fachleuten gut bekannt sein und schließen diejenigen ein, die im Katalog zu finden sind, der von Pierce (Rockford, IL) erhältlich ist. Beispiele schließen ein:

– Ethylenglycobis(succinimidylsuccinat) (EGS), ein aminreaktives Vernetzungsreagens, das mit Hydroxylamin spaltbar ist (1 M bei 37°C für 3–6 Stunden);
– Disuccinimidyltartrat (DST) und Sulfo-DST, die aminreaktive Vernetzungsreagentien sind, spaltbar mit 0,015 M Natriumperiodat;
– Bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES) und Sulfo-BSOCOES, die aminreaktive Vernetzungsmittel sind, spaltbar durch Base (pH 11,6);
– 1,4-Di[3'-(2'-pyridyldithio(propionamido))butan (DPDPB), ein Pyridyldithiol-Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– N-[4-(p-Azidosalicylamido)-butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid (APDP), ein Pyridyldithiol-Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– Bis-[beta-4-(azidosalicylamido)ethyl]-disulfid, ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat (SADP), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– Sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAED), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAND), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist.

Andere Beispiele für spaltbare Linker und die Spaltungsbedingungen, die verwendet werden können, um Markierungen freizusetzen, sind wie folgt. Eine Silyl-Verknüpfungsgruppe kann durch Fluorid oder unter sauren Bedingungen gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Nitrobenzyloxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4-Nitrobenzyloxy-Verknüpfungsgruppe kann durch eine Photonenquelle (Photolyse) gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Alkoxyphenoxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4-Alkoxyphenoxy-Verknüpfungsgruppe kann durch Ce(NH₄)₂(NO₃)₆ (Oxidation) gespalten werden. Ein NCO₂(Urethan)-Linker kann durch Hydroxid (Base), Säure oder LiAlH₄ (Reduktion) gespalten werden. Eine 3-Pentenyl-, 2-Butenyl- oder 1-Butenyl-Verknüpfungsgruppe kann durch O₃, OsO₄/IO₄ ^- oder KMnO₄ (Oxidation) gespalten werden. Eine 2-[3-, 4- oder 5-substituierte Furyl]oxy-Verknüpfungsgruppe kann durch O₂, Br₂, MeOH oder Säure gespalten werden.
Bedingungen für die Spaltung weiterer labiler Verknüpfungsgruppen schließen ein: tert.-Alkyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure gespalten werden; Methyl(dialkyl)methoxy- oder 4-substituierte 2-Alkyl-l,3-dioxan-2-yl-Verknüpfungsgruppen können durch H₃O⁺ gespalten werden; 2-Silylethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Fluorid oder durch Säure gespalten werden; 2-(X)-Ethoxy (wobei X = Keto, Esteramid, Cyano, NO₂, Sulfid, Sulfoxid, Sulfon ist)-Verknüpfungsgruppen können unter alkalischen Bedingungen gespalten werden; 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte Benzyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure oder unter reduktiven Bedingungen gespalten werden; 2-Butenyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch (Ph₃P)₃RhCl(H) gespalten werden; 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Bromphenoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Li, Mg oder BuLi gespalten werden; Methylthiomethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Hg²⁺ gespalten werden; 2-(X)-Ethyloxy(wobei X = ein Halogen)-Verknüpfungsgruppen können durch Zn oder Mg gespalten werden; 2-Hydroxyethyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Oxidation (z. B. mit Pb(OAc)₄) gespalten werden.
Bevorzugte Linker sind diejenigen, die durch Säure oder Photolyse gespalten werden. Mehrere der säurelabilen Linker, die für Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden sind, sind zur Verknüpfung von Markierungen mit MOIs nützlich. Einige dieser Linker sind bei einem kürzlich erschienenen Überblick von Lloyd-Williams et al. beschrieben (Tetrahedron 49: 11065–11133, 1993). Ein nützlicher Linker-Typ beruht auf p-Alkoxybenzylalkoholen, von denen zwei, 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure und 4-(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)buttersäure, von Advanced ChemTech (Louisville, KY) kommerziell erhältlich sind. Beide Linker können über eine Esterbindung mit dem Benzylalkohol an eine Markierung gebunden werden und über eine Amidbindung mit der Carbonsäure an ein aminhaltiges MOI. Markierungen, die durch diese Moleküle gebunden sind, werden vom MOI mit variierenden Konzentrationen in Trifluoressigsäure freigesetzt. Die Spaltung dieser Linker führt zur Freisetzung einer Carbonsäure auf der Markierung. Säurespaltung von Markierungen, die durch verwandte Linker gebunden sind, wie etwa 2-Dimethoxy-4'-(carboxymethyloxy)-benzhydrylamin (erhältlich von Advanced ChemTech in FMOCgeschützter Form), führt zur Freisetzung eines Carbonsäureamids auf der freigesetzten Markierung.
Die photolabilen Linker, die für diese Anwendung nützlich sind, sind ebenfalls größtenteils für die Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden (siehe Übersicht von Lloyd-Williams). Diese Linker beruhen üblicherweise auf 2-Nitrobenzylestern oder 2-Nitrobenzylamiden. Zwei Beispiele für photolabile Linker, über die vor kurzem in der Literatur berichtet worden ist, sind 4-(4-(1-FMOC-Amino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (Holmes und Jones, J. Org. Chem. 60: 2318–2319, 1995) und 3-(FMOC-Amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al., Molecular Diversity 1: 4–12, 1995). Beide Linker können über die Carbonsäure an ein Amin auf dem MOI gebunden werden. Die Bindung der Markierung an den Linker erfolgt durch Bildung eines Amids zwischen einer Carbonsäure auf der Markierung und dem Amin auf dem Linker. Die Spaltung photolabiler Linker erfolgt üblicherweise mit UV-Licht mit 350 nm Wellenlänge bei Intensitäten und Zeiträumen, die den Fachleuten bekannt sind. Die Spaltung der Linker führt zu einer Freisetzung eines primären Amids auf der Markierung. Beispiele für photospaltbare Linker schließen Nitrophenylglycinester, exo- und endo-2-Benzonorborneylchloride und Methansulfonate und 3-Amino-3(2-nitrophenyl)propionsäure ein. Beispiele für enzymatische Spaltung schließen Esterasen, die Esterbindungen spalten werden, Nuklearen, die Phosphodiester spalten werden, Proteasen, die Peptidbindungen spalten werden, etc. ein.
Eine bevorzugte Linkerkomponente besitzt eine ortho-Nitrobenzyl-Struktur, wie unten dargestellt:
in der ein Kohlenstoffatom an den Positionen a, b, c, d oder e mit -L³-X substituiert ist und L¹ (das vorzugsweise eine direkte Bindung ist) links von N(R¹) in der obigen Struktur vorhanden ist. Solch eine Linkerkomponente ist empfindlich gegenüber selektiver photo-induzierter Spaltung der Bindung zwischen dem Kohlenstoff mit der Bezeichnung "a" und N(R^l). Die Identität von R¹ ist typischerweise für die Spaltungsreaktion nicht kritisch, R¹ wird jedoch vorzugsweise ausgewählt aus Wasserstoff und Hydrocarbyl. Die vorliegende Erfindung sorgt dafür, daß in der obigen Struktur -N(R¹)- durch -O- ersetzt werden könnte. Auch können in der obigen Struktur eine oder mehrere der Positionen b, e, d oder e fakultativ mit Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert sein, wobei diese Substituenten bei jedem Auftreten unabhängig ausgewählt werden.
Eine weitere bevorzugte Linkerkomponente mit einem chemischen Griff L_h hat die folgende Struktur:
in der eine oder mehrere der Positionen b, c, d oder e mit Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert ist, R¹ Wasserstoff oder Hydrocarbyl ist und R² -OH oder eine Gruppe ist, die eine Carbonsäure zur Kopplung mit einer weiteren Einheit entweder schützt oder aktiviert. Fluorkohlenstoff- und Fluorkohlenwasserstoffgruppen sind bevorzugte Gruppen, die Carbonsäure zu einer Kopplung mit einer. anderen Einheit aktivieren.
3. Interessierendes Molekül (MOI)
Beispiele für MOIs schließen Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloge (z. B. PNA), Fragmente von Nukleinsäuren (d. h. Nukleinsäurefragmente), synthetische Nukleinsäuren oder Fragmente, Oligonukleotide (z. B. DNA oder RNA), Proteine, Peptide, Antikörper oder Antikörperfragmente, Rezeptoren, Rezeptorliganden, Teile eines Ligandenpaares, Cytokine, Hormone, Oligosaccharide, synthetische organische Moleküle, pharmazeutische Wirkstoffe und Kombinationen derselben ein.
Bevorzugte MOIs schließen Nukleinsäurefragmente ein. Bevorzugte Nukleinsäurefragmente sind Primersequenzen, die zu den Vektoren vorhandenen Sequenzen komplementär sind, wobei die Vektoren zur Basensequenzierung verwendet werden. Vorzugsweise ist ein Nukleinsäurefragment direkt oder indirekt an eine Markierung an einem anderen als dem 3'-Ende des Fragments gebunden; am bevorzugtesten am 5'-Ende des Fragmentes. Nukleinsäurefragmente können gekauft oder hergestellt werden auf der Basis genetischer Datenbanken (z. B. Dib et al., Nature 380: 152–154, 1996 und CEPH Genotype Database, http://www.cephb.fr) und von kommerziellen Anbietern (z. B. Promega, Madison, WI).
Wie hierin verwendet, schließt MOI Derivate eines MOIs ein, die eine Funktioalität enthalten, die nützlich ist bei der Verknüpfung des MOIs mit einer T-L-L_h-Verbindung. Ein Nukleinsäurefragment, das einen Phosphodiester am 5'-Ende aufweist, wobei der Phosphodiester auch an ein Alkylenamin gebunden ist, ist z. B. ein MOI. Solch ein MOI ist in z. B. U.S.-Patent 4,762,779 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme mit einbezogen wird. Ein Nukleinsäurefragment mit einer internen Modifikation ist ebenfalls ein MOI. Eine beispielhafte interne Modifikation eines Nukleinsäurefragmentes ist, daß die Base (z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin, Uracil) modifiziert worden ist, um eine reaktive funktionelle Gruppe hinzuzufügen. Solche intern modifizierten Nukleinsäurefragmente sind kommerziell erhältlich von z. B. Glen Research, Herndon, VA. Eine weitere beispielhafte interne Modifikation eines Nukleinsäurefragments ist, daß ein abasisches Phosphoramidat verwendet wird, um einen modifizierten Phosphodiester zu synthetisieren, der zwischen einem Zucker und einer Phosphatgruppe eines Nukleinsäurefragments angeordnet ist. Das abasische Phosphoramidat enthält eine reaktive Gruppe, die ermöglicht, daß ein Nukleinsäurefragment, das diese Phosphoramidat-abgeleitete Einheit enthält, mit einer weiteren Einheit verknüpft wird z. B. mit einer T-L-L_h-Verbindung. Solche abasischen Phosphoramidate sind kommerziell erhältlich von z. B. Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA.
4. Chemische Griffe (L_h)
Ein chemischer Griff ist eine stabile, aber reaktive Atomanordnung, die als ein Teil eines ersten Moleküls vorhanden ist, wo der Griff eine chemische Reaktion mit einem komplementären chemischen Griff durchlaufen kann, der als Teil eines zweiten Moleküls vorhanden ist, um eine kovalente Bindung zwischen den zwei Molekülen zu bilden. Der chemische Griff kann z. B. eine Hydroxylgruppe sein und der komplementäre chemische Griff kann eine Carbonsäuregruppe (oder ein aktiviertes Derivat, z. B. ein Hydrofluoroarylester) sein, woraufhin eine Reaktion zwischen diesen zwei Griffen eine kovalente Bindung (spezifisch eine Estergruppe) bildet, die die zwei Moleküle miteinander verknüpft.
Chemische Griffe können in einer großen Anzahl von kovalente Bindungen bildenden Reaktionen verwendet werden, die für die Bindung von Markierungen an Linker und Linker in MOIs geeignet sind. Solche Reaktionen schließen Alkylierung (z. B. um Ether, Thioether zu bilden), Acylierung (z. B. um Ester, Amide, Carbamate, Harnstoffe, Thioharnstoffe zu bilden), Phosphorylierung (z. B. um Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide zu bilden), Sulfonylierung (z. B. um Sulfonate, Sulfonamide zu bilden), Kondensation (z. B. um Imine, Oxime, Hydrazone zu bilden), Silylierung, Disulfidbildung und Erzeugung reaktiver Zwischenstufen, wie etwa Nitrene oder Carbene, durch Photolyse ein. Im allgemeinen sind Griffe und bindungsbildende Reaktionen, die zur Bindung von Markierungen an Linker geeignet sind, auch zur Bindung von Linkem an MOIs geeignet und umgekehrt. In einigen Fällen kann das MOI eine vorherige Modifikation oder Derivatisierung durchlaufen, um den für die Bindung des Linkers benötigten Griff bereitzustellen.
Ein Bindungstyp, der besonders nützlich ist zur Bindung von Linkem an MOIs, ist die Disulfidbindung. Ihre Bildung erfordert das Vorhandensein einer Thiolgruppe ("Griff") auf dem Linker und einer weiteren Thiolgruppe auf dem MOI. Milde oxidierende Bedingungen reichen dann aus, um die zwei Thiole als ein Disulfid miteinander zu verbinden. Disulfidbildung kann auch durch Verwendung eines Überschusses an einem geeigneten Disulfidaustauschreagens, z. B. Pyridyldisulfide, induziert werden. Weil Disulfidbildung leicht reversibel ist, kann das Disulfid auch als die spaltbare Bindung zur Freisetzung der Markierung verwendet werden, falls gewünscht. Dies wird typischerweise unter ähnlich milden Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Thiolaustauschreagens, z. B. Dithiothreitol.
Von besonderem Interesse für die Bindung von Markierungen (oder Markierungen mit Linkem) an Oligonukleotide ist die Bildung von Amidbindungen. Griffe aus primärem aliphatischen Amin können leicht mit Phosphoramiditen, wie etwa 6-Monomethoxytritylhexylcyanoethyl-N,N-düsopropylphosphoramidit (erhältlich von Glen Research, Sterling, VA), in synthetische Oligonukleotide eingeführt werden. Die in natürlichen Nukleotiden anzutreffenden Amine, wie etwa Adenosin und Guanosin, sind praktisch nicht-reaktiv, verglichen mit dem eingeführten primären Amin. Dieser Unterschied in der Reaktivität bildet die Grundlage für die Fähigkeit, selektiv Amide und verwandte Bindungsgruppen (z. B. Harnstoffe, Thioharnstoffe, Sulfonamide) mit dem eingeführten primären Amin und nicht mit den Nukleotid-Aminen zu bilden.
Wie in dem Katalog von Molecular Probes (Eugene, OR) aufgelistet, schließt eine teilweise Aufzählung von aminreaktiven funktionellen Gruppen aktivierte Carbonsäureester, Isocyanate, Isothiocyanate, Sulfonylhalogenide und Dichloitriazene ein. Aktivester sind hervorragende Reagentien zur Aminmodifizierung, da die gebildeten Amidprodukte sehr stabil sind. Diese Reagentien zeigen auch gute Reaktivität mit aliphatischen Aminen und geringe Reaktivität mit den Nukleotid-Aminen von Oligonukleotiden. Beispiele für Aktivester schließen N-Hydroxysuccinimidester, Pentafluorphenylester, Tetrafluorphenylester und p-Nitrophenylester ein. Aktivester sind nützlich, weil sie aus praktisch jedem Molekül hergestellt werden können, das eine Carbonsäure enthält. Verfahren zur Herstellung von Aktivestern sind aufgelistet in Bodansky (Principles of Peptide Chemistry (2. Aufl.), Springer-Verlag, London, 1993).
Die "X"-Gruppe in den durch T^MS-L-X bezeichneten Molekülen dient als ein chemischer Griff, der es ermöglicht, daß das Molekül an ein Biomolekül, z. B. ein Nukleinsäuremolekül angebracht wird. Die X-Gruppe ist ein Phosphoramidit oder eine H-Phosphonat-Gruppe. Wenn X eines dieser zwei Funktionalitäten ist, dann kann das T-L-X-Molekül an das Ende eines Oligonukleotids angefügt werden, das durch jedes der gut bekannten Phosphoramidit(auch als Phosphit-Triester bekannt) oder H-Phosphonat-Synthese-Methodologien für die Oligonukleotid-Synthese synthetisiert wurde, hinzugefügt werden.
Zum Beispiel, wenn X eine Phosphoramiditgruppe ist, kann das T-L-X-Molekül die Struktur die Formel aufweisen,
wobei ein bevorzugtes T-L-X-Molekül mit X als einem Phosphoramidit die Struktur
aufweist.
In den oben genannten Phosphoramidit-enthaltenden T-L-X-Molekülen ist R typischerweise eine Alkylgruppe, wie zum Beispiel eine C1-C6-Alkylgruppe, oder eine Alkylgruppe, die einen Substituenten anstelle eines Wasserstoff der Alkylgruppe aufweist, wobei geeignete einen Substituenten Cyano-(CN)-Gruppe einschließen. Daher kann "OR" im Phosphorami lit OCH₂CH₂CN sein und NR₂ kann N(isopropyl)₂ sein, die die zwei am meisten bei c er Herstellung von Oligonukleotiden unter der Verwendung von Phosphoramidit-Chen ie angewendeten Gruppen sind. NR₂ kann alternativ, zum Beispiel, eine Morpholingruppe sein In einer Ausführungsform ist R eine Alkylgruppe oder eine substituierte Alkylgruppe, die einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus Halogen und Cyano aufweist und die zwei R-Gruppen von NR₂ können miteinander verbunden sein, um eine Cycloalkylgruppe zu bilden.
Ein zweiter Ansatz für die Synthese von Oligonukleotiden basiert vorteilhafterweise auf H-Phosphonat-Chemie. Ein T-L-X-Molekül der vorliegenden Erfindung kann einen chemisch n Griff/X-Gruppe aufweisen, die eine H-Phosphonat-Gruppe ist und daher eine Struktur wie folgt aufweisen:
In der oben genannten H-Phosphonatgruppe stellt R₃ drei Alkylgruppen dar, die typischerweise 1-6 Kohlenstoffatome in jeder Alkylgruppe aufweisen. Ethyl ist eine herkömmliche R-Gruppe in H-Phosphonat-Reagenzien, die in der Oligonukleotid-Synthese verwendet werden und ist daher eine bevorzugte R-Gruppe in T-L-X-Molekülen der Erfindung, worin X eine H-Phosphonat-Gruppe ist.
5. Linker-Bindung
Typischerweise wird ein einziger Linker-Typ verwendet, um einen bestimmten Satz oder eine bestimmte Familie von Markierungen mit einem bestimmten Satz oder einer bestimmten Familie von MOIs zu verbinden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein einziger, gleichförmiger Prozeß befolgt werden, um alle verschiedenen T-L-MOI-Strukturen zu schaffen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn der Satz von T-L-MOI-Strukturen groß ist, weil es ermöglicht, daß der Satz unter Verwendung von Verfahren der kombinatorischen Chemie oder einer anderen Parallelverarbeitungstechnologie hergestellt werden kann. In einer ähnlichen Art und Weise ermöglicht die Verwendung eines einzigen Linker-Typs, das ein einziger, gleichförmiger Prozeß zur Spaltung aller verschiedenen T-L-MOI-Strukturen eingesetzt werden kann. Wieder ist dies für einen großen Satz von T-L-MOI-Strukturen vorteilhaft, weil der Satz auf eine parallele, wiederholte und/oder automatisierte Art und Weise verarbeitet werden kann.
Es gibt jedoch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der zwei oder mehr Linker-Typen verwendet werden, um unterschiedliche Untersätze von Markierungen mit entsprechenden Untersätzen von MOIs zu verbinden. In diesem Fall können selektive Spaltungsbedingungen verwendet werden, um jeden der Linker unabhängig zu spalten, ohne die auf den anderen Untersätzen von MOIs vorhandenen Linker zu spalten.
Eine große Anzahl von kovalente Bindungen bildenden Reaktionen sind für die Bindung von Markierungen an Linker und Linker an MOIs geeignet. Solche Reaktionen schließen Alkylierung (z. B. um Ether, Thioether zu bilden), Acylierung (z. B. um Ester, Amide, Carbamate, Harnstoffe, Thioharnstoffe zu bilden), Phosphorylierung (z. B. um Phosphate, Phosphonate,l5hosphoramide, Phosphonamide zu bilden), Sulfonylierung (z. B. um Sulfonate, Sulfonamide zu bilden), Kondensation (z. B. um Imine, Oxime, Hydrazone zu bilden), Silylierung, Disulfidbildung und Erzeugung reaktiver Zwischenstufen, wie etwa Nitrene oder Carbene, durch Photolyse ein. Im allgemeinen sind Griffe und bindungsbildende Reaktionen, die zur Bindung von Markierungen an Linker geeignet sind, auch zur Bindung von Linkem an MOIs geeignet und umgekehrt. In einigen Fällen kann das MOI eine vorherige Modifikation oder Derivatisierung durchlaufen, um den zur Bindung des Linkers notwendigen Griff bereitzustellen.
Ein Bindungstyp, der besonders nützlich für die Bindung von Linker an MOIs ist, ist die Disulfidbindung. Ihre Bildung erfordert das Vorhandensein einer Thiolgruppe ("Griff") auf dem Linker und einer weiteren Thiolgruppe auf dem MOI. Milde oxidierende Bedingungen reichen dann aus, um die zwei Thiole miteinander als ein Disulfid zu verbinden. Disulfidbildung kann auch durch die Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Disulfidaustauschreagens, z. B. Pyridyldisulfide, induziert werden. Weil Disulfidbildung leicht reversibel ist, kann das Disulfid auch als die spaltbare Bindung zur Freisetzung der Markierung verwendet werden, falls gewünscht. Dies wird typischerweise unter ähnlich milden Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Thiolaustauschreagenz, z. B. Dithiothreitol.
Von besonderem Interesse für die Bindung von Markierungen an Oligonukleotide ist die Bildung von Amidbindungen. Griffe aus primärem aliphatischen Amin können leicht mit Phosphoramiditen, wie etwa 6-Monomethoxytritylhexylcyanoethyl-N,N-disopropylphosphoramidit (erhältlich von Glen Research, Sterling, VA), in synthetische Oligonukleotide eingeführt werden. Die in natürlichen Nukleotiden anzutreffenden Amine, wie etwa Adenosin und Guanosin, sind praktisch nicht-reaktiv, verglichen mit dem eingeführten primären Amin. Dieser Unterschied in der Reaktivität bildet die Grundlage für die Fähigkeit, selektiv Amide und verwandte Bindungsgruppen (z. B. Harnstoffe, Thioharnstoffe, Sulfonamide) mit dem eingeführten primären Amin und nicht mit den Nukleotid-Aminen zu bilden.
Wie in dem Katalog von Molecular Probes (Eugene, OR) aufgelistet, schließt eine teilweise Aufzählung von aminreaktiven funktionellen Gruppen aktivierte Carbonsäureester, Isocyanate, Isothiocyanate, Sulfonylhalogenide und Dichlortriazene ein. Aktivester sind hervorragende Reagentien zur Aminmodifizierung, da die gebildeten Amidprodukte sehr stabil sind. Diese Reagentien zeigen auch gute Reaktivität mit aliphatischen Aminen und geringe Reaktivität mit den Nukleotid-Aminen von Oligonukleotiden. Beispiele für Aktivester schließen N-Hydroxysuccinimidester, Pentafluorphenylester, Tetrafluorphenylester und p-Nitrophenylester ein. Aktivester sind nützlich, weil sie aus praktisch jedem Molekül hergestellt werden können, das eine Carbonsäure enthält. Verfahren zur Herstellung von Aktivestern sind aufgelistet in Bodansky (Principles of Peptide Chemistry (2. Aufl.), Springer-Verlag, London, 1993).
Zahlreiche kommerzielle Vernetzungsreagentien existieren, die als Linker dienen können (siehe z. B. Pierce Cross-linkers, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Unter diesen sind homobifunktionelle -aminreaktive Vernetzungsreagentien, wie beispielhaft homobifunktionelle Imidoester und N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)-Ester. Es gibt auch heterobifunktionelle Vernetzungsreagentien, die zwei oder mehr unterschiedliche reaktive Gruppen besitzen, die sequentielle Reaktionen ermöglichen. Imidoester reagieren schnell mit Aminen bei alkalischem pH. NHS-Ester ergeben stabile Produkte, wenn sie mit primären oder sekundären Aminen umgesetzt werden. Maleimide, Alkyl- und Arylhalogenide, Alpha-Haloacyle und Pyridyldisulfide sind thiolreaktiv. Maleimide sind spezifisch für Thiol(Sulfhydryl)-Gruppen im pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 und können bei alkalischem pH aminreaktiv werden. Die Thioether-Bindung ist unter physiologischen Bedingungen stabil. Alpha-Haloacetyl-Vernetzungsreagentien enthalten die Iodacetylgruppe und sind gegenüber Sulfhydrylen reaktiv. Die Imidazole können mit der Iodacetyleinheit reagieren, aber die Reaktion ist sehr langsam. Pyridyldisulfide reagieren mit Thiolgruppen, um eine Disulfidbindung zu bilden. Carbodiimide koppeln Carboxyle an primäre Amine von Hydraziden, was zur Bildung einer Acyl-Hydrazin-Bindung führt. Die Arylazide sind Photoaffinitätsreagentien, die chemisch inert sind, bis sie UV- oder sichtbarem Licht ausgesetzt werden. Wenn solche Verbindungen bei 250–460 nm photolysiert werden, wird ein reaktives Arylnitren gebildet. Das reaktive Arylnitren ist relativ unspezifisch. Glyoxale sind reaktiv gegenüber dem Guanidinyl-Teil von Arginin.
In einer typischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Markierung zunächst an einen Linker gebunden, anschließend die Kombination von Markierung und Linker an ein MOI gebunden, um die Struktur T-L-MOI zu schaffen. Alternativ wird dieselbe Struktur gebildet, indem zunächst ein Linker an ein MOI gebunden wird und anschließend die Kombination von Linker und MOI an eine Markierung gebunden wird. Ein Beispiel ist, wenn das MOI ein DNA-Primer oder Oligonukleotid ist. In diesem Falle wird die Markierung typischerweise zunächst an einen Linker gebunden, anschließend das T-L an einen DNA-Primer oder ein Nukleotid gebunden, was dann z. B. in einer Sequenzierungsreaktion verwendet wird.
Eine nützliche Form, in der eine Markierung reversibel an ein MOI (z. B. ein Oligonukleotid oder einen DNA-Sequenzierungsprimer) gebunden werden kann, ist durch einen chemisch labilen Linker. Eine bevorzugte Konstruktion für den Linker ermöglicht, daß der Linker gespalten werden kann, wenn er einer flüchtigen organischen Säure ausgesetzt wird, z. B. Trifluoressigsäure (TFA). TFA ist besonders kompatibel mit den meisten Verfahren zur MS-Ionisierung, einschließlich Elektrospray.
Wie im Detail unten beschrieben, liefert die Erfindung eine Methodik für die Genotypisierung. Eine Zusammensetzung, die beim Genotypisierungsverfahren nützlich ist, umfaßt eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel: T^ms-L-MOI in der T^ms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die ermöglicht, daß eine T^ms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die T^ms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben wenigstens zwei Verbindungen dieselbe T^ms, aber die MOI-Gruppen dieser Moleküle besitzen nicht-identische Nukleotidlängen.
Eine weitere Zusammensetzung, die beim Genotypisierungsverfahren nützlich ist, umfaßt eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel: T^ms-L-MOI in der T^ms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Sauerstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine T^ms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die T^ms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben wenigstens zwei Verbindungen dieselbe T^ms, aber diese Verbindungen haben nicht-identische Elutionszeiten bei Säulenchromatographie.
Eine weitere Zusammensetzung, die beim Genotypisierungsverfahren verwendet werden kann, umfaßt eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel: T^ms-L-MOI
in der T^ms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Sauerstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine T^ms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die T^ms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben keine zwei Verbindungen, die dieselbe MOI-Nukleotidlänge aufweisen, auch dasselbe T^ms.
In der obigen Zusammensetzung ist die Mehrzahl vorzugsweise größer als 2 und vorzugsweise größer als 4. Auch hat das Nukleinsäurefragment im MOI eine zu einem Abschnitt eines Vektors komplementäre Sequenz, wobei das Fragment zum Priming einer Polynukleotidsynthese in der Lage ist. Vorzugsweise unterscheiden sich die T^ms-Gruppen von Mitgliedern der Mehrzahl um wenigstens 2 amu und können sich um wenigstens 4 amu unterscheiden.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Mehrzahl von Sätzen von Verbindungen umfaßt, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel besitzt: T^ms-L-MOI in der T^ms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine T^ms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die T^ms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI auch ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben Mitglieder innerhalb eines ersten Satzes von Verbindungen identische T^ms-Gruppen, haben jedoch nicht-identische MOI-Gruppen mit unterschiedlichen Anzahlen von Nukleotiden im MOI, und es gibt wenigstens zehn Mitglieder im ersten Satz, wobei zwischen den Sätzen die T^ms-Gruppen sich um wenigstens 2 amu unterscheiden. Die Mehrzahl ist vorzugsweise wenigstens 3 und bevorzugter wenigstens 5.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Mehrzahl von Sätzen von Verbindungen umfaßt, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel hat T^ms-L-MOI in der T^ms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine T^ms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die T^ms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben die Verbindungen innerhalb eines Satzes dieselbe Elutionszeit, aber nicht-identische T^ms-Gruppen.
Zusätzlich stellt die Erfindung einen Kit zum Genotypisieren zur Verfügung. Der Kit umfaßt eine Mehrzahl von Amplifikationsprimerpaaren, wobei wenigstens einer der Primer die Formel hat: T^ms-L-MOI in der T^ms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine T^ms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die T^ms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist; und jedes Primerpaar assoziiert mit einem unterschiedlichen Locus. Im Kit ist die Mehrzahl vorzugsweise wenigstens 3 und bevorzugter wenigstens 5.
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäurefragmente, die komplementär zu einem ausgewählten Nukleinsäuremolekül (z. B. markierte Fragmente) von einem ersten Ende bis zu einem zweiten Ende eines Nukleinsäuremoleküls) sind, wobei eine Markierung mit einem bestimmten oder ausgewählten Nukleotid korrelativ ist und mit irgendeinem aus einer Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge, (c) Abspalten einer Markierung von einem markierten Fragment und (d) Nachweisen der Markierungen und Bestimmen der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls daraus. Jeder der Aspekte wird unten detaillierter diskutiert werden.
B. DIAGNOSEVERFAHREN
1. Einführung
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung auch eine breite Vielfalt von Verfahren zur Verfügung, in denen die oben beschriebenen Markierungen und/oder Linker anstelle herkömmlicher Markierungen (z. B. radioaktiv oder enzymatisch) eingesetzt werden können, um die Spezifität, Empfindlichkeit oder Anzahl von Proben, die gleichzeitig analysiert werden können, in einem vorgegebenen Verfahren zu erhöhen. Repräsentative Beispiele für solche Verfahren, die verbessert werden können, schließen z. B. RNA-Amplifikation (siehe Lizardi et al., Bio/Technology 6: 1197–1202, 1988; Kramer et al., Nature 339: 401–402, 1989; Lomeli et al., Clinical Chem. 35(9): 1826–1831, 1989; U.S.-Patent Nr. 4,786,600) und DNA-Amplifikation unter Verwendung von LCR oder Polymerasekettenreaktion ("PCR") (siehe U.S. Patente Nrn. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159) ein.
Die CMST-Technologieplattform kann in einer Zahl von Anwendungen verwendet werden, in denen Nukleinsäure-Messungen in einem großen Maßstab durchgeführt werden. Diese Technologieplattform kann mit oder ohne einer Auftrennungs- oder Größen-Methodologie verwendet werden. Ein Beispiel eines nicht-Größen Assays würde Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Assays einschließen, in denen Oligonukleotide verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Basenveränderung in einer Ziel-Nukleinsäure nachzuweisen. Alternativ kann ein HPLC- oder Auftrennungssystem an den Massenspektrometrie-Detektor (MSD) angehängt werden, in dem Nukleinsäurefragmente nach ihrer Größe sortiert werden können und daher wird ein Massenspektrometrie-Marker mit einer Retentionszeit kombiniert, um eine Sequenz zu identifizieren. Die HPLC von Nukleinsäuren (Huber et al., 1993, Anal. Biochem 212, 5.351; Huber et al., 1993, Nuc. Acids Res., 21, 5.1061; Huber et al., 1993, Biotechniques, 16, 5.898) oder denaturierende HPLC (DHPLC) ist ein bei der Auftrennung von DNA-Duplices, die sich in ihrer Identität um eine oder mehrere Basenpaare unterscheiden, allgemein erfolgreiches Verfahren und ist für das Screening von Mutanten allgemein brauchbar. Ein allgemeines Verfahren wurde unter der Verwendung von 100 mM Triethylammoniumacetat als dem Ionen-paarenden Reagenz entwickelt, in dem Oligonukleotide über HPLC erfolgreich auf alkyliertem nicht-porösen 2,3 μM Poly(styrol-divinylbenzol) aufgetrennt wurden (Oefner et al., 1994, Anal. Biochem., 223, S.39). Diese Technik erlaubte auch die Auftrennung von PCR-Produkten, die sich in Ihrer Länge in nur 4 bis 8 Basenpaaren innerhalb eines Größenbereichs von 50 bis 200 Nukleotide unterscheiden.
DHPLC hat die Suche nach SNPs signifikant beschleunigt (Oefner und Underhill, Am. J. Hum. Genetics, 57, A266, 1995). Zahlreiche Anwendungen der DHPLC-Technik schließen die Identifizierung von Polymorphismen auf dem menschlichen Y-Chromosom ein, um evolutionäre Untersuchungen zu erleichtern (PNAS USA, 93, 196–200, 1996), und die schnelle Identifizierung von Erkrankungen die Mutationen auf dem Chromosom 19 verursachen, die Ataxia verursachen (Cell, 87, 543–552, 1996).
Während es schwierig war genetische Tests für multifaktorielle Erkrankungen zu entwickeln, werden mehr als 200 bekannte menschliche Erkrankungen durch einen Defekt in einem einzelnen Gen verursacht, oftmals eine Veränderung eines einzelnen Aminosäurerests (Olsen, Biotechnology: An industry comes of age, National Academic Press, 1986).
Sensitive Mutations-Nachweistechniken bieten außergewöhnliche Möglichkeiten für das Mutationsscreening. Effiziente genetische Tests können auch ein Screening auf onkogene Mutationen in Zellen ermöglichen, die aus dem respiratorischen Trakt oder der Blase abgestoßen werden, in Zusammenhang mit Gesundheitsvorsorgeuntersuchungen (Sidransky et al., Science 252: 706, 1991). Auch, wenn ein unbekanntes Gen eine genetische Erkrankung verursacht, sind Verfahren brauchbar, um DNA-Sequenzvarianten zu überwachen, um die Vererbung der Erkrankung durch genetische Kopplungsanalyse zu untersuchen. Mehrere verschiedenen Ansätze wurden verfolgt, jedoch ist keiner weder effizient noch billig genug um wirklich weit verbreitet angewendet zu werden (Cotton. RGH, (1997), Mutation Detection, Oxford University Press, New York). Mutationen, die ein einzelnes Nukleotid einschließen, können in einer Probe durch physikalische, chemische oder enzymatische Mittel identifiziert werden. Im allgemeinen, können Verfahren zum Mutationsnachweis in Scann-Techniken (Fearon, 1997, Science, 278, p 1043–1050) eingeteilt werden, die geeignet sind, um bisher unbekannte Mutationen zu modifizieren und Techniken, die dazu aufgebaut sind, um bekannten Sequenzvarianten nachzuweisen, zu unterscheiden oder zu quantifizieren (Hotzman et al., 1997, Science, 278, 602–605).
Verschiedenen Scan-Techniken zum Mutationsnachweis wurden für Heteroduplices entwickelt, wo die Anwesenheit eines Fehlpaares ein abnormales Verhalten induziert, wenn die Duplex teilweise denaturiert wird. Dieses Phänomen wird in den denaturierenden und Temperaturgradientgelelektrophoreseverfahren (jeweils DGGE und TGGE) ausgenutzt. Duplexe, die in sogar einer einzelnen Nukleotidposition fehlgepaart sind, können teilweise denaturieren, was zu verzögerter Wanderung führt, wenn in einem ansteigenden denaturierenden Gradientengel elektrophoriert (Orita, Genomics 5: 874, 1989; Keen, Trends Genet. 7: 5, 1991, Myers et al., Nature 313: 495, 1985; Abrams et al., Genomics 7: 463, 1990; henco et al., Nucl. Acids Res. 18: 6733, 1990). Obwohl Mutationen nachgewiesen werden können, sind keine Informationen im Hinblick auf den genauen Ort oder die Sequenz um die Mutation herum erhalten.
Fehlgepaarte Basen in einer Duplex sind ebenfalls gegenüber chemischer Modifikation empfindlich. Solche Modifikation kann die Stränge gegenüber der Spaltung an der Stelle der Fehlpaarung empfindlich machen oder verursachen, daß eine Polymerase in einer anschließenden Verlängerungsreaktion anhält. Die chemische Spaltungstechnik erlaubt die Identifizierung einer Mutation in vielen Sequenzen von bis zu 2 kb und stellt Informationen über den ungefähren Ort der fehlgepaarten Nukleotide zur Verfügung (Cotton et al., PNAS USA 85: 4397, 1988; Ganguly et al., Nucl. Acids Res. 18: 3933, 1991).
Eine alternative Strategie zum Nachweis einer Mutation in einem DNA-Strang ist durch Substituierung (während der Synthese) eines der normalen Nukleotide in einem modifizierten Nukleotid, das das Molekulargewicht oder andere physikalische Parameter des Produkts verändert. Ein Strang mit einer erhöhten oder verringerten Zahl diesen modifizierten Nukleotids relativ zu der Wildtyp-Sequenz zeigt eine veränderte elektrophoretische Mobilität (Naylor et al., Lancet 337: 635, 1991). Wiederum weist diese Technik die Anwesenheit einer Mutation nach, stellt jedoch nicht den Ort zur Verfügung.
Alle der oben genannten Techniken zeigen die Anwesenheit einer Mutation in einem begrenzten Segment von DNA an, und einige dieser ermöglichen die ungefähre Lokalisierung innerhalb des Segments. Jedoch ist eine Sequenzanalyse immer noch erforderlich, um die genaue Position der Basenveränderung zu lokalisieren.
Eine große Anzahl von anderen Techniken wurden entwickelt, um bekannte Sequenzvarianten oder Single Nucleotide Polymorphismen zu analysieren. Die Automatisierung und Wirtschaftlichkeit und sehr wichtige Überlegungen für diese Typen von Analysen, die zum Screening von Individuen und der allgemeinen Population angewendet werden können. Mutationen können über ihre destabilisierenden Effekte auf die Hybridisierung von kurzen Oligonukleotidsonden an eine Zielsequenz identifiziert werden (siehe Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26: 227, 1991). Im allgemeinen, schließt diese Technik, Allel-spezifische Oligonukleotidhybridisierung, die Amplifikation von Zielsequenzen ein, und die anschließende Hybridisierung mit kurzen Oligonukleotidsonden. Der Oligonukleotid-Ligations-Assay ist eine Erweiterung von PCR-basiertem Screening, der einen ELISAbasierten Assay verwendet (OLA, Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8923, 1990), um die PCR-Produkte nachzuweisen, die Zielsequenz enthalten. Daher werden sowohl Gelelektrophorese und Koloniehybridisierung beseitigt.
Wie oben angegeben stellt die CMST-Technologie ebenfalls eine breite Vielzahl von Verfahren zur Verfügung, wo die abspaltbaren Marker und/oder Linker anstelle von herkömmlichen Markierungen (z. B. radioaktiv, Fluoreszenz oder enzymatisch) verwendet werden können, um die Spezifität, Sensitivität oder Zahl von Proben, die gleichzeitig analysiert werden können, innerhalb eines bestimmten Verfahrens zu erhöhen. Repräsentative Beispiele von solchen Verfahren, die verbessert werden können, schließen zum Beispiel Standard-Nukleinsäurehybridisierungsreaktionen (siehe Sambrook et al., supra), diagnostische Reaktionen wie zum Beispiel die Cycling-Probe-Technology (CPT) (siehe U.S.-Patente Nrn. 4,876,187 und 5,011,769) oder Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) (Burket et al., Science 196: 180, 1987).
Die CMST-Technologie, kombiniert mit Hybridisierung kann für die Forensik verwendet werden. Die DNA-Analyse ermöglicht leicht die Ableitung von Verwandtschaft zwischen Individuen, wie es bei Vaterschaftstests erforderlich ist. Die genetische Analyse hat sich als sehr brauchbar bei der Knochenmarkstransplantation erwiesen, wo es erforderlich ist zwischen engen Verwandten Donor- und Empfängerzellen zu unterscheiden. Zwei Typen von Sonden sind nun für DNA-Fingerprinting und -Typisierung in Gebrauch. Polymorphe Minisatelliten-DNA-Sonden identifizieren multiple DNA-Sequenzen, die jeweils in variablen Formen in verschiedenen Individuen vorhanden sind, wodurch Muster erzeugt werden, die komplex und zwischen den Individuen hoch variabel sind. VNTR-Sonden identifizieren einzelne Sequenzen in einem Genom, jedoch können diese Sequenzen in bis zu 30 verschiedene Formen in der menschlichen Population vorhanden sein, wie durch die Größe der identifizierten Fragmente unterschieden (Bennett und Todd, 1996, Ann. Rev. Genetics, 30, S. 343–70).
Tumordiagnose und -Phasenbestimmung (Goodfellow und Wells, 1995, J. Natl. Cancer Inst., 87, S. 1515–23) ist eine weitere Anwendung der CMST-Technologie-Plattform. Der Nachweis von Onkogenen und deren jeweiligen Polymorphismen ist ein wichtiges Feld der Nukleinsäurediagnose. Die zellulären Onkogene können durch spezifische Modifikationen, wie zum Beispiel Punktmutationen, aktiviert werden (wie bei dem c-K-ras-Onkogen in Blasenkarzinom und in colorektalen Tumoren), Promotor-Induktion, Gen-Amplifikation (wie in dem N-myc-Onkogen im Fall von Neuroblastom) oder der Neuanordnung von Chromosomen (wie bei der Translokation des c-abl-Onkogens von Chromosom 9 zu Chromosom 22 im Fall von chronischer Myeloid-Leukämie). Die CMST-Technologie kann auch für die Transplantationsanalyse, Genomdiagnose (4% aller Neugeborenen werden mit genetischen Defekten geboren) angewendet werden. Von den 3.500 beschriebenen Erbkrankheiten, die durch die Modifikation von nur einem einzelnen Gen verursacht werden, sind die primären molekularen Effekte nur für ungefähr 400 bekannt. Die Verwendung von DNA-Sonden mit abspaltbaren Markern kann dazu verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Mikroorganismen in jedem Typ von Probe oder Spezimen nachzuweisen.
Die CMST-Technologie-Plattform kann mit verschiedenen größenabhängigen Techniken gekoppelt werden. Kapillarelektrophorese (CE) in ihren verschiedenen Ausführungen (freie Lösung, Isotachophorese, isoelektrische Fokussierung, Polyacrylamidgel, mizellare Elektrokinetik "Chromatographie") entwickelt sich als ein Verfahren für schnelle hochauflösende Abtrennungen von sehr kleinen Probenvolumen von komplexen Gemischen. In Kombination mit der inhärenten Aktivität und Selektivität von MS, ist CE-MS eine potentiell leistungsfähige Technik für die Bioanalyse. In der hier beschriebenen neuen Anwendung könnte die Überlappung dieser zwei Verfahren zu überlegenen DNA-Sequenzierungsverfahren führen, die die augenblickliche Rate-Verfahren der Sequenzierung um mehrere Größenordnungen übersteigt.
Die Korrespondenz zwischen CE und Elektrosprayionisierung-(ESI)-Flußraten und die Tatsache, daß beide durch (und primär verwendet werden für) ionische Spezies in Lösung unterstützt werden, stellt die Base für eine extrem attraktive Kombination zur Verfügung. Die Kombination von sowohl Kapillarzonenelektrophorese (CZE) und Kapillarisotachophorese mit Quadrapolmassenspektrometer, basierend auf ESI, wurden beschrieben (Olivares et al., Anal. Chem. 59: 1230, 1987; Smith et al., Anal. Chem. 60: 436, 1988; Loo et al., Anal. Chem. 179: 404, 1989; Edmonds et al., J. Chroma. 474:21, 1989; Loo et al., J. Microcolumn Sep. 1: 223, 1989; Lee et al.; J. Chromatog. 458: 313, 1988; Smith et al., J. Chromatog. 480: 211, 1989; Grese et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2835, 1989).
Das wirksamste Abtrennverfahren für DNA-Fragmente ist Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), im allgemeinen in einem Scheibengelformat. Jedoch ist die hauptsächliche Begrenzung der augenblicklichen Technologie die relativ lange Zeit, die erforderlich ist, um die Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten durchzuführen, die in den Sequenzreaktionen produziert wurden. Eine Erhöhung um eine Größenordnung (10-fach) kann mit der Verwendung von Kapillarelektrophorese eneicht werden, die ultradünne Gele verwendet. In Polyacrylamidgelen werden DNA-Fragmente gesiebt und wandern als eine Funktion der Länge und dieser Ansatz wurde nun auf CE angewendet. Eine bemerkenswerte Plattenzahl pro Meter wurde nun mit kreuz-vernetztem Polyacrylamid (10^–7 Platten pro Meter, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 9660, 1988) eneicht. Solche CE-Säulen, wie bisher beschrieben, können für die DNA-Sequenzierung verwendet werden. Smith und andere (Smith et al., Nuc. Acids. Res. 18: 4417, 1990) haben die parallele Verwendung von vielen Kapillaren vorgeschlagen, um den Durchsatz zu erhöhen. Ebenfalls haben Mathies und Huang (Mathies und Hang, Nature 359: 167, 1992) eine Kapillarelektrophorese eingeführt, in der die Abtrennungen über eine parallele Anordnung von Kapillaren durchgeführt wird, und eine Hochdurchsatz-Sequenzierung gezeigt (Huang et al., Anal. Chem. 64: 967, 1992, Huang et al., Anal. Chem 64: 2149, 1992). Da es keinen Grund gibt, parallele Spesen laufen zu lassen, besteht kein Grund ein Scheibengel zu verwenden. Daher kann man ein Röhrengelformat für das elektrophoretische Abtrennverfahren anwenden. Grossuran (Grossuran et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 9, 1992) hat gezeigt, daß ein beträchtlicher Vorteil erhalten wird, wenn ein Röhrengelformat anstelle eines Scheibengelformats verwendet wird. Dies liegt an der größeren Fähigkeit, Joulewärme in einem Röhrenformat abzuleiten, verglichen mit einem Scheibengel, was zu schnelleren Laufzeiten führt (um 50%) und sehr viel höhere Auflösung von hoch molekular Gewichts-DNA-Fragmenten (größer als 1.000 Nukleotide). Lange Ablesbarkeit ist bei der genomischen Sequenzierung wichtig. Daher weist die Verwendung von abspaltbaren Mackern bei der Sequenzierung den weiteren Vorteil auf, daß es dem Anwender ermöglicht wird, das am meisten effiziente und sensitive DNA-Abtrennverfahren zu verwenden, daß auch die höchste Auflösung besitzt.
Das hinter der Verwendung von mikro-fabrizierten Vonichtungen stehende Konzept ist die Fähigkeit, die Informationsdichte bei der Elektrophorese zu erhöhen, durch Miniaturisierung der Spurendimensionen auf ungefähr 100 Mikrometer. Die elektronische Industrie verwendet routinegemäß Mikro-Fabrikation, um die Schaltkreise mit Merkmalen herzustellen von weniger als einem Mikron Größe. Die augenblickliche Dichte von Kapillaren-Anays ist auf den äußeren Durchmesser der Kapillarenröhre begrenzt. Die Mikro-Fabrikation von Kanälen stellt eine höherer Array-Dichte zur Verfügung. Die Mikro-Fabrikation erlaubt auch physikalische Anordnungen, die mit Glasfasern nicht möglich nicht und koppelt die Kanäle direkt zu anderen Vonichtungen auf einem Chip. Ein paar Vonichtungen wurden auf Microchips für Abtrenntechnologien konstruiert. Ein Gaschromatograph (Teny e al., IEEE Trans. Electron Devic, ED-26: 1880, 1979) und ein Flüssigkeitschromatograph (Manz et al., Sens. Actuators B1: 249, 1990) wurden auf Siliziumchips hergestellt, jedoch wurden diese Vonichtungen nicht weiter verwendet. Verschiedene Gruppen haben die Abtrennung von fluoreszenten Farbstoffen und Aminosäuren auf Mikro-hergestellten Vonichtungen berichtet (Manz et al., J. Chromatography 593: 253, 1992, Effenhauser et al., Anal. Chem. 65:2637, 1993). Vor kurzem haben Woolley und Mathies (Woolley und Mathies, Proc. Natl. Acad. Scci. 91: 11348, 1994) gezeigt, daß Photolithographie und chemisches Ätzen dazu verwendet kann, um eine große Zahl von Abtrennkanälen auf Glassubstraten herzustellen. Diese Kanäle werden mit Hedroxyethylzellulose-(HEC)-Abtrennmatrices gefüllt.
Hybotrope werden in Tests und anderen Verfahren vorteilhaft angewendet, wobei ein markiertes Oligonukleotid an ein komplementäres oder semi-komplementäres (d. h. fast, jedoch nicht genau dieselbe Sequenz, wie das markierte ODN) Nukleinsäurefragment hybridisiert wird. Hybotrope sind genauer beschrieben in zum Beispiel U.S.-Patentanmeldungen Nrn. 60/026,621 (angemeldet 24. September 1996); 08/719,132 (angemeldet 24. September 1996); 08/933,924 (angemeldet 23. September 1997); 09/002,051 (angemeldet 31. Dezember 1997) und PCT Internationale Publikationsnr. WO 98/13527, die alle in ihrer Gesamtheit hier aufgenommen werden.
Die Beobachtung, daß Δ-T_m sich als eine Funktion der Konzentration von Hybotropen nicht verändert, weist wesentliche Brauchbarkeit zur Verwendung in DNA, RNA oder Nukleinsäureamplifikation auf, die auf der Primerverlängerung durch Polymerase basieren (z. B. Polymerasekettenreaktion, siehe U.S.-Patente Nrn. 4,683,195; 4,683,202 und 4,800,159, Cycling Probe Technology, NASBA), Ligation (LCR, Ligationskettenreaktion) und RNA-Amplifikation (siehe Lizardi et al., Bio/Technologe 6: 1197, 1988; Kramer et al., Natrure 339: 401, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35: 1826, 1989; U.S.-Patent Nr. 3,786,600). Die Beobachtung, daß WT (Wildtyp) und MT (Mutanten) 30-mer Oligonukleotide (30 verbundene Nukleotide im Oligonukleotid) auf der Basis von thermischen Schmelzen in 0,5 M LiTCA unterschieden werden kann, erlaubt die Möglichkeit einer wesentlichen Verbesserung bei der Priming-Effizienz in der PCR. In seiner augenblicklichen Anordnung wird der PCR-Puffer eher für die Polymerase aktiviert, als für ein spezifisches Priming gemeint ist, mit der Einführung der Technik wurden Bedingungen entwickelt, die die Performance der Polymerase über die Performance der Spezifität von Priming mit Oligonukleotiden bevorzugen. Daher stellt der PCR-Puffer, wie augenblicklich käuflich erhältlich, keinen hohen Spiegel von Stringenz von Hybridisierung von PCR-Primern zur Verfügung, noch unterstützt er diese.
Käuflich erhältliche PCR-Puffer werden im Hinblick auf das Schmelzverhalten von 24-mer Oligonukleotiden in sowohl den Wildtyp-(WT) und Mutanten-(MT)-Formen untersucht. Alternativ wird das Primen in einer hybotropen Lösung durchgeführt und die Kettenverlängerung wird in einem getrennten Puffer durchgeführt, der die Polymerase unterstützt. Zum Beispiel könnte eine Festphasen-PCR verwendet werden, wobei die feste Phase durch zwei Lösungen hindurch bewegt wird. Ein Primen würde in einiger geeigneten Konzentrationen von LiTCA oder TMATCA auftreten und dann würde die Polymerasekttenreaktion in einem verschiedenen PCR-Puffer stattfinden, der die Polymerase enthält. Es ist auch möglich, die ersten paar Runden in der Amplifikation in einer Hybotrop basierten Hybridisierungslösung durchzuführen und die restlichen Runden in einem normalen PCR-Puffer durchzuführen (im allgemeinen sind nur die ersten paar Runden für die Spezifität wichtig).
Die Verwendung von abasisch modifizierten Oligonukleotiden erhöht auch die Spezifität des Primens in der PCR (siehe, z. B. U.S.-Patentanmeldungen Nrn. 60/026,621 (angemeldet 24. September 1996); 08/719,132 (angemeldet 24. September 1996); 08/933,924 (angemeldet 23. September 1997); 09/002,051 (angemeldet 31. Dezember 1997); und PCT Internationale Publikation Nr. WO 98/13527). Eine in einem Oligonukleotid eingefügte abasische Substitution verringert den HCT um 2,5°C. Zwei Oligonukleotidsonden, die drei abasische Stellen pro 24-mer enthalten, weisen eine HCT-Abnahme um 8°C relativ zu der nicht substituierten Kontrolle auf. Diese Abnahme in der HCT erhöht den Spiegel der Spezifität von Primen in der PCR-Reaktion dramatisch. Dies liegt an der Reduktion von falschen oder Miß-Primen während der ersten 10 Zyklen der PCR. Gemeint ist, daß die Enthalpie der abasischen substituierten Oligonukleotide relativ zu dem nicht substituierten Primer ansteigt, wodurch sich die Spezifität des Primens erhöht. Der Primer ist bevorzugterweise 6 bis 36 Basen lang und enthält 1 bis 6 abasische Stellen. Die abasischen Stellen sind bevorzugterweise 4, 5, 6, 7 oder 8 Nukleotide von einander getrennt und können bis zu 12 zu 24 Nukleotide von einander getrennt sein. Die Substitutionen sind bevorzugterweise am 3'-Ende des Primers gehäuft, um die Spezifität der Primerverlängerung durch Nukleinsäurepolymerasen sicherzustellen.
Weiterhin verringert die Konzentration einer abasischen Stelle in einem PCR-Primer und die Verwendung einer hybotropen Salzlösung, die einen hohen Enthalpiewert für die Primerduplex unterstützt, signifikant die Δ-HTC der Primer-Duplex. Wie oben diskutiert, wenn die Δ-HTC abnimmt, dann steigt der Stringenzfaktor an und ein hochdiskriminatorisches Priming der Polymerasekettenreaktion kann stattfinden. Dies sind Bedingungen, die für Multiplex-PCRs erforderlich sind. Der Ausdruck Multiplex betrtfft die Fähigkeit, mehr als ein Set von Primern in einer PCR-Reaktion zu verwenden und multiple Produkte zu erzeugen, oder die Fähigkeit mehr als eine Zielnukleinsäure pro Set von PCR-Primern zu verwenden. Die Verwendung des Hybotrops Tetramethylammoniumtrichloracetat ist von besonderer Brauchbarkeit, da die Abhängigkeit des G + C-Gehalts auf T_m (Stabilität) neutralisiert wird.
Die beschriebenen hybotropen Lösungen werden dazu verwendet, um die Spezifität des Primens in der PCR zu erhöhen. Es gibt verschiedene Optionen im Hinblick auf einen Mechanismus durch den die Spezifität des Priming Schritts verbessert werden kann. Die erste ist durch die Verwendung eines festen Trägers, an den einer der PCR-Primer (kovalent) angebracht ist. Der feste Träger kann viele Formen annehmen, wie zum Beispiel Perlen, Membranen, usw. Der Priming Schritt kann in dem Hybotropen stattfinden und dann kann der feste Träger gewaschen werden und in einer Lösung bewegt werden, die die Polymerasekettenreaktion unterstützt. Der feste Träger wird dann zurück in das Nesstrope für die Priming Reaktion bewegt und der Zyklus wiederholt. Der Kreislauf des festen Trägers zwischen zwei verschiedenen Lösungen muß nur bis zu einer begrenzten Zahl von Zeiten (1-15 Zyklen) erfolgen, wonach es dem herkömmlichen Amplifikationszyklus in einem standardisiertem PCR-Puffer erlaubt werden kann, fortzuschreiten. Alternativ werden die Zielnukleinsäuren von Interesse zwischen der Priming Lösung und der Polymeraseverlängerungslösung unter der Verwendung elektrischer Felder (d. h. Elektrophorese) hin und her bewegt.
Die Verwendung von Hybotropen und/oder abasischen oder anukleosidischen Oligonukleotidsonden kann dazu verwendet werden, die Spezifität und Effizienz von isothermalen Anwendungen von Polymerasen für die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen zu erhöhen. Die Anwendungen von isothermalen Bedingungen zur Verwendung von Nukleinsäurepolymerasen schließen Nukleinsäuresequenzierung, Genotypisierung, Mutationsnachweis, Oligonukleotid-Ligationsassays, Mutationsnachweis und ähnliches ein.
Ein anderes Verfahren, das dazu verwendet wird, die Spezifität in Hybridisierungsreaktionen zu verbessern, erzeugt Basenfehlpaarungen unter der Verwendung von Basenanaloga um jedes der A-, G-, C- oder T-Nukleotide zu ersetzen. Die Forschung hat gezeigt, daß einige Primer, die eine Basenpaarfehlpaarung enthalten, eine erhöhte Spezifität aufweisen, wenn die Fehlpaarung an präzisen Stellen plaziert wird (siehe Wenham et al., Clinical Chemistry 37: 241, 1991; Newton et al., Nucleic Acids Research 17: 2503, 1989; Ishikawa et al., Human Immunology 42: 315, 1995). Jedoch sind auch Unterschiede von so wenig wie 0,5°C in den Schmelztemperaturen gleichfalls zwischen perfekt passenden Hybriden verbreitet und durch das selbe Hybrid mit einer einzelnen Basenfehlpaarung eingefügt (siehe Tibanyenda et al., European Journal of Biochemistry 139: 19, 1984; Werntges et al., Nucleic Acids Research 14: 3773, 1986). Sogar noch bessere Spezifität wurde zwischen einem und zwei fehlgepaarten Duplices bemerkt, als diese zwischen einer perfekt gepaarten Duplex und der selben Duplex mit einer einzelnen Fehlpaarung beobachtet wurde (siehe Guo et al., Nature Biotechnology 15: 31, 1997). Guo et al. fanden eine ΔTm von 4°C zwischen null und einer Fehlpaarung und eine ΔTm von 13°C zwischen einer und zwei aneinander grenzenden Fehlpaarungen für eine 20-mer Duplex. Jedoch, auch mit zwei Fehlpaarungen gibt es oft immer noch wenig Destabilisierung der Duplex. Diese Unfähigkeit, konsistent zwischen Fehlpaarungen zu unterscheiden, trägt zur fehlenden Spezifität bei PCR bei.
Die Verwendung von mehr als einer Basenfehlpaarung pro Hybridisierung, wobei mindestens ein Nukleotidanalogon verwendet wurde, wurde untersucht (siehe Guo et al., Nature Biotechnology 15: 331, 1997). In diesem Fall besteht die analoge Verbindung aus einer 3-Nitropyrrole-Ersatz der Purin- oder Pyrimidin-Basen. 3-Nitropyrrol hat die Fähigkeit minimale Wasserstoffbrücken mit allen vier Basen auszubilden (sie Nichols et al., Nature 369: 492, 1994; Bergstorm et al., Journal of the Amercan Cheical Society 117: 1201, 1995). Durch Einfügung einer künstlichen Fehlpaarung treten große Unterschiede in den Duplexschmelztemperaturen auf, die von ungefähr 5°C bis 15°C reichen, wobei die größte Differenz auftritt, wenn die Fehlpaarung in der Mitte des 15-mer hybridisierenden Oligos lokalisiert ist. Signifikante Unterschiede in ΔTm treten auf, wenn ein künstliches Nukleotid in eine Duplex eingeführt wird, die bereits eine Basenfehlpaarung enthält, was eine zwei- Fehlpaarungsduplex erzeugt. Das Ausmaß der Destabilisierung hängt von dem Typ von Basenfehlpaarung ab (z. B. G/T) und der Trennung zwischen den beiden Fehlpaarungen. Bei experimenteller Untersuchung reichte das Basenanalogon-Nukleotid von 1 bis 7 Basen von der 3'-Seite der Basenfehlpaarung, die in der Mitte des 15-mers gehalten wurde. Die Unterschiede in ΔTm für die drei verschiedenen Basen-fehlgepaarten 15-Mere reichten von einer 2°C Stabilisierung (nur im Falle der C/T-Fehlpaarung und wenn die Fehlpaarungen aneinander angrenzen), bis zu einer 7°C weiteren Destabilisierung, wobei die maximale Destabilisierung konsistenter weise bei einer 3 oder 4 Basenfehlpaarungstrennung auftrat (siehe Guo et al., Nature Biotechnology 15: 331, 1997).
Wenn zwei künstliche Fehlpaarungen eingefügt werden, beeinflußt die Umgebung der künstlichen Basen das Ausmaß der Destabilisierung stark. Die zwei künstlichen Fehlpaarungen wurden auf der Mitte einer 21-Mer-Duplex zentriert, beginnend mit einem Abstand von 6 Basenpaaren. Die Destabilisierung, oder ΔTm, ist mindestens 12°C verglichen mit der perfekt gepaarten Duplex. Der größte Unterschied von über 20°C tritt auf, wenn die zwei künstlichen Fehlpaarungen 10 Basen von einander beabstandet sind. Dieser Unterschied entspricht einer Helixwindung und zeigt an, daß eine Art von Interaktion zwischen den zwei künstlichen Basen auftritt, die die Stabilität der Duplex verringert.
Experimentell, wenn verwendete PCR-Primer eine oder zwei künstliche Fehlpaarungen zwischen dem Primer und der DNA-Probe enthielten, ergab die PCR Ergebnisse, wie sie für einen perfekt passenden Primer erwartet würden (siehe Gua et al. Nature Biotechnology 15: 331, 1997). Jedoch, wenn der Primer sowohl eine echte und eine künstliche Fehlpaarung enthielt, versagte die PCR dabei, irgendein meßbares Ergebnis zu produzieren. Hingegen produzierten die PCR-Reaktionen mit perfekt passenden und echten Fehlpaarungen alle meßbare Mengen von PCR-Produkt. Die selbe Untersuchung fand ähnliche Ergebnisse, wenn Hybridisierungssonden verwendet wurden: diejenigen mit perfekter Übereinstimmung, echten Fehlpaarungen und künstlichen Fehlpaarungen lagerten sich an, während die Sonden, die künstliche und echte Fehlpaarungen enthielten, dies nicht taten. Diese Untersuchungen zeigten, daß eine größere Spezifität erzeugt wird, wenn künstliche Basenfehlpaarungen in Hybridisierungsreaktionen eingefügt werden, als wenn natürlich auftretende Basenfehlpaarungen auftreten. Diese thermodynamisch weniger stabil als eine perfekt passende Hybridisierungsreaktion und daher ist weniger wahrscheinlich, daß sie ein falsch positives Ergebnis in einem Test oder PCR hervorrufen. Interessanter weise ist jedoch der oben angegebene Unterschied in der thermodynamischen Stabilität für Duplexes, die nur eine künstliche Fehlpaarung enthalten, nicht in der experimentellen Situation manifestiert.
Ein weiteres Mittel zur Hervorrufung der Hybridisierungsunterscheidung ist durch Unterschiede in der Stabilität zwischen Hybridisierungsduplices, die Nicks und Lücken enthalten. In diesen Reaktion werden Duplices aus in Tandem-gestapelten kurzen Oligomeren gebildet, die an einen längeren Strang hybridisieren, die sich entweder kontinuierlich oder nicht-kontinuierlich anlagern, wobei eine Lücke von ein paar Basen zurückgelassen wird. Hybridisierungen, die zu einem Nick führen werden "Stapel-Hybridisierung" unterzogen, wobei ein anderer DNA-Strang über die Nick-Stelle hinweg hybridisiert. Stapel-Hybridisierung tritt nicht auf, wenn Lücken in den nicht-kontinuierlichen Oligomeren vorhanden sind. Das Stapeln hat den Effekt von erhöhter Unterscheidung, wie durch abnehmende Dissozüerungsraten und größere thermodynamische Stabilität nachgewiesen, anders als bei den nicht-kontinuierlichen Gegenspielern (siehe Lane et al., Nucleic Acids Res. 25: 611, 1997). Thermodynamische Messungen zeigen, daß die Unterschiede zwischen der Hybridisierungs-gestapelte Duplices-Standard-freie Energieveränderung (ΔG) und den lückenhaften Duplices 1,4 bis 2,4 kcal/Mol sind. Daher kann eine Unterscheidung bei der Hybridisierung durch die Verwendung von vielen kurzen Sonden ermöglicht werden.
Die meisten der augenblicklich verwendeten Basenmimetika sind das Ergebnis des Streben nach einer universellen Base. Viele verwenden Nitroazol-Basenanaloga und haben eine verringerte Unterscheidung bei der Basenpaarung gezeigt. Eine Serie von Nitroazol-Nukleobasenanaloga wurden in einem Versuch untersucht, zusätzliche Einsicht in die Signifikanz von elektronischer Struktur und heterozyklischer Größe bei der Basenpaarung für die Entwicklung von effektiveren universellen Basen zu erhalten (siehe Bergstrom et al., Nucleic Acids Res. 25: 1935, 1997). In dieser Arbeit wurden die thermodynamischen Eigenschaften der Desoxyribonukleoside von 3-Nitropyrrol, 4-Nitropyrazol, 4-Nitoimidazol und 5-Nitroindol gemessen. Zum Vergleich wurden thermodynamische Messungen auch mit den Desoxyribonukleosiden von Hypoxanthin und Pyrazol sowie einem abasischem Spacer, 1,2-Didesoxyribose durchgeführt. Vier Oligonukleotide wurden für jedes modifizierte Nukleosid synthetisiert, um Duplices zu erhalten, in denen jede der vier natürlichen Basen gegenüber dem Basenmimetikum plaziert war. Alle der analysierten Basenmimetika erwiesen sich als viel weniger stabil als die natürlichen Basenpaarungen (A + T: TM = 65,7°C, C + G: Tm = 70,5°C), wobei die Tms von 35–46°C für 5-Nitroindol bis 18–29°C für die anderen analysierten Nitroazolbasen reichten. Die einzige Ausnahme war 4-Nitroimidazol, gepaart mit dGTP, wobei die Tm 40,9°C war. Bei der Analyse der freien Energie für die Duplexschmelzung wurde von dem 3-Nitropyrrol-Basenmimetikum gefunden, welches die geringste Unterscheidung aufweist, wenn mit jeder der vier natürlich auftretenden Basen gepaart, mit einer gesamten ΔG 0,4 von kcal/Mol. Die nächste am wenigsten unterscheidende Base war 5-Nitroindol mit einem ΔG von 0,8 kcal/Mol. Beide dieser Werte sind weniger als die ΔG von 1,1 kcal/Mol, die zwischen den natürlichen Basenpaarungen von A + T und G + C gefunden wurden. 4-Nitropyrazol zeigen eine leichte Präferenz für Paarung mit A, mit einem ΔG 1 kcal/Mol, die stabiler als die C, G und T freien Energien war. Zuletzt zeigte 4-Nitroimidazol eine hohe Selektivität für Paarung mit G (wie durch ihren hohen Tm-Wert nachgewiesen wurde), aufgrund der Fähigkeit des Imidazol N3 mit dem Desoxyguanosin N1 eine Wasserstoffbrücke auszubilden. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß die oben genannten Werte von den nächsten Basennachbarn des Mimetikums abhängig sind. Weitere Untersuchungen veränderten die nächsten Nachbarn und fanden, daß 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol relative nicht-diskriminatorische Basenpaarungspartner sind.
Von Interesse wurden die Enthalpie- und Entropie-Veränderungen als einander folgend gefunden (d. h. eine große Enthalpie-Veränderung korreliert mit einer großen Entropie-Veränderung), unabhängig vom verwendeten Basenmimetikum, was impliziert, daß die korrelation zwischen ΔS und ΔH unabhängig von der Art der Assoziierung der Basen ist. Was beobachtet wurde war, daß Enthalpie-Veränderungen in den nicht-Wasserstoffbindenden Basenmimetika gefunden wurden. Die geringen Werte für die Entropie- Veränderung reflektiert das größer Ausmaß an Bewegungsfreiheit, das für Basen möglich ist, die nicht in die Duplex durch Wasserstoffbrücken-Interaktionen eingeschlossen sind. Die kleinen Enthalpie-Veränderungen reflektieren Veränderungen in den Wasserstoffbrücken-Interaktionen als eine Ergebnis des Verlust von Wasserstoffbrücken-Interaktionen für die Base gegenüber des Basenmimetikums. Falls eine natürliche Base in der Helix gestapelt verblieb, ohne einen gegenüberliegenden Wasserstoffbrücken-bindenden Partner, dann hat sie die Wasserstoffbrücken-Interaktion mit Wasser verloren, ohne einen neuen Donor-Akzeptor-Partner wiederzuerhalten.
Eine ähnliche Untersuchung, schloß die Untersuchung von azyklischen Nukleosidanaloga mit Carboxamido- oder Nitro-substituierten heterozyklischen Basen ein (siehe Aerschot et al., Nucleic Acids Res. 23: 4363, 1995). Die Verwendung von azyklischen Nukleosiden stattet die Konstrukte mit genug Flexibilität aus, um ein gutes Basenstapeln zu ermöglichen, sowie es den Basenmimetika zu ermöglichen, eine Orientierung zu erreichen, um am besten mit der entsprechenden Base Basenpaarung auszubilden. Die untersuchten heterozyklischen Basen schlossen ein: 4,5-Immidzoldicarboxamid, 4-Nitroimidazol und 5-Nitroindazol. Diese Komplexe wurden gegen azyklisches Hypoxanthin, 1-(2(-Desoxy-(-D-ribofuransosyl)-3-nitropyrrol, 5-Nitroindol, und 2(-Desoxyinosin gemessen. Alle neuen azkylischen Komplexe wiesen Spuren von 7–20°C weniger als diejenigen auf, die für die natürlichen Basen beobachtet wurden. 5-Nitroindol, und 2(-Desoxyinosin gemessen. Alle neuen azkylischen Komplexe wiesen Spuren von 7–20°C weniger als diejenigen auf, die für die natürlichen Basen beobachtet wurden. 5-Nitroindazol, wenn gegen jedes der vier natürlichen Basen gepaart, wie die kleinste Divergenz mit ΔTm nur 2,2°C auf, während das 4-Nitroimidazol einen Unterschied von 8,0°C aufwies, wobei dG signifikant außerhalb der Linie der anderen drei Basen lag, wie oben ähnlich beobachtet wurde. Von den Referenzverbindungen wies Desoxyinosin eine ΔTm von 5,6°C auf, 5-Nitroindol ΔTm war 1,0°C, 1-(2(-Desoxy-(-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol wies eine ΔTm von 5,1°C auf und die ΔTm von azyklischen Hypoxanthin war 4,8°C. Jedoch zeigten alle Basenmimetika ungefähr die selbe Destabilisierung (ΔTm 45°C), wenn in einem Oligo plaziert, das fast ausschließlich aus Adenosinen bestand, mit der Ausnahme von 4-Nitroimidazol und azyklischem Desoxyinosin, die Tms von jeweils 7,0°C und 8,9°C aufwiesen.
Aershot und Mitarbeiter untersuchten auf dem Effekt der Einfigung von mehrfachen Basenmimetika in ein Oligo (siehe Aershot et al., Nucleic Acids Res. 23: 4363, 1995). Insgesamt sanken die Schmelztemperaturen insgesamt ab, jedoch am deutlichsten bei der Einfügung von drei Basenmimetika. Die Nitroindole zeigten jedoch die geringste Menge von Temperaturunterschied.
Ein anderes Basenmimetikum, 1-(2(-Desoxy-(-D-ribofuranosyl)imidazol-4-carboxiamid (Nukleosid 1), ahmt bevorzugterweise dA-, sowie dC-Nukleoside (siehe Johnson et al., Nucleic Acids Res. 25: 559, 1997). Die Fähigkeit für sowohl dA und dC zu substituieren ergibt sich aus der Rotation um die Carböxiamid-/Imidazolbindung sowie der Bindung zwischen dem Imidazol- und Furanose-Ring. Wenn das Imidazol anti gegenüber der Furanose ist und die Carboxiamidgruppe anti zu dem Imidazol ist, ist das einzelne Paar auf dem Sauerstoff und einem der Amid-NH-Wasserstoffe in einer Position, die das NH₂ und N-1 von Adenosin nachahmt. Die Imidazolrotation um die glycosidische Bindung zu der Sinnorientierung plaziert die Amidgruppe in einer Position, die ungefähr den Positionen des NH₂ und N-3 von Cytosin entspricht.
Wenn Nukleosid 1 für jedes natürlich auftretende Nukleosid substituiert wird, erhöht sich die Enthalpie, mit der größten Erhöhung für eine dG-Substitution für die 1-C-Paarung (von ΔH = 74,7 (kcal/Mol)/ ΔG = –16,5 (kcal/Mol) für die G/C-Paarung von ΔH = –45,5 (kcal/Mol)/ΔG –5,8 (kcal/Mol)). Die kleinste Enthalpie-Veränderung tritt für eine dA-Substitution auf (ΔH –72,9 (kcal/Mol)/ ΔG = –15,4 (kcal/Mol) für A/T-Paarung von ΔH = –66,7 (kcal/Mol)/ΔG = –11,7 (kcal/Mol) für die 1-T-Paarung. Entsprechend nimmt die Tm signifikant von 65,7°C und 70,5°C für jeweils die A-T- und C-G-Paare ab auf 46,6°C für die 1-T-Paarung, 43,4°C für 1-G, 27,6°C für 1-A und 14,6°C für 1-C.
Wenn in einer PCR-Reaktion verwendet, werden Nukleosid 1 und sein N-Propylderivat bevorzugterweise als dATP-Analoga inkorporiert (siehe Sala et al., Nucleic Acids Res. 24: 3302, 1996). Jedoch, sobald in ein DNA-Templat inkorporiert, gab ihr mehrdeutiges Wasserstoffbindungspotential eine Miß-Inkorporation jeder der natürlich auftretenden Basen bei Sequenzen von 3 × 10^–2 pro Base pro Amplifikation. Die meisten der Substitutionen (die primär aus G bestanden) waren ein Ergebnis der Rotation um die Carboxyamidgruppe, wenn Teil des Templats. Zwischen 11 bis 15% der Substitutionen lagen an der Rotation der Imidazolgruppe um die glycosidische Bindung. Als Teil eines DNA-Templats wirkte das N-Propylderivat auf die selbe Weise wie 1, trotz seiner Propylgruppe. Diese Untersuchung zeigt, daß während 1 bevorzugterweise als dATP wirkt, es die Fähigkeit in einer PCR-Typ-Umgebung aufweist, sich auch als alle vier natürlich auftretenden Nukleotide zu benehmen. Aus dieser und den oben genannten Untersuchungen ist ersichtlich, daß ein breiter Bereich von Duplex-Stabilität durch Variationen in Basenmimetika und deren Plazierung innerhalb eines Oligonukleotids erhalten werden kann.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder -fragments (oder zum Nachweisen des Vorhandenseins eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls oder -fragments) zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem oder mehreren ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekülen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Nukleinsäuremolekül korrelativ und mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Abtrennen der markierten Moleküle nach Größe, (c) Abspalten der Markierungen von den markierten Molekülen und (d) Nachweisen der Markierungen mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Identität der Nukleinsäuremoleküle daraus.
In einem verwandten Aspekt der. Erfindung werden Verfahren zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren markierter Nukleinsäuresonden mit Target-Nukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung einer markierten Nukleinsäuresonde an eine komplementäre ausgewählte Target-Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen, wobei eine markierte Nukleinsäuresonde mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Verändern der Größe hybridisierter markierter Sonden, nicht-hybridisierter Sonden oder Target-Moleküle oder der Sonden:Target-Hybride, (c) Abtrennen der markierten Sonden nach Größe, (d) Abspalten der Markierungen von den markierten Sonden und (e) Nachweisen der Markierungen mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des ausgewählten Nukleinsäuremoleküls daraus. Diese und andere verwandte Techniken werden detaillierter unten diskutiert.
2. PCR
PCR kann eine gewünschte DNA-Sequenz eines beliebigen Ursprungs (Virus, Bakterium, Pflanze oder Mensch) Hunderte von Millionen mal innerhalb einiger Stunden amplifizieren. PCR ist insbesondere wertvoll, weil die Reaktion hoch-spezifisch, leicht zu automatisieren und zum Amplifizieren kleiner Probenmengen fähig ist. Aus diesen Gründen hat PCR eine große Bedeutung für die klinische Medizin, die Diagnose genetischer Erkrankungen, die forensische Wissenschaft und die Evolutionsbiologie gehabt.
Kurz gesagt ist PCR ein Verfahren, das auf einer spezialisierten Polymerase beruht, die einen komplementären Strang zu einem gegebenen DNA-Strang in einer Mischung synthetisieren kann, die die 4 DNA-Basen und 2 DNA-Fragmente (Primer, jeder etwa 20 Basen lang), die die Target-Sequenz flankieren, enthält. Die Mischung wird erhitzt, um die Stränge aus doppelsträngiger DNA, die die Target-Sequenz enthalten, voneinander, und anschließend abgekühlt, um zu ermöglichen, daß (1) die Primer ihre komplementären Sequenzen auf den voneinander getrennten Strängen finden und sich an sie binden, und (2) daß die Polymerase die Primer zu neuen komplementären Strängen verlängert. Wiederholte Zyklen von Erhitzen und Abkühlen multiplizieren die Target-DNA exponentiell, da jeder neue Doppelstrang sich so auftrennt, daß er zwei Matrizen für eine weitere Synthese wird. In etwa 1 Stunde können 20 PCR-Zyklen das Target um ein Millionenfaches amplifizieren.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen des ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der PCR-Technik zw Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente oder -moleküle während der PCR und Auftrennen der resultierenden Fragmente nach Größe. Der Größenauftrennschritt kann unter Verwendung irgendeiner der hierin beschriebenen Techniken durchgeführt werden, einschließlich z. B. Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC. Die Markierungen werden anschließend von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten und mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen Beispiele für solche Technologien sind hierin beschrieben worden und schließen z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie ein.
3. RNA-Fingerprinting und Differential Display
Wenn die Matrize RNA ist, ist der erste Schritt beim Fingerprinting reverse Transkription. Liang und Pardee (Science 257: 967, 1992) waren die ersten, die ein RNA-Fingerprinting-Protokoll beschrieben haben, das einen Primer für reverse Transkription auf der Basis von Oligo(dT) verwendet, aber mit einem "Anker" aus zwei Basen am 5'-Ende (z. B. Oligo-5'-(dT₁₁)CA-3'). Priming tritt hauptsächlich am 5'-Ende des Poly(rA)-Schwanzes auf und hauptsächlich in Sequenzen, die 5'-UpG-poly(rA)-3' enden, mit einer Selektivität, die sich einer aus 12 polyadenylierten RNAs nähert. Nach reverser Transkription und Denaturierung wird willkürliches Priming auf dem resultierenden ersten Strang aus cDNA durchgeführt. PCR kann jetzt verwendet werden, um einen Fingerprint von Produkten zu erzeugen, die am besten mit den Primern zusammenpassen und die vom 3'-Ende der mRNAs und polyadenylierten heterogenen RNAs abgeleitet werden. Dieses Protokoll ist als "Differential Display" bezeichnet worden.
Alternativ kann ein willkürlicher Primer im ersten Schritt der reversen Transkription verwendet werden, wobei diejenigen für die RNA-internen Regionen ausgewählt werden, die 6-8 Basenmatches mit dem 3'-Ende des Primers haben. Dem folgt willkürliches Priming des resultierenden ersten Stranges aus cDNA mit demselben oder einem unterschiedlichen willkürlichen Primer und anschließend PCR. Dieses besondere Protokoll sampled irgendwo in der RNA, einschließlich offene Leserahmen (Welsh et al., Nuc. Acids. Res. 20: 4965, 1992). Zusätzlich kann es auf RNAs verwendet werden, die nicht polyadenyliert sind, wie etwa viele bakterielle RNAs. Diese Variante von RNA-Fingerprinting durch PCR mit willkürlichem Primer ist RAP-PCR genannt worden.
Wenn Fingerprinting von RNA durch PCR mit willkürlichem Primer auf Proben durchgeführt wird, die aus Zellen, Geweben oder anderem biologischen Material gewonnen sind, die verschiedenen experimentellen Behandlungen unterzogen worden sind oder verschiedene Entwicklungsgeschichten haben, können Unterschiede in der Genexpression zwischen den Proben nachgewiesen werden. Für jede Reaktion wird angenommen, daß dieselbe Anzahl von effektiven PCR-Verdopplungsereignissen auftritt und alle Unterschiede in den anfänglichen Konzentrationen von cDNA-Produkten als ein Verhältnis von Intensitäten im letztendlichen Fingerprint konserviert werden. Es gibt keine sinnvollen Beziehungen zwischen den Intensitäten von Banden innerhalb einer einzigen Spur auf einem Gel, die eine Funktion von Match und Menge sind. Jedoch wird das Verhältnis zwischen Spuren für jede gesamplete RNA konserviert, was ermöglicht, daß differentiell exprimierte RNAs nachgewiesen werden können. Das Verhältnis von Ausgangsmaterialien zwischen Proben wird aufrechterhalten, selbst wenn die Anzahl von Zyklen ausreichend ist, um zu ermöglichen, daß die PCR-Reaktion absättigt. Dies beruht darauf, daß die Anzahl von Verdopplungen, die benötigt wird, um Sättigung zu erreichen, beinahe vollständig durch die invarianten Produkte gesteuert wird, die den Großteil des Fingerprint ausmachen. In dieser Hinsicht ist PCR-Fingerprinting verschieden von herkömmlicher PCR eines einzelnen Produkts, bei der das Verhältnis von Ausgangsmaterialien zwischen Proben nicht konserviert wird, sofern nicht Produkte in der exponentiellen Phase der Amplifikation gesampled werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der Technik des RNA-Fingerprinting zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente. Die Fragmente, die mit PCR oder ähnlichen Amplifikationsschemen erzeugt werden, werden dann anschließend nach Größe getrennt. Der Schritt der Größentrennung kann z. B. jede der hierin beschriebenen Techniken sein, einschließlich z. B. Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC. Die Markierungen werden dann von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen. Repräsentative Beispiele für geeignete Technologien schließen Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie ein. Die relativen Mengen aller gegebenen Nukleinsäurefragmente sind nicht wichtig, aber die Größe der Bande ist informativ, wenn sie mit einer Kontrollprobe in Beziehung gesetzt wird.
4. PCR-Einzelstrankonformationspolymorphismus auf Fluoreszenz-Basis (PCR-SSCP)
Eine Reihe von Verfahren, zusätzlich zum RFLP-Ansatz, sind für die Analyse von Basensubstitutionspolymorphismen verfügbar. Orita et al. haben einen Weg zur Analyse dieser Polymorphismen auf der Basis von Konformationsunterschieden denaturierter DNA entwickelt. Kurz gesagt wird Restriktionsenzymverdau oder PCR verwendet, um relativ kleine DNA-Fragmente zu erzeugen, die anschließend denaturiert und durch Elektrophorese auf nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen aufgetrennt werden. Konformationsunterschiede in den einzelsträngigen DNA-Fragmenten, die aus Basensubstitutionen resultieren, werden durch Elektrophoresemobilitätsverschiebung nachgewiesen. Basenpaarung innerhalb des Strangs schafft Einzelstrangkonformationen, die hoch sequenzspezifisch und in der Elektrophoresemobilität unterschiedlich sind. Nachweisraten in verschiedenen Studien unter Verwendung von herkömmlichem SSCP reichen jedoch von 35% bis nahezu 100%, wobei die höchsten Nachweisraten am häufigsten mehrere unterschiedliche Bedingungen erfordern. Im Prinzip könnte das Verfahren auch verwendet werden, um Polymorphismen auf der Basis kurzer Insertionen oder Deletionen zu analysieren. Dieses Verfahren ist eines der leistungsfähigsten Tools zur Identifizierung von Punktmutationen und -deletionen in DNA (SSCP-PCR, Dean et al., Cell 61: 863, 1990).
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der PCR-SSP-Technik zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente. Die mit PCR erzeugten Fragmente werden dann nach Größe getrennt. Vorzugsweise ist der Größentrennschritt nicht-denaturierend, und die Nukleinsäurefragmente werden vor der Trennmethodik denaturiert. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Markierungen werden anschließend von den abgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie).
5. Didesoxy-Fingerprinting (ddF)
Ein weiteres Verfahren ist beschrieben worden (ddF, Sarkar et al., Genomics 13: 441, 1992), das 100% von Einzelbasenveränderungen im Gen des Humanfaktors IX nachgewiesen hat, wenn getestet in einer retrospektiven und prospektiven Art und Weise. Insgesamt wurden 84 von 84 unterschiedlichen Sequenzveränderungen nachgewiesen, wenn genomische DNA von Patienten mit Haemophilie B analysiert wurde.
Kurz gesagt ist, bei den Anwendungen von Markierungen zum Genotypisieren oder anderen Zwecken, ein Verfahren, das verwendet werden kann, Didesoxy-Fingerprinting. Dieses Verfahren setzt einen Didesoxyterminator in einer Sanger-Sequenzierungsreaktion ein. Das Prinzip des Verfahrens ist wie folgt: Eine Target-Nukleinsäure, die sequenziert werden soll, wird in eine Reaktion gegeben, die einen Didesoxy-Terminator aufweist, der komplementär zu der Base ist, von der bekannt ist, daß sie in der Target-Nukleinsäure mutiert ist. Wenn die Mutation z. B. zu einer A → G-Änderung führt, würde die Reaktion in einer C-Didesoxy-Terminator-Reaktion durchgeführt werden. PCR-Primer werden verwendet, um die interessierende Targetsequenz zu lokalisieren und zu amplifizieren. Wenn die hypothetische Targetsequenz die A → G-Änderung enthält, wird die Größe einer Population von Sequenzen aufgrund des Einbaus eines Didesoxy-Terminators in die amplifizierten Sequenzen verändert. In dieser besonderen Anwendung von Markierungen würde ein Fragment erzeugt werden, das eine vorhersagbare Größe im Fall einer Mutation besäße. Die Markierungen wären an das 5'-Ende der PCR-Primer gebunden und würden eine "Karte" für den Probentyp und den Didesoxy-Terminatortyp liefern. Eine PCR-Amplifikationsreaktion würde stattfinden, die resultierenden Fragmente würden nach Größe mit z. B. HPLC oder PAGE getrennt werden. Am Ende des Trennverfahrens werden die DNA-Fragmente in einem temporären Bezugsrahmen gesammelt, die Markierungen werden abgespalten, und das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Mutation wird durch die Kettenlänge aufgrund frühzeitigen Kettenterminators durch den Einbau eines gegebenen Didesoxy-Terminators bestimmt.
Es ist wichtig anzumerken, daß ddF zu einem Gewinn oder Verlust eines Didesoxy-Terminationssegments und/oder einer Verschiebung der Mobilität wenigstens eines der Terminationssegmente oder -produkte führt. Daher wird bei diesem Verfahren eine Suche nach der Verschiebung von einer Fragmentmobilität vor einem hohen Hintergrund an Fragmenten mit anderer relativer Molekülmasse durchgeführt. Ein Vorteil ist die Vorkenntnis der Länge des Fragmentes, die mit einer gegebenen Mutation assoziiert ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines selektierenden Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der ddF-Technik zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugung einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente, gefolgt von der Trennung auf der Grundlage der Größe. Vorzugsweise ist der Größentrennschritt nicht-denaturierend, und die Nukleinsäurefragmente werden vor der Trennmethodik denaturiert. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Die Markierungen werden anschließend von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie).
6. Restriktionskarten und RFLPs
Restriktionsendonukleasen erkennen kurze DNA-Sequenzen und schneiden DNA-Moleküle an diesen spezifischen Stellen. Einige Restriktionsenzyme (Rare-Cutters) schneiden DNA sehr selten, wodurch eine kleine Anzahl sehr großer Fragmente (mehrere tausend bis eine Million bp) erzeugt werden. Die meisten Enzyme schneiden DNA häufiger, wodurch eine große Anzahl kleiner Fragmente (weniger als einhundert bis mehr als eintausend bp) erzeugt wird. Im Mittel werden Restriktionsenzyme mit 4-Basen-Erkennungsstellen Stücke liefern, die 256 Basen lang sind, 6-Basen-Erkennungsstellen werden Stücke liefern, die 4.000 Basen lang sind, und 8-Basen-Erkennungsstellen werden Stücke liefern, die 64.000 Basen lang sind. Da hunderte von verschiedenen Restriktionsenzymen charakterisiert worden sind, kann DNA in viele verschiedene kleine Fragmente geschnitten werden.
Eine breite Vielfalt von Techniken ist für die Analyse von DNA-Polymorphismen entwickelt worden. Das am weitesten verwendete Verfahren, der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFPL)-Ansatz, kombiniert Restriktionsenzymverdau, Gelelektrophorese, Blotting auf eine Membran und Hybridisierung an eine klonierte DNA-Sonde. Polymorphismen werden als Variationen in den Längen der markierten Fragmente auf den Blots nachgewiesen. Der RFLP-Ansatz kann verwendet werden, um Basensubstitutionen zu analysieren, wenn die Sequenzveränderung in eine Restriktionsenzymstelle fällt, oder um Minisatelliten/(VNTRs) durch Auswahl von Restriktionsenzymen zu analysieren, die außerhalb der Wiederholungseinheiten schneiden. Die Agarosegele liefern üblicherweise nicht die notwendige Auflösung, um Minisatellit/VNTR-Allele zu unterscheiden, die sich um eine einzige Wiederholungseinheit unterscheiden, aber viele der Minisatelliten/VNTRs sind so variabel, daß dennoch hochinformative Marker erhalten werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines selektierenden λlukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der Technik der Restriktionskartierung oder RFLPs bereitgestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente, wobei die erzeugten Fragmente mit Restriktionsenzymenen verdaut werden. Die markierten Fragmente werden erzeugt, indem ein Hybridisierungsschritt der markierten Sonden mit der verdauten Target-Nukleinsäure durchgeführt wird. Der Hybridisierungsschritt kann vor oder nach dem Restriktionsnukleaseverdau stattfinden. Die resultierenden verdauten Nukleinsäurefragmente werden dann nach Größe getrennt. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Die Markierungen werden anschließend von den getrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie).
7. DNA-Fingerprinting
DNA-Fingerprinting umfaßt das Display eines Satzes von DNA-Fragmenten von einer spezifischen DNA-Probe. Eine Vielzahl von DNA-Fingerprintingtechniken sind gegenwärtig verfügbar (Jeffreys et al., Nature 314: 67, 1985; Zabeua und Vos, 1992); "Selective Restriction Fragment Amplification: A General Method for DNA Fingerprinting," European Patent Application 92402629.7; Vos et al., "DNA FINGERPRINTING: A New Technique for DNA Fingerprinting. "Nucl. Acids Res. 23: 4407–4414, 1996; Bates, S. R. E., Knorr, D. A., Weller, J. W., und Ziegele, J. S., "Instrumentation for Automated Molecular Marker Acquisition and Analysis." Kapitel 14, Seiten 239-255, in The Impact of Plant Molecular Genetics, edited by B. W. S. Sobral, veröffentlicht von Birkhauser, 1996.
Daher werden in einer Ausführungsform der Erfindung Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines selektierenden Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der Technik des DNA-Fingerprintings bereitgestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente, gefolgt von Trennung der Fragmente nach Größe. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamid-gelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Die Markierungen werden dann von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie).
Kurz gesagt, basiert DNA-Fingerprinting auf der selektiven PCR-Amplifikation von Restriktionsfragmenten aus einem Gesamtverdau von genomischer DNA: Die Technik schließt drei Schritte ein. 1) Restriktion der DNA-Fragmente und anschließende Ligation von Oligonukleotid-Adaptoren, 2) Die selektive Amplifikation von Sets von Restriktionsfragmenten, 3) Gelanalyse der amplifizierten Fragmente. Die PCR-Amplifikation der Restriktionsfragmente wird durch Verwendung der Adapter- und Restriktionsstellen-Sequenz als Zielstellen für die Primer Anhybridisierung erreicht. Die selektive Amplifikation wird durch die Verwendung von Primern erreicht, die sich in die Restriktionsfragmente hinein erstrecken und nur die Fragmente amplifizieren, in denen die Primerverlängerungen den Nukleotiden entsprechen, die die Restriktionsstellen flankieren.
Dieses Verfahren ergibt daher Sets von Restriktionsfragmenten, die durch eine Vielzahl von Verfahren visualisiert werden können (d. h. PAGE, HPLC oder andere Typen von Spektrometrie), ohne vorheriges Wissen der Nukleotidsequenz. Das Verfahren ermöglicht auch die Co-Amplifikation von großen Zahlen von Restriktionsfragmenten. Die Zahl von Fragmenten ist jedoch abhängig von der Auflösung des Nachweissystems. Typischerweise werden 50–100 Restriktionsfragmente amplifiziert und auf denaturierenden Polyacrylamidgelen nachgewiesen. In der hier beschriebenen Anmeldung wird die Trennung durch HPLC durchgeführt.
Die DNA-Fingerprinting-Technik basiert auf der Amplifikation von Untergruppen von genomischen Restriktionsfragmenten unter der Verwendung von PCR. Die DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten und Doppelstrang-Adapter werden an die Enden der DNA-Fragmente ligiert, um Templat-DNA für die einplifikationsreaktionen zu erzeugen. Die Sequenz der ligierten Adapter und die angrenzenden Restriktionsenzyme (-stellen) dienen als Bindungsstellen für das DNA-Fingerprinting von Primern für die PCR-basierte Amplifikation. Selektive Nukleotide werden am 3'-Ende der PCR-Primer eingeschlossen, die dadurch nur eine DNA-Synthese von einer Untergruppe der Restriktionsstellen primen können. Nur Restriktionsfragmente, in denen die Restriktionsstelle flankierende Nukleotide zu den selektiven Nukleotiden passen, werden amplifiziert werden. Der DNA-Fingerprintprozess ergibt "Fingerprint"-Muster von verschiedenen Fragmentlängen, die charakteristisch und reproduzierbar für einen individuellen Organismus sind. Diese Fingerprints können dazu verwendet werden, sogar sehr eng verwandte Organismen zu unterscheiden, einschließlich nahezu isogener Linien. Die Unterschiede in den Fragmentlängen können auf Basenveränderungen in der Restriktionsstelle oder der Primerverlängerungsstelle oder auf Insertionen oder Deletionen im Körper des DNA-Fragments zurückgeführt werden.
Die Abhängigkeit von dem Wissen um die Sequenz des Zielgenoms wird durch die Verwendung von Adaptoren von bekannter Sequenz eleminiert, die an die Restriktionsfragmente ligiert werden. Die PCR-Primer sind für die bekannten Sequenzen der Adaptoren und der Restriktionsstellen spezifisch. Die Schritte des genetischen Fingerprintingverfahrens sind unten beschrieben.

1) Restriktion und Ligation. Die Restriktionsfragmente von genomischer DNA werden durch Verwendung zweier verschiedener Restriktionsenzymen erzeugt: ein selten schneidendes Enzym (das sechs-Base-erkennende Enzym EcoRI) und ein häufig schneidendes Enzym (das vier-Basen-erkennende Enzym MseI). Drei verschiedene Typen von Fragmenten werden produziert: einige mit EcoRI-Schnitten an beiden Enden, einige MseI-Schnitten an beiden Enden und einige mit einem EcoRI-Schnitt an einem Ende und mit einem MseI-Schnitt am anderen Ende. Doppelsträngige Adaptoren werden dann an die überstehenden Enden der DNA-Fragmente ligiert, was Templat-DNA für die Amplifikation erzeugt. Die Adaptoren sind spezifisch für entweder die EcoRI-Stelle oder die MseI-Stelle. Die Restriktion und Ligation findet in einer einzelnen Reaktion statt. Die Ligation des Adaptors an die verdaute DNA verändert die Restriktionsstelle, um so zu verhindern, daß eine zweite Restriktions stattfindet, nachdem die Ligation stattgefunden hat.
2) Präselektive Amplifikation. Die Sequenzen der Adaptoren und Restriktionsstellen dienen als Primerbindungsstellen für die "präselektive PCR-Amplifikation". Die präselektiven Primer weisen jeder ein "selektives" Nukleotid auf, das das Unterset von Restriktionsfragmenten erkennen wird, die das passenden Nukleotid stromabwärts von der Restriktionsstelle aufweisen. Die primären Produkte der präselektiven PCR sind diejenigen Fragmente, die einen MseI-Schnitt und EcoRI-Schnitt aufweisen und auch das passende interne Nukleotid aufweisen. Die präselektive Amplifikation erreicht eine 16-fache Verringerung der Komplexität des Fragmentgemisches.
3) Selektive Amplifikation mit CMST-markierten Primern. Die Komplexität des PCR-Produkts wird weiter reduziert (256-fach) und Fragmente werden mit einem Set von CMSTs durch Durchführen einer zweiten PCR unter der Verwendung von selektiven Primern, markiert mit CMSTs, markiert. Es ist möglich, aus unter 64 verschiedenen Primerpaaren (die sich aus allen möglichen Kombinationen von acht MseI- und acht EcoRI-Primern ergeben) für die Amplifikation auszuwählen. Jeder dieser Primer besitzt drei selektive Nukleotide. Das erste ist dasselbe, wie das in der präselektiven Amplifikation verwendete, die anderen können jede von den 16 möglichen Kombinationen der vier Nukleotide sein. Nur die Untergruppe von Fragmenten, die passende Nukleotide an allen drei Positionen aufweist, wird zu dieser Phase in der Amplifikation amplifiziert werden.

8. Anwendung spaltbarer Marker auf die Genotypisierung und den Polymorphismus-Nachweis
a. Einführung
Obgleich einige bekannte Human-DNA-Polymorphismen auf Insertionen, Deletionen oder anderen Umordnungen nicht-wiederholter Sequenzen beruhen, beruht die große Mehrzahl auf entweder Einzelbasensubstitutionen oder auf Variationen in der Anzahl von Tandemwiederholungen. Basensubstitutionen sind im menschlichen Genom reichlich vorhanden, wobei sie im Mittel einmal alle 200–500 bp auftreten. Längenvariationen in Blöcken von Tandemwiederholungen sind ebenfalls im Genom üblich, mit wenigstens einigen 10.000 eingestreuten polymorphen Stellen (Laci genannt). Wiederholungslängen für Tandem-Wiederholungs-Polymorphismen reichen von 1 bp in (dA)_n(dT)_n-Sequenzen bis wenigstens 170 bp in α-Satelliten-DNA. Tandem-Wiederholungs-Polymorphismen können in zwei große Gruppen unterteilt werden, die aus Minisatelliten/variable Anzahl von Tandem-Wiederholungen (VNTRs), mit typischen Wiederholungslängen von einigen zehn Basenpaaren und mit einigen 10.000 Gesamtwiederholungseinheiten, und Mikrosatelliten, mit Wiederholungslängen von bis zu 6 bp und mit maximalen Gesamtlängen von etwa 70 bp, bestehen. Die meisten Mikrosatelliten-Polymorphismen, die bisher identifiziert worden sind, haben auf (dC-dA)_n- oder (dG-dT)_n-Dinukleotidwiederholungssequenzen beruht. Die Analyse von Mikrosatelliten-Polymorphismen umfaßt die Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) eines kleinen DNA-Fragments, das einen Block von Wiederholungen enthält, gefolgt von Elektrophorese der amplifizierten DNA auf denaturierendem Polyacrylamidgel. Die PCR-Primer sind komplementär zu einzigartigen Sequenzen, die die Wiederholungsblöcke flankieren. Polyacrylamidgele, anstelle von Agarosegelen, werden traditionellerweise für Mikrosatelliten verwendet, weil die Allele sich in der Größe oft nur um eine einzige Wiederholung unterscheiden.
So werden in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem ausgewählten Targetmolekül, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Moleküle nach Sequenzlänge, (c) Abspalten der Markierung vom markierten Molekül und (d) Nachweisen der Markierung mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.
In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren eines markierten Nukleinsäuremoleküls mit einem ausgewählten Targetmolekül unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung des markierten Moleküls an das Targetmolekül zu ermöglichen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge, (e) Abspalten der Markierung vom markierte Fragment und (d) Nachweisen der Markierung mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.
b. Anwendung spaltbarer Markierungen auf die Genotypisierung
Ein PCR-Ansatz, um Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFPL) zu identifizieren, kombiniert Gelelektrophorese und den Nachweis von Markierungen, die mit spezifischen PCR-Primern assoziiert sind. Im allgemeinen wird ein PCR-Primer eine spezifische Markierung aufweisen. Die Markierung wird daher einen Satz von PCR-Primern repräsentieren und daher eine vorbestimmte DNA-Fragmentlänge. Polymorphismen werden als Variationen in der Länge der markierten Fragmente in einem Gel oder aus einem Gel eluierend nachgewiesen. Polyacrylamidgelelektrophorese wird üblicherweise die notwendige Auflösung liefern, um Minisatellit/VNTR-Allele zu unterscheiden, die sich um eine einzige Wiederholungseinheit unterscheiden. Die Analyse von Mikrosatellitenpolymorphismen umfaßt die Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) eines kleinen DNA-Fragments, das einen Wiederholungsblock enthält, gefolgt von der Elektrophorese der amplifizierten DNA auf denaturierendem Polyacrylamidgel oder gefolgt von der Trennung von DNA-Fragmenten mit HPLC. Die amplifizierte DNA wird unter Verwendung von Primern markiert werden, die spaltbare Markierungen am 5'-Ende des Primers aufweisen. Die Primer werden in die neu synthetisierten Stränge durch Kettenverlängerung eingebaut. Die PCR-Primer sind komplementär zu einzigartigen Sequenzen, die die Wiederholungsblöcke flankieren. Minisatelliten/VNTR-Polymorphismen können ebenfalls amplifiziert werden, weitgehend so wie bei den oben beschriebenen Mikrosatelliten.
Beschreibungen vieler Arten von DNA-Sequenzpolymorphismen haben die grundlegende Basis für das Verständnis der Struktur des menschlichen Genoms geliefert (Botstein et al., Am. J. Human Genetics 32: S. 314, 1980; Donis-Keller, Cell 51: 319, 1987; Weissenbach et al., Nature 359: 794). Die Konstruktion umfangreicher Kopplungskarten-Systeme ist durch die Verwendung dieser DNA-Polymorphismen erleichtert worden und hat ein praktisches Mittel zur Lokalisierung von Krankheitsgenen durch Kopplung geliefert. Mikrosatelliten-Dinukleotidmarker haben sich als sehr leistungsfähige Tools bei der Identifizierung menschlicher Gene erwiesen, bei denen sich gezeigt hat, daß sie Mutationen enthalten und in einigen Fällen Krankheiten verursachen. Genomische Dinukleotidwiederholungen sind hochpolymorph (Weber, 1990, Genomic Analysis, Vol. 1, S. 159–181, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Weber und Wong, 1993, Hum. Mol. Genetics, 2, S. 1123) und können bis zu 24 Allele besitzen. Mikrosatelliten-Dinukleotidwiederholungen können mit PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert werden, die zu den einzigartigen Regionen komplementär sind, die das Dinukleotid umgeben. Im Anschluß an die Amplifikation können mehrere amplifizierte Loci vor einem Größentrennschritt kombiniert (vervielfältigt) werden. Das Verfahren der Anwendung der amplifizierten Mikrosatellitenfragmente auf einen Größentrennschritt und des anschließenden Identifizierens der Größe und daher des Allels ist als Genotypisierung bekannt. Über chromosomenspezifische Marker, die ein hohes Vervielfältigungsniveau erlauben, ist zum Durchführen vollständiger Genomscans fur Kopplungsanalyse berichtet worden (Davies et al., 1994, Nature, 371, S. 130).
Markierungen können mit großer Wirkung beim Genotypisieren mit Mikrosatelliten verwendet werden. Kurz gesagt, werden die PCR-Primer konstruiert, um Markierungen zu tragen, und in einer sorgfältig ausgewählten PCR-Reaktion verwendet, um Di-, Tri- oder Tetranukleotid-Wiederholungen zu amplifizieren. Die Amplifikationsprodukte werden anschließend nach Größe mit Verfahren, wie etwa HPLC oder PAGE getrennt. Die DNA-Fragmente werden anschließend in einer temporären Art und Weise gesammelt, die Markierungen von ihren entsprechenden DNA-Fragmenten abgespalten und die Länge aus einem Vergleich mit internen Standards im Größentrennschritt abgeleitet. Allel-Identifizierung wird aus der Bezugnahme zur Größe der amplifizierten Produkte durchgeführt.
Beim Ansatz mit spaltbaren Markierungen für die Genotypisierung ist es möglich, mehrere Proben in einem einzigen Trennschritt zu kombinieren. Es gibt zwei allgemeine Wege, auf denen dies durchgeführt werden kann. Das erste allgemeine Verfahren für ein Screening mit hohem Durchsatz ist der Nachweis eines einzelnen Polymorphismus in einer großen Gruppe von Individuen. In diesem Szenario wird ein einzelner oder „nested" Satz von PCR-Primern verwendet, und jede Amplifikation wird mit einem DNA-Probentyp pro Reaktion durchgeführt. Die Anzahl von Proben, die im Trennschritt kombiniert werden können, ist proportional zur Anzahl spaltbarer Markierungen, die pro Nachweistechnologie erzeugt werden können (d. h. 400–600 für Massenspektrometrie-Markierungen). Es ist daher möglich, 1 bis mehrere Polymorphismen einer großen Gruppe von Individuen gleichzeitig zu identifizieren. Der zweite Ansatz ist, mehrere Sätze von PCR-Primern zu verwenden, die zahlreiche Polymorphismen auf einer einzigen DNA-Probe identifizieren können (ein Individuum z. B. genotypisieren können). Bei diesem Ansatz werden PCR-Primer in einer einzigen Amplifikationsreaktion kombiniert, die PCR-Produkte unterschiedlicher Länge erzeugt. Jedes Primerpaar oder jeder eingebaute Satz ist durch eine spezifische spaltbare Markierung codiert, was impliziert, daß jedes PCR-Fragment mit einer spezifischen Markierung codiert sein wird. Die Reaktion wird in einem einzigen Trennschritt durchgeführt (siehe unten). Die Anzahl von Proben, die im Trennschritt kombiniert werden können, ist proportional zur Anzahl spaltbarer Markierungen, die pro Nachweistechnologie erzeugt werden können (d. h. 400–600 für Massenspektrometer-Markierungen).
Die Genotypisierung kann auch auf. landwirtschaftliche Proben angewendet werden. Zum Beispiel ermöglicht die Amplifizierter Polymorphismus Längen Polymorphismus (AFLP)-Analyse eine landwirtschaftlich bedeutsame Gruppierung des Keimplasmas. Die Zusammenfassung von QTL-Effekten kann verschiedene Regionen des Genoms ergeben, die konsistent wichtige Determinanten von vielen quantitativen Eigenschaften sind. Die Assoziierung von AFLP- und QTL-Polymorphismen sollte von prädiktiver Brauchbarkeit beim Erstellen von Paarungsgruppen sein. Weiterhin sollte das Wissen im Hinblick auf die genomische Architektw von verwandten und nicht verwandten Keimplasmen in Schlüsselregionen des Genoms eine systematische Trennung auf Basis von Selektionsantworten in verwandten Keimplasmen ermöglichen. Es sollte auch die systematische Introgression von exotischen Keimplasmen erleichtern. Zuletzt sollte eine übergreifende Beschreibung von Keimplasma auf dem molekularen Niveau, gekoppelt mit extensiver QTL-Information, es Züchtern ermöglichen, eine mittlere Performance beizubehalten und gleichzeitig genetische Diversität zu erreichen.
Sobald Werkzeuge für die Routinecharakterisierung zur Verwendung von genetischen Ressourcen erhältlich sind, wird es einen größeren Impetus für die Konservierung von genetischen Ressourcen geben.
Lander und Botstein (Lander, E. S. und D. Botstein, "Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps" Genetics 121: 185–189, 1987, beschrieben die Entwicklung von Gedanken, die zum Abgleich der Mendelschen Theorie der bestimmten Vererbung und der Beobachtung führten, daß viele Marker eine kontinuierliche Variation zeigen. Die Entwicklung von molekularen Markertechnologien wird die Entwicklung von ausreichend dichten Karten ermöglichen, um die Abtrennung von quantitativen Markern zu initiieren. Ein hauptsächlicher Impetus für den QTL-Nachweis ist es, die zugrunde liegenden Determinanten in einem angewandten Züchterkontext zu manipulieren. Parterson et al. "DNA markers in plant improvement" Adv. in Agron. 46: 39–90, 1991; und Dedley, J. W. "Comparison of genetic distance estimators using molecular marker data", Proc. Second Plant Breeding Symposium of the Crop Sci. Soc. Amer. and Amer. Soc. Hort., Corvallis, OR, Amer. Soc. Hort Sci. Alexandria, VA, 1994, stellten alle ausgezeichnete Überblicke über die potentiellen Anwendungen dieser Techniken zur Verfügung. Zum Beispiel kann die Assoziierung von quantitativer Markerexpression mit kartierten Markern als eine Basis für Entscheidungen im Hinblick auf die Manipulation von Züchtungspopulationen, für die molekulare Marker unterstützte Selektion (MMAS) oder zur Entdeckung von wünschenswerten Genen in exotischen Keimplasmen (siehe auch Tanksley et al. "Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable QTLs form unadapted germplasm into elite breeding lines", Theor. Appl. Genet. 92: 191–203, 1996) führen. QTL für einen Bereich von Markern, z. B. Ausbeute, Malzqualität, Winterhärte, und Erkrankungsresistenz, wurden in einer Zahl von Gerste Keimplasmaquellen lokalisiert (zusammengefaßt von Hayes et al., "Barley genome mapping and itsapplicaitons" in P. P. Jauhar (ed.) Methods for Genome Analysis in Plants, CRC Press, Boca Raton, USA, 1996; und Hayes, P. M. et al., "Multiple disease resistance loci and their relationship to agronomic and quality loci in a spring barley population", JQTL, 1996, see http://probe.nalusda.gov:8000/otherdocs/jqtl/index.htm). Diese Berichte, wie diejenigen in anderen Getreidsorten, waren größtenteils beschreibend.
Die genetische Basis dieser QTL, obwohl sie von größerem theoretischem Interesse und signifikanter praktischer Wichtigkeit sind, ist im allgemeinen nicht bekannt. Es wurde vorgeschlagen, daß QTL Konsequenzen von Allelen an Loci sind, wo die Effekte von anderen Allelen auf eine einfache Mendelsche Weise interpretiert werden können. Falls das der Fall wäre, dann sollten sich QTL-Allele in einer additiven Weise verhalten und sie sollten von einem Set von Keimplasma zu einem anderen transferierbar sein. Alternativ können komplexe Typen die Endergebnisse von komplexen Signalwegen sein (siehe z. B. Dawkins, R. "The extended phenotype" Oxford University Press, Oxford. UK, 1982). Falls dem so ist, stellt QTL die Effekte von Allelen dar, die den komplexen Signalweg stören, der in quantitativen Phänotypen gipfelt. In diesem Szenario wäre es einfach, den quantitativen Phänotyp zu verändern (d. h. die Anwesenheit eines nicht wünschenswerten Allels an jedem Punkt in dem Signalweg wäre ausreichend, den Signalweg zum Entgleisen zu bringen), jedoch schwierig den quantitativen Phänotyp zu erhalten (d. h. ein Wirt mit gewünschten Allelen an multiplen Loci würde erforderlich sein, um den quantitativen Phänotyp zu erhalten). Falls dies der Fall wäre, dann wäre die Introgression von QTL-Allelen in nicht verwandtes Keimplasma ein relativer Erfolg- oder Fehlschlagansatz: Keimplasma, das nicht mit der kartierenden Referenz-Population verwandt wäre, könnte gut nicht wünschenswerte Allele an Loci aufweisen, wo vorteilhafte Allele in der kartierenden Referenz-Population fixiert wären.
Die Komplexität der Kontrolle wird möglicherweise mit der untersuchten Eigenschaft varieren. Zuletzt sollte sogar der komplexeste Phänotyp letztendlich auf eine Serie von diskreten, wenn auch hoch interaktiven, Schritten reduzierbar sein. Relativ wenige QTL sind für komplexe Phänotypen nachgewiesen, wie zum Beispiel Ausbeute, Komponenten der Malzqualität und die quantitative Resistenz gegenüber biotischen und abiotischen Stressfaktoren (zusammengefaßt durch Hayes et al., "Barley genome mapping and its applications" in P. P. Jauhar (ed.) Methods of Genome Analysis in Plants: CRC Press, Boca Raton, USA, 1996). In einigen Fällen können Kandidatengene als QTL-Determinanten angegeben werden: Schüttelresistenz als eine Determinante der Ausbeute (Hayes et al., 1993, wie oben) und hydrolytische Enzyme als Determinanten von Malzextrakt (die Menge von löslichen Kohlenhydraten, die als ein Substrat für die Fermentation erhältlich sind) (siehe Hayes, P. M., 1996m, oben). Barley genome mapping: new insights into the malting quality of the world's oldest crop. (siehe, z. B. MBAA 33: 223-225).
In anderen Fällen können bis jetzt keine Kandidatengene als Determinanten von komplexen Phänotypen angegeben werden. Ein Beispiel ist die quantitive adulte Planzenresistenz gegenüber Streifenrost, wobei Resistenz-QTL nicht mit den berichteten Kartenlokationen von Resistenzgenen zusammenfallen, die Muster von Mendelscher Vererbung zeigen (siehe Hayes, P. M. et al., "Multiple disease resistance loci and their relationship to agronomic and quality loci in a spring barley population", JQTL, 1996 und http://probe.nalusda.gov:8000/otherdocs/jqtl/index.htm).
DNA-Niveau-Polymorphismen können auch dazu verwendet werden, Themen der genetischen Diversität zu untersuchen. Genetische Diversität wurde in einer Zahl von Gerste-Keimplasma-Arrays gemessen, unter der Verwendung von Werkzeugen, die von Abstammungsanalyse (siehe, z. B. Eslick, R. F. et al., "Genetic engineering as a key to ater use efficiency", Agric. Meteor. 14: 13–23, 1974), über morphologische Marker (siehe, z. B., Tolbert, D. M. et al., "A diversity analysis of a world collection of barley" Crop. Sci. 19: 789-794, 1979) bis zu molekularen Markern verschiedener Sorten (Melchinger, A. E. et al. "Relationships among European barley germplasm: I. Genetic diversity among winter and spring cultivars revealed by RFLPs" Crop Sci. 34: 1191–1199, 1994; Saghai-Maroof, M. A. et al. "RFLPs in cultivated barley and their application in the evaluation of malting quality cultivars" Hereditas 121: 2129, 1994) reichten. Molekulare Marker sind aus dieser Hinsicht besonders attraktiv, da sie reichlich vorhandene adaptiv neutrale Referenzpunkte zur Verfügung stellen. Im Fall von molekularen Polymorphismen waren die Zeit, die Ressourcen die erforderlich waren, die Daten zu erzeugen, eine Begrenzung.
Die Kopplungs-Karten-Konstruktion ist der erste Schritt in einer systematischen QTL-Analyse. Werkzeuge, wie zum Beispiel die CMST-Technologie-Plattform wie hier bei der Kartierung verwendet beschrieben, sollten auch dazu brauchbar sein es den Züchtern zu ermöglichen, die genetische Diversität auszudehnen ohne den Wert des Arbeits-Keimplasmapools zu verringern. Bis jetzt war nicht ausreichend Information erhältlich, um eine Charakterisierung der Diversität mit den Ergebnissen von QTL-Analysen zu integrieren. Der Schlüssel für solch eine integrative Strategie ist eine Markertechnologie, die schnell und Kosten-effektiv ist und ausreichend Polymophismen über das Genom hinweg zur Verfügung stellt. Die vorliegende Erfindung stellt diesen Schlüssel zur Verfügung.
c. Enzymatischer Mutationsnachweis und die Anwendungen von Markierungen.
In dieser besonderen Anwendung oder diesem besonderen Verfahren werden Fehlpaarungen in Heteroduplices durch enzymatische Spaltung von Fehlpaarungs-Basenpaaren in einer gegebenen Nukleinsäureduplex nachgewiesen. DNA-Sequenzen, die auf das Vorhandensein von einer Mutation getestet werden sollen, werden mit PCR unter Verwendung eines spezifischen Satzes von Primern amplifiziert, die amplifizierten Produkte werden denaturiert und mit denaturierten Bezugsfragmenten vermischt und hybridisiert, was zur Bildung von Heteroduplices führt. Die Heteroduplices werden anschließend mit Enzymen behandelt, die die Duplex erkennen und spalten, wenn eine Fehlpaarung vorhanden ist. Solche Enzyme sind Nuklease S1, Mungobohnen-Nuklease, "Resolvasen", T4-Endonuklease IV, etc.. Im wesentlichen kann jedes Enzym verwendet werden, das Fehlpaarungen in vitro erkennt und die resultierende Fehlpaarung spaltet. Nach Behandlung mit dem geeigneten Enzym werden die Duplices nach Größe mit z. B. HPLC oder PAGE getrennt. Die DNA-Fragmente werden temporär gesammelt. Markierungen werden abgespalten und nachgewiesen. Das Vorhandensein einer Mutation wird durch die Verschiebung der Mobilität des Fragments relativ zu einem Wildtyp-Bezugsfragment nachgewiesen.
d. Anwendungen von Markierungen auf dem Oligonukleotid-Ligationsassay (OLA).
Der Oligonukleotid-Ligationsassay, wie er ursprünglich von Landegren et al. (Landegren et al., Science 241: 487, 1988) beschrieben ist, ist eine nützliche Technik zur Identifizierung von (bekannten) Sequenzen in sehr großen und komplexen Genomen. Das Prinzip der OLA-Reaktion beruht auf der Fähigkeit von Ligase, zwei diagnostische Oligonukleotide kovalent zu verknüpfen, wenn sie benachbart zueinander auf einem gegebenen DNA-Target hybridisieren. Wenn die Sequenzen an der Sondenverbindungsstelle nicht perfekt basengepaart sind, werden die Sonden nicht von der Ligase verknüpft werden. Die Fähigkeit einer thermostabilen Ligase, potentielle Einzelbasenpaarunterschiede zu unterscheiden, wenn sie am 3'-Ende der "stromaufwärtigen" Sonde angeordnet sind, liefert die Möglichkeit zur Einzelbasenpaarauflösung (Barony, PNAS USA 88: 189, 1991). Bei der Anwendung von Markierungen würden die Markierungen an die Sonde gebunden werden, die an das amplifizierte Produkt ligiert wird. Nach Abschluß der OLA werden die Fragmente auf der Grundlage ihrer Größe getrennt, die Markierungen abgespalten und mit Massenspektrometrie nachgewiesen.
e. Sequenzspezifische Amplifikation
PCR-Primer mit einem 3'-Ende, das entweder zu einer Mutanten- oder normalen Oligonukleotidsequenz komplementär ist, können verwendet werden, um das eine oder das andere Allel selektiv zu amplifizieren (Newton et al., Nuc. Acids Res., 17, S. 2503; et al., 1989, Genomics, 5, S. 535; Okayama et al., 1989, J. Lab. Clin. Med., 114, S. 105; Sommer et al., 1989, Mayo Clin. Proc., 64, 1361; Wu et al., PNAS USA, 86, S. 2757). Üblicherweise werden die PCR-Produkte nach der Amplifikation mit PAGE sichtbar gemacht, aber das Prinzip sequenzspezifischer Amplifikation kann auf Festphasenformate angewendet werden.
f. Potentielle Anwendung von Markierungen auf einige Assays auf Amplifikationsbasis.
Genotypisierung von Viren: Eine potentielle Anwendung von Markierungen ist die Genotypisierung oder Identifizierung von Viren durch Hybridisierung mit markierten Sonden. F+-RNA-Coliphagen können z. B. nützliche Kandidaten als Indikatoren für Enteroviruskontamination sein. Genotypisierung mit Nukleinsäurehybridisierungsverfahren ist eine verläßliche, schnelle, einfache und preiswerte Alternative zur Serotypisierung (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7: 1541, 1979). Amplifikationstechniken und Nukleinsäurehybridisierungstechniken sind mit Erfolg verwendet worden, um eine Vielzahl von Mikroorganismen zu klassifizieren, einschließlich E. coli (Feng, Mol. Cell Probes 7: 151, 1993), Rotavirus (Sethabutr et al., J. Med. Virol. 37: 192, 1992), Hepatitis-C-Virus (Stuyver et al., J. Gen Virol. 74: 1093, 1993) und Herpes-simplex-Virus (Matsumoto et al., J. Virol. Methods 40: 119, 1992).
Prognostische Anwendungen von Mutationsanalyse bei Krebserkrankungen: Genetische Veränderungen sind in einer Vielzahl experimenteller Säuger- und Human-Neoplasmen beschrieben worden und stellen die morphologische Grundlage für die Abfolge morphologischer Veränderungen dar, die bei Karzinogenese beobachtet wird (Vogelstein et al., NEJM 319: 525, 1988). In den letzten Jahren, mit dem Aufkommen von molekularbiologischen Techniken, sind Allelverluste auf bestimmten Chromosomen oder Mutation von Tumorsuppressorgenen sowie Mutationen in mehreren Onkogenen (z. B., c-myc, c-jun und die ras-Familie) die am häufigsten untersuchten Einheiten gewesen.
Frühere Arbeiten (Finkelstein et al., Arch Surg. 128: 526, 1993) haben eine Korrelation zwischen spezifischen Typen von Punktmutationen im K-ras-Onkogen und dem Stadium bei Diagnose bei kolorektalem Karzinom identifiziert. Die Ergebnisse legen nahe, daß die Mutationsanalyse wichtige Informationen über Tumoraggressivität liefern könnte, einschließlich dem Muster und der Verteilung von Metastasen. Der prognostische Werte von TP53- und K-ras-2-Mutationsanalyse bei Stufe III-Karzinomen des Colons ist vor kurzem nachgewiesen worden (Pricolo et al., Am. J. Surg. 171: 41, 1996). Es ist daher offensichtlich, daß die Genotypisierung von Tumoren und präkanzerösen Zellen und spezifischer Mutationsnachweis bei Behandlung von Krebserkrankungen bei Menschen zunehmend wichtig werden wird.
9. Einzel-Nukleotid Verlängerungsassay
Die Primerverlängerungstechnik für den Nachweis von Einzelnukleotiden in genomischer DNA wurde erst durch Sokolov 1989 beschrieben (Nucleic Acids Res. 18(12): 3671, 1989). In diesem Artikel beschrieb Sokolov die Einzelnukleotidverlängerung von 30-Meren und 20- Meren, die zu der bekannten Sequenz des zystischen Fibrosegens komplementär waren. Es wurde gezeigt, daß das Verfahren die Fähigkeit aufwies, konekt eine einzelne Nukleotidveränderung innerhalb des Gens zu identifizieren. Das Verfahren basierte auf der Verwendung von radiomarkierten Desoxynukleotiden für ein Markierungsverfahren in dem Einzelnukleotidverlängerungsassay.
Spätere Publikationen beschrieben die Verwendung von Einzelnukleotidverlängerungsassays für genetische Erkrankungen, wie zum Beispiel Hämopholie B (Faktor IX) und das zystische Fibrosegen (siehe, z. B., Kuppuswamy et al., PNAS USA 88: S. 1143–1147, 1991). Kuppuswamy et al. zeigten, daß der Einzelnukleotidverlängerungsassay dazu verwendet werden könnte, um genetische Erkrankungen nachzuweisen, wobei die Anwendung der Nachweis von Hämophilie B (Faktor IX) und das zystische Fibrosegen waren. Wiederum basiert dieses Verfahren auf dem einzelnen Nukleotidprimer, der an eine Sequenz hybridisiert wird, die an einen bekannten Single Nucleotide Polymorphismus angrenzt. Die geprimte genomische DNA wird dann Bedingungen unterzogen, in denen Taq-Polymerase ein ³²P-markiertes dNTP hinzufügen wird, falls die Stelle hinter der Stelle von Interesse komplementär zu dem alpha markierten Reaktionsgemisch ist.
Kürzlich wurden die Parameter des Einzelnukleotidverlängerungsassays im Hinblick auf den quantitativen Bereich, die Variabilität und Multiplex-Analyse genau beschrieben. Daher beschrieben 1996 Greenwood und Burke (Greenwood, A. D. und Burke, D. T. (1996) Genome Research, 6, S. 336–348) genau die Parameter des Einzelnukleotidverlängerungsassays im Hinblick auf den quantitativen Bereich, die Variabilität und die Multiplex-Analyse. RNA diente als ein Templat für die PCR-Amplifikation von einer Sequenz von Interesse, die einen einzel-Base Unterschied zwischen zwei Allelen aufweist. Jedes PCR-erzeugte Templat wird auf die Anwesenheit, Abwesenheit oder relative Menge jedes einzelnen Allels durch Annealen eines Primers analysiert, der eine Base 5' zu dem Polymorphismus liegt und sich um eine markierte Base verlängert (oder eine markierte Base verwendet). Nur wenn die korrekte Base in der Reaktion erhältlich ist, wird ein Einbau am 3'-Ende des Primers auftreten. Die Verlängerungsprodukte werden dann analysiert (herkömmlich durch PAGE).
Daher basiert diese Strategie auf der Genauigkeit der DNA-Polymerase, nur das korrekt gepaarte Nukleotid an das 3'-Ende des Templat-hybridisierten Primers anzufügen. Da nur ein Didesoxy-Terminatornukleotid pro Reaktion hinzugefügt wird, ist dies eine einfache Weise herauszubekommen, welcher Primer in allen vier Typen von dNTPs verlängert wurde.
Daher werden innerhalb eines Aspekts der Erfindung Verfahren zum Nachweis einer einzelnen ausgewählten Nukleotids innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von (a) Hybridisieren in mindestens zwei getrennten Reaktionen einen markierten Primer und ein Zielnukleinsäuremolekül unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, eine Hybridisierung des Primers an das Zielnukleinsäuremolekül zu ermöglichen, wobei jede Reaktion ein Enzym enthält, das einen Nukleotidkettenterminator hinzufügen wird, und einen Nukleinkettenterminator, komplementär zu Adenosin, Cytosin, Guanosin, Thymidin oder Uracil, und wobei jede Reaktion einen verschiedenen Nukleotidkettenterminator enthält, (b) Auftrennen von markierten Primern mittels Größe, (c) Abspalten des Markers von dem markierten Primer und (d) Nachweisen des Markers durch nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie und daraus Nachweisen der Anwesenheit des ausgewählten Nukleotids innerhalb des Nukleinsäuremoleküls.
Wie hier angegeben, kann eine große Vielzahl von Abtrennverfahren verwendet werden, einschließlich, z. B. Flüssigkeitschromatographie-Mitteln, wie zum Beispiel HPLC. Zusätzlich kann eine große Vielzahl von Nachweisverfahren verwendet werden, einschließlich, zum Beispiel, Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Ultraviolett-Spektrometrie oder potentiostatische Amperometrie. Auch können mehrere verschiedene Enzyme verwendet werden (z. B. eine Polymerase) sowie jede der hier zur Verfügung gestellten Markierungen. Innerhalb bestimmter bevorzugter Ausführungsformen weist jeder Primer, der innerhalb einer Reaktion verwendet wird, einen verschiedenen einmaligen Marker auf. Auf diese Weise können multiple Proben (oder multiple Stellen) gleichzeitig auf die Anwesenheit von ausgewählten Nukleotiden hin getestet werden.
Einzelnukleotidtests, so wie diejenigen hier beschrieben, können dazu verwendet werden, um polymorphe Varianten nachzuweisen oder eine biologische Probe auf die Anwesenheit eines spezifischen Nukleotids innerhalb oder nahe einer bekannten Sequenz hin zu untersuchen. Die Zielnukleinsäuremoleküle schließen nicht nur DNA ein (z. B. genomische DNA), sondern auch RNA.
Im allgemeinen schießt dieses Verfahren das Hybridisieren eines Primers an die Ziel-DNA-Sequenz auf solche Weise ein, daß das 3'-Ende des Primers unmittelbar an die Mutation, die nachgewiesen und identifiziert werden soll, angrenzt. Das Verfahren ist ähnlich zu der Sanger Sequenzreaktion, mit der Ausnahme, daß nur das Didesoxynukleotid eines bestimmten Nukleotids zum Reaktionsgemisch hinzugefügt wird. Jedes Didesoxynukleotid wird mit einem einmaligen Marker markiert. Von den vier Reaktionsgemischen wird nur eines einen Didesoxyterminator an die Primersequenz anfügen. Falls die Mutation vorhanden ist, wird sie durch den einmaligen Marker auf dem Didesoxynukleotid nachgewiesen werden und seine Identität etabliert werden. Auch können multiple Mutationen durch Markieren des DNA-Primers mit einem einmaligen Marker gleichzeitig ermittelt werden. Innerhalb eines Aspekts der Erfindung werden Verfahren zur Analyse von Einzelnukleotid-Mutationen aus einer bestimmten biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von Exponieren von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe und Kombinieren der ausgesetzten Nukleinsäuren mit einer oder mehreren ausgewählten Nukleinsäuren, die markiert oder nicht markiert sein können, unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, für die Sonden an die Nukleinsäuren zu hybridisieren, wobei der Marker, falls verwendet, mit einer bestimmten Nukleinsäuresonde korrelativ ist und durch nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist. Die DNA-Fragmente werden in vier getrennten Reaktionen reagiert, die jede einen verschieden markierten Didesoxyterminator enthalten, wobei der Marker mit einem bestimmten Didesoxynukleotid korrelativ ist und durch nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist. Die DNA-Fragmente werden gemäß der Größe durch zum Beispiel Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder, bevorzugterweise, HPLC aufgetrennt. Die Marker werden von den aufgetrennten Fragmenten aufgespalten und durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen. Die nachgewiesenen Marker können mit den bestimmten zu analysierenden DNA-Fragmenten sowie der Identität des Mutanten-Nukleotids korreliert werden.
10. Amplifiziertes Längenpolymorphismus (AFLP)
AFLP wurde als ein hoch sensitives Verfahren für DNA-Fingerprinting entwickelt, das in einer Vielzahl von Gebieten verwendet werden soll, einschließlich Pflanzen- und Tierzucht, medizinische Diagnose, forensische Analyse und mikrobieller Typisierung, nur um ein paar zu nennen (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23: 4407–4414, 1995). Die Stärke von AFLP basiert auf den molekulargenetischen Variationen, die zwischen eng verwandten Spezies, Sorten oder Kulturen bestehen. Diese Variationen in der DNA-Sequenz werden durch die genetische Fingerprint-Technologie ausgenutzt, so daß "Fingerprints" von bestimmten Genotypen routinemäßig erzeugt werden können. Diese "Fingerprints" sind einfache RFLPs, die durch selektive PCR-Amplifikation von DNA-Restriktionsfragmenten visualisiert werden. Kurz gesagt, besteht die genetische Fingerprinting-Technologie aus den folgenden Schritten: genomische DNA wird bis zur Vollständigkeit durch zwei verschiedene Restriktionsenzyme verdaut. Spezifische Doppelstrang-Oligonukleotid-Adaptoren (~25–30 bp) werden an die verdauten DNA-Fragmente ligiert. Zu den Adaptoren homologe Oligonukleotidprimer, die jedoch Verlängerungen an dem 3'-Ende aufweisen, werden dazu verwendet, um ein Unterset der DNA-Fragmente zu amplifizieren (ein Präamplifikationsschritt kann auch durchgeführt werden, wenn diese Verlängerung nur eine Länge von 1 bp aufweist. Die Amplifikation mit dem Primer, der eine 3-Basenpaar Verlängerung aufweist, würde folgen.) Diese Verlängerungen können in ihrer Länge von einem bis drei Basenpaare variieren, sind jedoch für einen bestimmten Primer von definierter Länge. Die Sequenz der Verlängerung kann auch von einem Primer zu einem anderen variieren, ist jedoch für einen bestimmten Primer von definierter Länge. Die Sequenz der Verlängerung kann auch von einem Primer zum anderen variieren, ist jedoch innerhalb eines Primers von einer einzelnen, definierten Sequenz. Die selektive Natur der AFLP-PCR basiert auf den 3'-Verlängerungen an den Oligonukleotid- Primern. Da diese Verlängerungen nicht homolog zu der Adaptersequenz sind, werden nur DNA-Fragmente amplifiziert werden, die komplementär zu den Verlängerungen sind, aufgrund der Unfähigkeit der Taq-DNA-Polymerase, anders als einige andere DNA-Polymerasen, DNAs zu verlängern, falls eine Fehlpaarung am 3'-Ende eines Moleküls auftritt, das synthetisiert wird. Daher wird in jeder Reaktion nur eine Untergruppe des gesamten Genoms amplifiziert. Zum Beispiel, falls zwei Basenpaar (bp)-Verlängerungen verwendet werden, wird nur eines in 256 Molekülen amplifiziert. Um die Zahl von Fragmenten weiter zu begrenzen, die wirklich visualisiert werden (so daß eine handhabbare Zahl beobachtet wird), wird nur eine dieser Primer markiert. Zuletzt werden die amplifizierten DNAs auf einem Polyacrylamidgel (Sequenziertyp) aufgetrennt und ein Autoradiogramm oder Phosphorimage wird erzeugt.
Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt oder zum Nachweis eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in, z. B. einer biologischen Probe, wobei die Technik des genetischen Fingerprinting verwendet wird. Kurz gesagt, umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte von Verdauen (z. B. genomischer DNA) bis zur Vollständigkeit durch zwei verschiedene Restriktionsenzyme. Spezifische Doppelstrang-Oligonukleotid-Adapter (~25–30 bp) werden an die verdauten DNA-Fragmente ligiert. Gegebenenfalls kann ein Präamplifikation unter der Verwendung von Primern mit einer 1 bp Verlängerung durchgeführt werden. Das PCR-Produkt wird dann verdünnt und markierte Primer, die homolog zu den Adaptern sind, jedoch Verlängerungen an dem 3'-Ende aufweisen, werden dazu verwendet, durch PCR eine Untergruppe der DNA-Fragmente zu amplifizieren. Die sich ergebenden PCR-Produkte werden dann in ihrer Größe nach aufgetrennt. Der Größentrennschritt kann dann durch eine Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden, einschließlich, z. B. HPLC. Die Marker werden dann von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten und durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen.
11. Genexpressionsanalyse
Eine der hier beschrieben Erfindung ist ein Hochdurchsatzverfahren zur Messung der Expression von zahlreichen Genen (1–2.000) in einer einzigen Messung. Das Verfahren hat auch die Fähigkeit, parallel durchgeführt zu werden mit mehr als 100 Proben pro Verfahren. Das Verfahren ist für Wirkstoffscreening, Entwicklungsbiologie, molekulare medizinische Studien und ähnliches anwendbar. Innerhalb eines Aspekts der Erfindung werden Verfahren zur Verfügung gestellt zur Analyse der Muster von Genexpression aus einer ausgewählten biologischen Probe, umfassend die Schritte von (a) Exponieren von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe, (b) Kombinieren der exponierten Nukleinsäuren mit einer oder mehrerer ausgewählten markierten Nukleinsonden unter Bedingungen und für eine Zeitdauer,, die ausreichend ist, für die Sonden, an den Nukleinsäuren zu hybridisieren, wobei der Marker mit einer bestimmten Nukleinsäuresonde korrelativ ist und nachweisbar durch nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie, (c) Abtrennen von hybridisierten Sonden von nicht-hybridisierten Sonden, (d) Abspalten des Markers von dem markiertem Fragment, (e) Nachweisen des Markers durch nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie und Nachweisen des Muster der Genexpression der biologischen Probe daraus.
Innerhalb einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Tests oder Verfahren zur Verfügung gestellt, die wie folgt beschrieben werden: RNA aus einer Zielquelle wird an einen festen Träger durch einen spezifischen Hybridisierungsschritt gebunden (d. h. Fangen von poly(A) mRNA durch eine gebundene Oligo(dT)-Fangsonde). Der feste Träger wird dann gewaschen und die cDNA wird auf dem festen Träger unter der Verwendung von Standardverfahren (d. h. reverser Transkriptase) synthetisiert. Der RNA-Strang wird dann über Hydrolyse entfernt. Das Ergebnis ist die Erzeugung einer DNA-Population, die kovalent an den festen Träger immobilisiert ist, die die Diversitäts-Häufigkeit und -komplexität der RNA widerspiegelt, aus der die cDNA synthetisiert wurde. Der feste Träger wird dann mit 1 bis mehrere tausend Sonden untersucht (hybridisiert), die komplementär zu einer Gensequenz von Interesse sind. Jeder Sondentyp ist mit einem abspaltbaren Massenspektrometriemarker oder anderem Typ von abspaltbarem Marker markiert. Nach dem Untersuchungsschritt wird überschüssige oder nicht hybridisierte Sonde weggewaschen, der feste Träger wird, zum Beispiel, in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte plaziert und der Massenspektrometriemarker von dem festen Träger abgespalten. Der feste Träger wird aus der Vertiefung des Probenbehälters entfernt und die Inhalte der Vertiefung werden mit einem Massenspektrometer gemessen. Das Auftreten von spezifschen Massenspektrometermarkern zeigt die Anwesenheit von RNA in der Probe an und weist nach, daß ein spezifisches Gen in einer bestimmten biologischen Probe exprimiert wird. Das Verfahren kann auch quantifizierbar sein.
Die Zusammensetzung und Verfahren zur schnellen Messung von Genexpression und der Verwendung von spaltbaren Markern können genau wie folgt beschrieben werden. Kurz gesagt, kann Gewebe (Leber, Muskel, usw.) primäre oder transformierte Zellinien, isolierte oder gereinigte Zelltypen oder jede andere Quelle von biologischem Material, in der die Bestimmung von genetischer Expression brauchbar ist, als eine Quelle von RNA verwendet werden. In den bevorzugten Verfahren wird das biologische Quellenmaterial in der Anwesenheit eines Chaotrops lysiert, um Nukleasen und Proteasen zu unterdrücken und die stringente Hybridisierung von Zielnukleinsäure an den festen Träger zu unterstützen. Gewebe, Zellen und biologische Quellen können effektiv in 1 bis 6 molar chaotropischen Salzen (Guanidinhydrochlorid, Guanidinthocyanat, Natriumperchlorat, usw.) lysiert werden. Nachdem die quellen-biologische Probe lysiert ist, wird die Lösung mit einem festen Träger gemischt, um ein Fange von Zielnukleinsäure zu bewirken, die in dem Lysat vorhanden ist. In einer Permutation des Verfahrens wird RNA unter der Verwendung einer gebundenen Oligo(dT)-Fangprobe gefangen. Feste Träger können Nylonperlen, Polystyrolmikroperlen, Glasperlen und Glasoberflächen oder jeden anderen Typ von festem Träger einschließen, an den Oligonukleotide kovalent angebracht werden können. Die festen Träger sind bevorzugterweise mit einem Amin-Polymer, wie zum Beispiel Polyethylen(imin), Acrylamid, Amin-Dendrimeren, usw. beschichtet. Die Amine der Polymere werden dazu verwendet, um kovalent Oligonukleotide zu immobilisieren. Die Oligonukleotide werden bevorzugterweise mit einem 5'-Amin synthetisiert (im allgemeinen ein Hexylamin, das einen 6-Kohlenstoff-Spacer-Arm und ein distales Amin einschließt). Die Oligonukleotide können 15 bis 50 Nukleotide in der Länge betragen. Die Oligonukleotide werden durch homo-bifunktionelle oder hetero-bifunktionelle kreuz-vernetzende Reagenzien, wie zum Beispiel Cyanurchlorid, aktiviert. Die aktivierten Oligonukleotide werden dann von einem überschüssigen kreuzvernetzendem Reagenz (z. B. Cyanurchlorid) durch Ausschlußchromatographie gereinigt. Das aktivierte Oligonukleotid wird dann mit den festen Trägern gemischt, um eine kovalente Anbindung zu bewirken. Nach der kovalenten Anbringung der Oligonukleotide werden die nicht reagierten Amine des festen Trägers maskiert (d. h. mit Succinianhydrid), um die positive Ladung auf dem festen Träger zu eliminieren. Die festen Träger können parallel verwendet werden und sind bevorzugterweise in einem 96-Vertiefungen- oder 384-Vertiefungen-Format konfiguriert. Die festen Träger können an Zapfen, Stämmchen oder Stäben in einer 96-Vertiefungen- oder 384-Vertiefungen-Konfiguration angebracht werden, wobei die festen Träger entweder ablösbar oder, alternativ, integral mit der besonderen Konfiguration sind. Die besondere Konfiguration des festen Träger ist für die Funktion des Assays nicht von kritischer Wichtigkeit, sondern beeinflußt eher die Fähigkeit des Tests, an eine Automatisierung angepaßt zu werden. Die festen Träger werden mit dem Lysat für 15 Minuten bis mehrere Stunden gemischt, um ein Fangen der Zielnukleinsäure auf dem festen Träger zu bewirken. Im allgemeinen geschieht das "Fangen" der Zielnukleinsäure durch komplementäre Basenpaarung von Ziel-RNA und der auf dem festen Träger immobilisierten Fangsonde. Eine Permutation verwendet den 3'-Poly(A)-Schwanz, der an den meisten eukaryontischen Messenger-RNAs gefunden wird, um an ein immobilisiertes Oligo(dT) auf dem festen Träger zu hybridisieren. Eine andere Permutation ist es, ein spezifisches Oligonukleotid zu verwenden oder lange Sonden (länger als 50 Basen), um eine RNA zu fangen, die eine definierte Sequenz enthält. Eine andere Möglichkeit ist es, degenerierte Primer (Oligonukleotide) zu verwenden, was das Fangen von zahlreichen verwandten Sequenzen in der Ziel-RNA-Population bewirken würde. Die Sequenzkomplexität der RNA-Population und der Typ von verwendeter Fangsonde bestimmen die Hybridisierungszeiten. Die Hybridisierungstemperaturen werden durch den Typ von verwendetem Chaotrop und der finalen Konzentration von Chaotrop diktiert (siehe Van Ness und Chen, Nuc. Acids Res. 1991, für allgemeine Anweisungen). Das Lysat wird bevorzugterweise kontinuierlich mit dem festen Träger bewegt, um eine Diffusion der Ziel-RNA zu bewirken. Sobald der Schritt des Fangens der Zielnukleinsäure vervollständigt ist, wird das Lysat vom festen Träger gewaschen und alle Chaotrope oder Hybridisierungslösung wird entfernt. Der feste Träger wird bevorzugterweise mit Lösungen gewaschen, die ionische oder nicht-ionische Detergenzien, Puffer und Salze enthalten. Der nächste Schritt ist die Synthese von DNA, die komplementär zu der gefangenen RNA ist. In diesem Schritt dient das befestigte Fangoligonukleotid als der Verlängerungsprimer für die reverse Transkriptase. Die Reaktion wird im allgemeinen bei 25–37°C durchgeführt und im allgemeinen während der Polymerisierungsreaktion geschüttelt. Nachdem die cDNA synthetisiert ist, wird sie kovalent an den festen Träger angebracht, da das Fangoligonukleotid als der Verlängerungsprimer dient. Die RNA wird dann aus der cDNA-/RNA-Duplex hydrolysiert. Der Schritt kann durch die Verwendung von Hitze durchgeführt werden, der die Duplex denaturiert oder der Verwendung von Base (d. h. 0,1 N NaOH), um die RNA chemisch zu hydrolysieren. Das Schlüsselergebnis an diesem Schritt ist es, die cDNA für die anschließende Hybridisierung mit definierten Sonden erhältlich zu machen. Der feste Träger oder das Set von festen Trägern wird dann weiter gewaschen, um RNA oder RNA-Fragmente zu entfernen. An diesem Punkt enthält der feste Träger eine ungefähre repräsentative Population von cDNA-Molekülen, die die RNA-Population im Hinblick auf Sequenzhäufigkeit, -komplexität und -diversität widerspiegeln. Der nächste Schritt ist es, ausgewählte Sonden an den festen Träger zu hybridisieren, um die Anwesenheit oder Abwesenheit und die relative Häufigkeit von spezifischen cDNA-Sequenzen zu identifizieren. Die Sonden sind bevorzugterweise Oligonukleotide mit einer Länge von 15–50 Nukleotiden. Die Sequenz der Sonden wird durch die Endverwender des Assays bestimmt. Zum Beispiel, falls der Endverwender beabsichtigt, eine Genexpression in einer entzündlichen Antwort in einem Gewebe zu untersuchen, würden die Sonden komplementär zu zahlreichen Cytokin mRNAs, RNAs, die für Enzyme kodieren, die Lipide modulieren, RNAs, die für Faktoren kodieren, die Zellen regulieren, die an einer entzündlichen Antwort beteiligt sind, usw., ausgewählt werden. Sobald ein Set von definierten Sequenzen für die Untersuchung definiert ist, wird jede Sequenz in einer Oligonukleotidsonde hergestellt und jeder Sonde ein spezifischer spaltbarer Marker zugeordnet. Der Marker/die Marker werden dann an die jeweiligen Oligonukleotid(e) angebracht. Das Oligonukleotid/die Oligonukleotide werden an die cDNA auf dem festen Träger unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Nach Vervollständigung des Hybridisierungsschrittes wird der feste Träger gewaschen, um jede nicht-hybridisierte Sonde zu entfernen. Der feste Träger oder das Array von Trägern wird dann erhitzt, um die kovalente Bindung zwischen der cDNA und dem festen Träger zu spalten. Die markierten cDNA-Fragmente werden dann gemäß ihrer Größe durch Gelelektrophorese getrennt (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder bevorzugterweise HPLC. Die Marker werden dann von den DNA-Molekülsonden abgespalten und durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrometrie) nachgewiesen. Jeder vorhandene Marker wird identifiziert und die Anwesenheit (und Häufigkeit) oder Anwesenheit einer exprimierten mRNA wird nachgewiesen.
Ein alternatives Verfahren würde die markierten DNA-Sonden direkt an die befestigten mRNA-Zielmoleküle unter den geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Nach Vervollständigung des Hybridisierungsschrittes wird der feste Träger gewaschen, um jede nicht hybridisierte Probe zu entfernen. Die RNA wird dann aus der DNA-Sonden/RNA-Duplex hydrolysiert. Der Schritt kann durch die Verwendung von Hitze erfolgen, die die Duplex denaturiert oder die Verwendung von Base (d. h. 0,1 N NaOH), um die RNA chemisch zu hydrolysieren. Dieser Schritt wird freie mRNA und ihre entsprechenden DNA-Sonden zurücklassen, die dann durch einen Größenabtrennschritt isoliert werden können, der im allgemeinen aus Gelelektrophorese besteht (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder bevorzugterweise HPLC. Die Marker werden dann von den DNA-Molekülsonden abgespalten und durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen. Jeder vorhandene Marker wird identifiziert und die Anwesenheit (und Häufigkeit) oder Abwesenheit einer exprimierten mRNA wird bestimmt.
Ein bevorzugter Genexpressionstests der vorliegenden Erfindung verwendet markierte Oligonukleotide in Verbindung mit PCR (oder anderen gleichfalls effektiven Techniken), Lambda-Exonuklease, Ultrafiltration und einem internen Standard um quantitative Information über die Genexpression zu erhalten. Dieser bevorzugte Genexpressionsassay und Unterverfahren davon werden als nächstes beschrieben.
a. BESCHREIBUNG DES INTERNEN STANDARDVERFAHRENS
Die PCR ist ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis von kleinen Mengen von DNA oder RNA (durch RT-PCR). Jedoch ist die genaue und präzise Quantifizierung des Ziels schwierig, da die Menge von amplifiziertem Produkt nicht immer proportional zu der Menge von Templat ist. Dies liegt daran, daß PCR eine "Plateau-Phase" erreicht, in der fast die gesamte Menge von amplifiziertem Produkt erhalten wird, unabhängig von der Menge von Templat, nach einer bestimmten Zahl von Zyklen. Die Verwendung eines internen Standards während der PCR hilft dabei, dieses Problem durch Co-Amplifikation von bekannten Mengen eines internen Standardtemplats zu überwinden, wobei das selbe Primerset wie das Zieltemplat verwendet wird. Da beide Template das selbe Set von Primern verwenden, spiegelt das Verhältnis zwischen den Mengen der zwei amplifizierten Produkte das anfängliche Verhältnis zwischen der Menge von Ziel- und dem internen Standardtemplat vor der PCR-Amplifikation wider. Die Menge von Zieltemplat kann dann aus der bekannten Menge des internen Standardtemplats berechnet werden. Das bevorzugte interne Standardtemplat für einen PCR-Test wird sich mit einer identischen Effizienz im Vergleich zu dem Zieltemplat amplifizieren lassen. Identische Primerstellen werden in das interne Standardtemplat eingebaut, um eine Co-Amplifikation sicherzustellen. Die Region zwischen den Primerstellen und dem internen Standardtemplat sind typischerweise von dem Zieltemplat verändert (z. B. Deletion oder Addition von 10–20 Basenpaaren) um die Template durch Gelelektrophorese oder durch Restriktionsenzyme unterscheidbar zu machen. Modifikationen dieses Typs verursachen jedoch Unterschiede in der Amplifikationseffizienz der Template. Typischerweise wird eine Zahl von internen Standardtemplaten hergestellt und getestet, bis eine nahezu identische Amplifikation gefunden wird.
Ein internes Standardassayformat wird unter der Verwendung der CMST-Marker und Hybotropen entwickelt. Hybotrope sind beschrieben in, z. B., U.S.-Anmeldung Nrn. 60/026,621 (angemeldet 24. September 1996); 08/719,132 (angemeldet 24. September 1996); 08/933,924 (angemeldet 23. September 1997); 09/002,051 (angemeldet 31. Dezember 1997); und Internationale Publikation Nr. WO 98/13527, die alle hier in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen sind. Grundsätzlich betrifft Hybotrope jede chemische Substanz, die die Enthalpie einer Nukleinsäureduplex um 20% oder mehr erhöhen kann, wenn mit einer Standardsalzlösung (d. h. 0,165 M NaCl) verglichen. Eine chemische Substanz zeigt hybotrope Eigenschaften, wenn als eine Lösung einer 18 bp Oligonukleotid-Duplex, die 50% G + C ist, eine helikale-coil Transition (HCT) von 15°C oder weniger aufweist. Die HCT ist der Unterschied zwischen den Temperaturen, bei denen 80% und 20% der Duplex einzelsträngig sind. Die Temperatur zur Anlagerung wird dann als diejenige Unterscheidungstemperatur gewählt, die eine Temperatur ist, bei der eine Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird, die eine nachweisbare Unterscheidung zwischen einer fehlgepaarten Duplex und einer perfekt gepaarten Duplex ermöglicht. Ein Bereich von Temperaturen erfüllt diese Kriterien einer Unterscheidungstemperatur.
Da hoch spezifische Hybridisierung. unter der Verwendung von Hybotropen durchgeführt werden kann, kann ein bevorzugtes internes Standardtemplat verwendet werden, das dieselbe Lange aufweist und nur ein Basenpaar unterschiedlich von dem Zieltemplat ist. Dies ist ein bevorzugter interner Standard, da er a priori identisch mit dem Zieltemplat co-amplifizieren wird. Ein bevorzugtes Verfahren des Nachweises dieses Typs von Standard und Zielamplikongemisch ist es, hybotrope Puffer zu verwenden, um ein spezifische Hybridisierung von Amplikon-spezifisch markierten Oligonukleotiden (die bevorzugterweise CMST-markiert sind, d. h. durch Massenspektrometerie nachweisbare Marker aufweisen), an deren jeweilige Amplikons, um die Menge von Amplikon nachzuweisen, wird es Amplikonspezifische Oligonukleotid mit einem einmaligen Massenmarker markiert. Die Amplikon-Quantifizierung wird durch Messen des Massenspektrometriesignals abgeleitet, das mit dem internen Standard und den Zielamplikons assoziiert ist. Eine bekannte Menge von internem Standard wird in eine Probe gegeben, und die Menge von Zielamplikon wird unter der Verwendung der folgenden Gleichung und der Verwendung der Daten bestimmt, die im Anschluß an die Lambda-Exonuklease und Ultrafiltrationsverfahren erhalten werden, die als nächstes beschrieben werden.
Ziel_Massensignal/interner Standard_Massensignal) × interner Standard_Menge = Ziel_Menge
b. BESCHREIBUNG DES LAMBDA EXONUKLEASE VERFAHRENS
Nach Inkubation mit einer DNA-Duplex verdaut Lambda-Exonuklease selektiv einen Strang von einem 5'-phosphoryliertem Ende her, was ein für DNA-Sequenzierung geeignetes einzelsträngiges Templat zurückläßt. Die Lambda-Exonuklease stellt eine einzelsträngige Sequenzierungstemplate her, ohne die Mühe von herkömmlichen biologischen Verfahren oder der Lästigkeit der Optimierung von asymmetrischer PCR. Durch Amplifikation von DNA in der Anwesenheit eines Primers, der ein 5'-terminales Phosphat enthält, kann ein Fachmann einer DNA-Duplex mit einem 5'-phophoryliertem Ende erzeugen. Danach wird das PCR-Produkt entweder durch Fällung oder Gelfiltration gereinigt, um restliche Primer und andere Reaktionskomponenten zu entfernen. Der phosphorylierte Strang der DNA-Duplex wird dann selektiv mit Lambda-Exonuklease verdaut, was ein einzelsträngiges nicht-phosphoryliertes Templat zurückläßt, das für die Sequenzierung geeignet ist. Nach der Hitzeinaktivierung der Lambda-Endonuklease kann die konzentrierte, einzelsträngige DNA direkt zu einer Hybridierungsreaktion hinzugefügt werden, die herkömmliche Techniken anwendet.
c. BESCHREIBUNG DES ULTRAFILTRATIONSVERFAHRENS
Genomische DNA, wie aus weißen Blutzellen geerntet, kann gemäß den Standardverfahren von RNase-Behandlung, Proteinase-K-Verdau und Phenol : Chloroform-Extraktion, gefolgt durch Fällung mit Natriumacetat und Ethanol, gereinigt werden. Die Konzentrationen werden durch Spektrophotometrie bestimmt und Arbeitsverdünnungen von 0,01 μg/μl werden hergestellt. 50 μl der DNA-Proben werden in 96-Vertiefungs-"Mutter"-Platten ausgebracht. "Tochter"-Platten, die für die Amplifikationsreaktion verwendet werden, werden durch transferieren von 1,5 μl von DNA aus der Mutterplatte aus den Vertiefungen von entweder einer 96-Vertiefungsplatte oder 192-Vertiefungsplatte in einer identischen Konfiguration unter der Verwendung von 8-Kanal-Pipetten präpariert. Eine 18 μl Lage von flüssigem Wachs (MJ Research) wird dann hinzugefügt und dann wird diese Platte bei 4 Grad gelagert, wobei sich das Wachs verfestigt, was eine Verdampfung verhindert.
Um die PCR anzusetzen, werden die Tochterplatten entfernt und auf Eis plaziert, um das Wachs festzuhalten. Dieses bildet eine Barriere zwischen der Templat-DNA und anderen Komponenten der Reaktion, bis die Platte in dem Thermal-Cycler plaziert wird und die Reaktion durch Erhitzen während des ersten Zyklus initiiert wird. Die PCR wird in einer Gesamtzahl von 10–50 μl pro Reaktion durchgeführt. Mastermixlösungen werden vorher in Vorratslösungen hergestellt und in Röhrchen aufgeteilt, die alle der Komponenten der PCR, außer den Marker-spezifischen Primern enthalten. Die Hauptzahl der Reaktionen werden mit M13-verlängerten Primern durchgeführt. M13-verlängerte Primer sind eine Modifikation des Standard-PCR-Primerpaars. Die Modifikation ist die Hinzufügung von 17 Nukleotiden an das 5'-Ende des Vorwärtsprimers. Die 17-Nukleotidsequenz ist komplementär zu dem m13-Sequenzierungsprimer und besitzt die Sequenz: 5'-(NH₂)-AGG GTT TTCCCA GTC ACG AC-3'. Die Modifikation erlaubt die Verwendung eines dritten Oligonukleotidprimers in einer PCR-Reaktion. Der dritte Primer ist typischerweise gemäß den hier beschriebenen Verfahren markiert.
Ultrafiltration ist das herkömmliche Verfahren zur Konzentration und Entsalzung von Proteinen. Es ist auch ein effiziente Alternative zur Ethanolfällung von Nukleinsäuren, insbesondere für kleine Mengen und besonders, wenn immer Nukleinsäuren nur gefällt werden, um Lösungsmittel auszuwechseln. Für Proben, die Phosphat oder 10 mM EDTA enthalten, kann die Ultrafiltration eine bemerkenswert zeitsparende Methodologie sein. Herkömmlich erforderten solche Proben die vorhergehende Dialyse, um die Co-Fällung von Salzen mit Nukleinsäuren während der Ethanolfällung zu vermeiden. Zentrifugal- Mikrokonzentratoren entsalzen und konzentrieren Oligonukleotidsonden oder einzelsträngige Amplikons (und Nukleinsäuren) in einem einfachen Schritt.
Microcon® Mikrokonzentratoren sind ideal zur Konzentration von 50–500 μl Proben. Bei der zentrifugalen Ultrafiltration wird die DNA durch die Membran zurückgehalten. Lösungsmittel und Salze passieren und werden entfernt. Eine zweite umgedrehte Zentrifugation von Microcon stellt einen maximalen DNA-Rückerhalt der Sonde oder Nukleinsäure von Interesse sicher. Bei der Konzentration der Oligomerproben ist es wichtig, hohe Salzkonzentrationen zu vermeiden, die eine Bindung von einzelsträngigen Nukleinsäure an Zellulose-basierte Ultrafiltrationsmembranen unterstützen.
Typische Ultrafiltrationsbedingungen sind wie folgt: eine DNA-Lösung (500 μl) wird einem Microcon-30-Konzentrator für 10 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert; eine 500 μl Lösung von Oligonukleotiden in TE-Puffer wird in einer Microcon-3-Einheit für 45 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert. Die Überstände können durch Umdrehen der Vorrichtungen und Zentrifugieren bei 500–1.000 × g für 2 Minuten zurückerhalten werden. Im Gegensatz dazu erfordert Gelelektrophorese Fraktionierung, Elution und Entsalzung des Fragments aus der Gelscheibe. Sie erfordert auch genügend Material, um zu visualisieren, was manchmal schwierig zu erhalten ist, insbesondere im Fall von cDNA. Beide Verfahren (Gelelektrophorese und Dialyse) sind zeitaufwendig und schließen viele Probenverarbeitungsschritte ein.
In einer typischen Hybridisierungsreaktion werden die Sonden in 50–100-fachen molaren Überschoß von DNA-Fragmentkonzentration hinzugefügt. Aus diesem Grund ist es erforderlich, die überschüssige nicht-hybridisierte Sonde zu entfernen. Herkömmliche Verfahren zur Sondenentfernung schließen Gelfiltrationchromatographie oder Gelelektrophorese ein. Die Gelfiltration erfordert, daß viele Fraktionen gesammelt, analysiert, vereinigt und gefällt werden, was für Hochdurchsatzassays nicht anwendbar ist. Jedoch ist die Ultrafiltration eine effektive Alternative für ein schnelles Entfernen von überschüssiger Sonde von PCR-Primern. Bei Amicon's Centricon wegwerfbarem Konzentrator, würde das Reaktionsgemisch durch ein Ultrafiltrationsmembran filtriert, was zu der Entfernung von Puffer und nicht-hybridisierter Sonde oder nicht-verlängerten Primern führt. Die konzentrierten Fragmente werden durch die Membran zurückgehalten. Antreibende Kraft für die Filtration wird durch die Zentrifugation in einem Rotor mit fixiertem Winkel bei 1.000-5.000 g zur Verfügung gestellt. Herkömmliche Verfahren erfordern typischerweise 24 Stunden für die Probenverarbeitung und 2–3 Stunden Arbeitszeit. Bei Centricon benötigen die Proben typischerweise weniger als ein paar Stunden, um diese zu reinigen. Die Probenhandhabung ist minimal und viele Proben können zur selben Zeit verarbeitet werden. Als Referenz siehe Krowczynska, A. M., "Efficient Purification of PCR Products using Ultrafiltration" BioTechniques 13(2): 286–289, 1992.
12. Hybridisierungstechniken
Die erfolgreiche Klonierung und Sequenzierung eines Gens führt zu der Untersuchung seiner Struktur und der Expression dadurch, daß es möglich gemacht wird, das Gen nachzuweisen oder seine mRNA in einem großen Pool von nicht-verwandten DNA- oder RNA-Molekülen. Die Menge von mRNA; die für ein spezifisches Protein in Gewebe kodiert, ist ein wichtiger Parameter für die Aktivität eines Gens und kann signifikant mit der Aktivität von funktionierenden Systemen zusammenhängen. Seine Regulation ist abhängig von der Interaktion von Sequenzen innerhalb des Gens (cis-wirkende Elemente) und Sequenz-spezifischen DNA-bindenden Proteinen (traps-wirkenden Faktoren), die Gewebe-spezifisch aktiviert werden, oder durch Hormone und Second Messenger Systeme.
Verschiedene Techniken zur Analyse eines bestimmten Gens, seine regulatorischen Sequenzen, seiner spezifischen mRNA und der Regulation seiner Expression sind erhältlich, diese schließen Southern- oder Northern-Blot-Analyse und Ribonuklease-(Rnase)-Protection-Assay ein.
Veränderungen in der Nukleotidzusammensetzung eines bestimmten Gens können von großer pathophysiologischer Relevanz sein. Wenn in den nicht-kodierenden Regionen (5'-, 3'-flankierenden Regionen und Intron) lokalisiert, können sie die Regulation der Genexpressioin beeinflussen, was abnormale Aktivierung oder Inhibierung verursacht. Wenn in den kodierenden Regionen des Gens (Exone) lokalisiert, können sie zu Veränderung der Proteinfunktion oder disfunktionellen Proteinen führen. Daher kann eine bestimmte Sequenz innerhalb eines Gens mit einer spezifischen Erkrankung korrelieren und kann als ein Marker der Erkrankung brauchbar sein. Ein primäres Ziel der Forschung im medizinischen Bereich ist es daher, diejenigen genetischen Variationen als diagnostische Tools nachzuweisen und wichtige Informationen für das Verständnis von pathophysiologischen Phänomenen zu erhalten. Das Basisverfahren für die Analyse einer Population im Hinblick auf die Variationen innerhalb eines bestimmten Gens ist DNA-Analyse unter der Verwendung der Southern-Blot-Technik. Kurz gesagt, wird präparierte genomische DNA mit einem Restriktionsenzym (RE) verdaut, was zu einer großen Zahl von DNA-Fragmenten von verschiedenen Längen führt, die durch die Anwesenheit der spezifischen Erkennungsstelle des RE im Genom bestimmt werden. Allele eines bestimmten Gens mit Mutationen innerhalb dieser Restriktionsstelle werden in Fragmente verschiedener Zahl und Länge gespalten werden. Dies wird Restriktionslängenpolymorphismus (RFLP) genannt und kann ein wichtiger diagnostischer Marker mit vielen Anwendungen sein. Das zu analysierende Fragment muß aus dem Pool von DNA-Fragmenten abgetrennt werden und von anderen DNA-Spezies unter der Verwendung einer spezifischen Sonde unterschieden werden. Daher wird die DNA einer elektrophoretischen Fraktionierung unter Verwendung eines Agarosegels unterzogen, gefolgt von Transfer und Fixierung an eine Nylon- oder Nitrozellulosemembran. Die fixierte, Einzelsträngige DNA wird an eine markierte DNA hybridisiert, die komplementär zu der nachzuweisenden DNA ist. Nach Entfernen von nicht-spezifischen Hybridisierungen kann das DNA-Fragment von Interesse gemäß den Sondencharakteristika (Autoradiagraphie oder Phosphorimageanalyse) visualisiert werden.
Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Nukleinsäuremolekül in, zum Beispiel, einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die Techniken ähnlich zu Southern-Blotting verwendet werden. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte von Erzeugen einer Reihe von markierten Nukleinsäurefragmenten, in denen die erzeugten Fragmente mit Restriktionsenzymen verdaut werden. Die markierten Fragmente werden durch Durchführen eines Hybridisierungsschritts der markierten Sonden mit der verdauten Zielnukleinsäure erzeugt. Der Hybridisierungsschritt kann vor oder nach dem Restriktionsnukleaseverdau erfolgen. Die sich ergebenden verdauten Nukleinsäurefragmente werden dann nach ihrer Größe getrennt. Der Größentrennungsschritt kann dann durch zum Beispiel Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder, bevorzugterweise HPLC, erfolgen. Die Marker werden dann von den abgetrennten Fragmenten abgespalten und dann werden die Marker durch die jeweilige Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie).
Die Anwesenheit und Quantifizierung eines spezifischen Gentranskripts und seine Regulierung durch physiologische Parameter können mittels Northern-Blot und RNase-Protection-Assay analysiert werden. Die prinzipielle Basis dieser Verfahren ist die Hybridisierung eines Pools von gesamter zellulären DNA an eine spezifische Sonde. Bei der Northern-Blot-Technik wird Gesamt-RNA eines Gewebes unter der Verwendung eines HPLC- oder LC-Verfahrens fraktioniert, an eine markierte Antisense-RNA (cRNA) hybridisiert, die komplementär zu der nachzuweisenden RNA ist. Durch Anwendung von stringenten Waschbedingungen werden nicht-spezifisch gebundene Moleküle eliminiert. Spezifisch gebundene Moleküle würden anschließend gemäß des Typs von verwendeter Sonde (Massenspektrometrie oder mit einem elektrochemischen Detektor) nachgewiesen. Zusätzlich kann die Spezifität durch Vergleichen der Größe der nachgewiesenen mRNA und der vorhergesagten Länge der mRNA von Interesse kontrolliert werden.
Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Identität eines Ribonukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Ribonukleinsäuremoleküls in, zum Beispiel, einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die Techniken ähnlich zu Northern-Blotting verwendet werden. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte von Erzeugen einer Reihe von markierten RNA-Molekülen durch Durchführen eines Hybridisierungsschrittes der markierten Sonden mit der Ziel-RNA. Die Ziel-RNA-Moleküle werden dann nach ihrer Größe aufgetrennt. Der Größenauftrennungsschritt kann dann, zum Beispiel, bevorzugterweise, HPLC erreicht werden. Die Marker werden dann von den getrennten RNA-Molekülen abgespalten und dann werden die Marker durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen.
Das meisten spezifische Verfahren zum Nachweis einer mRNA-Spezies ist der RNase-Protection-Assay. Kurz gesagt, wird Gesamt-RNA aus einem Gewebe oder einer Zellkultur an eine markierte spezifische mRNA von vollständiger Homologie hybridisiert. Die Spezifität wird durch anschließenden RNase-Verdau erreicht. Nicht-hybridisierte Einzel-strängige RNAs und nicht-spezifisch hybridisierte Fragmente mit sogar kleinen Fehlpaarungen werden erkannt und gespalten, während doppelsträngige RNA von vollständiger Homologie nicht für das Enzym zugänglich ist, und geschützt werden wird. Nach Entfernen der RNase durch Proteinase-K-Verdau und Phenol-Extraktion kann das spezifisch geschützte Fragment von den Abbauprodukten abgetrennt werden, gewöhnlicherweise durch HPLC.
Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Ribonukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Ribonukleinsäuremolekül in, zum Beispiel, einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die Technik des RNase-Protection-Assays verwendet wird. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte von Gesamt-RNA aus einem Gewebe oder einer Zellkultur, die an eine markierte spezifische cRNA von vollständiger Homologie hybridisiert wird, einen RNase-Verdau, Behandlung mit Proteinase K und eine Phenol-Extraktion. Das markierte geschützte RNA-Fragment wird aus den Abbauprodukten isoliert. Der Größenabtrennschritt kann zum Beispiel durch LC oder HPLC erreicht werden. Der Marker wird dann von dem abgetrennten RNA-Molekül abgespalten und wird dann durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen.
13. Mutationsnachweistechniken
Der Nachweis von Erkrankungen ist bei der Vorbeugung und Behandlungen zunehmend von Wichtigkeit. Während es für multifaktorielle Erkrankungen schwierig ist genetische Tests dafür zu entwickeln, werden mehr als 200 bekannte menschliche Erkrankungen durch einen Defekt in einem einzelnen Gen, oft eine Veränderung eines einzelnen Aminosäurerests (Olsen, Biotechnology: An industry comes of age, National Academic Press, 1996) verursacht. Viele dieser Mutationen führen zu einer veränderten Aminosäure, die einen Erkrankungszustand verursacht.
Sensitive Mutationsnachweistechniken bieten außerordentliche Möglichkeiten für Mutationsscreening. Zum Beispiel, können Analysen durchgeführt werden sogar vor der Implantation eines befruchteten Eis (Holding und Monk, Lacet 3: 532, 19889). Erhöhte effiziente genetische Tests können auch ein Screening auf onkogene Mutationen in Zellen ennöglichen, die vom respiratorischen Trakt oder der Blase abgestoßen wurden, in Verbindung mit Vorsorgeuntersuchungen (Sidransky et al., Science 252: 706). Auch sind, wenn ein unbekanntes Gen eine genetische Erkrankung verwsacht, Verfahren zur Überwachung von DNA-Sequenzvarianten brauchbar, um die Vererbung von Erkrankung durch genetische Kopplungsanalyse zu untersuchen. Jedoch verursacht der Nachweis und die Diagnose von Mutationen in einzelnen Genen technische und ökonomische Herausforderungen. Mehrere verschiedene Ansätze wurden verfolgt, jedoch ist keiner sowohl effizient und kostengünstig genug für eine wirklich weit verbreitete Anwendung.
Mutationen, die ein einzelnes Nukleotid einschließen, können in einer Probe durch physikalische, chemische oder enzymatische Mittel identifiziert werden. Im allgemeinen können Verfahren zum Mutationsnachweis in Scan-Techniken eingeteilt werden, die geeignet sind, um vorher unbekannte Mutationen zu identifizieren und Techniken, die so aufgebaut sind, um bekannte Sequenzvarianten nachzuweisen, zu unterscheiden oder zu quantifizieren. Verschiedenen Scan-Techniken für den Mutationsnachweis wurden in Heteroduplices von fehlgepaarten komplementären DNA-Strängen, die von Wildtyp- und Mutantensequenzen abgeleitet waren und ein abnormales Verhalten, insbesondere wenn denaturiert, zeigten, entwickelt. Diese Phänomen wird bei der denaturierenden und Temperaturgradient-Gelelektrophorese-(DGGE und TGGE)-Verfahren ausgenutzt. Duplices, die sogar in einer einzelnen Nukleotidposition fehlgepaart sind, können teilweise denaturieren, was zu einer verzögerten Wanderung führt, wenn in einem ansteigend denaturierenden Gradienten gelelektrophoriert (Myers et al., Nature 313: 495, 1985; Abrades et al., Genomics 7: 463, 1990; Henco et al., Nucl. Acids Res. 18: 6733, 1990). Obwohl Mutationen nachgewiesen werden können, wird keine Information im Hinblick der präzisen Lokalisierung einer Mutation erhalten. Die Mutanten-Formen müssen weiterhin isoliert werden und einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen werden. Alternativ kann RNase A eine Heteroduplex einer RNA-Sonde und eines Zielstranges an einer Position spalten, wo die zwei Stränge nicht genau gepaart sind. Diese Spaltstelle kann dann durch Elektrophorese der denaturierten Probe bestimmt werden. Jedoch können einige Mutationen dem Nachweis entkommen, da nicht alle Fehlpaarungen durch RNase A effizient gespalten werden. Fehlgepaarte Basen in einer Duplex sind ebenfalls gegenüber chemischer Modifikation empfindlich. Solche Modifikationen können die Stränge gegenüber Spaltung an der Stelle der Fehlpaarung empfindlich machen oder dazu führen, daß eine Polymerase in einer anschließenden Verlängerungsreaktion dort stoppt. Die chemische Spalttechnik ermöglicht die Identifizierung einer Mutation in Zielsequenzen von bis zu 2 kb und sie stellt Informationen über die ungefähre Lokalisierung von fehlgepaarten Nukleotiden zur Verfügung (Cotton et al., PNAS LISA 85: 4397, 1988; Ganguly et al., Nucl. Acids Res. 18: 3933, 1991). Jedoch ist diese Technik arbeitsintensiv und kann die präzise Lokalisierung der Mutation vielleicht nicht identifizieren.
Eine alternative Strategie zum Nachweis einer Mutation in einem DNA-Strang ist durch Substituierung (während der Synthese) eines der normalen Nukleotide mit einem modifizierten Nukleotid, wobei das Molekulargewicht oder andere physikalische Parameter des Produkts verändert werden. Ein Strang mit einer erhöhten oder verringerten Zahl dieses modifizierten Nukleotids in Bezug auf die Wildtyp-Sequenz zeigt eine veränderte elektrophoretische Mobilität (Naylor et al., Lancet 337: 636, 1991). Diese Technik weist die Anwesenheit von einer Mutation nach, stellt jedoch nicht die Lokalisierung zur Verfügung.
Zwei andere Strategien visualisieren Mutationen in einem DNA-Fragment durch veränderte Gelmigration. In der Einzel-Strang-Polymorphismustechnik (SSCP), verursachen Mutationen meiner Meinung nach, daß denaturierte Stränge verschiedener Sekundärstrukturen annehmen, wodurch die Mobilität während nativer Gelelektrophorese beeinflußt wird. Heteroduplex-DNA-Moleküle, die interne Fehlpaarungen aufweisen, können auch von korrekt gepaarten Molekülen durch Elektrophorese abgetrennt werden (Orita, Genomics 5: 874, 1989; Keen, Trends Genet. 7: 5, 1991). Wie mit den oben diskutierten Techniken, kann die Anwesenheit einer Mutation bestimmt werden, jedoch nicht Lokalisierung. Genauso können viele dieser Techniken nicht zwischen einer einzelnen und multiplen Mutationen unterscheiden. Alle der oben genannten Techniken zeigen die Anwesenheit einer Mutation in einem begrenzten Segment von DNA an und einige von ihnen ermöglichen die ungefähre Lokalisierung innerhalb des Segments Jedoch ist immer noch Sequenzanalyse erforderlich, um den Effekt der Mutation auf das Kodierungspotential des Fragments zu ermitteln. Sequenzanalyse ist sehr wirksam, was zum Beispiel ein Screening auf die selbe Mutation in anderen Individuen einer beeinträchtigten Familie ermöglicht, wodurch ein Erkrankungsfortschreiten im Falle von maligner Erkrankung beim Nachweis von restlichen malignen Zellen im Knochenmark vor autologer Transplantation verfolgt wird. Trotz dieser Vorteile ist es aufgrund der hohen Aufgaben, die enthalten sind, unwahrscheinlich, daß das Verfahren als ein Routine-diagnostisches Verfahren angenommen werden wird.
Eine große Anzahl von anderen Techniken wurden entwickelt, um bekannte Sequenzvarianten zu analysieren. Die Automatisierung und Wirtschaftlichkeit sind sehr wichtige Überlegungen für diese Typen von Analysen, die für das Screening von Individuen und der allgemeinen Population angewendet werden können. Keine der unten diskutierten Techniken kombiniert Wirtschaftlichkeit und Automatisierung mit der erforderlichen Spezifität.
Mutationen können über ihre destabilisierenden Effekte auf die Hybridisierung von kurzen Oligonukleotidsonden an eine Zielsequenz identifiziert werden (siehe Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227, 1991). Im allgemeinen schließt diese Technik, Allel-spezifische Oligonukleotidhybridisierung, die Amplifikation von Zielsequenzen und anschließende Hybridisierung von kurzen Oligonukleotidsonden ein. Ein amplifiziertes Produkt kann daher auf viele mögliche Sequenzvarianten durch Bestimmen seines Hybridisierungsmusters an Array von immobilisierten Oligonukleotidsonden gescannt werden. Jedoch hängt das Etablieren von Bedingungen, die zwischen einer Zahl von anderen Strategien zur Nukleotidsequenz-Unterscheidung unterscheiden, alle von Enzymen ab, um Sequenzunterschiede zu identifizieren (Saiki, PNAS USA 86: 6230, 1989; Zhang, Nucl. Acids Res. 19: 3929, 1991).
Zum Beispiel erkennen Restriktionsenzyme Sequenzen von ungefähr 4–8 Nukleotiden. Basierend auf einem durchschnittlichen G+C-Gehalt können ungefähr die Hälfte der Nukleotidpositionen in einem DNA-Fragment mit einem Panel mit 100 Restriktionsenzymen überwacht werden. Als eine Alternative können künstliche Restriktionsenzyme-Erkennungssequenzen um eine variable Position herum durch Verwendung von teilweise fehlgepaarten PCR-Primern erzeugt werden. Mit dieser Technik kann entweder die Mutanten oder die Wildtyp-Sequenz allein erkannt werden und durch ein Restriktionsenzym nach Amplifikation gespalten werden (Chen et al., Anal. Biochem. 195: 51, 1991; Levi et al., Cancer Res. 51: 3497, 1991). Ein anderes Verfahren. nutzt die Fähigkeit aus, daß ein Oligonukleotidprimer, der an der 3'-vorletzten Position mit einer Zielsequenz fehlgepaart ist, eine verringerte Kapazität aufweist, als ein Primer in der PCR zu dienen. Jedoch sind einige 3'-Fehlpaarungen, bemerkenswerter weise G-T, weniger inhibitorisch als andere, was dessen Brauchbarkeit begrenzt. In einem Ansatz um dieses Verfahren zu verbessern, werden zusätzliche Fehlpaarungen in dem Primer an der dritten Position von dem 3'-Ende eingefügt. Dieses führt zu zwei fehlgepaarten Positionen in dem 3'-Nukleotiden des Primers, der mit einer allelischen Variante hybridisiert und eine Fehlpaarung in der dritten Position von dem 3'-Ende wenn der Primer an die andere allelische Variante hybridisiert (Newton et al., Nucl. Acids Res. 17: 2503, 1989). Es ist erforderlich, Amplifikationsbedingungen zu definieren, die signifikant die Amplifikation einer 1 bp – Fehlpaarung bevorzugen.
DNA-Polymerasen wurden auch dazu verwendet, um allelische Sequenzvarianten zu unterscheiden, durch Bestimmen welches Nukleotid an den Oligonukleotidprimer angefügt wird, unmittelbar stromaufwärts einer variablen Position in dem Zielstrang.
Ein Ligationsassay wurde entwickelt. In diesem Verfahren werden zwei Oligonukleotidsonden, die in unmittelbarer Nebeneinanderstellung auf einem Zielstrang hybridisieren durch eine DNA-Ligase verbunden. Die Ligation ist inhibiert, falls eine Fehlpaarung auftritt, wo die zwei Oligonukleotidsonden aneinander grenzen.
14. Assays für den Mutationsnachweis
Mutationen sind eine Einzel-Basenpaar-Veränderung in genomischer DNA. Innerhalb des Kontext dieser Erfindung werden die meisten solcher Veränderungen leicht durch Hybridisierung mit Oligonukleotiden nachgewiesen, die zu der fraglichen Sequenz komplementär sind. In dem hier beschriebenen System werden zwei Oligonukleotide verwendet um eine Mutation nachzuweisen. Ein Nukleotid besitzt die Wildtyp-Sequenz und das andere Oligonukleotid besitzt die Mutantensequenz. Wenn die zwei Oligonukleotide als ein Sonden auf einer Wildtyp-zielgenomischen Sequenz verwendet werden, wird das Wildtyp-Oligonukleotid eine perfekt Basen-gepaarte Struktur ausbilden und die Mutanten-Oligonukleotidsequenz wird eine Duplex mit einer Einzelbasepaarfehlpaarung bilden. Wie oben diskutiert – erlaubt eine 6 bis 7°C Differenz in der Tm einer Wildtyp gegenüber einer fehlgepaarten Duplex die leichte Identifizierung und Unterscheidung der zwei Typen von Duplices. Um diese Unterscheidung zu bewirken, wird eine Hybridisierung bei der Tm der fehlgepaarten Duplex in der jeweiligen hybotropen Lösung durchgeführt (siehe, z. B. U.S.-Anmeldung Nrn. 60/026,621 (angemeldet 24. September 1996); 08/719,132 (angemeldet 24. September 1996); 08/933,924 (angemeldet 23. September 1997); 09/002,051 (angemeldet 31. Dezember 1997) und Internationale Publikations-Nr. WO 98/13527, die alle hier in ihrer Gesamtheit für eine Beschreibung von hybotropen Lösungen aufgenommen sind). Das Ausmaß der Hybridisierung wird dann für das Set von Oligonukleotidsonden gemessen. Wenn das Verhältnis des Ausmaßes der Hybridisierung der Wildtyp-Sonde zu der fehlgepaarten Sonde gemessen wird, wird ein Wert von 10/1 bis größer als 20/1 erhalten. Diese Typen von Ergebnissen ermöglichen die Entwicklung von robusten Assays für den Mutationsnachweis.
Für beispielhafte Zwecke verwendet ein Testformat für den Mutationsnachweis eine Zielnukleinsäure (z. B. genomische DNA) und Oligonukleotidsonden, die den Bereich von Interesse überspannen. Die Oligonukleotidsonden sind größer oder gleich zu 24 Nukleotiden in ihrer Länge (mit einem Maximum von ungefähr 36 Nukleotiden) und markiert mit einem Fluorochrom an dem 3' oder 5'-Ende der Oligonukleotidsonde. Die Zielnukleinsäure wird über die Lyse von Gewebekulturzellen, Geweben, Organismen, usw., in der jeweiligen Hybridisierungslösung erhalten. Die lysierte Lösung wird dann auf eine Temperatur erhitzt, die die Zielnukleinsäure denaturiert (15–25°C oberhalb der Tm der Zielnukleinsäureduplex). Die Oligonukleotidsonden werden bei der Denaturierungstemperatur hinzugefügt und die Hybridisierung wird bei der Tm der fehlgepaarten Duplex für 0,5 bis 24 Stunden durchgeführt. Die genomische DNA wird dann gesammelt und durch einen GF/C (GF/B und ähnliches) Glasfaserfilter hindurch passiert. Der Filter wird dann mit der jeweiligen Hybridisierungslösung gewaschen, um alle nicht-hybridisierten Oligonukleotidsonden zu entfernen (RNA, kurze Oligos und Nukleinsäure bindet nicht an Glasfaserfilter und unter diesen Bedingungen). Die Hybridisierungsoligosonde kann dann von der Ziel-DNA termisch eluiert werden und gemessen werden (durch Fluoreszenz z. B.). Für Tests, die sehr hohe Spiegel an Sensitivität erfordern, werden die Sonden konzentriert und gemessen.
Andere hochsensitive Hybridisierungsprotokolle können verwendet werden. Die Verfahren der folgenden Erfindung ermöglichen es einem, leicht auf eine Nukleinsäure zu testen, die eine Mutation enthält, von der vermutet wird, daß sie in Zellen, Proben, usw. vorhanden ist, d. h. einer Zielnukleinsäure. Die Zielnukleinsäure enthält eine Nukleotidsequenz von Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), deren Anwesenheit von Interesse ist und deren Anwesenheit oder Abwesenheit in dem Hybridisierungsassay nachgewiesen werden soll. Die Hybridisierungsverfahren der folgenden Erfindung können auch auf ein komplexes biologisches Gemisch von Nukleinsäuren (RNA und/oder DNA) angewendet werden. Solch ein komplexes biologisches Gemisch schließt einen weiten Bereich von eukaryontischen und prokaryontischen Quellen, einschließlich Protoplasten ein, und/oder andere biologische Materialien, die Polynukleotidnukleinsäure enthalten. Das Verfahren ist daher auf Gewebekulturzellen, tierische Zellen, tierisches Gewebe, Blutzellen (z. B. Retikulozyten, Lymphozyten), Pflanzenzellen, Bakterien, Hefen, Viren, Mykoplasmen, Protozoen, Pilze und ähnliches anwendbar. Durch Nachweisen einer spezifischen Hybridisierung zwischen Nukleinsäuresonden einer bekannten Quelle kann die spezifische Anwesenheit einer Zielnukleinsäure etabliert werden. Ein typisches Hybridisierungsassayprotokoll zum Nachweis einer Zielnukleinsäure in einer komplexen Population von Nukleinsäuren wird wie folgt geschrieben: Zielnukleinsäure werden in ihrer Größe auf einer LC oder HPLC aufgetrennt, kloniert und isoliert, unterteilt in Pools oder als eine komplexe Population belassen. Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in, z. B. einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die allgemeinen Techniken von Hybridisierungsassay verwendet werden. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte von Klonierung und Isolierung von Zielnukleinsäuren, Unterteilung in Pools oder Belassen als eine komplexe Population. Die Zielnukleinsäuren werden dann mit markierten Oligonukleotidsonden unter oben beschriebenen Bedingungen hybridisiert. Die Zielnukleinsäuren werden ihrer Größe nach durch LC oder HPLC aufgetrennt. Die Marker werden von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten und dann werden die Marker durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen.
15. Sequenzierung durch Hybridisierung
Die DNA-Sequenzanalyse wird herkömmlicherweise durch Hybridisieren eines Primers an Ziel-DNA und Durchführen von Kettenverlängerungen unter der Verwendung einer Polymerase durchgeführt. Spezifische Stops werden durch den Einbau eines Didesoxydnukleotids kontrolliert. Die Spezifität des Primens bei diesem Typ von Analyse kann durch Einschließen eines Hybotrops in dem Annealingpuffer und/oder in Kooperation eines abasischen Rests in dem Primer und Annealing bei einer unterscheidenden Temperatur erhöht werden.
Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in, z. B., einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die allgemeinen Techniken der Sequenzierung durch Hybridisierung unter der Verwendung des Sanger-Verfahren verwendet werden. Kurz umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte von Hybridisieren eines markierten Primers an Ziel-DNA und Durchführung von Kettenverlängerungen unter der Verwendung einer Polymerase. Spezifische Stops werden durch den Einbau eines Didesoxynukleotids kontrolliert, das auch markiert sein kann. Die Zielnukleinsäuren werden gemäß ihrer Größe durch HPLC aufgetrennt. Die Marker werden von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten und werden durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen. Andere Sequenz-Analyseverfahren schließen die Hybridisierung des Ziels mit einer Auswahl von zufälligen, kurzen Oligonukleotiden ein. Die Sequenz wird durch überlappende Hybridisierungsanalyse konstruiert. Bei dieser Technik ist präzise Hybridisierung essentiell. Die Verwendung von hybotropen oder abasischen Resten und ein Annealing bei unterscheidenden Temperatur ist für dieses Verfahren vorteilhaft, um fehlgepaarte Hybridisierung zu verringern oder auszuschließen. Das Ziel ist es, automatisierte Hybridisierungsverfahren zu entwickeln, um große Arrays von Oligonukleotidsonden oder große Arrays von Nukleinsäureproben zu testen. Die Anwendungen von solchen Technologien schließen Genkartierung, Kloncharakterisierung, medizinische Genetik und Genentdeckung, DNA-Sequenzanalyse durch Hybridisierung und zuletzt Sequenzverifikation. Viele Parameter müssen kontrolliert werden, um Oligonukleotidsonden zu automatisieren oder einen Multiplex durchzuführen. Die Stabilität der jeweiligen Sonden muß ähnlich sein, das Ausmaß von Fehlpaarung mit der Zielnukleinsäure, die Temperatur, Ionenstärke, der A + T-Gehalt der Sonde (oder des Ziels) sowie andere Parameter wenn die Sonde kurz ist (d. h. 6–50 Nukleotide) sollten ähnlich sein. Gewöhnlicherweise werden die Bedingungen des Experiments und Sequenz der Sonde eingestellt, bis die Bildung der perfekten Basen-gepaarten Sonde thermodynamisch über jede Duplex, die eine Fehlpaarung enthält, bevorzugt wird. Die Anwendungen von Sonden in sehr großem Maßstab, wie z. B. bei Sequenzierung durch Hybridisierung (SBH) oder dem Testen von hochpolymorphen Loci, wie z. B. dem zystische Fibrose Trans-Membran Proteinlocus erfordern ein stringenteres Niveau der Kontrolle von Multiplex-Sonden. Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in, z. B. einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, welche die allgemeinen Techniken von Sequenzierung durch Hybridisierung anwenden. Kurz gesagt, umfassen solche Verfahren im allgemeinen ein Hybridisieren einer Reihe von markierten Primern an ein DNA-Ziel oder eine Reihe von Ziel-DNA-Fragmenten unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen. Die Zielnukleinsäuren werden nach ihrer Größe durch HPLC aufgetrennt. Die Marker werden dann von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten und durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen.
16. Oligonukleotid-Ligationsassay
Der Oligonukleotid-Ligationsassay ist eine Erweiterung von PCR-basiertem Screening, die einen ELISA-basierten Assay verwendet (OLA, Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8923, 1990), um die PCR-Produkte nachzuweisen, die die Zielsequenz enthalten. Daher werden sowohl Gelelektrophorese und Koloniehybridisierung beseitigt. Kurz gesagt verwendet die OLA zwei angrenzende Oligonukleotide: eine „Reporter"-Sonde (markiert an 5'-Ende) und eine 5'-phosphorylierte/3'-biotinylierte „Verankerungs"-Sonde. Die zwei Oligonukleotide, die zu Sequenzen innerhalb der PCR-Primer komplementär sind, werden an Ziel-DNA annealed und, falls perfekte Komplementarität vorhanden ist, werden die zwei Sonden durch T4-DNA-Ligase ligiert. Ein Fangen der biotinylierten Verankerungssonde auf mobilisierten Streptavidin und die Analyse auf die kovalent gebundene Reportersonde testet auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielsequenzen unter den PCR-Produkten. Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls, in, z. B., einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, die die Technik des Oligonukleotid-Ligationsassays verwenden. Kurz gesagt, umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte von Durchführen einer PCR auf der Ziel-DNA, gefolgt durch Hybridisierung mit der 5'-markierten „Reporter"-DNA-Sonde und einer 5'-phosphorylierten/nicht-biotinylierten Sonde. Die Probe wird mit T4-DNA-Ligase inkubiert. Die DNA-Stränge mit ligierten Proben können von der DNA mit nicht-ligierten Proben durch, z. B., bevorzugterweise LC oder HPLC abgetrennt werden. Die Marker werden dann von den abgetrennten Fragmenten abgespalten und dann werden die Marker durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen. Kürzliche Fortschritte im OLA-Assay erlauben die gleichzeitige Analyse von multiplen Proben und multiplen Mutationen. (Baron et al., Nature Biotechnology 87: 1279, 1996). Kurz gesagt besteht das Verfahren aus der Amplifikation des Genfragments, das die Mutation von Interesse enthält, mit PCR. Das PCR-Produkt wird dann mit einer gewöhnlichen und zwei Allel-spezifischen Oligonukleotidsonden (wobei eine die Mutation enthält, während die andere dies nicht tut) hybridisiert, so daß die 3'-Enden der Allel-spezifischen Sonden unmittelbar angrenzend zu dem 5'-Ende der gewöhnlichen Sonde sind. Dieses erstellt einen kompetetiven Hybridisierungs-Ligationsprozeß zwischen den zwei allelischen Proben und der herkömmlichen Probe an jedem Locus. Die thermostabile DNA-Ligase unterscheidet dann zwischen Einzel-Base-Fehlpaarungen an der Verbindungsstelle, wodurch Allel-spezifische Ligationsprodukte erzeugt werden. Die herkömmliche Probe wird mit einem von vier Fluorophoren markiert und die Allel-spezifischen Sonden werden jede mit einem oder mehreren Pentaethylenoxid-Mobilitäts-modifizierenden Verlängerungen markiert, die einen Größenunterschied zwischen den verschiedenen Allel-spezifischen Sonden zur Verfügung stellen. Die Proben werden dann durch Gelelektrophorese basierend auf der Länge der modifizierenden Enden aufgetrennt und durch den fluoreszenten Marker an der herkömmlichen Sonde nachgewiesen. Durch die Verwendung in Größenunterschieden auf den Allel-spezifischen Sonden und vier für die herkömmliche Probe erhältlichen vier Fluorophore können viele Proben auf einer Spur des elektrophoretischen Gels analysiert werden. Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in, z. B. einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei die Technik des Oligonukleotid-Ligationsassays für gleichzeitigen multiplen Probennachweis verwendet wird. Kurz gesagt, umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte von Durchführung von PCR auf der markierten DNA, gefolgt von Hybridisierung mit der herkömmlichen Probe (nicht markiert) und den zwei Allel-spezifischen Sonden, die gemäß den Beschreibungen der Erfindung markiert sind. Die Probe wird mit DNA-Ligase inkubiert und die Fragmente, z. B. bevorzugterweise durch LC oder HPLC aufgetrennt. Die Marker werden von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten und dann werden die Marker durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen.
17. Differential Display
a. Überblick
Säugetiere, wie z. B. der Mensch, weisen ungefähr 100.000 verschiedene Gene in ihrem Genom auf, von denen nur ein kleiner Teil, möglicherweise 15%, in jeder einzelnen Zelle exprimiert werden. Die Auswahl von exprimierten Genen bestimmt den biochemischen Charakter jeder bestimmten Zelle oder Gewebe. Das Verfahren von normalen zellulären Wachstum und Differenzierung sowie die pathologischen Veränderungen, die in Erkrankungen wie Krebs entstehen, werden alle durch Veränderungen in der Genexpression angetrieben. Differential-Display-Verfahren ermöglichen die Identifizierung von Genen, die spezifisch in einzelnen Zelltypen exprimiert werden.
Die Differential-Display-Technik amplifiziert die 3'-terminalen Teile von entsprechenden cDNAs durch Verwendung eines Primers, der so aufgebaut ist, um an die 5'-Grenze eines Poly(A)-Schwanzes zu binden und Primern mit beliebiger Sequenz, die stromaufwärts binden. Amplifizierte Populationen mit jedem Primerpaar werden durch ein Größentrennverfahren (PAGE HPLC, usw.) visualisiert, was einen direkten Vergleich der mRNAs zwischen zwei biologischen Proben von Interesse ermöglicht. Das Differential-Display-Verfahren weist das Potential auf, um alle der exprimierten Gene (ungefähr 10.000 bis 15.000 mRNA Spezies) in einer Säugerzelle zu visualisieren und die Sequenzanalyse zu ermöglichen. Es ist möglich, zu vergleichen: (1) die Gesamtzahl von in den Eltern amplifizierten Peaks, (2) die Zahl von polymorphen Peaks zwischen Eltern und (3) die Segregationsverhältnisse von polymorphen Peaks in den Nachkommen von Kreuzungen von Tieren oder Pflanzen. Differential Display wird auch zur Identifizierung von Hoch- und Herunter-regulierten bekannten oder unbekannten Genen nach einer Vielzahl von Stimuli verwendet. Differential-Display-PCR-Fragmente können auch als Sonden für die cDNA-Klonierung verwendet werden (wobei ein unbekanntes Gen aus einer cDNA oder genomischen Bibliothek entdeckt wird).
Kurz gesagt sind die Schritte beim Differential-Display wie folgt: 1) RNA wird aus der biologischen Probe von Interesse isoliert. Gesamt-RNA, zytoplasmatische RNA oder mRNA kann verwendet werden. 2) Erster Strang cDNAs werden unter der Verwendung eines verankerten OligodT (OligodTdN, wobei N A, C oder G ist) erzeugt. 3) Amplifikation von cDNA unter der Verwendung von OligoTdN und kurzen Primern mit beliebiger Sequenz. Für eine vollständige Differential-Display-Analyse von zwei Zellpopulationen oder zwei Proben von Interesse werden 9 verschiedene Primer benötigt. Die Nachweisgrenze von Differential-Display für eine spezifische mRNA ist weniger als 0,001% der gesamten mRNA-Population.
Aufgrund der Einfachheit, Sensitivität und Reproduzierbarkeit des hier beschriebenen Verfahrens ist die CMST Differential-Display-Methode ein signifikanter Fortschritt über herkömmliche gelbasierte Systeme. Mit der CMST-basierten Differential-Display-Analyse von zwei Zelltypen können einschließlich 64 × 24 PCR-Läufe schnell vervollständigt werden, im Gegensatz zu einer arbeitsintensiven lang andauernden Zeit mit dem herkömmlichen Verfahren. Darüber hinaus wurde von Sequenzheterogenität von Banden, die aus Differential-Display-Gelen isoliert wurden gefunden, daß sie ein zu der hohen Fehlerrate dieser Technik beitragender Faktor sind. Dies wird mit der hier beschriebenen CMST-basierten Differential-Display-Methodologie vollständig vermieden.
b. CMST-basiertes Differential-Display Beispiel:
Das Ausgangsmaterial für Differential-Display ist RNA, die aus zwei verschiedenen Populationen von Zellen isoliert wurde. Im allgemeinen sind die Zellen von ähnlichem Ursprung und unterscheiden sich im Hinblick auf ihre Behandlung mit Wirkstoffen, ihrem „normalen" gegenüber „transformierten" Zustand oder ihrer Expression von verschiedenen eingefügten Genen.
Pflanzengewebe oder tierisches Material (2–3 g) wird geerntet und in sterile Petrischalen zerhackt oder zerschnitten. Das Material wird dann zu einem feinen Pulver in einem vorgekühlten Mörser- und Stöße unter flüssigem N₂ zerrieben. Ein Gramm von gefrorenem Pulver wird zu einem 12 ml Poly-Propylen-Röhrchen (1 g = ca. 5 ml Pulver), enthaltend 8 ml eines heißen (80°C) 1 : 1 Gemisches von RNA-Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1,0% LIDS) und Phenol (Basisvolumen.: 4 ml) transferiert. Die Probe wird bei hoher Geschwindigkeit für mindestens 30 Sekunden gemischt (gevortext). Ein Volumen von Chloroform wird hinzugefügt (4 ml) und nochmals gemischt und zentrifugiert für 20 Minuten in einer Zentrifuge bei 5000 bis 10.000 × g. Die wäßrige Phase wird in ein neues 12 ml Röhrchen transferiert und 1/3 Volumen von kaltem 8M LiCl wird hinzugefügt, um die RNA zu fällen (3 h bei 0°C). Die RNA wird bei 0°C für 20 Minuten zentrifugiert und in 1 ml H₂O suspendiert. Restliche genomische DNA wird durch Behandlung der RNA-Probe mit DNase I beseitigt. Reverse Transkription wird durchgeführt auf jeder RNA-Probe unter der Verwendung von 500 ng DNA-freier RNA in 1x reverse Transkriptasepuffer, 10 mM DTT, 20 μM dNTPs, 0,2 μM 5'RS H-711 C (ein basenverankerter Primer mit 5'-Restriktionsstelle), 200 Einheiten MoMuLV reverser Transkriptase und 1,5 Einheiten RNA Guard pro 20 μl Reaktionsvolumen. Obwohl die Verwendung eines stromabwärts-Primers die Zahl von cDNA-Subfraktionen dreifach vemngert, reduziert sie nicht die Zahl von PCR-Reaktionen, die erforderlich sind, um die meisten der cDNA-Spezies, die in dem Pool vorhanden sind, darzustellen. Im Gegenteil verringert sie die theoretische Chance, diejenigen cDNA-Spezies zu identifizieren, die vorhanden sind. Die besten Ergebnisse werden unter der Verwendung einer Kombination von neun verschiedenen Primern des Typs DMO-VV, wobei V A, G, C sein kann, jedoch nicht T, erhalten. Mit einem T in der terminalen 3'-Position führt die unvollständige Hybridisierung des Primers zu einem Verschmieren von Banden auf dem Gel. Die optimale Konzentration von RNA ist 200–300 ng pro cDNA-Synthese.
Das CMST-basierte Differential-Display wird im wesentlichen wie vorher beschrieben (Liang and Pardee, Science 257: 967–971, 1992) durchgeführt, mit der Ausnahme für den Aufbau von für die reverse Transkription und de Amplifikationsschritte verwendeten Primer und die Auswahl von radiomarkiertem Nukleotid. Eine vollständige Differential-Display-Analyse der cDNAs aus zwei biologischen Proben von Interesse unter der Verwendung von neun Stromabwärts-Primern und 24 Stromaufwärts-Primern würde 9 × 24 × 2 CMST-basierte Differential-Display-Reaktionen erzeugen. Die Amplifikationsprodukte können durch HPLC aufgetrennt werden und, falls gewünscht, reamplifiziert werden.
Im Anschluß an die Inkubation der RNA bei 65°C für 5 Minuten werden die Proben auf Eis gekühlt, zu den Reverse-Transkriptionsmix hinzugefügt und für 60 Minuten bei 37°C inkubiert, gefolgt von 95°C für 5 Minuten. Duplikat cDNA-Proben werden dann unter der Verwendung desselben 5'-Primers in Kombination mit einer Reihe von 13-Meren von beliebiger, jedoch definierter Sequenz: H-AP: AAGCTTCGACTGT, H-AP: AAGCTTTGGTCAG, H-AP4: AAGCTTCTCAACG, H-AP5: AAGCTTAGTAGGC amplifiziert.
Die Modifikation wird in Raktionsgemischen durchgeführt, die 0,1 Volumen von reverser Transkriptionsreaktion enthalten, 1 × PCR-Puffer (10 × PCR-Puffer = 100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂, 10 mM KCl, pH 8,3) 2 μM dNTPs, 0,2 μM RS H-T11C verankertem Primer, 0,2 μM geeignetem beliebigem Primer, 1,5 Einheiten Expand^TM High Fidelity DNA-Polymerase und Wasser bis zu einem finalen Volumen von 20 μl. Die Amplifikation der cDNA wird unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C (1 Minute), gefolgt von 40 Zyklen von 94°C (30 Sekunden), 40°C (2 Minuten), 72°C (30 Sekunden) und beendet mit 72°C (5 Minuten).
Die Amplifikation für jedes Gen wird mit genspezifischen Primern durchgeführt, die eine bekannte Intron/Exon-Grenze überspannen (siehe unten). Alle Amplifikationen werden in 20 μl Volumen durchgeführt, die 10 mM Tris HCl pH 8,3, 1 mM NH4Cl, 1,5 M MgCl2, 100 mM KCl, 0,125 mM NTPs, 10 ng/ml der jeweiligen Oligonukleotidprimer und 0,75 Einheiten von Taq-DNA-Polymesse (Gibco-BRL) enthalten. Die Zyklusparameter waren 94°C Vorheizschritt für 5 Minuten, gefolgt von 94°C Denaturierungsschritt für 1 Minute, 55°C Annealingschritt für 2 Minuten und einem 72°C Verlängerungsschritt für 30 Sekunden bis 1 Minute und einer finalen Verlängerung von 72°C für 10 Minuten. Die Zahl der Amplifikationszyklen lag im allgemeinen von 30–45.
Die Amplifikationsprodukte werden Gel-gereinigt (Zhen and Swank, BioTechniques 14: 894-898, 1993) auf 1% Agarosegelen, die in 0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA (1 × TEA)-Puffer laufen gelassen wurden und mit Ethidiumbromid gefärbt wurden. Eine Mulde wird gerade vor der Bande von Interesse eingeschnitten und mit 50–200 μl von 10% PEG in 1 × TAE-Puffer gefüllt. Die Elektrophorese wird fortgeführt, bis die Bande vollständig in die Mulde eingetreten ist. Die Inhalte werden dann entfernt und mit Phenol, Chloroform extrahiert und in 0,1 Volumen von 7,5 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumen 100% EtOH gefällt. Die Proben werden mit 75% EtOH gewaschen und kurz bei Raumtemperatur getrocknet. Die Quantifizierung der Ausbeute wird durch Elektrophorese eines kleinen Aliquots auf 1% Agarosegel in 1 × TBE-Puffer mit Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit einem bekannten Standard durchgeführt.
Die Produkte aus den Amplifikationsreaktionen werden durch HPLC analysiert. Die HPLC wird unter der Verwendung von automatisierter HPLC-Instrumentierung (Rainin, Emeryville, CA, oder Hewlett Packard, Palo Alto, CA) durchgeführt. Ungereinigte DNA-Fingerprinting-Produkte, die für 3 Minuten bei 95°C vor der Injektion in eine HPLC denaturiert werden, werden mit linearen Acetonitril (ACN, J. T. Baker, NJ) Gradienten von 1,8%/Minute bei einer Flußrate von 0,9 ml/Minute eluiert. Die Start- und Endpunkte werden gemäß der Größe der amplifizierten Produkte eingestellt. Die für die erfolgreiche Auflösung der Moleküle, die während der DNA-Fingerprinting-Technik erzeugt wurden erforderliche Temperatur ist 50°C.
Der Efflux aus der HPLC wird dann in einen Massenspektrometer (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) zum Nachweis der Marker umgeleitet.
Der Vergleich der Chromatogramme (Massenspektrometrie-basiert) zeigt, daß Banden bei 220 bp und 468 bp in den stimulierten Jurkat-Zellen beobachtet werden und nicht in den nicht-stimulierten Jurkat-Zellen beobachtet werden.
C. TRENNUNG VON NUKLEINSÄUREFRAGMENTEN
Eine Probe, die eine Analyse erfordert, ist oft eine Mischung aus vielen Komponenten in einer komplexen Matrix. Für Proben, die unbekannte Verbindungen enthalten, müssen die Komponenten voneinander getrennt werden, so daß jede einzelne Komponente mit anderen analytischen Verfahren identifiziert werden kann. Die Trenneigenschaften der Komponenten in einer Mischung sind unter konstanten Bedingungen konstant, und wenn sie daher erst einmal bestimmt sind, können sie verwendet werden, um jede der Komponenten zu identifizieren und zu quantifizieren. Solche Verfahren sind typisch bei chromatographischen oder elektrophoretischen analytischen Trennungen.
1. Hochleistungsflüssigkeitschromatrographie (HPLC)
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine chromatographische Trenntechnik, um Verbindungen zu trennen, die in Lösung gelöst sind. HPLC-Instrumente bestehen aus einem Reservoir aus mobiler Phase, einer Pumpe, einem Injektor, einer Trennsäule und einem Detektor. Verbindungen werden durch Injizieren eines aliquoten Teils der Probenmischung auf die Säule getrennt. Die unterschiedlichen Verbindungen gehen aufgrund der Unterschiede in ihrem Verteilungsverhalten zwischen der mobilen flüssigen Phase und der stationären Phase mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule hindurch.
Vor kurzem ist gezeigt worden, daß IP-RO-HPLC auf nicht-porösen PS/DVB-Teilchen mit chemisch gebundenen Alkylketten schnelle Alternativen zu Kapillarelektrophorese bei der Analyse von sowohl einzel- als auch doppelsträngigen Nukleinsäuren ist, die ähnliche Auflösungsgrade liefert (Huber et al., Anal. Biochem. 212: 351, 1993; Huber et al., 1993, Nuc. Acids Res. 21: 1061; Huber et al, Biotechniques 16: 898, 1993). Im Gegensatz zu Ionenaustauschchromatographie, die nicht immer doppelsträngige DNA als eine Funktion der Stranglänge zurückhält (da AT-Basenpaare mit der positiv geladenen stationären Phase stärker als GC-Basenpaare wechselwirken), ermöglicht IP-RP-HPLC eine streng größenabhängige Trennung.
Ein Verfahren unter Verwendung von 100 mM Triethylammoniumacetat als Ionenpaarungsreagens ist entwickelt worden, Phosphodiester-Oligonukleotide konnten mit Erfolg auf alkylierten nicht-porösen 2,3 μM Poly(styrol-divinylbenzol)-Teilchen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie getrennt werden (Oefner et al., Anal. Biochem. 223: 39, 1994). Die beschriebene Technik ermöglichte die Trennung von PCR-Produkten, die sich nur 4 bis 8 Basenpaare in der Länge unterscheiden, in einem Größenbereich von 50 bis 200 Nukleotiden.
2. Elektrophorese
Elektrophorese ist eine Trenntechnik, die auf der Mobilität von Ionen (oder DNA, wie dies der hierin beschriebene Fall ist) in einem elektrischen Feld beruht. Negativ geladene DNA wandert zu einer positiven Elektrode und positiv geladene Ionen wandern zu einer negativen Elektrode. Aus Sicherheitsgründen ist üblicherweise eine Elektrode geerdet und die andere positiv oder negativ vorgespannt. Geladene Spezies haben unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten in Abhängigkeit von ihrer Gesamtladung, Größe und Gestalt und können daher getrennt werden. Ein Elektrodenapparat besteht aus einer Hochspannungs-Stromquelle, Elektroden, Puffer und einem Träger für den Puffer, wie etwa Polyacrylamidgel, oder eine Kapillarröhre. Offene Kapillarröhren werden für viele Arten von Proben verwendet und die anderen Gelträger werden üblicherweise für biologische Proben verwendet, wie etwa Proteinmischungen oder DNA-Fragmente.
3. Kapillarelektrophorese (CE)
Kapillarelektrophorese (CE) in ihren verschiedenen Manifestationen (freie Lösung, Isotachophorese, isoelektrische Fokussierung, Polyacrylamidgel, mizelläre elektrokinetische "Chromatographie") entwickelt sich als ein Verfahren für schnelle Hochauflösungstrennungen sehr kleiner Probenvolumina komplexer Mischungen. In Kombination mit der inhärenten Empfindlichkeit und Selektivität von MS ist CE-MS eine potentielle leistungsfähige Technik für die Bioanalyse. In der hierin offenbarten neuartigen Anwendung wird das Zusammenspiel dieser zwei Verfahren zu überlegenen DNA-Sequenzierungsverfahren führen, die die Sequenzierungsverfahren mit der augenblicklichen Geschwindigkeit um mehrere Größenordnungen übertreffen.
Die Beziehung zwischen CE und Durchflüssen bei Elektrosprayionisierung (ESI) und die Tatsache, daß beide durch Ionenspezies in Lösung erleichtert werden (und primär dafür verwendet werden), liefert die Grundlage für eine extrem attraktive Kombination. Die Kombination von sowohl Kapillarzonenelektrophorese (CZE) und Kapillarisotachophorese mit Quadrapol-Massenspektrometern auf der Basis von ESI ist beschrieben worden (Olivares et al., Anal. Chem. 59: 1230, 1987; Smith et al., Anal. Chem. 60: 436, 1988; Loo et al., Anal. Chem. 179: 404, 1989; Edmonds et al., J. Chroma. 474: 21, 1989; Loo et al., J. Microcolumn Sep. 1: 223, 1989; Lee et al., J. Chromatog. 458: 313, 1988; Smith et al., J. Chromatog. 480: 211, 1989; Grese et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2835, 1989). Kleine Peptide sind einer CZE-Analyse mit guter Empfindlichkeit (im Femtomol-Bereich) leicht zugänglich.
Das leistungsfähigste Trennverfahren für DNA-Fragmente ist Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), im allgemeinen in einem Slabgel-Format. Die wesentliche Beschränkung der gegenwärtigen Technologie ist jedoch die relativ lange Zeit, die erforderlich ist, um die Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten, die in den Sequenzierungsreaktionen hergestellt werden, durchzuführen. Eine Erhöhung der Größenordnung (10-fach) kann mit der Verwendung von Kapillarelektrophorese erreicht werden, die ultradünne Gele einsetzt. In freier Lösung wandert, in einer ersten Annäherung, die gesamte DNA mit derselben Mobilität, da die Zugabe einer Base zw Kompensation von Masse und Ladung führt. In Polyacrylamidgelen sieben und wandern DNA-Fragmente als eine Funktion der Länge, und dieser Ansatz ist nunmehr auf CE angewendet worden. Bemerkenswerte Bodenzahlen pro Meter sind jetzt mit quervernetztem Polyacrylamid erreicht worden (10⁺⁷ Böden pro Meter, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 9660, 1988). Solche CE-Säulen, wie beschrieben, können zur DNA-Sequenzierung eingesetzt werden. Das CE-Verfahren ist im Prinzip 25-mal schneller als Slabgel-Elektrophorese in einem Standard-Sequenzer. Zum Beispiel können etwa 300 Basen pro Stunde gelesen werden. Die Trennungsgeschwindigkeit ist bei Slabgel-Elektrophorese durch die Größenordnung des elektrischen Feldes beschränkt, das ohne übermäßige Wärmeproduktion an das Gel angelegt werden kann. Daher wird die größere Geschwindigkeit von CE durch die Verwendung höherer Feldstärken erreicht (300 V/cm bei CE gegenüber 10 V/cm bei Slabgel-Elektrophorese). Das Kapillarformat verringert den Stromfluß und damit die Leistung und die resultierende Wärmeerzeugung.
Smith und andere (Smith et al., Nuc. Acids Res. 18: 4417, 1990) haben den Einsatz mehrerer Kapillaren in Parallelschaltung vorgeschlagen, um den Durchsatz zu erhöhen. In ähnlicher Weise haben Mathies und Huang (Mathies und Huang, Nature 359: 167, 1992) Kapillarelektrophorese eingeführt, bei der Trennungen auf einer Parallelanordnung von Kapillaren durchgeführt werden, und zeigten Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Huang et al., Anal. Chem. 64: 967, 1992, Huang et al., Anal. Chem. 64: 2149, 1992). Der wichtigste Nachteil von Kapillarelektrophorese ist die begrenzte Probenmenge, die auf die Kapillare geladen werden kann. Durch Konzentration einer großen Probenmenge am Beginn der Kapillare, vor der Trennung, wird die Beladbarkeit erhöht, und Nachweisgrenzen können um mehrere Größenordnungen gesenkt werden. Das populärste Verfahren zur Vorkonzentration bei CE ist Probenstapelung. Probenstapelung ist vor kurzem in einer Übersicht dargestellt worden (Chien und Burgi, Anal. Chem. 64: 489A, 1992). Probenstapelung hängt ab von dem Matrixunterschied (pH, Ionenstärke) zwischen dem Probenpuffer und dem Kapillarpuffer, so daß das elektrische Feld über die Probenzone stärker ist als in der Kapillarregion. Bei Probenstapelung wird ein großes Probenvolumen in einem Puffer mit geringer Konzentration zur Vorkonzentrierung am Kopf der Kapillarsäule eingeführt. Die Kapillare wird mit einem Puffer derselben Zusammensetzung gefüllt, aber mit höherer Konzentration. Wenn die Proben-Ionen den Kapillarpuffer und das niedrigere elektrische Feld erreichen, stapeln sie sich in eine konzentrierte Zone hinein. Probenstapelung hat die Nachweisbarkeiten um 1–3 Größenordnungen erhöht.
Ein weiteres Verfahren zur Vorkonzentration ist die Anwendung von Isotachophorese (ITP) vor der Freizonen-CE-Trennung von Analyten. ITP ist eine Elektrophoresetechnik, die es ermöglicht, daß Mikroliter-Probenvolumina auf die Kapillare geladen werden können, im Gegensatz zu den Injektionsvolumina von wenigen nl, die typischerweise mit CE assoziiert sind. Die Technik beruht auf der Einführung der Probe zwischen zwei Puffern (Leading- und Trailing-Elektrolyten) mit höherer bzw. niedrigerer Mobilität als der Analyt. Die Technik ist inhärent eine Konzentrationstechnik, bei der die Analyten sich in reine Zonen hineinkonzentrieren, die mit derselben Geschwindigkeit wandern. Die Technik ist gegenwärtig weniger populär als die Stapelverfahren, die oben beschrieben sind, wegen des Bedarfs mehrerer Wahlmöglichkeiten von Leading- und Trailing-Elektrolyten und der Fähigkeit, nur kationische oder anionische Spezies während eines Trennverfahrens zu trennen.
Das Herz des DNA-Sequenzierungsverfahrens ist die bemerkenswert selektive elektrophoretische Trennung von DNA- oder Oligonukleotid-Fragmenten. Sie ist bemerkenswert, weil jedes Fragment aufgelöst wird und sich nur um Nukleotide unterscheidet. Trennungen von bis zu 1.000 Fragmenten (1.000 bp) sind erzielt worden. Ein weiterer Vorteil der Sequenzierung mit spaltbaren Markierungen ist wie folgt. Es gibt kein Erfordernis, ein Slabgel-Format zu verwenden, wenn DNA-Fragmente mit Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt werden, wenn spaltbare Markierungen eingesetzt werden. Da zahlreiche Proben kombiniert werden (4 bis 2.000), besteht keine Notwendigkeit, Proben parallel laufen zu lassen, wie dies der Fall bei gegenwärtigen Farbstoff-Primer- oder Farbstoff-Terminator-Verfahren ist (d. h. ABI373-Sequenzer). Da es keinen Grund gibt, Parallelspuren laufen zu lassen, gibt es keinen Grund, ein Slabgel zu verwenden. Daher kann man ein Röhrengel-Format für das Elektrophoresetrennverfahren einsetzen. Grossman (Grossman et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 9, 1992) hat gezeigt, daß ein beträchtlicher Vorteil gewonnen wird, wenn ein Röhrengel-Format anstelle eines Slabgel-Formats verwendet wird. Dies beruht auf der größeren Fähigkeit, Joule-Wärme in einem Röhrenformat abzuleiten, verglichen mit einem Slabgel, was zu schnelleren Laufzeiten führt (um 50%) und viel höherer Auflösung von DNA-Fragmenten mit hoher relativer Molekülmasse (mehr als 1.000 nt). Lange Ablesungen sind bei genomischer Sequenzierung entscheidend. Daher hat die Verwendung spaltbarer Markierungen beim Sequenzieren den zusätzlichen Vorteil, daß sie dem Benutzer erlaubt, das effizienteste und empfindlichste DNA-Trennverfahren einzusetzen, das auch die höchste Auflösung besitzt.
4. Mikrosysteme
Kapillarelektrophorese (CE) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur DNA-Sequenzierung, forensischen Analysen, PCR-Produktanalyse und Restriktionsfragmentgrößenbestimmung. CE ist weit schneller als traditionelle Slab-PAGE, da bei Kapillargelen ein weit höheres Spannungsfeld angelegt werden kann. CE hat jedoch den Nachteil, daß es die Verarbeitung von nur einer Probe pro Gel erlaubt. Das Verfahren kombiniert die schnelleren Trennzeiten von CE mit der Fähigkeit, mehrere Proben parallel zu analysieren. Das zugrundeliegende Konzept hinter der Verwendung von Mikrosystemen ist die Fähigkeit, die Informationsdichte in der Elektrophorese durch Miniaturisierung der Spwabmessung auf etwa 100 Mikrometer zu erhöhen. Die Elektronikindustrie verwendet routinemäßig Mikrotechnologie, um Schaltungen mit Merkmalen von weniger als 1 Mikron in der Größe herzustellen. Die gegenwärtige Dichte von Kapillaranordnungen ist beschränkt durch den Außendurchmesser der Kapillarröhre. Mikrotechnologisch hergestellte Kanäle erzeugen eine höhere Dichte von Anordnungen. Mikrotechnologie ermöglicht auch physikalische Baugruppen, die mit Glasfasern nicht möglich sind, und verbindet die Kanäle direkt mit anderen Vorrichtungen auf einem Chip. Mehrere Vonichtungen sind auf Mikrochips für Trenntechnologien konstruiert worden. Ein Gaschromatograph (Teny et al., IEEE Trans. Electron Device, ED-26: 1880, 1979) und ein Flüssigkeitschromatograph (Manz et al., Sens. Actuators B 1: 249, 1990) sind auf Siliciumchips hergestellt worden, aber diese Vorrichtungen sind nicht in breitem Umfang eingesetzt worden. Mehrere Gruppen haben über die Trennung von Fluoreszenzfarbstoffen und Aminosäuren auf mikrotechnologisch hergestellten Vorrichtungen berichtet (Manz et al., J. Chromatography 593: 253, 1992, Effenhauser et al., Anal. Chem. 65: 2637, 1993). Vor kurzem haben Woolley und Mathies (Woolley und Mathies, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 11348, 1994) gezeigt, daß Photolithographie und chemisches Ätzen verwendet werden können, um eine große Anzahl von Trennkanälen auf Glassubstraten herzustellen. Die Kanäle werden mit Hydroxyethylcellulose(HEC)trennmatrizes gefüllt. Es wurde gezeigt, daß DNA-Restriktionsfragmente in so wenig wie zwei Minuten getrennt werden konnten.
D. ABSPALTUNG VON MARKIERUNGEN
Wie oben beschrieben, werden unterschiedliche Linkerkonstruktionen Spaltbarkeit ("Labilität") unter unterschiedlichen spezifischen physikalischen oder chemischen Bedingungen verleihen. Beispiele für Bedingungen, die dazu dienen, verschiedene Linkerkonstruktionen zu spalten, schließen saure, basische, Oxidations-, Reduktions-, Fluorid-, Thiolaustausch-, Photolyse- und enzymatische Bedingungen ein.
Beispiele für spaltbare Linker, die die allgemeinen Kriterien für Linker, die oben aufgelistet sind, erfüllen, werden den Fachleuten gut bekannt sein und schließen diejenigen ein, die im von Pierce (Rockford, IL) erhältlichen Katalog zu finden sind. Beispiele schließen ein:

– Ethylenglycobis(succinimidylsuccinat) (EGS), ein aminreaktives Vernetzungsreagens, das mit Hydroxylamin spaltbar ist (1 M bei 37°C für 3–6 Stunden);
– Disuccinimidyltartrat (DST) und Sulfo-DST, die aminreaktive Vernetzungsreagentien sind, spaltbar mit 0,015 M Natriumperiodat;
– Bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES) und Sulfo-BSOCOES, die aminreaktive Vernetzungsmittel sind, spaltbar durch Base (pH 11,6);
– 1,4-Di[3'-(2'-pyridyldithio(propionamido))butan (DPDPB), ein Pyridyldithiol-Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– N-[4-(p-Azidosalicylamido)-butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid (APDP), ein Pyridyldithiol-Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– Bis-[beta-4-(azidosalicylamido)ethyl]-disulfid, ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat (SADP), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– Sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAED), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
– Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAND), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist.

Andere Beispiele für spaltbare Linker und die Spaltungsbedingungen, die verwendet werden können, um Markierungen freizusetzen, sind wie folgt. Eine Silyl-Verknüpfungsgruppe kann durch Fluorid oder unter sauren Bedingungen gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Nitrobenzyloxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4-Nitrobenzyloxy-Verknüpfungsgruppe kann durch eine Photonenquelle (Photolyse) gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Alkoxyphenoxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4-Alkoxyphenoxy-Verknüpfungsgruppe kann durch Ce(NH₄)₂(NO₃)₆ (Oxidation) gespalten werden. Ein NCO₂(Urethan)-Linker kann durch Hydroxid (Base), Säure oder LiAlH₄ (Reduktion) gespalten werden. Eine 3-Pentenyl-, 2-Butenyl- oder 1-Butenyl-Verknüpfungsgruppe kann durch O₃, OsO₄/IO₄ ^– oder KmnO₄ (Oxidation) gespalten werden. Eine 2-[3-, 4- oder 5-substituierte Furyl]oxy-Verknüpfungsgruppe kann durch O₂, Br₂, McOH oder Säure gespalten werden.
Bedingungen für die Spaltung weiterer labiler Verknüpfungsgruppen schließen ein: tert.-Alkyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure gespalten werden; Methyl(dialkyl)methoxy- oder 4-substituierte 2-Alkyl-1,3-dioxan-2-yl-Verknüpfungsgruppen können durch H₃O⁺ gespalten werden; 2-Silylethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Fluorid oder durch Säure gespalten werden; 2-(X)-Ethoxy (wobei X = Keto, Esteramid, Cyano, NO₂, Sulfid, Sulfoxid, Sulfon ist)-Verknüpfungsgruppen können unter alkalischen Bedingungen gespalten werden; 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte Benzyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure oder unter reduktiven Bedingungen gespalten werden; 2-Butenyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch (Ph₃P)₃RhCl(H) gespalten werden; 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Bromphenoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Li, Mg oder BuLi gespalten werden; Methylthiomethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Hg²⁺ gespalten werden; 2-(X)-Ethyloxy(wobei X = ein Halogen)-Vernüpfungsgruppen können durch Zn oder Mg gespalten werden; 2-Hydroxyethyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Oxidation (z. B. mit Pb(OAc)₄) gespalten werden.
Bevorzugte Linker sind diejenigen, die durch Säure oder Photolyse gespalten werden. Mehrere der säurelabilen Linker, die für Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden sind, sind zur Verknüpfung von Markierungen mit MOIs nützlich. Einige dieser Linker sind bei einem kürzlich erschienenen Überblick von Lloyd-Williams et al. beschrieben (Tetrahedron 49: 11065–11133, 1993). Ein nützlicher Linker-Typ beruht auf p-Alkoxybenzylalkoholen, von denen zwei, 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure und 4-(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)buttersäure, von Advanced ChemTech (Louisville, KY) kommerziell erhältlich sind. Beide Linker können über eine Esterbindung mit dem Benzylalkohol an eine Markierung gebunden werden und über eine Amidbindung mit der Carbonsäure an ein aminhaltiges MOI. Markierungen, die durch diese Moleküle gebunden sind, werden vom MOI mit variierenden Konzentrationen in Trifluoressigsäure freigesetzt. Die Spaltung dieser Linker führt zur Freisetzung einer Carbonsäure auf der Markierung. Säurespaltung von Markierungen, die durch verwandte Linker gebunden sind, wie etwa 2-Dimethoxy-4'-(carboxymethyloxy)-benzhydrylamin (erhältlich von Advanced ChemTech in FMOC-geschützter Form), führt zur Freisetzung eines Carbonsäureamids auf der freigesetzten Markierung.
Die photolabilen Linker, die für diese Anwendung nützlich sind, sind ebenfalls größtenteils für die Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden (siehe Übersicht von Lloyd-Williams). Diese Linker beruhen üblicherweise auf 2-Nitrobenzylestern oder 2-Nitrobenzylamiden. Zwei Beispiele für photolabile Linker, über die vor kurzem in der Literatur berichtet worden ist, sind 4-(4-(1-FMOC-Amino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (Holmes und Jones, J. Org. Chem. 60: 2318–2319, 1995) und 3-(FMOC-Amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al., Molecular Diversity 1: 4–12, 1995). Beide Linker können über die Carbonsäure an ein Amin auf dem MOI gebunden werden. Die Bindung der Markierung an den Linker erfolgt durch Bildung eines Amids zwischen einer Carbonsäure auf der Markierung und dem Amin auf dem Linker. Die Spaltung photolabiler Linker erfolgt üblicherweise mit UV-Licht mit 350 nm Wellenlänge bei Intensitäten und Zeiträumen, die den Fachleuten bekannt sind. Die Spaltung der Linker führt zu einer Freisetzung eines primären Amids auf der Markierung. Beispiele für photospaltbare Linker schließen Nitrophenylglycinester, exo- und endo-2-benzonorborneylchloride und Methansulfonate und 3-Amino-3(2-nitrophenyl)propionsäure ein. Beispiele für enzymatische Spaltung schließen Esterasen, die Esterbindungen spalten werden, Nukleasen, die Phosphodiester spalten werden, Proteasen, die Peptidbindungen spalten werden, etc. ein.
Geeignete Vorrichtungen, die dazu verwendet werden können, die Photospaltung von markierten Molekülen durchzuführen, schließen die Vorrichtung ein, die unter der Abkürzung „PHRED" bekannt ist, was für Photochemischer Reaktor für den verstärkten Nachweis steht und von Aura Industries, Staten Island, NY erhältlich ist (erhältlich mit sowohl einer 254 nm und 366 nm Lampe), PhotoBlaster System –1 mit dem LuxTube Aufbau, von Agrenetics, 81 Salem Street, Wilmington, MA, USA 01187 (erhältlich mit einer 366 nm Lampe, jedoch enthält sie Röhre einen Photokatalysator, der durch 366 nm Licht aktiviert wird, was zu einer Emission von einem Bereich von Wällenlängen führt, der 254 nm einschließt).
E. NACHWEIS VON MARKIERUNGEN
Nachweisverfahren beruhen typischerweise auf der Absorption und Emission in bestimmten Spektraltypen. Wenn Atome oder Moleküle Licht absorbieren, regt die einstrahlende Energie eine quantisierte Struktur in ein höheres Energieniveau an. Der Anregungstyp hängt von der Wellenlänge des Lichtes ab. Elektronen werden durch ultraviolettes oder sichtbares Licht auf höhere Orbitale angehoben, Molekülvibrationen werden durch Infrarotlicht angeregt und Rotationen werden durch Mikrowellen angeregt. Ein Absorptionsspektrum ist die Lichtabsorption als eine Funktion der Wellenlänge. Das Spektrum eines Atoms oder Moleküls hängt von seiner Energieniveaustruktur ab. Absorptionsspektren sind nützlich für die Identifizierung von Verbindungen. Spezifische absorptionsspektroskopische Verfahren schließen Atomabsorptionsspektroskopie (AA), Infrarotspektroskopie (IR) und UV-vis-Spektroskopie (UV-vis) ein.
Atome oder Moleküle, die auf hohe Energieniveaus angeregt werden, können durch Abgabe von Strahlung auf niedrigere Niveaus absteigen. Diese Lichtemission wird Fluoreszenz genannt, wenn der Übergang zwischen Zuständen mit demselben Spin erfolgt, und Phosphoreszenz, wenn der Übergang zwischen Zuständen mit unterschiedlichem Spin auftritt. Die Emissionsintensität des Analyten ist linear proportional zur Konzentration (bei niedrigen Konzentrationen) und ist nützlich zur Quantifizierung der emittierenden Spezies. Spezifische emissionsspektroskopische Verfahren schließen Atomemissionsspektroskopie (AES), Atomfluoreszenzspektroskopie (AFS), molekulare laserinduzierte Fluoreszenz (LIF) und Röntgenfluoreszenz (XRF) ein.
Wenn elektromagnetische Strahlung durch die Materie hindurchgeht, setzt der größte Teil der Strahlung seinen Weg in seiner ursprünglichen Richtung fort, ein kleinerer Teil wird aber in andere Richtungen gestreut. Licht, das mit derselben Wellenlänge wie das einstrahlende Licht gestreut wird, wird Rayleigh-Streuung genannt. Licht, das in durchsichtigen Feststoffen aufgrund von Vibrationen (Phononen) gestreut wird, wird Brillouin-Streuung genannt. Brillouin-Streuung ist typischerweise um 0,1 bis 1 Wellenzahl vom einstrahlenden Licht verschoben. Licht, das aufgrund von Vibrationen in Molekülen oder optischen Phononen in undurchsichtigen Feststoffen gestreut wird, wird Raman-Streuung genannt. Raman-gestreutes Licht wird um so viel wie 4.000 Wellenzahlen vom einstrahlenden Licht verschoben. Spezifische streuungsspektroskopische Verfahren schließen Raman-Spektroskopie ein.
IR-Spektroskopie ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Licht im mittleren Infrarotbereich durch eine Probe. Licht im mittleren Infrarotbereich (2,5–50 μm, 4.000–200 cm^–1) ist energetisch ausreichend, um Molekülvibrationen auf höhere Energieniveaus anzuregen. Die Wellenlänge der IR-Absorptionsbanden ist charakteristisch für spezifische Typen von chemischen Bindungen und IR-Spektroskopie ist im allgemeinen am nützlichsten zur Identifizierung organischer und metallorganischer Moleküle.
Absorptionsspektroskopie im nähen Infrarotbereich (NIR) ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Licht im nahen Infrarotbereich durch eine Probe. Licht im nahen Infrarotbereich überspannt den Bereich 800 nm bis 2,5 μm (12.500 bis 4.000 cm^–1) und ist energetisch ausreichend, um Obertöne und Kombinationen von Molekülvibrationen auf höhere Energieniveaus anzuregen. NIR-Spektroskopie wird typischerweise zw quantitativen Messung organischer funktioneller Gruppen verwendet, insbesondere O-H, N-H und C=O. Die Komponenten und die Konstruktion der NIR-Instrumentierung sind ähnlich zu UV-vis-Absorptionsspektrometern. Die Lichtquelle ist üblicherweise eine Wolframlampe und der Detektor ist üblicherweise ein PbS-Festkörperdetektor. Probenhalter können Quarz oder Glas sein und typische Lösungsmittel sind CCl₄ und CS₂. Die bequeme Instrumentierung der NIR-Spektroskopie macht sie für on-line-Überwachung und Prozeßkontrolle geeignet.
Absorptionsspektroskopie im ultravioletten und sichtbaren Bereich ( UV-vis) ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Licht im nahen ultravioletten und sichtbaren Bereich durch eine Probe. Die Absorption im Vakuum-UV tritt bei 100–200 nm (10⁵–50.000 cm^–1), Quarz-UV bei 200–350 nm (50.000–28.570 cm^–1) und im Sichtbaren bei 350–800 nm (28.570–12.500 cm^–1) auf und wird von dem Beer-Lambert-Bouguet-Gesetz beschrieben. Ultraviolettes und sichtbares Licht sind energetisch ausreichend, um äußere Elektronen in höhere Energieniveaus zu heben. UV-vis-Spektroskopie kann üblicherweise auf Moleküle und anorganische Ionen oder Komplexe in Lösung angewendet werden. Die UV-vis-Spektren sind durch die breiten Merkmale der Spektren begrenzt. Die Lichtquelle ist üblicherweise eine Wasserstoff- oder Deuteriumlampe für UV-Messungen und eine Wolframlampe für Messungen im Sichtbaren. Die Wellenlängen dieser kontinuierlichen Lichtquellen werden mit einem Wellenlängenseparator ausgewählt, wie etwa einem Prisma oder Gittermonochromator. Spektren werden durch Abtasten des Wellenlängenseparators erhalten und quantitative Messungen können aus einem Spektrum oder bei einer einzigen. Wellenlänge durchgeführt werden.
Massenspektrometer nutzen den Unterschied im Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) ionisierter Atome oder Moleküle, um sie voneinander zu trennen. Massenspektrometrie ist daher nützlich zur Quantifizierung von Atomen oder Molekülen und auch zur Bestimmung chemischer und struktureller Informationen über Moleküle. Moleküle haben deutliche Fragmentierungsmuster, die Strukturinformation liefern, um Verbindungen zu identifizieren. Die allgemeinen Betriebsweisen eines Massenspektrometers sind wie folgt. Gasphasen-Ionen werden erzeugt, die Ionen werden in Raum oder Zeit auf der Grundlage ihres Masse/Ladungs-Verhältnisses getrennt und die Menge an Ionen jeden Masse/Ladungs-Verhältnisses wird gemessen. Die Ionentrennkraft eines Massenspektrometers wird durch die Auflösung beschrieben, die definiert ist als R = m/delta m, wobei m die Ionenmasse und delta m der Unterschied in der Masse zwischen zwei auflösbaren Peaks in einem Massenspektrum ist. Ein Massenspektrometer mit einer Auflösung von 1.000 kann z. B. ein Ion mit einem m/z von 100,0 von einem Ion mit einem m/z von 100,1 auflösen.
Im allgemeinen besteht ein Massenspektrometer (MS) aus einer Ionenquelle, einem masseselektiven Analysator und einem Ionendetektor. Die Magnetsektor-, Quadrapol- und Flugzeit-Konstruktionen erfordern auch Extraktions- und Beschleunigungs-Ionenoptiken, um Ionen aus dem Quellenbereich in den Masseanalysatorbereich zu überführen. Die Details mehrerer Masseanalysatorkonstruktionen (fiir Magnetsektor-MS, Quadrapol-MS oder Flugzeit-MS) sind unten diskutiert. Einzelfokussierungs-Analysatoren für Magnetsektor-MS nutzen einen Teilchenstrahlweg von 180, 90 oder 60 Grad. Die verschiedenen Kräfte, die das Teilchen beeinflussen, trennen Ionen mit unterschiedlichen Masse/Ladungs-Verhältnissen. Bei Doppelfokussierungsanalysatoren wird ein elektrostatischer Analysator in diesem Instrumententyp hinzugefügt, um Teilchen mit Unterschieden in den kinetischen Energien zu trennen.
Ein Quadrapol-Massenfilter für Quadrapol-MS besteht aus vier Metallstäben, die parallel angeordnet sind. Die angelegten Spannungen beeinflussen die Bahn von Ionen, die sich entlang des Flugweges bewegen, der zwischen den vier Stäben zentriert ist. Für gegebene Gleich- und Wechselspannungen gehen nur Ionen eines bestimmten Masse/Ladungs-Verhältnisses durch den Quadrapolfilter hindurch und alle anderen Ionen werden aus ihrem ursprünglichen Weg geworfen. Ein Massenspektrum wird durch Überwachen der Ionen erhalten, die durch den Quadrapolfilter hindurchgehen, wenn die Spannungen an den Stäben variiert werden.
Ein Flugzeit-Massenspektrometer nutzt die Unterschiede in der Durchgangszeit durch eine "Driftregion", um Ionen unterschiedlicher Massen zu trennen. Er arbeitet in einem Pulsmodus, so daß Ionen in Pulsen erzeugt und/oder in Pulsen extrahiert werden müssen. Ein gepulstes elektrisches Feld beschleunigt alle Ionen in einer feldfreien Driftregion mit einer kinetischen Energie qV, wobei q die Ionenladung und V die angelegte Spannung ist. Da die kinetische Ionenenergie 0,5 mV² beträgt, haben leichtere Ionen eine höhere Geschwindigkeit als schwerere Ionen und eneichen den Detektor am Ende der Driftregion früher. Der Ausgang eines Ionendetektors wird auf einem Oszilloskop als eine Funktion der Zeit dargestellt, um das Massenspektrum zu erzeugen.
Der Ionenbildungsprozeß ist der Startpunkt für massenspektrometrische Analysen. Chemische Ionisierung ist ein Verfahren, das ein Reagens-Ion einsetzt, um mit den Analytmolekülen (Markierungen) zu reagieren, um Ionen durch entweder einen Protonen- oder Hydridtransfer zu bilden. Die Reagens-Ionen werden erzeugt durch Einbringen eines großen Überschusses Methan (relativ zur Markierung) in eine Elektronenstoß(EI)-Ionenquelle. Elektronenzusammenstöße erzeugen CH₄ ⁺ und CH₃ ⁺, die weiter mit Methan reagieren, um CH₅ ⁺ und C₂H₅ ⁺ zu bilden. Ein weiteres Verfahren, um Markierungen zu ionisieren, ist durch Plasma und Glühentladung. Plasma ist ein heißes, teilweise ionisiertes Gas, das Atome wirkungsvoll anregt und ionisiert. Eine Glühentladung ist ein Niederdruckplasma, das zwischen zwei Elektroden gehalten wird. Elektronenstoßionisation setzt einen Elektronenstrahl ein, üblicherweise von einem Wolframfaden erzeugt, um Gasphasen-Atome oder -Moleküle zu ionisieren. Ein Elektron aus dem Strahl schlägt ein Elektron aus Analyt-Atomen oder -Molekülen, um Ionen zu erzeugen. Elektrosprayionisierung verwendet eine sehr feine Nadel und eine Reihe von Abstreifern. Eine Probenlösung wird in die Quellenkammer gesprüht, um Tröpfchen zu bilden. Die Tröpfchen tragen Ladung, wenn sie aus der Kapillare austreten, und wenn das Lösungsmittel verdampft, verschwinden die Tröpfchen, wobei sie hochgeladene Analytmoleküle zurücklassen. ESI ist besonders nützlich für große biologische Moleküle, die schwierig zu verdampfen oder zu ionisieren sind. Bombardierung mit schnellen Atomen (FAB) verwendet einen Hochenergiestrahl neutraler Atome, typischerweise Xe oder Ar, der auf eine feste Probe trifft, wodurch Desorption und Ionisierung bewirkt wird. Es wird für große biologische Moleküle verwendet, die schwierig in die Gasphase zu bringen sind. FAB bewirkt geringe Fragmentierung und gibt üblicherweise einen großen Molekülionenpeak, was sie nützlich zur Bestimmung der relativen Molekülmasse macht. Der Atomstrahl wird durch Beschleunigung von Ionen aus einer Ionenquelle durch eine Ladungsaustauschzelle erzeugt. Ionen nehmen in Kollisionen mit neutralen Atomen ein Elektron auf, um einen Strahl aus Hochenergie-Atomen zu bilden. Laserionisierung (LIMS) ist ein Verfahren, bei dem ein Laserpuls Material von der Oberfläche einer Probe ablöst und ein Mikroplasma schafft, das einen Teil der Probenbestandteile ionisiert. MatriX-unterstützte Laserdesorptionsionisation (MALDI) ist ein LIMS-Verfahren zum Verdampfen und Ionisieren großer biologischer Moleküle, wie etwa Proteine oder DNA-Fragmente. Die biologischen Moleküle werden in einer festen Matrix, wie etwa Nicotinsäure, dispergiert. Ein UV-Laserpuls trägt Material von der Matrix ab, was einen Teil der großen Moleküle in einer ionisierten Form in die Gasphase bringt, so daß sie in einen Massenspektrometer extrahiert werden können. Plasmadesorptionsionisation (PD) verwendet den Zerfall von ²⁵²Cf, was zwei Fissionsfragmente erzeugt, die sich in entgegengesetzte Richtungen bewegen. Ein Fragment trifft auf die Probe, wodurch 1–10 Analyt-Ionen herausgeschlagen werden. Das andere Fragment trifft auf einen Detektor und triggert den Start der Datenaufnahme. Dieses Ionisationsverfahren ist besonders nützlich für große biologische Moleküle. Resonanzionisation (RIMS) ist ein Verfahren, bei dem ein oder mehrere Laserstrahlen in Resonanz auf Übergänge eines Gasphasen-Atoms oder -Moleküls eingestellt werden, um es schrittweise über sein Ionisationspotential zu heben, um ein Ion zu erzeugen. Sekundärionisation (SIMS) verwendet einen Ionenstrahl, wie etwa ³He⁺, ¹⁶O⁺ oder ⁴⁰Ar⁺, wird auf die Oberfläche einer Probe fokussiert und zerstäubt Material in die Gasphase hinein. Funkenquelle ist ein Verfahren, das Analyte in feste Proben durch Pulsen eines elektrischen Stroms über zwei Elektroden ionisiert.
Eine Markierung kann vor, während oder nach der Abspaltung vom Molekül, an die sie gebunden ist, mit Ladung versehen werden. Ionisationsverfahren auf der Basis von Ionen-"Desorption", der direkten Bildung oder Emission von Ionen von festen oder flüssigen Oberflächen haben zunehmende Anwendung auf nicht-flüchtige und thermisch labile Verbindungen ermöglicht. Diese Verfahren eliminieren die Notwendigkeit der Verflüchtigung neutraler Moleküle vor der Ionisation und minimieren im allgemeinen die thermische Zersetzung der Molekülspezies. Diese Verfahren schließen Felddesorption (Becky, Principles of Field Ionization and Field Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford, 1977), Plasmadesorption (Sundgvist und MacFarlane, Mass Spectrom. Rev. 4: 421, 1985), Laserdesorption (Karas und Hillenkamp, Anal. Chem. 60: 2299, 1988; Karas et al., Angew. Chem. 101: 805, 1989), Bombardierung mit schnellen Teilchen (z. B. Bombardierung mit schnellen Atomen, FAB, und Sekundärionen-Massenspektrometrie, SIMS, Barher et al., Anal. Chem. 54: 645A, 1982), und Thermospray(TS)-Ionisation (Vestal, Mass Spectrom. Rev. 2: 447, 1983) ein. Thermospray wird in breitem Umfang für die on-line-Kombination mit Flüssigkeitschromatographie angewendet. Die FAB-Verfahren mit kontinuierlichem Durchfluß (Caprioli et al., Anal. Chem. 58: 2949, 1986) haben ebenfalls signifikantes Potential gezeigt. Eine vollständigere Auflistung von Ionisations/Massenspektrometrie-Kombinationen ist Ionenfallen-Massenspektrometrie, Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie, Ionenspray-Massenspektrometrie, Flüssigionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation bei atmosphärischem Druck, Elektronenionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Bombardierung mit metastabilen Atomen, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Bombardierung mit schnellen Atomen, MALDI-Massenspektrometrie, Photoionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie, Lasertröpfchen-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-Massenspektrometrie, APCI-Massenspektrometrie, Nanospray-Massenspektrometrie, Nebelsprayionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit chemischer Ionisation, Resonanzionisations-Massenspektrometrie, Sekundärionisations-Massenspektrometrie, Thermospray-Massenspektrometrie.
Die Ionisationsverfahren, die für nicht-flüchtige biologische Verbindungen geeignet sind, haben überlappende Anwendbarkeitsbereiche. Ionisationswirkungsgrade sind in hohem Maße abhängig von Matrixzusammensetzung und Verbindungstyp. Gegenwärtig verfügbare Ergebnisse weisen darauf hin, daß die obere Molekülmasse für TS etwa 8.000 Daltons beträgt (Jones und Krolik, Rapid Comm. Mass Spektrom. 1: 67, 1987). Da TS hauptsächlich mit Quadrapol-Massenspektrometern durchgeführt wird, leidet die Empfindlicheit typischerweise disproportional bei höheren Masse/Ladungs-Verhältnissen (m/z). Flugzeit(TOF)-Massenspektrometer sind kommerziell erhältlich und besitzen den Vorteil, daß der m/z-Bereich nur durch den Detektorwirkungsgrad begrenzt ist. Vor kurzem sind zwei zusätzliche Ionisationsverfahren eingeführt worden. Diese zwei Verfahren werden nun als Matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI, Karas und Hillenkamp, Anal. Chem. 60: 2299, 1988; Karas et al., Angew. Chem. 101: 805, 1989) und Elektrosprayionisation (ESI) bezeichnet. Beide Methodiken haben einen sehr hohen Ionisationswirkungsgrad (d. h. sehr hohes [erzeugte Molekülionen]/[verbrauchte Moleküle]). Die Empfindlichkeit, die das letztendliche Potential der Technik definiert, ist abhängig von der Probengröße, der Menge an Ionen, der Durchflußgeschwindigkeit, dem Nachweisgrad und dem tatsächlichen Ionisationswirkungsgrad.
Elektrospray-MS beruht auf einer Idee, die als erstes in den 1960igern vorgeschlagen wurde (Dole et al., J. Chem. Phys. 49: 2240, 1968). Elektrosprayionisation (ESI) ist ein Mittel, um geladene Moleküle für die Analyse durch Massenspektroskopie zu erzeugen. Kurz gesagt erzeugt Elektrosprayionisation hochgeladene Tröpfchen durch Vernebeln von Flüssigkeiten in einem stark elektrostatischen Feld. Die hochgeladenen Tröpfchen, die im allgemeinen in einem Trockenbadgas bei atmosphärischem Druck gebildet werden, schrumpfen durch Verdampfung von neutralem Lösungsmittel, bis die Ladungsabstoßung die kohäsiven Kräfte überwindet, was zu einer "Coulomb-Explosion" führt. Der genaue Mechanismus der Ionisation wird kontrovers diskutiert und mehrere Gruppen haben Hypothesen vorgelegt (Blades et al., Anal. Chem. 63: 2109–14, 1991; Kebarle et al., Anal. Chem. 65: A972–86, 1993; Fenn, J. Am. Soc. Mass. Spektrom. 4: 524–35, 1993). Ungeachtet des letztendlichen Ionenbildungsprozesses erzeugt ESI geladene Moleküle aus Lösung unter milden Bedingungen.
Die Fähigkeit, nützliche Massenspektrumdaten von geringen Mengen eines organischen Moleküls zu erhalten, beruht auf der effizienten Erzeugung von Ionen. Der Ionisationswirkungsgrad für ESI steht im Zusammenhang mit dem Ausmaß der positiven Ladung, die mit dem Molekül assoziiert ist. Die Verbesserung der Ionisation auf experimentellem Wege hat üblicherweise die Verwendung saurer Bedingungen mit sich gebracht. Ein weiteres Verfahren, um die Ionisation zu verbessern, ist gewesen, quartäre Amine zu verwenden, wenn möglich (siehe Aebersold et al., Protein Science 1: 494–503, 1992; Smith et al., Anal. Chem. 60: 436–41, 1988).
Elektrosprayionisation wird detaillierter wie folgt beschrieben. Elektrospray-Ionenerzeugung erfordert zwei Schritte: Dispersion hochgeladener Tröpfchen bei nahezu atmosphärischem Druck, gefolgt von Zuständen, um Verdampfung zu induzieren. Eine Lösung von Analyt-Molekülen wird durch eine Nadel geleitet, die bei hohem elektrischen Potential gehalten wird. Am Ende der Nadel dispergiert die Lösung in einen Nebel von kleinen hochgeladenen Tröpfchen hinein, die die Analyt-Moleküle enthalten. Die kleinen Tröpfchen verdampfen schnell, und mit einem Verfahren der Felddesorption oder Restverdampfung werden protonierte Proteinmoleküle in die Gasphase freigesetzt. Ein Elektrospray wird im allgemeinen durch Anlegen eines hohen elektrischen Feldes an einen geringen Flüssigkeitsstrom (im allgemeinen 1–10 μl/min) aus einer Kapillarröhre erzeugt. Eine Potentialdifferenz von 3–6 kV wird typischerweise zwischen der Kapillare und der Gegenelektrode angelegt, die 0,2 bis 2 cm entfernt angeordnet ist (wo Ionen, geladene Cluster und sogar geladene Tröpfchen, in Abhängigkeit vom Ausmaß der Desolvatisierung, vom MS durch eine kleine Öffnung gesampelt werden können). Das elektrische Feld führt zu einer Ladungsakkumulation auf der Flüssigkeitsoberfläche des Kapillarendes; somit sind die Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeit, der spezifische Widerstand und die Oberflächenspannung wichtige Faktoren bei der Tröpfchenerzeugung. Das hohe elektrische Feld führt zum Aufbrechen der Flüssigkeitsoberfläche und zw Bildung hochgeladener Flüssigkeitströpfchen. Positiv oder negativ geladene Tröpfchen können in Abhängigkeit von der Kapillarvorspannung erzeugt werden. Der negative Ionenmodus erfordert das Vorhandensein eines Elektronenfängers, wie etwa Sauerstoff, um elektrische Entladung zu hemmen.
Ein breiter Bereich von Flüssigkeiten kann elektrostatisch in ein Vakuum gesprüht werden, oder mit Hilfe eines Vernebelungsmittels. Die Verwendung von ausschließlich elektrischen Feldern zur Vernebelung führt zu einigen praktischen Beschränkungen des Bereichs der Flüssigkeitsleitfähigkeit und dielektrischen Konstante. Lösungsleitfähigkeit von weniger als 10^–5 Ohm ist bei Raumtemperatur für ein stabiles Elektrospray bei brauchbaren Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeiten erforderlich, was einer wäßrigen Elektrolytlösung von < 10^–4 M entspricht. Bei dem Modus, der sich für ESI-MS als am nützlichsten erwiesen hat, führt eine geeignete Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeit zu Dispersion der Flüssigkeit als ein feiner Nebel. In kurzer Entfernung von der Kapillare ist der Tröpfchendurchmesser oft ziemlich gleichförmig und in der Größenordnung von 1 μm. Von besonderem Interesse ist, daß der Elektrospray-Ionenstrom für höhere Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeiten nur insgesamt leicht ansteigt. Es gibt Hinweise, daß Erwärmung für die Manipulation des Elektrosprays nützlich ist. Leichte Erwärmung ermöglicht zum Beispiel, daß wäßrige Lösungen leicht in Elektrospray überführt werden können, vermutlich aufgrund der verringerten Viskosität und Oberflächenspannung. Sowohl thermisch unterstützte als auch Gasvernebelungs-unterstützte Elektrosprays ermöglichen, daß höhere Flüssigkeitsdurchflußraten verwendet werden können, senken aber das Ausmaß der Tröpfchenladung. Die Bildung von Molekülionen erfordert Bedingungen, die eine Verdampfung der anfänglichen Tröpfchenpopulation bewirken. Dies kann bei höheren Drücken durch einen Trockengasstrom bei mäßigen Temperaturen (< 60°C), durch Erhitzen während des Transports durch die Schnittstelle und (insbesondere im Falle von Ioneneinfangverfahren) durch energetische Kollisionen bei relativ niedrigem Druck durchgeführt werden.
Obgleich die detaillierten Prozesse, die ESI zugrundeliegen, unsicher bleiben, scheinen die sehr kleinen Tröpfchen, die durch ESI erzeugt werden, zu ermöglichen, daß nahezu jede Spezies, die in Lösung eine Nettoladung trägt, nach Verdampfung von Restlösungsmittel in die Gasphase überführt werden kann. Massenspektrometrischer Nachweis erfordert dann, daß Ionen nach Desolvatisierung einen verfolgbaren m/z-Bereich haben (<4.000 Daltons für Quadrapol-Instrumente) sowie mit ausreichendem Wirkungsgrad erzeugt und überführt werden können. Der breite Bereich von gelösten Stoffen, für den bereits festgestellt wurde, daß ESI-MS dafür geeignet ist, und das Fehlen einer substantiellen Abhängigkeit des Ionisationswirkungsgrades von der relativen Molekülmasse weist auf ein in hohem Maße nicht-diskriminierendes und breit anwendbares Ionisationsverfahren hin.
Die Elektrospray-Ionen-"Quelle" arbeitet bei nahezu atmosphärischem Druck. Die Elektrospray-"Quelle" ist typischerweise eine Metall- oder Glaskapillare, die ein Verfahren zur elektrischen Vorspannung der flüssigen Lösung relativ zu einer Gegenelektrode umfaßt. Lösungen, typischerweise Wasser-Methanol-Mischungen, die den Analyten und oft weitere Additive, wie etwa Essigsäure, enthalten, strömen zum Kapillarende. Eine ESI-Quelle ist beschrieben worden (Smith et al., Anal. Chem. 62: 885, 1990), die im wesentlichen jedes Lösungsmittelsystem aufnehmen kann. Typische Durchflußgeschwindigkeiten für ESI sind 1 bis 10 μl/min. Das prinzipielle Erfordernis einer ESI-MS-Schnittstelle ist, Ionen aus dem Hochdruckbereich so wirkungsvoll wie möglich in das MS zu sampeln und zu transportieren.
Der Wirkungsgrad von ESI kann sehr hoch sein, was die Grundlage für extrem empfindliche Messungen liefert, was für die hierin beschriebene Erfindung nützlich ist. Die augenblickliche Instrumentenleistung kann einen Gesamtionenstrom am Detektor von etwa 2 × 10^–12 A oder etwa 10⁷ Zählimpulse/s für einfach geladene Spezies liefern. Auf der Basis der Instrumentenleistung werden so niedrige Konzentrationen wie 10^–10 M oder etwa 10^–18 mol/s einer einfach geladenen Spezies einen nachweisbaren Ionenstrom (etwa 10 Zählimpulse/s) ergeben, wenn der Analyt vollständig ionisiert ist. Nachweisgrenzen im unteren Attomol-Bereich sind z. B. für quartäre Ammonium-Ionen unter Verwendung einer ESI-Schnittstelle mit Kapillarzonenelektrophorese erhalten worden (Smith et al., Anal. Chem. 59: 1230, 1988). Für eine Verbindung mit einer relativen Molekülmasse von 1.000 ist die mittlere Zahl von Ladungen 1, die mittlere Zahl von Ladungszuständen 1, die Peakbreite (m/z) 1 und die maximale Intensität (Ionen/s) 1 × 10¹².
Eine bemerkenswert kleine Probe wird beim Erstellen eines ESI-Massenspektrums tatsächlich verbraucht (Smith et al., Anal. Chem. 60: 1948, 1988). Substantielle Gewinne könnten auch durch die Verwendung von Array-Detektoren mit Sektorinstrumenten erzielt werden, was gleichzeitigen Nachweis von Teilen des Spektrums ermöglicht. Da gegenwärtig nur etwa 10^–5 aller Ionen, die von ESI gebildet werden, nachgewiesen werden, kann eine Fokussierung auf die Faktoren, die die Instrumentenleistung begrenzen, eine Grundlage für verbesserte Empfindlichkeit liefern. Es wird den Fachleuten deutlich sein, daß die vorliegende Erfindung Verbesserungen für Ionisations- und Nachweismethodiken überdenkt und anpaßt.
Vorzugsweise wird zwischen die Trennvonichtung (z. B. Gel) und den Detektor (z. B. Massenspektrometer) eine Schnittstelle gesetzt. Die Schnittstelle hat vorzugsweise die folgenden Eigenschaften: (1) die Fähigkeit, die DNA-Fragmente in diskreten Zeitintervallen zu sammeln, (2) die DNA-Fragmente zu konzentrieren, (3) die DNA-Fragmente aus den Elektrophoresepuffern und dem Milieu zu entfernen, (4) die Markierung vom DNA-Fragment abzuspalten, (5) die Markierung vom DNA-Fragment zu trennen, (6) das DNA-Fragment zu verwerfen, (7) die Markierung in eine flüchtige Lösung zu geben, (8) die Markierung zu verflüchtigen und zu ionisieren und (9) die Markierung in eine Elektrosprayvorrichtung einzubringen oder dorthin zu transportieren, die die Markierung in das Massenspektrometer einführt.
Die Schnittstelle hat auch die Fähigkeit, DNA-Fragmente zu "sammeln", wenn sie aus dem Boden eines Gels eluieren. Das Gel kann aus einem Slabgel, einem Röhrengel, einer Kapillare, etc. bestehen. Die DNA-Fragmente können mit verschiedenen Verfahren gesammelt werden. Das erste Verfahren ist dasjenige der Verwendung eines elektrischen Feldes, wobei DNA-Fragmente auf oder nahe einer Elektrode gesammelt werden. Ein zweites Verfahren ist dasjenige, bei dem die DNA-Fragmente durch Leiten eines Flüssigkeitsstroms am Boden eines Gels vorbei gesammelt werden. Aspekte beider Verfahren können kombiniert werden, wobei DNA in einen fließenden Strom hinein gesammelt wird, der später unter Verwendung eines elektrischen Feldes konzentriert werden kann. Das Endergebnis ist, daß DNA-Fragmente aus dem Milieu entfernt werden, in dem das Trennverfahren durchgeführt wurde. Das heißt, daß DNA-Fragmente durch Verwendung eines elektrischen Feldes aus einem Lösungstyp in einen anderen "gezogen" werden können.
Wenn die DNA-Fragmente erst einmal in der geeigneten Lösung sind (kompatibel mit Elektrospray und Massenspektrometrie), kann die Markierung vom DNA-Fragment abgespalten werden. Das DNA-Fragment (oder Reste desselben) kann von der Markierung durch das Anlegen eines elektrischen Feldes getrennt werden (vorzugsweise hat die Markierung die entgegengesetzte Ladung zu derjenigen der DNA-Markierung). Die Markierung wird anschließend durch die Verwendung eines elektrischen Feldes oder einer strömenden Flüssigkeit in die Elektrosprayvonichtung eingebracht.
Die Nachweis-Vorrichtung ist bevorzugterweise ein Massenspektrometer. Weil Massenspektrometer den Unterschied in den Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/e) von ionisierten Spezies verwenden, um spezifisch Moleküle zu identifizieren, ist diese Nachweistechnik zur Quantifizierung von kleinen Molekülen brauchbar und auch zur Bestimmung von chemischen und strukturellen Informationen über Moleküle. Einige Moleküle weisen distinkte Fragmentierungsmuster auf, die Information zur Verfügung stellen können, um strukturelle Komponenten zu identifizieren. Jedoch, für die hier beschriebene Verwendung wird das MSD im wesentlichen als ein "Anay-Detektor" für den Nachweis, die Messung und die Quantifizierung von Markern von bekannten Molekulargewicht verwendet. Daher kann ein Massenspektrometer so ähnlich verwendet werden, wie Wissenschaftler im Augenblick einen Dioden-Array-Detektor in einen UVNIS-Spektrometer verwenden, um kleine Moleküle mit bekannten Extinktionskoeffizienten zu messen. In der hier beschriebenen Anwendung werden die Marker dazu verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren und die Probenidentifikation zu kartieren.
Ein Quadrapol-Massendetektor besteht aus vier parallelen Metallstäben. Zwei gegenüberliegende Stäbe weisen ein angelegtes Potential von (U-Vcos(wt)) auf und die anderen zwei Stäbe weisen ein Potential von –(U-Vcos(wt)) auf, worin U eine DC-Spannung und Vcos(wt) eine AC-Spannung ist. Die angelegten Spannungen beeinträchtigen die Trajektion von Ionen, die entlang der Flugstrecke wandern, die zwischen den vier Stäben zentriert ist. Für gegebene DC- und AC-Spannungen passieren nur die Ionen eines bestimmten Masse-zu-Ladungsverhältnisses durch den Quadrapol-Filter und alle anderen Ionen werden aus ihrer Ausgangsbahn beworfen. Ein Masenspektrum wird durch Überwachen der Ionen erhalten, die durch den Quadrapol-Filter passieren, während die Spannungen an den Stäben variiert werden. Die Ionentrennfähigkeit eines Massenspektrometers wird durch die Auflösung beschrieben, die die Differenz in der Masse zwischen zwei auflösbaren Peaks in einem Massenspektrum ist. Gemeint ist, ein Massenspektrometer mit einer Auflösung von 1000 kann ein Ion mit einer m/e von 100,0 von einem Ion mit einer m/e von 100,1 auflösen. Der allgemeine Betrieb eines Massenspektrometers ist es, zuerst Gas-Phase-Ionen zu erzeugen, zweitens, die Ionen im Raum oder in der Zeit basierend auf ihren Masse-zu-Ladungsverhältnis zu trennen und drittens, die Menge von Ionen von jedem Masse-zu-Ladungsverhältnis zu messen.
Das Massenspektrometer ist ideal als ein Spektrometer für Anwendungen in Genomics geeignet, da es die gleichzeitige Messung von hunderten von Markern erlaubt. Die augenblickliche Zahl von genomischen Anwendungen (Sequenzierung, Kartierung, Genotypisierung) verwendet an Markern, ist ungefähr 4, was sich aus den überlappenden Emissionsspektrum von fluoreszenten Markern ergibt, die zwischen 300 nm und 700 nm plaziert werden können. Im Unterschied dazu können mit augenblicklich verwendeten Quadrapol-Instrumenten (sowie dem Micromass MS, dem Hewlett Packard LC/MSD 1100, den PE Sciex API 165 LC/MS oder dem Finnigan Navigator) ungefähr 400 Marker in den Spektren von 50–3000 amu plaziert werden. Die MS-Instrumente weisen mindestens 0,1 amu auf Lösung auf. Das neue Meßsystem, das wir beschreiben (d. h. markierte Biomoleküle) kann in Verbindung mit fast allen kommerziellen Massenspektrometern und HPLC-Systemen mit geringen Modifikationen verwendet werden. Idealer weise wird ein Software-Paket mit der "Driver"-Software beigefügt werden, um die molekularbiologischen, genetischen oder genomischen Anwendungen zu erarbeiten. Geeignete Software-Pakete sind beschrieben in z. B. U.S. Provisional Patent Application Nr. 60/053,429, angemeldet am 22. Juli 1997.
Atmosphärischer Druck chemischer Ionisierung (APCI) kann auf eine Vielzahl von Markertypen angewendet werden und wird im allgemeinen dazu verwendet, die Häufigkeit des molekularen Ions (Moleküle Formen seltener Addukte während APCI) zu verstärken. Der brauchbare Molekulargewichtsbereich von APCI ist 50 bis 3000 amu (im allgemeinen). Die Genauigkeit der Messung bei niedriger Auflösungsfähigkeit ist 0,1 amu und in dem hochauflösenden Modus, 5 ppm. Die APCI verwendet ein Reagenz-Ion, um mit den Analytmolekülen zu reagieren, um Ionen durch entweder einen Protonen- oder Hydridtransfer zu bilden. Im Augenblick werden nur ungefähr 10^–4 bis 10^–5 von allen durch APCI gebildeten Ionen nachgewiesen. Dieser wichtige Parameter (der die Instrumenten-Performance begrenzt) kann eine Basis für erhöhte Sensitivität zur Verfügung stellen. Diese Ionsierungstechnik ist ein kontinuierliches Verfahren, daß zur Verwendung als eine Schnittstelle mit HPLC oder Kapillar-Elektrophorese geeignet ist.
Es gibt alternative Formen von Ionisation, die für die CMST-Technologie angewendet werden können. Die Elektrospray-Ionisation (ESI) ermöglicht die Produktion von Molekularionen, die direkt aus Proben in Lösung. Die Elektrospray-Ionisation ist ein Verfahren, das mit einzelnen Quadrapol-Instrumenten kompatibel ist. Sehr wenig Probe wird während des Erhalts eines ESI-Massenspektrums (Smith et al., Anal. Chem. 60: 1948, 1988) gebraucht, jedoch bleibt die Gesamteffizienz der Ioneneinführung in das MS-Vakuumsystem relativ ineffizient. Die ESI leidet auch an den Effekten von denaturierenden Mitteln und Detergentien, die den Ionisationsschritt nachteilig beeinflussen. Sie kann auch für Biopolymere kleinen und großen Molekulargewichts (Peptide, Proteine, Kohlenhydrate und DNA-Fragmente) und Lipide verwendet werden. Anders als MALDI, die gepulst ist, ist ESI ein kontinuierliches Ionisationsverfahren. Mit ESI als der Ionisationsmethode werden mehrfach geladene Ionen normalerweise hergestellt (Moleküle neigen mehr zur Adduktbildung).
Ein alternatives Ionisationsverfahren ist die Matrix-unterstützte Laser-Desorption (MALDI), die dazu verwendet werden kann, um das Molekulargewicht von hier beschriebenen Markern zu bestimmen (Peptide, Proteine, Oligonukleotide und andere Verbindungen von biologischen Ursprung, sowie von kleinen synthetischen Polymeren können auch gemessen werden). Die Menge von erforderlicher Probe ist sehr gering (pmol oder weniger). Die Analyse kann auf eine lineare Weise (hohe Masse, niedriger Auflösung) bis zu einem Molekulargewicht von m/z 300.000 (in seltenen Fällen) oder Reflektronmodus (geringere Masse, höhere Auflösung) bis zu einem Molekulargewicht von 10.000 durchgeführt werden.
APCI und ESI sollten im allgemeinen als ein Komplement zu MALDI betrachtet werden. MALDI weist den schweren Nachteil auf, ein nicht-quantifizierbares Ionisationsverfahren zu sein. Die Elektrospray-Ionisation wwde auf HP-Quadrapol, den Finnigan LCQ, den Finnigan TSQ 7000 (Medicine), den PE/Sciex-Instrument und dem Micromass-Instrument installiert. Sowohl APCI und ESI weisen den Vorteil über MALDI auf, daß sie in der Lage sind, Echtzeitmessungen von Markern während jeder Art von Abtrenntechnologie (d. h. HPLC und Elektrophorese) durchzuführen.
Fluoreszenz-Markierungen können am direktesten durch ihre Absorptions- und Fluoreszenzemissionswellenlängen und -intensitäten identifiziert und quantifiziert werden.
Während ein herkömmlicher Spektrofluorometer extrem flexibel ist, wobei er kontinuierliche Bereiche für die Anregungs- und Emissionswellenlängen liefert (I_EX, I_S1, I_S2), können spezialisiertere Instrumente, wie etwa durchflußcytometer und Laserabtastmikroskope, Sonden erfordern, die bei einer einzigen fixierten Wellenlänge anregbar sind. In heutigen Instrumenten ist dies üblicherweise die 488-nm-Linie des Argonlasers.
Die Fluoreszenzintensität pro Sondenmolekül ist proportional zum Produkt von E und QY. Der Bereich dieser Parameter unter Fluorophoren von gegenwärtiger praktischer Bedeutung ist ungefähr 10.000 bis 100.000 cm^–1M^–1 für e und 0,1 bis 1,0 für QY. Wenn die Absorption durch Hochintensitätsbeleuchtung zur Sättigung getrieben wird, wird die irreversible Zerstörung des angeregten Fluorophors (Photobleichung) der Faktor, der die Fluoreszenznachweisbarkeit begrenzt. Die praktische Auswirkung der Photobleichung hängt von der jeweiligen Fluoreszenznachweistechnik ab.
Es wird einem Fachmann deutlich sein, daß eine Vorrichtung (eine Schnittstelle) zwischen die Trenn- und Nachweisschritte geschaltet werden kann, um den kontinuierlichen Betrieb von Größentrennung und Markierungsnachweis (in Echtzeit) zu ermöglichen. Dies vereinheitlicht die Trennmethodik und -instrumentierung mit der Nachweismethodik und -instrumentierung, unter Bildung einer einzigen Vorrichtung. Eine Schnittstelle ist z. B. zwischen eine Trenntechnik und den Nachweis durch Massenspektrometrie oder potentiostatischer Amperometrie geschaltet.
Die Funktion der Schnittstelle ist primär die Freisetzung der (z. B. Massenspektrometrie)-Markierung vom Analyten. Es gibt mehrere repräsentative Implementierungen der Schnittstelle. Die Konstruktion der Schnittstelle ist abhängig von der Auswahl der spaltbaren Linker. Im Falle von licht- oder photospaltbaren Linkern ist eine Energie- oder Photonenquelle erforderlich. Im Falle eines säurelabilen Linkers, eines baselabilen Linkers oder eines Disulfid-Linkers ist die Zugabe von Reagens in der Schnittstelle erforderlich. Im Falle wärmelabiler Linker ist eine Energiewärmequelle erforderlich. Enzymzugabe ist erforderlich für einen enzymempfindlichen Linker, wie etwa eine spezifische Protease und einen Peptid-Linker, einen Nuklease- und einen DNA- oder RNA-Linker, eine Glycosylase, HRP oder Phosphatase oder einen Linker, der nach Spaltung instabil ist (z. B. ähnlich zu Chemilumineszenzsubstraten). Andere Eigenschaften der Schnittstelle schließen minimale Bandenverbreiterung, Trennung der DNA von Markierungen vor Injektion in einen Massenspektrometer -ein. Trenntechniken schließen diejenigen ein, die auf Elektrophoreseverfahren und -techniken, Affinitätstechniken, Größenretention (Dialyse), Filtration und dergleichen beruhen.
Es ist auch möglich, die Markierungen (oder das Nukleinsäure-Linker-Markierungs-Konstrukt) zu konzentrieren, elektrophoretisch einzufangen und dann in einen alternativen Reagensstrom freizusetzen, der mit dem bestimmten ausgewählten Ionisationsverfahrenstyp kompatibel ist. Die Schnittstelle kann auch in der Lage sein, die Markierungen (oder Nukleinsäure-Linker-Markierungs-Konstrukte) auf Mikroperlen einzufangen, die Perle(n) in eine Kammer einzuschließen und anschließend Laserdesorption/Verdampfung durchzuführen.
Es ist auch möglich, im Strom in einen alternativen Puffer hinein zu extrahieren (z. B. aus Kapillarelektrophoresepuffer in hydrophoben Puffer durch eine permeable Membran). In einigen Anwendungen kann es auch wünschenswert sein, Markierungen intermittierend in den Massenspektrometer einzuführen, was eine weitere Funktion der Schnittstelle umfassen würde. Eine weitere Funktion der Schnittstelle ist, Markierungen aus mehreren Säulen in einen Massenspektrometer zuzuführen, mit einem rotierenden Zeitslot für jede Säule. Es ist auch möglich, Markierungen aus einer einzigen Säule in mehrere MS-Detektoren einzuführen, getrennt nach Zeit, jeden Satz von Markierungen für ein paar Millisekunden zu sammeln und dann einem Massenspektrometer zuzuführen.
Die folgende ist eine Liste repräsentativer Anbieter für Trenn- und Nachweistechnologien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Hoefer Scientific Instruments (San Francisco, CA) stellt Elektrophoreseausrüstung (Two Step^® , Poker Face^®II) für Sequenzierungsanwendungen her. Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) stellt Elektrophoreseausrüstung für DNA-Trennungen und -sequenzierung her (PhastSystem für PCR-SSCP-Analyse, MacroPhor System für DNA-Sequenzierung). Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (ABI, Foster City, CA) stellt halbautomatisierte Sequenzer auf der Basis von Fluoreszenzfarbstoffen her (ABI373 und ABI377). Analytical Spectral Devices (Boulder, CO) stellt UV-Spektrometer her. Hitachi Instruments (Tokio, Japan) stellt Atomabsorptionsspektrometer, Fluoreszenzspektrometer, LC- und GC-Massenspektrometer, NMR-Spektrometer und UV-vis-Spektrometer her. PerSeptive Biosystems (Framingham, MA) stellt Massenspektrometer (Voyager^® Elite) her. Bruker Instrumens, Inc. (Manning Park, MA) stellt FTIR-Spektrometer (Vector 22), FT-Raman-Spektrometer, Flugzeit-Massenspektrometer (Reflex II^®, Ionenfallen-Massenspektrometer (Esquire^®) und einen Maldi-Massenspektrometer her. Analytical Technology Inc. (ATI, Boston, MA) stellt Kapillargelelektrophoreseeinheiten, UV-Detektoren und Diodenarray-Detektoren her. Teledyne Electronic Technologies (Mountain View, CA) stellt einen Ionenfallen-Massenspektrometer her (3DQ Discovery^® und den 3DQ Apogee^®). Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (Foster City, CA) stellt einen Sciex-Massenspektrometer (Dreifachquadrapol LC/MS/MS, den API 100/300) her, der mit Elektrospray kompatibel ist.
Hewlett-Packard (Santa Clara, CA) stellt massenselektive Detektoren (HP 5972A), MALDI-TOF-Massenspektrometer (HP G2025A), Diodenarray-Detektoren, CE-Einheiten, HPLC-Einheiten (HP 1090) sowie UV-Spektrometer her. Finnigan Corporation (San Jose, CA) stellt Massenspektrometer (Magnetsektor (MAT 95 S^®), Quadrapol-Spektrometer (MAT 95 SQ^®) und vier weitere verwandte Massenspektrometer) her. Rainin (Ameryville, CA) stellt HPLC-Instrumente her.
Die Verfahren und Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, erlauben die Verwendung von abgespaltenen Markierungen, um als Karten für bestimmte Probentypen und Nukleotididentitäten zu dienen. Zu Beginn jedes Sequenzierungsverfahrens wird ein bestimmter (ausgewählter) Primer einer bestimmten einzigartigen Markierung zugeordnet. Die Markierungen kartieren auf entweder einen Probentyp, einen Didesoxyterminatortyp (im Falle einer Sanger-Sequenzierungsreaktion) oder vorzugsweise beides. Genauer gesagt kartiert die Markierung auf einen Primertyp, der seinerseits auf einen Vektortyp kartiert, der seinerseits auf eine Probenidentität kartiert. Die Markierung kann auch auf einen Didesoxyterminatortyp (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP) durch Bezugnahme, in welche Didesoxynukleotidreaktion der markierte Primer gegeben wird, kartieren. Die Sequenzierungsreaktion wird dann durchgeführt, und die resultierenden Fragmente werden sequentiell über die Zeit nach Größe getrennt.
Die Markierungen werden von den Fragmenten in einem Zeitrahmen abgespalten und in einem Zeitrahmen gemessen und aufgezeichnet. Die Sequenz wird durch Vergleich der Markierungskarte mit dem Zeitrahmen konstruiert. Das heißt, daß alle Markierungsidentitäten über die Zeit nach dem Bemessungsschritt aufgezeichnet und miteinander in einem Zeitrahmen in Beziehung gesetzt werden. Der Bemessungsschritt trennt die Nukleinsäurefragmente nach Inkrementen von einem Nukleotid, und die damit zusammenhängenden Markierungsidentitäten werden daher nach Inkrementen von einem Nukleotid getrennt. Durch Vorkenntnis des Didesoxyterminators, oder der Nukleotidkarte und des Probentyps kann die Sequenz leicht auf lineare Art und Weise abgeleitet werden.
Ein genetisches Fingerprinting-System der vorliegenden Erfindung besteht im allgemeinen aus einer Probeneinführungsvorrichtung, einer Vorrichtung, um die markierten Proben von Interesse zu trennen, eine Aufteilvorrichtung, um eine veränderliche Menge der Probe zu einem Fraktionssammler umzuleiten, eine Vorrichtung, um die Marker von den Proben von Interesse abzuspalten, eine Vorrichtung zum Nachweis des Markers und ein Softwareprogramm, um die gesammelten Daten zu analysieren und sie in einem Differential-Display-Modus wiederzugeben. Es wird dem Fachmann ersichtlich sein, wenn er im Besitz der vorliegenden Beschreibung ist, daß diese allgemeine Beschreibung viele Varianten jeder der angeführten Komponenten aufweisen kann. Wie am besten in 15 gesehen, besteht ein beispielhaftes genetisches Fingerprinting-System 10 der vorliegenden Erfindung aus einer Probeneinführvorrichtung 12, einer Trennvorrichtung 14, die die Proben durch High-Performance-Liquid-Chromatographie (HPLC) trennt, eine Aufteilvorrichtung 13, einen Fraktionssammler 15, eine Photospaltungsvorrichtung 16, um die Marker von den Proben von Interesse abzuspalten, eine Nachweisvorrichtung 18, die die Marker mittels, eines elektrochemischen Detektors nachweist und eine Daten verarbeitende Vorrichtung 20, mit einem Datenanalyse-Softwareprogramm, das die Ergebnisse aus der Nachweisvorrichtung analysiert. Jede Komponente wird im folgenden genauer diskutiert.
Die Probeneinführvorrichtung 12 nimmt automatisch einen gemessenen Aliquot 22 des PCR-Produkts, das in dem genetischen Fingerprinting-Verfahren erzeugt wurde und liefert sie über eine herkömmliche Leitung 24 zu der Trennvorrichtung 14 (im allgemeinen eine HPLC). Die Probeneinführvorrichtung 12 der exemplarischen Ausführungsform besteht aus einem Temperatur kontrollierten Autosampler 26, der Mikrotiterplatten aufnehmen kann. Der Autosampler 26 ist Temperatur kontrolliert, um die Integrität der erzeugten Nukleinsäureproben aufrechtzuerhalten und ist in der Lage, 25 μl oder weniger an Probe zu injizieren. Hersteller von diesem Typ von Probeneinführungsvorrichtung 12 sind, zum Beispiel, Gilson (Middleton, WI).
Die Probeneinführvorrichtung 12 ist operativ in Reihe mit der Auftrennvorrichtung 14 durch eine herkömmliche Leitung 24 verbunden. Die PCR-Produkte in den gemessenen Aliquot 22, die in der Auftrennvorrichtung 14 aufgenommen werden, werden temporal durch High- Performance-Liquid-Chromatographie getrennt, um getrennte DNA-Fragmente zur Verfügung zu stellen. Die High-Performance-Liquid-Chromatographie kann eine isokratische, binäre oder quaternäre Pumpe(n) 27 aufweisen und kann von vielen Herstellern erworben werden (z. B. Hewlett Packard (Palo Alto, CA) HP 1100 oder 1090 Serie, Beckman Instruments Inc. (800-142-2345), Bioanalytical Systems, Inc. (800-845-4246), ESA, Inc. (508) 250-700), Perkin-Eimer Corp. (800-762-4000), Varian Instruments (800-926-3000), Waters Corp. (800-254-4752)).
Die Auftrennvorrichtung 14 schließt eine analytische HPLC-Säule 28 ein, die zur Verwendung zur Auftrennung der Oligonukleotide geeignet ist. Die Säule 28 ist eine analytische HPLC, zum Beispiel modifizierter nicht-poröses Polystyroldivinylbenzol-(2,2 μm Partikelgröße)-fester Träger, der innerhalb eines pH-Bereichs von 2–12, Drücken von bis zu 3000 psi und einem Temperaturbereich von 10 bis 70°C betrieben werden kann. Eine Temperatur-Kontrollvorrichtung (z. B. ein Säulenofen) (nicht gezeigt) kann dazu verwendet werden, um die Temperatur der Säule zu kontrollieren. Solche Temperatur-Kontrollvorrichtungen sind im Stand der Technik bekannt und können zum Beispiel von Rainin Instruments (Tochterunternehmen von Varian Instruments, Palo Alto, CA) erworben werden. Eine geeignete Säule 28 ist unter dem kommerziellen Namen DNASep^® erhältlich und ist von Serasep (San Jose, CA) erhältlich. Andere geeignete analytische HPLC-Säulen sind von anderen Herstellern erhältlich (z. B. Hewlett Packard (Palo Alto, CA), Beckman Industries (Brea, CA), Waters Corp. (Milford, MA) und Supelco (Bellefonte, PA)).
Die Auftrennvorrichtung 14 in der gezeigten Ausführungsform enthält den Probenteiler 13 und der Probenteiler ist mit dem Flußstrom der Proben verbunden. Der Probenteiler 13 ist dazu angepaßt, um auf eine herkömmliche Weise variable Mengen von Probe zum Fraktionssammler 15 entweder für weitere Analyse oder Lagerung umzuleiten. Der Fraktionssammler 15 muß in der Lage sein, kleine Volumen aufzunehmen, eine Temperaturkontrolle zu niedrigen Temperaturen aufzuweisen und einstellbare Probenzeiten zu haben. Hersteller von In-line-Abteilern schließen Upchurch (Oak Harbor, WA) ein.
Der Fraktionssammler 15 ist an die HPLC/LC-Vorrichtung über eine Fluß-Aufteilungsleitung 29 angebracht. Die Fraktionssammler 15 erlauben die Sammlung von spezifischen Peaks, DNAs, RNAs und Nukleinsäurefragmenten oder Molekülen von Interesse in Röhrchen, Vertiefungen von Mikrotiterplatten oder Behältern. Zusätzlich können die Fraktionssammler 15 alles oder einen Teil eines Sets von Nukleinsäurefragmenten sammeln, die durch HPLC oder LC getrennt wurden. Hersteller von Fraktionssammlern schließen Gilson (Middleton; WI) und Isco (Lincoln, NE) ein. Die Verwendung eines Fraktionssammlers 15 in dieser Technologie stellt bemerkenswerte wesentliche Vorteile über die Gel-basierten Systeme zur Verfügung. Zum Beispiel ist es möglich, direkt Nukleinsäurefragmente zu klonieren, die durch die HPLC- oder LC-Verfahren erhalten wurden. Zusätzlich ist es möglich, Nukleinsäurefragmente durch PCR zu amplifizieren, die durch HPLC- oder LC-Verfahren erhalten wurden. Diese zwei Verfahren ermöglichen die schnelle Identifizierung von Nukleinsäurefragmenten von Interesse auf einem Sequenzniveau. Beide Verfahren sind mühsam und ineffektiv, wenn in Verbindung mit Gel-basierten Systemen verwendet.
In der dargestellten Ausführungsform ist der Fraktionssammler 15 eine einzelne Komponente vom genetischen Fingerprinting-System 10. In einer alternativen Ausführungsform (nicht gezeigt) ist der Fraktionssammler 15 in der Probeneinführungsvorrichtung 12 integriert. Demzufolge richtet die Fluß-Teilungsleitung 32 die geteilte Probe von dem Probenteiler 13 zurück zu der Probeneinführvorrichtung 12.
Ein Strom der getrennten DNA-Fragmente (z. B. Sequenzreaktionsprodukte) fließt durch eine herkömmliche Leitung 30 von der Trennvorrichtung 14 stromabwärts des Probenteilers 13 zu der Spaltungsvorrichtung 16. Jedes der DNA-Fragmente ist mit einem einmaligen abspaltbaren (z. B. Photo-abspaltbaren) Marker markiert. Der Flußstrom von aufgetrennten DNA-Fragmenten passiert durch oder entlang der Spaltvorrichtung 16, wo der Marker für den Nachweis (z. B. durch Massenspektrometrie oder mit einem elektrochemischen Detektor) entfernt wird. In der beispielhaften Ausführungsform ist die Spaltvorrichtung 16 eine photospaltende Einheit, so daß der Flußstrom der Probe gegenüber ausgewählter Lichtenergie und Wellenlänge ausgesetzt wird. In einer Ausführungsform tritt die Probe in die photospaltende Einheit 16 ein und wird gegenüber der ausgewählten Lichtquelle für eine ausgewählte Zeitdauer ausgesetzt. In einer alternativen Ausführungsform wird der Flußstrom der Probe angrenzend an die Lichtquelle entlang eines Flußpfades getragen, der ein ausreichendes Aussetzen gegenüber seiner Lichtenergie zur Verfügung stellt, um die Marker von den getrennten DNA-Fragmenten abzuspalten. Eine photospaltende Einheit ist von Supelco (Bellefonte, PA) erhältlich. Photospaltung kann bei vielen Wellenlängen mit einer Quecksilber/Xenon-Lichtbogenlampe durchgeführt werden. Die Wellenlängengenauigkeit ist ungefähr 2 nm mit einer Bandbreite von 10 nm. Der bestrahlte Bereich ist kreisförmig und typischerweise ein Bereich von 10–100 Quadratzentimetern. In alternativen Ausführungsformen können andere Spaltvorrichtungen, die durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Fluorid, Thiolaustausch, Photolyse oder enzymatische Bedingungen spalten, dazu verwendet werden, um die Marker von den aufgetrennten DNA-Fragmenten zu entfernen.
Nachdem die Spaltvorrichtung 16 die Marker von den aufgetrennten DNA-Fragmenten abspaltet, fließen die Marker durch eine herkömmliche Röhre 32 zur Nachweisvorrichtung 18 zum Nachweis jedes Markers. Der Nachweis der Marker kann auf dem Unterschied im elektrochemischen Potential zwischen jedem der Marker basiert sein, die dazu verwendet wurden, jede Art von DNA zu markieren, die in dem PCR-Schritt erzeugt wurde. Der elektrochemische Detektor 18 kann auf entweder coulometrischen oder amperometrischen Prinzipien beruhen. Der bevorzugte elektromechanische Detektor 18 ist der coulometrische Detektor, der aus einem Durchfluß- oder porösen Carbongraphit amperometrischen Detektor besteht, wobei die Probe durch die Elektrode hindurch passiert, was zu einer 100%-igen Nachweiseffizienz führt. Um jede Komponente vollständig nachzuweisen, wird ein Array von 16 coulometrischen Detektoren, die jeder bei einem unterschiedlichen Potential (im allgemeinen bei 60 mV anstiegen) gehalten wird. Beispiele von Herstellern dieses Typs von Detektor sind ESA (Bedford, MA) und Bioanalytical Systems Inc. (800-845-4246).
In einer alternativen Ausführungsform, die schematisch in 16 dargestellt ist, sind die Probeneinführungsvorrichtung 12, die Abtrennvorrichtung 14 und die Spaltvorrichtung 16 in Reihe wie oben diskutiert miteinander verbunden, um den Fluß der Probe aufrechtzuerhalten. Die Spaltvorrichtung 16 ist mit einer Nachweisvorrichtung 18 verbunden, die ein Massenspektrometer 40 oder ähnliches ist, die die Markierungen basierend auf dem Unterschied im Molekulargewicht zwischen jedem der Marker, die dazu verwendet wurden, um jede Art von DNA zu markieren, die in dem PCR-Schritt erzeugt wurde, nachzuweisen. Der Beste auf Unterschieden in der Masse basierende Detektor ist das Massenspektrometer. Für diese Verwendung wird das Massenspektrometer 40 typischerweise eine atmosphärischer Druckionisations (API)-Schnittstelle mit entweder Elektrospray- oder chemischer Ionisation, einen Quadrapol-Massenanalyser und einen Massenbereich von mindestens 50 bis 2600 m/z aufweisen. Beispiele von Herstellern eines geeigneten Massenspektrometers sind: Hewlett Packard (Palo Alto, CA), HP 1100 LC/MSD, Hitachi Instruments (San Jose, CA), M-1200H LC/MS, Perkin Elmer Corporation, Applied Biosystems Division (Foster City, CA) API 100 LC/MS oder API 300 LC/MS/MS, Finnigan Corporation (San Jose, CA) LCQ, MAT 95 S, Bruker Analytical Systems, Inc. (Billerica, MA) APEX, BioAPEX und ESQUIRE und Micromass (U.K.).
Die Nachweisvorrichtung 18 ist elektronisch mit einem Datenprozessor und Analysen 20 verbunden, der Daten von der Nachweisvorrichtung empfängt. Der Datenprozessor und der Analysen r schließen ein Softwareprogramm ein, das den nachgewiesenen Marken identifiziert. Der Datenprozessor und Analysen 230 in alternativen Ausführungsformen ist operativ mit der Injektionsvorrichtung 12, der Trennvorrichtung 14, den Fraktionssammler 15 und/oder der Spaltvorrichtung 16 verbunden, um die verschiedenen Komponenten des genetischen Fingerprinting-Systems 10 zu kontrollieren.
Das Software-Paket kartiert die elektrochemische Signatur eines bestimmten Markers mit einem spezifischen Primer und einer Retentionszeit. Software erzeugte Nukleinsäureprofile werden dann verglichen (Länge zu Länge, Fragment zu Fragment) und die Ergebnisse werden dem Verwender berichtet. Die Software wird sowohl Ähnlichkeit und Unterschiede in den Nukleinsäurefragmentprofilen hervorheben. Die Software wird auch in der Lage sein, die Sammlung von spezifischen Nukleinsäurefragmenten durch den Fraktionssammler 15 zu steuern.
Das Software-Paket kartiert die m/z-Signatur eines bestimmten Markers mit einem bestimmten Primer und einer Retentionszeit. Software erzeugte Nukleinsäureprofile werden dann verglichen (Länge zu Länge, Fragment zu Fragment) und die Ergebnisse dem Verwender berichtet. Die Software wird sowohl die Ähnlichkeiten als auch die Unterschiede in den Nukleinsäurefragmentprofilen hervorheben. Die Software wird auch in der Lage sein, die Sammlung von spezifischen Nukleinsäurefragmenten durch den Fraktionssammler zu steuern.
Das System 18 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird durch operatives miteinander Verbinden der multiplen Komponenten des Systems zur Verfügung gestellt. Demzufolge können eine oder mehrere Systemkomponenten, wie zum Beispiel die Probeneinführvorrichtung 12 und die Nachweisvorrichtung 18, die in einem Labor in Betrieb sind, mit den anderen Komponenten des Systems, kombiniert werden (z. B. der Abtrennvorrichtung 14, der Spaltvorrichtung 16 und dem Datenprozessor und Analyser 20, um das Labor mit dem DNA-Sequenzierungssystem 10 der vorliegenden Erfindung auszurüsten.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Differential-Display-System zur Verfügung, das im allgemeinen aus einer Probeneinführvorrichtung, eine Vorrichtung, um die markierten Proben von Interesse zu trennen, einer Aufteilvorrichtung, um eine variable Menge der Probe zu einem Fraktionssammler umzuleiten, eine Einheit, um die Marker von den Proben von Interesse abzuspalten, eine Vorrichtung zum Nachweis des Markers und ein Softwareprogramm, um die gesammelten Daten zu analysieren und sie in einem Differential-Displaymodus wiederzugeben, besteht. Es wird dem Fachmann ersichtlich sein, der sich in Besitz der vorliegenden Offenbarung befindet, daß die allgemeine Beschreibung viele Varianten für jede der aufgelisteten Komponenten haben kann. Das Differential-Displaysystem einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus ähnlichen Komponenten, die in 15 dargestellt sind, einschließlich der Probeneinführvorrichtung 12, der Abtrennvorrichtung 14 zur Abtrennung der Proben durch High-Performance-Liquid-Chromatographie (HPLC), der Abteilvorrichtung 13, dem Fraktionssammler 15, der Photospaltungsvorrichtung 16, um die Macker von den Proben von Interesse abzuspalten, der Nachweisvorrichtung 18 zum Nachweis der Macker durch Elektrochemie und den Datenprozessor und Analyser 20, mit einem Softwareprogramm. Jede Komponente wird unten genauer diskutiert.
In dem Differential-Displaysystem nimmt die Probeneinführvorrichtung 12 automatisch einen gemessenen Aliquot 22 des PCR-Produkts, der in dem Differential-Displayverfahren erzeugt wurde und führt sie über eine herkömmliche Leitung 24 zu der Abtrennvorrichtung 14 (im allgemeinen ein HPLC) zu. Die Probeneinführvorrichtung 12 der beispielhaften Ausführungsform besteht aus einem Temperatur kontrollierten Autosampler 26, der Mikrotiterplatten aufnehmen kann. Der Autosampler 26 muß Temperatur-kontrolliert sein, um die Integrität der erzeugten Nukleinsäureproben aufrechtzuerhalten und in der Lage sein 25 μl oder weniger an Probe zu injizieren. Hersteller dieses Typs von Produkt sind zum Beispiel durch Gilson (Middleton, WI repräsentiert.
Die Probeneinführvorrichtung ist operativ in Reihe mit der Abtrennvorrichtung durch die herkömmliche Leitung 24 verbunden. Die PCR-Produkte in den gemessenen Aliquots 22, die in der Auftrennvorrichtung 14 aufgenommen werden, werden temporal durch High-Performance-Liquid-Chromatographie abgetrennt, um abgetrennte DNA-Fragmente zur Verfügung zu stellen. Die High-Performance-Liquid-Chromatographie kann eine isokratische, binäre oder quaternäre Pumpe(n) 27 aufweisen und kann von zahlreichen Herstellern erworben werden (z. B. Hewlett Packard (Palo Alto, CA) HP 1100 oder 1090 Serien, Analytical Technology Inc. (Madison, WI), Perkin Elmer, Waters, usw.). Die Auftrennvorrichtung 14 schließt eine analytische HPLC-Säule 28 ein, die zur Verwendung zur Abtrennung der Oligonukleotide geeignet ist. Die Säule 28 ist eine analytische HPLC, zum Beispiel, nicht poröses Polystyroldivinylbenzol (2,2 μl Partikelgröße) fester Träger, modifiziert, die innerhalb eines pH-Bereichs von 2 bis 12, drücken von bis zu 3000 psi und einem Temperaturbereich von 10 bis 70°C betrieben werden kann. Eine Temperatur-Kontrollvorrichtung (z. B. ein Säulenofen) (nicht gezeigt) kann dazu verwendet werden, um die Temperatur der Säule zu kontrollieren. Solche Temperatur-Kontrollvorrichtungen sind im Stand der Technik bekannt und können zum Beispiel von Rainin Instruments (Tochterunternehmen von Varian Instruments, Palo Alto, CA) erworben werden. Eine geeignete Säule 28 ist unter dem kommerziellen Namen DNAsep^® erhältlich und ist von Serasep (San Jose, CA) erhältlich. Andere geeignete analytische HPLC-Säulen sind von anderen Herstellern erhältlich (z. B. Hewlett Packard (Palo Alto, CA), Beckman Industries (Brea, CA), Waters Corp. (Milford, MA) und Supelco (Bellefonte, PA)).
In der dargestellten Ausführungsform ist der Fraktionssammler 15 eine einzelne Komponente des Differential-Displaystems 10, die an die anderen Komponenten des Systems gekoppelt ist. In einer alternativen Ausführungsform ist der Fraktionssammler 15 in die Probeneinführungsvorrichtung 12 integriert. Demzufolge leitet die Fluß-Aufteilungsleitung 32 die getrennten Proben von dem Probenteiler 13 zurück zu der Probeneinführvorrichtung 12.
Die Auftrennvorrichtung 14 in der dargestellten Ausführungsform enthält den Probenteiler 13, der mit dem Flußstrom der Probe verbunden ist. Der Probenteiler 13 ist so angepaßt, um auf eine herkömmliche Weise veränderliche Mengen von Probe zu dem Fraktionssammler 15 entweder für die weitere Analyse oder Lagerung abzuteilen. Der Fraktionssammler 15 muß in der Lage sein, kleine Volumen aufzunehmen, eine Temperaturkontrolle zu niedrigen Temperaturen aufzuweisen und einstellbare Probenzeiten aufzuweisen. Hersteller von In-line-Abteilern schließen Upchurch (Oak Harbor, WA) ein.
Ein Fluß der getrennten DNA-Fragmente fließt durch eine herkömmliche Leitung 30 von der Auftrennvorrichtung 14 stromabwärts des Probenteilers 113 zu der Spaltvorrichtung 16. Jedes der PCR-Produkte ist mit einem einmaligen spaltbaren (z. B. photospaltbaren) Marker markiert. Der Flußstrom von getrennten DNA-Fragmenten passiert durch oder entlang der Spaltvorrichtung 16, wo der Marker zum Nachweis durch elektrochemischen Nachweis entfernt wird. In der beispielhaften Ausführungsform ist die Spaltvorrichtung 16 eine photospaltende Einheit, so daß der Flußstrom der Probe gegenüber einer ausgewählten Lichtenergie ausgesetzt wird. In einer Ausführungsform tritt die Probe in die photospaltende Einheit 16 ein und wird gegenüber der ausgewählten Lichtquelle für eine ausgewählte Zeitdauer ausgesetzt. In einer alternativen Ausführungsform wird der Strom an Probe in einem geeigneten Rohrteil oder ähnlichen in Angrenzung an die Lichtquelle entlang eines Weges geführt, der ein ausreichendes Aussetzen gegenüber der Lichtquelle zur Verfügung stellt, um die Marker von dem abgetrennten DNA-Fragmenten abzuspalten. Eine photospaltende Einheit ist erhältlich von Supelco (Bellefonte, PA). Die Photospaltung kann bei vielen Wellenlängen mit einer Quecksilber/Xenon-Bogenlampe durchgeführt werden. Die Wellenlängengenauigkeit ist ungefähr 2 nm mit einer Bandbreite von 10 nm. Der bestrahlte Bereich ist kreisförmig und typischerweise ein Bereich von 10–100 Quadratzentimetern. In alternativen Ausführungsformen können andere Spaltvorrichtungen, die durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Fluorid, Thiolaustausch, Photolyse oder enzymatische Bedingungen spalten, dazu verwendet werden, die Marker von den abgetrennten DNA-Fragmenten zu entfernen.
Nachdem die Spaltvorrichtung 16 die Marker von den abgetrennten DNA-Fragmenten abspaltet, fließen die Marker durch ein konventionelles Röhrchen 32 zur der Nachweisvorrichtung 18 zum Nachweis jedes Markers. Der Nachweis der Marker basiert auf dem Unterschied in dem elektrochemischen Potential zwischen jedem der Marker, die dazu verwendet werden, jede in dem PCR-Schritt erzeugte Art von DNA zu markieren. Der elektrochemische Detektor 18 kann auf entweder coulometrischen oder amperometrischen Prinzipien operieren. Der bevorzugte elektromechanische Detektor 18 ist der coulometrische Detektor, der aus einem Durchfluß oder porösen Carbongraphit amperometrischen Detektor besteht, wobei das Säuleneluat durch die Elektrode hindurch passiert, was zu einer 100%-igen Nachweiseffizienz führt. Um jede Komponente vollständig nachzuweisen, wird ein Array von 16 coulometrischen Detektoren, wobei jeder bei einem unterschiedlichen Potential gehalten wird (im allgemeinen bei 60 mV anstiegen) verwendet. Die Hersteller dieses Typs von Detektor schließen ESA (Bedford, MA) und Bioanalytical Systems Inc. (800-845-4246) ein.
In einer alternativen Ausführungsform des schematisch in 16 dargestellten Differential-Displaysystems sind die Probeneinführungsvorrichtung 12, die Abtrennvorrichtung 14 und die Spaltvorrichtung 16 in Reihe verbunden, wie oben diskutiert, um den Fluß an Probe aufrechtzuerhalten. Die Abspaltvorrichtung 16 ist mit einer Nachweisvorrichtung 18 verbunden, die die Marker basieren auf den Unterschied im Molekulargewicht zwischen jedem der Marker, die dazu verwendet werden, jede Art von in PCR-Schritt erzeugte DNA zu markieren, basiert. Der Beste auf Unterschieden in der Masse basierende Detektor ist das Massenspektrometer 40. Für diese Verwendung wird das Massenspektrometer typischerweise eine atmosphärische Druckionisations (API)-Schnittstelle mit entweder Elektrospray oder chemischer Ionisation, einen Quadrapol-Massenanalyser und einen Massenbereich von mindestens 50 bis 2600 m/z aufweisen. Beispiele von Herstellern von geeigneten Massenspektrometern sind: Hewlett Packard (Palo Alto, CA), HP 1100 LC/MSD, Hitachi Instruments (San Jose, CA), M-1200H LC/MS, JEOL USA, Inc. (Peabody, MA), Perkin Elmer Corporation, Applied Biosystems Division (Foster City, CA) API 100 LC/MS oder API 300 LC/MS/MS, Finnigan Corporation (San Jose, CA) LCQ, MAT 95 S, MAT 95 Q, MAT 900 S, MAT 900 SQ und SSQ 7000, Bruker Analytical Systems, Inc. (Billerica, MA) APEX, BioAPEX und ESQUIRE.
Die Nachweisvorrichtung 18 ist elektronisch mit einem Datenprozessor und Analyser 20 verbunden, der Daten von der Nachweisvorrichtung empfängt. Der Datenprozessor und der Analyser 20 schließen ein Softwareprogramm ein, das den nachgewiesenen Marker und seine Position in der DNA-Sequenz identifiziert. Der Datenprozessor und Analyser 20 ist in alternativen Ausführungsformen operativ mit der Injektionsvorrichtung 12, der Abtrennvorrichtung 14, den Fraktionssammler 15 und/oder der Spaltvomchtung 16 verbunden, um die verschiedenen Komponenten des Differential-Displaysystems zu kontrollieren.
Das Softwarepaket kartiert die Signatur eines gegebenen Markers auf einen spezifischen Primer und eine Retentionszeit. Software erzeugte Nukleinsäureprofile werden dann verglichen (Länge zu Länge, Fragment zu Fragment) und die Ergebnisse werden dem Verwender berichtet. Die Software wird sowohl Ähnlichkeiten als auch Unterschiede in den Nukleinsäurefragmentprofilen hervorheben. Die Software wird auch in der Lage sein, die Sammlung von spezifischen Nukleinsäurefragmenten durch den Fraktionssammler 15 zu steuern.
Das Softwarepaket kartiert die m/z-Signatur eines bestimmten Markers auf einen spezifischen Primer und einer Retentionszeit. Die Software erzeugten Nukleinsäureprofile werden dann verglichen (Länge zu Länge, Fragment zu Fragment) und die Ergebnisse dem Verwender berichtet. Die Software hebt sowohl Ähnlichkeiten als auch Unterschiede in den Nukleinsäurefragmentprofilen hervor. Die Software ist auch in der Lage, die Sammlung von spezifischen Nukleinsäurefragmenten durch den Fraktionssammler zu steuern.
Das Differential-Displaysystem wird durch operatives miteinander Verbinden der zahlreichen Komponenten des Systems zur Verfügung gestellt. Demzufolge können eine oder mehrere Komponenten des Systems, wie zum Beispiel die Probeneinführvorrichtung 12 und die Nachweisvorrichtung 18, die in einem Labor in Betrieb sind, mit den anderen Komponenten des Systems kombiniert werden (z. B. der Abtrennvorrichtung 14, der Spaltvorrichtung 16 und dem Datenprozessor und Analyser 20, um das Labor mit einem System in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung auszurüsten.
Einzel-Nukleotid-Verlängerungsassay, Oligo-Ligationsassay oder Oligonukleotidsonde basierte Assaysysteme der vorliegenden Erfindung bestehen aus, im allgemeinen, einer Probeneinführvorrichtung, einer Vorrichtung um die markierten Proben von Interesse aufzutrennen, einer Vorrichtung um die Marker von den Proben von Interesse abzuspalten, einer Vorrichtung zum Nachweis des Markers und ein Softwareprogramm, um die gesammelten Daten zu analysieren. Es wird dem Fachmann ersichtlich sein, wenn in Besitz der vorliegenden Beschreibung, daß die allgemeine Beschreibung viele Varianten für jede der aufgelisteten Komponenten aufweisen kann. Wie am besten in 17 gesehen wird (brauche Figur #) besteht ein bevorzugtes Einzel-Nukleotid-Verlängerungsarray, Oligoligationsassay oder Oligonukleotidsonde basiertes Assaysystem 200 aus einer Probenzuführvorrichtung 212, einer Abtrennvorrichtung 214, daß die Proben durch High-Performance-Liquid-Chromatographie (HPLC) trennt, einer Spaltvorrichtung 216, um die Marker von den Proben von Interesse abzuspalten, einer Nachweisvorrichtung 218 zum Nachweis der Marker durch Massenspektrometrie und einen Datenprozessor und Analyser 220, der ein Softwareprogramm enthält. Jede Komponente wird unten genauer diskutiert.
Die Probenzuführvorrichtung 212 nimmt automatisch ein gemessenes Aliquot 222 des durch eine Vielzahl von Verfahren (PCR, Ligationen, Verdau, Nuklearen, usw.) erzeugten Nukleinsäurefragments und führt sie über eine herkömmliche Leitung 224 zu einer Abtrennvorrichtung 214 (im allgemeinen ein HPLC) zu. Die Probenzuführvorrichtung 212 der beispielhaften Ausführungsform besteht aus einem Temperatur kontrollierten Autosampler 226, der Mikrotiterplatten aufnehmen kann. Der Autosampler 226 muß Temperatur kontrolliert sein, um die Integrität der erzeugten Nukleinsäureproben aufrechtzuerhalten und in der Lage sein, 25 μl oder weniger an Probe zu injizieren. Hersteller dieses Produkts sind zum Beispiel durch Gilson (Middleton, WI) repräsentiert.
Die Probenzuführvorrichtung ist operativ in Reihe mit der Abtrennvorrichtung durch die herkömmliche Leitung 224 verbunden. Die Nukleinsäureprodukte (die durch PCR, Ligationsreaktionen, Verdau, Nukleasen usw. hergestellt werden können) in den gemessenen Aliquots 222, die in der Auftrennvorrichtung 214 anfangen werden, werden temporal durch High-Performance-Liquid-Chromatographie aufgetrennt. Die High-Performance-Liquid-Chromatographie kann eine isokratische, binäre oder quaternäre Pumpe(n) 227 aufweisen und kann von zahlreichen Herstellern erworben werden (z. B. Hewlett Packard (Palo Alto, CA) HP 1100 oder 1090 Serie, Beckman Instruments Inc. (800-742-2435), Bioanalytical Systems, Inc. (800-845-4246), ESA, Inc. (508) 250-700), Perkin Elmer Corp. (800-762-4000), Varian Instruments (800-926-3000), Waters Corp. (800-254-4752)).
Die Abtrennvorrichtung 214 schließt eine analytische HPLC-Säule 228 ein, die zur Verwendung zur Abtrennung der Nukleinsäurefragmente geeignet ist. Die Säule 228 ist eine analytische HPLC, zum Beispiel, nicht poröses Polystyroldivinylbenzol (2,2 μm Partikelgröße) fester Träger, der innerhalb eines pH-Bereichs von 2 bis 12, drücken von bis zu 3000 psi und einem Temperaturbereich von 10 bis 70°C betrieben werden kann. Eine Temperatur-Kontrollvorrichtung (z. B. ein Säulenofen) (nicht gezeigt) kann dazu verwendet werden, die Temperatur der Säule zu kontrollieren. Solche Temperatur-Kontrollvorrichtungen sind im Stand der Technik bekannt und können zum Beispiel von Rainin Instruments (Tochterunternehmen von Varian Instruments, Palo Alto, CA) erworben werden. Eine geeignete Säule 228 ist unter dem kommerziellen Namen DNAsep^® erhältlich und ist von Serasep (San Jose, CA) erhältlich. Eine große Vielzahl von HPLC-Säulen 228 kann für diese bestimmte technologische Einheit verwendet werden, da eine Einzel-Basenpaarauflösung nicht nötiger weise erforderlich ist. Andere geeignete analytische HPLC-Säulen sind von anderen Herstellern (z. B. Hewlett Packard (Palo Alto, CA), Beckman Instruments, Inc. (Brea, CA) und Waters Corp. (Milford, MA)) erhältlich.
Ein Strom der getrennten DNA-Fragmente (z. B. Sequenzierungs-Reaktionsprodukte) fließt durch eine herkömmliche Leitung 230 von der Trennvorrichtung 214 zu der Spaltvorrichtung 216. Jedes der DNA-Fragmente ist mit einem einmaligen spaltbaren (z. B. Photo-spaltbaren) Marker markiert. Der Flußstrom von getrennten DNA-Fragmenten passiert durch oder entlang der Spaltvorrichtung 216, wobei der Marker zum Nachweis durch Massenspektrometrie oder mit einem elektrochemischen Detektor entfernt wird. Die Photospaltungseinheit ist von Supelco (Bellefonte, PA) erhältlich. Die Photospaltung kann bei vielfachen Wellenlängen mit einer Quecksilber/Xenon-Bogenlampe durchgeführt werden. Die Wellenlängengenauigkeit ist ungefähr 2 nm mit einer Bandbreite von 10 nm. Der bestrahlte Bereich ist kreisförmig und typischerweise ein Bereich von 10–100 Quadratzentimetern. In alternativen Ausführungsformen können andere Spaltvorrichtungen, die durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Fluorid, Thiolaustausch, Photolyse oder enzymatische Bedingungen spalten, dazu verwendet werden, die Marker von den getrennten DNA-Fragmenten zu entfernen.
Nachdem die Spaltvorrichtung 216 die Marker von den getrennten DNA-Fragmenten abspaltet, fließen die Marker durch eine herkömmliche Leitung 232 zur Nachweisvorrichtung 218 zum Nachweis jedes Markers. Der Nachweis der Marker kann auf dem Unterschied im Molekulargewicht zwischen jedem der Marker, die dazu verwendet wurden, jede Art von den in den verschiedenen Assay-Schritten erzeugten DNA zu markieren, basiert sein. Der beste Detektor, der auf Unterschieden in der Masse basiert, ist das Massenspektrometer. Für diese Verwendung wird das Massenspektrometer typischerweise ein atmosphärische Druck-Ionisations (API)-Schnittstelle mit entweder Elektrospray oder chemischer Ionisation, ein Quadrapol-Massenanalyser und einen Massenbereich von mindestens 50 bis 2600 m/z aufweisen. Beispiele von Herstellern eines geeigneten Massenspektrometers sind: Hewlett Packard (Palo Alto, CA), HP 1100 LC/MSD, Hitachi Instruments (San Jose, CA) M-1200H LC/MS, Perkin Elmer Corporation, Applied Biosystems Division (Foster City, CA) API 100 LC/MS oder API 300 LC/MS/MS, Finnigan Corporation (San Jose, CA) LCQ, Bruker Analytical Systems, Inc. (Billerica, MA), ESQUIRE und Micromers (U.K.).
In einer schematisch in 16 dargestellten alternativen Ausführungsform sind die Probeneinführungsvorrichtung 212, die Abtrennvorrichtung 214 und die Spaltvorrichtung 216 in Reihe wie oben diskutiert miteinander verbunden, um den Fluß der Probe aufrechtzuerhalten. Die Spaltvorrichtung 216 ist mit einer Nachweisvorrichtung 218 verbunden, die ein elektrochemischer Detektor 240 ist, der die Marker basierend auf dem Unterschied im elektrochemischen Potential zwischen jedem der Marker, der dazu verwendet wurde, jede Art von DNA, die in dem Sequenzierungs-Reaktionsschritt erzeugt wurde, zu markieren, nachweist. Der elektrochemische Detektor 240 der beispielhaften Ausführungsform kann auf entweder coulometrischen oder amperometrischen Prinzipien arbeiten. Der bevorzugte elektrochemische Detektor 240 ist der coulometrische Detektor, der aus einem Durchfluß- oder porösen Carbongraphit amperometrischen Detektor besteht, wobei das Säulen-Eluat durch die Elektrode hindurch passiert, was zu einer 100% Nachweiseffizienz führt. Um jede Komponente voll nachzuweisen, wird ein Array von 16 coulometrischen Detektoren, die jeder bei einem unterschiedlichen Potential gehalten werden (im allgemeinen bei 60 mV anstiegen) verwendet. Beispiele von Herstellern dieses Typs von Detektoren sind ESA (Bedford, MA) und Bioanalytical Systems Inc. (800-845-4246). Zusätzliche Hersteller von elektrochemischen Detektoren können in der Liste von anderen Herstellern gefunden werden, die unten gefunden wird.
Der elektrochemische Detektor 240 ist elektrisch mit dem Datenprozessor und Analyser 220 mit dem oben diskutierten Softwarepaket verbunden. Das Softwarepaket kartiert die nachgewiesene Eigenschaft (z. B. die Masse oder elektrochemische Signatur) eines gegebenen Markers auf einem spezifischen Proben-ID. Die Software wird in der Lage sein, das Nukleinsäurefragment von Interesse zu identifizieren und die ID-Information in jeweilige Datenbanken zu laden.
Die hier beschriebenen Analysesysteme weisen zahlreiche Vorteile gegenüber den herkömmlichen Gel-basierten Systemen auf. Einer der prinzipiellen Vorteile ist, daß die Systeme vollautomatisiert werden können. Bei Verwendung eines HPLC-basierten Auftrennungssystems können die Proben automatisch in die HPLC initiiert werden, wohingegen Gel-basierte Systeme eine manuelle Beladung erfordern. Es gibt auch signifikante Zeitersparnisse, die bei der Aufbauzeit gefunden werden (keine Gelformen sind zu reinigen, keine Gele zu gießen) und der Analysezeit (mehr als 4 Stunden für ein großes Gel gegenüber viel kürzeren Zeiten (5 Minuten bis 1 Stunde) für eine HPLC-Analyse. Zusätzlich gibt es einen Probendurchsatzvorteil. Bei Verwendung der in dieser Erfindung beschriebenen Marker können viele Proben in einer Charge analysiert werden (potentiell 384 Proben/Spur), wohingegen die Gel-basierten Analysen oft auf die 4 erhältlichen Fluorophore oder eine Probe/Spur begrenzt sind. Die verwendeten Gele sind inhärent empfindlich und können leicht brechen oder eine Luftblase oder einen anderen Mangel enthalten, der das gesamte Gel oder einige Spuren unbrauchbar macht. HPLC-Säulen sind solide und, wenn prä-gepackt erworben, frei von Packdefekten, was einen konsistenten, im allgemeinen gleichmäßigen Auftrennweg erzeugt. Die HPLC-Systeme verleihen auch eine bessere Qualitätssicherung, in das interne Standards verwendet werden können, aufgrund der Reproduzierbarkeit der HPLC-Säulen. Die Gelqualität ist sowohl zwischen Gelen als auch innerhalb eines Gels konsistent, was die Verwendung von Standards nahe zu unmöglich macht. Zuletzt sind sowohl die Massenspektrometrie und elektrochemischen Detektoren sensitiver als die Detektoren, die in den Gel-basierten Systemen verwendet werden, was geringer Nachweisgrenzen und die Analyse von weniger Probe ermöglicht, was für nicht-PCR-basierte Analysen brauchbar wäre.
Markierte Proben in Array-basierten Assays
Arrays mit kovalent angebundenen Oligonukleotiden wurden hergestellt, die dazu verwendet wurden, um eine DNA-Sequenz-Analyse durch Hybridisierung durchzuführen (Southern et al., Genenomics 13: 1008, 1992; Drmanac et al., Science 260: 1649, 1993), Expressionsprofile zu bestimmen, auch Mutationen zu screenen und ähnliches. Im allgemeinen verwendet der Nachweis für diese Teste fluoreszente oder radioaktive Markierungen. Fluoreszente Markierungen können am direktesten durch ihre Absorption und Fluoreszenz-Emissions-Wellenlängen und -intensitäten identifiziert und quantifiziert werden. Ein Mikrokoskop/Kameraaufbau, unter der Verwendung einer Fluoreszenzlichtquelle ist ein bequemes Mittel zum Nachweis von Fluoreszenzmarker. Radioaktive Marker können durch Standard-Autoradiographie, Phosphor-Image-Analyse oder CCD-Detektor visualisiert werden. Für solche Marker ist die Zahl von verschiedenen Reaktionen, die zu einer einzelnen Zeit nachgewiesen werden können, begrenzt. Zum Beispiel begrenzt die Verwendung von 4 fluoreszenten Molekülen, wie zum Beispiel herkömmlich bei der DNA-Sequenz-Analyse verwendet, die Analyse auf zwei Proben zur gleichen Zeit. Im wesentlichen, aufgrund dieser Begrenzung muß jede Reaktion einzeln untersucht werden, wenn diese Detektorverfahren verwendet werden.
Ein vorteilhafteres Verfahren zum Nachweis ermöglicht, daß Vereinigen der Probenreaktionen auf mindestens einem Array und den gleichzeitigen Nachweis der Produkte. Durch Verwendung eines Markers, sowie denjenigen wie hier beschrieben, der ein unterschiedliches Molekulargewicht oder andere physikalische Eigenschaft in jeder Reaktion aufweist, kann das gesamte Set von Reaktionsprodukten zusammen geerntet und analysiert werden.
Wie oben angegeben sind die oben beschriebenen Verfahren für eine Vielzahl von Zwecken anwendbar. Zum Beispiel können die Arrays von Oligonukleotiden dazu verwendet werden, um auf die Qualität von Herstellung von Anays, zur Quantifizierung oder qualitativen Analyse von Nukleinsäuremolekülen, zum Nachweis von Mutationen, zum Nachweis von Expressionsmolekülen, für toxikologische Tests und ähnliches verwendet werden.
1. Sondenquantifizierung oder -typisierung
In dieser Ausführungsform werden die Oligonukleotide pro Element in einem Array immobilisiert, wobei jedes Oligonukleotid in dem Element eine verschiedene oder verwandte Sequenz ist. Bevorzugterweise besitzt jedes Element ein bekanntes oder verwandtes Set von Sequenzen. Die Hybridisierung einer markierten Sonde an solchen einen Array ermöglicht die Charakterisierung einer Sonde und die Identifizierung und Quantifizierung der Sequenzen, die in einer Sondenpopulation enthalten sind.
Ein generalisiertes Assay-Format, das in den bestimmten Anwendungen, die unten diskutiert werden, verwendet werden kann, ist ein Sandwich-Assay-Format. In diesem Format werden eine Vielzahl von Oligonukleotiden von bekannter Sequenz auf einem festen Substrat immobilisiert. Das immobilisierte Oligonukleotid wird dazu verwendet, um eine Nukleinsäure (z. B. RNA, rRNA, ein PCR-Produkt, fragmentierte DNA) zu fangen und dann wird eine Signalsonde an einen verschiedenen Teil der gefangenen Zielnukleinsäure hybridisiert.
Ein weiteres generalisiertes Assay-Format ist ein sekundäres Nachweissystem. In diesem Format werden die Arrays dazu verwendet, um markierte Nukleinsäuren zu identifizieren und zu quantifizieren und die in einem primären Bindungsassay verwendet wurden. Zum Beispiel, falls ein Assay zu einer markierten Nukleinsäure führt, kann die Identität dieser Nukleinsäure durch Hybridisierung an einen Array bestimmt werden. Diese Assay-Formate sind insbesondere brauchbar, wenn mit abspaltbaren Massenspektrometrie-Narkern kombiniert.
2. Mutationsnachweis
Mutationen, die ein einzelnes Nukleotid einschließen, können in einer Probe durch Scanning-Techniken identifiziert werden, die dafür geeignet sind, um vorher unbekannte Mutationen zu identifizieren oder durch Techniken, die so aufgebaut sind, um bekannte Sequenzvarianten nachzuweisen, zu unterscheiden oder zu quantifizieren. Verschiedene Scanning-Techniken für den Mutationsnachweis wurden entwickelt, basierend auf der Beobachtung, daß Heteroduplices von fehlgepaarten komplementären DNA-Strängen, die von Wildtyp- und Mutantensequenzen abgeleitet sind, ein abnormales Wanderungsverhalten aufweisen.
Die hier beschriebenen Verfahren können zum Mutationsscreening verwendet werden. Eine Strategie zum Nachweis einer Mutation in einem DNA-Strang ist durch Hybridisierung der Testsequenz an Zielsequenzen, die Wildtyp- oder Mutantensequenzen sind. Eine fehlgepaarte Sequenz weist einen destabilisierenden Effekt auf die Hybridisierung von kurzen Oligonukleotidsonden an eine Zielsequenz auf (siehe Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227, 1991). Die Test-Nukleinsäurequelle kann genomische DNA, RNA, cDNA oder die Amplifikation von jeder dieser Nukleinsäuren sein. Bevorzugterweise wird die Amplifikation von Testsequenzen zuerst durchgeführt, gefolgt von Hybridisierung mit kurzen Oligonukleotidsonden, die auf einem Array immobilisiert sind. Ein Amplifikationsprodukt kann auch viele mögliche Sequenzvarianten durch Bestimmen seines Hybridisierungsmusters an einen Array von immobilisierten Oligonukleotidsonden gescannt werden.
Ein Marker, wie zum Beispiel hier beschrieben, wird im allgemeinen in das finale Amplifikationsprodukt inkorporiert durch Verwendung eines markierten Nukleotids oder durch Verwendung eines markierten Primers. Das Amplifikationsprodukt wird denaturiert und an den Array hybridisiert. Nicht-gebundenes Produkt wird abgewaschen und an den Array gebundener Marker wird durch eine der Verfahren hier nachgewiesen. Zum Beispiel, wenn abspaltbare Massenspektrometriemarker verwendet werden, können viele Produkte gleichzeitig nachgewiesen werden.
3. Expressionsprofile/Differential Display
Säuger, wie zum Beispiel der Mensch, weisen etwa 100.000 verschiedene Gene in ihrem Genom auf, von denen nur ein kleiner Anteil, möglicherweise 15%, in jeder individuellen Zelle exprimiert werden. Differential-Display-Techniken erlauben die Identifizierung von Genen, die für individuelle Zelltypen spezifisch sind. Kurz gesagt werden im Differential Display die 3'-terminalen Teile von mRNAs amplifiziert und auf der Basis ihrer Größe identifiziert. Unter der Verwendung eines Primers, der so aufgebaut ist, um an die 5'-Grenze poly(A)-Schwanzes für die reverse Transkription zu binden, gefolgt von Amplifikation der cDNA unter der Verwendung von stromaufwärts liegenden willkürlichen Sequenzprimern, werden mRNA-Subpopulationen erhalten.
Wie hier beschrieben, wird ein Hochdurchsatzverfahren zur Messung der Expression von zahlreichen Genen, z. B. 1–2.000, zur Verfügung gestellt. Innerhalb einer Ausführungsfonn der Erfindung werden Verfahren zur Analyse des Muster zur Genexpression von einer ausgewählten biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von (a) Amplifizieren von cDNA aus einer biologischen Probe unter der Verwendung von einem oder mehreren markierten Primern, wobei der Marker korrelativ mit einer bestimmten Nukleinsäuresonde ist und nachweisbar durch nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie ist, (b) Hybridisieren von amplifizierten Fragmenten an ein Array von Oligonukleotiden, wie hier beschrieben, (c) Abwaschen von nicht-hybridisierten Material und (d) Nachweisen des Markers durch nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie, und daraus Bestimmen des Musters von Genexpression der biologischen Probe. Marker-basiertes Differential Display, insbesondere unter der Verwendung von abspaltbaren Massenspektrometriemarkern auf festen Substraten ermöglicht die Charakterisierung von unterschiedlich exprimierten Genen.
4. Einzelnukleotidverlängerungsassay
Die Primerverlängerungstechnik kann für den Nachweis von einzelnen Nukleotidaustauschen in einem Nukleinsäure-Templat verwendet werden (Sokolov, Nucleic Acids Res. 18: 3671, 1989). Die Technik ist im allgemeinen auf den Nachweis von jeder einzelnen Basenmutation anwendbar (Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143–1147, 1991). Kurz gesagt hybridisierte dieses Verfahren zuerst einen Primer an einer Sequenz angrenzend an einen bekannten einzelnen Nukleotidpolymorphismus. Die geprimte DNA wird dann Bedingungen unterzogen, in denen eine DNA-Polymerase ein markiertes dNTP, typischerweise ein ddNTP, hinzufügt, falls die nächste Base in dem Templat komplementär zu dem markierten Nukleotid in dem Reaktionsgemisch ist. In einer Modifikation wird cDNA zuerst auf eine Sequenz von Interesse amplifiziert, die einen einzelnen Basen-Unterschied zwischen zwei Allelen enthält. Jedes amplifizierte Produkt wird dann auf die Anwesenheit, Abwesenheit oder relativen Menge von jedem Allel durch Annealing eines Primers analysiert, der eine Base 5' zu dem Polymorphismus ist und Verlängern durch eine markierte Base (im allgemeinen durch ein Didesoxynukleotid). Nur wenn die korrekte Base in der Reaktion erhältlich ist, wird eine Base am 3'-Ende des Primers inkorporiert werden. Die Verlängerungsprodukte werden dann durch Hybridisierung an einen Array von Nukleotiden analysiert, so daß ein nicht-verlängertes Produkt nicht hybridisieren wird.
Kurz gesagt, wird in der vorliegenden Erfindung jedes Didesoxynukleotid mit einem einmaligen Marker markiert. Von den vier Reaktionsgemischen wird nur eine einen Didesoxy-Terminator an die Primer-Sequenz anfügen. Falls die Mutation vorhanden ist, wird sie durch den einmaligen Marker, auf dem Didesoxynukleotid nach der Hybridisierung an den Array nachgewiesen werden. Multiple Mutationen können gleichzeitig durch Agieren des DNA-Primers mit einem einmaligen Marker auch bestimmt werden. Daher werden die DNA-Fragmente in vier verschiedenen Reaktion reagiert, die jede einen verschieden markierten Didesoxy-Terminator enthalten, wobei der Marker mit einem bestimmten Didesoxynukleotid korrelativ ist und die nicht-fluoreszente Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist. Die DNA-Fragmente werden dann an einen Array hybridisiert und nicht-hybridisiertes Material wird weg gewaschen. Die Marker werden von den hybridisierten Fragmenten abgespalten und durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen. Die nachgewiesenen Marker können mit den zu untersuchenden bestimmten DNA-Fragment korreliert werden sowie der Identität des Mutanten-Nukleotids.
5. Oligonukleotid-Ligationsassay
Der Oligonukleotid-Ligationsassay, (OLA) (Landegren et al., Science 241: 487, 1988) wird für die Identifizierung von bekannten Sequenzen in sehr großen und komplexen Genomen verwendet. Das Prinzip der OLA-Reaktion beruht auf der Fähigkeit von Ligase, zwei diagnostische Oligonukleotide kovalent zu verknüpfen, wenn sie benachbart zueinander auf einem gegebenen DNA-Target hybridisieren. Wenn die Sequenzen an der Sondenverbindungsstelle nicht perfekt basengepaart sind, werden die Sonden nicht von der Ligase verknüpft werden. Bei der Anwendung von Markierungen sind diese an die Sonde angebracht, die an das amplifizierte Produkt ligiert wird. Nach Abschluß der OLA werden die Fragmente an einen Array von komplementären Sequenzen hybridisiert, die Markierungen abgespalten und mit Massenspektrometrie nachgewiesen.
Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines selektierenden Nukleinsäuremoleküls in, zum Beispiel, einer biologischen Probe, zur Verfügung gestellt, wobei die Technik des Oligonukleotid-Ligationsassays verwendet wird. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte von Durchführen einer Amplifikation auf der Ziel-DNAS, gefolgt von der Hybridisierung mit der 5'-Ende markierten Reporter-Sonde und einer 5'-phosphorylierten Sonde. Die Probe wird mit T4-DNA-Ligase inkubiert. Die DNA-Stränge mit ligierten Proben werden auf dem Array durch Hybridisierung an ein Array gefangen, wobei nicht-ligierte Produkte nicht hybridisieren. Die Marker werden von den abgetrennten Fragmenten abgespalten und dann werden die Marker durch die jeweilige Nachweistechnologie (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV/sichtbare Spektrophotometrie) nachgewiesen.
6. Andere Assays
Die hier beschriebenen Verfahren können auch dazu verwendet werden, um zu genotypisieren oder zur Identifizierung von Viren oder Mikroben. Zum Beispiel können F + RNA-Coliphagen brauchbare Kandidaten als Indikatoren für enterische Virus-Kontamination sein. Die Genotypisierung durch Nukleinsäureamplifikations- und Hybridisierungsverfahren sind verläßliche, schnelle, einfache und billige Alternativen zur Serotypisierung (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7: 1541, 1979). Die Amplifikationstechniken und Nukleinsäurehybridisierungstechniken wurden erfolgreich dazu verwendet, um eine Vielzahl von Mikroorganismen einschließlich E. coli (Feng, Mol. Cell Probes 7: 151, 1993), Rotavirus (Sethaburt et al., J. Med Virol. 37: 192, 1992), Hepatitis-C-Virus (Stuyver et al., J. Gen Virol. 74: 1093, 1993) und Herpex-Simplex-Virus (Matsumoto et al., J. Virol. Methods 40: 119, 1992) zu klassifizieren.
Genetische Änderungen wurden in einer Vielzahl von experimentellen Säuger- und menschlichen Neoplasmen beschrieben und stellen die morphologische Basis für die Sequenz von morphologischen Veränderungen dar, die bei der Karzinogenese beobachtet wurden Vogelstein et al., NEJM 319: 525, 1988). In den letzten Jahren mit dem Auftauchen von molekularbiologischen Techniken, waren allelische Verluste auf bestimmten Chromosomen oder Mutationen von Tumorsuppressorgenen sowie Mutationen in bestimmten Onkogenen (z. B. c-myc, c jun. und der ras-Familie) die am meisten untersuchten Gruppen. Vorherige Arbeit (Finkelstein et al., Arch Surg. 128: 526, 1993) identifizierte eine Korrelation zwischen verschiedenen spezifischen Typen von Punktmutationen in den K-ras-Onkogenen und der Phase bei der Diagnose in den colorectalen Karzinomen. Die Ergebnisse lassen vermuten, daß die Mutationsanalyse wichtige Informationen über die Tumoragressivität zur Verfügung stellen könnte, einschließlich des Musters und der Verbreitung von Metastasen. Der prognostische Wert von TP53- und K-ras-2-Mutationsanalyse in Phase III-Karzinomen des Colons wurde kürzlich gezeigt (Pricolo et al., Am. J. Surg. 171: 41, 1996). Es ist daher ersichtlich, daß die Genotypisierung von Tumoren und prä-kanzerösen Zellen und der spezifische Mutationsnachweis bei der Behandlung von Krebsarten in Menschen zunehmend wichtig sein werden.
Markierte Sonden in Array-basierten Sonden
Die hier beschriebenen markierten Biomoleküle können dazu verwendet werden, um (nicht-markierte) Arrays von Biomolekülen zu untersuchen. Bevorzugte Arrays von Biomolekülen enthalten ein festes Substrat, das eine Oberfläche umfaßt, wobei die Oberfläche mindestens teilweise mit einer Lage von Poly(ethylenimin) (PEI) bedeckt ist. Die PEI-Lage umfaßt eine Vielzahl von diskreten ersten Regionen, die an eine kontinuierlich zweite Region angrenzen und umgeben sind. Die ersten Regionen werden durch die Anwesenheit eines Biomoleküls und PEI definiert, während die zweite Region durch die Anwesenheit von PEI und das wesentliche Fehlen des Biomoleküls definiert ist. Bevorzugterweise ist das Substrat eine Glasplatte oder ein Silizium-Wafer. Jedoch kann das Substrat zum Beispiel Quarz, Gold, Nylon-6,6, Nylon oder Polystyrol sowie Verbundmaterialien davon sein, wie oben beschrieben.
Die PEI-Beschichtung enthält bevorzugterweise PEI, das ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 100.000 aufweist. Die PEI-Beschichtung kann direkt an das Substrat gebunden sein, unter der Verwendung von zum Beispiel silyliertem PEI. Alternativ kann ein Reaktionsprodukt eines bifunktionellen Kopplungsmittels zwischen der Substratoberfläche und der PEI-Beschichtung zwischengelagert sein, wobei das Reaktionsprodukt kovalent an sowohl die Oberfläche und die PEI-Beschichtung gebunden ist und die PEI-Beschichtung die Oberfläche sichert. Das bifunktionelle Kopplungsmittel enthält eine erste und eine zweite reaktive funktionelle Gruppe, wobei die erste reaktive funktionelle Gruppe zum Beispiel ein Tri(O-C₁-C₅alkyl)silan ist, und die zweite reaktive funktionelle Gruppe wie zum Beispiel ein Epoxid, Isocyanat, Isothiocyanat und Anhydridgruppe ist. Bevorzugte bifunktionelle Kopplungsmittel schließen 2-(3,4-Epoxycyclohexyl)ethyltrimethoxysilan; 3,4-Epoxybutyltrimethoxysilan; 3-Isocyanatopropyltriethoxysilan, 3-(triethoxysilyl)-2-methylpropylsuccinianhydrid und 3-(2,3-Epoxypropoxy)propyltrimethoxysilan ein.
Der Array der Erfindung enthält erste Biomolekül-enthaltende Regionen, wobei jede Region einen Bereich innerhalb des Bereichs von ungefähr 1.000 Quadratmikron bis ungefähr 100.000 Quadratmikron aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die ersten Regionen Bereiche auf, die von ungefähr 5.000 Quadratmikron bis ungefähr 25.000 Quadratmikron reichen.
Die ersten Regionen sind bevorzugterweise im wesentlichen kreisförmig, wobei die Kreise einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 10 Mikron bis 200 Mikron aufweisen. Ob kreisförmig oder nicht, sind die Grenzen der ersten Regionen im wesentlichen voneinander (durch die zweite Region) durch einen durchschnittlichen Abstand von mindestens ungefähr 25 Micron beabstandet, jedoch durch nicht mehr als ungefähr 1 cm (und bevorzugterweise durch nicht mehr als ungefähr 1.000 Mikron). In einem bevorzugten Array sind die Grenzen von benachbarten ersten Regionen durch eine durchschnittliche Distanz von ungefähr 25 Mikron bis ungefähr 100 Mikron beabstandet, wobei diese Distanz bevorzugterweise durch das Array hindurch konstant ist und die ersten Regionen sind bevorzugterweise in sich wiederholenden geometrischen Muster angeordnet, wie in den hier beigefügten Figuren gezeigt. In einem bevorzugten parallel wiederholenden geometrischen Muster sind alle benachbarten ersten Regionen durch ungefähr den selben Abstand (ungefähr 25 Mikron bis ungefähr 100 Mikron) getrennt.
In bevorzugten Ausführungsformen gibt es von 10 bis 50 erste Regionen auf dem Substrat. In anderen Ausführungsformen gibt es zwischen 50 und 400 erste Regionen auf dem Substrat. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform gibt es 400–800 erste Regionen auf dem Substrat.
Das in den ersten Regionen lokalisierte Biomolekül ist bevorzugterweise ein Nukleinsäurepolymer. Ein bevorzugtes Nukleinsäurepolymer ist ein Oligonukleotid, das ungefähr 15 bis 50 Nukleotide aufweist. Das Biomolekül kann Amplifikationsreaktionsprodukte sein, die von ungefähr 50 bis 1.000 Nukleotide aufweisen. In jeder ersten Region ist das Biomolekül bevorzugterweise bei einer durchschnittlichen Konzentration im Bereich von 10⁵–10⁹ Biomoleküle pro 2.000 Quadratmikron einer ersten Region vorhanden. Weiter bevorzugt reicht die durchschnittliche Konzentration von Biomolekül von 10⁷ bis 10⁹ Biomolekülen pro 2.000 Quadratmikron. In der zweiten Region ist das Biomolekül bevorzugterweise bei einer durchschnittlichen Konzentration von weniger als 10³ Biomolekülen pro 2.000 Quadratmikron der zweiten Region vorhanden und weiter bevorzugt bei einer durchschnittlichen Konzentration von weniger als 10² Biomolekülen pro 2.000 Quadratmikron. Am meisten bevorzugt enthalten die zweiten Regionen überhaupt kein Biomolekül.
Die zur Anheftung der Lage von PEI an das Substrat verwendete Chemie hängt zu einem wesentlichen Teil von der chemischen Identität des Substrats ab. Der Stand der Technik stellt zahlreiche Beispiele von geeigneten Chemien zur Verfügung, die PEI an einen festen Träger anheften können. Zum Beispiel, wenn das Substrat Nylon-6,6 ist, kann die PEI-Beschichtung durch die in Van Ness, J. et al. Nucleic Acids Res. 19: 3345–3350, 1991 und die PCT Internationale Publikation WO 94/00600, die beide durch Bezugnahme hierdurch aufgenommen sind, beschriebenen Verfahren aufgetragen werden. Wenn der feste Träger Glas oder Silizium ist, werden geeignete Verfahren zur Aufbringung einer Lage von PEI gefunden in, z. B. Wassermann, B.P. Biotechnology and Bioengineering XXII: 271–287, 1980; und D'Souza, S. F. Biotechnology Letters 8: 643–648, 1986.
Bevorzugterweise wird die PEI-Beschichtung kovalent an das feste Substrat angebracht. Wenn das feste Substrat Glas oder Silizium ist, kann die PEI-Beschichtung kovalent an das Substrat unter der Verwendung von silysierender Chemie angebunden werden. Zum Beispiel ist PEI, das reaktive Siloxy-Endgruppen aufweist, käuflich von Gelest, Inc. (Tullytown, PA) erhältlich. Solches reaktives PEI kann mit einem Glasträger oder Silizium-Wafer in Kontakt gebracht werden und nach sanftem Schütteln wird das PEI an das Substrat adherieren. Alternativ kann ein bifunktionelles silysierendes Reagenz verwendet werden. Gemäß diesem Verfahren wird das Glas- oder Silizium-Substrat mit dem bifunktionellen silysierenden Reagenz behandelt, um das Substrat mit einer reaktiven Oberfläche auszustatten. Das PEI wird dann mit der reaktiven Oberfläche in Kontakt gebracht und bindet kovalent an die Oberfläche durch das bifunktionelle Reagenz.
Die in das Array-Format plazierten Biomoleküle sind auch ursprünglich in einer sogenannten "Arraying-Lösung" vorhanden. Um Biomoleküle in diskreten Regionen auf dem PEI-beschichteten Substrat zu plazieren, enthält die Arraying-Lösung bevorzugterweise ein Verdickungsmittel bei einer Konzentration von ungefähr 35 Vol% bis 80 Vol%, basierend auf dem Gesamtvolumen der Zusammensetzung, ein Biomolekül, das bevorzugterweise ein Oligonukleotid ist, bei einer Konzentration, die von 0,001 μg/ml bis 10 μg/ml reicht und Wasser.
Die Konzentration des Verdickungsmittel ist 35% V/V bis 80% V/V für flüssige Verdickungsmittel, wie zum Beispiel Glyzerin. Die bevorzugte Konzentration von Verdickungsmittel in der Zusammensetzung hängt zu einigem Ausmaß von der Temperatur ab, bei der das Arraying durchgeführt wird. Je geringer die Arraying-Temperatur ist, desto geringer die Konzentration von Verdickungsmittel, das verwendet zu werden braucht. Die Kombination von Temperatur und flüssiger Verdickungsmittel-Kombination-Kontrolle ermöglicht es, Arrays auf den meisten Typen von festen Trägern (z. B. Glas, Wafern, Nylon 6/6, Nylonmembranen, usw.) herzustellen.
Die Anwesenheit eines Verdickungsmittels weist den zusätzlichen Vorteil von Ermöglichen der konkunierenden Anwesenheit von niedrigen Konzentrationen von verschiedenen anderen Materialien auf, die in Kombination mit dem Biomolekül vorhanden sind. Zum Beispiel können 0,001% V/V bis 1% V/V von Detergenzien in der Anaying-Lösung vorhanden sein. Dies ist brauchbar, da PCR-Puffer eine kleine Menge von Tween-20 oder NP-40 enthält und es ist häufig wünschenswert, Probennukleinsäuren direkt aus einem PCR-Gefäß ohne vorherige Reinigung der Amplikons anzuordnen. Die Verwendung eines Verdickungsmittels ermöglicht die Anwesenheit von Salzen (zum Beispiel NaCl, KCl oder MgCl₂), Puffern (zum Beispiel Tris) und/oder Chelat-bildenden Reagenzien (zum Beispiel EDTA) als auch in der Anaying-Lösung vorhanden zu sein. Die Verwendung eines Verdickungsmittels weist auch den weiteren Vorteil von Ermöglichen der Verwendung von kreuzvernetzenden Reagenzien und/oder organischen Lösungsmitteln auf, die in der Anaying-Lösung vorhanden sein können. Wie käuflich erhalten, werden kreuzvernetzende Reagenzien herkömmlich in organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel DMSO, DMF, NMP, Methanol, Ethanol und ähnliches gelöst. Herkömmlich verwendete organische Lösungen können bei Anaying-Lösungen der Erfindung in den Spiegeln von 0,05% bis 20% (V/V) verwendet werden, wenn Verdickungsmittel verwendet werden.
Im allgemeinen verleihen die Verdickungsmittel eine erhöhte Viskosität an die Arraying-Lösung. Wenn eine geeignete Viskosität in der Arraying-Lösung erhalten wird, hat der erste Tropfen im wesentlichen die selbe Größe, wie zum Beispiel der aufgebrachte 100ste Tropfen. Wenn eine ungeeignete Viskosität in der Arraying-Lösung verwendet wird, sind die ersten aufgetragenen Tropfen signifikant größer als die späteren Tropfen, die aufgetragen werden. Die gewünschte Viskosität liegt zwischen derjenigen von reinem Wasser und reinem Glyzerin.
Das Biomolekül in dem Array kann ein Nukleinsäurepolymer oder ein Analog davon sein, wie zum Beispiel PNA, Phosphorthioate und Methylphosphonate. Nukleinsäure betrifft sowohl Ribonukleinsäure als auch Desoxyribonukleinsäure. Das Biomolekül kann unnatürliche und/oder synthetische Basen umfassen. Das Biomolekül kann ein Einzel- oder doppelsträngiges Nukleinsäurepolymer sein.
Ein bevorzugtes Biomolekül ist ein Nukleinsäurepolymer, das Oligonukleotide enthält (bis zu ungefähr 100 Nukleotidbasen) und Polynukleotide (über ungefähr 100 Basen). Ein bevorzugtes Nukleinsäurepolymer wird aus 15–50 Nukleotidbasen gebildet. Ein anderes bevorzugtes Nukleinsäurepolymer weist 50–1.000 Nukleotidbasen auf. Das Nukleinsäurepolymer kann ein PCR-Produkt, PCR-Primer oder Nukleinsäure-Duplex sein, um nur ein paar Beispiele aufzulisten. Jedoch kann im wesentlichen jeder Nukleinsäuretyp kovalent an eine PEI-beschichtete Oberfläche angebracht werden, wenn die Nukleinsäure ein primäres Amin enthält, wie unten diskutiert. Die typische Konzentration von Nukleinsäurepolymer in der Arrraying-Lösung ist 0,001–10 μg/ml, bevorzugterweise 0,01–1 μg/ml und am meisten bevorzugt 0,05–0,5 μg/ml.
Bevorzugte Nukleinsäuremoleküle sind "Amin-modifiziert", in das sie modifiziert wurden um ein primäres Amin an ein 5'-Ende des Nukleinsäurepolymers zu enthalten, bevorzugterweise mit einer oder mehrerer Methylen (-CH₂-) Gruppen, angeordnet zwischen dem primären Amin und dem Nukleinsäureteil des Nukleinsäurepolymers. Sechs ist eine bevorzugte Zahl von Methylengruppen. Amin-modifizierte Nukleinsäurepolymere sind bevorzugt, da sie kovalent an einen festen Träger durch die 5'-Amingruppe gekoppelt werden können. PCR-Produkte können unter der Verwendung von 5'-Hexylamin-modifizierten PCR-Primern angeordnet werden. Die Nukleinsäure-Duplices können nach der Einführung von Aminen durch Nick-Translation unter der Verwendung von Aminoallyl-dUTP (Sigma, St. Louis, MO) angeordnet werden. Die Amine können in Nukleinsäuren durch Polymerasen, wie zum Beispiel terminale Transferase und Aminoallyl-dUTP oder durch Ligation von kurzen Amin-enthaltenden Nukleinsäurepolymeren auf Nukleinsäuren durch Ligaren eingeführt werden.
Bevorzugterweise wird das Nukleinsäurepolymer aktiviert, bevor es mit der PEI-Beschichtung in Kontakt gebracht wird. Dies kann bequem durch Kombinieren von Aminfunktionalisiertem Nukleinsäurepolymer mit einer multi-funktionellen Amin-reaktiven Chemikalie, wie zum Beispiel Trichlortriazin eneicht werden. Wenn das Nukleinsäurepolymer eine 5'-Aminogruppe enthält, kann diese 5'-Amin mit Trichlortriazin reagiert werden, auch bekannt als Cyanurchlorid (Van Ness et al., Nucleic Acids Res. 19(2): 3345–3350, 1991). Bevorzugterweise wird ein Überschuß von Cyanurchlorid zu der Nukleinsäurepolymerlösung hinzugefügt, wobei ein 10- bis 1.000-facher molarer Überschuß von Cyanurchlorid über die Zahl von Aminen in dem Nukleinsäurepolymer in der Anaying-Lösung bevorzugt ist. Auf diese Weise hat die Hauptzahl von Amin-terminierten Nukleinsäurepolymeren mit einem Molekül von Trichlortriazin reagiert, so daß das Nukleinsäurepolymer mit Trichlortriazin beendet wird.
Bevorzugterweise wird die Arraying-Lösung unter der Verwendung eines herkömmlichen Puffers, wie zum Beispiel Natriumphosphat, Natriumborat, Natriumcarbonat und Tris HCl gepuffert. Ein bevorzugter pH-Bereich für die Anaying-Lösung ist 7 bis 9, wobei ein bevorzugter Puffer frisch präpariertes Natriumborat bei pH 8,3 bis pH 8,5 ist. Um eine typische Arraying-Lösung herzustellen, wird Hexylamin-modifiziertes Nukleinsäurepolymer in 0,2 M Natriumborat, pH 8,3, bei 0,1 μg/ml auf ein Gesamtvolumen von 50 μl plaziert. 10 μl einer 15 mg/ml Lösung von Cyanwchlorid werden dann hinzugefügt und der Reaktion wird ermöglicht, für eine Stunde bei 25°C mit konstantem Schütteln fortzuschreiten. Glyzerin (Gibco Brl®, Gran Island, NY) wird bis zu einer finalen Konzentration von 56% hinzugefügt.
Die biomolekularen Anaying-Lösungen können auf die PEI-Beschichtung durch jede einer Zahl von Techniken, die im Augenblick bei der Mikrofabrikation verwendet werden, aufgetragen werden. Zum Beispiel können die Lösungen in einem Inkjet-Druckkopf plaziert werden und aus solch einem Kopf auf die Beschichtung ausgestoßen werden.
Ein bevorzugter Ansatz zur Zuführung von biomolekularer Lösung auf die PEI-Beschichtung verwendet eine modifizierte Springprobe. Springproben sind von verschiedenen Verkäufern erhältlich, einschließlich Everett Charles (Pomona, CA), Interconnect Devices Inc. (Kansas City, Kansas) und Test Connections Inc., (Upland, CA). Damit die wie oben beschriebenen erhältlichen Springsonden zufriedenstellend als flüssige Zubringvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung funktionieren, müssen ungefähr 1/1000 bis 5/1000 eines Inchs von Metallmaterial von der Spitze der Sonde entfernt werden. Das Verfahren muß zu einer flachen Oberfläche führen, die senkrecht zu der Längsachse der Springsonde ist. Das Entfernen von ungefähr 1/1000 bis 5/1000 eines Inchs von Material von dem Boden der Spitze ist bevorzugt und kann leicht mit einem sehr feingekörnten Schleifstein durchgeführt werden. Spezifische Springsonden, die käuflich erhältlich sind und die modifiziert werden können, um eine planare Spitze wie oben beschrieben zur Verfügung zu stellen, schließen die XP54-Sonde ein, die durch Ostby Barton (eine Abteilung von Everett Charles (Pomona, CA)); die SPA-Sonde 25P, die durch Everett Charles hergestellt wird (Pomona, CA) und 43-P-"fluted"-Springsonde von Test Connections Inc., (Upland, CA).
Die wie oben beschriebenen Anaying-Lösungen können direkt in einem Arraying-Verfahren verwendet werden. Gemeint ist, die aktivierten Nukleinsäurepolymere brauchen nicht vor dem Druckschritt von nicht reagiertem Cyanurchlorid weg gereinigt zu werden. Typischerweise wird der Reaktion, die die aktivierte Nukleinsäure an den festen Träger anbringt ermöglicht, für 1 bis 20 Stunden bei 20 bis 50°C fortzuschreiten. Bevorzugterweise ist die Reaktionszeit 1 Stunde bei 25°C.
Die hier beschriebenen Anays sind besonders brauchbar bei der Durchführung von Hybridisierungstests, zum Beispiel unter der Verwendung von CMST-markierten Sonden. Jedoch müssen die Amine auf dem festen Träger, um solche Tests durchzuführen, vor der Durchführung des Hybridisierungsschrittes geschützt werden. Dies kann durch Reagieren des festen Trägers mit 0,1–2,0 M Succinianhydrid eneicht werden. Die bevorzugten Reaktionsbedingungen sind 1,0 M Succinianhydrid in 70% m-Pyrol und 0,1 M Natriumborat. Der Reaktion wird typischerweise erlaubt für 15 Minuten bis 4 Stunden zu erfolgen, mit einer bevorzugten Reaktionszeit von 30 Minuten bei 25°C. Restliches Succinianhydrid wird mit einer 3x-Wasser-Waschung entfernt.
Der feste Träger wird dann mit einer Lösung inkubiert, die 0,1–5 M Glycin in 0,1–10,0 M Natriumborat bei pH 7–9 enthält. Dieser Schritt "schützt" jedes Dichlortriazin, das kovalent an die PEI-Oberfläche gebunden sein kann, durch Überführung in Monochlortriazin. Die bevorzugten Bedingungen sind 0,2 M Glycin in 0,1 M Natriumborat bei pH 8,3. Der feste Träger kann dann Detergenz-enthaltenen Lösungen gewaschen werden, um nicht-gebundene Materialien zu entfernen, zum Beispiel Spuren von NMP. Bevorzugterweise wird der feste Träger auf 95°C in 0.01 M NaCl, 0,05 EDTA und 0,1 M Tris, pH 8,0 für 5 Minuten erhitzt. Dieser Erhitzungsschritt entfernt nicht-kovalent angebrachte Nukleinsäurepolymere, wie zum Beispiel PCR-Produkte, in dem Fall wo Doppelstrang-Nukleinsäure angeordnet wird, hat dieser Schritt auch den Effekt von Überführen des Doppelstrangs in die einzelsträngige Form (Denaturierung).
Die Arrays können dann durch Sonden (z. B. Oligonukleotide, Nukleinsäurefragmente, PCR-Produkte, usw.) untersucht werden, die mit zum Beispiel CMST-Markern, wie hier beschrieben, Radioisotopen, Fluorophoren oder Biotin markiert sein können. Die Verfahren zur Biotinylierung von Nukleinsäuren sind im Stand der Technik gut bekannt und werden geeignet durch Pierce (Avidin-Biotin Chemistry: A Handbookk, Pierce Chemical Company, 1992, Rockford Illinois) beschrieben. Die Sonden werden im allgemeinen bei 0,1 ng/ml bis 10 μg/ml in Standard-Hybridisierungslösungen verwendet, die GuSCN, GuHCl, Formamid, usw. (siehe Van Ness und Chen, Nucleic Acids Res. 19: 5143–5151, 1991) enthalten.
Um das Hybridisierungsereignis (d. h. die Anwesenheit des Biotins) nachzuweisen wird der feste Träger mit Streptavidin-/Rettichperoxidase-Konjugat inkubiert. Solche Enzymkonjugate sind käuflich erhältlich von, zum Beispiel, Vector Laboratories (Burlingham, CA). Das Streptavidin bindet mit hoher Affinität an das Biotinmolekül, was die Rettichperoxidase in die Nähe der hybridisierten Sonde bringt. Nicht-gebundenes Streptavidin-/Rettichperoxidase-Konjugat wird in einem einzelnen Waschschritt weg gewaschen. Die Anwesenheit von Rettichperoxidaseenzym wird dann unter der Verwendung eines ausfällenden Substrats in der Anwesenheit von Peroxid und den geeigneten Puffern nachgewiesen.
Ein blaues Enzymprodukt, das auf einer reflektierenden Oberfläche, wie zum Beispiel einem Wafer aufgetragen wird, weist einen vielfach niedrigeren Spiegel des Nachweises (LLD), verglichen mit demjenigen, der für ein colorimetrischen Substrat erwartet wird, auf. Weiterhin ist die LLD für verschieden gefärbte Enzymprodukte sehr verschieden. Zum Beispiel ist die LLD für 4-Methoxynaphthol (was ein ausgefälltes blaues Produkt produziert) pro 50 μM Durchmesser-Fleck ungefähr 1.000 Moleküle, wohingegen ein rot ausfallendes Substrat eine LLD von ungefähr 1.000-fach höher bei 1.000.000 Moleküle pro 50 μM Durchmesser-Fleck ergibt. Die LLD wird durch Untersuchen der Oberfläche mit einem Mikroskop (wie zum Beispiel des Axiotech-Mikroskop, käuflich erhältlich von Zeiss), ausgerüstet mit einer sichtbaren Lichtquelle und einer CCD-Kamera (Princeton Instruments, Princeton, NJ) nachgewiesen. Ein Bild von ungefähr 10.000 μM × 10.000 μM kann zur selben Zeit gescannt werden.
Um das blaue colorimetrische Nachweisschema zu verwenden, muß die Oberfläche nach der enzymatischen Reaktion wieder rein sein und der Wafer oder der Glasträger muß in einem trockenen Zustand gescannt werden. Zusätzlich muß die enzymatische Reaktion vor der Sättigung der Referenzflecken gestoppt werden. Für Rettichperoxidase ist dies ungefähr 2–5 Minuten.
Es ist ebenfalls möglich, chemilumineszente Substrate für alkalische Phosphatase oder Rettichperoxidase (HRP) oder Fluoreszenz-Substrate für HRP oder alkalische Phosphatase zu verwenden. Beispiele schließen die Dioxethan-Substrate für alkalische Phosphatase, erhältlich von Perkin Elmer oder Attophos HRP-Substrate von JBL Scientific (San Luis, Obispo, CA) ein.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
Sofern nicht anders angegeben, können Chemikalien, wie sie in den Beispielen verwendet werden, von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI erhalten werden. Die folgenden Abkürzungen, mit den angegebenen Bedeutungen, werden hierin verwendet.
ANP = 3-(Fmoc-Amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure
NBA = 4-(Fmoc-Aminomethyl)-3-nitrobenzoesäure
HATU = O-7-Azabenzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
DIEA = Diisopropylethylamin
MCT = Monochlortriazin
NMM = 4-Methylmorpholin
NMP = N-Methylpyrrolidon
ACT375 = ACT375-Peptidsynthesizer von Advanced ChemTech, Inc., Louisville, KY
ACT = Advanced ChemTech, Inc., Louisville, KY
NovaBiochem = CalBiochem-NovaBiochem International, San Diego, CA
TFA = Trifluoressigsäure
Tfa = Trifluoracetyl
iNIP = N-Methylisonipecotinsäure
Tfp = Tetrafluorphenyl
DIAEA = 2-(Diisopropylamino)ethylamin
MCT = Monochlortriazen
5'-AH-ODN = Oligodesoxynukleotid mit 5'-Aminohexyl-Schwanz
BEISPIELE
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG VON SÄURELABILEN LINKERN ZUR VERWENDUNG BEI DER SEQUENZIERUNG EINES SPALTBAREN MG-IDENTIFIKATORS
A. Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäureamid-Enden freizusetzen
1 zeigt das Reaktionsschema.
Schritt A. TentaGel-S-AC-Harz (Verbindung II; erhältlich von ACT; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357-Peptidsynthesizers (ACT) suspendiert. Verbindung I (3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung III zu ergeben.
Schritt B. Das Harz (Verbindung III) wird mit 25%igem Piperidin in DMF vermischt und für 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, anschließend mit 25%igem Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt C verwendet.
Schritt C. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt B wird in DMF suspendiert und dazu werden eine Aminosäure mit FMOC-Schutzgruppe, die Aminofunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Verbindung IV, z. B. Alpha-N-FMOC-3-(3-Pyridyl)-alanin (erhältlich von Synthetech, Albany, OR; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Das Gefäß wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von IV an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt D. Das Harz (Verbindung V) wird mit Piperidin behandelt, wie in Schritt B beschrieben, um die FMOC-Gruppe zu entfernen. Das Harz ohne Schutzgruppe wird anschließend gleichmäßig vom ACT357 aus dem Sammelgefäß in 16 Reaktionsgefäße aufgeteilt.
Schritt E. Die 16 Aliquote aus Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt D werden in DMF suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß werden die geeignete Carbonsäure VI₁ _-16 (R_1-16CO₂H; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Harz-Aliquote mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von VI_1-16 an die Harz-Aliquote und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindungen VII_1-16 zu ergeben.
Schritt F. Die Harz-Aliquote (Verbindungen VII_1-16) werden mit CH₂Cl₂ (3X) gewaschen. Zu jedem der Reaktionsgefäße wird 1% TFA in CH₂Cl₂ zugegeben und die Gefäße für 30 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhren filtriert. Die Harz-Aliquote werden mit CH₂Cl₂ (2X) und McOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhren hinein zusammengeführt. Die einzelnen Röhren werden im Vakuum eingedampft, was die Verbindungen VIII_1-16 liefert.
Schritt G. Jede der freien Carbonsäuren VIII_1-16 wird in DMF gelöst. Zu jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) zugegeben, gefolgt von Pentafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (3X) und 5% wäßrigem NaHCO₃ (3X) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und in vacuo eingedampft, was die Verbindungen IX_1-16 liefert.
B. Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäureenden freizusetzen
2 zeigt das Reaktionsschema.
Schrift A. 4-(Hydroxymethyl)phenoxybuttersäure (Verbindung I; 1 Äq.) wird zusammengebracht mit DIEA (2,1 Äq.) und Allylbromid (2,1 Äq.) in CHCl₃ und für 2 h unter Rückfluß erhitzt. Die Mischung wird mit EtOAc verdünnt, mit 1 N HCl (2X), pH 9,5 Carbonatpuffer (2X) und Salzlösung (IX) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo eingedampft, um den Allylester von Verbindung I zu ergeben.
Schritt B. Der Allylester von Verbindung I aus Schritt A (1,75 Äq.) wird in CH₂Cl₂ mit einer Aminosäure mit FMOC-Schutzgruppe, die Aminofunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Verbindung II, z. B. Alpha-N-FMOC-3-(3-Pyridyl)-alanin, erhältlich von Synthetech, Albany, OR; 1 Äq.), N-Methylmorpholin (2,5 Äq.) und HATU (1,1 Äq.) zusammengebracht und bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. Die Mischung wird mit CH₂Cl₂ verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (2X), Wasser (1X) und 5%iger wäßriger NaHCO₃ (2X) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo eingedampft. Verbindung III wird durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂ → EtOAc) isoliert.
Schritt C. Verbindung III wird in CH₂Cl₂ gelöst, Pd(PPh₃)₄ (0,07 Äq.) und N-Methylalanin (2 Äq.) werden hinzugegeben und die Mischung wird bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. Die Mischung wird mit CH₂Cl₂ verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (2X) und Wasser (1X) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo eingedampft. Verbindung IV wird durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂ → EtOAc + HOAc) isoliert.
Schritt D. TentaGel-S-AC-Harz (Verbindung V; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357-Peptidsynthesizers (Advanced ChemTech Inc. (ACT), Louisville, KY) suspendiert. Verbindung IV (3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF werden hinzugefügt und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von IV an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritt E. Das Harz (Verbindung VI) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, dann mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Das Harz ohne Schutzgruppe wird dann gleichmäßig durch den ACT357 aus dem Sammelgefäß in 16 Reaktionsgefäße aufgeteilt.
Schritt F. Die 16 Aliquote aus Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt E werden in DMF suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß werden die geeignete Carbonsäure VII₁ _-16 (R_1-16CO₂H; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Harz-Aliquote mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von VII_1-16 an die Harz-Aliquote und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindungen VIII_1-16 zu ergeben.
Schritt G. Die Harz-Aliquote (Verbindungen VIII_1-16) werden mit CH₂Cl₂ (3X) gewaschen. Zu jedem der Reaktionsgefäße wird 1% TFA in CH₂Cl₂ zugegeben und die Gefäße werden für 30 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhren filtriert. Die Harz-Aliquote werden mit CH₂Cl₂ (2X) und McOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhren hinein zusammengegeben. Die einzelnen Röhren werden im Vakuum verdampft, was die Verbindungen IX_1-16 liefert.
Schritt H. Jede der freien Carbonsäuren IX₁ _-16 wird in DMF gelöst. Zu jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) hinzugegeben, gefolgt von Pentafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (3X) und 5% wäßriger NaHCO₃ (3X) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und in vacuo eingedampft, was die Verbindungen X_1-16 liefert.
BEISPIEL 2
NACHWEIS PHOTOLYTISCHER SPALTUNG VON T-L-X
Eine T-L-X-Verbindung, wie hergestellt in Beispiel 11, wurde mit Licht im nahen UV-Bereich für 7 min bei Raumtemperatur bestrahlt. Eine Rayonett-Fluoreszenz-UV-Lampe (Southern New England Ultraviolet Co., Middletown, CT) mit einem Emissionspeak bei 350 nm wird als eine UV-Lichtquelle verwendet. Die Lampe wird in einem Abstand von 15 cm von den Petrischalen mit Proben gestellt. SDS-Gelelektrophorese zeigt, daß >85% des Konjugats unter diesen Bedingungen gespalten werden.
BEISPIEL 3
HERSTELLUNG VON FLUORESZENZMARKIERTEN PRIMERN UND NACHWEIS DER SPALTUNG VON FLUOROPHOR (betrifft nicht den beanspruchten Gegenstand)
Synthese und Reinigung von Oligonukleotiden
Die Oligonukleotide (ODNs) werden auf automatisierten DNA-Synthesizern unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie, geliefert vom Anbieter, oder der H-Phosphonat-Chemie (Glen Research Sterling, VA) hergestellt. In geeigneter Weise blockierte dA-, dG-, dC- und T-Phosphoramidite sind in diesen Formen kommerziell erhältlich und synthetische Nukleoside können leicht in die geeignete Form überführt werden. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie, geliefert vom Anbieter, oder der H-Phosphonatchemie hergestellt. Oligonukleotide werden durch Adaptionen von Standardverfahren gereinigt. Oligonukleotide mit 5'-Tritylgruppen werden auf HPLC unter Verwendung einer 12 Mikrometer, 300 # Rainin (Emeryville, CA) Dynamax C-8 4,2 × 250 mm Umkehrphasensäule unter Verwendung eines Gradienten von 15% bis 55% MeCN in 0,1 N Et₃NH⁺OAc^-, pH 7,0, über 20 min chromatographiert. Wenn die Detritylierung durchgeführt wird, werden die Oligonukleotide durch Gelausschlußchromatographie weitergereinigt. Analytische Überprüfungen der Qualität der Oligonukleotide werden mit einer PRP-Säule (Alltech, Deerfield, IL) bei alkalischem pH und mit PAGE durchgeführt.-Herstellung von 2,4,6-Trichlortriazin-abgeleiteten Oligonukleotiden: 10 bis 1.000 μg 5'-terminal aminverknüpftes Oligonukleotid werden mit einem Überschuß umkristallisierter Cyanurolsäurechloride in 10% N-Methylpyrrolidon in alkalischem Puffer (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) bei 19°C bis 25°C für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen bestehen aus 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertem Cyanurolsäurechlorid und 500 μg/ml entsprechendem Oligonukleotid. Das nicht-umgesetzte Cyanurolsäurechlorid wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt.
Das aktivierte gereinigte Oligonukleotid wird dann mit einem 100-fachen molaren Überschuß Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden dann mit aminreaktiven Fluorochromen umgesetzt. Die abgeleitete ODN-Zubereitung wird in 3 Portionen aufgeteilt und jede Portion wird mit entweder (a) einem 20-fachen molaren Überschuß von Texasrot-Sulfonylchlorid (Molecular Probes, Eugene, OR), (b) einem 20-fachen molaren Überschuß von Lissamin-Sulfonylchlorid (Molecular Probes, Eugene, OR), (c) einem 20-fachen molaren Überschuß von Fluoresceinisothiocyanat umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen bestehen aus 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die nicht-umgesetzten Fluorochrome werden durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule entfernt.
Um das Fluorochrom vom Nukleotid abzuspalten, werden die ODNs auf 1 × 10^–5 molar eingestellt und dann Verdünnungen (12,3-fache Verdünnungen) in TE hergestellt (TE ist 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA). Zu 100 μl-Volumina von ODNs werden 25 μl 0,01 M Dithiothreitol (DTT) zugegeben. Zu einem identischen Satz von Kontrollzusammensetzungen wird kein DTT zugegeben. Die Mischung wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Fluoreszenz wird in einer schwarzen Mikrotiterplatte gemessen. Die Lösung wird aus den Inkubationsröhren (150 μl) entfernt und in eine schwarze Mikrotiterplatte (Dynatek Laboratories, Chantilly, VA) gegeben. Die Platten werden dann direkt unter Verwendung eines Fluoroskan-II-Fluorometers (Flow Laboratories, McLean, VA) unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 495 nm und Überwachung der Emission bei 520 nm für Fluorescein, unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 591 nm und Überwachung der Emission bei 612 nm für Texasrot und unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 570 nm und Überwachung der Emission bei 590 nm für Lissamin abgelesen, wobei die Ergebnisse in Tabelle I angegeben sind.
Tabelle I
Die Daten zeigen, daß es einen etwa 200-fachen Anstieg der relativen Fluoreszenz gibt, wenn das Fluorochrom vom ODN abgespalten wird.
BEISPIEL 4
HERSTELLUNG VON MARKIERTEN M13-SEQUENZPRIMERN UND NACHWEIS DER ABSPALTUNG VON MARKIERUNGEN
Herstellung von 2,4,6-Trichlortriazin-abgeleiteten Oligonukleotiden: 1.000 μg 5'-terminales aminverknüpftes Oligonukleotid (5'-Hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGT-3") (Seq. ID Nr. 1) werden mit einem Überschuß umkristallisierten Cyanursäurechlorids in 10% N-Methylpyrrolidon in alkalischem Puffer (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) bei 19 bis 25°C für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen bestehen aus 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertem Cyanursäurechlorid und 500 μg/ml entsprechendem Oligonukleotid. Das nicht-umgesetzte Cyanursäurechlorid wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule entfernt.
Das aktivierte gereinigte Oligonukleotid wird anschließend mit einem 100-fachen molaren Überschuß Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden anschließend mit einer Vielzahl von Amiden umgesetzt. Die abgeleitete ODN-Zubereitung wird in 12 Portionen aufgeteilt und je Portion wird (25-molarer Überschuß) mit den Pentafluorphenylestern von: (1) 4-Methoxybenzoesäure, (2) 4-Fluorbenzoesäure, (3) Tolylsäure, (4) Benzoesäure, (5) Indol-3-essigsäure, (6) 2,6-Difluorbenzoesäure, (7) Nicotinsäure-N-oxid, (8) 2-Nitrobenzoesäure, (9) 5-Acetylsalicylsäure, (10) 4-Ethoxybenzoesäure, (11) Zimtsäure oder (12) 3-Aminorricotinsäure umgesetzt. Die Reaktion läuft für 2 Stunden bei 37°C in 0,2 M NaBorat pH 8,3. Die abgeleiteten ODNs werden mit Gelausschlußchromatographie auf G-50-Sephadex gereinigt.
Um die Markierung vom Oligonukleotid abzuspalten, werden die ODNs auf 1 × 10^–5 molar eingestellt und anschließend werden Verdünnungen (12,3-fache Verdünnungen) in TE hergestellt (TE ist 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA) mit 50% EtOH (v/v). Zu 100 μl-Volumina ODNs werden 25 μl 0,01 M Dithiothreitol (DTT) zugegeben. Zu einem identischen Satz von Kontrollzusammensetzungen wird kein DTT zugegeben. Die Inkubation erfolgt für 30 Minuten bei Raumtemperatur. NaCI wird anschließend auf 0,1 M zugegeben und 2 Volumina EtOH werden zugegeben, um die ODNs auszufällen. Die ODNs werden aus Lösung durch Zentrifugation bei 14.000 × G bei 4°C für 15 Minuten entfernt. Die Überstände werden aufbewahrt, vollständig getrocknet. Der Pellet wird anschließend in 25 μl McOH gelöst. Der Pellet wird anschließend mit Massenspektrometrie auf das Vorhandensein von Markierungen getestet.
Der Massenspektrometer, der bei diesen Arbeiten verwendet wurde, ist ein Fouriertransformations-Massenspektrometer (FTMS) mit externer Ionenquelle. Proben, die für MALDI-Analyse hergestellt wurden, werden auf der Spitze einer direkten Sonde abgeschieden und in die Ionenquelle eingeführt. Wenn die Probe mit einem Laserpuls bestrahlt wird, werden Ionen aus der Quelle extrahiert und in eine lange Quadrapol- Ionenführung geleitet, die sie fokussiert und zu einer FTMS-Analysatorzelle transportiert, die innerhalb der Bohrung eines supraleitfähigen Magneten angeordnet ist.
Die Spektren liefern die folgende Information. Peaks die in der Intensität von 25 bis 100 relativen Intensitätseinheiten variieren, bei den folgenden relativen Molekülmassen: (1) 212,1 amu, was 4-Methoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, (2) 200,1, was 4-Fluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, (3) 196,1 amu, was Tolylsäure-Derivat anzeigt, (4) 182,1 amu, was Benzoesäure-Derivat anzeigt, (5) 235,2 amu, was Indol-3-essigsäure-Derivat anzeigt, (6) 218,1 amu, was 2,6-Difluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, (7) 199,1 amu, was Nikotinsäure-N-oxid-Derivat anzeigt, (8) 227,1 amu, was 2-Nitrobenzamid anzeigt, (9) 179,18 amu, was 5-Acetylsalylsäure-Derivat anzeigt, (10) 226,1 amu, was 4-Ethoxybenzoesäure-Derivat. anzeigt, (11) 209,1 amu, was Zimtsäure-Derivat anzeigt, (12) 198,1 amu, was 3-Aminorricotinsäure-Derivat hinweist.
Die Ergebnisse zeigten, daß die MW-Identifikatoren von den Primern abgespalten werden und mit Massenspektrometrie nachweisbar sind.
BEISPIEL 5
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R_1-36-LYS(εINIP)-ANP-TFP
3 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = L_h), wobei L_h ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho-Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die L_h und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R_1-36 mit variabler Masse (wobei die R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über jede der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massensepktrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die ε-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf 3:
Schritt A. NovaSyn-HMP-Harz (erhältlich von NovaBiochem; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357 suspendiert. Verbindung I (ANP, erhältlich von ACT; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung II zu ergeben.
Schritt B. Das Harz (Verbindung II) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, anschließend mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt C verwendet.
Schrift C. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt B wird in DMF suspendiert und dazu wird eine Aminosäure aus FMOC-Schutzgruppe hinzugegeben, die eine geschützte Aminfunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Fmoc-Lysin(Aloc)-OH, erhältlich von PerSeptive Biosystems; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF. Das Gefäß wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von Fmoc-Lys(Aloc)-OH an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung IV zu ergeben.
Schritt D. Das Harz (Verbindung IV) wird mit CH₂Cl₂ (2X) gewaschen und anschließend in einer Lösung von (PPh₃)₄Pd(0) (0,3 Äq.) und PhSiH₃ (10 Äq.) in CH₂Cl₂ suspendiert. Die Mischung wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit CH₂Cl₂ gewaschen. Der Palladiumschritt wird wiederholt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit CH₂Cl₂ (2X), N,N-DÜsopropylethylammoniumdiethyldithiocarbamat in DMF (2X), DMF (2X) gewaschen, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt E. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt D wird mit N-Methylisonipecotinsäure gekoppelt, wie in Schritt C beschrieben, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritt F. Das Fmoc-geschützte Harz VI wird gleichmäßig durch den ACT357 aus dem Sammelgefäß in 36 Reaktionsgefäße aufgeteilt, um die Verbindungen VI₁ _-36 zu ergeben.
Schritt G. Das Harz (Verbindungen VI_1- ₃₆) wird mit Piperidin behandelt, wie beschrieben in Schritt B, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt H. Die 36 Aliquote des Harzes ohne Schutzgruppe aus Schritt G werden in DMF suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß werden die entsprechende Carbonsäure (R_1-36CO₂H; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Harz-Aliquote mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von R_1-36CO₂H an die Harz-Aliquote und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindungen VIII₁ _-36 zu ergeben.
Schritt I. Die Harz-Aliquote (Verbindungen VIII_1- ₃₆) werden mit CH₂Cl₂ (3X) gewaschen. Zu jedem der Reaktionsgefäße wird TFA : H₂O : CH₂Cl₂ im Verhältnis 90 : 5 : 5 zugegeben und die Gefäße für 120 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhren filtriert. Die Harz-Aliquote werden mit CH₂Cl₂ (2X) und McOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhren hinein zusammengeführt. Die einzelnen Röhren werden in vacuo eingedampft, was die Verbindungen IX_1- ₃₆ liefert.
Schritt J. Jede der freien Carbonsäure IX₁ _-36 wird in DMF gelöst. Zu jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) zugegeben, gefolgt von Tetrafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, mit 5% wäßrigem NaHCO₃ (3X) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und in vacuo eingedampft, was die Verbindungen X_1- ₃₆ liefert.
BEISPIEL 6
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R_1-36-LYS(ε-iNIP)-NBA-TFP
4 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = L_h), wobei L_h ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho-Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine direkte Bindung zwischen L_h und L² ist, wobei L_h direkt mit dem aromatischen Ring der L²-Gruppe verknüpft ist, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R_1-36 mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über jede der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet ist, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrieverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die ε-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf 4
Schritt A. NovaSyn-HMP-Harz wird mit Verbindung I (NBA hergestellt gemäß dem Verfahren von Brown et al., Molecular Diversity, 1, 4 (1995)) gemäß dem in Schritt A von Beispiel 5 beschriebenen Verfahren gekoppelt, um Verbindung II zu ergeben.
Schritte B–J. Das Harz (Verbindung II) wird behandelt, wie beschrieben in den Schritten B–J von Beispiel 5, um die Verbindungen X_1- ₃₆ zu ergeben.
BEISPIEL 7
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL iNIP-LYS(ε-R_1-36)-ANP-TFP
5 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = L_h), wobei L_h ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho-Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die L_h und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R_1-36 mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über jede der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die ε-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf 5:
Schritte A–C. Dieselben wie in Beispiel 5.
Schritt D. Das Harz (Verbindung IV) wird mit Piperidin behandelt, wie in Schritt B von Beispiel 5 beschrieben, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt E. Das α-Amin ohne Schutzgruppe auf dem Harz in Schritt D wird mit N-Methylisonipecotinsäure gekoppelt, wie beschrieben in Schritt C von Beispiel 5, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt F. Derselbe wie in Beispiel 5.
Schritt G. Das Harz (Verbindungen VI₁ _-36) wird behandelt mit Palladium, wie beschrieben in Schritt D von Beispiel 5, um die Aloc-Gruppe zu entfernen.
Schritte H–J. Die Verbindungen X₁ _-36 werden auf dieselbe Art und Weise hergestellt wie in Beispiel 5.
BEISPIEL 8
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R_1-36-GLU(γ-DIAEA)-ANP-TFP
6 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbidnungen (X = L_h), wobei L_h ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho-Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die L_h und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die α-Carbonsäuregruppe von Glutaminsäure mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R_1- ₃₆ mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über eine der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe der Glutaminsäure gebunden ist, während eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über 2-(Diisopropylamino)ethylamin) durch die γ-Carbonsäure der Glutaminsäure gebunden ist.
Bezug nehmend auf 6:
Schritte A–B. Dieselben wie in Beispiel 5.
Schritt C. Das Harz ohne Schutzgruppe (Verbindung III) wird an Fmoc-Glu-(OAl)-OH unter Verwendung des Kopplungsverfahrens, das in Schritt C von Beispiel 5 beschrieben ist, gekoppelt, um Verbindung IV zu ergeben.
Schritt D. Der Allylester auf dem Harz (Verbindung IV) wird mit CH₂Cl₂ (2X) gewaschen und mit einer Lösung von (PPh₃)₄Pd(0) (0,3 Äq.) und N-Methylanilin (3 Äq.) in CH₂Cl₂ vermischt. Die Mischung wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit CH₂Cl₂ (2X) gewaschen. Der Palladiumschritt wird wiederholt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit CH₂Cl₂ (2X), N,N-Diisopropylethylammoniumdiethyldithiocarbamat in DMF (2X), DMF (2X) gewaschen, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt E. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt D wird in DMF suspendiert und durch Vermischen mit HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) aktiviert. Die Gefäße werden für 15 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (1X) gewaschen. Das Harz wird mit 2-(Diisopropylamino)ethylamin (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) vermischt. Die Gefäße werden für 1 Stunde geschüttelt. Die Kopplung von 2-(Diisopropylamino)ethylamin an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritte F–J. Dieselben wie in Beispiel 5.
BEISPIEL 9
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R_1-36-LYS(ε-iNIP)-ANP-LYS(ε-NH₂)-NH₂
7 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = L_h), wobei L_h ein Amin ist (genauer die ε-Aminogruppe einer von Lysin abgeleiteten Einheit), L² eine ortho-Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Carboxamido-substituierte Alkylenaminoacylalkylen-Gruppe ist, die L_h und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R_1-36 mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über eine der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die ε-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf 7:
Schritt A. Fmoc-Lys(Boc)-SRAM-Harz (erhältlich von ACT; Verbindung I) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, dann mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt B verwendet.
Schritt B. Das Harz (Verbindung II), ANP (erhältlich von ACT; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), McOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung III zu ergeben.
Schritte C–J. Das Harz (Verbindung III) wird behandelt wie in den Schritten B–I in Beispiel 5, um die Verbindungen X_1-36 zu ergeben.
BEISPIEL 10
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R_1- ₃₆-LYS(ε-TFA)-LYS(ε-INP)-ANP-TFP
8 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = L_h), wobei L_h ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho-Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die L_h und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe eines ersten Lysins mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die ε-Aminogruppe des ersten Lysins gebunden ist, ein zweites Lysinmolekül mit dem ersten Lysin über die a-Aminogruppe des ersten Lysins verknüpft worden ist, eine Gruppe zur Einstellung der relativen Molekülmasse (mit einer Trifluoracetylstruktur) durch die ε-Aminogruppe des zweiten Lysins gebunden ist und eine Komponente R_1-36 mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über eine der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des zweiten Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf 8:
Schritte A–E. Diese Schritte sind identisch mit den Schritten A–E in Beispiel 5.
Schritt F. Das Harz (Verbindung VI) wird mit Piperidin behandelt wie beschrieben in Schritt B in Beispiel 5, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt G. Das Harz ohne Schutzgruppe (Verbindung VII) wird an Fmoc-Lys(Tfa)-OH unter Verwendung des Kopplungsverfahrens, das in Schritt C von Beispiel 5 beschrieben ist, gekoppelt, um Verbindung VIII zu ergeben.
Schritte H–K. Das Harz (Verbindung VIII) wird behandelt, wie in den Schritten F–J in Beispiel 5, um die Verbindungen XI_1- ₃₆ zu ergeben.
BEISPIEL 11
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R_1-36-LYS(ε-iNIP)-ANP-5'-AH-ODN
9 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = MOI, wobei MOI ein Nukleinsäurefragment ist, ODN), abgeleitet von den Estern von Beispiel 5 (dasselbe Verfahren könnte bei anderen T-L-X-Verbindungen verwendet werden, in denen X ein aktivierter Ester ist). Das MOI ist an T-L durch das 5'-Ende des MOIs konjugiert, über eine Phosphodiester-Alkylenamin-Gruppe.
Bezug nehmend auf 9:
Schritt A. Die Verbindungen XII₁ _-36 werden hergestellt gemäß einem modifizierten Biotinylierungsverfahren in Van Ness et al., Nuleic Acids Res., 19, 3345 (1991). Zu einer Lösung eines der 5'-Aminohexyl-Oligonukleotide (Verbindungen XI₁ _-36, 1 mg) in 200 mM Natriumborat (pH 8,3, 250 ml) wird einer der Tetrafluorphenylester zugegeben (Verbindungen X₁ _-36 aus Beispiel A, 100-facher molarer Überschuß in 250 ml NMP). Die Reaktion wird über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die nicht-umgesetzten und hydrolysierten Tetrafluorphenylester werden von den Verbindungen XII_1-36 durch Sephadex-G-50-Chromatographie getrennt.
BEISPIEL 12
HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R_1-36-LYS(ε-iNIP)-ANP-LYS(ε-(MCT-5'-AH-ODN))-NH₂
10 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = MOI, wobei MOI ein Nukleinsäurefragment ist, ODN), abgeleitet von den Aminen von Beispiel 11 (dasselbe Verfahren könnte bei anderen T-L-X-Verbindungen verwendet werden, in denen X ein Amin ist). Das MOI ist an T-L durch das 5'-Ende des MOIs konjugiert, über eine Phosphodiester-Alkylenamin-Gruppe.
Bezug nehmend auf 10:
Schritt A. Die 5'-[6-(4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-2-ylamino)hexyl]-Oligonukleotide XII_1- ₃₆ werden hergestellt wie beschrieben in Van Ness et al., Nucleic Acids Res., 19, 3345 (1991).
Schritt B. Zu einer Lösung eines der 5'-[6-(4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-2-ylamino)hexyl]-Oligonukleotide (Verbindungen XII_1- ₃₆) in einer Konzentration von 1 mg/ml in 100 mM Natriumborat (pH 8,3) wurde ein 100-facher molarer Überschuß eines primäre Amins zugegeben, das ausgewählt ist aus R_1-36-Lys(ε-iNIP)-ANP-Lys(ε-NH₂)-NH₂ (Verbindungen X_1- ₃₆ aus Beispiel 11). Die Lösung wird über Nacht bei Umgebungstemperatur gemischt. Das nicht-umgesetzte Amin wird durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einem 3.000 MG-Schnitt (Amicon, Beverly, MA) unter Verwendung von H₂O als der Waschlösung (3X) entfernt. Die Verbindungen XIII₁ _-36 werden durch Verringerung des Volumens auf 100 ml isoliert.
BEISPIEL 13
DEMONSTRATION DES GLEICHZEITIGEN NACHWEISES MEHRERER MARKIERUNGEN DURCH MASSENSPEKTROMETRIE
Dieses Beispiel liefert eine Beschreibung der Fähigkeit, mehrere Verbindungen (Markierungen) durch Massenspektrometrie gleichzeitig nachzuweisen. In diesem besonderen Beispiel werden 31 Verbindungen mit einer Matrix vermischt, auf einem festen Träger abgeschieden und getrocknet und anschließend mit einem Laser desorbiert. Die resultierenden Ionen werden anschließend in einen Massenspektrometer eingeführt.
Die folgenden Verbindungen (bezogen von Aldrich, Milwaukee, WI) werden auf einer äquimolaren Basis auf eine Endkonzentration von 0,002 M (pro Verbindung) zusammengemischt: Benzamid (121,14), Nicotinamid (122,13), Pyrazinamid (123,12), 3-Amino-4-pyrazolcarbonsäure (127,10), 2-Thiophencarboxamid (127,17), 4-Aminobenzamid (135,15), Tolumid (135,17), 6-Methylnicotinamid (136,15), 3-Aminonicotinamid (137,14), Nicotinamid-N-Oxid (138,12), 3-Hydropicolinamid (138,13), 4-Fluorbenzamid (139,13), Zimtsäureamid (147,18), 4-Methoxybenzamid (151,17), 2,6-Difluorbenzamid (157,12), 4-Amino-5-imidazolcarbonsäureamid (162,58), 3,4-Pyridindicarbonsäureamid (165,16), 4-Ethoxybenzamid (165,19), 2,3-Pyrazindicarboxamid (166,14), 2-Nitrobenzamid (166,14), 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure (170,4), Indol-3-acetamid (174,2), 5-Acetylsalicylamid (179,18), 3,5-Dimethoxybenzamid (181,19), 1-Naphthalinacetamid (185,23), 8-Chlor-3,5-diamino-2-pyrazincarboxyamid (187,59), 4-Trifluormethylbenzamid (189,00), 5-Amino-5-phenyl-4-pyrazolcarboxamid (202,22), 1-Methyl-2-benzylmalonamat (207,33), 4-Amino-2,3,5,6-tetrafluorbenzamid (208,11), 2,3-Naphthalindicarbonsäure (212,22). Die Verbindungen werden in der oben beschriebenen Konzentration in DMSO gegeben. Ein μl des Materials wird dann mit Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix (nach einer 1 : 10.000-Verdünnung) vermischt und auf einem festen Träger aus rostfreiem Stahl abgeschieden.
Das Material wird anschließend mit einem Laser unter Verwendung des Protein-TOF-Massenspektrometers (Bruker, Manning Park, MA) desorbiert und die resultierenden Ionen werden in sowohl dem linearen als auch dem Reflektron-Betriebsmodus gemessen. Die folgenden m/z-Werte werden beobachtet (11):
Die Daten zeigen, daß 22 von 31 Verbindungen im Spektrum mit der vorhergesagten Masse erschienen, 9 von 31 Verbindungen im Spektrum mit einer n + H-Masse (1 Atommasseneinheit, amu) über der vorhergesagten Masse erschienen. Das letztere Phänomen beruht wahrscheinlich auf der Protonierung eines Amins in den Verbindungen. Daher werden 31 von 31 Verbindungen mit MALDI-Massenspektroskopie nachgewiesen. Noch wichtiger ist, daß das Beispiel zeigt, daß mehrere Markierungen gleichzeitig mit einem spektroskopischen Verfahren nachgewiesen werden können.
Die Alpha-Cyano-Matrix allein (11) ergab Peaks bei 146,2, 164,1, 172,1, 173,1, 189,1, 190,1, 191,1, 192,1, 212,1, 224,1, 228,0, 234,3. Weitere identifizierte Massen im Spektrum beruhen auf Verunreinigungen in den gekauften Verbindungen, da keine Anstrengungen unternommen wurden, die Verbindungen weiter zu reinigen.
BEISPIEL 14
MIKROSATELLITEN-MARKER:PCR-AMPLIFIKATIONEN.
Die Mikrosatelliten-Marker werden amplifiziert unter Verwendung der folgenden Standard-PCR-Bedingungen. Kwz gesagt, werden PCR-Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt, das 40 ng genomische DNA, 50 pmol von jedem Primer, 0,125 mM dNTPs und 1 Einheit Taq-Polymerase enthält. 1X-Amplifikationspuffer enthält 10 mM Tris-Base, pH 9, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100 und 0,01% Gelatine. Die Reaktionen werden unter Verwendung eines "Heißstart"-Verfahrens durchgeführt: Taq-Polymerase wird erst nach einem ersten Denatwierungsschritt von 5 Minuten bei 96°C zugegeben. Amplifikation wird über 35 Zyklen durchgeführt: Denaturierung (94°C für 40 s) und Annealing (55°C für 30 s). Ein Verlängerungsschritt (72°C für 2 Minuten) beendet das Verfahren nach dem letzten Annealing. Da die Amplifikationsprodukte, die erhalten werden sollen, kurz sind (90 bis 350 Basenpaare lang) und das Zeitintervall, um die Temperatur von 55°C auf 94°C anzuheben (erhalten mit einer Anstiegsgeschwindigkeit von 1°C/Sekunde), lang genug ist, kann die Vervollständigung der DNA-Verlängerung ohne einen Schritt bei 72°C erreicht werden.
BEISPIEL 15
AUFRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN
Instrumentierung
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten kann unter Verwendung eines HPLC-Systems durchgeführt werden, das aus verschiedenen Stundardkomponenten zusammengesetzt ist. Diese Komponenten schließen ein Minimum von zwei Hochdruckpumpen ein, die Lösungsmittel durch einen Hochdruckgradientenmischer, einen Injektor, einer HPLC-Säule und einen Detektor pumpen. Der Injektor ist ein automatisierter programmierbarer Autosampler, der in der Lage ist, typischerweise zwischen 80 und 100 Proben bei oder unterhalb von Raumtemperaturen zu Lagern, um die Stabilität der Probenkomponenten aufrechtzuerhalten. Der Autoinjektor ist ebenfalls in der Lage, μl-Größen-Injektionen auf eine reproduzierbare Weise vollständig ohne Kontrolle durchzuführen. Die HPLC-Säule ist in einem geheizten Säulenkompartiment enthalten, das in der Lage ist, eine definierte Temperatur auf innerhalb von 0,1°C zu halten. Die in den Beispielen unten verwendetete Säule wurde von SeraSep (San Jose, CA) unter dem Namen DNASep erworben. Die Säule ist eine 55 × 4,6 mm Säule mit einem 2,2 μm nicht-porösen Polystyroldivinylbenzol-Copolymer-Partikel, der mit C18 alkyliert ist. Das Packmaterial ist innerhalb eines pH-Bereichs von 2–12 stabil und toleriert Temperaturen so hoch wie 70°C. Der Nachweis von Analyt wurde unter der Verwendung eines Einzel- oder multiple Wellenlängen UV-Detektors oder Dioden-Arraydetektor durchgeführt.
Verfahren
Die in diesem Beispiel zur Abtrennung von DNA-Fragmenten angewendeten Verfahren verwenden Ionen-Paarchromatographie, eine Form von Chromatographie, in der Ionen in Lösung gepaart oder neutralisiert werden können und als ein Ionenpaar auf eine Umkehrphasensäule getrennt werden können. Der lipophile Charakter und die Konzentration des Gegenions bestimmen das Ausmaß der Retention des Analyten. Im Fall eines DNA-Moleküls paart die lipophile kationische Pufferkomponente mit anionischen Phosphatgruppen auf dem DNA-Rückgrat. Die Pufferkomponenten interagieren auch mit den Alkylgruppen der stationären Phase. Die gepaarte DNA eluiert dann gemäß ihrer Größe, während die mobile Phase fortschreitend organischer mit ansteigenden Konzentrationen von Acetonitril gemacht wird. Die Evaluierung der Geeignetheit von verschiedenen Aminsalzen wurde unter der Verwendung von enzymatischen Verdaus von Plasmiden oder kommerziell erhältlichen DNA-Leitern untersucht. Der Bereich von Acetonitril, der erforderlich ist um die DNA zu eluieren, sowie die Temperatur des Säulenkompartiments variierte mit jedem untersuchten Puffer.
Puffer
Die auf ihre Ionen-Paarungsfähigkeit hin untersuchten Puffer wurden aus Vorratslösungen hergestellt. Um die Konzentration von Ionen-Paaneagenz während des Gradienten konstant zu halten, wurde das Ionen-Paaneagenz zu sowohl der Wasser- und der Acetonitril-mobilen Phase hinzugefügt. Die Säue wurde mit einer neuen mobilen Phase für ungefähr 18 Stunden bei einer Flußrate von 50 μl/Minute vor dem Versuch jeglicher Trennung äquilibriert. Sobald eine mobile Phase untersucht wurde, wurde sie entfernt und die Säule mit einer Spülung von 800 ml 0,1% Ameisensäure und 50% Acetonitril, gefolgt von einer Spülung mit 800 ml 0,1% Essigsäure und 50% Acetonitril vor der Äquilibrierung mit einer neuen mobilen Phase gereinigt.
A. nn-Dimethyloctylammoniumtrifluoracetat
Eine Vorratslösung von 1 molar von Dimethyloctylammoniumtrifluoracetat wurde durch Mischen einer Hälfte eines Äquivalents von Trifluoressigsäure in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamem Hinzufügen eines Äquivalents von nn-Dimethyloctylamin hergestellt. Der pH dieser Vorratslösung ist 7. Die Vorratslösung wurde mit einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
B. nn-Dimethylheptylammoniumacetat
Eine Vorratslösung von 1 molar Dimethylheptylammoniumacetat wurde durch Mischen eines Äquivalents von Eisessig in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamem Hinzufügen eines Äquivalents von nn-Dimethylheptylamin hergestellt. Der pH dieser Vorratslösung ist 6,6. Die Vorratslösung wurde mit einer geeigneten Menge von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
C. nn-Dimethylhexylammoniumacetat
Eine Vorratslösung von 1 molar Dimethylhexylammoniumacetat wurde durch Mischen eines Äquivalents von Eisessig in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamem Hinzufügen eines Äquivalents von nn-Dimethylhexylamin hergestellt. Der pH dieser Vorratslösung ist 6,5. Die Vonatslösung wurde mit einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
D. nn-Dimethylbutylammoniumacetat
Eine Vorratslösung von 1 molar Dimethylbutylammoniumacetat wurde durch Mischen eines Äquivalents von Eisessig in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamem Hinzufügen eines Äquivalents von nn-Dimethylbutylamin hergestellt. Der pH der Vorratslösung ist 6,9. Die Vorratslösung wurde mit einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
E. nn-Dimethylisopropylammoniumacetat
Eine Vorratslösung von 1 molar Dimethylisopropylammoniumacetat wurde durch Mischen eines Äquivalents von Eisessig in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamem Hinzufügen eines Äquivalents von nn-Dimethylisopropylamin hergestellt. Der pH der Vorratslösung ist 6,9. Die Vonatslösung wurde mit einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
F. nn-Dimethylcyclohexylammoniumacetat
Eine Vorratslösung von 1 molar Dimethylcyclohexylammoniumacetat wurde durch Mischen eines Äquivalents von Eisessig in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamem Hinzufügen eines Äquivalents von nn-Dimethylcyclohexylamin hergestellt. Der pH der Vorratslösung ist 6,5. Die Vorratslösung wurde mit einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
G. Methylpiperidinacetat
Eine Vorratslösung von 1 molar Methylpiperidinacetat wurde durch Mischen eines Äquivalents von Eisessig in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamen Hinzufügen eines Äquivalents von 1-Methylpiperidin hergestellt. Der pH der Lösung ist 7. Die Vonatslösung wurde mit einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
H. Methylpynolidinacetat
Eine Vorratslösung von 1 molar Methylpyrrolidinacetat wurde durch Mischen eines Äquivalents von Eisessig in einem geeigneten Volumen von Wasser und langsamem Hinzufügen eines Äquivalents 1-Methylpyrrolidin hergestellt. Der pH der Vorratslösung ist 7. Die Vonatslösung wurde in einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
I. Triethylammoniumacetat
Eine Vorratslösung von 2 molar Triethylammoniumacetat pH 7,0 wurde von Glenn Research Sterling, Virginia, erworben. Die Vonatslösung wurde mit einem geeigneten Volumen von Wasser oder Acetonitril auf Arbeitskonzentration verdünnt.
BEISPIEL 16
DNA-FINGERPRINT
DNA-Fingerprintingadaptoren werden umfassend das Folgende hergestellt: Eine Kernsequenz und eine Enzym-spezifische Sequenz. Die Struktur des EcoRI-Adapters ist 5'-CTCGTAGACTGCGTACC (SEQ ID NO. _), die Struktur des MseI-Adapters ist 5'-GACGATGAGTCCTGAG.
Adaptoren für die selten schneidenden Enzyme waren identisch zu dem EcoRI mit der Ausnahme, daß kohäsive Enden verwendet wurden. ALPH-Primer bestehen aus drei Teilen: Einer Kernsequenz, einer Enzym-spezifische Sequenz und einer selektiven Verlängerungssequenz. Die EcoRI- und MseI-Primer werden wie folgt beschrieben: EcoRI: 5'-gactgcgtaaa-aattc-NNN (SEQ ID NO. _); MseI: 5'-gatgagtcctgag-taa-NNN (SEQ ID NO. _).
Genomische DNA wurde für 1 Stunde bei 37°C mit 5 Einheiten EcoRI und 5 Einheiten MseI und 40 μl Volumen mit 10 mM Tris-Acetat pH 7,5, 10 mM MgAce, 50 mM KActate, 5 mM DTT, 50 ng/Mikroliter BSA, 5 mM DTT inkubiert. Als nächstes wurden 10 μl einer Lösung, die 5 pMol EcoRI-Adaptoren, 50 pMol MseI-Adaptoren, 1 Einheit T4-Ligase, 1 mM ATP in 10 mM Tris-Acetat pH 7,5, 10 mM MgAce, 50 mM KAcetate, 5 mM DTT, 50 ng/Mikroliter BSA enthielt, hinzugeführt und die Inkubation wurde für 3 Stunden bei 37°C fortgeführt. Die Adaptoren wurden durch Hinzufügen von äquimolaren Mengen von beiden Strängen hergestellt: Die Adaptoren waren nicht phosphoryliert. Nach der Ligation wurde das Reaktionsgemisch auf 500 μl mit 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 verdünnt und bei – 20°C gelagert.
Genetische Fingerprintingreaktionen: Amplifikationsreaktionen werden beschrieben, die DNA-Template für die Enzymkombination EcoRI/MseI verwenden. Genomische Fingerprints mit anderen Enzymkombinationen wurden mit geeigneten Primern durchgeführt. Die Amplifikationsreaktionen verwendeten im allgemeinen zwei Oligonukleotide, eines entsprechend den EcoRI-Enden und eines entsprechend den MseI-Enden. Einer der zwei Primer war mit dem CMST-Marker markiert, bevorzugterweise der EcoRI-Primer. Die PCRs wurden unter der Verwendung von 5 ng markiertem EcoRI-Primer, 30 ng MseI-Primer, 5 Mikroliter Templat DNA, 0,4 Einheiten Taq-Polymerase, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,2 mM von dATP, dGTP, dCTP, dTTP durchgeführt. Die PCR-Reaktionen unterschieden sich in Abhängigkeit von der Art der selektiven Amplifikationsverlängerung der für die Amplifikation verwendeten DNA-Fingerprintingprimer. Die DNA-Fingerprintingreaktionen mit Primern, die zwei oder drei selektive Nukleotide aufweisen, wurden für 36 Zyklen mit dem folgenden Zyklusprofil durchgeführt: Ein 30 Sekunden DNA-Denaturierungsschritt bei 94°C, ein 30 Sekunden Annealingschritt bei 55°C und dann ein 1 Minute Verlängerungsschritt bei 72°C für 1 Minute. Die Annealingtemperatur im ersten Schritt war 65°C und wurde anschließend für jeden Zyklusschritt um 0,7°C in den nächsten 12 Zyklen verringert und wurde bei 56°C für die restlichen 23 Zyklen fortgeführt. Alle Amplifikationen wurden in einem MJ-Thermocycler (Watertown, MA) durchgeführt.
Das DNA-Fingerprinting der komplexen Genome (wie zum Beispiel bei Menschen) schloß zwei Amplifikationsschritte ein. Die Präamplifikation wurde mit zwei DNA-Fingerprintings durchgeführt, die ein einzelnes selektives Nukleotid, wie oben beschrieben, aufwiesen, mit der Ausnahme, daß 30 ng von beiden DNA-Fingerprintingprimern verwendet wurden und daß diese Primer nicht mit CMST markiert wurden, nach dem Preamplifikationsschritt wurden die Reaktionsgemische 10-fach mit 10 mM Trts-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0 verdünnt und als Template für die zweite Amplifikationsreaktion verwendet. Die zweite Amplifikationsreaktion wurde wie oben beschrieben für die DNA-Fingerprintingreaktionen mit Primern durchgeführt, die die längeren selektiven Verlängerungen aufwiesen.
Die Produkte aus den Amplifikationsreaktionen wurden durch HPLC analysiert. Die HPLC wurde unter der Verwendung von automatisierter HPLC-Instrumentierung (Rainin, Emeryville, CA oder Hewlett Packard, Palo Alto, CA) durchgeführt. Nicht-gereinigte DNA-Fingerprintingprodukte, die für 3 Minuten bei 95°C vor der Injektion in einer HPLC denaturiert wurden, wurden mit einem linearen Acetonitril (ACN, J. T. Baker, NJ) Gradienten von 1,8%/Minute bei einer Flußrate von 0,9 ml/Minute eluiert. Die Start- und Endpunkte wurden gemäß der Größe der amplifizierten Produkte eingestellt. Die für die erfolgreiche Auflösung der während der DNA-Fingerprinting-Technik erzeugten Moleküle erforderliche Temperatur war 50°C. Der Ausfluß aus der HPLC wurde dann in ein Massenspektrometer zum Nachweis der Markierungen geleitet (Hewlett Packard, Palo Alto, CA).
Die folgenden Fragmente eluierten in der präsentierten Reihenfolge (die zitierte Nummer sind die Positionen innerhalb des Lambda-Genoms, bei denen eine Spaltstelle auftrat): 47, 78, 91, 733, 1456, 2176, 3275, 3419, 4349, 444, 5268, 5709, 6076, 6184, 6551, 7024, 7949, 8062, 8200, 8461, 9079, 9253, 9692, 9952, 11083, 11116, 11518, 11584, 12619, 12967, 14108, 14892, 15628, 15968, 16034, 16295, 16859, 18869, 19137, 19482, 20800, 21226, 21441, 2635, 21702, 21903, 21948, 22724, 23048, 23084, 23111, 23206, 23297, 23285, 23479, 23498, 23555, 23693, 23887, 23979, 23987, 24073, 24102, 24751, 24987, 25170, 25255, 25353, 25437, 26104, 25578, 25746, 25968, 26133, 26426, 26451, 26483, 26523, 26585, 26651, 26666, 26679, 26693, 26763, 26810, 26984, 26993, 27038, 27092, 27203, 27317, 27683, 28456, 28569, 28922, 28972, 29374, 29981, 30822, 30620, 30639, 30722, 30735, 30756, 31169, 31747, 31808, 32194, 32218, 32641, 32704, 33222, 33351, 33688, 33736, 33748, 33801, 34202, 34366, 34406, 34590, 34618, 34684, 34735, 34753, 34831, 35062, 35269, 35534, 35541, 36275, 36282, 36303, 36430, 36492, 36531, 36543, 36604, 36736, 36757, 36879, 37032, 37442, 37766, 37783, 37882, 37916, 37994, 36164, 38287, 38412, 38834, 39168, 44972, 39607, 39835, 40127, 40506, 40560, 40881, 41017, 41423, 41652, 41715, 42317, 42631, 42651, 42673, 42814, 43410, 43492, 43507, 43528, 43593, 44424, 44538, 44596, 45151, 45788, 46033, 46408, 46556, 46804, 46843, 46853, 46896, 46952, 47256, 47274, 47287, 47430, 47576, 47699, 47799, 48059, 48125, 48227, 48359, 48378. Die durchschnittliche Fragmentlänge war ungefähr 160 nt. Die beobachteten Stellen der Spaltung waren größtenteils (>95%) mit denjenigen aus einer MseI/EcoRI Verdaukarte vorhergesagten kompatibel.
BEISPIEL 17
EINZELNUKLEOTID-VERLÄNGERUNGSASSAYS
RNA-Präparation: Gesamt-RNA wurde isoliert und wurde aus Jurkat-Zellen (ausgehend von 1 × 10⁹ Zellen in exponentiellen Wachstum) unter der Verwendung eines RNA-Isolierungskits von Promega (WI) präpariert. Die RNA wurde in zwei Aliquots gelagert: 1) Vorratsaliquot in Diethylpyrocarbonat-behandeltem ddH₂O wurde bei –20°C gelagert und 2) Langzeitlagerung als eine Suspension in 100% H₂O.
Reverse Transkription: Poly(dT)-geprimte reverse Transkription von Gesamt-RNA wurde wie beschrieben in Ausubel et al. (Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, 1991, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, NY, NY.) durchgeführt mit der Ausnahme, daß die Reaktionen) auf die Verwendung von 1 μg von Anfangs-Gesamt-RNA eingestellt wurden. 20–50 Einheiten von reverser Transkriptase (Promega) wurden 10-fach in 10% Glyzerin, 10 mM KP04, pH 7,4, 0,2% Triton X-100, und 2 mM DTT verdünnt und auf Eis für 30 Minuten plaziert, vor der Zugabe zu den Reaktionen. Gen-spezifische reverse Transkription für GADPH und andere Kontrollgene, wie unten beschrieben, wurden unter der Verwendung von 1 μg Gesamt Jurkat RNA durchgeführt, die in 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, M MgCl2, 1 mM dNTPs, 2 U/μl RNAsin (Gibco-BRL), 0,1 M Oligomer und 0,125 U/μl von M-MLV reverse Transkriptase (Gibco-BRL) in 20 μl Reaktionen revers transkribiert wurde. Die Reaktionen wurden bei 42°C für 15 Minuten inkubiert, bei 95°C für 5 Minuten Hitze-inaktiviert und auf 100 μl mit einem Mastermix von (10 mM Tris HCl pH 8,3, 1 mM NH4Cl, 1,5 M MgCl2, 100 mM KCl), 0,125 mM NTPs, 10 ng/ml der jeweiligen Oligonucleotidprimer und 0,75 Einheiten von Taq-Polymerase (Gibco-BRL) in Vorbereitung auf die PCR-Amplifikation verdünnt.
PCR: Die PCR für jedes Gen wurde mit genspezifischen Primern durchgeführt, die eine bekannte Intron/Exon-Grenze überspannten (siehe unten). Alle PCRs wurden in 20 μl Volumen durchgeführt, die 10 mM Tris HCl pH 8,3, 1 mM NH₄Cl, 1,5 M MgCl₂, 100 mM KCl), 0,125 mM NTPs, 10 ng/ml der jeweiligen Oligonukleotidprimer und 0,75 Einheiten Taq-Polymerase (Gibco-BRL) enthielten. Die Zyklusparameter waren 94°C Vor-Erhitzungsschritt für 5 Minuten, gefolgt von 94°C Denaturierungsschritt für 1 Minute, 55°C Annealingschritt für 2 Minuten und ein 72°C Verlängerungsschritt für 30 Sekunden bis 1 Minute und einer finalen Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten. Die Amplifikationen waren im allgemeinen 30–5 an der Zahl.
Reinigung von Templaten: Die PCR-Produkte wurden wie durch Zhen und Swank (Zhen und Swank, BioTechniques, 14(6): 894–898, 1993) beschrieben gelgereinigt. Die PCR-Produkte wurden auf 1% Agarosegelen getrennt, die in 0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA (1 × TAE) Puffer laufen gelassen wurden und mit Ethidiumbromid gefärbt wurden, während sie mit einer UV Lichtquelle sichtbar gemacht wurden. Eine Vertiefung wurde gerade vor der Bunde von Interesse eingeschnitten und mit 50–200 μl von 10% PEG in 1 × TAE Puffer gefüllt. Die Elektrophorese wurde fortgeführt, bis die Bunde vollständig in die Vertiefung eingetreten war. Die Inhalte wurden dann entfernt und extrahiert mit Phenol, Chloroform extrahiert, und dann in 0,1 Volumen von 7,5 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumen 100% EtOH gefällt. Die Proben. wurden mit 75% EtOH gewaschen und kurz bei Raumtemperatur getrocknet. Die Quantifizierung der Ausbeute wurde durch Elektrophorese eines kleinen Aliquots auf 1% Agarosegel in 1 × TBE Puffer mit Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit einem bekannten Standard durchgeführt.
Jede SNuPE-Reaktion wurde in einem 50 μl Volumen, das ungefähr 100 ng des amplifizierten DNA Fragments, 1 μM des SNuPE-Primers, 2 Einheiten Taq-Polymerase und 1 μl des geeigneten dNTP enthielt, durchgeführt. Alle dNTPs waren in diesem Typ Assay nicht-markiert. Der verwendete Puffer war 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), mit 50 mM KCl, SmM MgCl2 und 0,001% (Gew/Vol) Gelatine. Die Proben wurden einem Zyklus unterzogen, der aus einer 2-Minuten Denaturierungsperiode bei 95°C, einer 2 Minuten Annealingperiode bei 60°C und einer 2-Minuten Primerverlängerungsperiode bei 72°C bestand. Die Sequenz des SNUPE-Primers für jede Familie ist unten beschrieben.
Primerverlängerungen: Einzel-Nucleotidprimerverlängerung wurden wie in Singer-Sam et al., (Singer-Sam et al., PCR Methods und Applications 1: 160–163, 1992) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 1 mM Mg++, 0,1 μM Primer, und 0,05 μM jedes dNTP-Typs in jedem Reaktionstyp verwendet wurden. Nach jeder oben beschriebenen Primerverlängerung wurde ein fünftel Volumen eines Ladefarbstoffs (80% Formamid, 0,1% Bromophenolblau, 0,1% Xylencyanol, 2 mM EDTA) hinzugefügt und die gesamte Probe in 15% denaturierendem Polyacrylamidgel elektrophoriert. Die Gele wurden in 10% Glyzerin, 10% Methanol, 10% Eisessig unter konstantem Schütteln fixiert, gefolgt von Waschschritten mit 10% Glyzerin. Die Gele wurden dann bei 55°C für 3–5 Stunden getrocknet.
Die in diesem Experiment beschriebenen Primer sind durch Rychlik beschrieben (Rychlik, BioTechniques 18: 84–90, 1995). Die Primer können synthetisiert werden oder als Gel-Filtrationsgradprimer von Midland Certified Reagent Company (Midland, Texas) erhalten werden. Die Amplifikationen sind entweder Taq DNA-Polymerase-basiert (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl) oder Pfu-DNA-Polymerase-basiert (20 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,0 mM MgCl2, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin). Die Gesamt-Nukleosidtriphosphat (NTPs) Konzentration in den Reaktionen ist 0,8 mM, die Primerkonzentration ist 200 nM (falls nicht anders angegeben) und die Templatmenge ist 0,25 ng von Bakteriophagen Lambda-DNA pro 20 μl Reaktion. Die Zyklusparameter waren 94°C Vor-Heizschritt für 5 Minuten, gefolgt von 94°C Denaturierungsschritt für 1 Minute, 55°C Annealingschritt für 2 Minuten und einem 72°C Verlängerungsschritt für 30 Sekunden bis 1 Minute und einer finalen Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten. Die Amplifikationen waren im allgemeinen 30–45 an der Zahl.
Zwei Regionen im Bakteriophagen Lambda-Genom (GenBank Zugangsnummer # J02459) wurden als die Startstellen für die Amplifikation ausgesucht. Der 5'-Primer wies ein stabiles GC-reiches 3'-Ende auf: Der 3'-Primer is so ausgewählt, daß sich ein 381 bp Produkt ergeben wird. Der 5'-Vorwärtsprimer ist H17: 5'-GAACGAAAACCCCCCGC (SEQ ID NO: _). Der 3'-rückwärtige Primer ist RP 17: 5'-GATCGCCCCCAAAACACATA (SEQ ID NO: _).
Das amplifizierte Produkt wurde dann auf die Anwesenheit eines Polymorphismus an Position 31245 getestet. Der folgende Primer wurde in vier Einzel-Nukleotidverlängerungstests verwendet; SNE17: 5'-GAACGAAAACCCCCCGC (SEQ ID NO: _). Die vier Einzel-Nukleotidverlängerungsassays wurden dann wie oben beschrieben durchgeführt. All die Reaktionen wurden dann vereinigt und 5 μ1 des vereinigten Materials wurde auf die HPLC-Säule (SeraSep, San Jose, CA) ohne weitere Reinigung injiziert.
Die HPLC wurde unter der Verwendung von automatisierter HPLC-Instrumentierung (Rainin, Emeryville, CA., oder Hewlett Packard, Palo Alto, CA) durchgeführt. Nicht-gereinigte SNEA-Produkte, die für 3 Minuten bei 95°C vor der Injektion in eine HPLC denaturiert wurden, wurden mit einem linearen Acetonitrilgradienten (ACN, J. T. Baker, NJ) von 1,8%/Minute bei einer Flußrate von 0,9 ml/Minute eluiert. Die Start und Endpunkte wurden gemäß der Größe des SNEA-Produkts eingestellt. Die für die erfolgreiche Auflösung der SNEA-Moleküle erforderliche Temperatur war 50°C. Der Ausfluß aus der HPLC wurde dann in ein Massenspektrometer geleitet (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) zum Nachweis von Markierungen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 2 angegeben sind.
TABELLE 2
Die Ergebnisse zeigen daher an, daß der Massenspektrometrie-Marker (CMST) bei einer Retentionszeit von 4,6 Minuten nachgewiesen wurde, was anzeigt, daß der SNE17-Primer durch eine Base (ddCTP) verlängert wurde und daher der Polymorphismus an der Position 31245 in diesem Falle ein "G" war. Die SNE17-487, SNE17-496, und SNE17-555 markierten Primer wurden nicht verlängert und ihre Retentionszeit auf der HPLC war jeweils 2,5 Minuten.
BEISPIEL 18
In diesem Beispiel (18) wurden alle Reaktionen in Folien-abgedeckten Flaschen durchgeführt. Die Sequenz der Reaktionen A → F, beschrieben in diesem Beispiel, ist in 19A und 19B dargestellt. Die in diesem Beispiel angegebenen Verbindungsnummern beziehen sich auf Verbindungen derselben Nummern in 19A und 19B.
A. Zu einer Lösung eines ANP-Linkers (Verbindung 1, 11,2 mMol) und Diisopropylethylamin (22,4 mMol) in CHCl₃ (60 ml) wurde Allylbromid (22,4 mMol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 Stunden refluxiert, für 19 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, verdünnt mit CHCl3 (200 ml) und mit 1,0 M HCl (2 × 150 ml) und H₂O (2 × 150 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft, um Verbindung 2 als gelben Feststoff zu ergeben.
Zu einem Gemisch von Verbindung 2 in CH₂Cl₂ (70 ml), wurde Tris(2-aminoethyl)amin (50 ml) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit CH₂Cl₂ (150 ml) verdünnt und mit pH 6,0 Phosphatpuffer (2 × 150 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rest wurde Säulenchromatographie (Hexan/EtOAc) unterzogen, um 1,63 g (58%) von Verbindung 3 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,85 (dd, 2H), 7,70 (t, 1H), 7,43 (t, 1H), 5,85 (m, 1H); 5,20 (q, 2H), 4,58 (q, 1H), 4,50 (d, 2H), 2,70 (m, 2H), 2,20 (br s, 2H).
B. Zu einer Lösung von Boc-5-aminopentanonsäure (1,09 mMol) und NMM (3,27 m/Mol) in trockenem DMF (6 ml) wurde HATU (1,14 mMol) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt. Eine Lösung von Verbindung 3 (1,20 mMol) in trockenem DMF (1 ml) wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit EtOAc (50 ml) verdünnt und mit 1,0 M HCl (2 × 50 ml) und D.I. H₂O (2 × 50 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und zur Trocknung abgedampft. Der Rest wurde Säulenchromatographie unterzogen, um 420 mg (91%) von Verbindung 4 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 8,65 (d, 1H), 7,88 (d, 1H), 7,65 (m, 2H), 7,48 (t, 1H), 6,73 (br s, 1H), 5,85 (m, 1H), 5,55 (m, 1H), 5,23 (q, 2H), 4,55 (d, 2H), 2,80 (m, 2H), 2,05 (t, 2H), 1,33 (s, 9H), 1,20–1,30 (m, 4H).
C. Eine Lösung von Verbindung 4 (0,9 mMol) in HCl·1,4-Dioxan (20 mMol) wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, in MeOH und Toluol gelöst und nochmals konzentriert (5 × 5 ml) um 398 mg (quantitativ) der Verbindung 5 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 8,75 (d, 1H). 7,88 (d, 1H), 7,65 (m, 2H), 7,51 (t, 1H), 7,22 (m, 2H), 5,85 (m, 1H), 5,57 (m, 1H), 5,23 (q, 2H), 4,55 (d, 2H), 2,80 (m, 2H), 2,71 (m, 2H), 2,07 (s, 2H), 1,40–1,48 (br s, 4H).
D. Zu einer Lösung von Verbindung 21 (0,48 mMol, hergestellt gemäß Beispiel 20) und NMM (1,44 mMol) in trockenem DMF (3 ml) wurde HATU (0,50 mMol) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt. Eine Lösung von Verbindung 5 (0,51 mMol) in trockenem DMF (3 ml) wurde hinzugefügt und die Reaktion bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc (75 ml) verdünnt und mit 5% Na₂CO₃ (3 × 50 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel verdampft, um 281 mg (78%) von Verbindung 6 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 8,65 (d, 1H), 8,17 (d, 1H), 7,82–7,95 (m, 4H), 7,68 (m, 3H), 7,50 (t, 1H), 6,92 (d, 1H), 5,85 (m, 1H), 5,57 (m, 1H), 5,20 (q, 2H), 4,55 (d, 2H), 4,30 (q, 1H), 4,05 (q, 2H), 2,95 (m, 4H), 2,80 (m, 2H), 2,72 (m, 2H), 2,05 (s, 3H), 2,01 (t, 2H), 1,58–1,77 (m, 3H), 1,50 (m, 4H), 1,30 (q, 3H), 1,17–1,40 (m, 9H).
E. Zu einem Gemisch von Verbindung 6 (0,36 mMol) in THF (4 ml), wurden 1 M NaOH (1 mMol) hinzugefügt und die Reaktion bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 7,0 mit 1,0 M HCl (1 ml) angesäuert und das Lösungsmittel abgedampft, um Verbindung 7 zu ergeben (quantitativ): ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 8,65 (d, 1H), 8,17 (d, 1H), 7,82–7,95 (m, 4H), 7,68 (m, 3H), 7,50 (t, 1H), 6,92 (d, 1H), 5,52 (m, 1H), 4,30 (q, 1H), 4,05 (q, 2H), 2,95 (m, 4H), 2,80 (m, 2H), 2,72 (m, 2H), 2,05 (s, 3H), 2,01 (t, 2H), 1,58–1,77 (m, 3H), 1,50 (m, 4H), 1,30 (q, 3H), 1,17–1,40 (m, 9H).
F. Zu einer Lösung von Verbindung 7 (0,04 mMol) und NMM (0,12 mMol) in trockenem DMF (0,4 ml), wurde HATU (0,044 mMol) hinzugefügt und die Reaktion bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt. Allylamin (0,12 mMol) wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc (15 ml) verdünnt und mit 5% Na₂CO₃ (3 × 10 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft, um 15 mg (49%) von Verbindung 8 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,49 (d, 1H), 8,17 (d, 1H), 7,82–7,95 (m, 4H), 7,68 (m, 3H), 7,50 (t, 1H), 6,92 (d, 1H), 5,72 (m, 1H), 5,50 (m, 1H), 5,03 (q, 2H), 4,37 (d, 2H), 4,30 (q, 1H), 4,05 (q, 2H), 2,95 (m, 4H), 2,80 (m, 2H), 2,72 (m, 2H), 2,05 (s, 3H), 2,01 (t, 2H), 1,581,77 (m, 3H), 1,50 (m, 4H), 1,30 (q, 3H), 1,17–1,40 (m, 9H).
BEISPIEL 19
Die Sequenz von Reaktionen A → G wie in diesem Beispiel 19 beschrieben, wird in 20A und 20B dargestellt. Die in diesem Beispiel angegebenen Verbindungsnummern beziehen sich auf die Verbindungen der selben Nummern, wie in 20A und 20B.
A. Zu einer Lösung von Fmoc-Lys(Boc)-OH (Verbindung 9, 33,8 mMol) in CHCl₃ (200 ml), wurde Diisopropylethylamin (67,5 mMol) und Allylbromid (67,5 mMol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 6 Stunden refluxiert, bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt, verdünnt mit CHCl₃, gewaschen mit 1,0 M HCl (2 × 150 ml), gesättigtem NaHCO₃ (1 × 150 ml) und D.I. H₂O (2 × 150 ml). Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft, um Verbindung 10 zu ergeben.
Zu einer Lösung von Verbindung 10 in CHCl₃ (90 ml) wurde Pyrrolidin (10 äq.) hinzugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CHCl₃ (150 ml) verdünnt und mit gesättigtem NaHCO₃ (3 × 250 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rest wurde Säulenchromatographie unterzogen (EtOAc/McOH) um 6,52 g (67%) von Verbindung 11 zu ergeben: ¹H NMR (CDCl₃): δ 5,90 (m, 1H), 5,27 (m, 2H), 4,60 (d, 2H), 3,48 (t, 1H), 3,10 (d, 2H), 1,40–1,78 (m, 9H), 1,40 (s, 9H).
B. Zu einer Lösung von N-Methylisonipekotinsäure (1,60 mMol) und N-Methylmorpholin (4,80 mMol) in trockenem DMF (5 ml) wurde HATU (1,67 mMol) hinzugefügt. Nach 0,5 Stunden wurde eine Lösung der Verbindung 11 (1,75 mMol) in trockenem DMF (2 ml) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂CL₂ (60 ml) verdünnt und mit gesättigtem Na₂CO₃ (3 × 40 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rest wurde Säulenchromatographie unterzogen (CH₂Cl₂/McOH/ Triethylamin), um 580 mg (88%) von Verbindung 12 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO): δ 8,12 (d, 1H), 6,77 (t, 1H), 5,90 (m, 1H), 5,27 (m, 2H), 4,53 (d, 2H), 4,18 (m, 1H), 2,62–2,90 (m, 5H), 2,13 (s, 3H), 1,85 (m, 2H), 1,57 (m, 5H), 1,35 (s, 9H), 1,00 (t, 2H).
C. Ein Gemisch von Verbindung 12 (1,39 mMol) in HCl·1,4-Dioxan (20 mMol) wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, in McOH gelöst, mit Toluol co-abgedampft (5 × 5 ml), um 527 mg (quantitativ) von Verbindung 13 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 8,12 (d, 1H), 6,77 (t, 1H), 5,90 (m, 1H), 5,27 (m, 2H), 4,53 (d, 2H), 4,18 (m, 1H), 2,65–3,00 (m, 8H), 2,23 (s, 3H), 1,85 (m, 2H), 1,57 (m, 5H), 1,00 (t, 2H).
D. Zu einer Lösung von 4-Ethoxybenzoesäwe (1 äq.) in trockenem DMF wird NMM (3 äq.) und HATU (1,05 äq.) hinzugefügt. Nach 0,5 Stunden wird eine Lösung von Verbindung 13 in trockenem DMF hinzugefügt. Nach der Vervollständigung der Reaktion und der basischen Aufarbeitung wird die Verbindung 14 isoliert und gereinigt.
E. Zu einer Lösung von Verbindung 14 in THF wird 1N NaOH hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Vervollständigung der Reaktion und Ansäuerung wird die Verbindung 15 isoliert.
F. Zu einer Lösung von Verbindung 15 (1 äq.) in trockenem DMF, wird NMM (3 äq.) und HATU (1,05 äq.) hinzugefügt. Nach 0,5 Stunden wird eine Lösung von Verbindung 21 (ANP-Allylester, gemäß Beispiel 20 hergestellt) in trockenem DMF hinzugefügt. Nach der Vervollständigung der Reaktion und der basischen Aufarbeitung wird die Titelverbindung 16 isoliert und gereinigt.
G. Zu einer Lösung von Verbindung 16 in THF wird 1N NaOH hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Vervollständigung der Reaktion und der Ansäuerung wird die Verbindung 17 isoliert.
BEISPIEL 20
Die Sequenz der Reaktion A bis D, wie in diesem Beispiel 20 beschrieben, wird in 21 dargestellt. Die wie in diesem Beispiel angegebenen Verbindungsnummern, sowie in den Beispielen 18 und 19 beziehen sich auf die Verbindungen mit derselben Nummer wie in 21.
A. Zu einer Lösung von 4-Ethoxybenzoesäwe (7,82 mMol) und N-Methylmorpholin (20,4 mMol) in CH₂Cl₂ (10 ml) wurde HATU (7,14 mMol) hinzugefügt. Nach 0,25 Stunden wurde eine Lösung der Verbindung 11 (6,8 mMol) in CH₂Cl₂ (6 ml) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit CH₂Cl₂ (150 ml) verdünnt und mit 1,0 M HCl (3 × 50 ml) und gesättigtem NaHCO₃ (3 × 50 ml) gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rest wurde Säulenchromatographie unterzogen (CH₂Cl₂/MeOH), um 2,42 g (82%) von Verbindung 18 zu ergeben: ¹H NMR (CDCl₃): δ 7,78 (d, 2H), 6,91 (d, 2H), 6,88 (d, 1 H), 5,83–5,98 (m, 1 H), 5,21–5.38 (m, 2H), 4,80 (q, 1 H), 4,66 (d, 2H), 4,06 (q, 2H), 3,11 (q, 2H), 1,90–2.04 (m, 1H), 1,68–1,87 (m, 1H), 1,39 (t, 3H), 1,34 (s, 9H), 1,32–1,58 (m, 4H).
B. Ein Gemisch von Verbindung 18 (5,5 mMol) in HCl·1,4-Dioxan (14,3 mMol) wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, in MeOH gelöst, azetropiert mit Toluol und wiederum konzentriert (5 × 5 ml), um eine quantitative Ausbeute von Verbindung 19 zu ergeben.
C. Zu einer Lösung von N-Methylisonipekotinsäure (6,21 mMol) in trockenem DMF (15 ml) wurde NMM (21,6 mMol) und HATU (5,67 mMol) hinzugefügt. Nach 0,5 Stunden wurde eine Lösung von Verbindung 19 (5,4 mMol) in trockenem DMF (10 ml) hinzugefügt und die Reaktion bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 12 mit 1N NaOH (20 ml) gebracht und mit CHCl₃ (2 × 200 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel abgedampft, um 2,2 g (89%) von Verbindung 20 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 8,52 (d, 1H), 7,84 (d, 2H), 7,72 (t, 1H), 6,95 (d, 2H), 5,80–5,95 (m, 1H), 5,18–5,31 (dd, 2H), 4,58 (d, 2H), 4,37 (q, 1H), 4,08 (q, 2H), 3,01 (d, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,95 (m, 1H), 1,63–1,82 (m, 4H), 1,51 (m, 4H), 1,32 (t, 3H), 1,22–1,41 (m, 6H).
D. Zu einer Lösung von Verbindung 20 (4,4 mMol) in THF (10 ml), wird 1N NaOH (4,4 mMol) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde konzentriert, in THF/Toluol (2 × 5 ml) gelöst, konzentriert, in CH₂Cl₂/Toluol (1 × 5 ml) gelöst und noch mal konzentriert, um eine quantitative Ausbeute von Verbindung 21 zu ergeben: ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 7,76 (d, 2H), 6,96 (d, 2H), 4,04 (q, 2H), 3,97 (d, 1H), 2,97 (d, 2H), 2,64 (d, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,95 (m, 1H), 1,58–1,79 (m, 4H), 1,44 (m, 6H), 1,30 (t, 3H), 1,11–1,35 (m, 4H).
BEISPIEL 21
Die Synthese der CMSTs (spaltbarer Massenspektrometrie-nachweisbarer Marker) können, wie in 22 beschrieben, auf einem kombinatorischen Ansatz basiert sein. Der allgemeine Ansatz ist so aufgebaut, um mit den Entwicklungen der Massenspektrometer und den Veränderungen und Verbesserungen in den Ionisationstechnologien kompatibel zu sein. Ein zentrales Gerüst wird zuerst auf seine Kompatibilität mit dem Typ von Ionisation getestet, der in dem Verfahren verwendet werden wird. Es ist wichtig, daß das Gerüst nicht gegenüber Fragmentierung, Hitzedegradation, oder Dimerisierung zur Adduktbildung empfindlich ist. Mit den augenblicklichen APCUQuadrapol-Massenspektrometern werden ungefähr 400 Markern das Spektrum füllen, wobei isotopische Kontamination berücksichtigt wird, die zu einer minimalen Beabstandung von ungefähr 4 AMU zwingt.
Die CMSTs wurden auf eine modulare Weise aufgebaut, so daß die Macker mit einem kombinatorischen Chemie-Ansatz aufgebaut werden können. Es gibt 5 "Module" (funktionell getrennte Atomgruppen) in dem vollständigen Marker-Oligonukleotid. Das erste Modul ist das Oligonukleotid (ODN), das von jeder Länge und Sequenz sein kann und das ein 5'-Hexylamin zur Kopplung an den Linker besitzt, der bevorzugterweise ein photospaltbarer Linker ist. Das ODN kann entweder als eine Sonde für die Hybridisierung oder als ein Primer in einem Verlängerungs-, Ligationss- oder Enzym-basierten Assay sein. Das zweite Modul ist der Linker, bevorzugterweise ein photolabiler Linker, der den Macker an die Oligonukleotidsonde oder den Primer bindet. In dem hier genau beschriebenen Ansatz ist der photolabile Linker ein o-Nitrobenzylaminosäurederivat (siehe Lebl M. et al. "Dynamic database of references in molecular diversity", der die Internet-Adresse http://www.5z.com für eine Zusammenfassung hat). Das dritte Modul ist der Ionisationsverstärker. Dieses Modul ist das Gerüst, auf das der CMST synthetisiert wird und stellt im allgemeinen Funktionalität zur Verfügung, die für den Typ von Ionisationsverfahren, das verwendet wird (d. h. APCI (positiv oder negativer Modus) Elektrospray, MALDI, usw.), spezifisch ist. Das vierte Modul ist der Gesamtmasseneinsteller, womit die Masse in großen Schritten von 200–500 amu verändert werden kann. Dieses Modul erlaubt die Wiederverwendung der variablen Gewichtseinsteller. Das fünfte Modul ist der variable Gewichtseinsteller, auch als variable Masseneinheiten (VMU) bezeichnet. Die variablen Gewichtseinsteller sind chemische Seitenketten, die zu dem Markergerüst hinzugefügt werden. Diese variablen Gewichtseinsteller stellen das Gewicht der CMSTs fein ein. Das Gewicht der Marker ist mindestens jede 4 amu voneinander beabstandet, um überlappende Spektren aufgrund der isotopischen Kontamination zu vermeiden. Dieselben VMU-Seitenarme können wiederholt mit den verschiedenen Typen von Ionisationsgerüsten verwendet werden. Zusammengefaßt sind das Ionisationsmodul und die variablen Masseneinsteller so aufgebaut, um ein vorhersagbares Verhalten in dem MSD zu bewirken, die Photospaltung des photolabilen Linkers ist schnell (unten beschrieben) und die CMST/Oligonukleotidkonjugate sind mit PCR und HPLC und anderen in Assay-Formaten gefundenen Manipulationen kompatibel.
Eine genaue synthetische Route der Marker ist unten und in 22 beschrieben. Die synthetische Route in Richtung eines CMST beginnt mit der Esterfizierung des photosensitiven ANP-Linkers (3-Amino-3-(2-nitrophenyl)propionsäure, (1) um das Ethylesterhydrochlorid (2) mit 84% Ausbeute zu ergeben. Ein wichtiger Schritt in dem Verfahren ist die enzymatische Transformation (2), um den Ethylester als ein einzelnes Isomer zur Verfügung zu stellen. Nachdem das Ethylesterhydrochlorid zum freien Amin basifiziert wurde und konzentriert wurde, wurde der ölige Rest in pH 7 Phosphatpuffer aufgenommen und auf neutralen pH mit 2N HCl eingestellt. Das Amano PS Esteraseenzym wurde als eine Phosphatpufferschlämme hinzugefügt. Nach der Vervollständigung der Reaktion entfernte eine basische Aufarbeitung das hydrolysierte ANP-Nebenprodukt (4) und der Einzel-Isomerethylester (3 > 99% e.e.) wurde zurückerhalten (92% des erhältlichen Materials).
Das Koppeln von (3) mit einem a-BOC-e-alloc-lysin (5), unter der Verwendung von EDAC und HOBT, ergab das geschützte ANP-Lysin (6) in 91% Ausbeute. Das Entfernen von BOC mit TFA stellt den Amino-e-alloc-lysin ANP-Ester (7) als einen weißen Feststoff zur Verfügung. Methyl-isonipecotische Säure Hydrochloride wurde an 7 gekoppelt, unter der Verwendung von EDAC und Triethylamin, um ungereinigte Alloc-geschützte Kernstruktur (8) zu ergeben, die mit Diethylamin, Triphenylphosphin und Palladiumacetat bei 50°C geschützt wurde. Die sich ergebene Kernstruktur (9) wurde aus dem Reaktionsgemisch kristallisiert und durch Filtration in 95% Ausbeute als ein gelber Feststoff zurückgehalten.
Eine Vielzahl von Carboxylsäuren, die als variable Masseneinheiten (VMU) bezeichnet wurden, wurden an (9) gekoppelt, unter der Verwendung von HATU und N-Methylmorpholin. Ein Set von VMU's wurden so aufgebaut, um Gleich-Massenmarker zur Verfügung zu stellen und 4 amu Beabstandung, um eine isotopische Kontamination zu vermeiden. Die Folgenden wurden als Ausschlußkriterien bei der Auswahl bestimmter VMU's der Zielmassen verwendet: 1) Funktionalitäten, die mit der synthetischen Sequenz inkompatibel waren (z. B. Ester); 2) Elemente mit multiplen Isotopen (z. B. Cl, Br, S); 3) Funktionalitäten, die vielleicht zu störenden Photoprozessen führen (Jodid, Acyl- und Ary1-phenone); 4) racemische Säuren und 5) die Erhältlichkeit von Lieferanten.
Nach der Reinigung durch Säulenchromatographie wurde der CMST-Ethylester (10) in veränderlichen Ausbeuten zurückgehalten. Basische Hydrolyse von (10) mit NaOH ergab die CMST-Säure (11) in quantitativer Ausbeute. Der letzte Schritt, die Bildung des aktivierten Esters, wurde unter Verwendung von Tetrafluorophenoltrifluoroacetat und Hunnich's Base erreicht und führte zu dem CMST-TFP-Ester (12) in verschiedenen Ausbeuten.
Es ist bequem, die Marker an das 5'-Ende der Oligonukleotide anzubringen (im allgemeinen), so daß das 3'-Hydroxyl in der Polymerasekettenreaktion verlängert werden kann oder für andere enzymatische Modifikationen zugänglich ist. Auch, wenn direkt als Sonden wie in der Anwendung hier beschrieben, verwendet, werden die Marker bevorzugterweise an das 5'-Ende der Oligonukleotide angebracht. Die durch Lukhtanov et. al., beschriebenen Richtlinien "Oligodeoxyribonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole oligopeptides: preparation und hybridization properties", Bioconjug Chem 6(4): 418–26, Jul–Aug, 1995, können befolgt werden, um die markierten Oligonucleotide aus CMSTs und Oligonukleotiden herzustellen.
BEISPIEL 22
Eine PHRED-Photospaltungseinheit wird zwischen die HPLC und das Massenspektrometer oder einen Autoinjektor und den MSD plaziert. "PHRED", das für Photochemical Reactor for Enhanced Detection steht, und erhältlich ist von Aura Industries, Staten Islund, NY (erhältlich mit sowohl einer 254 nm und 366 nm Lampe, die 254 nm Lampe wurde verwendet). Eine in-line-Vorrichtung wird bevorzugterweise zwischen die Abtrenninstrumentierung (z. B. HPLC oder Gel) und der Detektor plaziert. Die Schnittstelle weist bevorzugterweise die folgenden Eigenschaften auf: Die Fähigkeit, die DNA-Fragmente zu diskreten Zeitintervallen zu sammeln, die DNA-Fragmente zu konzentrieren, die DNA-Fragmente aus den Elektrophoresepuffern und dem Milieu zu entfernen, die MW-Identifizierer von dem DNA-Fragment abzuspalten, die MW-Identifizierer von dem DNA-Fragment abzutrennen, das DNA-Fragment zu verwerfen, den Marker in eine flüchtige Lösung zu plazieren, den Marker zu verflüchtigen und ionisieren, was den Marker in das Massenspektrometer einführt.
Eine geeignete Konfiguration der Photospaltungsvorrichtung ist eine 300 cm lange, 8 Watt, UV-keimabtötende Lampe (G8T50) (mit einer Emission um 366 nm) unter die eine 801 Spule von 0,01 Inch ID Tefzel-Röhre plaziert wird. Flußraten von 800 l pro Minute sind im allgemeinen geeignet. Die Lösungszusammensetzungen, die mit APCUMS kompatibel sind und die nur geringe Konzentrationen von Acetronitril und Puffer, wie zum Beispiel Tris-HCl enthaltend, sind bevorzugt. Mit diesem Aufbau gibt es kein Erfordernis, die DNA von dem Marker vor dem Ionisationsschritt abzutrennen. Der photolabile Linker spaltet sich sehr schnell unter diesen Bedingungen. Die Wärmequelle in der APCI-Kammer trägt zu der Spaltung des photolabilen Linkers bei.
Durch Variieren der Länge der Tefzel-Röhrenspule unter der UV-Quelle und Konstanthalten der Flußrate wurde die Verweildauer unter der UV-Quelle von den 0,75 bis 6 Sekunden variiert. Der Antwortfaktor (der integrierte Ionenstrom, der pro Mol Macker produziert wurde, das in den Flußstrom injiziert wurde, in der "Flußinjektionsanalyse" (FIA)) der Macker wurde für einen Pool von 6 Markierungen bestimmt, die alle an einer einzelnen Oligonukleotidsequenz angebracht waren (21-mer, M13 Vorwärtssequenzierungsprimer). Der Antwortfaktor ist das Integral der Effizienz der Ionisation, Ioneneinführung in die Vakuumkammer und dann anschließender Nachweis durch den MSD. Jede Markierung in dem Pool war bei einer Konzentration von 100 fmol pro μl vorhanden. Das Verdünnungsmittel war tRNA (Boehringer Mannheim) bei einer Konzentration von 1 μg/ml in HPLC-Grad Wasser. In Tabelle 3 sind der Antwortfaktor und die Prozentsätze des beobachteten Signals relativ zu dem längsten Aussetzen (6 Sekunden) auf einer Pro-Markierungsbasis aufgelistet. Die Ergebnisse zeigen an, daß der Marker schnell wird (weniger als 2 Sekunden) von dem befestigten Oligonukleotid abgespalten wird. Im Zeitrahmen von 1,9 bis 6 Sekunden gab es wenig Abnahme im beobachteten Antwortfaktor mit 6 verschiedenen markierten ODNs. Bei der kürzesten Aussetzungszeit, die getestet wurde (0,75 Sekunden) gab es bis zu einer 25%igen Abnahme in dem beobachteten Antwortfaktor.
TABELLE 3
Es gab eine ungefähr 40%-ige Abnahme in dem Antwortfaktor der sechs Marker, wenn die Lampe in der Photospaltungseinheit (Daten nicht gezeigt). Es wurde nachgewiesen, daß der photolabile Linker thermolabil ist und der Marker offensichtlich während des APC-Ionisationsschrittes abgespalten wird, wenn die Verdampfungstemperatur 450°C ist.
BEISPIEL 23
KOLLEKTIVES MARKERVERHALTEN UND RELATIVE STABILITÄT
Die Marker wurden so aufgebaut, um ein einzelnes parenterales Ion zur Verfügung zu stellen, das nicht in Tochter-Ionen zerfiel oder Addukte bildete. Die Antwort der Marker wurde für einen Pool von 43 Markern bestimmt, die alle an eine einzelne Oligonukleotidsequenz befestigt waren (20-mer, M13 Sequenz). Jeder Marker in dem Pool war bei einer Konzentration von 100 fmol pro μl vorhanden (die Konzentration wurde bestimmt durch Anwenden eines Verdünnungsfaktors auf eine Oligo/Makervorratslösung, die spektrophotometrisch bei 260 nm gemessen wurde. Eine Korrektur auf den Markerbeitrag zur Absorption bei 260 nm wurde nicht verwendet. Das Verdünnungsmittel war tRNA (Boehringer Mannheim) bei einer Konzentration von 1 μg/ml in HPLC-Grad Wasser. Der Pool wurde bei 4°C im Dunkeln gelagert. Die CMST-markierten Oligonukleotide können unter normalen Labor-Lichtbedingungen gehandhabt werden, ohne das Auftreten von wahrnehmbarer Degradation.
Vor der Analyse wurde ein 55 μl Aliquot aus der Vorratslösung entfernt und in ein 200 μl Polypropylen-Autosamplergefäß plaziert und durch Falten geschlossen. Fünf Injektionen von jeweils 5 μl aus dem Pool und 3 Injektionen von jeweils 5 μl von dem Verdünnungsmittel wurden durch den HPLC HP1100 ALS durchgeführt. Die APCI-MS-Kammer Parameter waren wie folgt: 20 PSI für den Verneblungsdruck, die Verdampfungstemperatur war 450°C, der Trocknungsgasfluß war 3 l/min, die Trockengastemperatur war 350°C, Coronastrom war 4 uA, Fragmentorspannung 125 V, die Verstärkung wurde auf 1 gesetzt und die Peakweite 0,07 Minuten. Die Flußrate war 0,8 ml/min, das "Todvolumen" der Photospaltungseinheit war 80 μl (0,01" ID Tefzel). Die Lampe der Photospaltungseinheit arbeitete bei 366 nm. Jeder Marker wurde durch die Extraktion des SIM-Ions aus dem TIC quantifiziert. Die Peaks wurden unter den folgenden Parametern integriert: Steigungssensitivität bei 2500, Minimum Peakfläche bei 800, Minimum Peakhöhe bei 100, Peakbreite bei 0,15, die Schultereinstellung bei "aus". Die Peakfläche für jeden Marker wurde für alle fünf Injektionen innerhalb eines Experiments aufgezeichnet und die durchschnittliche Fläche wurde zusammen mit der Standabweichung und dem Variationskoeffizienten berechnet. Durchschnittliche Bereiche, Standabweichungen und CVs wurden auch für einen einzelnen Tag, über eine zwei Tage Zeitdauer und für eine drei Tage-Zeitdauer hinweg berechnet. Innerhalb eines einzelnen Tages variierte der Koeffizient der Variation zwischen 2,0% und 9,9% zwischen verschiedenen Markern. Über eine drei Tage-Zeitdauer variierte der Koeffizient der Variation zwischen 4,0 und 9,8% zwischen verschiedener, Markern. Die Marker sind daher im Hinblick auf Lagerung und Poolen stabil, wie in Tabellen 4a, 4b und 4c gezeigt.
TABELLE 4a 1-Tag
TABELLE 4b 2-Tage
TABELLE 4e 3-Tage
Sensitivität und untere Nachweisgrenze
Spannungsmassen-produzierte Quadrapole weisen Sensitivitäten auf, die mit Fluoreszenz-basierter Sequenzierung vergleichbar sind. Die Sensitivität kann im Hinblick auf die unter Nachweisgrenze der Masse des CMST angegeben werden. Wir definieren die untere Nachweisgrenze als 3 Standardabweichungen oberhalb des Hintergrunds des Assay-Systems. Die untere Nachweisgrenze des Pools von 43 Konjugaten wurde für den 30-Ion SIM Modus bestimmt.
Ein Set von 10 zweifachen Verdünnungen wurde in dem tRNA/Wasser-Verdünnungsmittel präpariert, um 500, 250, 125, 62,5, 31,2, 15,6, 7,8, 3,9, 1,9 und 0,9 Femtomol von Material pro Injektion (5–10 μl) zu ergeben. Die Daten wurden in dem 30-Ion SIM Modus unter oben beschriebenen Bedingungen erhalten: Die LLD für jeden Marker ist in Tabelle 5 gezeigt.
TABELLE 5 UNTERE NACHWEISGRENZE FÜR 43 CMSTs.
Die LLD für dieses bestimmte Set von Markern ist ungefähr 4–30 Femtomol pro Injektion im Anschluß an den Photospaltungsschritt des Oligonukleotids: (30 × 10–15 Mole @ 500 MW → 5 × 10–11 Gramm → 50 Picogramm Marker, 100 × 10–15 Mole bei 330 × 400 nt × 2 = 3 × 10-8 Gramm = 30 Nanogramm eines 400 nt doppelsträngigen PCR-Produkts). Daher, unter der Annahme, daß eine durchschnittliche 25 μl PCR-Reaktion 300 ng eines doppelsträngigen PCR-Produkts enthält, wird ungefähr 1/10 dieses Produkts dazu verwendet, um ein Signal zu erzeugen, das statistisch oberhalb des Hintergrunds der Messung liegt. Zu Vergleichszwecken wurden ungefähr 100–200 ng DNA pro Spur auf dem ABI 377 Sequenzierer verwendet.
Die untere Nachweisgrenze des Markierungssystems beeinträchtigt den Grad an Multiplexierung, das in einer einzelnen Injektion eneicht werden kann. Im Augenblick haben wir kein Problem mit dem Meßprozeß festgestellt, wenn bis zu 10 μg an PCR-Produkt pro Injektion verwendet wird. Die Implikation diese Zahl ist, daß 10.000/30 oder ungefähr 300 Reaktionen unter der Verwendung des Markierungssystems der vorliegenden Erfindung multiplexiert werden können. Daher ist für das HP-MSD 1.100 das Maß von Multiplexierung ungefähr dasselbe, wie die Marker, die in das Spektrum des Quadrapol MS plaziert werden können.
Markerinterferenz
Es gibt wenig oder keine Interferenz im Hinblick auf die Antwort (wobei Antwort der meßbare Ionenstrom ist, der das Ausmaß an Ionisation, Ausmaß von Fragmentierung oder Abbau, Adduktbildung, usw. widerspiegelt) bei der Multiplexierung großer Zahlen von CMSTs der vorliegenden Erfindung. Die Multiplexierung von Markern beeinträchtigt nicht die Antwort von einzelnen Markern und daher beeinträchtigt die Multiplexierung nicht die Ionisation oder den gesamten Ionenstrom.
Antwortfaktor als eine Funktion des Injektionsvolumens
Wie oben beschrieben, wurde ein Pool von 43 Konjugaten gemessen, um den Antwortfaktor als eine Funktion des Injektionsvolumens zu bestimmen. 50 fmol pro Injektion und 500 fmol pro Injektion wurden in 5, 10, 20, 50 und 100 μl Volumen gemessen. Die APCI-MS Parameter waren identisch zu denjenigen, die in dem Markerstabilitätsexperiment verwendet wurden. Die in Tabelle 4 gezeigten Werte sind ein Mittelwert von 5-Replikatinjektionen für jedes gemessene Volumen. Es gab keinen Anstieg im RF zwischen 5 μl und 10 μl Volumina. Bei den 20 μl Injektionsvolumina war der RF 90–97% des 5 μl Volumens. Wenn 50 μl Volumina gemessen wurden, war der RF 54%–75% des 5 μl Volumens. Es gab kein nachweisbares Signal unter der Verwendung der 100 μl Injektionsvolumina.
BEISPIEL 24
P4502D6 POLYMORPHISMUSNACHWEIS
Die hier beschriebene CMST-Technologie-Plattform kann dazu verwendet werden, den CYP2D6 Polymorphismus zu messen, der für den Stoffwechsel von Debrisoquin-4-hydroxylase verantwortlich ist. Dieses bestimmte P450 Cytochrom ist im Stoffwechsel von mehr als 30 Wirkstoffen und xenobiotischen Verbindungen wichtig. CYP2D6 (P450-2D6) ist geschätzter weise für den Stoffwechsel von ungefähr 25% der im Augenblick verschriebenen Wirkstoffe verantwortlich. Die CYP2D6 ist auch als Debrisoquin/Spartein-Hydroxylase bekannt. Sache, Am. J. Human Genetics, 60: 284–295, 1997, hat geschätzt, daß bis zu 10% aller Kaukasier schlechte Metabolisierer sind, aufgrund entweder inaktivierenden Mutationen in beiden Allelen oder dem vollständigen Fehlen des Gens. Es gibt auch einen breiten Bereich von CYP2D6-Aktivitäten, zusätzlich zu schlechten Metabolisieren. Die für die Untersuchung ausgewählten Mutationen schließen C188T, G212A, delT1795, G1846T/A, G1934A, delA2637, C29387, und G4268C ein. Die RFLPS wurden durch Gelelektrophorese nachgewiesen, wie vorher beschreiben (siehe Gough et. al., Nature 347: 773–776, 1990). Die für die RFLP verwendeten Primer entsprechen denjenigen, die durch Sachse et al, Am. J. Hum. Genet. 60: 284–295, 1997 verwendet wurden. Die für die Sequenzierung verwendeten Primer entsprechen denjenigen, die von Meyer et al., Pharmacogenetics 5: 373–384, 1995 verwendet wurden.
Das Prinzip des CMST-basierten Assays war es, ein Strang des amplifizierten CYP2D6-Exons auf einer festen Phase (z. B. magnetischen Partikeln) zu immobilisieren, die Oligonukleotidsonden zu hybridisieren, nicht hybridisiertes Material abzuwaschen, die hybridisierte Sonde zu eluieren und dann den Massenspektrometermarker durch Massenspektrometrie (nach Spalten des Markers von der Probe) nachzuweisen.
Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: Primer, die das 2D6-Gen flankierten (Sachse et. al., Am. J Hum. Genet. 60: 284–295, 1997) wurden dazu verwendet, um ein 4,681 bp genomisches DNA-Fragment zu amplifizieren, das alles der relevanten Gensequenz enthält. Die PCR-Reaktion wurde aus 1 × Expand HF Puffer, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP's, TM 0,5 μM Primern, P100 und P200, 0,5% Formamid, 100 ng gDNA, und 1,1 U Expand^TM High Fidelity Enzym-Mix (Boehringer Mannheim) zusammengesetzt. Die Thermozyklusbedingungen waren wie folgt: 94°C für 3 Minuten; 10 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 62°C für 30 Sekunden und 68°C für 4 Minuten, 20 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 62°C für 30 Sekunden und 68°C für 4 Minuten + 20 Sekunden/Zyklus; 68°C für 10 Minuten. Die Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel sichtbar gemacht, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde.
Das Assayformat wird wie folgt beschrieben: Streptavidin magnetische Partikel (Promega Magnasphere, Bindungskapazität von 80 pmol Biotin/100 μg Partikeln) wurden mit einem Niedrigsalz und Bindungspuffer gewaschen (LSWBB, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7,5) und dann in einem Hochsalz Wasch- und Bindungspuffer (HSWBB, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, und 10 mM Tris pH 7,5) bei einer Konzentration von 2000 μg/ml resuspendiert. Die biotinylierten PCR-Produkte wurden mit den Steptavidinpartikeln für 2 Stunden bei 21°C mit konstantem Rotormischen inkubiert. Die Partikel wurden zweimal mit 200 μl HSWBB gewaschen und einmal mit 200 μl LSWBB. Die gebundenen PCR-Amplikons wurden dann durch Behandlung mit 50 μl 0,1 N NaOH für 10 Minuten bei 21°C denaturiert. Die Partikel wurden dann einmal mit 50 μl 0,1 N NaOH und dreimal mit 200 μl LSWBB gewaschen. Die Partikel-gebundenen Amplikons wurden dann mit äquimolaren Gemischen von Wild-typ (wt) und Mutanten (mt) Sonden hybridisiert, die verschiedene Massenmarker besaßen. Fünfzig Picomol von jeweiliger Sonde wurden in 200 μl von 2 m GuSCN, 5 mM EDTA und 10 mM Tris pH 7,5 plaziert und 50 μl der Hybridisierungslösung wurden zu den Partikeln plaziert. Die Hybridisierung war für 1 Stunde bei 21°C mit konstantem rotierendem Mischen. Die Partikel wurden fünfmal mit LSWBB gewaschen und die Röhrchen wurden nach der zweiten Waschung gewechselt. Die hybridisierten Sonden wurden von den Partikeln durch Behandlung der Partikel mit 50 μl 0,1 N NaOH und einem anschließenden Waschschritt von 9 μl von 0,1 N NaOH eluiert. Die Lösung wurde dann mit 3 μl 1 M Essigsäure neutralisiert. 5 μl dieser Lösung wurden dann in das Massenspektrometer injiziert (HP 1100 Serie LC/MS, ausgerüstet mit Vakuum-Entgaser, binärer Pumpe, Autosampler und Diodenarraydetektor). Das Massenspektrometer wurde mit der APCI Quellenoption verwendet. HP LC/MSD Chemstation-Software wurde für die Systemkontrolle, Datenaufnahme und Datenanalyse, installiert auf einem HP vectra XA mit dem Windows NT Workstation Version 4.0 Betriebssystem) verwendet. Der Flußstrom in das MS besteht aus 50% Acetonitril in ultra-reinem Wasser bei einer Flußrate von 800 μl/Minute. Die photochemische Spaltvorrichtung bestand aus einer 254 nm Niederdruck Quecksilberlampe, einer UV-transparenten Reaktorspule und einem Lampenhalter (Aura Industries).
Repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
TABELLE 6
BEISPIEL 25
GENEXPRESSIONSVERFOLGUNG MIT CMST-MARKIERTEN ODNs
Gesamt-RNA (1–2 μg) aus der A549 menschlichen Zelllinie wurde unter der Verwenudung von Superscript II reverser Transkriptase und OligodT-Primer in einem finalen Volumen von 22 μl gemäß den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies; Gaithersburg, MD) transkribiert. Eine 75 bp-Region der Apoptose-verwandten menschliches DAD-1 Gen kodierenden Region, die eine Intron-Exon-Grenze überspannte, wurde durch Taq-Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert; eine anfängliche Denaturierung bei 95°C (5 Minuten) wurde von 25–60 Zyklen gefolgt (Annealing bei 45°C für 15 Sekunden und Denaturierung bei 95°C für 5 Sekunden). Die PCR-Reaktion (20–200 μl) enthielt 0,5 μM AD-1 reverser Primer (5'-Biotin-CCA GGA AAT TCA AAG AGT GA-3'), 0,0125 μm oder 0,5 μM DAD-1 phosphorylierter Vorwärtsprimer (5'-TTG GCT GAA TCA TTC TCA TT-3'), 7 X 10²–1,2 X 10⁷ Moleküle internem Standard (5'-CC AGG AAA TTC AAA GAG TGA ACA TTC TTT TTG TGT CG-3'), 1 μl A549 cDNA oder 8 X 10⁴- X 10¹¹ Moleküle von WT Mimetikum (5'-CCA GGA AAT TCA AAG AGT GAA CAT TCT TTT AGT CTC CTA CTC CTC AAT TAA GTA AAT GAG AAT GAT TCA GCC AA-3'), 0,8 U Taq-Polymerase, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2mM dGTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, und 10 mM Tris-HCl pH 8,3.
Das Amplifikationsprodukt (50 μl) wurde einzelsträngig durch entweder asymmetrische Amplifikationsbedingungen (oben) oder durch Verdau mit 2,5 U Lambda Exonuklease (Boehringer Mannheim; Indianapolis, 1N) für 15 min (37°C) in 18 mM Tris-HCl pH 9,5, 1,8 mM MgCl2, 28 mM KCl gemacht. Das verdaute Amplikon oder die asymmetrische PCR-Reaktion wurden bei 70°C für 5 Min. plaziert, kurz gekühlt (Raumtemperatur) und auf 2,1 M Guanidinisothiocyanate, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% Sarkosyl, 1 μg/ml tRNA, 5 μg/ml WT 394 Sonde (5'-394 MW CMST Marker-TTG AGG AGT AGG AGA CTA AAA-3'), 5 μg/ml IS 390 probe (5'-390 MW CMST Marker TTGACGACTACGACACAAAAA-3') eingestellt.
Die Hybridisierungsreaktion wurde für 10 Min inkubiert (RT) und auf einen 30K MWCO Spin-Filter (Millipore Corp.; Bedford, MA) transferiert, der 7 μl von 286 μg/m1 Avidin-DN (Vector; Burlingame, CA) und 0,7 pg/ml tRNA enthielt. Der Spin-Filter wurde für 5–10 Min. inkubiert (RT) und zentrifugiert (4,000 × g, 10 min). Der Spin-Filter wurde zweimal mit 400 μl kaltem HPLC-Grad dH₂O gewaschen und zentrifugiert (4,000 × g, 10 min). Fünfundzwanzig Mikroliters von 1 μg/m1 tRNA wurden zu dem Spin-Filter hinzugefügt, um das zurückgehaltene Hybrid zu eluieren. Die 25 μ1 Retentat wurden in 50% Acetonitril über eine Photolyseeinheit in ein HP Massenspektrometer (APCI positiver Modus) injiziert. Einzel-Ionenmessung wurden für Marker gemacht, die Molekulargewichte von 390 und 394 aufwiesen, und die Ergebnisse als Peakbereiche dargestellt. Das Verhältnis der 390/394 Markersignale war proportional zu der Menge von Amplikon, das entweder aus dem internen Standard oder der A549 DAD-1 cDNA oder dem WT Mimetikum erzeugt wurde. Die Berechnung der unbekannten Zahl von RNA-Molekülen in der A549 Gesamt-RNA oder Zahl von WT Mimetika konnte auf einer Standardkurve gemacht werden, wie auf dem log/log-Plot der Zahl von Eingangs-internen Standardmolekülen, gegenüber dem Verhältnis der 390/394 Markersignale gezeigt. Die Unbekannte ist ein Wert von x, wenn y = 0. Alternativ ist die Unbekannte = das Verhältnis von 390/394 × der Zahl von Eingangs-interner Standardmoleküle, wenn das Verhältnis zwischen 0,3 und 3 ist.
Die Ergebnisse sind in 23 gezeigt.
BEISPIEL 26
EINZELNUKLEOTID-VERLÄNGERUNGSASSY
RNA-Präparation: Gesamt-RNA wurde isoliert, die aus Jurkat-Zellen (beginnend mit 1 × 10⁹ Zellen in exponentiellem Wachstum) unter der Verwendung eines RNA-Isolierungskits von Promega (WI) hergestellt wurde. Die RNA wurde in zwei Aliquots gelagert: (1) Vorratsaliquots in Diethylpyrocarbonat-behandeltem ddH₂O wurden bei –20°C gelagert und (2) Langzeitlagerung als eine Suspension in 100% H₂O.
Reverse Transkription: Poly(dT) geprimte reverse Transkription von Gesamt-RNA wurde wie beschrieben in Ausubel et al. (Ausubel et. al., in Cunent Protocols in Molecular Biology, 1991, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, NY, NY.) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Reaktionen) auf die Verwendung von 1 μg von Anfangs-Gesamt-RNA eingestellt wurden. 2–50 Einheiten von reverser Transkriptase (Promega) wurden 10-fach in 10% Glyzerin, 10 mM KPO4, pH 7,4, 0,2% Triton X-100, und 2 mM DTT verdünnt und auf Eis für 30 Minuten plaziert, vor der Zugabe zu den Reaktionen. Gen-spezifische reverse Transkription für GADPH und andere Kontrollgene, wie beschrieben in den Figuren und Tabellen, wurden unter Verwendung von 1 μg von Gesamt Jurkat RNA, revers transkribiert in 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, M MgCl2, 1 mM dNTPs, 2 U/μl RNAsin (Gibco-BRL), 0,1 μM Oligomer und 0,125 U/μl von M-MLV reverser Transkriptase (Gibco-BRL) in 20 μl Reaktionen durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei 42°C für 15 Minuten inkubiert, bei 95°C für 5 Minuten Hitze-inaktiviert und auf 100 μl mit einem Mastermix von 10 mM Tris HCl pH 8,3, 1 mM NH4Cl, 1,5 M MgCl2, 100 mM KCl), 0,125 mM NTPs, 10 ng/ml der jeweiligen Oligonucleotidprimer und 0,75 Einheiten von Taq-Polymerase (Gibco-BRL) in Vorbereitung auf die PCR-Amplifikation verdünnt.
PCR: Die PCR für jedes Gen wurde mit genspezifischen Primern durchgeführt, die eine bekannte Intron/Exon-Grenze überspannten (siehe Tabellen unten). Alle PCRs wurden in 2Oμ1 Volumina durchgeführt, die 10 mM Tris HCl pH 8,3, 1 mM NH₄Cl, 1,5 M MgCl₂, 100 mM KCl), 0,125 mM NTPs, 10 ng/ml der jeweiligen Oligonukleotidprimer und 0,75 Einheiten Taq-Polymerase (Gibco-BRL) enthielten. Die Zyklusparameter waren 94°C Vor-Erhitzungsschritt für 5 Minuten, gefolgt von 94°C Denaturierungsschritt für 1 Minute, 55°C Annealingschritt für 2 Minuten und einem 72°C Verlängerungsschritt für 30 Sekunden bis 1 Minute und einer finalen Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten. Die Amplifikationen waren im allgemeinen 30–45 an der Zahl.
Reinigung von Templaten: Die PCR-Produkte wurden wie durch Zhen und Swank (Zhen und Swank, BioTechniques, 14(6): 894–898, 1993) beschrieben gelgereinigt. Die PCR-Produkte wurden auf 1% Agarosegel getrennt, die in 0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA (1 × TAE) Puffer laufen gelassen wurden und mit Ethidiumbromid gefärbt wurden, während sie mit einer UV Lichtquelle sichtbar gemacht wurden. Eine Vertiefung wurde gerade vor der Bande von Interesse eingeschnitten und mit 50–200 μl von 10% PEG in 1 × TAE Puffer gefüllt. Die Elektrophorese wurde fortgeführt, bis die Bande vollständig in die Vertiefung eingetreten war. Die Inhalte wurden dann entfernt und extrahiert mit Phenol, Chloroform extrahiert und dann in 0,1 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumen 100% EtOH gefällt. Die Proben wurden mit 75% EtOH gewaschen und kwz bei Raumtemperatur getrocknet. Die Quantifizierung der Ausbeute wurde durch Elektrophorese eines kleinen Aliquots auf 1% Agarosegel in 1 × TBE Puffer mit Ethidiumbromid-Färbung und Vergleich mit einem bekannten Standard durchgeführt.
Jede SNuPE-Reaktion wurde in einem 50 μl Volumen, das ungefähr 100 ng des amplifizierten DNA Fragments, 1 μM des SNuPE-Primers, 2 Einheiten Taq-Polymerase und 1 μl des geeigneten dNTP enthielt, durchgeführt. Alle dNTPs waren in diesem Typ Assay nicht-markiert. Der verwendete Puffer war 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), mit 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 und 0,001% (Gew/vol) Gelatine. Die Proben wurden einem Zyklus unterzogen, der aus einer 2-Minuten Denaturierungsperiode bei 95°C, einer 2 Minuten Annealingperiode bei 60°C und einer 2-Minuten Primerveilängerungsperiode bei 72°C bestand. Die Sequenz des SNuPE-Primers für jede Familie ist unten beschrieben.
Primerverlängerungen: Einzel-Nukleotidprimerverlängerung wurden wie in Singer-Sam et al., (Singer-Sam et al., PCR Methods und Applications 1: 160–163, 1992) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 1 mM Mg++, 0,1 μM Primer, und 0,05 μM jedes dNTP-Typs in jedem Reaktionstyp verwendet wurden. Nach jeder oben beschriebenen Primerverlängerung wurde ein fünftel Volumen eines Ladefarbstoffs (80% Formamid, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylencyanol, 2 mM EDTA) hinzugefügt und die gesamte Probe in einem 15% denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoriert. Die Gele wurden in 10% Glyzerin, 10% Methanol, 10% Eisessig unter konstantem Schütteln fixiert, gefolgt von Waschschritten mit 10% Glyzerin. Die Gele wurden dann bei 55°C für 3–5 Stunden getrocknet.
Die in diesem Experiment beschriebenen Primer sind durch Rychlik beschrieben (Rychlik, BioTechniques 18: 84–90, 1995). Die Primer können synthetisiert werden oder als Gel-Filtrationsgrad-Primer von Midland Certified Reagent Company (Midland, Texas) erhalten werden. Die Amplifikationen sind entweder Taq DNA-Polymerase-basiert (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl) oder Pfu-DNA-Polymerase-basiert (20 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,0 mM MgCl2, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)₂SO4, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin). Die Gesamtnukleosidtriphosphat (NTPs) Konzentration in den Reaktionen ist 0,8 mM, die Primerkonzentration ist 200 nM (falls nicht anders angegeben) und die Templatmenge ist 0,25 ng von Bakteriophagen Lambda-DNA pro 20 μl Reaktion. Die Zyklusparameter waren 94°C Vorheizschritt für 5 Minuten, gefolgt von 94°C Denaturierungsschritt für 1 Minute, 55°C Annealingschritt für 2 Minuten und einem 72°C Verlängerungsschritt für 30 Sekunden bis 1 Minute und einer finalen Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten. Die Amplifikationen waren im allgemeinen 30–45 an der Zahl.
Zwei Regionen des Bakteriophagen Lambda-Genoms (GenBank Zugangsnummer # J02459) wurden als die Startstellen für die Amplifikation ausgesucht. Der 5'-Primer weist ein stabiles GC-reiches 3'-Ende auf: Der 3'-Primer ist so ausgewählt, daß sich ein 381 bp Produkt ergeben wird. Der 5'-Vorwärtsprimer ist H17: 5'-GAACGAAAACCCCCCGC. Der 3'-rückwärtige Primer ist RP 17: 5'-GATCGCCCCCAAAACACATA.
Das amplifizierte Produkt wurde dann auf die Anwesenheit eines Polymorphismus an Position 31245 hin getestet. Der folgende Primer wurde in vier Einzel-Nukleotidverlängerungsassays verwendet; SNE17: 5'-GAACGAAAACCCCCCGC. Die vier Einzel-Nukleotidverlängerungsassays wurden dann wie oben beschrieben durchgeführt. All die Reaktionen wurden dann vereinigt und 5 μl des vereinigten Materials wurde auf die HPLC-Säule (SeraSep, San Jose, CA) ohne weitere Reinigung injiziert.
Die HPLC wurde unter der Verwendung von automatisierter HPLC-Instrumentierung (Rainin, Emeryville, CA. oder Hewlett Packard, Palo Alto, CA) durchgeführt. Nicht-gereinigte SNEA-Produkte, die für 3 Minuten bei 95°C vor der Injektion in eine HPLC denaturiert wurden, wurden mit einem linearen Acetonitrilgradienten (ACN, J. T. Baker, NJ) von 1,8%/Minute bei einer Flußrate von 0,9 ml/Minute eluiert. Die Start und Endpunkte wurden gemäß der Größe des SNEA-Produkts eingestellt. Die für die erfolgreiche Auflösung der SNEA-Moleküle erforderliche Temperatur war 50°C. Der Ausfluß aus der HPLC wurde dann in ein Massenspektrometer (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) zum Nachweis von Markierungen geleitet, wobei die Ergebnisse in Tabelle 7 angegeben sind.
TABELLE 7
Die Ergebnisse von Tabelle 7 zeigen, daß der Massenspektrometer-Marker (CMST) bei einer Retentionszeit von 4,6 Minuten nachgewiesen wurde, was anzeigte, daß der SNE17-Primer um eine Base (ddCTP) verlängert wurde und daher der Polymorphismus an Position 31245 in diesem Falle ein "G" war. Die SNE17-487, SNE17-496, und SNE17-555 markierten Primer wurden nicht verlängert und ihre Retentionszeiten waren auf der HPLC jeweils 2,5 Minuten.
BEISPIEL 27
PHOSPHORAMIDIT-CHEMIE FÜR MARKIERTE MOLEKÜLSYNTHESE
Herstellung von Aminohexyl-verlängerten Markern
Wie in 26 gezeigt, wurde die Herstellung von reinem Aminohexyl-verlängertem Marker (8) unter der Verwendung der TFP-Methodologie erhalten. Der TFP-Ester wurde durch die Reaktion des Lithiumsalz von Marker 166 (9) mit Überschuß-TFP-TFA und Hunigs Base in DMF präpariert. Nach einer Aufarbeitung wurde ein Dichlormethanlösung-TFP-Ester mit 6-Aminohexanol behandelt. Ein Präzipitat von (8) wurde sofort gebildet und wurde durch Filtration isoliert.
Herstellung von Marker-Phosphoramiditen
Die Reaktion des Aminohexyl-verlängerten Markers (5) mit Chlorphosphoramidit ergab das gewünschte Phosphoramidit (17), wobei durch Massenspektrometeranalyse kein Phosphonat nachgewiesen wurde.
Überschüssiges phosphotylierendes Mittel wurde mit deuteriertem Methanol abgelöscht (H3-Methanol wird normalerweise verwendet, jedoch erlaubt die Verwendung von deuteriertem Methanol in diesem Fall die eindeutige Identifizierung des Ursprungs der Löschprodukte), was (18) hervorrief. Dieses Material überlebte die anschließende wäßrige Aufarbeitung und ist selber ein Phosphoramidit, das das Potential aufweist, in den anschließenden Reaktionen zu interferieren.
Reaktion von Phosphoramidit mit Polymer-getragenem Thymidin
Das Thymidin wird an kontrollierte-Poren Glasperlen gekoppelt, die innerhalb einer Plastikkartusche enthalten sind. Die verwendeten Kartuschen enthalten 1000 nM (1 × 10^–6 Mol) von getragenem Thymidin. Das 5'-Hydroxyl der Base wird als der Dimethoxytritylether geschützt, was mit 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan vor der Reaktion mit Phosphoramidit (27) entfernt wird. Nach der Reaktion mit dem Phosphoramidit wird der Zwischenprodukt-Phosphidtriester (19) zu dem stabilieren Phosphotriester (20) oxidiert. Anschließendes Entfernen der Cyanoethyl-Schutzgruppe und Abspaltung von dem festen Träger wird mit Ammonium durchgeführt, um das markierte Thymidin (21) zu ergeben.
Das Rohmaterial aus der Phosphoramididherstelltung wurde in dieser Sequenz verwendet und das von dem Träger abgespaltene Material durch Massenspektrometrie analysiert. Die hauptsächlichen beobachteten Ionen im positiven Modus, zusammen mit den Zuordnungen sind in Tabelle 8 gezeigt.
TABELLE 8
Es scheint, daß unter den verwendeten Bedingungen die Phosphat-Esterbrücke zur Fragmentierung neigt. Die Analyse im negativen Modus zeigte einen Peak bei 338 amu, was der Verbindung (22) entspricht, dies stammt aus der Reaktion des Ablöschprodukts (18) (28) die eine hauptsächliche Kontaminante des ungereinigten Produktes ist.
Der Marker-Phosphoramidit (17) konnte von der nicht-polaren Kontaminante (18) durch Silica-Gelchromatographie (10% Methanol/89% Dichlormethan/1% Triethylamin) abgetrennt werden und 115 mg von (17) wurden erhalten. Dieses Material wurde in dem Reaktionszyklus verwendet, um (21) zu ergeben, das als sein Spaltprodukt (5) in der Massenspektrometrie (die HPLC-Analyse des Rohprodukts zeigte, daß (5) nicht vorhanden war, daher muß der Peak bei 711 amu in der Massenspektrometrie durch die Spaltung des gewünschten Produkts (21) in dem Instrument entstanden sein) nachgewiesen wurde. Auch vorhanden war nicht-reagiertes Thymidin, was anzeigte, daß die Reaktion nicht bis zur Vervollständigung fortgeschritten war. Das Material wurde auch durch das UV-Spaltungsflußsystem hindurch passiert und das Photospaltungsprodukt (23) durch Massenspektrometrie nachgewiesen.
Daher ist es möglich, ein Massenspektrometrie-Marker-Phosphoramidit herzustellen und zu reinigen und es mit einem Polymer-gebundenem Substrat reagieren zu lassen, das anschließen oxidiert, entschützt und von dem Träger abgespalten werden kann, um eine markierte Basis zu ergeben.

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Aus dem Voranstehenden wird es ersichtlich sein, daß, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hier zum Zweck der Verdeutlichung beschrieben wurden, verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne sich von dem Geist und Bereich der Erfindung zu entfernen.

Claims

Verbindung der Formel:
worin T^ms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, umfassend Kohlenstoff, mindestens eines von Wasserstoff und Fluor, und gegebenenfalls Atome, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Jod; L ist eine organische Gruppe, die es einer einmaligen T^ms-enthaltenden Gruppe ermöglicht, von dem Rest der Verbindung abgespalten zu werden, wobei die T^ms-enthaltende Gruppe eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterzogen wird, und die tertiäres Amin, quaternäres Amin oder organische Säure ist; X ist eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Phosphoramidit und H-Phosphonat.
Verbindung nach Anspruch 1, worin X eine Phosphoramiditgruppe ist, so daß T^ms-L-X die Struktur
aufweist, worin R eine Alkylgruppe oder eine substituierte Alkylgruppe ist, die eine oder mehrere Substituenten ausgewählt aus Halogen und Cyano aufweist, und die zwei R-Gruppen von NR₂ können miteinander verbunden sein, um eine Cycloalkylgruppe zu bilden.
Verbindung nach Anspruch 2, worin X eine Phosphoramiditgruppe ist, so daß T^ms-L-X die Struktur
aufweist und OR ist OCR₂CH₂CN, während NR₂ N(iso-propyl)₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin X eine H-Phosphonatgruppe aufweist, so daß T^ms-L-X die Struktur
aufweist, worin R eine C_1-6-Alkylgruppe ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin T^ms eine Masse von 15 bis 10.000 Dalton und eine molekulare Formel von C_1-5000-100O_0-100S_0-10P_0-10H_αF_βI_δ aufweist, worin die Summe von α, β und δ ausreichend ist, die sonst nicht gesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome zu sättigen.
Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin T^ms und L miteinander über eine funktionelle Gruppe ausgewählt aus Amid, Ester, Ether, Amin, Sulfid, Thioester, Disulfid, Thioether, Harnstoff, Thioharnstoff, Carbamat, Thiocarbamat, Schiffsche-Base, reduzierte Schiffsche-Base, Imin, Oxim, Hydrazon, Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Sulfonat, Sulfonamid oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung verbunden sind.
Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin L ausgewählt ist aus L^hν, L^Säure L^Base, L[O], L[R], L^enz, L^elc, L^Δ und L^SS, wobei jeweils aktinische Strahlung, Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Enzym, elektrochemische, thermale und Thiol-Austausch dazu führen, daß die T^ms-enthaltende Gruppe von dem Rest des Moleküls abgespalten wird.
Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin L^hν die Formel L¹-L^Z-L³ aufweist, worin L² ein molekulares Fragment ist, daß aktinische Strahlung absorbiert, um die Abspaltung von T^ms von X zu unterstützen, und L¹ und L³ unabhängig voneinander eine direkte Bindung oder eine organische Gruppe sind, wobei L¹ L² von T^ms abtrennt und L³ L² von X abtrennt und weder L¹ noch L³ einer Bindungsspaltung unterzogen werden, wenn L² die actinische Strahlung absorbiert.
Verbindung nach Anspruch 8, worin -L²-L³ die Formel:
aufweist, wobei ein Kohlenstoffatom an Positionen a, b, c, d oder e mit -L³-X substituiert ist und gegebenenfalls eine oder mehrere der Positionen b, c, d oder e mit Alkyl, Alkoxy, Fluor, Chlor, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert ist; und R¹ Wasserstoff oder Hydrocarbyl ist.
Verbindung nach Anspruch 8, worin L³ ausgewählt ist aus einer direkten Bindung, einem Hydrocarbylen, -O-Hydrocarbylen und Hydrocarbylen-(-O-hydrocarbylen)_n-H und n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin -L-X die Formel:
aufweist, worin eine oder mehrere der Positionen b, c, d oder e durch Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Fluor, Chlor, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert ist; R¹ ist Wasserstoff oder Hydrocarbyl, und R² endet in einer "X"-Gruppe.
Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin T^ms die Formel: T²-(J-T³)_n aufweist, T² eine organische Gruppe ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluor, Jod, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet ist, die eine Masse von 15 bis 500 Dalton aufweist; T³ eine organische Gruppe ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluor, Jod, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet ist, und die eine Masse von 50 bis 1.000 Dalton aufweist; J ist eine direkte Verbindung oder eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Amid, Ester, Amin, Sulfid, Ether, Thioester, Disulfid, Thioether, Harnstoff, Thioharnstoff, Carbamat, Thiocarbamat, Schiffsche-Base, reduzierte Schiffsche-Base, Imin, Oxim, Hydrazon, Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Sulfonat, Sulfonamid oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung; und n ist eine ganze Zahl von 1 bis 50, und wenn n größer als 1 ist, ist jedes von T³ und J unabhängig voneinander ausgewählt.
Verbindung nach Anspruch 12, worin T² ausgewählt ist aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-amid-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen, Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen, Heterocyclylhydrocarbyl, worin das/die Heteroatom(e) ausgewählt ist/sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, substitutiertes Heterocyclylhydrocarbyl, worin das/die Heteroatom(e) ausgewählt ist/sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor und die Substituenten ausgewählt sind aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen und Hydrocarbyla cyl-hydrocarbylen, sowie Derivative von jedem der Voranstehenden, wobei einer oder mehrere Waerstoffe durch eine gleiche Zahl von Fluor ersetzt ist.
Verbindung nach Anspruch 12, worin T³ die Formel -G(R²)- aufweist, G ist C_1-6 Alkylen mit einem einzelnen R² Substituenten, und R² ist ausgewählt aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl-fusioniertes-Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Arylsubstitutiertes Alkenyl oder Alkinyl, Cycloalkyl-substitutiertes Alkyl, Cycloalkenylsubstituiertes Cycloalkyl, Biaryl, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Aralkoxy, Arylsubstituiertes Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryl-substituiertes Alkylamino, Aryl-substituiertes Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryloxy, Arylamino, N-Alkylharnstoff-substituiertes Alkyl, N-arylharnstoff-substituiertes Alkyl, Alkylcarbonylamino-substituiertes Alkyl, Aminocarbonyl-substituiertes Alkyl, Heterocyclyl, Heterocyclyl-substituiertes Alkyl, Heterocyclyl-substituiertes Amino, Carboxyalkyl substituiertes Aralkyl, Oxocarbocyclylfusioniertes Aryl und Heterocyclylalkyl; Cycloalkenyl, Aryl-substituiertes Alkyl und Aralkyl, Hydroxy-substituiertes Alkyl, Alkoxy-substituiertes Alkyl, Aralkoxysubstituiertes Alkyl, Alkoxy-substituiertes Alkyl, Aralkoxy-substituiertes Alkyl, Amino-substituiertes Alkyl, (Aryl-substituiertes Alkyloxycarbonylamino)-substituiertes Alkyl, Thiol-substituiertes Alkyl, Alkylsulfonyl-substituiertes Alkyl, (Hydroxy-substituiertes Alkylthio)-substituieres Alkyl, Thioalkoxy-substituiertes Alkyl, Hydrocarbylacylamino-substituiertes Alkyl, Heterocyclylacylamino-substituiertes Alkyl, Hydrocarbyl-substituiertes-Heterocyclylacylamino-substituiertes Alkyl, Alkylsulfonylamino-substituiertes Alkyl, Arylsulfonylamino-substituiertes Alkyl, Morpholino-alkyl, Thiomorpholino-alkyl, Morpholinocarbonyl-substituiertes Alkyl, Thiomorpholinocarbonyl-substituiertes Alkyl, [N-(Alkyl, Alkenyl or Alkinyl)- oder N,N-[Dialkyl, Dialkenyl, Dialkinyl oder (Alkyl, Alkenyl)-amino]carbonyl-substituiertes Alkyl, Heterocyclylaminocarbonyl, Heterocylylalkylenaminocarbonyl, Heterocyclylaminocarbonyl-substituiertes Alkyl, Heterocylylalkylenaminocarbonyl-substituiertes Alkyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbonyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbonyl-substituiertes Alkyl, Alkyl-substituiertes Heterocyclylcarbonyl, Alkyl-substituiertes Heterocyclylcarbonyl-alkyl, Carboxyl-substituiertes Alkyl, Dialkylamino-substituiertes Acylaminoalkyl und Aminosäure-Seitenketten, ausgewählt aus Arginin, Asparagin, Glutamin, S-Methylcystein, Methionin und entsprechenden Sulfoxid- und Sulfonderivaten davon, Glycin, Leucin, Isoleucin, Allo- Isoleucin, Tert-Leucin, Norleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Prolin, Alanin, Ornithin, Histidin, Glutamin, Valin, Threonin, Serin, Asparaginsäure, beta-Cyanoalanin, und Allo-Threonin; Alinyl- und Heterocyclylcarbonyl, Aminocarbonyl, Amido, Mono- oder Dialkylaminocarbonyl, Mono- oder Diarylaminocarbonyl, Alkylarylaminocarbonyl, Diarylaminocarbonyl, Mono- oder Diacylaminocarbonyl, aromatischem oder aliphatischem Acyl, Alkyl, gegebenenfalls substituiert durch Substituenten, ausgewählt aus Amino, Carboxy, Hydroxy, Mercapto, Mono- oder Dialkylamino, Mono- oder Diarylamino, Alkylarylamino, Diarylamino, Mono- oder Diacylamino, Alkoxy, Alkenoxy, Aryloxy, Thioalkoxy, Thioalkenoxy, Thioalkinoxy, Thioaryloxy und Heterocyclyl.
Verbindung nach Anspruch 12, die die folgende Formel:
aufweist, worin G (CH₂)_1-6 ist, worin ein Wasserstoff an einer und nur einer der CH₂-Gruppen durch -(CH₂)_c-Amid-T⁴ ersetzt ist; T² und T⁴ organische Gruppen der Formel C_1-25N_0-9O_0-9H_αF_β sind, worin die Summe von α und β ausreichend ist, die sonst ungesättigten Valenzen von C-, N- und O-Atomen zu sättigen;
R¹ ist Wasserstoff oder C_1-10 Alkyl; c ist eine ganze Zahl im Bereich von 0–4; X ist gemäß Anspruch 1 definiert; und n ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 50, so daß, wenn n größer als 1 ist, G, c, Amid, R¹ und T⁴ unabhängig voneinander ausgewählt sind.
Verbindung nach Anspruch 15, die die Formel
aufweist, worin T⁵ eine organische Gruppe der Formel C_1-25N_0-9O_0-9H_αF_β ist, worin die Summe von α und β ausreichend ist, die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome zu sättigen und T⁵ ein tertiäres oder quaternäres Amin oder eine organische Säure einschließt; und m eine ganze Zahl im Bereich von 0–49 ist.
Verbindung nach Anspruch 15, die die Formel
aufweist, worin T⁵ eine organische Gruppe der Formel C_1-25N_0-94_0-9H_αF_β ist, worin die Summe von α und β ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome zu sättigen; und T⁵ ein tertiäres oder quaternäres Amin oder eine organische Säure einschließt; und m eine ganze Zahl im Bereich von 0–49 ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 und 17, worin -Amid-T⁵ ausgewählt ist aus:,
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 und 17, worin -Amid-T⁵ ausgewählt ist aus:
Verbindung nach einem der Ansprüche 14–16, worin T² die Struktur aufweist, die sich ergibt, wenn eine der folgenden organischen Säuren mit einer Amin-Gruppe kondensiert wird, um T²-C(=O)-NCR¹)- zu bilden: Ameisensäure, Essigsäure, Propiolinsäure, Propionsäure, Fluoressigsäure, 2-Butinonsäure, Cyclopropancarboxylsäure, Buttersäure, Methoxyessigsäure, Difluoressigsäure, 4-Pentinonsäure, Cyclobutancarboxylsäure, 3,3-Dimethylacrylsäure, Valerinsäure, N,N-Dimethylglycin, N-Formyl-Gly-OH, Ethoxyessigsäure, (Methylthio)essigsäure, Pyrrol-2-carboxylsäure, 3-Furoesäure, Isoxazol-5-carboxylsäure, trans-3-Hexenonsäure, Trifluoressigsäure, Hexanonsäure, Ac-Gly-OH, 2-Hydroxy-2-methylbuttersäure, Benzoesäure, Nicotinsäure, 2- Pyrazincarboxylsäure, 1-Methyl-2-pyrrolcarboxylsäure, 2-Cyclopenten-1-essigsäure, Cyclopentylessigsäure, (S)-(–)-2-Pyrrolidon-5-carboxylsäure, N-Methyl-L-prolin, Heptanonsäwe, Ac-b-Ala-OH, 2-Ethyl-2-hydroxybuttersäure, 2-(2-Methoxyethoxy)essigsäure, p-Toluonsäure, 6-Methylnicotinsäure, 5-Methyl-2-pyrazincarboxylsäure, 2,5-Dimethylpynol-3-carboxylsäure, 4-Fluorbenzoesäure, 3,5-Dimethylisoxazol-4-carboxylsäure, 3-Cyclopentylpropionsäure, Octanonsäure, N,N-Dimethylbernsteinsäure, Phenylpropiolinsäure, Zimtsäure, 4-Ethylbenzoesäure, p-Anisinsäure, 1,2,5-Trimethylpynol-3-carboxylsäure, 3-Fluor-4-methylbenzoesäure, Ac-DL-Propargylglycin, 3-(Trifluormethyl)buttersäure, 1-Piperidinpropionsäure, N-Acetylprolin, 3,5-Difluorbenzoesäure, Ac-L-Val-OH, Indol-2-carboxylsäure, 2-Benzofurancarboxylsäure, Benzotriazol-5-carboxylsäure, 4-n-Propylbenzoesäure, 3-Dimethylaminobenzoesäure, 4-Ethoxybenzoesäure, 4-(Methylthio)benzoesäure, N-(2-Furoyl)glycin, 2-(Methylthio)nicotinsäure, 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure, Tfa-Gly-OH, 2-Napthoinsäure, Chinaldinsäure, Ac-L-Ile-OH, 3-Methylinden-2-carboxylsäure, 2-Chinoxalincarboxylsäure, 1-Methylindol-2-carboxylsäure, 2,3,6-Trifluorbenzoesäure, N-Formyl-L-Met-OH, 2-[2-(2-Methoxyethoxy)ethoxy]essigsäure, 4-n-Butylbenzoesäure, N-Benzoylglycin, 5-Fluorindol-2-carboxylsäure, 4-n-Propoxybenzoesäure, 4-Acetyl-3,5-dimethyl-2-pyrrolcarboxylsäure, 3,5-Dimethoxybenzoesäure, 2,6-Dimethoxynicotinsäure, Cyclohexanpentanonsäure, 2-Naphthylessigsäure, 4-(1H-Pyrrol-1-yl)benzoesäure, Indol-3-propionsäure, m-Trifluormethylbenzoesäure, 5-Methoxyindol-2-carboxylsäure, 4-Pentylbenzoesäure, Bz-b-Ala-OH, 4-Diethylaminobenzoesäure, 4-n-Butoxybenzoesäure, 3-Methyl-5-CF3-isoxazol-4-carboxylsäure, (3,4-Dimethoxyphenyl)essigsäure, 4-Biphenylcarboxylsäure, Pivaloyl-Pro-OH, Octanoyl-Gly-OH, (2-Naphthoxy)essigsäure, Indol-3-buttersäure, 4-(Trifluormethyl)phenylessigsäure, 5-Methoxyindol-3-essigsäure, 4-Trifluormethoxy)benzoesäure, Ac-L-Phe-OH, 4-Pentyloxybenzoesäure, Z-Gly-OH, 4-Carboxy-N-(fur-2-ylmethyl)pynolidin-2-on, 3,4-Diethoxybenzoesäure, 2,4-Dimethyl-5-CO₂Et-pyrrol-3-carboxylsäure, N-(2-Fluorphenyl)bernsteinsäure, 3,4,5-Trimethoxybenzoesäure, N-Phenylanthranilinsäure, 3-Phenoxybenzoesäure, Nonanoyl-Gly-OH, 2-Phenoxypyridin-3-carboxylsäure, 2,5-Dimethyl-1-phenylpynol-3-carboxylsäure, trans-4-(Trifluormethyl)zinnsäure, (5-Methyl-2-phenyloxazol-4-yl)essigsäure, 4-(2-Cyclohexenyloxy)benzoesäure, 5-Methoxy-2-methylindol-3-essigsäure, trans-4-Cotinincarboxylsäure, Bz-5-Aminovalerinsäure, 4- Hexyloxybenzoesäure, N-(3-Methoxyphenyl)bernsteinsäure, Z-Sar-OH, 4-(3,4-Dimethoxyphenyl)buttersäure, Ac-o-Fluor-DL-Phe-OH, N-(4-Fluorphenyl)glutarminsäure, 4'-Ethyl-4-biphenylcarboxylsäure, 1,2,3,4-Tetcahydroacridincarboxylsäure, 3-Phenoxyphenylessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)bernsteinsäure, N-Decanoyl-Gly-OH, (+)-6-Methoxy-a-methyl-2-naphthalinessigsäure, 3-(Trifluormethoxy)zinnaminsäure, N-Formyl-DL-Trp-OH, (R)-(+)-a-Methoxy-a-(trifluormethyl)phenylessigsäure, Bz-DL-Leu-OH, 4-(Trifluormethoxy)phenoxyessigsäure, 4-Heptyloxybenzoesäure, 2,3,4-Trimethoxyzinnaminsäure, 2,6-Dimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionsäure, 2,3,4,5,6-Pentafluorphenoxyessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)glutarminsäure, N-Undecanoyl-Gly-OH, 2-(4-Fluorbenzoyl)benzoesäure, 5-Trifluormethoxyindol-2-carboxylsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)diglycolaminsäure, Ac-L-Trp-OH, Tfa-L-Phenylglycin-OH, 3-Jodbenzoesäure, 3-(4-n-Pentylbenzoyl)propionsäure, 2-Phenyl-4-chinolincarboxylsäure, 4-Octyloxybenzoesäure, Bz-L-Met-OH, 3,4,5-Triethoxybenzoesäure, N-Lauroyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)benzoesäure, Ac-5-Methyl-DL-Tip-OH, 2-Jodphenylessigsäure, 3-Jod-4-methylbenzoesäure, 3-(4-n-Hexylbenzoyl)propionsäure, N-Hexanoyl-L-Phe-OH, 4-Nonyloxybenzoesäure, 4'-(Trifluormethyl)-2-biphenylcarboxylsäure, Bz-L-Phe-OH, N-Tridecanoyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)phenylessigsäure, 3-(4-n-Heptylbenzoyl)propionsäure, N-Hepytanoyl-L-Phe-OH, 4-Decyloxybenzoesäure, N-(α,α,α-Trifluor-m-tolyl)anthranilinsäure, Nifluminsäure, 4-(2-Hydroxyhexafluorisopropyl)benzoesäure, N-Myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-Octylbenzoyl)propionsäure, N-Octanoyl-L-Phe-OH, 4-Undecyloxybenzoesäure, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionyl-Gly-OH, 8-Jodnaphthoinsäure, N-Pentadecanoyl-Gly-OH, 4-Dodecyloxybenzoesäure, N-Palmitoyl-Gly-OH und N-Stearoyl-Gly-OH.
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Single Nukleotide Polymorphismus in einem Nukleinsäureziel, umfassend: a) Amplifizieren einer Sequenz eines Nukleinsäureziels, das einen Single Nukleotide Polymorphismus enthält; b) Erzeugen einer Einzelstrangform des Ziels; c) Kombinieren einer markierten Nukleinsäuresonde mit den amplifizierten Zielnukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Hybridisierung der markierten Nukleinsäuresonde an komplementäre amplifizierte ausgewählte Zielnukleinsäuremoleküle zu ermöglichen, wobei die Markierung mit einem bestimmten Single Nukleotide Polymorphismus korrelierbar ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist; d) Abtrennen von nicht hybridisierter markierter Probe von hybridisierter markierter Probe durch eine Größenbestimmungs-Methodologie; e) Abspalten des Markers von der Sonde; und f) Nachweisen des Markers durch Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Anwesenheit des Single Nukleotide Polymorphismus, wobei die markierte Nukleinsäuresonde die Struktur T^ms-L-X' aufweist, worin T^ms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, umfassend Kohlenstoff, mindestens eines von Wasserstoff und Fluor, und gegebenenfalls Atome ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Jod; L ist eine organische Gruppe, die es einer einmaligen T^ms-enthaltenden Gruppe ermöglicht, von dem Rest der Verbindung abgespalten zu werden, wobei die T^ms-enthaltende Gruppe eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterzogen wird, und die tertiäres Amin, quaternäres Amin oder organische Säure ist; und X' ist Nukleinsäure.
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Single Nukleotide Polymorphismus in einem Nukleinsäureziel, umfassend: a) Amplifizieren einer Sequenz eines Nukleinsäureziels, das einen Single Nukleotide Polymorphismus enthält; b) Kombinieren eines markierten Nukleinsäureprimers mit den amplifizierten Zielnukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um ein Annealing des markiereen Nukleinsäureprimers an komplementäre amplifizierte ausgewählte Zielnukleinsäuremoleküle zu ermöglichen, wobei der Oligonukleotidprimer eine zu der Wildtyp-Sequenz oder dem Single Nukleotide Polymorphismas komplementäre äußerst 3'-liegende Base aufweist, wobei der Marker mit einem bestimmten Single Nukleotide Polymorphismus konelierbar ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist; c) Verlängern des Primers, wobei ein zu dem Ziel komplementärer Strang synthetisiert wird, wenn die am weitesten 3'-liegende Base des Primers mit dem Ziel komplementär ist; d) Abtrennen von nicht verlängertem markierten Primer von verlängertem markierten Primer durch eine Größenbestimmungs-Methodologie; e) Abspalten des Markers von den Primern oder verlängerten Primern; und f) Nachweisen des Markers durch Spektrometrie oder Potentiometrie, und Bestimmen daraus der Anwesenheit des Single Nukleotide Polymorphismus, wobei der markierte Nukleinsäureprimer die Struktur T^ms-L-X aufweist, worin T^ms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, umfassend Kohlenstoff, mindestens eines von Wasserstoff und Fluorid, und gegebenenfalls Atome ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Jod; L ist eine organische Gruppe, die es einer einmaligen T^ms-enthaltenden Gruppe ermöglicht, von dem Rest der Verbindung abgespalten zu werden, wobei die T^ms-enthaltende Gruppe eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterzogen wird, und die tertiäres Amin, quaternäres Amin oder organische Säure ist; und X' ist Nukleinsäure.
Verfahren zur Bestimmung der Menge eines spezifischen mRNA-Moleküls in einer Nukleinsäurepopulation, umfassend: a) Überführen einer RNA-Population in eine cDNA-Population; b) Hinzufügen einer einzelsträngigen Nukleinsäure (interner Standard), die eine Vielzahl von Single Nukleotide Polymorphismen enthält, die ansonsten Identisch zu dem cDNA-Ziel ist; c) Amplifizieren einer spezifischen Sequenz des cDNA-Ziels; d) Coamplifizieren des internen Standards, wobei der interne Standard dieselbe Länge aufweist, wie das cDNA-Amplicon; e) Erzeugen einer einzelsträngigen Form des Ziels; f) Kombinieren eines Sets von markierten Nukleinsäuresonden mit der amplifizierten Ziel-cDNA und dem amplifizierten internen Standard unter Bedingungen für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Hybridisierung der markierten Nukleinsäuresonde an komplementäre ausgewählte Ziel-cDNA und interne Standardsequenzen zu erlauben, wobei der Marker mit einer bestimmten cDNA-Sequenz korrelierbar ist und ein zweiter Marker ist mit dem internen Standard korrelierbar, und ist durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar; g) Abtrennen von nicht hybridisierter markierter Sonde von hybridisierter markierter Sonde durch eine Größenbestimmungs-Methodologie; h) Abspalten des Markers von den Sonden; i) Nachweisen der Marker durch Spektrometrie oder Potentiometrie; und j) Nehmen des Verhältnisses von Marker, der zu cDNA koneliert ist, gegenüber Marker, der mit dem internen Standard koneliert ist und daraus bestimmen der Menge der cDNA, wodurch die Menge der spezifischen mRNA in einer Nukleinsäurepopulation bestimmt wird, wobei die markierte Nukleinsäuresonde die Struktur T^ms-L-X' aufweist, worin T^ms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, umfassend Kohlenstoff, mindestens eines von Wasserstoff und Fluor, und gegebenenfalls Atome ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Jod; L ist eine organische Gruppe, die es einer einmaligen T^ms-enthaltenden Gruppe ermöglicht, von dem Rest der Verbindung abgespalten zu werden, wobei die T^ms-enthaltende Gruppe eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterzogen wird, und die tertiäres Amin, quaternäres Amin oder organische. Säure ist; und X' ist Nukleinsäure.
Verfahren zur Bestimmung der Menge eines Single Nukleotide Polymorphismus in einem Nukleinsäureziel, umfassend: a) Amplifizieren einer Sequenz eines Nukleinsäureziels, das einen Single Nukleotide Polymorphismus aufweist; b) Erzeugen einer einzelsträngigen Form des Ziels; c) Kombinieren einer markierten Nukleinsäuresonde mit den amplifizierten Zielnukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Hybridisierung der markierten Nukleinsäuresonde an komplementäre amplifizierte ausgewählte Zielnukleinsäuremoleküle zu ermöglichen, wobei der Marker mit einem bestimmten Single Nukleotide Polymorphismus korrelierbar ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist; d) Abtrennen von nicht hybridisierter markierter Sonde von markierter hybridisierter Sonde durch eine Größenbestimmungs-Methodologie; e) Abspalten des Markers von den Sonden; f) Nachweisen der Marker durch Spektrometrie oder Potentiometrie; und g) Nehmen des Verhältnisses von mit dem Wildtyp-Polymorphismus korrelierbaren Markers zu dem mit dem Mutantenpolymorphismus korrelierten Markers und daraus bestimmen der Menge des Polymorphismus, wobei die markierte Nukleinsäure die Struktur T^ms-L-X' aufweist, worin T^ms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, umfassend Kohlenstoff, mindestens eines von Wasserstoff und Fluor, und gegebenenfalls Atome ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Jod; L ist eine organische Gruppe, die es einer einmaligen T^ms-enthaltenden Gruppe ermöglicht, von dem Rest der Verbindung abgespalten zu werden, wobei die T^ms-enthaltende Gruppe eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterzogen wird, und die tertiäres Amin, quaternäres Amin oder organische Säure ist; und X' ist Nukleinsäure.