CZ218498A3 - Způsoby a kompozice pro stanovení sekvence molekul nukleových kyselin - Google Patents

Description

Způsoby a kompozice pro stanovení sekvence molekul nukleových kyselin

Oblast techniky

Vynález se týká obecně způsobů a kompozic pro stanovování sekvence molekul nukleových kyselin, přesněji řečeno způsobů a kompozic, jimiž lze stanovit současně násobné sekvence nukleových kyselin.

Dosavadní stav techniky

Sekvencování deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je jedním ze základních technických postupů biologie. Je to srdce molekulární biologie a hraje prudce se rozšiřující úlohu pro biologii vůbec. Tzv. Human Genome Project” je mnohonárodní snaha přečíst dokonale lidský genetický kod. Je to nejširší projekt dosud vůbec prováděný v biologii a začal již mít větší dopad na lékařství. Rozvinutí levnějších a rychlejších sekvenčích technologií by podporovala výsledek tohoto projektu. A skutečně bylo vynaloženo velké úsilí v odborech NIH a DOB, patřících do Human Genome Project” na zlepšení sekvenční technologie, ale stále dosud bez podstatnějšího dopadu na běžné praktiky, viz Sulston a Waterson, Nátuře 376 175 (1995).

V posledních dvou desetiletích bylo stanovování a analýza sekvence nukleových kyselin jedním ze základních bloků biologického výzkumu. To pak spolu s novými výzkumnými možnostmi a metodologiemi dovolovalo vědeckým pracovníkům studovat geny a produkty genů s úmyslem lépe porozumět funkci těchto genů, jakož i dospět k novým lékům a diagnostikám.—-- . .

Dva různé postupy sekvencování DNA byly popsány v r.1977 a používají se široce dodnes. V krátkosti: enzymový postup popsal Sanger, Proč.Nati.Acad.Sci.(USA) 74» 5463 (1977), využívá didesoxy-terminátory a zahrnuje syntézu provazce DNA z jednoprovazcových templátů DNA-polymeraeou. Sanger-ův způsob • ·

sekvencování je založen na zjištění, že didesoxynukleotidy (ddNTP) jsou vřazovány do rostoucího provazce stejným způsobem, jako normální desoxynukleotidy (i když s nižší účinností). Avšak ddNTP se liší od normálních deorynukleotidů (dNTP) tím, že postrádají 3 *-hydroxylovou skupinu, jež je nutná pro prodloužení řetězce· Je-li ddNTP vřazen do řetězce DNA, pak nepřítomnost hydroxylové skupiny v poloze 3* způsobí, že nemůže vzniknout nová fosfodiesterová vazby a DNA fragment se zakončí zařazením ddNTP, komplementárním k základu templátu DNA Postup dle Maxen-a a Gilbert-a, Proč·Natl.Acad·Sci. (USA) 74, 560 (1977) používá chemický degradační postup původní DNA (v obou případech musí být DNA klonální)· Oběma postupy se získá populace fragmentů se začátkem od určitého bodu a zakončením v každé bázi, jež se nalézá ve fragmentu DNA, který se má sekvencovat· Zakončení každého fragmentu je závislé na umístění odpovídající báze ve fragmentu původní DNA. Fragmenty DNA se oddělí pólyakrylamidovou gélovou elektroforesou a pořadí bází DNA (adenin, cytosin, thymin, guanin, známé rovněž pod označením A, C, T, G v tom kterém případě) se přečte z autoradiografu gélu.

Svízelná spojogací sekvenční strategie pro DNA, viz Church a Kieffer-Higgins, Science 24, 185 (1988) jest jedním z novějších přístupů k řešení sekvencování DNA. Spojovací sekvenční strategie se zakládá na spojení určitého počtu templátů (vzorků) DNA s tím, že se vzorky zpracovávají jako celek· S úmyslem oddělit informace o sekvenci na konci postupu se molekuly DNA, které jsou předmětem zájmu, vážou na sadu oligonukleotidových značených složek na počátku postupu. Značené molekula DNA se spojí, amplifikuji a chemicky fragmentu ji na desce s 96 žlábky. Po elektroforeze spojených vzorků se DNA přenese na pevný podklad a tamže se hybridizuje sekvenční sérií specificky značených oligonukleotidů. Tyto membrány se potom testují tolikrát, kolik bylo značených složek v původní směsi s tím, že vznikají a to v každé sadě testování, autoradiografy podobné oněm ze standertních postupů sekvencování DNA. Takže výsledkem každé reakce a gélu je množství údajů., které se rovnají oněm, získaným z běžných reakcí a gélů za násobení počtem použitých vzorků. Použije-li se alkalická fosfatasa jako enzymová podstata, 1,2-dioxetanový substrát se může použít a zjistí se chemiluminiscenčním postupem. Avšak zásadním nedostatkem spojovací strategie je to, že sekvence lze přečíst pouze pomocí Southern blotting) sekvenoováním gelu a hybridizováním takové membrány jednou pro každý klon spojených částí.

Navíc k získaným výhodám sekvenčních metod bylo dosaženo pokroku v důsledku automatizovaného sekvencování DNA. Tyto postupy využívají fluorescenčně značených primérů, čímž byly nahrazeny postupy využívající radioaktivně značené složky. Fluoreskující barviva se navazují buď na sekvenční priméry nebo na ddNTP-terminátory. Robotové uspořádání nyní využívá techniku polymerasové řetězové reakce (PCR), jež vedla k rozvinutí lineární amplifikační strategie. Běžně provozované sekvencování dovoluje provedení všech čtyř didesoxyterminátorových reakcí v jediném sledu. Každá z didesoxyterminátorových reakcí je reprezentována jednoznačným fluoreskujícím primérem (tedy jeden fluorofor pro každý typ zásady: A T, C, G). Pouze jeden templát DNA (např. vzorek DNA) je takto značen pro každý sled. Běžné gély dovolují současnou elektroforezu až do 64 vzorků v různých 64 sledech. Různě zakončená DDNTP fragmenty se zjistí ozářením gelových sledů světlem s následující detekoí emitovaného světla z fluoroforu. Každý elektrofořezní stupeň trvá asi 4 až 6 hodin. Každé elektroforetické dělení rozřeší problém asi 400 až 600 nukleotidů (nt), takže asi 6000 nt lze sekvenčně sledovat sekvenčním zařízením za hodinu.

Rovněž bylo popsáno použití hmotnostní spektrometrie pro sledování monomerních složek nukleových kyselin, viz Hignite, kapitola 16, atr.527 v Biochemical Applications of Mass SpectrometryV vydavatelé Waller a Dermer, Wiley Interscience (1972). V otázce větších oligomerů bylo dosaženo nyní podstatného úspěchu plasmovou desorpoí chráněných syntetických oligo4-

nukleotidů až do délky 14 bází, v případě nechráněných až do délky 4 bází. Jako tonu bylo v případě proteinů byla dokázána použitelnost ESI-hmotnostní spektrometrie na oligonukleotidy, viz Covey a spol·, Rapid Coma. in Mass Spec· 2, 249 (1988).

Tyto typy se ionizují v roztoku s tím, že náboj je na kyselém přemosíévacía fosfodiesteru a/nebo ne terminálních fosfátovýxh částech a v plynné fází tím dojde ke vzniku vícekráte nabitých molekulárních aniontů navíc k aduktům sodíku·

Sekvencování DNA s méně než počtem 100 bází použitím obvyklé enzymové ddNTP techniky je složitější, než jak je tomu v případě větších DNA-templátů, takže se někdy používá chemická degradace· Avšak chemické odbourávájící postupy vyžadují asi 90 pmol radioaktivních materiálu, značeného na konci .pomocí *P, 6 chemických stupňů, elektroforetické dělení a vyvolání filmu. V případě malých oligonukleotidů (pod 14 nt) je kombinace elektrosprejové ionizace (ESI) a Pourierovy transformní (PT) hmotnostní spektrometrie (MS) mnohem rychlejší a citlivější. Disociačnx produkty násobně nabitých iontů za měření vysoce (10^) štěpící silou představují následná štěpení základního uzpůsobení, čímž se dosáhne znění plné sekvence v době pod minutu za použití sub-picomol. množství vzorku, viz Little a spol., J.Amer.Chem.Soc. 116» 4893 (1994). Pro měření mol.hmotností bylo použití ESI/MS rogšířeno na větší fragmenty, viz Potier a spol·, Nucl.Acids Res. 22, 3895 (1994). Použití ESX/Ú?MS se jeví být cenným doplňkem klasických postupů sekvencování a místních mutací v nukleotidech délky až 100-merů. Spektrální údaje jsou nyní dosahovány použitím 3 x lO**^ mol 50-meru za využiti citlivéjaích ESI-zdrojů, viz Valaskovio, Anal.Chem.

68, 259 (1995). '

Dalším přístupem k sekvencování DNA použitím hmotnostní spektrometrie je to, že se DNA značí individuálními Izotopy jednoho prvku a hmotnostní spektrální analýza pak jednoduše má rozlišit izotopyté, oo směsi různých velikostí DUA byly rozděleny elektroforézou. (Další možností je využití rozlišovací schopnosti hmotnostního spektrometru dělit a také zjistit oligonukleotidy DNA různých dííek; v nejlepším případě je to • ··

nesnadný úkol)· Všechny výše popsané postupy využívají Sangerův postup převést sekvencovaný primér na sérii fragmentů DNA, jež se liší délkou jednoho nukleotidu· Enzymově syntetizované molekuly DNA obsahují vždy původní primér, opakovanou sekvenci části DNA, jež je předmětem zájmu a didesozytermlnátor· Znamená to, že vzniká sada molekul DNA, které obsahují primér a vzájemně se od sebe liší o jeden nukleotidový zbytek.

Brennen a spol·, viz Biol«Mass Spec·, New York, Elsevier, str.219 (1990) popsali způsoby použití 4 stabilních izotopů síry ke značení DNA, což dovoluje zjištění fragmentů DNA, které byly odděleny kapilární elektroforézou na všechny fragmenty DNA. Takže každý se 4 typů fragmentů DNA (ddTTP, ddATP, ddGTP a ddCTP-za končených) se může jednoznačným způsobem značit dle koncového nukleotidu; například S pro fragment se zakončením A, 33_{S pro} q, 34_{s pro c a} 36g _{pro T a} nanesením směsi na elektroforetickou kolonu se získají frakce několika málo picolitrů použitím modifikovaného vstřikovacího značícího zhlaví a ty sa pak dokonale spálí v pícce. Tímto postupem se oxidují thiofosfáty značené DNA za vzniku oxidu siřičitého a ten se pak analyzuje v quadrupolním nebo magnetieky-sektorovém hmotnostním spektrometru. Hmotnostní jednotka oxidu siřičitého je 64 pro fragmenty končící na A, 65 pro G, 66 pro G a 68 pro T. Udržování rozlišeni fragmentů DNA, jak vycházejí z kolony, je závisléna odbetu dostatečně malých frakcí· Protože hmotnostní spektrometr je spojen přímo s kapilární gélovou kolonou, je rychlost analýza dána rychlostí elektroforézy. Tento postup je na neštěstí nákladný, uvolňuje se radioaktivní plyn, takže nebyl dosud komerčně využit· Dva další návazné postupy využívá jí rovněž tento přístup k řešení problému: -- --=a) nelze připustit žádnou jinou složku, než s hmotnostním značením 64, 65, 66 nebo 68 (isobarní nečistoty), a

b) přírodní sestava izotopů síry v % ( ³²S » 95,0, . «

0,75, ³*S β 4,2 a ³^S = 0,11) ovlivňuje citlivost a cenu provedení Protože obsah přírodního izotopu ³²S 95% je převažující, je třeba obohacení dalšími izotopy nad 99%, aby se eliminovalo znečistování S. Izotopy dosažitelné v množství pod 1% jsou velmi nákladné, má-li se dosáhnout obohacení na 99% a i když se čistí stonásobně, obsahuje právě tolik nebo i více než

S.

Gilbert popsal automatizované zařízení pro sledování sekvencí DNA, viz EPA 921 086 78.2, sestavené ze zařízení pro syntézu oligomerů, seskupení na membráně a detektor, který zjistí hybridizování, dále pak centrální počítač. Syntetické zeřízení syntetizuje s značí více oligomerů náhodně předem stanovenou sekvencí. Oligomery se použijí k důkazu imobilizované DNA na membráně. Detektor zjistí hybridizacní vzor a ten přenese do centrálního počítače, který kontruuje sekvenci a předá tuto sekvenci další dávce syntetizovaných oligomerů. Ačkoliv je to postup, založený na opakování, dají se tím sekvence DNA získat automatizovaným postupem.

Brennen popsal způsob sekvencování nukleových kyselin, založený na vzájemné vazbě oligomerů, viz U.S.pat. 5 403 708. Tamže jsou popsány postupy a kompozice pro vznik produktů ligace, hybridizovaných na templát nukleové kyseliny. Primér se hybridizuje na templát DNA a potom se shluk nahodile protažených oligonukleotidů rovněž hybridizuje na vytvořený templát za přítomnosti ligasy či ligaa. Enzym ligasa váže kovalentně oligomery na primér. Modifikace dovolují stanovení sekvence nukleotidu jednoho či více členů prvá sady cílového nukleotidového zbytku v templátu nukleové kyseliny, který je prostorově uspořádán v intervalech N nukleotidů. Při tomto postupu se tvoří spojené značené produkty, kde poloha a typ vneseného značení do produktu ligace poskytuje informace, týkající se nukleotidového zbytku v templátu nukleové kyseliny, který je se značeným nukleotidovým zbytkem bazicky zdvojen.

Koster popsal, viz PCT/US94/02938 způsob sekvencování DNA hmotnostní spektrometrií po odbourání DNA exonukleasou. Popsaný postup je jednoduchý tím, že se sekvence DNA stanoví přímo, tedy bez použití Sanger-ovy reakce. DNA se klonuje do standartních vektoru, 5 *-koncovka se imo> ^a provazce se potom sekvenčně

degradují na 3 *- koncovce použitím exo nukleasy a produkt enzymové reakce (nukleotidy) se zjistí hmotnostní spektrometrií.

Weiss a spol·, viz PCT/US94/11918 popsali automatizované hybridizační a zobrazovací zařízení pro fluoreskující násobné sekvencování DNA. Způsob se zakládá na konceptu hybridizování enzymově spojených vzorků na membránu, obsahující velikostně oddělené fragmenty DNA, jak byly získány z typické Sanger-ovy reakce·

Požadavky na sekvenční informace jsou větší, než lze získat takové použitím běžně dostupných sekvenčních strojů, jako je ABI377 a Plarmacia ALP· Jedním ze zásadních omezení současné technologie je malý počet značených složek, které lze dělit použitím běžného systému značení. Shlukovácí systém Churoh, diskutovaný zde výše, využívá větší množství značených složek, ale použití a detekce těchto značených složek je náročná·

Podstata vynálezu

Tento vynález popisuje nové kompozice a způsoby, kterých lze využít na sekvence molekul nukleových kyselin se značně zvýšenou rychlostí a citlivostí ve srovnání s výše popsanými postupy s tím, že jsou s tím spojeny ještě další výhody.

V krátkosti jsou předmětem tohoto vynálezu způsoby, látky, kompozice, sestavy (kity) a systémy ke stanovení sekvence molekul nukleových kyselin. Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu se popisují způsoby zjištění sekvence mole ku-» ly nukieové kyseliny· Způsoby zahrnují tyto stupně:

a) _přípravu značenýbh fragmentů nukieové kyseliny, které jsou komplementární k vyvolenéi.vmolekule cílové nukieové kyseliny, kdeže značená složka je korelativní s příslušným nukleotidem a je zjistitelná nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometrieky,

b) dělení značených fragmentů dle sekvenční délky,

c) odštěpení značených složek ze značených fragmentů, a • · · • ·· — 8*·

d) zjištění značené složky nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky, a tak se stanoví sekvence molekuly nukleové kyseliny. Podle výhodného provedení se značené složky zjištují hmotnostní spektrometrií, infračervenou nebo ultrafialovou spektrometrií nebo potenciostatiokou ampérometrií.

Podle dalšího aspektu se tento vynález týká sloučenin vzorce

T^ms-L-X kde t“® znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, síra, fosfor a jod,

L znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T^m® odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdež© část, obsahující Τ®® zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny terč.-aminů, kvart.amoniových skupin s organických kyselin,

X znamená funkční skupinu, zvolenou z řady skupin: hydroxylová, aminoskupina, thiolová, karboxylová, halogenalkylová a jejich derivátů, které buď aktivují, nebo inhibují schopnost takových skupin vázat se na jiné částice, nebo znamená fragment nukleové kyseliny, vázaný na 1 v jakékoli jiné poloze, než je 3 '-koncovka fragmentu nukleové kyseliny, to za omezení, že sloučenina není vázána na pevný podklad prostřednictvím X aniž má hmotnost pod 250 daltonů·

Podle dalšího aspektu se vynález týká kompozic, obsahujících větší množství sloučenin vzorce T^-L-MOI, kde T⁵³¹⁸ znamená orgahickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru, případně další atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T^m® odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže T™ zahrnuje funkční skupinu, podporující jediný ionizovaný nábojový stav sloučeniny,

-9je-li sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny, kterou tvoří terč.-aminy, kvart.amoniové částice a organické kyseliny, MOI znamená fragment nukleové kyseliny, kde I» je v konjunkci s MOI v kterékoli jiné poloze, než je 3 *-koncovka MOI, a kdeže žádné dvé sloučeniny nemají totožnou skupinu T^ms nebo tutéž skupinu MOI,

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu se popisují kompozice, obsahující vodu a sloučeninu vzorce Τ®®-1-ΜΟΙ, kde T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně další atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, umožňující části, obsahující T®⁸ odštěpit se od zbývající části sloučeniny, kdeže T®⁸ obsahuje funkční skupinu, podporující jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektro metrií a je zvolena ze skupiny terč.-aminů, kvart.amoniových zbytků a organických kyselin, a MOI je fragment nukleové kyseliny, kde L je navázáno na MOI v jakékoli jiné poloze, než je 3 *-koncovka MOI,

Podle ještě dalšího aspektu se vynález týká kompozic, obsahujících větší počet sad sloučenin, kde každá sada sloučenin má vzorec T®®-L-MOI, kde T®⁸ znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru, a případně atomy ze skupiny kyslík dusík, síra, fosfor a jod, I» znamená organickou skupinu, umožňující části s obsahem T®⁸ odštěpit se od zbývající části sloučeniny, kdeře část s obsahem T®⁸ zahrnuje funkční skupinu, podporující jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny,— kterou tvoří tere.„aminy, kvartvarnoniové zbytky a organické kyseliny, MOI znamená fragment nukleové kyseliny, kde 1 je skupina navázaná na MOI v jakákoli jiné poloze, než je 3 *koncovka MOI s tím, že ve vlastní sadě mají všechny látky stejnou skupinu T®⁸ a fagmenty MOI mají variabilní délky, které jsou zakončeny týmž didesoxynukleotidem ze skupiny ddAMP, ddGMP, * · • · • ·

-10ddCMP a ddTMP s tím, že mezi jednotlivými sadami se skupiny Τ®⁸ Ιίδί nejméně o 2 amy.

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu se popisuje kompozice, obsahující větší počet sad sloučenin, jak byly popsány v předchozím odstavci a to v kombinaci a druhým větším počtem sad sloučenin sloučenin T^-L-MOI, kde T®⁸ znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně další atomy, jako je kyslík dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T¹³¹⁸ odštěpit vno se od zbytku sloučeniny, kdeže T zahrnuje část, podporující funkční skupinou jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a tato skupina je zvolena z terč.-aminů, kvert.amoniových bází a orgamických kyselin, MOI je fragment nukleové kyseliny s tím, že l je napojeno na MOI v jakékoli jiné poloze, než je 3 '-koncovka MOI, a kde všechny členy v druhém větším množství mají sekvence MOI terminované týmž didesoxynukleotidem ze skupiny ddAMP, ddGMP, ddCMP a ddTMP, to za omezení, že didesoxynukleotid, přítomný ve sloučeninách prvého většího množství není totožný s didesoxynukleotidem, přítomným ve sloučeninách druhého většího množství.

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu se popisuje sestava (kit) pro sekvenční analýzu PNA. Sestava zahrnuje větší počet zásobníčkových sad, přičemž každá sada zásobníčků zahrnuje nejméně 5 zásobníčků, kde prvý zásobníček obsahuje vektor, druhý, třetí, čtvrtý a pátý obsahují sloučeniny obecného vzorce T^-L-MOI, kde Τ¹⁰⁸ znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně další prvky, jako je kyslík dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, umožňující části, obsahující T^m8 odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže část, obsahující T zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena z terč.-aminů, kvart.amoniových skupin a organických kyše

-li• ····

lia a MOI znamená fragment nukleové kyseliny, kde skupina I> je navázána na MOI v jakékoli jiné poloze, než je 3 *-koncovka MOI a to tak, že MOI ve druhém, třeiím, čtvrtém a pátém zásobníčku jsou totožné a komplementární k části vektoru uvnitř vnj9 sady zásobníčků a skupina T uvnitř každého zásobnicku se ντιο lisí od ostatních skupin T sestavy (kitu).

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu je tím dán systém stanovování sekvence v molekule nukleové kyseliny· Systém zahrnuje dělící zařízení, kde se oddělují značené fragmenty nukleové kyseliny, další zařízení, jež odštěpuje z fragmentu značené nukleové kyseliny značenou složku, jež je korelatiní s příslušným nukleotidem a zjistitelná elektrochemickou detekcí, a dále zařízení pro potenciometrickou amperometrii·

Podle dalšího provedení tůhoto vynálezu se může použít 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200,

300, 350, 400, 450 nebo více než 500 různě i jednotně značených molekul v rámci uvedené reakce současně, jestliže každá značená složka je jednotná pro zvolený fragment nukleové kyseliny, nebo pro odpovídajícího prvého či druhého člena a lze je tak odděleně identifikovat.

Tyto a ještě další aspekty dle tohoto vynálezu budou jasně zřejmé s odkazem na falší podrobný popis a připojená vyobrazení. Dále pak jsou připojeny četné odkazy, kde se popisují podrobněji určité postupy či kompozice, například plasmidy atd, a jsou sem zahrnuty se zřetelem na úplnost. Krátký popis vyobrazení.

Vyobr.l je schéma synthesy pentafluorfenylesterů chemicky ——štěpitelných značených vzorků dle hmotnostní spektroskopie k uvolení značených vzorků s karboxamidovou koncovou skupinou.

Vyobr.2 je schéma synthesy pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných značených vzorků dle hmotnostní spektroskupie k uvolnění značených vzorků s koncovou karboxylovou skupinou.

Vyobr.3 až 6 i 8 popisuje schéma synthesy tetrafluorfenylesterů serie 36ti fotochemicky štěpitelných vzorků dle

-12hmotnostní spektroskopie.

Vyobr.7 popisuje schéma synthesy serie 36 fotochemický štěpitelných vzorků dle hmotnostní spektroskopie s koncovou aminoskupinou.

Vyobr,9 popisuje schéma synthesy 36 fotóchemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených oligonukleotidu, připravených z odpovídající serie 36 tetraf^luorfenylesterů fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených kyselin,

Vyobr.lO popisuje synthesu 36 fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených oligonukleotidů, připravených z odpovídající serie 36 fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených vzorků s koncovou aminoskupinou.

V-yobr.ll znázorňuje současnou detekci většího počtu značených vzorků hmotnostní spektrometrií.

Vyobr.l2 znázorňuje hmotnostní spektrogram samotné o6-kya n-ma tr ic e.

Vyobr.13 uvádí modulárně konstruovaný fragment značené nukleové kyseliny.

Podrobný popis vynálezu

Jak to zde již bylo výše uvedeno popisuje tento vynález kompozice a způsoby analyzování molekul nukleových kyselin, kde je žádoucí dělení molekul nukleových kyselin na základě jejich velikosti. Tento vynález umožňuje současnou ďěfěkči molekul, těšících se zájmu, což zahrnuje kyseliny nukleové a jejich fragmenty, proteiny, peptidy atd.

Pro usnadnění sledování souvislosti přihlášky s originálem jsou ponechána písmenná vyjádření, jež na štěstí nekolidují se značkami prvků, takže v dalším textu

znamená značenou složku (tag component) '· ·

I • · ·♦ » · ···

znamená vazebnou složku (linker coraponent), jíž je labilní vazba, nebo tato složka labilní vazbu obsahuje, a

je buď molekula vlastního zájmu (MOI, molecule of inte rest) nebo funkční skupinová složka (L^), pomocí které je MOI navázána na T-L.

Krátce řečeno, jedním předmětem tohoto vynálezu jsou sloučeniny, kde molekula vlastního zájmu, nebo výchozí látka pro ni je vázána labilní vatbou či labilními vazbami na značenou látku. Lze tedy nazírat na sloučeniny dle tohoto vynálezu jako na látky obecného vzorce

vyjádřitelné lépe specifičtějšími vzorci

Z důvodů, které budou ještě detailněji dále probrány, serie sloučenin T-L-MOI mohou být účelově vystaveny podmínkám, jež způsobí rozrušení labilní vazby nebo labilních vazeb, čímž se uvolní značená Část od zbytku molekuly. Značená část se potom charakterizuje jedním či více analytických postupů, čímž se dospěje přímo k informaci o struktuře značené části a (to je velice důležité) nepřímo k informaci o identitě odpovídající látky MOI.

Jako jednoduchý názorný příklad reprezentativní molekuly dle tohoto vynálezu, kde L znamená přímou vazbu, lze odkázat ©·

-14na následující strukturu (i)

značená složka molekula interesantní sloučeniny

V uvedené struktuře (i) znamená T polycyklickou aromatickou částici, obsahující dusík a vázanou na karbonylovou skupinu, a X znamená MOI (a přesněji řečeno fragment nukleové kyseliny se zakončením aminoskupinou), L pak znamená vazbu, tvořící amidovou skupinu. Amidová ^ckaztiB·· je labilní v porovnání sevazbami v části Τ , protože - jak to odborníci znají - lze amidovou skupinu chemicky čtěpit (rozrušit) v kyselém či alkalickém prostředí za podmínek, kdy zůstanou vazby ve složce T nedotčeny. Takže značená část (tj.produkt štěpehí, obsahujíe-í—Φ-)—s-e—může u-voT-nl-t—t-a-let-OH

fragment nukieové kyyeliny kyselina či báze

9.99'. φ 9 .Φ · · κ '99

9 9 · · · · φ · φ 9 • φ · φ 99 φ φ φφ

9 99 99 99 9·9Φ 9 • Φ , 9999 ΦΦΦ

ΦΦΦ 9999 99 99 99 91

značená část

Zbytek sloučeniny přímá vazba

Avšak vazebnou složkou L může být více než jedna , jak je to patrné z dalšího připojeného příkladu,

Je velmi dobře známo, že sloučeniny, obsahující o-nitrobenzylaminovou část (viz zarámovaná skupina atomů ve struktuře (ii) ) jsou fotolyticky nestálé a že je-li taková sloučenina vystavena účinkům aktinického záření specifikované vlnové délky, dojde k selektivnímu odštěpení benzylaminové vazby (viz silná vazba ve struktuře (ii). Takže struktura (ii) má tytéž skupiny či složky T a MOI, jako má struktura (i), ale vazebná skupina obsahuje větší počet atomů a vazeb, mezi nimiž je případná labilní vazba. Potolyzou struktury (ii) se uvolňuje značená část T (tedy část obsahující T) od zbývající části sloučeniny, jak je to zachyceno zde dále.

• · · · ·· · · ··

značená část zbytek sloučeniny

Jsou tedy dle tohoto vynálezu dostupné sloučeniny, které za podmínek vhodného štěpehí podlehnou tomuto štěpení za uvolnění značené části od zbytku molekuly. Sloučeniny dle tohoto vynálezu lze popisovat výrazy značená část, část MOI (nebo ospovídající výchozí složka L_h) a 1 abilní vazba či vazby, čímž jsou spojeny obě skupiny dohromady. Jinak lze sloučeniny dle tohoto vynálezu popisovat citováním složek, ze kterých vznikly. Takže sloučeniny je možno definovat jako reakční proďukt značené části, vazebné složky a reakční složky MOT.__ a variabilní složky (T ), takže reakční značená složka má vc

Značená složka z chemické složky (T^, Chemical handle) bilní i obecný vzorec

K objasnění tohoto názvosloví je třeba odkázat na strukturu (iii), jež znázorňuje reaktivní značenou složku, kterou lze využít při přípravě sloučenin struktury (ii). Reaktivní značená složka struktury (iii) obsahuje variabilní značený podíl a manipulační složku, viz dále:

• ·

(iii) variabilní značený manipulační složka podíl

Ve struktuře (iii) představuje manipulační složka -C(=O)-A východisko pro reakci značné složky s vazebnou složkou za vzniku částice T-L. Skupina A ve struktuře (iii) znamená,že karboxylová skupina je v chemicky aktivním stavu, takže je schopná reagovat s dalšími složkami. Skupinou ”Aů může být například skupina hydroxylová nebo pentafluorfenoxylová mezi četnými dalšími možnostmi. Vynález tedy zahrnuje velký počet značených složek, které lze vázat na variabilní značený podíl, /jak to ještě bude zde podrobněji popisováno. Variabilní značený podíl je tedy částí Tů ve vzorci T-L-X a bude tedy také částí značené složky, jež se vytvoří reakcí štěpením L.

Jak to zde bude ještě podrobněji popisováno, je variabilní značený podíl takto označován proto, že při přípravě členů určitého seskuúení je žádoucí, aby měly jednotnou variabilní složku, takže lze jednotlivé členy takového seskupení rozlišit vzájemně od sebe analytickými postupy. Jako jeden z_ přiLkladůJFze uvést, 'že“ variabilní značený podíl struktury (iii) může být jedním z členů dále uvedeného seskupení, kde lze členy tohoto seskupení rozlišit jejich ultrafialovými nebo hmotnostními spektry:

• ·

18·

Podobně lze vazebnou složku popisovat použitím pojmů odpovídajícího chemického se chování (obvykle jsou nutné· nejméně dvě, každá z nich může být označena jako L^), které jsou bočně na vazebné labilní složce, kde vazebná labilní složka sestává z nutné labilní složky (L ) a případně labilnich složek (n a Ir), kde případné labilní podíly slouží účinně 2 »od oddělení L od manipulačních složek a potřebná labilní •složka slouží jako labilní vazba uvnitř vazebné labilní složky. Takže vazebná složka může mít obecný vzorec

Zde používané názvosloví vazebné složky může být objasněno pohledem na strukturu vzorce (iv), jež je odvozena od struktury (ii):

Jak to plyne ze strultury (iv), mohou atomy zastávat více než jednu funkční úlohu. Takže ve struktuře (iv) dusíkatá funkce benzylové skupiny může sloužit jako manipulační složka, umožňující vazebné složce napojení na značenou složku reakční tvorbou amidu, a pak slouží jako nutná část struktury labilní vazebné složky L tím, že • ·.

• · · · ·· ···· · •-ΧΓ9- ·· ·· vazba dusíku na uhlík benzylové skupiny je zvláště vhodná k fotolytickému štěpení. Struktura (iv) také ukazuje, že vazebná složka může mít skupinu Ir ( v tomto případě methylenovou skupinu), ačkoliv neobsahuje skupinu ΐΛ. Podobně může mít vazebná složka skuninu L , nikoli však L, nebo může 1 3 v obsahovat skupiny L a L , nebo nemít žádnou z nich. Ve struktuře (iv) přítomnost.' skupiny *'P v blízkosti karbonylové skupiny naznačuje, že karbonylová skupina je před reakcí chráněna. Za této konfigurace může aktivovaná karboxylová skupina značené složky (iii) reagovat čistě s aminoskupinou vazebné složky (iv) za vzniku amidové vazby a tedy látky vzorce T_L-Lk°

Reakční složka MOI je vhodnou reaktivní formou předmětné molekuly. Je-li takovou molekulou fragment nukleové kyseliny, je vhodná reakční složka MOI fragmentem nukleové kyseliny, který je vázán 5 '-hydroxylovou skupinou na fosfodiesterovou skupinu a potom dále na alkylenový řetězec, končící aminoskupinou. Tato aminoskupina může potom reagovat s karbonylovou skupinou struktury (iv), pochopitelně po odstranění chránících funkcí karbonylové skupinj’ a s výhodou potom ještě aktivovat karbonylovou skupinu při reakci s aminoskupinou, takže se složka MOI naváže na vazebnou složku.

Vezme-li se v úvahu chronologické pořadí, pak z pohledu vynálezu se použije značená složka (obsahující značenou manipulační složku a značenou variabilní složku), vazebná složka -(-se—d-v-ě-ma—c-hemi-ckiý-mi—manipulačními složkami, potřebnou labilní částí a s nulcu až dvěma případně labilními částmi) a reakční složka MOI, obsahující molekulu předmětné zajímavé složky a chemickou molekulu manipulační složky) ke vzniku látky vzorce T_L-MOI. Takže při vzniku T-L-MOI buď reaguje značená složka nejprve s vazebnou složkou dohromady za vzniku T_L-L^, a potom s tímto seskupením reaguje MOI za vzniku T-L_MOI, nebo - a to je méně výhodné - reagují spolu nejprve vazebná složka a složka MOI za vzniku L^-L-MOI a další reakcí se značenou složkou se připraví T-L _MOI,

Pro pohodlí budouxzde sloučeniny vzorce T-L-MOI popisovány výrazem značená složka, vazebná složka a reagens MOI, kterých • · • · ·· · • ·

-20Ize použít pro přípravu takových látEkPochopitelně se může sloučenina či sloučeniny vzorce T~L_M0I připravovat jinými (obvykle pracnějšími) postupy a to vše spadá do rozsahu tohoto vynálezu.

V každém případě se vynálezem dají získat sloůčeiňny vzorce T-L-NOI, které lze štěpit tak, že se značená složka uvolní od zbytku sloučeniny. Vazebná složka pak bude obsahovat nejméně značenou variabilní složku a báde typicky dále obsahovat některé nebo všechny atomy ze značené manipulační složky, některé nebo všechny atomy z vazebné manipulační složky, jež byla použita k navázání značené reakční složky na vazebnou složku, případně 1 bilní složku ΐΛ, byla-li tato přítomná v T-L-MOI, a bude snad i obsahovat určitou část nutné labilní složky L v závislosti na přesné struktuře L a povaze chemického štěpení. Pro pohodlí značená složka se může označovat jako T-obsahující částice, protože T bude typicky představovat největší podíl (míněno hmotnostně) značené složky.

Po tomto výkladu jednoho aspektu dle tohoto vynálezu budou rlzné složky T, L a X popsány podrobněji. Tento popis začíná definováním určitých termínů, jak zde budou nadále použity při popisech T, L a X.

Jak je zde použit , výraz fragment nukleové kyše' * v liny znamená molekulu, jež je doplňkem k vyvolené molekule v

značené nukleové kyseliny (to znamená doplňkem docela nebo určité její Části) a může být odvozena od přírodních nebo synthetických či rekombinantně získaných molekul, čítaje v to i takové, které se mezi přírodními látkami nevyskytují a může být v dvojitě nebo jednoduše navazane formě, jak se to hodí; zahrnuje tedy oligonukleotid (tedy DRA či RNA), přiměř, vzorek, obdobu nukleové kyseliny(třeba PNA), oligonukleotid, který je protažen ve směru poloh 5 ' a 3 ' -polymerasou, nukleovou kyselinu, jež se štěpí chemicky nebo enzymově, nukleovou kyselinu, jež je zakončena didesoxyterminátorem nebo zastřešena na koncovkách 3'nebo 5' sloučeninou, jež předchází polymerování koncovky 5' nebo 3' - Q jejich kombinace,.

Doplnění fragmentu nukleové kyseliny na zvolenou cílovou značenou molekulu nukleové kyseliny znamená obvykle zvýšení • ·

•21mejméně o asi 70% specifického základu, čítaje v to zdvojení po délce fragmentu. S výhodou se fragment nukleové kyseliny vyznačuje nejméně o asi 80% specifického zdvojení základu, výhodněji nejméně asi 90%„ Testy pro zjištění procenta překřížení (nahodilého a tedy procenta specifického propojení základu) jsou dobře známé a jsou založeny na % překřížení ve funkci Tm, pokud je tím míněn kontrolní vzorek s dokonale prokříženým základem.

Jak je použit zde, výraz alkyl či alkylová skupina, buď co taková nebo v kombinaci, znamená nasycený, přímý nebo větvený uhlovodíkový řetězový zbytek, obsahující 1 až 10, s výhodou 1 až 6, nejvýhodněji 1 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady lze uvést, ale bezjakéhokoli omezování, skupiny methylovou, ethylo_ vou, n-propyÍovou, isopropylovou, n-butylovou, isobutylovou, sek-r-butylavou, terc.-butylovou, pentyÍovou, isoamylovou, hexylovou, decyÍovou a pod. Výraz alkylen či alkylenová skupina znamená nasycenou, přímou nebo větvenou uhlovodíkovou řetězovou skupinu charakteru diradikálu s obsahem 1 až 10, s výhodou až 6 a nejvýhodněji 1 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny methylenovou, ethylenovou, (-CH^.CHg-), propylenovou apod.

Výraz alkenyl či alkenylová skupina, samotný či v kombinaci, znamená uhlovodíkový řetězec přímý nebo větvený s nejméně jednou dvojnou vazbou mezi uhlíkovými atomy a to celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady takových zbytků opět bez jakéhokoli omezování lze jmenova t skupiny e the ny Íovou., _E^_a_Z^pr-O-pe-ny-lo-V-ou,—i-so-pro-pen-y-lo-v-o-uyE- a Z-Butenylovou, E- a Z-isobůtenylovou, E a Z-pentenylovou, decehylovou apod» Výraz alkenylen nebo alkenylenová skupina znamená přímou nebo větvenou uhlovodíkovou biradikálovou skupinu s nejméně jednou dvojnou vazbou .mezi atomy uhlíku, celkem se až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny methylidenovou (=01^), ethylidenovou (-CH=CH-) propylidenovou (-CH2-CH=CH)- apod.

Výrazalkinylová skupina, samotný či v kombinaci znamená přímou či větvenou uhlovodíkovou skupinu s nejméně jednou troj• · · ·· · · ···· · β β 'β β- — β β ··· · · ·· ·· ··

-22nou vazbou mezi uhlíkovými atomy celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady takových skupin, ale bez jakéhokoli omezování, lze uvést skupiny ethinylovou (acotylenylovou), propinylovou (propargylovou), butinylovou, hexinylovoUji decinylovou apod. Výrazem alkinylenová skupina” se míní, samotná či v kombinaci, přímá nebo větvená uhlovodíková dvojvazná skupina s nejméně jednou trojnou vazbou mezi uhlíkovými atomy celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až b a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny ethinylenovou (C-C-), propinylenovou (-CH^Css C-) a pod.

Výrazem cykloalkylová skupina, samotným či v kombinaci, se míní nasycené cyklické uspořádání uhlíkových atomů v počtu 3 až 8, a s výhodou 3 až 6. Jako příklady takových cykloalkylových skupin bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny cyklopropylovou, cyklobutylevou, cyklepentylovou, cyklohexylovou apod. Výraz cykloalkylenová skupina se týká diradikálu cykloalkylové skupiny.

Výrazem 3cykloalkenylová skupina, samotným či v kombinaci, s>e míní cyklocká uhlíkatá skupina se čtyřmi až 8, s výhodou 5 nebo 6 atomy uhlíku a s jednou dvojnou vazbou či více takových. Příklady .takových skupin zahrnují skupinu - ale bez jakéhokoli omezení __cy klopě nteny lovou, cyklohexenylovou, cyklopentadienylovou apod. Výraz cykloálkenylenová skupina se týká odvozených diradikálů.

Výraz aryl či arylová skupina znamená karbosykličkou aromatickou skupinu (tedy jen z atomů uhlíku a vodíku), jako je skupina fenylová, naftylová, indenylová, andynylová, azulenyibová fluorenýlová a ahthra.ee hylová, nebo heterocyklickou aromatickou skupinu, jako je furylová, thienylová, pyridylevá, pyrrolylová, oxazolylová, thiazolylová, imidazolylová, pyrazolylová, 2-pyrazolinylová, pyrazolidinylová, isoxazolyl vá, isothiazolylová,

1,2,3 .oxadiazolylová, ' 1,2,3-triazolylová, 1,3,4-rthiadiazol lová, pyridazinylová, pyrimidinylová, pyrazinylová, 1,3,5-triazinylová, 1,3,5-trithianylová, indolizinylová, andolylová, isoindolylová, 3H-indolylová, indolinylová, benzofbj fůra ny lová, 2,3-dihydrobenzofuranylová, benzo^b)thiofenylová, ΙΗ-indazolylová, benzimidazolylová, benzthiazolylová, purinylová, 4H-chinolizinylová, chino·» linylová, isobinolinylová, cinnolinylová, f talazinylová, china• · • rf » · β

-23zolinylová, chinoxalinylová, 1,8-naftyridinylová, pteridinylová, karbqzolylová, akridinylová, fenazinylová, fenothiazinylová, a fenoxazinylová.

Arylové skupiny, jak jsou zde definovány, mohou vzájemně nezávisle obsahovat 1 až 4 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z těchto: halogeny, skupina hydroxylová, aminoskupina, nitroskupina, skupina trifluormethylová, trifluormethoxylová, alkylová, alkenylová, alkinylová, kyanová, karboxylové, karboalkoxylová, 1,2-oxyethylenová, alkoxylová, alkenoxylová nebo alkinoxylová, alkylaminoskuoina, alkenylamjnoskupina, alki-r nylaminoskupina nebo alifatická či aromatická acylová skupina, aIkoxykarbonylaminoskupina, alkyIsulfonylaminoskupina, morfolinokarbonylaminoskupina, thiomorfolinokar bonylaminoskupina , N-alkylguanidinová, aralkylaminosulfonylcvá skupina, dále aralkoxyalkylová ; N-arakjixymočovina, N-hydroxylmočovina, N-alkenylmočovina, K,N-(alkyl,hydroxyl)-močovina,, dále skupina heterocyklylová, thioaryloxysubstituovaná arylová, N,N-(aryl,alkyl)hydrazinová,

Ar'-substituovaná sulfonylheterocyklylová, aralkylsubstituovaná heterocyklylová, cykloalkyl- a .cykloalkenyl-substituovaná heterocyklylová, cykloalkyl-nakondenzobaná arylová, aryloxysubstituovaná alkylová, heterocyklylaminoskupina, alifatická či aromatická acylaminokarbonylová skupina,, alifatická či aromatická acyl-substituovaná alkenylová, Ar'-substituovaná aminokarbonyloxylová, Ar ','Λ±'-disubstituovaná arylová, alifatická či aromatická acyl-substituovaná acylová, cykloalkylkarbony1alkylová, cykloalkylsubstituovaná aminoskupina, aryloxykarbony1-al-k-yl-ov-á—skupina, fosford'iamidyl-ová^— kyselina nebo ester. ’.....

Ar je karbocyklická nebo heterocyklická arylová skuúina, jak byla zde výše definována s jedním až třemi substituenty ze skupiny, kterou tvoří halogeny, hydroxylová skupina, aminoskupina, nitroskupina, skupena trifluormethylová, trifluormethoxylová, alkylová, alkenylová, alkinylová, 1,2-dioxymethylenová,

1,2-dioxyethylenová, alkoxylová, alkenoxylová, alkinoxylocá, alkylaminoskupina, alkenylamino- nebo alkinylaminoskupina, dále skupina alkylkarbonyloxylová, alifatická či aromatická acylová, ··· ·

-24alkylkarbonylaminoskupina, alkoxykarbonylaminoskupina, alkylsulfonylaminoskupina, N-alkyl- anebo Ν,Ν-dialkylmočovina.

Výrazem alkoxylová skupina či alkoxy’¹ se míní, samotná či v kombinaci skupina typu alkyletherového radikálu, kde výraz alkyl byl zde již výše definován. Jako příklady vhodných alkyletherových radikálů lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny methoxylovou, ethoxylovou,mn-propoxylovou, isopropoxylovou, n-butoxylovou, iso-butoxylovou, sek.-butoxylovou, terc.-butoxylovou apod_o

Výrazem alkenoxylová skupina, samotným či v kombinaci, se míní radikál vzorce alkenyl-Ο-, kde výraz alkenyl byl již výše definován za předpokladu, že radikálem není enol-ether·

Příklady vhodných alkenoxylových skupin zahrnují bez jakéhokoli omezování skupiny allyloxylovou, E a Z-3-methyl2-propenoxylo\rou apod.

Výraz alkinyloxylová skupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkinyl-Ο-, kde výraz alkinyl byl již výše definován, ale za omezení, že nejde o inol-ether. Jako vhodné příklady takových skupin lze uvést bez jakéhokoli omezování skupinu propargyloxylovou, 2-butinyloxylovou apod.

Výraz thioalkoxylová skupina se týká thioetherovýoh zbytků vzorce alkyl-S-, kdeolNyl byl již výše definován.

Výraz alkylamino, samotný či v kombinaci, znamená mono- nebo dialkylaminosubstituovanou aminoskupinu (např.

zbytek vzorxe alkyl-NH- nebo (alkyl)₂~N-), kde pojem alkyl byl již dříve definován.Jako vhodné příklady možno uvést skupiny, to‘béz jakéhokoli omezování- methy laminovou, e thy lamino- ''vou, propylaminovou, isopropylaminivou, terč.-butylaminovou,

N,N-diethylaminovou apod.

Výraz alkenylaminová skupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkenyl-NH- nebo (alkenyl)₂-N-, kde pojem alkenyl^byl již výše definován, to za omezení, že se nejedná o nějaký enamin. Jako příklad lze uvést allylaminovou skupinu.

Výraz alkinylaminoskupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek alkinyl-NH nebo (alkinyl)₂-N, kde výraz alkinyl byl již výše definován, to za omezení, že nejde o inamin. Jako příklad

988 9 1 • · ·· ·*

-25· 8 lze uvést propargylaminový zbytek.

Výraz amid se týká buď seskupení -N(R^)-C(=0)- nebo -0(=0)-12-(51^)-, kde R¹ ve srňí^Lu zde již dříve uvedené definice znamená vodík, jakož i jiné skupiny. Výraz substituovaný amid je vztažen k situaci, kdy R^ neznamená vodík, zatím co výraz nesubstituovaný amid se týká situace, kdy vodík znamená.

Výraz aryloxy, samotný ci v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-Ο-, kde pojem aryl_dbyl zde již definován. Jeko příklady lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny fenoxylovou, neftoxylovou, pyridyloxylovou apod.

Výraz arylamino, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-NH, kde aryl byl již zde výše definován. Jako příklady opět bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny anilináminovou (anilidovou), naftylaminovou, 2-, 3- a 4-pyridylaminovou apod.

Výraz arylnavázaná cykloalkylové skupina, samotný či v kombinaci, znamená cykloalkylovou skupinu, jež sdílí dva sousedící uhlíkové atomy s arylovým zbytkem, kde výrazy cykloalkyl a aryl byly zde již dříve definovány. Jako příklad lze uvést cyklobutylovou skupinu s nekondenzovaným benzenovým jádrem.

Výraz alkylkarbonylaminoskupina, samozný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkyl-ΝΟ-ΝΗ-, kde výraz alkyl byl zde již definován.

Výraz alkoxykarbonylaminoskupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkyl-OCONH-, kde výraz alkyl byl zde již dříve definován.

_Výraz alkyl sulfonylami noskupina, samotný či v kombinaci, __ znamená zbytek vzorce alkyl-SC^NH-, kde výraz alkyl byl zde již definován.

Výraz arylsulfonylaminoskupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-SOg-NH-, kde pojem aryl byl zde již dříve definován.

Výraz N-alkylmočovina, samolný či v kombinaci, znamená skupinu vzorce alkyl-NH-CO-NH, kde výraz alkyl byl zde již dříve definován.

• fc

-26Výraz ”N-arylmočovina”, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-NH-CO-NH, kde poje ·. aryl” byl zde již dříve definován.

Výrazem Bhalogen” je míněn fluor, chlor, brom či jod.

Výrazem uhlovodíkový zbytek” se míní uspořádání uhlíku -a vodíku, kde je třeba pouze jediného¹· vodíkového atomu, aby vznikla nezávislá stgbilní molekula. Má tedy uhlovodíkový zbytek jedno volné valenční místo na uhlíkovém atomu, kde je uhlovodíkový zbytek navázán na jiný. atom či atomx. Jako příklády lze uvést skupiny alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou apod.

Výraz uhlovodíkový diradikál se týká uspořádání atomů uhlíku a vodíku, kde je třeba dvou vodíkových atomů ke vzniku stálé nezávislé molekuly. Takže má tedy takový diradikál dvě volná valenční místa na jednom či na dvou uhlíkových atomech, kudy je tento zbytek názán na jiný atom či atomy. Jako příkáady takový skupin možno jmenovat skupinu alkylenovou, alkenylenovou, alkinylenovou, cykloalkylenovou.

Výrazem hydrokarbyl se míní každé stabilní uspořádání pouze z atomů uhlíku a vodíku s jedním valenčním volným místem, kudy je vázáno na jinou částici a zahrnuje tedy skupiny alkylové, alkenylové, alkinylové, cykloalkylové, cykloalkenyld^vé, arylové (bez vsunutí^, heteroatomů do arylového cyklu), arylalkylové, alkylarylové a pod.

Výrazem hydrokarbylen se míní jakékoli stabilní uspořádání jen z atomů uhlíku a vodíku se dvěma volnými valenčními místy, kudy je vázáno na jiné částice, takže sem patří skupiny alkyiénově, alkenylenové, alkinylenové, cyklealkylenové, cykloalfeenylenové, arylenové (bez heteroatomů, vsunutého do aromatického jádra), arylalkylenové, alkylarylenové apod.

Výraz hydrokarby1-0-hydrokarbyIsn se týká hydrokarhýlové skupiny, vázané na atom kyslíku, kde kyslíkový atom je déle vázán na hydrokarbylenovou skupinu na jednom či dvou valenčních místech, kde je hydtokarbyle nová skupina vázána na další jiné. Výraz hydrokarbyl-S-hydrokarbylen, hydrokgfbyl-NH-hydrokarbylen a hydrokarby1-amido-hydrokarbylen” mají odpovídající * ····

-27významy, kdeže kyslík byl nahrazen sírou, skupinou -NH- nebo amidovou v tom kterém případě.

Výraz N-(hydrokarbyl)-hydrokarbylen se týká hydrokarbylenové skupiny, kde jedno či dvě valenční místa jsou ve vazbě na dusíkový atom a tento dusíkový atom je současně vázán na vodík a hydrokarbylovou skupinu. Výraz N,N-di(hydrokarbyl)-hydrokarbylen se týká hydrokarbylenové skupiny, kde jedno ze dvou valenčních míst je vázáno na atom dusíku a dusíkový atom je současně vázán na dvě hydrokarbylové skupiny.

Výraz hydrokarbylacyl-hydrokarbylen se vztahuje k hydrokar bylové skupině, vázané pomocí acylové skupiny -C(=O)- na jedno či dvě valenční místa hydrokarbylenové skupiny.

Výrazy heterocyklylhydroearbyl a hererocyklyl se týkají stabilního cyklického uspořádání atomů se zahrnutím atomů uhlíku a až do čtyř atomů (označovaných jako heteroatomy) ze skupiny kyslík, dusík, fosfor a síra. Cyklické uspořádání může mít formu monocyklického zbytku s 3 až 7 atomy, nebo bicyklického s 6 až 11 atomy. Cykly mohou být nasycené či nenasycené (čítaje •v to aromatické kruhy) a mohou případně mít nakondenfeované benzo-zbytky. Atomy dusíku a síry mohou zde být v jakémkoli oxidačním stavu, čítaje v to kvarternizovanou formu dusíku. Heterocyklyhydrokarbyjový zbytek může být vázán na kterémkoli findocyklickém atomu uhlíku či heteroatomu, Čímž vznikne stabilní struktura. Výhodnými takovými zbytky jsou 5-7mičlenné monocyklické heterocykly, ůsahující jeden nebo dva atomy dusíku ve smyslu heteroatomů, __________

SubstituovanýheterocyklyIkydrokarbylový zbytek odpovídá výee^uvedenému, kde nejméně jeden z cyklů je vázán na uvedený substituent, který je navázán na kruhu.

S odkazem na hydrokarbylové a hydrokarbylenové skupiny, výraz deriváty kteréhokoli z uvedených, kde jeden či více atomů vodáku je nahrazeno totožným množstvím atomů fluoru, se týká molekul, obsahujících uhlík, vodík a fluo r, nikoli však další jiné atomy.

·

Výrazem aktivovaný ester se míní takový ester, který obsahuje odštěpující! se skupinu, kterou lze snadno nahradit nukleofilem, jako je amin, alkohol nebo thiolový nukleofil. Takové odštěpující se skupiny jsou dobře známé a zahrnují bez jakéhokoli omezování N-hydroxyimid kyseliny jantarové, N-hydroxybenzotriazol, halogeny (jako helogenidy), alkoxylové skupiny se zahrnutím tetrafluorfenolátů, thioalkoxylové skupiny a pod. Výraz chráněný ester se týká esterové skupiny, jež je maskována či jinak převedena do nereaktivní formy. K tomu viz Greene Protecting Groups in Organic Synthesis o

S přihlédnutím k výše uvedeným definicím budou další chemické termíny, jak jsou použitelné v textu, snadno pochopitelné obeznámeným v tomto oboru. Termíny mohou být použity samostathě či v kombinaci a je výhodné, případně ještě výhodnější, aby délky řetězců radikálů vyhovovaly všem uvedeným kombinacím.

A o Příprava značených fragmentů nukleových ky selin

Jak to zde již bylo uvedeno, je jedním z předmětů tohoto vynálezu zajištění generálního schématu pro sekvence DNA, kdy by bylo možno použití více než 16 značených vzorků v každé linii; za nepřetržitého detegování lze značené vzorky zjistit a odečtení sekvence v závislosti na míře dělení se provede právě jako při obvyklém sekvencování na podkladu fluorescence. Toto schéma je aplikovatelné na jakýkoli postup sekvencování DNA, založený na míře dělení značených molekul. 0 vhodných značených látkách i vazebných použitých složkách při použití dle tohoto vynálezu, jakož i o postupech sekvencování nukleových kyselin bude podrobnější fiskuse ještě zde dále.

1. Značené vzorky

Značený vzorek (Tů, tj.tag) chemické částice, jež se dá použít vání molekuly, těšící se zájmu a je obvykle vztažen k pojetí k jednoznačnému identifikopřesněji řečeno se týká obvyk , ·· ·· ·· ·· • · · · © · · · · • · · ·· · · ·· » · © · · © * ··· · ♦ • · · · · · ·

-29le proměnné složky značené složky, at již je jakkoli těsněji vázána na ni a kterémkoli z dále uvedených činidel: značená reagující látka, značená složka a značená částice.

Značená složka, používaná při postupu dle tohoto vynálezu má několik výhod:

1) Je schopná odlišeni od všech ostatních značených složek. Toto odlišeni od ostatních chemických částí může být založeno na ohromatografickém chování se značené složky (zvláštš po štěpné reakci), na spektroskopických nebo potenciometrických vlastnostech, nebo jejich kombinací. Spektroskopické postupy, jimož lze značené složky jednoznačně rozlišit, zahrnují hmotnostní spektroskopii (MS), infračervená spektra (IR), •ultrafialová spektra (UV) a fluorescenci, přičemž prvé 3 postupy lze označit za výhodnější, prvý za nejvýhodnější. Z potenciometrických postupů je výhodnou potenciometrická amperometrie.

2) Značenou složku je možno dokázat za přítomnosti 10 az 10 mol.

3) Značena sjožka je vybavena ehemickou schopností navázat se na MOI, kteroužto složku má značená látka jednoznačně identifikovat. Napojení může proběhnout přímo na MOI, nebo nepřímo prostřednictvím vazebné složky.

4) Značená složka je z chemického hlediska stabilní za všech pochodů, jimž je vystavena, čítaje v to navázání na MOI a odštěpení z MOI, jakož i za všech manipulací, prováděných s MOI, je-li navázána tamže značená složka.

5) Značená složka nijak závažněji nevadí při postupech á’ manipulacích “s“M0I, je-li tamze značená složka navázána. Např. je-li značená složka navázána na oligonukleotid, pak značená složka nesmí podstatněji vadit při jakékoli hybridizaci nebo při enzymových reakcích, prováděných s oligonukleotidem (např. PCR-sekvenčních reakcích.Podobně je-li značená složka navázána na antilátku, nesmí podstatněji rušit při zjištování antigenu antilátkou.

Značená složka, jež má být zjištována určitými spektroskopickými nebo potenciometrickými postupy se má vyznačovat vlastnost• ····

-30,mi, jež zvyšují citlivost a specifičnost zjištění tímto postupem-r Typicky bude mít značená složka takovéto vlastnosti, protože ty byly vneseny do značené variabilní komponenty, a ta bude typicky představovat hlavní část značené složky. V dalším pojednání se výraz značená složka obvykle týká štěpného produktu, obsahujícího variabilní značenou komponentu, ale může být použit i pro variabilní značenou komponentu jako takovou, protože ta je odpovědná za možnost provedení jednoznačeného důkazu a k dosažení nutných vlastností. Ve sloučeninách vzorce T-L-X bude podíl T obdahovat značenou variabilní komponentu.

Zatím co značená variabilní složka byla takto označena za účelem charakterizování, například hmotnostní spektrometrií, může být ”T$, část celku T-L-X označována jako T¹*^13, -^o^o^ne štěpný produkt z T-L-X, obsahující T, může být ozbačován jako T^ms-obsahující složka. Následující spektroskopické a potenciometric' postupy se mohou použít k charakterizování podílů, obsahujíz , _mms cích T «

Charakterizování značených složek hmotnostní spektrometrií

Pokud se má značená složka analyzovat hmotnostní spektrometrií (např.tedy v příůade značené složky, sledovatelné hmotnostní chromatografií, kdeže tato část je označována také jako složka-obsahující T^ms”), pak je základním přsdpokladeem pro značnou složku, aby byla ionizovatelná. Je tedy výhodným předpokladem pro zjištování značených složek pomocí hmotnostní chromátografie, aby tamže byla vnesena a přítomná chemická funkce , nesoucí kladný nebo záporný náboj za podmínek ionizování při hmotnostní spektrometrii. Tento rys přispívá ke zvětšení tvorby iontů a celkově vyšší citlivosti při konstitučním sledování, zvláště elektrosprejovou ionizací. Chemická funkce, jež podporuje tvorbu ionizovaného stavu, se může odvozovat od T^ms či L, nebo od obou dvou typů. Faktory, které zvaŠují relativní citlivost analyzované látky, sledované hmotnostní spektrometrií, jsou diskutovány např. v pojednání Sunner-a a spol., Anal.Chem. 60, 1300-1307 (1988).

• ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · · · · · • · ·.··· · · · · • « « · · · ·· ·· · ♦ · • · · · * · · · · ··· ···· ·· ·· ·· ··

-31- ,

Výhodnou funkcí k usnadnění vzniku záporného náboje, je některá z organických kyselých funkcí, jako je fenolická hydroxylová skupina, karboxylová skupina, skupina fosfonátová, fosfátová, tetrazolové, sulfonylmočovinová, perfluoroalkoholová a zbytek sulfonové kyseliny.

Výhodnou fuhkcí pro usnadnění kladného náboje za podmínek ionnizace jsou alifatické a aromatické aminy. Jako příklady aminových funkčních skupin, kdy dochází ke zvýšení možnosti zjištění pomocí hmotnostní spektroskopie značených složek, lze uvést kvarternizované aminy (tj.aminy, jež mají na dusíku 4 vazby, každou z nich směřující na atom uhlíku) v tomto směru viz Aebersold, US pat.spis 5 240 859, a terč.aminy (tj. dusíkaté látky se třemi vazbami směřujícími vždy na atom uhlíku s tím, že sem patří i látky se skupinou C=N-C, jako je tomu například v pyridinu, viz Hess a spol., Anal.Biochem. 224, 373 )19953, dále Bureš a spol., Anal.Biochem. 224, 364 (1995). Stericky bráněné terč.-aminy jsou zvláště výhodné. Terč.aminy i kvarterní amoniové soli mohou být povahy alifatické či aromatické. Část, obsahující T^ms, musí obsahovat nejméhě jednu ionizovatelnou složku, ale může jich obsahovat a i více. Výhodným nábojem je jediný ionizovaný druh na jednu značenou složku. Ve shodě s tím je výhodné, aby každý podíl s obsahem T (a tedy každá značená variabilní komponenta) obsahovala pouze jeden sterický bráněný amin nebo skupinu organické kyseliny.

Jako vhodné skupiny, obsahující aminovou funkci, jež mohou tvořit část složky, obsahující T‘ , je možno uvést tyto další:

°-(c₂-^cio)-u

-c

Ci-C_ic

··

Identifikování značené složky pomocí hmotnostní ·- spektrometrie se s výhodou provádí na základě odpovídajícího poměru molekulární hmotnosti k náboji (m/z). Výhodné molekulární hmotnostní rozmezí značených složek MS se pohybuje v rozmezí od asi 100 do 2000 daltonů a s výhodou podíl s obsahem T^ms má hmotnost nejméně asi 250 daltonů, s výhodou nejméně asi 300 daltonů a ještě výhodněji nejméně asi 350 daltonů. Je zprav-idla nesnadné pro ‘hmotnostní spektrometry rozlišit mezi podíly ty, které mají matečné ionty pod asi 200 až 250 daltonů (v závislosti na přesnosti přístroje), takže výhodné podíly s obsahem T^ms mají hmotnost nad tímto rozsahem.

Jek to již bylo vysvětleno výše, podíl, obsahující T^ms může obsahovat jiné atomy, než jsou ty, které jsou přítomné ve variabilní komponentě značené složky a ve skutečnosti i jiné, než jsou v T jako látce co takové. Podle toho hmotnost samotné látky T^ms může být pod asi 250 daltonů, a to tak dlouho, z ms z pokud podíl T má sám hmotnost nejméně asi 250 daltonů. Takže ·· ·· ·· > · · « • · ·· » 11 « » e · i

9« ·· ·« ·· * · · 9 · ··

9 9 9

9 9

99 hmotnost T^ms může kolísat od 15 (tj. např.methylový radikál) do asi 10 000 daltonů, s výhodou se pohybuje v rozmezí od 100 do asi 5000 daltonů a nejvýhodněji od asi 200 do asi 1000 daltonů.

Je poměrně obtížné rozlišit značené složky hmotnostní spektrometrií, pokud takové složky obsahují atomy, obsahující více než jeden izotop v podstatném nadbytku. Dle toho výhodné skupiny T, které jsou určené pro hmotnostní spektrometrii a spektroskopické identifikování (T skupiny) obsahují uhlík, nejméně jeden vodík a fluor a případně další atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, síra, fosfor a jod. I když mohou být v T^ms další jiné atomy, pak jejich přítomnost může poněkud znesnadnit analýzu pomocí údajů hmotnostních spekter. S výhodou T^ms skupiny obsahují pouze uhlík, atomy dusíku a kyslíku navíc k vodíku a/nebo fluoru.

Fluor je výhodný a dokonce preferovaný atom ve skupině T^ms, ve srovnání s vodíkem je fluor pochopitelně těžší. Takže přítomnost atomu fluoru místo vodíkových způsobí u skupin T , že mají vyšší hmotnost a tím je možno, že skupiny T ’ dosahují až i převyšují hmotnost nad 250 daltonů, a to je žádoucí, viz zde dříve. Navíc náhrada vodíku fluorem vede k větší těkavosti podílu, obsahujícího T^ms, a větší těkavost analyzované látky zvyšuje citlivost použité hmotnostním spektrometrie, použité jako analytické metody.

Molekulární vzorec T ^C1-500^Ix'0-100°0-100^S0-10'^P0-10^Hí< ^{F kde sou}°et ot,^a (J je dosta • z z ^1C1 k uspokojení jinak nenasycených vazností atomů uhlíku, du,ms spadá do rozmezí, vyjádřeného vzorcem cu siku, kyslíku, síry a fosforu.

Označení F^ I^znamená, že

T^ms obsahuje nejméně jeden, ale může obsahovat jakékoli množství od 1 do 500 atomů uhlíku, navíc až případně 100 atomů dusíku (Νθ znamená, že T^ms neobsahuje žádný atom dusíku) a až 100 atomů kyslíku, až 10 atomů síry a až 10 atomů fosforu. Symboly «Λ, pa a představují počet atomů vodíku, fluoru a jodu v T když kterékoli z těchto dvou čísel mohou znamenat nulu a kde

-3Φ^Α

• · • ·

a kde součet těchto čísel odpovídá celkovému počtu jinak nenasycených vazeb na uhlíku, dusíku, kyslíku, síře a fosforu. S výhodou má. T^ms molekulární vzorec, spadající do rozsahu ^G1 ^c0^R0-l0°0 lOd_ ^R * kde 4 «^znamena jí dohromady číslo, jež se rovná počtu atomů vodíku a fluoru, přítomných v částici

b. Chrakterizování značených složek infračervenými spektry

Jssu dvě zásadní formy infračerveného zjištování organických chemických skupin: Ramanovo rozptylové infračervené spektrum a absorpční infračervené spektrum. Dohromady jsou označována jako spektroskopické postupy. Obecně lze říci, že Ramenová excitace záleží na zrněných pclarizcvanosti vazeb, zatím co absorpční infračervená spektra jsou závislá na změnách vazebného dipolcvého momentu. Čáry slabé absorpce infračervených spekter zesílí v Ramenových spektrech a naopak. Pro infračervená spektra jsou charakteristickými jednotkami vlnočty. Jsou zde spektrální oblasti pro infračervená spektra značených složek s možností oddělitelných použití a aplikací: blízká IR v oblasti. I25OO až 4000 cm“\ střední IR 4000 až 600 cm“^ a daleká v oblasti 600 až 30 cm\ Pro zde používané použití, kde sloučenina se použivá jako značná složka pro identifikaci MOI, vzorku či priméru je výhodná střední spektrální oblast. Tak například karbonylová vazba (1850 až 1750 cm'*') se měří pro karboxylové kyseliny, jejich estery a amidy, alkyl- a arylestery kyseliny uhličité, karbamáty a ketony. Vazba N-H (1750-160 cm’'¹') se použije při identifikování aminů, amoniových ioirbů—a—am-i-d-ůo—Př-i—1400 až 'I-2-5-O—cm-se zjistí _____ vazba R-0H, jakož i C-N v amidech. Aromatické substituční stavy se zjistí při 900 až 690 cm’”'¹' (vazba C-H, N-H v případě ArNHg). Nasycené vazby uhlíku s vodíkem, olefiny, aromatické cykly, dvojné a trojné vazby, estery, acetaly, ketaly, amoniové soli, sloučenina s vazbou N-0, jako jsou oximy, nitrosloučeniny, N-oxidy a nitráty, azosloučeniny, hydrazony, chinony, karboxylové kyseliny, amidy a laktamy, ty všechny obsahují porovnatelné infračervené vibrační údaje, viz Pretsch a spol., Spectral Data for Strupture Determination of Organic Compounds, Springer• · ··» · · · · · · ·· · • · ···· · · · · • · ·· · · · · ·· · · · • · ···· ·· '· ··· ···· ·· ·· ·· ··

-35Verlag, New ýork 1989). Mezi výhodné sloučeniny v tomto směru patří aromatické nitrily s velmi silnou nitrilovou vibrací mezi 2230 aš 2210 cm“'*'. Dalšími vhodnými typy jsou aromatické alkiny se silnou vibrací s ostrým absorpčním pásem mezi 2140-2100 cm“^P. Třetím typem této skupiny jsou aromatické azidy s intenzivním absorpčním pásem v rozmezí 2l6O až 2120 cm\ Thiokyanatany jsou reprezentanty sloučenin $e silnou absorpcí mezi 227 5 až 2263 cm“·*·.

c. Charakterizování značených složek ultrafialovými spektry

Souhrn organických chromofornich typů a jejich v ultrafialových spektrech viditelné vlastnosti jsou uvedeny v publikaci Scott Interpretation of the UV Spectra of Natural Products’,' Pergamon Press, New York, 1962 . Jafro chromofor je označován atom nebo skupina atomů či elektronů, které jsou odpovědné za případnou světelnou absorpci. Jsou zde empirická pravidla pro hodnoty ]L až ý| ⁺ maksim v konjugovaných systémech, viz Pretsch a spol., Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, str. B65 až B70, Springer-Verlag, New York, 1989). Výhodné sloučeniny ( s konjugovaným systémem) se budou vyznačovat přechodem n ažjka Jk až Λ- · Příklady takových sloučenin viz Acid Violet 7, Acridine Orange, Acridine Yellow G, Brilliant Blue G, Congo Red, Crystal Violet, Malachite Green jako oxalát, Metanil Yellow, methylenová modř, methyloranž, methylviolet B, naftolová zeleň H, Oil Blue N, 011 Red 0, 4-fenyl-a^ofe-nol·,—Sja-fr-a-nie—O-y- Solvent Green 3 a Sudan Orange G a ty jsou všechny běžně obchodbě dostupné J^Aldrich, Milwaukea, TO), Jsou uváděny i další vhodné slouČeninym viz např. Jane _? spol.,

J .Chrom. 323, 191-225 (1985).

d. Charakterizování’značených složek fluorescencí

Fluoreskující vzorky se identifikují a kvantitativně vyhodnotí vlnovými délkami absorpce a fluorescenční emise, jakož i použitím odpovídajících intenzit. Emisní spektra (fluorescence a fusforescence) jsou mnohem citlivější a dovolují specicičtější měření ve srovnání s absorpčními spektry. Jin£fotofy-

sikální charakterizování, jako je životnost excitovaného stavu a fluorescenční anizotropie se využívají podstatně méně.

Obecně nejuživatelnějšími parametry zjištování intenzity je molární extinkční koeficient či odpovídající koeficienty pro absorpci a kvantové zjištění (quantum yield, QY) fluorescencí. Hodnota £ je specifikována pro jedinou vlnovou délku (zpravidla maximum absorpce vzorkuj zatím co hodnota QY je mírou totální fotonové emise z hlediska celého profilu spektrální fluorescence. Pro fluorescenční excitaci (cestou absorpce) se obvykle používá úzké optické pásové rozmezí (pod 20 nm), zatím co pásová rozmezí pro fluorescenční detekci jsou mnohem variabilnější a v* X zasahují od plného spektra maximální citlivosti az k uzkému pásu ( asi 20 nm) pro nejvyšší rozlišeni. Fluorescenční intenzita vzorku molekuly je úměrná produktu z a QY · Rozmezí těchto parametrů mezi chromofory běžné praktické důletitosti činí asi 10 000 až 100 000 cm”¹ pro £ a 0,1 až 1,0 pro QY, Sloučeniny, použitelné jako fluoreskující značné vzorky jsou tyto: rhodamin, modř lambda 470, zeleň lambda, červen lambda 664, červen lambda 665, akridinová oranž a propidiniumjodid, vše běžně dostupné od Lambda Fluorescence Co (Pleasent Gap, PA). Jiná fluoreskující činidla, jako je nilská červen texaská červen, lissamine , mv

BODIPY jsou dostupné od Molecular Probes (Eugene, OR), e Potenciometrické charakterizování značených složek

Princip elektrochemické detekce (BOD) je založen na oxidaci či redukci sloučenin, které za určité nanesené voltáže, jsou buď donorem či akceptorem elektronů za vzniku proudu, který lze změřit. Pokud jsou některé sloučeniny' vystaveny účinkům diferenčních potenciálů, pak molekula podléhne molekulárnímu přesmyku na povrchu pracovních elektrod ze ztráty (oxidace) nebo získání (redukce) elektronů; takovým sloučeninám se říká, že jsou elektronické a podléhají elektrochemické reakci.BC-detektory nanesou voltové napětí na povrch elektrory, po kterém teče eluent z vysokotlakové kapalinové chromatografie. Elektroaktivní slouČe-38······· »· » · · niny, eluované z kolony, jsou bud donory elektronů (oxidující) nebo potřebují elektrony (redukující) za vzniku proudového píku v reálném čase. Podíl vzhiklého proudu je velmi důležitě závislý jak na koncentraci analyzované látky, tak i na naneseném voltovém napětí s tím, že každá sloučenina má své specifické voltové napětí, za kterého se začne oxidovat či redukovat. Nejběžnějším obecně známým elektrochemickým detektorem je amperometrický detektor, na kterém se udržuje potenciál konstantní a měří se potom proud vzniky elektrochemickou reakcí. Tento typ spektrometrie se běžně označuje jako potensiostac amperometfie”. Kom'rně jsou amperometry dostupné od ESA, lne., Chemford^ MA.

Pokud je účinnost detekce 100%ní, pak jsou specializované detektory označovány jako coulometrické”.Jsou citlivé a mají určité výhody z praktického hlediska se zřetelem na selektivitu a citlivost a proto jsou tyto detektory užitečné na určitém úseku. Při použití coulometrických detektorů se za dané koncentrace analyzované látky nanáší signální proud jako funkce naneseného potenciálu (voltáže) proti pracující elektrodě. Výsledný sigmonální graf se nazývá křivkou proud/napětí nebo hydrodynamickým voltammagramem (HDV)..HDV umožňuje nejlepší volbu potenciálu nanášeného na pracovní elektrodu, jež dovoluje maximalizovat pozorovaný signál. Velkou výhodou EGD je bezprostřední citlivost na hladinu proudu detekce v subfentomolárním rozmezí.

četné chemikálie a sloučeniny jsou elektrochemicky aktivní, čítaje v to četné biochemické sloučeniny.; farmaceuticky používané látky a pesticidy. Chromátograficky koeluovatelné slofačeniny 1ze účinně rozdělit, i když jejich půlvlnový potenciál (potenciál poloviny signálu ma.xina) se liší v rozmezí pouze 30-60 mV.

V současné době vyvinuté coulometrické sensory zsjištuj^ selektivitu, identifikaci a rozdělení koeluovsných sloučenin, použijí-li se jako detektory při děleních, založených na chromatografii kapalin.

A proto takové vhodně uspořádané detektory představují další možnost provádění dělení, jež provede detektor sám.

Běžné přístroje obsahují 16 kanálků, jejichž výkonnost je omezena v podstatě jen rychlostí, za které lze potřebné údaje získat. Počet sloučenin, které je možno dělit za BC-uspořádání je z chromátografického hlediska omezen (např.omezením počtu destiček). Avšak jestliže dvě sloučeniny, nebo i více, které jsou' chromátograficky koeluovatelné, se vyznačují rozdílem půlvlnového potenciálu 30 až 60 mV, je zařízení schopno je rozlišit. Schopnost sloučenin k elektroaktivnímu rozlišeni je závislá na tom, zda obsahují BC-aktivní skupinu (například hydroxylovou, kyslík, síru nebo dusík).

Mezi sloučeniny, které byly s úspěchem detegovány použitím coulometrických detektorů, patří 5-hydroxytryptamin, 3-methoxy-4-hydroxyfenylglyko.l, kyselina homogentisová, dopamin, metanefrin, 3-hydroxykynurenin, acetaminofen, 3-hydroxytryptol, kyselina 5-hydroxyindoloctová, oktansulfonová, fenol, o-kresol, pyrogallol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol,

4.6- dinitrokresol, 3-methyl-2-nitrofenol, 2,4-dichlorfenol,

2.6- dichlorfenol, 2,4,5-trichlorfenol, 4-chlor-3-methylfenol,

5-methylfenol, 4-methyl-2-nitrofenol, 2-hydroxyanilin, 4-hydroxyanilin, 1,2-fenylendiamin, benzokatechin, buturan, cnlortholuron, diuron, isoproturon, linuron, methobromuron, metoxuron, monolinuron, monuron, methionin, tryptofan, tyrosin, kyselina 4-aminobenzoovó, 4-hydroxybenzoová, 4-hydroxykumarinová, Y-methoxykunarin, aftigenin, baikalein, kyselina kávová,_ katechin, cenraurein, kyselina chlorgenova, doidzein, datisce^rn, diosmetin, epikatechin-galav, epigallo-karechin, epigailo-katechin-galát, eugenoi, eupatorin, kyselina íerulova, fisei galangm, kyselina galová, garaenin, ganistein, kyselina gen-cisov: hesperidln, irigenin, kemřerol, leukokyanidm , luteolin, mangostin, morin, Myricetin, naringin, narirutin, pelargonidin, peonidin, floretin, pratensin, kyselina protokatechová, rhamnetin, kvercetin, sakuranetin, skutelarein, skopoletin, aldehyd kyseliny syringové, kyselina syringová, tangeritin, troxerutin, umbéliferon, kyselina vanilová, 1,3-dimethyltetrahydroisochinolin, 6-hydroxydopamin, r-salsolinol, N-methyl-r-salsolinol, • A • ·· * · · · • ff · · ·«·· ff • ffff · · · ·♦ ·· ·· ·-40tetrahydroisochinolin, amitriptylih, apomorfin, kapsaicin, chlordiazepoxid, ohlorpromazin, daunorubicin, desipramin, doxepin,flhoxetin, fluorazepan, imipramin, isoproterenol, fóethoxamin, morfin, morfin-3-glukuronid, nortriptylin, oxazepam, fenylefrin, trimipramin, kyselina askorbová, N-acetylserofaonin, 3,4-dihyároxybenzylamin, kyselina 3,4-dihydroxymandlová (DOMA), 3,4-dihydroxyfenyloctová (DOPAC), 3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DQPA),

3,4-di.hydroxyfenylglykol (DHPG), kyselina 3-hydroxyanthranilová, 2-hydroxyfenyloctová (2HPAC), 4-hydroxybenzoová (4HBAC),

5-hyd.roxyindol-3-octová (5HIAA), 3-hydroxykynurenin, kyselina

3- hydr o xy ma nd lo vá, 3-hy droxy-4-me tho xy fe nyle thyla mi n, ky s e1i na

4- hydroxyfenyloctová (4HPAC), 4-hyd.roxyfenylmléčná (4HPLA),

5- hydroxytryptofan (5HTP), 5-hydroxy^ryptofol (5HT0L), 5-hydroxy tryptamin (5HT), , jeho síran, 3-methoxy-4-hydroxyfenylglykol (MHPG), 5-methoxytryptamin, 5-methoxytryptofan, 5-methoxypraktofol, 3-methoxytyramin (3MT), 3-methoxytyrosin (3-0M-D0PA),

5-methylcystein, 3-msthylguanin, bufotenin, dopamin, jeho 3-glukuronid, dopamin-3-sulfán a -4-sulfát, epinefrin, epinin, kyselina folová, glutathion (redukovaný), guanin, guanosin, kyselina homogentisová (HGA), homovanilová(HVA), dále homovanilylalkohol (HVOL),. kyselina homoveratrovu, hva-síran, hypoxahthin, indol, kyselina indol-3-octová a indo1-3-mléčná, kynurenin, melatonin, metanefrin, N-methyltryptamin, N-methyltyramin, N,N~dimethy1tryptamin, Ν,Ν-dimethyltyramin, norepinefrin, normetanefrin, oktopamin, pyridoxal, jeho fosfát, pyridoxamin, synefrin, pryptofoLT^- tryptamin, kyselinamo-čo-V-á..-rva.n ily Ima nd lová ( vma), xa n t h i n__ a xanthosin. Pro další vhodné látky viz např. Jane I. a spol.,

J.Chrom. 323. 191-225 (1985) a Musch G., a spol., J.Chrom. 348.

97-110 (1985). Tyto sloučeniny lze vtěsnat do látek vzorce T-L-X použitím jinak známých postupů. Například sloučenin s karboxylovou skupinou mohou reagovat s aminem, hydroxylovou skupinou atd. za vzniku amidu Či esteru atd a lze vytvořit i jiné vazby mezi T a L.

• · • · • · • · ©·· · · · · • · · ·· · * · · · < β ♦ · · © · · 9 »··· «· ·· ··

-41Navíc k výše uvedeným vlastnostem a bez zřetele na svolenou detekční metodu je žádoucí, aby značená složka měla_ modulární chemickou strukturu. To napomáhá velmi při konstruování velkého počtu strukturně příbuzných značených složek za použití techniky kombinační chemie. Tak např. jsou žádoucí pro skupinu T^ms některé vlastnosti. Je žádoucí, aby obsahovala funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li složka, obsahující T^ras sledována hmotnostní spektrometrií;( jednodušeji je-li to látka, podporující citlivost hmotnostních spekter, tedy mass spéct.sensitivity enhancer, jinak MSEE).

Také je žádoucí, aby mohla být použita jako jediný člen ve skupině látek, obsahujících T^mS, kde jednotliví členové této skupiny mají vzájemně lišící se poměr hmotnost/náboj, ale současně mají přibližně tutéž citlivost pro hmotnostní spektrometrii.

Takže členové této skupiny mají totéž MSEE. Se zřetelem na tvorbu a přípravu skupin takových sloučenin bylo nalazeno, že je vhodné generovat značené složky cestou modulární syntetické chemie, takže lze nazírat na sloučeniny, obsahující značené složky jako obsahující moduly.

Je výhodným postupem z hlediska modularity ke struktuře akupiny s Τ’ aby ms měla strukturu

T²-(J-T³-)_nkde T² je organický podíl, vytvořený z uhlíku a jednoho či více vodíků, fluoru, Jodu, kyslíku, nusíku, síry a fosforu s hmotnostním rozsahem 15 až 500 daltonů, dále kde T³ je organický podíl, -Aty_tvo-ře-ný_z uhlíku a jednoho či více vodíků, fluoru, jodu,_ kyslíku, dusíku, 1000 daltonů.

íírv a fosforu v hmotnostním rozsahu 50 až takovém případě znamená J přímou vazbu, nebo některou z funkčních skupin, jako je amidová, esterová, aminová, sulfidová, etherová, thioesterova, disulfidická, thioetherová, močovinová, karbamátová, thiokarbamátová, některá ze Schiff-ových bází, případně redukovaná, iminová, ozimová, hydrazonová, fosfátová, fosfonátová, fosforamidová, fosfonamidová, sulfonátová, sulfonamidová, nebo vazba uhlíku na uhlík; n znamená celé kladné číslo od 0 do 50 a to tak, že pokud je fe větší než 1, pak T³ a J jsou voleny na sobě nezávisle.

	•		• ·		··	• ·		' · ·
									9
•	•	•		•	• ·	•	•	• ·
•	O 9	•		•	• « ·	• ·	•	•	4
• ·		•		•	• ·		•	•	9
·· · ··	• ·		• ·		• ·	4 4		♦ ·

-422 3 ^M

Modulární struktura T -(J-T ) podminuje vhodné vsunutí do skupiny sloučenin vzorce T-L-X, kde každý člen této skupiny ms má lišící se skupinu T. Tak například pokud T znamená T , „ každý z členů této skupiny má nutně shodné I4SSE, jedna ze skupin T může odpovídat struktuře MSSE. S přihlédnutím k seřízez PIS o *x ní variability mezi členy skupiny v pojetí hmotnosti Τ' , může 2 se skupina T obměňovat mezi členy této skupiny. Tak například jeden člen této skupiny má jako T methylovou skupinu, jiný ethylovou a další propylovou. atd.

Se zřetelem na zajištění rozdílné hmotnosti nebo velkých skoků v hmotnostech se může skupina T označit jako podstatný ořírůstek (například od 1 do několika set) hmotnostních jednotek do

TLX. Takovou skupinu T lze pak označit jako skupinu, jež upravuje či adjustuje rozsah molekulárních hmotností skupiny

WRA” (weight range adjuster). Tato skupina je velice užitečná, pokud se pracuje jen s jedinou sadou skupin Τ , jež budou mít hmotnosti přesahující omezené rozmezí. Jediná sada skupin T“ se může použít pro seřízení skupin T * s velmi širokým rozsahem hmotností a to jednoduše vsunutím jedné či více WRA-T^ skupin do

T^ms. Takže za noužití jednoduchého příkladu:jestliže sada skupin T se nalézá v hmotnostním rozsahu 250 až 340 daltonů nro skupinu T^ns, vsunutí jedné WRA, jež má například 100 dalto* 3 _z nů, jako skupina T zajistí postup do hmotnostního rozsahu 350 xz z z vz 2 xz r až 440 daltonů při použití-téže sady skupin T .Podobně vsunutí dvou MWA skupin s 100 daltony (každá jako skupina T ) umožní vstup do hmotnostního rozmezí 450 až 540 daltonů, a tamže inkrehmotnostního rozsahu pro skupiny Τ' . Výhodné sloučeniny vzorce T²-(J-T³-)_q-L-X mají vzorec R_vwc-(R_wra)-R_?<,_gSE-L-X, kde (vwc) znamená skupinu T a každá ze skupin WRA (wra) a I.ISSE znamená v * z skupinu T . Struktura je doložena vyobrazením 12 ,s představuje jeden z modulárních přístupů pro přípravu Τ' ,

3 2 3

Ve vzorci T -(J-T “)_n~ se T a T s výhodou zvolí ze skupiny kterou tvoří tyto: hydrokarbylová, hydrokarby1-O-hydrokarbylenová, hydrokarbyl-S-hydrokarbylenová, hydrokarby1-NH-hydrokarbylenová, hydrokarby1-amido-hydrokarbylenová, N-(hydrokarbyl)-hydrokarbyle nová, N,N-di(hydrokarbyl)-hydrokarbylenová, hydrokarbylapylhydrokarbylenová heterocyklylhydrokarbylová, kde heteroatom/y mohou být kyslík, dusík, síra a fosfor, dále sem patří substituované heterocyklylkydrokarbylové skupiny, kde heteroatom/s patří do skupiny kyslík, dusík, síra a fosfor a substituenty jsou zvoleny z těchto: hydrokarbylové, hydrokarbyl-O-hydrokarbylenové, hydrokarby1-NH-hydrokarbylenové, hydrokarby1-S-hydrokarbylenové, M-(hydrokerbyl)-hydrokarbylenové, N,N-di.(hydrolcarbyl)-‘ hydrokarbylenové a hydrokarbylacyl-hydrokarbylenové. Dále oak T a/nebo Τ'⁵ mohou být deriváty kterékoli z dříve uvedených notenciálbí skupin T /T tak, že jeden či více atomů vodíku se nahradí fluorem.

i3

3

Dále se zřetelem na vzorec T -(J-T -) - má výhodná skupina

O

Τ'' vzorec -GÍR^)-, kde G znamená alkylenovou řetězovou skupinu s jedním až šesti atomy uhlíku s jediným substituentem R

Takže znamená-li G ethylenovou skupinu (-CHg.-CHg-), psk^ jeden nebo oba dna ethylenové uhlíky mohou mít substituent R , který je zvolen z těchto možných skupin: alkylová, alkenylová, alkinylová, cykloalkylová, cykloalkylová s na kondenzovaným arylovým cyklem, cykloalkenylová, arylová, aralkylová, aryl-substituovaná alkenylová nebo alkinylová, cy kloalkyl-substitu.ov_sná alkylová, cykloa 1 ke ny1sub s t i ťuo vá ή á” č y klo a 1 ký lo va, ^: b iar y lov a, a Tko xy 1 o v a, ⁷ ' ~ alkenoxylová, alkinoxylová, a.ralkoxylová, aryl-substituovaná alkenoxylová nebo alkinoxylová, alkylaminoskupina, alkepylamino- či alkinylaminoskupina, arylaubstituované. alkylaminoskupino či takto substituovaná alkenylamino či alkinylaminoskupina, aryloxylová,. arylaminová, M-alkylmoČovinu, substituovanou alkylem, N-arylmočovinu substituovanou n alkylem, alkylkarbonylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, aminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, skupinu, heterocyklylovou, heterocyklysubstituovanou alkylovou, heterocyklylsubstituovanou aminoskupinu, karboxyalkylsubstituovanou aralkylovou skupinu, oxokarbocyklyϊ-nakondenzovanou arylovou skupinu a heterocyklylalkylovou skupinu, oále • * « 9 8 '·· ’ ·· ··* · · · · · 9 8 8 9

9 9 8 99 9 8 8 8 • 8 · 8 9 9 9 8 89 9 9 9

8 9 9 8 9 8 9 8

899 8898 8 · ·· 88 89

-44skupinu cykloalkenylovou, aryl-substitu.ovanou alkylovou a aralkylovou, hydroxysubstituovanou, alkoxysubstituovanou, aralkoxysubstituovanou, alkoxysubstituovanou, sralkoxysubstituovanou, aminosubstituovanou alkylovou skupinu (arylsubstituovanou alkyloxykarbonylamino)-substituovanou alkylovou, thiolsubstituovanou alkylovou, alkylsulfonylsubstituovanou alkylovou, (hydroxysubstituovanou alkylthip)-substituovanou alkylovou skupinu, thioalkox_vsubstituovanou alkylovou skupinu, hydro karbykacylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, keterocyklylacylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, hydrokarbylsubstituovanou-heterocyklylacylamino-substituovanou alkylovou skupinu, alkylsulfonyleminosiábstituovanou alkylovou a arylsulfonylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, morfolinosubstituovanou, thiomorfolinosubstituovanou a morfolinokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, případně ještě v alkylové části dále substituovanou, (N-(alkyl, alkenyl nebo alkinyl)- nebo N,N— dialkyl, dialkenyl, dialkinyl nebo (alkyl, alkenyl)-amino1-karbonylsubstituovanou alkylovou skupinu heterocyklylaminokarbonylovou skupinu, heterocyklylalkylenaminokarbonylovou skupinu, heterocyklylaminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, heterocyklylaikylenaminokarbony1-substituovanou alkylovou skupinu, R,rí-( dialkyl)-alkyle naminokar bonylsubstituovanou či N,N-(dialkyl)-alkylenaminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, alkylsubstituovanou heterocyklylkarbonylovou, heterocy klylkar bony laiky lovou substituovanou alkylovou skupinu, di^lkylaminosubstituovanou acylaminoalkylovou skupinu a aminokyselinové postranní řetězce, odvozené od argininu, asparaginu, glutaminu,

S-me thy Icy štělnu,“^_mě’thio hih'u‘ a od povídajícího sulfoxidu a od povídajících sulfonových derivátů, glycinu, leucinu, isoleucinu, allo-isoleucinu, terč.-leucinu, norleucinu, fenylalaninu, tyrosinu, tryptofanu, prolinu, alaninu, ornithinu, hissjidinu, glutaminurn valinu, threoninu, šeřinu, kyseliny asparagové, |>-kyanaianinu ^a sllothreoninu, dále od alynylových a heterocyklylkarbonylových, aminokarbonylových derivátů, látek s amidovou skupinou, mono- nebo dialkylaminokarbonylovou, mono- nebo diatylaminokarbonylovou, alkylarylaminokarbonylovou, diarylaminokarbonylovou, mono- n^bo diacylaminokarbonylovou

-45aromatickou nebo alifatickou skupinou, nebo ze skupiny substitue tů, případně alkylovou skupinou substituovaných, jako jsou skupiny aminové, karboxylové, hydroxylove, merkaptoskupiny, mononebo dialkylaminoskupiny, mono- nebo diarylaminoskupiny, alkylarylaminoskupiny, mono- nebo diacylaminoskupiny, alkoxylové, alkenoxylové, aryloxylové, thioalkoxylové, thioalkenoxylové, thioalkinoxylové, thioaryloxylové a heterocyklylové.

2/3

Výhodné sloučeniny vzorce T -(J-T -) -L-X mají strukturu

kde G znamená jednu až šest methylenových skupin (CH^) s tím, vy zna cen kde dále T že vodík na jedné, ale pouze jedné ze skupin CHg, který je jako ”G” je nahrazen seskupením -(CIL·) -amido-T^ 2 4 z c a Ίν jsou organické skupiny vzorce °1-25'·^!Ο-9°Ο-9^.^Ρ^ s tím, že součet

Λ + dostačuje k uspokojení jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, amido skuoins má vzorec 0 0 il ___ -N-C- nebo -C-lr r^x kde R^P znamená vodík nebo alkylovou skupinu s jedním až deseti atomů uhlíku, c znamená celé kladné číslo od 0 do 4 a n znamená celé kladné číslo od 1 až do 50 a to tak, že je-li 1 z n větší než 1, , pak se volí G, c, amidoskupina, R a T vzájemně nezávisle.

Podle dalšího výhodného provedení má sloučenin^ vzorce T²-(J-T³-)_n~L-X strukturu:

-46·· 9 ·♦··

I · 9 9 · ··· · ► 9 9 ί

9 99

99 τ

amid ο (0¾’ο

Τ'

•Λ kde Τ znamená organickou skupinu vzorce C _?ι_ΙΤθ__ο0θ_οΗ^ F a to tak, že součet + ^'dostačuje k uspokojení všech jinak nenasvcenvch vazeb na atomech uhlíku, dusíku e kyslíku, dále 5 kde T znamená terč.„amin nebo kvart.amoniovou skupinu nebo zbytek organické kyseliny, m znamená celé kladné číslo od O do 49 8 T^c, Tr\ L a X ma jí významy, uveoenv jak zde ji z. byly

Další výhodná skupina sloučenin vzorce T -(J-T -) -1-Xmá tuto strukturu:

T

nekde znamená organickou skupinu vzorce F^ a to tak, že součet +\P je dostačující k uspokojení všech jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, T^ znamená terč.-amin nebo kvart.amoniovou skupinu či zbytek organické kypeliny, m je celé kladné česlo od 0 do 49, a 9c , T⁴, c, R¹, amidoskupina, L a X mají významy, jak zde již byly dříve uvedeny.

• · · • ·· ····«·· · ·

-475

Ve výše uvedených strukturách se skupinou T má seskupění -amido-T s výhodou jednu z dále uvedených struktur, a ty se pohodlně připravují reakcí organických kyselin a volnou aminoskupinou či aminoskupínámi, jak jsou na zbytku ”G:

HC-(C il

-NHC

II o

l“^C10

\ ~ (^Gl”^C10 ) ⁹

-ΗΝΟ_<

u °<^C2-^C10^^N )C.

-HNC-(Co-Cio)

-NHC-(_Cl-C₁₀

O

^cicA pokud výše uvedené sloučeniny obsahují skupinu T a skupina G” má volnou karboxylovou skupinu (nebo odpovídající reaktivní derivát), pak dále uvedené výhodné seskupení -amido-T^ lze běžně připravit reakcí vhodného organického aminu s volnou karboxylovou skupinou na seskupení G:

♦ ' ’·< ·· ·· ·» ··

-48• · · · · · · · « ··· ···« ·· ·· ·· ·· ^(Cl-^C10)

N •0_ΝΗ-(0_ο-0_ΊΛ)-Η it 2 10' «

(c_r ^ci₀)

-CNH-(C_rC_l0)-. O ¹

-C-N Ií /“λ \ZX /1

L·

Ve třech výhodných provedeních dle tohoto vynálezu má seskupení T_L-M0I dále uvedené struktury:

(C₁-C_w)-0D!í-3 ^z-0H am^do

t βί,0 kde τ a T⁴ znamenají organická seskupení vzorce °1-25^ΗΟ-9°ο_9§(e-3)Wu^př ^ΣΓ ^{a t0 tak}’ ^{že so}’ j® dostačující k uspokojení všech jinak nenasycených vazeb atomů uhlíku, dusíku, kyslíku, síry a fosforu, kde dále G znamená skupenu (°¾ j_{eden Q} p_0Uze jeden vodík methylenové skupiny ve smyslu G je nahrazen seskupením -(CHg)_c-amido-T^7 amido-skupína má vzorec

Η

-N-Cɹ nebo -C-NR¹

R znamená vodík nebo alkylovou skupinu s jedním až deseti atomy uhlíku, c je celé kladné číslo v rozsahu od 0 do 4, ”^C2^_^iO^{n znamena} hyarokarbylenovou skupinu se dvěma až deseti atomy uhlíku, ODN-3'-0H” znamená fragment nukleové kyseliny s koncovou 3'-hydroxylovou skupinou (tedy třeba fragment nukleové kyseliny, navázaný na (C^-C-^q) na jiném místě, než je 3''-koncovka fragmentu nukleové kyseliny, a n znamená celé kladné číslo -v rozsahu 1 až 50, a to tak, ze^n je vetší než 1, ''pokud' pak významy G, c amido, R·¹ a jsou voleny nezávisle. Je výhodné, nejsou-li 3 heteroatomy vázány na jediný atom uhlíku.

Ve výše uvedených strukturách, jež obsahují seskupení

1 ,*, s *

T -G-(=O)-N(R ) se může tato skupina vytvářet reakcí aminu vzorce HN(R^)- s organickou kyselinou, a to některou z dále uvedených, které jsou uvedeny pouze jako příklady a v žádném případě nejsou vyčerpávajícím seznámen potenciálních orggnických kyselin. Tedy kyselina mravenčí, octová, propiolová, propionová, • · • · » 4 » 4 • 9

-50fluoroctová, 2-butinová, cyklopropankarboxylová, máselná, methoxyoctová, difluoroctová, 4-pentinová, cyklobutankarboxylová, 3,3-dimethylakrylová, valerová, N,N-dimethylglycin, N-formyl-Gly-OH, ethoxyoctová, (methylthio)-octová, pyrrol-2-karboxylová, 3-furoová, isoxazol-5-karboxylová, trans-3-hexenová, trifluoroctová, hexanová, Ac-Gly-OH, 2-hydroxy -2 -met hylmá selná, benzoová, nikotinová, 2-pyrazinkarboxylová,

1-methy1-2-pyrrolkarboxy lová, 2-cy klopěnten-l-ootová, cyklopentyloctová, (S)-(-)-2-pyrrolidon-5-karboxylová, N-methyl-L-prolin, heptsnová, Ac-b-Ala-OH, 2-ethyl-2-hydroxymáselná, 2-(2-methoxyethoxy)-octová, p-toluová, 6-methylnikotinová, 5-methyl-2-pyrezinkarboxylová, 2,5-dimethylpyrrol-3-karboxylová, 4-fluorbenzoová,

3,5-dime thylisoxazol-4-karboxylová, 2-cy klopě nt^lpropionová, oktanová, !:,N-áimethylsukcinaminová, fenylpropilová, skořicová,

4-ethylbenzoová, p-anisová, 1,2,5-trimethylpyrrol-3-karboxylová,

3-fluor-4-methy1benzoová, Ac-DL-propargylglycin, 3-(trifluormethyl)-máselná, 1-piperid.inpropionová, N-acetylprolin, 3,5-difluor· benzoová, Ac-L-Yal-OH, indol-2-karboxylová, 2<-benzofurankarboxylová, benzotriasol-5-karboxylová, 4-n-propylbenzoová, 3-dimethylaminobenzoova, 4-ethoxybenzoová, 4-(methylthio)-benzoová,

N~(2-furoyl)-glycin, 2-methylthio)-nikotinová, 3-fluor-4-rae thoxybenzoová, Tfa-Gly-OH, 2 naftoová, chinaldová, i n d e n -2 - k a ?? 'o o xy 1 o v á, 2- c.hinoxalin karboxy lová, boxylová, 2,3,6-trifluorbenzoová, N formyi-LAc-L-Ile-OH, 3-methyll-methyl-indol-2-karlet-OTí, 2-[2-(2—methoxy ethoxy)-etho xy]-octová, 4-n-butylbenzoová, K-benzoylglycin,

5-fluorindol~2-karboxylová, 4-n-propoxybenzoová, 4-acety1-3,5dime thyl-2-pyrrolkar'boxylová, 3,5-dimethoxýbenzoová, 2,’6-ďimethoxynikotinová, cyklohexanpentanová, 2-naftyloctová, 4-(lH-pyrroll-yl)-benzoová, indol-3-propionová, 51-trifluormethylbenzoová,

5-methoxyindol-2-ka.rboxylová, 4-pentylbenzoová, Bz-b-Ala-OH,

4-diethylaminobenzoová, 4-n-butoxybenzoová, 3-methy1-5-trifluorme thylisoxazol-4-karboxylová, (3,4-dimethoxyfenyl)-octová, 4-bifenylkarboxylová, pivaloyl-Pro-OH, Oktanoyl-Gly-OH,(2-neftoxy)octová, indol-3-máselná, 4-( trifluormethyl)-fenyloctová, 5-methoxyindol-3-octová, 4-(trifluormethoxy)-benzoová, Ac-L-Phe-OH,

I · ·· · '· *

-514-pentyloxybenzoová, Z-Gly-OH, 4-karboxy-N-(fur-2-ylmethy1)pyrrolidin-2-on, 3,4-diethoxybenzoová, 2,4-dimethyl-5-ethoxykarbonyl-pyrrol-3-karboxylová, N-(2-fluorfenyl)-sukcinaminová,

3,4,5-trimethoxybenzoová, N-fenylanthranilová, 3-fenoxybenzoová, nonanoyl-Gly-OH, 2-fenoxypyridin-3-karboxylová, 2,5-dimethyl-lfenylpyrrol-3-karboxylová, trans-4-(trifluormethyl)-skořicová, (5-methy1-2-fenyloxazol-4-yl)-octová, 4-(2-cyklohexenyloxy)-benzoová, 5-methoxy-2-methylindol-3-octová, trans-4-kotininkarboxylová, Bz-5-aminovalerová, 4-hexyloxybenzoová, N-(3-methoxyfenyl)sukcinaminová, Z-Sar-OH, 4-(3,4-dimethoxyfenyl)-máselná, Ac-o-řluorDL-Phe-OH, N-(4-fluorfenyl)-glutaramová, 4 '-ethyl-4-bifenylkarboxylová, 1,2,3,4-tetrahydroakridinkarboxylová, 3-fenoxyfenyloctová, N-(2,4-difluorfenyl)-sukcinamová, N-deka noyl-Gly-OH, (+)-6-methoxycú methylTr2-naftalenoctová, 3-(trifluormethoxy)-skořicová, N-formylDL-Trp-OH , (R)-(+)- cú-methoxy- <\-(trifluormethyl)-fenyloctová, Bz-Dl-Leu-OH, 4-(trifluormethoxy)-fenyloctová, 4-heptyloxybenzoová,

2,3,4-trimethoxyskořicová, 2,6-dimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5trimethoxyfenyl)-propionová, 2,3,4,5,6-pentafluorfenoxyoctová,

N-(2,4-difluorfenyl)-glutaramová, N-undekanoyl-Gly-OH, 2-(4-fluorv benzoyl)-benzoová, 5-trifluormethoxyindol-2-karboxylová, N-(2,4difluorfenyl)-diglykolamoizá, Ac-L-Tro-OH, Tfa-L-fenylglycin-OH,

3-jod benzoová, 3-(4-n-pentylb.enzoyl)-propionová, 2-fenyl-4-chinolinkarboxylová, 4-oktyloxybenzoová, Bz-L-Met-OH, 3,4,5-triethoxybenzoová, N-lauroyl-Gly-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-benzoová, Av-5-methyl-DL-Trp-0H, 2-jodfenyloctová, 3-jodmethylbenzoová,

3-(4-n-hexylbenzoyl)-propionová, N-hexanoyl-L-Phe-OH, 4-nonyloxybenzoová, 4'-(trifluormethyl)-2-bifenylkarboxylová, Bz-L-Phe-OH, N-tridekanoyl-Gly-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-fenyloctová,

3-(4-n-heptylbenzoyl)-propionová, N-heptanoyl-L-Phe-OH, 4-decylbenzoová, N-(X, -trifluor-m-tolyl)-anthranilová, 4-(2-hydroxyhexafluorisopropyl)-benzoová, N-myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-oktylbenzoyl)-propionová, N-oktanoyl-L-Phe-OH, 4-undecyloxybenzoová,

3-(3,4,5-trimethoxyfenyl)-propionyl-Gly-OH, 8-jodnaftoová, N-pentadekanoyl-Gly-OH, 4-dodecyloxybenzoové, N-palmitoyl-Gly-OH, a N-stearoyl-Gly-OH.

Tyto uvedené organické kyseliny jsou dostupné od Advanced Chem,Tech., ,Louisville, KY;$achem Bioscience Unc., Torrance, CA;

, · · · !· ···· « • ·

Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, GA; Farchan Laboratories lne., Gainesville, FLj Lsncaster Synthesis, Windham NH; a MaySridge Chemical Company /c/o Ryan Scientific), Columbia, Sc. V katalogách těchto výrobců jsou zkratky, použité výše pro identifikování kyselin.

f) Kombinační chemie jako postup pro přípravu značených vzorků.

Kombinační chemie je typ chemické strategie, která vede k produkci velkého množství chemických vzorků (viz například PCT přihláška WO 94/08051. Tyto prokombinované vzorky se dají použít jako značené složky pro identifikování molekul, těšících se zájmu (MOI). Kombinační chemie lze definovat jako systematické a opakující se kovalentní spojení různých základních bloků různých struktur vzájemně mezi sebou, to za vzniku velkého množství různých molékulových svazků. Základní bloky mohou být nejrůznějších forem, jak přírodních, tak i syntetických, jako jsou nukleofily, elektrofily, dieny, alkylační nebo acylační činidla, diaminy, nukleotidy, aminokyseliny, cukry, lipidy, organické monomery, syntetické látky i jejich kombinace. Chemické reakce, použitelné k výstavbě zmíněných základních bloků mohou zahrnovat alkylace, acylace, oxidace, redukce, hydrolyzu, substituce, eliminace, adice, cyklizace, kondenzace apod. Tímto postupem se dají připravit molekulové svazky sloučenin, které lze.pokládat za oligomery, ne-oligomery nebo jejich kombinace. Pokud se oligomerů týká, pak sloučeniny mohou být vě-tore-né-,—nevětvené—něho^-cykTickéTuJš ko př í kl ε d y oligomer nich struktur, které lze připravit kombinačními postupy, lze uvést oligopeptidy, oligonukleotidy, oligosacharidy, polylipidy, polyestery, polyamidy, polyurethany, polymočovinové deriváty, polyethery, póly(fosforové deriváty), například fosfáty, fosfonáty, fosforamiay, fosfonamidy, fosfity, fosfinamidy atd a polyóeriváty s obsahem síry, jako jsou odpovídající sulfony, sulfonáty sulfity, sulfonamidy, sulfenamidy atd.

Jednám ze společných typů oligomerní kombinační sbírky je kombinační peptidová sbírka. Poslední čerstvá inovace chemie • ·

-53peptidů a molekulární biologie umožnily vznik sbírek desítek až stovek milionů různých peptidových sekvencí, které třeba připravit ještě a. použít. Takové sbírky je možno rozdělit do tří širokých kategorií. Jedna z nich zahrnuje sbírky chemickou syntézou připravených rozpustných peptidů bez vazby na podklad, viz např. Houghten a spol., Nátuře 354. 84 (1991). Druhá kategorie se týká sbírek chemicky připravených peptidů, vázaných na podklad, vesměs pevný, jako jsou plastové jehly, kuličky z pryskyřic nebo bavlna, viz Geysen a spol., Mol.Immunol. 23,

709 (1986), dále Lam a spol., Nátuře 354. 82 (1991), Eichler a Houghten, Biochenistry 32, 11 035 (1993). V těchto dvou kategoriích jsou stavebními bloky typicky L-aminokyseliny,

B-aminokyseliny, nenasycené aminokyseliny nebo směsi či kombinace těchto látek. Třetí kategorie využívá přístupy cestou molekulární biologie k přípravě peptidů nebo proteinů na povrchu vláknitých částeček nebo plasmidů, vis Scott a Creig, Curr.Opinion Biotech. 5., 40 (1994). Srnírky rozpustných peptidů bez vazby na podklad jsou vhodné pro celou řadu aplikací, čítaje v to značené složky. Dostupný repertoár chemických růzností a odlišnosti ve sbírkách peptidů se dá rozšiřovat použitím v

stupňů, jako je napřijlad permethylace, vis Ostresh a spol.,

Proč.Nati.Acad.Sci., USA 91, 11 138 (1994).

Jsou možné četné varianty peptidů v kombinačních sbírkách, kdy se základní peptidová kostra modifikuje a/nebo se amidové vazby nahrazují mimetickými skupinami. Amido-mimetické skupiny, kterých lze využít, zahrnují močovinové deriváty, urethany a karboxyjnaihy_l_e.nov-é-_sku-pi-ny-.—R-e-s4;-r-u-k-t-uril-i-z-a-ee—z-ákl-a-d-ní—so-stry⁷tak, že se mění postranní řetězce na dusíkovém atomu amidové skupiny každé z aminokyselin, ponejvíce nikoli jinde, než na 3X _uhlékovém atomu, vedou ke sbírkám sloučenin, označovaných jako peptoidy, viz Simon a spol., Proč.Nati.Acad.Sci USA 89, 9367 (1992).

Dalším běžným typem oligomerní kombinační sbírky je kombinační sbírka oligonukleotidů, kde stavební bloky jsou určité • · ·· ·· • rf · »

• rf · · I • · 1 • rf ··

-54formy přírodních nebo nenasycených nukleosidů nebo derivátů polysacharidů, čítaje v to látky, kdy vazby fosforu mohou se nahradit různými organickými nebo anorganickými skupinami a kyslík v etherových vazbách je nahrazen dusíkem nebo sírou, viz Schneider a spol., Biochem.J. 34. 9599 (1995); Breier a spol., J.Med.Chem. 38, 344 (1995); Frank, J.Biotechnol. 41,

259 (1995); Schneider a spol., hubl. PCT 942 052; Ecker a spol., Nucleic Acids Res. 21, 1853 (1993).

Nověji byly ještě popsány postupy přípravy kombinačních sbírek neoligomerních sloučenin s malými molekulami,, viz DeWitt a spol., Proč.Nati.Acad.Sci., USA 90, 690 (1993); Proč. Nati.Acad.Sci., USA 91, 4708 (1994). Struktury, které jsou vhodné Zapracování do látek ve sbírkách sloučenin s nízkou molekulární hmotností zahrnují velký počet organických molekul, jako jsou např. heterocyklická, alicyklická, alifatické sloučeniny, steroidy, antibiotika, enzymové inhibitory, ligandy, hormony, léky, alkaloidy, opiové látky, terpeny, porfyriny, toxiny, katalyzátory, jakož i jejich kombinace.

g) Specifické postupy pro kombinační syntézy značených složek

Bále jsou popsány dva postupy přípravy a použití různých sad MS-značených složek s obsahem aminoskupin. V obou případech se používá při syntéze pevná fáze, aby se tím umožnilo současné paralelní syntetizování velkého počtu funkčních skupin značených složek za použití techniky kombinační chemie. Při prvém z postupů^— pŤíp^ne^tepěhí^-žňaciíe-šTozky od oligonukleotidů má za následek uvolnění karboxylamidové skupiny. Při druhém postupu vzniká štěpením značené složky karboxylové kyselina. Chemické složky, jakož i vazebné podíly, použité při těchto postupech, jsou zkracovány takto:

R

BMOC

AU = pryskyřice (resin) = fluorenylmethoxykarbonylová chránící skupina, = allylová chránící skupina, • · · · · ? ; ·..· • · ··· * · · · » « · · · · · ··· · 2 · · · · · · »· ·· ·· ·· ··

-55COOH conh₂ νη₂

OH

CONH

COO

NHg-kruh-OOOH

OH-lMeO-COOH

0H-2-Me0-C00H

NH_Q-A-COOH

Xl...Xn-COOH oligol....oligo(b) HBTU

- karboxylové skupina

- karboxamidová skupina, = prim.aminoskupina = hydroxylová skupina, = amidová vazba = esterová vazba = 4 j( A-e mino)-2,4-dimethoxybenzyl(fenoxymáselná kyselina (vazba kruhu) = (4-hydroxymethyl)-fenoxymáselná kyselina = (4-hydroxymethy1-3-methoxy)-fenoxyoctová kyselina = aminokyselina s funkcí alifatického nebo aromatického aminu v postranním řetězci = sada různých karboxylových kyselin ..tedy ..n...s jednotnou molekulární hmotností, = sada n oligonukleotidů

- O-benzotriazol-l-yl-Ν,Ν,Ν^Z,N ^z-tetramě thyl uroniumhexafluorfosfát

Sekvence stupňů při prvém postupu je tato:

0K-2Me0-C0NH~R

PMOC-NH-kr uh-C 00H-2Me 0-C ONH-R PM0C-NH-kruh-C00-2Me0-C0NH-R .

>iperidin (odstranění HlvíOC) lhí₂-kruh-C00-2he0-C0NH-R

FMOC-NH-A-COOH; spojení (např.HBTU)

PMOC-NH-A -C ONH- lír uh-C 0 0-2 Me 0-C ONHtR piperidin (odstranění FMOC) WH₂-A-CONH-kruh-COO-2MeO-COHH-R i lili ctíózdělení na n alikvotních částí navázání na n různých kyselin Xl...Xn-COOH

-56pokr

XI.. ,Xn-CONH-A-CONH-kruh-COO-2MeO-CONH-R

I odštěpené značených funkčních skupin z pryskyřice pomocí 1% kyseliny trifluoroctové XI----Xn-CO-NH-A-GONH-kruh-COOH spojení s n podíly oligo (oligo 1...oligo (n) např.via Pfp-esterů

XI.. .Xn-CONH-A-GONH-kruj-CONH-oligpl.. .oligo(b) shromáždění značených oligo-podílů; provedení sekvenční reakce; oddělení fragmentů s různými délkami po sekvenční reakci (nspříkled vysokotlakovou kapalinovou chromatografií nebo elucí; štěpení značených podílů z vazebných čásťí pomocí 25% až 100% kyseliny trifluroctové

XI... _oXn-00NH-A-C0NH i

analýza hmotnostní apektrometrií v

Sekvence stupňů při druhém postupu je tato OH-lMeO-COO-All

Φ PMOC-NH-A-COOH, spojení (naúř.HBTU)

PMOC-NH-A-COO-lMe0-G00-A 11

Jz palladium (odstranění ellylové skupiny) PMOG-NH-A-COO-lMeO-OOOH i/ ψ ’ OH-2 MeO-C ONH-R, spojení (např.NBTU)

HMOC-NH-A -C 00-lMe 0-C 00-2 -MeO-C ONH-R piperidin (odstranění PMOC)

NHg -A -C 00-lMe O-G 00-2 Me 0-C ONH-R

Φ* rpzdělení na n alikvotních částí navázání na n různých kyselin Xl....Xn-COOH

XI o.. .Xn-GONH-A-GOO-lMeO-COO-2MeO-CONH-R íiiji odštěpení značených funkčních skupin z pryskyřice pomocí 1% kyseliny trifluoroctové ·· · Λ ·· · ·

XI....Xn-CONH-A-COO-lMeO-COOH ί Η ί navázání na n podílů oligo (oligo l...oligo(a) např.via Pfp-esterů

XI... .Xn-CONH-A-COO-lMeO-CONH-oligol... .oligo(n) shromáždění značených oligo-podílů; provedení sekvenční reakce; oddělení fragmentů s různými délkami po sekvenční reakci (například vysoko tlakovou chromatografií nebo elucí); štěpení značených podílů z vazebných částí pomocí 25% až 100% kyseliny trifluoroctové

XI....X n-0ONH-A_C 00H

X analýza hmotnostní spektrometrií \'

2, Vazebné složky

Výraz vazebná složka, jak se zde používá, znamená buď přímou kovalentní vazbu nebo organickou chemickou skupinu, jež se použije ke spojení značené složky (T) na zájmovou molekulu (MOI) pomocí kovalentních chemických vazeb .Dále pak, pokud se přímé vazby týká, pak jedna či více vazeb ve vazebné složce je štěpitelná za podmínek, jež dovolují uvolnění T (jinými slovy odštěpení) ze zbývající T-L-X-sloučeniny (čítaje v to složku MOI^, Značená variabilní složka, přítomná v T, má být stálá za podmínek štěpení. S výhodou se má štěpení provést rychle; to znamená za několik málo minut, s výhodou během 15 sekund__ či ještě méně«,

Obecně řečeno: použije se vazebná složka ke spojení každé značené složky z velké sady na ksýdou zájmovou molekulu MOI, sada je v tomto případě podobného rozsahu. Typicky je jediná kombinace zlacená složka-vazebné složka navázána na každou komponentu MOI )vzniknou různé s četné T-L MOI), ale v některých případech více než jedna jediná kombinace značená složka-vazebná složka se může napojit na každou individuální MOI za vzniku různých (T-L) -MOI. Při jiném provedení tohoto • φ • · · φ φ

—58— vynálezu se dvě nebo i více značených složek napojí na jedinou vazebnou složku prostřednictvím většího počtu nezávislých míst na vazebné složce a takto vybavená kombinace většího počtu značených složek s vazebnou složkou se pak naváže na individuální MOI za vzniku různých (T) -L-MOI.

Po četných manipulacích se sadou značených MOI se použijí specielní chemické ε/nebo fyzikální podmínky ke štěpení jedné či více kovalentních vazeb vazebné složky, což vede k uvolnění značených složek z MOI, Štěpitelné vazba či takové vazby mohou, ale také nemusí být některými z týchž vazeb, které vznikly při spojení složek značená, vazebná a MOI dohromady. Ráz vazebné složky z větší míry bude určovat podmínky, za kterých je možno štěpehá uskutečnit. Dle toho jsou vazebné složky dány podmínkami štěpení,, aby byly k tomuto úkonu vhodné. Pokud je vazebná složka fotolabilní (například tedy náchylná ke štěpení po vystavení gktinickému záření), pak takovou složku L lze označit jako L'¹*. Podobně další označení L^zás, l^(o), L^(r), L^(enz)

L a L mohou být použita ve spojení s vazebnými složkami, které jsou zvláště vhodné k odštěpení působením kyselin, zásad, oxidací, redukcí, enzymově, elektrochemickou oxidací či redukcí, za zvýšené teploty nebo thiolovou výměnou v tom kterém případě.

Určité typy vazebných složek jsou labilní za jediného typu podmínek štěpení, jiné jsou labilní za podmínek několika typů' štěpení, Dále pak navíc vazebné složky, které jsou schopné vázat vetší počet značených složek zs vzniku struktur typu (T) -L-MOI, mohou být každá v různých místech značené složky labilnější za určitých podmínek štěpení. Tak například _v___·. · .

-p-ří-paďě—va^Une^Tózky s navázanými dvěma značenými složkami může být jedna labilní pouze v alkalickém prostředí, druhá pouze za podmínek fotolyzy.

Vezebná složka, použitelná při postupu dle tohoto vynálezu, má mít několik schopností:

1) Má mít schopnost vázat se chemicky (L^, Chemical handle), čímž se může napojit na MOI,

2) má druhou, oddělenou chemickou možnost (L^), pomocí

-59kfeeré se naváže značená složka na vazebnou složku. Pokud se větší počet značených složek naváže na jedinou vazebnou složku za vzniku struktury (T) -L-MOI, pak pro každou značenou složku existuje oddělené chemické zacházení,

3) vazebná složka mé být stabilní za všech manipulací, jímž je vystavena s výjimkou těch podmínek, které dovolují odštěpení skupiny’, obsahující značenou část od zbytku sloučeniny, čítaje v to MOI, Takže vazebná složka je stabilní při navazování značené složky na ni, navázání vazebné složky na

MOI a za všech manipulací, kdy MOI obsahuje jak značenou složku, tak i vazebnou složku (T-L), navázané na MOI,

4) vazebná složkq nemůže podstatněji vadit při manipulacích s MOI, jsou-li na tuto složku navázány složky značená a vazebná (T-L). Tedy, je-li složka T~L navázána na oligonukleotid, nesmí složka T-L podstatněji vadit při jakýchkoli hybridizačních nebo enzymových reakcích, prováděných s oligonukleotidem. Podobně je_li T-L názána na antilátku, nesmí podstatněji rušit při zjištovani antilátky antigenem.

5) Odštěpení značené složky od zbývající části sloučeniny 'se provádí za vysoce kontrolovaných podmínek, to za použití postupů fyzikálních nebo chemických, které nijak nepříznivě neovlivňují možnost zjištění značené složky.

Po každý druh vazebné složky platí, že je výhodné, aby byl navázatelný na velký rozsah struktur MOI e že velmi různé značené složky mohou být navázány na vazebnou složku. Taková pružnost je výhodná, protože dovoluje použít sbírku konjugátů T -L, jedno u j i ž __p.ř-i-Or a-v-e-n-ýe-h-i—k— pou^iťí^-s^d sTš imi jih ými sad smi

MOI.

Jak to již bylo výše uvedeno, má výhodná vazebná složka vzorec ^Lh“^Ll-L²-L³~L_h kde L^ znamená reaktivní použitou složku (rea.ctive handle),kterou lze využít pro navázání vazebné složky na značenou složku a reagu jící molekulu, těšící se zájmu. L^c je zásadní částí vazebné složky, protože ovlivňuje labilitu vazebné složky. L a L jsou přípádné vhodné skupiny, jež účinně slouží k oddělení L od L^.

φ «· fc· fcfc ·· ·· »· · « · fc · fc · · · « fc · fcfcfcfc fcfcfcfc

-60ΐΛ (jež se nalézá blíže k T než L³) slouží k oddělení T od potřebně labilní části L². Takové oddělení může být užitečné, když se za podmínek štěpení získávají zvláště reaktivní podíly (například volné radikály), které mohou způsobit chaotické a nahodilé změny ve struktuře části, obsahující T. Jelikož místo štěpení je dále odděleno od složky, obsahující T, sníží se nahodilost, že by mohl vzniknou\reaktivní podíl v místě štěpení a narušil by strukturu podílu, obsahujícího T, Také protože atomy v ΐΛ budou typicky obsaženy v podílu, obsahujícím T, mohou takové atomy ΐΛ ovlivňovat žádoucí kvalitu podílu, obsahujícího T. Například je-li podílem, obsahujícím T složka, obsahující T^ras a stericky bráněný amin je žádoucna přítomný jako část struktury podílu, s obsahem T^ms (tedy aby byl použit jako MSSE), může být stericky chráněný amin přítomný v labilní části L~,

V jiných případech mohou být L a/nebo If přítomny ve vazebné složce jen proto, že komerční dodavatel vazebné složky poskytuje vazebnou složku oouze ve formě, mající takovou ΐΛ a/nebo Ir skupinu. V takovém případě není na škodu použít vazebné složky se skupinami L a/nebo L (pokud tyto skupiny nevadí při štěpných reakcích), i když nijak nepřispívají k případným výhodám provedení při použití sloučenin, které je obsahují. Takže tento vynález dovoluje, aby skupiny L“ a/nebč 3

L byl;/ přítomny ve-vazebné složce.

Σ 3 X XZ X X

Skupinami L a/nebo L mohou být přímé vazby (v kterémžto případě tam skupina ve skutečnosti není), skupiny hydro karbyleno vé (např. alkyiénově, arylenové,_cykl^al-ky-l^-noy-é-ařá-)^<-0>==hy-Qr'o= ^:karby lenové’ ('například skupiny vzorců -O-CH^-, -O-CHqVHÍCH^ )~ atd, nebo hydrokarbylen-(p-hydrokar bylenové^ , kde w je celé kladné číslo v rozsahu od 1 do asi 10, například tedy

-CH₂-0-Ar-0H₂-(O-CH₂CH_g)₄- atd.

V souvislosti se syntézou na pevné fázi byl zaznamenán velký počet literárních údajů v souvislosti s vazebnými složkami labilními za určitých reakčních podmínek. Při provedení typické syntézy na pevné fázi se takový pevný podklad váže labilním vazným činitelem na reaktivní místo a molekula, jež se má synteticky připravit, se generuje na reaktivním místě. Jakmile byla • 99

9

9 9

-61• 9 • · * 9 « ····

molekula dokonale syntetizována, pak konstrukce pevného podkladu s vazebnou složkou a molekulou se vystaví podmínkám štěpení, za kterých se molekula uvolní od pevného podkladu. Labilní vazebná činidla, jež byla vyvinuta k použití v této souvislosti (nebo která by mohla být použita) se mohou snadno použít jako vazebná činidla dle tohoto vynálezu.

Llloyd-Williams P. a spol. v článku Convergent Solid-Phase

Peptide Synthesis Tetrahedron Report č.347, 49(48), 11065-11133 (1993) velmi důkladně diskutují o vazebných složkách, labilních za aktinického záření (např.fotolyzou) jakož i o podmínkách štěpení kyselinami, zásadami a i jinak. Další zdroje informací o labilních vazebných složkách lze získat snadno.

Jak to již konečně bylo uvedeno zde výše, různé znaky a charaktery vazebných složek budou rozhodujícími _za různých a lišících se podmínek štěpehí, at již fyzikálními nebo chemickými postupy. Jako příklady podmínek, za nichž lze štěpit různé typy vazebných složek, lze uvést reakce v kyselém či alkalickém prostředí, oxidace, redukce, fluoridy, thiolovou výměnu, fotolyzu a enzymové reakce.

Příklady štěpitelných vazebných složek, jež vyhovují obecným kriteriím pro charakter vazebných složek, jak jsou zde uvedeny výše, jsou obeznámeným dobře známé a zahrnují tyto látky, jak jsou obsaženy v katalogu od Pierce (Rockford II Patří sem: .

ethyle n-glykobis-r( sukcinimidyl-τ.- jantaran) (EGS), aminové reaktivní zesítující činidlo, štěpitelbé hydroxylaminem (1M, 37°C, 3 až 6 hodin),

).

disukcinimidyl-vínan (DST), a sulfo-DST, což jsou aminová zesítující reaktivní činidla, štěpitelná roztokem 0,015'. M jodistanu sodného, bis-Í2-(sukcinimidyloxykar.bonyloxy)-ethyl\-sulfon (BSOCOES a sulfo-BSOCOES, což jsou aminová zesítující činidla, štěpitelná působením zásad (pH 11,6), l,4-di-j3 '-(2 '-pyridy|.dithio(propionamido)j -butan (DPDPB)

V • ·

-62pyridyldithiol, jako zesítovač, který je štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí,

N-^4-(p-azidosalicylamido)-butylj-3 '-(2 '-pyridyldithio )-propionamid APDP), pyridyldithio, jako zesív tovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí, bis-^p-(4-(azidosalicylamido)-ethy^ -disulfid, fotoreaktivní zesítovač, který je šzěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí,

N-sukcinimidyl-(4-azidofenyl)-l,3 '-dithiopropionát (SADP), fotoreaktivní zesítovač, který je štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí,

Sulfosukcinimidyl-2-(7 -azido-4-methylkumarin-3-acetamido)ethyl-1,3 '-dithiopropionát (SAED), fotoreaktivní zesítovač, který je štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí, sulfosukcinimidyl-2_T(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-l,3 ' dithiopropionát (SAND), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí.

Dalšími příklady štěpitelnýcz vazebných složek a podmínek při štěpení, jak je lze použít při uvolňování značených slovek, jsou tyto: silylovou zesítující skupinu lze štěpit fluorem nebo za' podmínek kyselého štěpeníp 3-, 4-, 5- nebo 6-substituovaná

2-nit-robenzyloxy- nebo 2-, 3-, 5- nebo 6-substituovaná 4-nitroxz benzyloxy-zesítující skupina se může štěpit zdrojem fotonů (fotolyzou). Zesítující 3-, 4-, 6- nebo 6-substituovanou-2-atkoxyfenoxylovou nebo 2-, 3-, 5- nebo 6-substituova.nou 4-alkoxyfenoxylovou zesítující skupinu lze štěpit oxidačně působením sloučeniny vzorce Ce(KIM)₂(L:Q^)r. Zesítovač tvou NCQO (urethan) se dá štěpit působením hydroxidů, kyselin, nebo redukčně hydridem hlinitolithným. 3-PentenyRovou, 2-butenylovou nebo 1-butenylovou zesítující skupinu lze odštěpit ozonem, směsí oxidu osmiČelého a jodistanových aniontů nebo oxidačně manganistanem draselným. Zesítující skupinu 2-(3-, 4- nebo 5-substituovanou-furylJ-oxylovou lze štěpit kyslíkem, bromem, methanolem nebo kyselinou.

0 * 0

0 •0 0 0 · 0 0 •0 ·· 00 —63—

Podmínky, za michž lze odštěpit další labilní vazebné složky zahrnuji tyto: terč.-alkylo^y-vazebné složky lze štěpit kyselinami, methyl(dialkyl)methoxylové nebo 4-substituované

2-alkyl~l,3-dioxolan-2-ylové vazebné skupiny lze štěpit značenou vodou H^0⁺, 2-silylethoxylové podobné skupiny lze štěpit fluorem nebo kyselinami, 2-(X)-ethoxylové skupiny, kde X inamená skupinu ketonickou, esterovou, amidovou, kyanovou, nitroskupinu, dále skupinu sulfidickou, sulfoxidovou a sulfonovou se dají štěpit v alkalickém prostředí, dále 2-, 3-, 4-, 5nebo 6-substituované benzyloxylové vszebné skupiny se mohou štěpit kyselinami nebo v redukčním prostředí, 2-butenyloxyvazebné skupiny se mohou štěpit působením (CgH^O)^RhCl(H), dále 3-, 4-, 5- nebo 6-substituované 2-bromfenoxylové vazebné skupiny je možno štěpit lithiem, hořčíkem nebo butyllithiem, methylthiomethoxylové vazebné skupiny se dají štěpit rtutnatými ionty, 2-(X)-ethyloxyskupiny, kde X znamená halogen, jsou štěpitelné zinkem nebo hořčíkem a 2-hydroxyethy1oxyskupiny se mohou štěpit oxidačně, například působením octanu olovičitého.

Výhodnými vazebnými skupinami jsou ty, které lze štěpit kyselinami nebo fotolyzou. Některé z vazebných skupin, labilních v kyselém prostředí, které byly popsány v souvislosti s -peptidovou syntézou na pevné fázi, jsou vhodné pro vázání značených složek na MOI. Některé z nich byly popsány nedávno v přehledné práci LLoyd-Williams-e a spol., Tetrahedron 49. 11065-11133 (1993). Jedním použitelným typem j sou va zebné - složky na podkladu p-alkoxybenzylalkoholových derivátů, z nichž dva jsou dostupné od Advanced Chem.Tech. (Louišville, KY).

Jsou to kyselina 4-hydroxymethylfenyloxyoctová a kyselina

4-(4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)-máselná. Obě tyto vazebné složky se mohou napojit na značenou složku využitím esterové vazby benzylalkoholu a na MOI, obsahuje-li aminoskupinu, pak amidickou vazbou, to s přihlédnutím ηβ karboxylovou kyselinu. Značené složky, vázané těmito molekulami, se mohou uvolnit z MOI použitím kyseliny trifluoroctové v různých koncentracích. Štěpěhí takových vazebných částí se projeví uvolněním karboxylové kyseliny na značene složce. Výsledkem štěpeni ··'

-64značených složek, navázaných těmito vazebnými složkami, jako je 2,4-dimethoxy-4'-(karboxymethyloxy)-benzhydrylamin se pro jeví uvolněním amidu karboxylové kyseliny na uvoněném značeném podílu; citovaná látka je dostupná od Advanced Chem.Tech. v FlvlOC-chráněné formě₀

Fotolabilní vazebné podíly, použitelné v této souvislosti, byly již také z největší části vyvinuty pro syntézu peptidů na pevné fázi, viz přehled LLoyd-Williams. Obvykle jsou založeny na 2-nifcrobenzy}.esterech nebo 2-nitrobenzylamidech. Dva příklady fotolabilních vazebných složek, které byly v poslední době uvedeny v literatuře, jsou kyselina 4-\4-(l-Fmoc-amino)^etc,yl)-2-methoxy-5-nitrofeno3>^,’J-butsnová, viz Holmes a Jones J.Org.Chem. 60, 2318-2319 (1995) a kyselina 3-(Tmoc-amino)-3-(2-nitrofenyl)-propionoví, viz Brown a spol., Molecular Diversity 1, 4-12 (1995). Obě vazebné složky lže navázat využitím karboxylové kyseliny na aminovou skupinu MOI. Navázání značené složkv na vazebnou složku se nrovede vytvořením amidu mezi karboxylovou skupinou značené složky a aminoskupinou na vazebné složce,, štěpení fotolabilních vazebných složek se obvykle provede ultrafialovým světlem (350 nm) za intenzit a dob, které jsou jinak známé. Rozštěpením vazebné složky se uvolní primární amidová skupina na značené složce. Jako příklady fotolabilních vazebných složek lze uvést nitrofenylestery glycinu, exo- a endo-2-benzonorborneylchloridy a methansulfonáty, dále kyselinu

3-(amino)-3-(2-nitrofenyl)-propionovou. Jako příklady enzymových štěpehí lze uvést použití esterág štěpících esterové vazby, nukleás, štěpících fosfodiesterové vazby, proteás, štěpících peptidová vazby atd.

Za výhodnou vazebnou složku lze uvést o-nitrobenzylové deriváty dále uvedeného obecného vhorce

kde jeden z uhlíkových atomů v postaveních a, b, c, d nebo e β β · O 5 9 • ······ • · · · · · ··· ···· ·· ··

1 je substituován skupinou -L -X,a L (tou je s výhodou přímá vazba) je na levé straně seskupení N(R^) ve výše uvedené struktuře. Taková vazebná složka může podlehnout selektivnímu foto-indukov₃nému štěpení vazby mezi uhlíkem, označeným a

Ί _ Ί a skupinou N(R ). Totožnost R není obvykle rozhodující pro štěpnou reakci, ale s výhodou se R¹ zvolí mezi vodíkem a hydrokarbylovou skupinou» Tento vynález zahrnuje také možnost, že ve výše uvedené struktuře se může nahradit -NÍR¹)- kyslíkem. Ve výše uvedené struktuře může být jedna či více z poloh b, c, d nebo e případně substituována skupinou alkylovou, alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxyláto vou nebo amidovou, kdeže tyto substituenty se nezávisle volí od případu k případu.

Další výhodnou vazebnou složkou s chemickou komponentou 1^ má tuto dále uvedenou obecnou strukturu

kde jedna či více z poloh b, c, d nebo e je substituována vodíkem, skupinou alkylovou, alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxylátovou nebo amidickou, R~ znamená vodík nebo hydrokarbylovou skupinu a R² znamená skupinu hydroxylovou, nebo skupinu, jež buď chrání nebo aktivuje napojení karboxylové kyseliny na další jinou část. Výhodnými skupinami, které aktivují karboxylovou skupinu při takovém spojování skupiny fluorkarbonové a hydrofluorkarbonové.

3_o Zájmová mooekula (MOI, molecule of interest)

Jako příklady zájmových molekul lze uvést nukleové kyseliny nebo jejich obdoby (například PNA), fragmenty nukleových kyselin, syntetické nukleové kyseliny či jejich fragmenty, oli·· —66 • ·· ·· • rf · · · · · · rf rf rf e φ 9 rf ♦ · rf · · · • · · · · · ··« ···< ·· ·· gonukleotidy (například DNA nebo RNA), proteiny, peptidy, antilátky či jejich fragmenty» dále receptory, receptorové ligandy, členy ligandových párů, cytokiny, hormony, oligosacharidy, syntetické organické molekuly, léky a jejich kombinace.

Výhodné MOI představují fragmenty nukleových kyselin. Z nich pak zvláště primární sekvence, doplňující sekvence, přítomné ve vektorech, kdy se vektor používá pro sekvencování báze. S výhodou je fragment nukleové kyseliny vázán přímo či nepřímo na značenou složku v každém jiném místě, než je 3 -koncovka fragmentu, nejvýhodněji v místě 5 '-koncovky fragmentu. Fragmenty nukleových kyselin lze koupit nebo připravit na podkladě genetických databází, viz Dib. a spol., Nátuře 380, 152-154,(1996), jakož i CEPH Genotype Database, http://WWW.cephb.fr, a dále komerčních vektorů, viz Promega, Madison, WI.

MOI, jak se zde tento výraz používá, zahrnuje deriváty MOI, obsahující funkčnost použitelnou pro spojení MOI s látkou T-L-L^. Tak například fragment nukleové kyseliny má na 5 '-koncovce fosfodiester,, kdy fosfodiester je rovněž vázán na alkylenamin. Takový MOI je popsán například v US pat.spise 4 762 779, na který se zde odkazuje. Nukleový fragment s vnitřním modifikováním je rovněž MOI. Jako příklady interního modifikování fragmentu nukleové kyseliny lze uvést případy, kdy odpovídající báze, tedy třeba adenin, guanin, cytosin, thymidin, uráčil byla modifikována přidáním reaktivní funkční skupiny. Takové interně modifikované fragmenty nukleových kyselin jsou běžně dostupné od např. Glen Research, Herndon, VA. Jiným příkla degi interního modifikování fragmentu nukleové kyseliny je případ kdy se použije nebázický fosfořamidát pro syntézu modifikovaného fosfodiesteru, který je vsunut mezi sacharid a fosfátovou skupinu fragmentu nukleové kyseliny. Nebázický fosfořamidát obsahuje reaktivní skupinu, jež umožní, aby se fragment nukleové kyseliny obsahující takový podíl, odvozený od fosforamidátu, vázal na podíly jiné, například některou látku T-L-L^. Takové nebázické fosféramidáty jsou obchodě dostupné od např.Clonetech Laboratories, lne., Palo Alto, CA.

-ογ444 4444

4 4

4 4

4 4

4ο Chemické záchytky (L^, Chemical handles)

Jako chemická záchytka je označováno stabilní, ale reaktivní atomové seskupení na prvé molekule, tedy na její části, kdy je možná chemická reakce takové záchytky s doplňující chemickou záchytkou na části druhé mokekuly za vzniku kovalentní vazby mezi oběma molekulami» Tok-například takovou záchytkou může být hydroxylová skupina a opačnou chemickou záchytkou seskupení karboxylové kyseliny, tedy karboxylová skupina nebo odpovídající aktivovaný derivát, třeba hydrofluorarylester, načež reakcí těchto dvou záchytek dojde ke tvorbě kovalentní vazby, zvláště esterové, jež spojí obě molekuly dohromady.

Chemické záchytky se mohou použít při velmi Četných reakcích, kdy vzniká kovalentní vazba, vhodná pro navázání značené složky na vazebnou složku a vazebné složky na MOI, Takové reakce zahrnují alkylování, tedy tvorbu etherů a thioetherů, acylování, tedy tvorbu esterů, amidů, karbamátů, derivátů močoviny a thiomočoviny, fosforylace, například za vzniku fosfátů, fosfonátů, fosforamidů, fosfonamidů, sulfonylace, například za vzniku sulfonátů a sulfonamidů, kondenzační reakce, tedy za vzniku iminů, oximů, hydrazonů, silylování, tvorbu disulfidů, jakož i přípravu reaktivních meziproduktů, jako jsou nitreny či karbeny a to fotolyzou. Obecně řečeno jsou záchytky a reakce za tvorby vazby vhodné pro navázání značené složky na vazebnou složku a rovněž vhodné pro navázání na MOI, i naopak. V některých případech se může předtím podíl MOI modifikovat nebo upravit do formy derivátu, aby se tak získala— záchytka, vhodná pro navázání na vazebnou složku.

Jedním typem vazby, jež se zvláště hodí pro navázání vazebné složky na MOI je disulfidická vazba. Její tvorba vyžaduje přítomnosti thiolové skupiny jako záchytky na vazebné složee a další thiolové skupiny na MOI, Mírně-oxidační podmínky pak dostačují k vzájemné reakci obou thiolů za vzniku disulfidické vazby. Tvorbu disulfidu lze rovněž indukovat použitím nadbytku eee c

49 44 44 • · · 4 4 44 «

4 4 4 «· . 4 · 4 e 9 9 β · 4 4 4 «

444 4 9 44 44 ·· vhodného reagens sulfidu. Protože může se disulfid ze skupiny disulfidů;; například pyridylditvorba disulfidů je reverzibilní reakcí, použít rovněž jako štěpitelná vazba při uvolňování značené složky, je-li to třeba. To se typick- provádí v mírně kyselém prostředí za použití vhodného výměnného činidla, jako je třeba dithiothreitol.

Zvláště zajímavá reakce pro navázání značených složek, nebo těchto složek na vazebné složky za vzniku oligonukleotidů je tvorba amidových bloků. Záchytky typu primárních alifatických aminů lze snadno zavést do syntetických oligonukleotidů působením fosforemiditů, jako je monometboxytritylhexylkyanethyl-R,N-diisopropylfosforamidit, dostupný od Glenn Research, Sterling, VA. Aminy, jak se nacházejí v přírodních nukleotidech jako je třeba adenosin a guanosin jsou ve skutečnosti nereaktiv ní ve srovnání s takto zavedenými primárními aminoskupinami. Tento rozdíl v reaktivitě je základem pro možnost selektivní tvorby amidů a podobně vázaných skupin, například močovinových, thiomočovinových, sulfonamidových s zavedenou primární aminoakupinou, nikoli však s eminoskupinami nukleotidu.

Při listování v katalogu Molecular Probes (Eugene, OR) zahrnuje částečné vyjmenování funkčních skupin, reagujících s aminy, aktivované estery karboxylových kyselin, isokyanáty, isothiokyanáty, sulfonylhalogenidy a dichlortriazeny. Aktivované estery jsou vynikajícími reagujícími složkami pro modifikování aminů, protože vzniklý amid jako produkt je velmi stálý. Rovněž se uvedená činidla vyznačují dobrou reaktivitou vůči alifatickým aminům, a η í z ko u vůči ^s nu kl c o t id o vým - anii n ům o 1 igonukleotidů. Jako příklady aktivovaných esterů možno uvést estery N-hydroxyimidu kyseliny jantarové, pentafluorfenylestery, tetrafluorfenylestery a p-nitrofenylestery. Aktivní estery jsou vhodné, protože se dají připravit ve skutečnosti z jakékol molekuly, pokud obsahuje karboxylovou skupinu. Přípravy aktivních esterů jsou uvedeny v publikaci Bodansky, Principles of Peptide Chemistry, 2.vyd., Springer ^verlag, London, 1993.

9

9 9 · · · 9· ···

9 9 9 9 9 · íee 99ee 0 0 0 0 ** —69—

Navázání vazebné složky

Typicky se použije jediný druh vazebné složky pro spojení předpokládá né sady značených složek na předpokládanou sadu MOI, Podle výhodného provedení dle tohoto vynálezu může jednoduchý a jediný postup vést ke tvorbě všech různých T-L-MOI struktur. To je zvláště výhodné, je-li sada struktur T-L-MOI velká, protože to dovoluje přípravu sady za použití postupů kombinační chemie nebo jinou odpovídající technologií. Podobně použití vazebné složky jednoho typu dovoluje provedení jedné a jednotné metody pro štěpení všch různých T-L-MDI struktur. A znovu je to výhodné pro velké sady T_L-MOI struktur protože se sada může zpracovávat souběžně, opakovaně a/nebo automatizovaným postupem.

Jsou však další provedení dle tohoto vynálezu, kdy se použijí dva či více typů vazebné složky ke spojení lišících se podskupin značných složek za vzniku odpovídajících podskupin MOT, V takovém případě se použijí podmínky selektivního štěpení k odštěpení každé z vazebných skupin nezávisle, aniž by fošlo k odštěpení vazebných složek na jiných podskupinách MOI.

Velký počet reakcí pro tvorbu kovalentních vazeb se hodí pro navázání značené složky na vazebnou složku á vazebné složky na MOI, Patří sem alkylace·, tedy tvorba etherů a thioetherů, acylace, tedy příprava esterů, amidů, karbamátů, močovinových a thiomočovinových derivátů, řosforylace, tedy příprava třeba fosfátů, fosfonátů, fosforamidů, fosfonamidů, sulfonylace, fěcly 'prš.prava sulfonatu a sulfonamidů, kondenzace, tedy třeba tvorba iminů, oximů, hydrazonů, silylování, tvorba disulfidů, a přípravě reaktivních meziproduktu, jako jsou nitreby anebo karbeny za použití fotolyzy·. Obecně lze říci, že reakce gáchytek a vznik vazeb, které se hodí pro navázání značených složek na vazebné složky, jsou rovněž vhodné pro navázání vazebných složek na MOI a naopak. V běkterých případech může být podíl MOI předtím modifikován nebo převeden na derivát, aby se tak získala gáchytka, vhodná pro navázání vazebné složky • · ·· ··· · • · ·* «

-70Jedním typem vazby, zvlášzě vhodné pro navázání vazebné složky na MOI, je disulfidické vazba. Jejé tvorba vyžaduje přítomnosti thiolové skupiny jako gáchytky na vazebné složce a další thiolové skupiny na MOI. Mírná oxidace p_ak dostačuje ke spojení obou dvou thiolů dohromady za vzniku disulfidu. Tvorbu disulfidu lze rovněž uskutečnit použitím nadbytku vhodného výměnného disulfidického činidla, jako jsou pyridyldisulfidy₀ Peotože tvorba disulfidu je obvykle reverzibilní, mlže se disulfid použít jako štěpitelná vazba pro uvolnění značené složky, je-li to třeba.

To se typicky provede za podobně mírných podmínek použitím nadbytku odpovídajícího thiol-výměnhého činidla, jako je třeba dithiothreitol.

Zvláštnímu zájmu pro navázání vazebných složek na oligonukleotidy se těší amidové vazby. Primární alifatické aminoskupiny jako záchytky lze snadno zavést do syntetických oligonukle tidů použitím fosforamiditů, jako je 6-monomethoxytritylhexylkyanethyl-N,ϊί-diisopropylfosfora.midit, dostupný od Glenn Research, Sterling, VA. Aminy v přírodních nukleotidech, jako jsou adenosin a guanosin,, jsou ve skutečnosti nereaktivní ve srovnání se zavedenou prim.aminoskupinou. Tento rozdíl v reaktivitě je podkladem schopnosti selektivní tvorby amidů a odpovídajících vazných skupin, jako jsou močovinové, thiomočovinové, sulfonamidové vždy za reakce zavedené prim.aminoskupiny, nikoli s aminem nukleotidu.

Jak je to uvedeno v katalogu Molecular Probes, Eugene, OR částečný výčet funkčních skupin, reaktivních vůěi aminům, zahrnuje aktivované estery ker boxylevých kyselin, isokyanáty, isothiokyanáty, sulfonylhalogenidy a dichlortriazeny. Aktivní estery jsou vynikajícími reakčními složkami pro modifikování aminů, protože amidy, vzniklé jako produkty, jsou velmi stálé.

Rovněž se tato činidla vyznačují dobrou reaktivitou s alifatickými aminy a nízkou reaktivitou vůči nukleo tidoVpím aminům oligonukleotidů Jako příklady aktivních esterů lze uvést estery H.hydroxyémidu kyseliny jantarové, pentafluurfenylestery tetrafluorfenylestery a p-nitrofenylestery. Aktivní estery jsou

5 9 φ Φ ···Φ

-71vhodné, protože se dají připravit skutečně z jakékoli molekuly, obsahující karboxylovou skupinu. Způsoby příprav aktivních esterů popisuje Bodansky, viz Principles of Peptide Chemistry,

2.vyd., Springer Verlag, London 1993.

Existují četná zesítující činidla, jichž lze použít jako vazebné složky, viz např. Pierce Cross-linkers, Pierce Chemical Co., Rockford, II» Mezi nimi jsou homobifunkční, s aminy reaktivní zesítující činidla, jako příklad lze uvést estery a to homobifunkční imidoestery a N-h-ydroxysukcinimidylestery (NHS). Existují rovněž heterobifunkční zesítující reakční činidle, obsahující dvě nebo více reaktivních skupin, což umožňuje sekvenční reakce. Imidoestery reagují rychle s aminy v alkalické oblasti pH. Z NHS-esterů se získávají stabilní produkty při reakci s primárními nebo sekundárními aminy. Jako thiol-reaktivní látky možno jmenovat imidy maleinové kyseliny, alkyl- a arylhsX logenidy, 'Ί -acylované deriváty a pyridyldisulfidy. Imidy maleinové kygeliny jsou specifické pro thiolové (sulfhydrylové) sku .piny v oblasti pH 6,5 až 7,5.V_aVlu^ické oblasti pH mohou reagovat s aminy. Za fyziologických podmínek je thioetherová vazba stálá. Zesítující látky typu J^-halogenacetylóerivátů obsahují jodacetylovou skupinu a vyznačují se reaktivitou vůči sulfhydrylovým skupinám. Irnidazolové látky mohou reagovat s jodacetylderiváty, ale reakce je velmi pomalá. Pyridyldisulfidy reagují s thiolovými skupinami za vzniku disulfidické vazby. Karbodiimidy spojují karboxylová skupiny s prim.aminy a hydrazidy, což vede k tvorbě acyl-hydrezinové vazby. Arylazidy jsou fotoafinitními -či-ni.d-ly_,__kt-er.á—j-S-O-U—ohemi-C-ky—in-e.r_t_ní_při_ejxpp-noviá.n.í_ul-t.r.af-is_l.ov₇ý_m paprsky mebo viditelným světlem» Fotolyzují-li se takové sloučeniny při 250 až 460 nm, vzniká reaktivní arylnitren. Ten je relativně nespecifický. Glyoxalové deriváty reagují z guanidinylovou částí argininu.

Při jednom typickém provedení postupu dle tohoto vynálezu se značená složka nejprve naváže na vazebnou složku a jejich kombinace se naváže na MOI ze vzniku struktury T-L-MOI. Jinak lze dospět k téže struktuře nrjprve navázáním vazebné složky na • 9 9 ·· ·· ·· ·· ··· 9 · 9 9 · · · 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9 • 9 ·· ·· · '9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 99 99 ·· ··

-72M6I s následnou vazbou kombinace vazebné složky a MOI na značenou ..složku. Fříkladem je stač, kdy MOI je primírem DNA nebo oligonukleotidem, V takovém případě se značená složka typicky nejprve naváže na vazebnou složku a potom se kombinace T-L naváže na DNA-primér nebo oligonukleotid, který se pak použije například při sekvenční reakci.

Jednou vhodnou formou k použití, je-li značená složka navázána reverzibilně na MOI (například oligonukleotid nebo DNA-sekvenční primér), je použití chemicky’ labilní c.’·.* vazrbné složky. Jedním z výhodných rysů pro vazebnou složku je to, že ji lze odštěpit těkavou organickou kyselinou, např. kyselinou trifluoroctovou. Ta je zvláště kompatibilní s většinou postupů za hmotnostně-spektrální ionizace, čítaje v to elektrosprej o

Jak’ je tó podrobně rozebráno ještě dále, předmětem vynálezu je způsob stanovování sekvence molekuly nukleové kyseliny. Komposice, kterou lze připravit podle způsobu vynálezu, zahrnuje větší počet sloučenin vzorce

T^-L-MOI kde T^ms je skupina zjistitelná hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a může obsahovat případně další atomy se zahrnutím kyslíku, dusíku, síry, fosforu a jodu. V uvedeném vzorci znamená I» organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T¹⁰^ odštěpit se od zbytku sloučeniny, je-li sloučenina vystavena podmínkám takového štěpení. Odštěpená skupina T^ms obsahujefunkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový «tav, je li každá ze sloučenin uvedeného většího množství sledována hmotnostní spektrometrií. Funkční skupinou může být terč.-amin, kvarterní amoniová báze nebo organická kyselina.MOI je fragment nukleové kyseliny, který je navázán na L pomocí 5'-koncovky MOI. Výraz navázán znamená, že zde mohou být chemické meziskupiny mezi L a MOI, například • 0

0·

skupina fosfodiesterová a/nebo alkylenová. Fragment nukleové kyseliny může mít sekvenci komplementární, k části vektoru, kde je fragment schopný nastavovat nuklhtidovou syntézu.

V kompozici nemají dvě sloučeniny buď stejnou skupinu T^ms nebo tutéž MOI. Řečeno jinými slovy: kompozice zahrnuje větší počet sloučenin, kde každá z nich má jak jednotnou skupinu T , tak i jednotný fragment nukleové kyseliny (jednotný potud, že obsahuje jednotnou sekvenci bází). Kompozici lze dále popsat tak, že obsahuje větší počet sloučenin, kdy každou z nich lze definovat jako mající jednotnou skupinu T , kde skupina T je jednotná do té míry, že žádná další sloučenina neobsahuje T⁰¹⁸, jež by měla týž signál při hmotnostní spektrometrii» Kompozice tedy obsahuje větší množství sloučenin a každá z nich má T^ms s jednotnou hmotností. Kompozici lze dále popsat také tak, že obsahuje větší množství sloučenin, kde každá z nich je definována tím, že má jednotnou sekvenci nukleové kyseliny. Tyto sekvence nukleové kyseliny jsou záměrně jednotné, takže každá sloučenina bude mít úlohu priméra pouze pro jeden vektor, kombinuje-li se kompozice s vektory pro sekvencování nukleové kyseliny. Sada sloučenin, majících jednotné skupiny T^ms je toutéž sadou sloučenin, které mají jednotnou sekvenci nukleové kyseliny.

S výhodou jsou skupiny T jednotné potud, že mají hmotnost rozdíl nejméně 2 amu, výhodněji nejméně 3 amu a ještě výhodněji nejméně 4 amu mezi skupinami T^ms kterékoli ze dvou lišících se sloučenin. V kompozici jsou nejméně dvě lišící se sloučeniny, s výhodou více než dvě a ještě výhodněji více než čtyři lišící se sloučeniny. Kompozice může obsahovat 100 či více různých slouče nin, z nichž každá má j edno značnou skupinu T a jednoznačnou sekvenci nukleové kyseliny.

Jiná kompozicé, jež se hodí například pro stanovování sekvence molekuly nukleové kyseliny, zahrnuje vodu a sloučeninu vzorce T^ms-L-M0I, kde T⁰¹⁸ je skupina, zjistitelná hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku • fc fcfc

• ·· • · · · • · • · o o ··· ··· ·

-74a fluoru a může obsahovat případně další atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod. V uvedeném vzorci znamená I organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T^ms odštěpit se od zbytku sloučeniny, je-li tato vystavena podmínkám štěpení. Odštěpená část s obsahem T¹³¹³ zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li větší počet sloučenin sledován hmotnostní spektrometrií. Fukční skupinou může být íerc.amin, kvart, amoniová skupina nebo organická kyselina. V uvedeném vzorci znamená MOI fragment nukleové kyseliny navázaný na své 5 '-koncovce.

Při vnášení do vody může taková kompozice obsahovat pufr se zřetelem na udržení hodnoty pH vodné kompozice v rozsahu od asi 5 do asi 9. Kompozice může dále obsanovat enzym, soli jako jsou třeba chlorid hořečnatý a sodný, a jednu látku ze skupiny dATP, dGTP, dCTP a dTTP. Výhodná kompozice obsahuje vodu, T^ras-L-MOI a jednu (ale pouze jednu) ze sloučenin ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP. Taková kompozice se hodí k použití při didesoxy-sekvenčním postupu.

Vynález se také týká kompozice, obsahující větší počet sad sloučenin, kde každá sada sloučenin má vzorec kde t“³ znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku či fluoru a případně atomy ze skupiny kyslík dusík, síra, fosfor a jod.

Ij znamená organickou skupinu, jež umožňuje části_f obsahující— T®³ odštěpit se od zbytku sloučeniny, kde část, obsahující T^ms zahrnuje funkční skupinu, podporující jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena z terč.„aminů, kvart.srnoniových skupin a organických kyselin. MOI je fragment nukleové kyseliny, kde L je skupina navázaná na MOI 5 '-koncovkou MOI.

V uvedené sadě mají všechny členy stejnou skupinu T⁰¹³, a fragmenty MOI mají lišící se délky, zakončené týmž didesoxynukleotidem ze skupiny ddAMP, ddGMP, ddCMP a dd TMP a mezi sadami ' 4

4* 44 44 4· • 4 4 4 4 4 44·«

4 4 44 4 4 4·

4 44 44 ♦ 4 4444 4

4 4 4 4 4 444

444 4444 4f <4 44 44

-75se skupiny T^ms liší nejméně 2 amu, výhodněji nejméně 3 amu.

Větší množství sad znamená nejméně 5 a může to být jakékoli číslo do 100 či více.

Ve výhodné kompozici dle tohoto tynálezu, obsahující prvý větší počet sad, jak to bylo výše uvedeno, může být druhý větší počet sad sloučenin vžorce

T^{m s}-L-M0I kde T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně další atomy ze skupiny kyslík/ dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T^ms odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže T^msobsahující část zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizační nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupin terč.aminů, kvart.amoniových skupin a organických kyselin. MOI je fragment nukleové kyseliny, kde L je konjugována s MOI 5'-koncovkou MOI. Všechny členy tohoto druhého většího množství mají sekvence MOI zakončené týmž didesoxynukleotidem ze skupiny ddAMP, ddGMP, ddCMP a dd TMP, to za omezení, že didesoxynukleotid, který je přítomný ve sloučeninách prvého většího množství není totožný s didesoxynukleotidem, který je ve sloučeninách druhého většího množství.

Vynález popisuje rovněž soupravu (kit) pro sekvenční analýzu DNA. Sestava obsahuje větší počet zásobníčkovýoh sad, kde každá zásobníčková sada obsahuje nejméně 5 zásobníčků. Prvý zásobníček obsahuje vektor, druhý, třetí, čtvrtý a pátv zásobníček obsahuje sloučeniny obecného vzotce

T^-L-MOI kde T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru, případně další atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod, I» znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T¹¹¹⁸, odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže T^ms-obsahující část zahrnuje funčkní skupinu, jež podporuje jediný ioni·· · · • · · ♦

9 9 9 9 9 · O 9 ·

9999999 · ·

-76začni nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny, kterou tvoří tere.-aminy, kvert.amoniové báze a organické kyseliny. MOI znamená fragment nukleové kyseliny, kde složka L je napojena na MOI 5'-koncovkou MOI. Podíly MOI pro druhý, třetí, čtvrtý a pátý zásobníček jsou totožné a komplementární k části vektoru uvnitř sady zásobníčků, a skupina T®⁸ v každém zásobníčku se liší od dalších skupin T®⁸ v soustavě·

S výhodou zhhrnuje sestava (kit) větší počet, nejméně 3 sady zásobníčků. Výhodněji pak nejméně 5 sad zásobníoků.

Jak to bylo zde již výše uvedeno, předmětem vynálezu jsou kompozice a způsoby stanovování sekvence molekul nukleových kyselin. V krátkosti tyto postupy zahrnují stupně?

a) přípravu značených fragmentů nukleové kyseliny, které jsou komplementární ke zvolené molekule nukleové kyseliny (např. značenému fragmentuj tedy od prvého konce ke druhému konci molekuly nukleové kyseliny), kdeže značená část je korelativní s případným nebo zvoleným nukleotidem a lze ji zjistit některým z různých známých postupů,

b) rozdělí se značené fragmenty, to dle sekvenční délky,

c) odštěpí se značená složka ze značeného fragmentu, a

d) zjistí se značené složky a tak se stanoví sekvence molekuly nukleové kyseliny. Každý z těchto aspektů bude nyní probrán dále podrobněji.

B. Sekvenční postupy a strategie

Jak to již bylo uvedeno zde dříve týká se vynález způsobů stanovování sekvence molekuly nukleové kyseliny. Krátce řečeno: připraví se značené fragmenty nukleové kyseliny, Fragmenty —— nukleové kyseliny jsou komplementární ke zvolené cílové nukleové kyselině. Podle výhodného provedení se fragmenty nukleové kyseliny připraví od prvé do druhé koncovky molekuly nukleové kyseliny a výhodněji od 5'-koncovky do 3'-koncovky· Podle dalšího výhodného provedení se značené fragmenty získají z 5 '-značených oligonukleotidových primérů nebo značených didesoxynukleotidových terminátorů. Značená složka značeného fragmentu nukleové kyseliny je korelativní s tím či oním nukleotidem a je zjistitelná spektrometričky(čitaje v to fluorescenci, ale s výhodou jinak, ·· ··

·..· : :·*·.

: : · ···:-.

• ·

-77než fluorescenčně) nebo potenciometričky. Při výhodném provwdení se připraví nejméně 5 značených fragmentů nukleové kyseliny a každá značená složka je jednoznačná pro fragment nukleové kyseliny. Přesněji řečeno počet značených fragmentů bude obvykle činit od 3 do 2000. Značené fragmenty nukleové kyseliny lze získat z nejrozmanitějších sloučenin, čítaje v to ty, které byly již uvedeny zde výše. Obeznámenému je zcela jasné, že postupy ile tohoto by nálezu nejsou omezeny použitím pouze příkladných sloučenin a zde popisovaných kompozic.

Následně po přípravě značených fragmentů nukleové kyseliny se značené fragmenty dělí dle sekvenční délky. Takové dělení lze provádět celou řadou postupů. Při výhodném provedení se použije kapalinová chromatografie a zvláště s výhodou vysokotlaková kapalinová chromatografie. Dále pak se ze značeného fragmentu odštěpí značená složka. Případný postup při rozrušení vazby se zřetelem na uvolnění značené složky se zakládá na typu citlivosti vazby pro štěpení. Tak například vazba, citlivá na světlo (například taková, která se rozruší světlem) se vystaví účinkům světla. Uvolněná značená složka se zjistí spektrome&ricky nebo potenciometričky. Výhodnými jsou přitom hmotnostní, infračervená a ultrafialová spektrometrie, potenciostatická amperometrie (například s ampérometrickým nebo coulometrickýra detektorem)·

Odborníkovi je ihned jasné, že jeden nebo více stupňů se dá automatizovat, například použitím vhodného zařízení. Dále pak se dělení, štěpení a zjištování jako oddělené stupně mohou provádět kontinuálně (například nepřetřžitým průtokem a nepřerušovanou průtokovou cestou značených fragmentů od stupně dělení přes štěpení až po detekci značené složky). Například se různé stupně mohou vřadit do systému, tak jako se stupně provádějí kontinuálním způsobem. Takovým systémem je obvykle nějaké zařízení nebo kombinace různých zařízení. Například značené fragmenty nukleové kyseliny, kzeré byly již rozděleny (například vysokotlakovou kapalinovou chromatografií) mohou dále se posunovat do zařízení pro štěpení (např.fotoreaktoru) a dále pak do detekčního zařizení pro zjištění značené složky (jako je hmotnostní spektrometr nebo coulometrický či amperometrický detektor. S výhodou je zařízení pro štěpení laditelné, takže • · lze zvolit optimální vlnovou délku pro štěpící reakci.

Odborníkovi je v tu chvíli naprosto jasné, že způsoby podle tohoto vynálezu pro sekvencování nukleových kyselin lze použít v celé řadě případů a pro různé účely.

Tak například použití těchto postupů zahrnuje stenovení primárních sekvencí pro virové, bakteriální, prokaryotické a eukaryotické (například savčé) molekuly nukleových kyselin; dále mutační detekce, diagnostiku, soudní lékařství, identifikaci a detekci polymorfianu.

1. Sekvenční postupy

Jak to bylo již zde uvedeno dříve, mohou se sloučeniny spadající do rozsahu tohoto vynálezu využít pro nejrůznější sekvenční postupy, čítaje v to jak enzymhvé tak i chemické degradační metody. Krátce řečeno: enzymový postup, který popsal Sanger, viz Proč.Natl.Acad.Sci.(USA) 74, 5463 (1977), který využívá didesoxyterminátory, zahrnuje syntézu provazce DNA z jodnoprovazcového templátu polymerasou DNA. Sanger-ův postup se zakládá na zjištění, že se didesoxynukleotidy (ddNTP) vřazují do rostoucího provazce týmž způsobem, jako normální deoxynukleotidy (i když s nižší účinností). Avšak ddNTP se liší od normálních desoxynukleotidů (dNTP) potud, že postrádají 3 '-hydroxylovou skupinu, jež je nutná pro prodloužení řetězce. Vřadí-li se ddNTP do řetězce DNA, nepřítomnost 3'-hydroxylové skupiny předejde tvorbě nové fosfodiesterové vazby a fragment DNA se zakončí složkou ddNTP, jež je komplementární k bázi v templátu DNA. Postup dle Maxsm- a Gilbert-a, viz Proč.Natl.Acad.Sci.(USA) 24, 560 (1977) využívá chemickou degra dacní metodu původní DNA (v obou případech je třeba, aby DNA byla klonována). Oběma postupy, vznikájí populace fragmentů, které začínají od určitého bodu a jsou terminovány každou bází, jež se nalézá ve fragmentu DNA, který se má sekvencovat. Terminování každého fragmentu je závislé od umístění příslušné báze v originálním fragmentu DNA. Fragmenty DNA se dělí polyakrylamidovou gélovou elektroforézou a pořadí bází DNA (A, C, T, G) se přečte z autoradiografu gélu.

-792. Sekvencování DNA exonukleasou

Postup stanovování sekvencí DNA-nukleotidu popsali Labeit a spol, viz Labeit S., Lehrach H a Goody R.S., DNA 2» 173*177 (1986).Překlad názvu článku: Nový postup sekvencování DNA za použití ά-thiotrifosfátů deoxynukleosidu. V prvém stupni postupu se čtyři DNA, ale každá odděleně substituuovaná jiným fosforothioátem deoxynukleosidu místo odpovídajícího monofosfátu, připraví templátem řízenou polymerací, katalyzovanou DNA polymerasou. Ve druhém stupni se tyto DNA vystaví účinkům přísně zvolené exonukleasy III s tím, že výsledkem jsou pouze fragmenty, končící fosforothioátovou internukleotidovou vazbou. Ty lze dělit standartním postupem gélové elektroforesy a sekvence se může přímo odčítat, jako je tomu u obvyklých sekvenčních postupů. Porter K.W., Tomasz J., Huang P.,

Sood A a Shw B.R., Biochemistry 21» 11963-11969(1995) v článku ” 5 *-trifosfát N-7-kyanoboran-2 '-deoxyguanosinu je dobrým substrátem pro DNA polymerasu popisují novou sadu analogů nukleotidů, substituovaných borem, které jsou vůči exonuklease resistentní a jsou dobrými substráty pro ve^ počet polymeras: tyto báze jsou rovněž vhodné pro sekvencování DNA exonukleasou·

3· Jednoduchá strategie pro sekvencování velkého počtu cDNA plné délky

Sekvencování cDNA bylo navrženo jako alternativa generování kompletní lidské genomické sekvence. V tomto směru byly zaznamenány dva přístupy k řešení problému. Prvý zahrnuje generování- značených složek s expresní sekvencí (EST) .pomocí = jediného pochodu sekvence DNA od jedhoho konce každého DNA-kloau. Tímto postupem bylo možno nahlédnout do distribuce typů expresních sekvencí a odkryla se tím případná použitelnost homologie s genomickými fragmenty, ale celkově se tím přispělo jen málo k našim základním znalostem, protože z každého klonu byly získány nedostačující údaje. Druhý postup popisuje generování kompletní sekvence cDNA, což může naznačit možnou funkci

-80• · ♦ • ·· • · · ·

kyselin cDNA· Na neštěstí velká většina kyselin cDNAz hlediska velikosti se pohybuje v rozsahu 1 až 4 kilobází, což je překážkou automatizování při stanovování sekvence plné délky·

Současně nejúčinnějším způsobem produkoe vysoce souhlasných sekvencí ve velkém měřítku je sekvencování od místa vektor/primér, což typicky je spojeno s výtěžkem méně než 500 bází v sekvenci každého křídla. Syntéza nových oligonukleotidových primérů o délce 15 až 18 bází pro přesun priméru může nyní uzavřít každou sekvenci. Jinou strategií pro sekvencování kyselin cDNA plné délky je generování modifikovaných templátů, které se hodí pro sekvencování univerzálním primérem, ale jsou spojeny s překrávajícím se krytím molekul·

Nástřelné sekvenční postupy se mohou použít pro studie sekvencování kyselin cNDA přípravou oddělené sestavy z každého klonu cDNA. Tyto postupy nebyly použity nijak siřeji pro analýzu fragmentů s 1,4 až 4,0 kilobází, hlavně proto, že jsou pracovně velmi náročné v počáteční fázi klonování· Místo toho se obecně používají při plánování, kde cílová sekvence je řádově v rozmezí 15 až 40 kilobází, jako je tomu u vsuvek typu lambda nebo cosmid.

4· Analoga kyselin cDNA s genomickým sekvencováním

Navzdory typickým velikostním rozdílům individuálních klonů, které se mají analyzovat při sekvencování kyselin cDNA jsou zde podobnosti se zřetelem na sekvencování genomických DNA ve velkém měřítku· Navíc k nízké ceně jednotlivých bází a vysoké propustnosti bude spojena ideální strategie pro sekvencování kyselin cDNA v plné délce s vysokou přesností. Výhodná a běžná metodika pro genomické sekvencování DNA zahrnuje přípravu nástřelného sekvencování sestav z cosmidů s následným nahodilým sekvencováním za použití zařízení pro ABI fluorescenční sekvencování DNA a uzávěr (zakončení) řízeným úsilím· Především je zde shoda v tom smyslu, že fluorescenční nástřelový přístup k problému je výhodnější bež jiné běžné alternativy z hlediska účinnosti i přesnosti. Počáteční kvalita nástřelné sestavy je kritickou určující složkou sekvenční sestavy z hlediska snadnosti přípravy • · ··· · • ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • · · · · · i kvality. Vysoká kvalita postupu za použití dostupných nástřelných sbírek vyvolala strategii přípravy multiplexních nástřelných sbírek, obsahujících směsi menších klonů kyselin cDNA. Přitom se jednotlivé klony, které se mají sekvencovat, smíchají předem s konstrukcí směsi a pak identifikují z hlediska náhodného sekvencování, to ve stadiu analyzy počítačem. Spoje mezi jednotlivými klony se značí během vzniku sbírky buď použitím PCR nebo identifikováním sekvence vektorových ramen.

Klony se mohou připravit jako mikrobiálními postupy, tak i použitím PCR. Při použití právě PCR se použijí v případě každého klonu 3 reakce, aby se tak snížilo nebezpečí omylu na minimum.

Sekvencování v jediném sledu je novým postupem se zřetelem na rychlost identifikování důležitých sekvencí v nové oblasti genomické DNA. Krátce řečeno připraví se nástřelná sbírka o vysoké kvalitě a pak se vzorkují sekvence s krytím 80 až 95%.

Pro cosmid” to znamená typicky asi 200 vzorků. V podstatě mají všechny geny podobnost v tom směru, že obsahují nejméně jeden exon zjištěný v tomto vzorku za použití buď sekvenční podobnosti (BLAST) nebo stínění exonové struktury (CRAIL2).

Stírání (skimming) bylo s úspěchem použito na cosmidy a Pl. Jednostupnové sekvencování je z hlediska účinnosti nejrychlejší a nejméně nákladnou cestou zjištění genů v pozičně určeném klonovaoím projektu. Výsledek je skutečně uajištěn. Největší počet badatelů nyní běžně používá cosmidovou techniku pro zachycení exonů a příbuzné postupy. Cosmidy jsou dokonale vhodné pro stírání. Pl a další podíly BAC by mohly být podstatně levnější, protože jsou zde úsprry jak při konstrukci nástřelných sbírek, tak i z hlediska minimalizace překryvů.

5. Nástřelné sekvencování

Nástřejné sekvencování kyseliny DNA začíná nahodilým fragmentováním cílové DNA. Nahodilé sekvencování se potom využije pro získání většiny údajů. Řízená fáze pak zakryje mezery, zajistí krytí každého provazce v obou směrech. Nástřelné sekvencování je spojeno s výhodou vysoké přesnosti a poměrně ·· * « ·· ·· • « » β ·· • eeee ββ

-82nízkých nákladů. Postup se nejlépe hodí pro analýzu poměrně velkých fragmentů a je to také postup při výběru sekvencování genomických kyselin DNA ve velkém rozměru.

Je zde několik faktorů, které jsou důležité se zřetelem na nástřelové sekvencování, aby totiž bylo přesné a výlohově únosné· Vejvětší význam má kvalita nastrelove sbírky, která se takto pořizuje, protože kterékoli klony, ktere nemají vsuvku nebo mají chimerní vsuvky, jsou důsledkem následujícího neúspěšného a neúčinného sekvencování· Dalším faktorem k úvaze je pečlivé balancování rozsahu a řízených fází, určených k sekvencování, takže se dosahuje vysoké přesnosti s minimální ztrátou účinnosti zbytečným sekvencováním.

6. Sekvenční chemie: chemie značených terminátorů

Jsou zde v podstatě dva typy fluorescenčního chemického sekvencování: zbarvení priméru, kdy je primér fluorescenčně značen, a zbarvení terminátoru, kdy je značen didesoxyterminátor. Každý z těchto dvou chemických postupů se dá použít buú se značenou složkou DNA polymerasy nebo s enzymy sekvenasy. Sekvenásové enzymy se zdají být snadno čitelné oblastí bohatou na G-C, jednoduché opakované složky a další, jinak svízelně čitelné sekvence* Sekvenasa se rovněž hodí pro sekvencování smíšených populací. Sekvenásové sekvencování vyžaduje 5 ug templátu, jednu extensi a několikastupňový proces čistění. Sekvencování značených primérů vyžaduje čtyři oddělené reakce, vždy jednu pro C, C, G a T a tedy i náročný laboratorní protokol stran čistění. Chemie sekvencováním cyklu značeného terminátoru je nejpoužívanějším sekvenčním postupem. Při tomto postupu se může použít kterýkoli sekvencovaný primér. Množství nutného . - > , templátu je poměrně malé a celý postup reakce od nasazení až do čistění je poměrně snadný ve srovnání s chemií sekvenasy a zbarvených primérů. Je třeba pouze 1,5 fig templátu DNA a 4 pm primeru, K tomu se přidá připravená reakční směs. Ta je složena z pufru, enzymu složek dNTP a fcnačených didesoxynukleo-83tidů. Tuto reakci lze provést v jediné trubičce, protože každý ze čtyř didesoxy-derivátů je značen jiným fluoreskujícím barvivém. Tyto značené terminátory jsou přítomny v uvedené směsi v nadbytku, protože se jinak těžko vřazují během extense. Použití nečistých DNA může inhibovat vřazení těchto didesoxyderivátů v vysoké mol.hmotnosti. Předběžná směs obsahuje dITP za účelem minimalizovat kompresi pásů. Použití značené složky jako DNA polymerasa umožňuje průběh reakce za vysoké teploty, aby se tak minimalizovaly problémy sekundárních struktur, jakož i nespecifické vazby primérů. Celý průběh je dán 25ti cykly denaturování, anelování a extense v tepelném cyklickém zařízení a kompletnost re_akce je sledována pomocí kolony Sephadex G50 (Pharmacia, Piscataway, NJ) a vše je připraveno pro nanesení na gél 5 minut po vysušení ve vakuovém exsikátoru.

7. Značení primérů

Značí-li se priméry, pak je třeba použít těchže kriterií jako při značená PCR-primérů. Zvláště pak priméry mají být délky s výhodou 18 až 20 nukleotidů a značením v koncovce 3 má být báze G nebo C. Priméry mají mít také hodnotu Tm více než 50°C. Priméry kratší než 18 nukleotidů jsou použitelné také, ale bez doporučení, čím kratší je primér, tím větší je pravděpodobnost že se naváže na více než jednom místě templátu DNA a tím nižší je jeho Tm. Sekvence má mít 100%ní souhlas s templátem. Jakákoli přimísenina., zvláště se zřetelem na 3-značenou koncovku patrným způsobem sníží sekvenční schopnost. Ale priméry s 5-značenou koncovkou se mohou použít, pokud je zde asi 18 bází s vazbou na 3-koncovce.’ Pokud kdo značí priméi? dle sekvenčního chromatogramu, musí se využít prostor s vysokou spolehlivostí. Protože dojde k pohybu 350 až 400 bází na standartnípí chromatogramu, píky se rozšíří a odezva báze není tak přesná. Jak to zde bylo popsáno, priméry mohou obsahovat 5'-záchytku, na které může být postranní rameno, nebo postranní značená složka zavěšena.

·· · ·

8. Příprava templátů nukleovýoh kyselin

Nejdůležitějším faktorem při sekvencování značených

DNA-primérů je kvalita templátu· V krátkosti je jedním společným mylným názorem to, že je-li templát zpracováván sekvenčně ručně, může také být použit pro automatizované sekvencování.

Ve skutečnosti pokud je reakce při sekvencování zpracovávána ručně, může být zpracovávána automatizovaným sekvencováním, ale automatizované sekvencování je mnohem více citlivější a výsledkem motou být templáty chatrné kvality s malými údaji nebo bez údajů, použije-li se fluorescenční sekvenční postup· Vysoké koncentrace solí, jakož i dalších buněčných materiálů, nedostatečně extrahovaných během přípravy templátu, čítaje v to RNA, mohou předejít schopnosti získat tak přesné sekvenční informace· Pomocí četných mini- i maxi-preparačních protokolů lze získat DNA, jež je dostatečně vhodná pro ruční sekvencování nebo PCR, nikoli však pro automatizované sekvencování za použití značilých primérů· Také použití fenolu není vůbec doporučováno, protože fenol může se vsunout do struktury šroubovnice. Použití 100%ního chloroformu je dostačující· Je zde určitý počet postupů přípravy DNA, které jsou zvláště výhodní pro sekvenční postupy se značenými priméry. Zvláště jsou výhodné maxi-preparaca, využívající přípravky s chloridem česným nebo Qiegen-em (Chatsworth, CA)maxi-preparační kolonou, ale pozor, aby nebyla přeložena· Pro minipreparativní kolony se dá využít Promega*s Magie Mini prep.(Madison, WI). Pokud se sekvencují fragmenty DNA, jako jsou fragmenty PCR nebo restrikčně vyjmuté fragmenty, je obecně výhodné vyčlenit potřebný fragment z agarosového gelu o nízké?t.t· a pak čistit produkt jako GeneClean (La Jolla, CA)· Je velmi důletité dbát na to, aby pouzejeden . pás byl vyříznut z gelu. Pro PCR-ítagmenty se mohou použít PCRpriméry nebo vnitřní priméry s úmyslem zajistit, aby byl sekvencován vhodný fragment· Pro získání optimální účinnosti pro vnitřní vybavení sekvenční analyzy mají být fragmenty větší než 200 bází· Dvouprovazcové nebo jednoduše provazcové DNA lze sekvencovat tímto postupem.

Dalším faktorem, který je obvykle brán v úvahu při přípravě DNA pro sekvencování, je volba výchozího kmene. Spo00 00 «0 0 0 0

0 ·

0 0 · ·

0 0 0

00090 0*

-85lečnosti, prodávající zařízení a reakční složky pro sekvencování, jako jsou ABI (Fdster City, CA) a Qiagen (Chatsworth, CA) typicky doporučují výchozí kmeny a dtíve již doporučovaly kmeny, jako jsou DH5 alpha, HB1O1, XL-1 Blue, JM109, M71190.

I když jsou přípravky DNA velmi čisté, jsou zde ještě další inherentní faktory, které mohou znesnadnit dosažení sekvence. Templáty bohaté na G-C se obvykle těžko prosekvencují a pekundární struktury mohou být zdrojem problémů. Sekvencování dlouze opakovaných celků je často obtížné. Tak například jak se značená složka pohybuje podél póly T-prodloužení, enzym často odpadne z templátu a naskočí opět se zásahem na T. Výsledkem jsou prodloužené produkty s X místo Ts v póly T-prodloužení a fragmenty s X-l, X-2 atd s celkovým množstvím Ts v póly T-prodloužení. Čistým výsledkem je to, že více než jedna báze se objaví v každém z postavení sož znemožňuje přečtení sekvence.

9. Použití molekúlárně rozdílných klonujících vektorů

Sekvencování lze rovněž provádět použitím univerzálního klonujícího vektoru (M13) a komplementárních sekvenčních primérů. V takovém případě se použijí pro současné klonující vektory sekvence těchže primérů a použijí se pouze 4 značené éložky (každá značená složka je jiný fluorofor, znamenající lišící se terminátor (ddNTP), každý amplifikačnímpostup se musí provádět v lišících se zásobníčcích (jeden vzorek DNA na 1 zásobníček)· Je tedy nemožno smíchat dva nebo různé vzorky DNA při témže amplifikačním postupu. Jsou-li jen 4 značené složky dostupné, pouze jeden vzorek DNA může být použít ve . .

vlnce gelu. Není to tedy vhodný prostředek pro řešení sekvence než jednoho vzorku DNA pouze se čtyřmi značenými složkami.

(z tohoto hlediska právě dbají pracovníci na tomto úseku na to, aby neraísili nebo nežnečistováli vzorky různých DNA při použití běžných tenologických postupů).

Podstatnou výhodou by bylo, kdyby bylo možno použít větší počet 4 značených složek na vlnku gelu, nebo při odpovídajícím postupu dělení. Zvláště pak tedy při použití značených složek

dle tohoto vynálezu lze zpracovat více než jeden vzorek DNA v jediné amplifikační reakci nebo zásobníčků. Pokud je dostupný větší počet 4 značených složek, pak každý značená sada může být vyznačena pro vzorek té kyseliny DNA. který se má applifikovat. ( Sada značených složek je složena ze serie 4 různých značených složek, z nichž každá má svoje osobité vlastnosti)· Každá značená složka je určena k zastoupení jiného dideaoxyterminátoru, ddATP, ddGTP, ddCTP anebo ccTTP. Při využití této výhody je třeba generovat sérii vektorů, do kterých se vsune jednoznačné značící místo· Jednoznačně značeným místem je sestava 18 nukleotidů, které se liší od vektoru k vektoru. Zbývající nukleotidová sekvence se zachová od vektoru k vektoru. Připraví se (synteticky) sekvenční primér, který odpovídá každému jednotlivému vektoru. Každý jednotlivý primér je odvozen (nebo značen) jednaznačně značenou sadou.

jsou-li zde po ruce tyto prostředky molekulární biologie, je možno postupem dle tohoto vynálezu zpracovat větší počet vzorků v jediném zásobníčků. Tak za prvé se vzorky, které je třeba sekvencovat, klonují do většího počtu vektorů. Tak na příklad je-li dostupných 100 jednoznačných vektorů, pak se provede 100 ligačních reakcí, je třeba stejný počet stupňů nanášení a odběrů z destiček. Za druhé jeden vzorek každého vektorového typu se přidá do shluku, čímž vznikne shluk 100 jednoznačných vektorů, obsahující 100 jednoznačných fragmentů DNA nebo vzorků. Tsn či onen vzorek DNA se tedy identifikuje a automaticky se spojí sada primeru se spojenou sadou značených složek. Do reakčního zásobníčků se vnesou odpovídající priméry, pufry, polymerasa či polymerasy, ddNTP, dNTP a kofaktory a provede se postup amplifikace. Reakční směs se zpracuje ve stupni dělení a ta či ona sekvence se zjistí z časového zjištění značené složky. Možnost shluknout větší počet vzorků DNA má svoje podstatné výhody. Cena činidel pro typickou reakci PCR se pohybuje kolem & 2,00/vzorek. Použitím výše popsaného postupu se amplifikační náklady na vzorek báze sníží nejméně stokrát. Zacházení se vzorkem se zredukuje také nejméně stonásobně, i materiálové výlohy lze snížit. Lze se tak vyhnout potřebě amplifikačních robotů pro práci ve velkém měřítku.

• ·

-8710. Sekvenční vektory pro hmotnostní spektroskopii s odštěpitelným značením

Použitím hmotnostní spektroskopie a odštěpitelným značením (CMST) dle tohoto vynálezu lze odečíst každou jednotlivou sekvenční reakci nezávisle a současně, jak dělení probíhá. Při sekvencování CMST je pro každý klonující vektor použit jiný primér, každá reakce zahrnuje 20 různých primérů, použije-li se 20 klonů na jeden shluk. Každý primér odpovídá pouze jednomu vektoru a každý primér je značen jedinou CMST-molekulou. Čtyři reakce se provedou s každým spojeným vzorkem DNA (jedna pro každou bázi), takže každý vektor má 4 oligonukleotidové priméry, každý z nich je sekvenčně identický, ale značený jinou CMS značenou složkou, čtyři oddělené sekvenční reakce se spojí a běží pak společně. Spojí-li se 20 vzorků, použije se 80 značených složek (4 báze na vzorek krát 20 vzorků) a všech 80 se deteguje současně, jak reakce probíhá na gelu.

Konstrukci vektorů lze provést klonováním kolem 20-mérů na každé straně restrikčního místa. Získané klony se sekvencují a počet se zvolí pro použití jako vektor. Pro každý zvolený vektor se připraví 2 oligo nukleotidy, jeden homologní k sekvenci na každé straně restrikčního místa a každý orientovaný tak,, že 3 '-koncovka směřuje k restrikčnímu místu.

Připraví se 4 vzorky značeného priméru z každého priméru, jeden pro každou bázi při sekvenční reakci a jeden z nich značený jednoznačně CMS složkou.

11. Výhody sekvencování použitím reverzibilních značených složek.

Jsou zde závažné výhody, použijí-li se odštěpitelné značené složky při sekvencování a podobných technologických postupech. Tak za prvé vzestup citlivosti přispěje k větší délce odečtu, jakož i schopnost shromáždit značené složky pro specifickou dobu před vlastním měřením. Použití odštěpitelných značených složek umožní vyvinutí systému, který srovná šíři pásů nad celým rozmezím gelu (1-1500 nukleotidů nt, na příklad). To značně zvýší schopnost délky odečtu nad 450 nt.

• ·

Použití odštěpitelných násobných značenýoh složek (k identifikaci mol.hmotn) má tu výhodu, že lze zpracovat větší počet vzorků DNA a jediném gelovém žlábku nebo postupem dělení. Tak například použitím metodologického zde popsaného způsobu lze kombinovat nejméně 96 vzorků a 4 sekvenční reakce (A, G, T, C) v jediném prostředí nebo postupu členění fragmentů dle velikosti, okud se použije větší počet vektorů, které mají jednoznačně značená místa, pak lze kombinovat nejméně 384 vzorků na vlnku gelu( reakce s různými terminátory nemohou být amplifikovány v rámci tohoto schiiatu. Pokud se schopnost použití odštěúitelných značených složek kombinuje s možností použití většího množství vektorů, dosáhne se zřejmě 10.000-násobného zvýšení při postupu sekvencování DNA. Také při zde popisovaných schématech se sníží použití reakčních složek, sníží se počet nutných zařízení, což se projeví snížením nákladů v zájmu konzumenta»

Další výhoda plyne z možnosti kontrolovat postup při celé metodologii, jak je zde popsána· Pro každou sadu vzorků lze přidat do vzorku či vzorků tnitřní kontrolní nukleovou kyselinu. Obvykle to jinak možné není. Tato výhoda umožňuje kontrolovat průběh amplifikování, postup dělení, důkaz značených složek a sekvenční sestavu. To je neuvěřitelná výhoda ve srovnání s běžným syatemem, kdy se kontrola provádí odděleně od vzorků ve všech stupních.

C· Dělení fragmentů DNA

Vzorek, který je třeba analyzovat je často směsí četných • · · · • · · · • · · · · • ······ • · · · · · »······ e · fc ·

-89složek v komplexní matrici. Tak například ve vzorcích, obsahujících neznámé sloučeniny, se musí složky nejprve vzájemně od sebe oddělit tak, že každou individuální složku lze identifikovat jinými a dalšími analytickými postupy. Se zřetelem na dělení jsou vlastnosti komponent ve směsi konstantní za konstantních podmínek, a tedy pokud jsou jednou již stanoveny, mohou se použít k identifikování každé ze složek, jakož i k zjištění v

množství takové složky. Takové postupy jsou typickými pri postupech celení chromatograficky Či elektroforeticky.

1. Vysokotlaková kapalinová chromatografie (HPLC)

Tento postup jako způsob chromatografického dělení slouží k odděleni látek, které jsou rozpuštěny v roztoku. Příslušný přístroj sestává ze zásobníku mobilní fáze, čerpadla, injektoru, dělící kolony a detektoru. Sloučeniny se dělí injikováním alikvot nich podílů vzorku směsi na kolonu. Různé složky směsi procházejí kolonou různými rychlostmi v důsledku jejich rozdělení mezi mobilní kapalnou fázi a stacionární fázi.

V poslední době bylo zjištěno, že částečky Ip-RO-HPCL a neporézní PS/DVB s chemicky navázanými sikylovými řetězci jsou .rychlými alternativami pro kapilární elektroforezu při analýze jak jednoprovazcových, tak i dvojitě provazcových nukleových kyselin za podobného stupně štěpení, viz Huber a spol., Anal. Biochem. 212 , 351 (1993, Huber a spol., Nucl.Acids Res. 21, 1061 (1993), Huber a spol., Biotechniques 16, 898 (1993). Na rozdíl od iontově výměnné chromatografie, jež často nezadržuje dvojité provazcovité DNA ve funkci délky provazce (protože AT páry základ nich složek vzájemně reagují s kladně nabitou stacionární fáfcí, a to silněji, než GC páry základních složek) dovoluje IR-RP-HPLC dělení v přísné závislosti na velikosti.

Způsob, který byl popsán, používá lOOmM triethylamoniumacet jako reagens, spojující ionty a fosfodiestery oligonukleotidů se dají s úspěchem dělit na neporézních částečkách μ&ί poly(styrendivinylbenzenu) použitím vysoce výkonné kapalinové chromatografie • · · • ·

-90• · · · · · · viz Oefner a spol., A nal.Biochem. 223, 39 (1994). dovoluje oddělení PCR produktů., lišících se pouze osmi páry základních složek v délce rozsahu 50 až

Popsaný postup čtyřmi až 200 nukleotidů

2. Elektroforeza

To je postup dělení, založený na pohyblivosti iontů (nebo DNA, jak je to v zde popisovaném případě) v elektrickém poli. Negativně nabité částečky DNA se pohybují směrem ke kladné elektrodě a kladně nabité ionty smerem k záporné elektrodě. Z bezpečnostních důvodů je obvykle jedna z elektrod u dna a další

V jinde, at již kladná či záporná. Nabité částečky se vyznačují různými migračními rychlostmi v závislosti na jejich celkovém náboji, velikosti a tvaru a mohou se proto oddělovat. Aparát s elektrodami je spojen se zdrojem napětí o vysoké voltáži, obsahuje elektrody, pufr a podklad pro pufr, jako je polyakrylamidovx gel, nebo kapilární trubičku. Otevřené kapilární trubičky se 'často používají pro četné typy vzorků a další různé gélové podklady se často používají pro biologické vzorky, jako jsou směsi proteinů nebo fragmentů DNA.

3. Kapilární elektroforeza (CE)

Je to postup, který při různých řešeních (roztoky, isotachoforéza, isoelektrické zaostřování, polyakrylamidový gél, micelární elaktrokinetická chromatografie) se jeví být postupem pro rychlé dělení s vysokou účinností při použití velmi malých objemů vzorku komplikovaných směsí. V souvislosti s neobyčejnou citlivostí a selektivitou molekulární spektroskopie, může -být kombinace CE. + MS potenciálně účinnou technikpu v bioana^JLyze. Při nových možnostech aplikace, jak jsou zde popisovány, propojení obou těchto postupů povede ke způsobům lepšího sledování sekvencí DNA, které vyřadí běžné postupy svou ryclfostí o několik řádů.

Soulad mezi CE a elektrosprejovou ionizací (ESI) z hlediska průtokových rychlostí a ta skutečnost, že oba postupy jsou uzpůsobeny pro (a hlavně pro) iontové podíly v roztoku je základem • · • 9

-91mimořádně přitažlivé kombinace. Byla popsána kombinace jak kapilární zonové elektroforezy (CZE) a kapilární isotachoforezy a quadrupolním hmotnostním spektrometrem na základu ESI, viz Olivares a spol., Anal.Chem. 5 9, 1230 (1987), Smith a spol., Anal.Chem. 60. 436 (1988), Loo a spol., Ahal. Chem. 179. 404 (1989), Bdmonds a spol., J.Chrom. 474. 21 (1989), Loo a spol., J.Ivíicrocolumn.Sep. 1, 223 (1989), Lee a spol., J.Chromatog. 458, 313 (1988), Smith a spol., J.Chromatog. 480. 211 (1989), Grese a spol.91 J.Amer .Chem.Soc. 111, 2835 (1989) p^íQ^-^·- paptidy jsou snadno zjistitelné použitím CZE-analyzy s dobrou citlivostí.

Nejúčinnějším postupem dělení fragmentů DNA je elektroforeza na polyakrylamidovém gélu (PAGE), obecně za použití destičky , gélu. Avšak velkou překážkou současné technologie je poměrně dlouhá doba, které j'e třeba k provedení gélové chromatografie fragmentů DNA, vzniklých sekvenčními reakcemi. Zvýšení (asi desetinásobného) lze docílit kapilární elektroforezou za použití mimořádně tenkých gélů. Ve volném roztoku se všechny pohybují přibližně stejně fychle, protože jejich _ai_íce se projeví kompenzac hmotnosti a náboje. Na polyakrylamidovém gélu se fragmenty prosejí a pohybují se ve funkci své délky a tento přístup byl nyní aplikován na CE. Pozoruhodný počet destiček na metr se dal nyní +7 dosáhnout použitím zesítěného polyakrylamidu (10 destiček na metr, viz Cohen a spol., Proč.Natl.Acad.Sci., USA 85, 9660 (1988). Takové OB koleny, jak to bylo zde popsáno, se mohou použít pro sekvencování DNA. Způsob s použitím CE je v podstatě dvacetpětkrát rychlejší, než gelová chromatografie na destičkách při standartním sekvenčním provedení. Tak například asi 300 podkladů lze přečíst za hodinu. Rychlost dělení je omezena

I při elektroforeza na gólových destičkách hodnotou elektrického pole, které bylo naneseno na gél bez nadbytečného vzniku tepla.

Z toho důvodu se větší rychlost CE dosáhne použitím vysokofrekvenčních polí (300 V/cm při CE proti 10 V/Cm při elektrofořeze na gelových destičkách).Kapilárové provedení zredukuje ampéry a tím i mohutnost a vznik následného tepla.

-92Smith a spol., Huc.Acids Res. 18, 4417 (1590) navrhli použití většího množství kapiláf, uspořádaných paralelně, to a úmyslem zvýšit průtok. Podobně Iviathies a Hungs, Nátuře 359.

167 (1992) zavedli kapilární elektroforezu, kdy se dělení provádí paralelně v kapilárách takto uspořádaných a dokazují tím rychlé průtokové sekvencování, Huang a spol., Anal.Chem.

64, 967, 1992, Huang s spol., Anal.Chem.64, 2149 (1992).

Největší nevýhodou kapilární elektroforezy je omezení množství, vzorku, který se může nanést na kapiláru. Koncentrováním velkého množství vzorku na počátku použití kapiláry před dělením se sice zvýší možnost nanesení vzorku, ale hladina detekce se sníží o několik řádů. Nojznámějšíra postupem předkoncentrování při postupu CE je stahování vzorku, to bylo popsáno nedávno, viz Chien a Burgi, Anal.Chem. 64, 489A (1992). Stahování vzorku je závislé na matričních rozdílech (pH, iontová síla) mezi pufrovaným vzorkem a kapilárním pufrem, takže elektrické pole napříč pásmem vzorku je větší než v oblasti kapiláry. Při stahování vzorku se velký objem vzorku v nízké koncentraci pufru nanese pro předkoncentrování do zhlaví kapilární kolony, kapilára se naplní pufrem téhož složení, ale s vyšší koncentrací. Když ionty vzorku dosáhnou k pufru kapiláry a k dolnímu elektrickému poli, stahují se to koncentrovaného pásma. Stahováním vzorku se zvýší možnost zjištění řádově jednou až třikrát.

Jiným způsobem předkoncentrování je použití isotachoforézy (ITP) před CE dělením analyzovaných vzorků ve volném pásmu. ITP je elektroforetický technický postup, dovolující nanesení mikrolitrových objemů vzorku na kapiláru na rozdíl od nízkých nL injekčních objemů-,- jak to typicky bývává spojeno s CE. Postup - — záleží ve vnesení vzorku mezi dva pufry (vodící a nosné elektrolyty) o vyšší a nižší mobilitě v tom kterém případě ve srování s analyzovaným vzorkem. Postup je bezprostředně postupem koncentrač ním, protože koncentráty analyzované látky se dostávají do čistých pásem stejnou rychlostí. Postup je obvykle méně známý než postup stahování, popsaný výše, protože to vyžaduje volbou obou dvou pufrů jako elektrolytů a schopnost dělit pouze druhy kationtů a aniontů během postupu dělení.

• ·

-93Těžištěm sekvenčního postupu DNA je pozoruhodné selektivní elektroforetické dělení DNA nebo oligonukleotidových fragmentů.

Je to pozoruhodné proto, že dojde k oddělení každého fragmentu a liší se pouze jedním nukleotidem. Bylo dosaženo rozdělení až 1000 fragmentů (1000 bp). Další výhoda sekvencování s použitím odštěpitelných značených složek je tato. Není zde nutnost použít formát tabulkových gélů, dělí-li se fragmenty DNA polyakrylamidovou gelovou elektroforezou při použití odštěpitelných značených složek. Protože se prokombinují početné vzorky ( 4 až 2000), netřeba vzorky sledovat paralelně, jako je tomu v případě běžných barevných primérů nebo barevných terminátorů, jakož i postupů s nimi (např. ABI373 sekvencování). Není zde důvod používat paralelní linky, není důvod používat tabulkový gél. Takže je třeba pouze použít gel formátu trubičky při elelctroforetickem postupu dělení, viz C-rossman a spol., Genet. Anal. Tech.A ppi. j), 9 (1992). Ti poukázali na to, že se dosáhne podstatné výhody, použije-li se formát gélové trubičky místo gelových destiček. Je to v důsledku vetší schopnosti rozptýlit Joule-ovo teplo ve formátu trubičky než na destičce gélu, čímž se zvýší průtokový rychlost (asi o 50%), a dosáhne se většího rozlišeni fragmentů DNA o vysoké molekulární hmotnosti (nad 100 nt). Dlouhé odčítání je rozhodující při genomickém sekvencování.'Takže použití štěpitelných značených složek při sekvencování má svou další výhodou v tom, že dovoluje použití účinnějšího a citlivějšího postupu dělení DNA s podstatně vyšší rozlíšitelbostí.

4. Niikroprovozní zařízení

-- Kapilární elektroforéza je účinným.postupem sekvencování DNA, při soudní analýze, analýze produktů PCR a zjištování restrikční velikosti fragmentů. CE je mnohem rychlejší než tradiční destičková PAGE, protože s kapilárními gély se dá nanést mnohem vyšší potenciál. Avšak CE má nevýiiodu v tom smyslu, že dovoluje sledování pouze jednoho vzorku na gel. Postup kombinuje rychlejší dělící doby CS se schopností analyzovat paralelně více vzorků.

-94·· ·· ·* ·· ι o · · · · 9 « ► · ·· · · ·« ► · · 9 9 999 · 4 » « · · 9 · 4

99 99 99

Podtextem při použití mikroprovozních zařízení je schopnost zvýšit tím hustotu informací pci elektroforeze miniaturizováním rozměrů dílku asi na 100 mikrometrů. Elektronický průmysl využívá běžně mikroprovozních zařízení pro obvody s velikostí pod 1 mikron. Hustota proudu kalipárních sestav je omezena vnějším průměrem kapilární trubičky. kikrovýroba kanálků je spojena s vyšší hustotou sestav. Hikrofabrikace rovněž dovoluje fyzikální sestavy, jak to dosud nedovolovalo použití skleněných vláken a napojuje kanálky přímo na další přístrojové části. Bylo konstruo váno několik málo zařízení použitím mikročásteček pro technologii dělení. Plynový chromatograf, viz Terry a spol., IEEE Trans. Electron Device, ED-26, 18S0 (1979) a kapalinový chromatograf, viz Manz a spol., Sens.Actuators 31:249 (1990) byly vyrobeny na silikonových částečkách, ale tato zařízení se nepříliš používají. Několik skupin publikovalo výsledky dělení za použití fluoreskujících barviv a aminokyselin na mikrovyrobených zařízeních, viz Manz a spol., J .Chromátography 593, 253 (1992), Bffenhauser a spol., Anal.Chrm. 65, 2637 (1993). V poslední době Woolley a Idathies, Proč.Nati.Acad.Sci. 21» 1D348 (1994) poukázali na to, že lze použít fotolithografie a chemického leptání prd dosažení velkého počtu dělících kanálků na skleněném podkladu. Kanálky se naplní dělícími matricemi z hydroxyethylcelulosy (HEC). Bylo zjištěno, že restrikční fragmenty DNA lze oddělit v tak krátké době, jako jsou 2 minuty

D. Štěpení značených složek

Jak to již bylo popsáno výše,, různá provedení vaz ebných složek jsou charakterizována štěpitelňostí (labilitou) za různých specifických fyzikálních nebo chemických podmínkách.

Jako příklady podmínek, jichž lze použít pro štěpení různých provedení vazebných složek lze uvést kyseliny, zásady, oxidaci, redukci, fluoridy, záměnu thiolů, fotolyzu a enzymové podmínky.

Příklady odštěpitelných vazebných složek, které vyhovují při výše uvedených podmínkách pro vazebné složky, jak jsou definovány zde již dříve, jsou odborníkům dobře známé a zahrnují ty, které lze nalézt v katalogu firmy Pierce (Rockford, ID. Příklady zahrnují:

··· ·

999 9999 ·β 99 99 90

-95ethylenglykol-bis-(sukcinimidylsukcinát) (EG3), aminické reaktivní zesítující činidlo, štěpitelné hydroxylaminem,

M, 37° C, 3 aš 6 hodin, disukcinirnidyl-vínan (DST) a sulfo-DST, aminické reaktivní činidlo, zesítující, odštěpitelné půbobením 0,015 M roztoku jodistanu sodného, « ·» bis-[2-( sukcinimidyloxykarbonyloxy )-ethylJ -sulfon (BSOCOBS) a sulfo-BSOCOES, což jsou aminická reaktivní činidla, zesítující, odštěpitelná v alkalickém prostředí, pH 11,6,

1,4—di-[3 ^z-(2 ^z-pyridyldithiopropionamido)J -butan (DPDBB^, pyridyldithiolové zesítující činidlo, štěpitelné thiolovou výměnou nebo redukčně,

N-Ι4—(p-azidosalicylamido)-butyll-3 ^z-(2 ^z-pyridyldithio)*** v propionamid (APDP, pyriayldithiolový zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, bis-^-4-(azidosalicylamido)-ethyp -disulfid, fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, N-sukcininiidýl-(4-azidofenyl)-l,3 -dithiopropionát (SADP) fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, sulfosukcinimidy'j—2-(7-azido-4—methylkumar i n-3-a četamido)-ethyl-l,3'-dithiopropionát (SASE), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, sulfosukeinimidyl-2-(m -azido-o-nitrobenzamido)-ethyl1,3 -dithiopropionát (3AED), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně.

Další příklady odštěpitelných.vazebných složek a podmínky jejich odštěpení, jak je lze využít k odštěpení značených složek, jsou tyto. Silylovou vazebnou skupinu lze štěpit fluorem nebo v kyselém prostředí. 3-, 4-, 5- nebo 6-Substituovaná 2-nitrobenzyloxylová skupina nebo 2-, 3-, 5- nebo 6-substituovaná 4-nitrobenzyloxyskupina jako vazebná složka se dá štěpit fotonovýma zdrojem (fotolyza). 3-, 4-, 5- nebo 6-Substituovaná 2-akoxyfenoxylová skupina, nebo 2-, 3, 5- či 6-substituovaná

• · ·	• · · ·	• · · ·
			•
• ·	• · · ·	• · · ·
			•
• ·	• · · ·	• ·	•
£......	• · · ·	• · · ·

4-alkoxyfenoxylová skupina se dá jako vazebná odštěpit oxidačně působením dusičnanu ceričitoamonného vzorce Ce(NI-I. )₂ (NO,) . Urethanová zesítující skupina vzorce -NCOO- se dá štěpit působením zásady, kyseliny nebo hydridem hlinitolithným, tedy redukčně. Jakákoli^-pentenylová, 2-butehylová nebo 1-butenylcvá vazebná složka se dá odštěpit ozonem, směsí oxidu osmiČelého a jodistanových aniontů nebo manganistanem draselným, tedy oxidačně 2-jo-, 4-, nebo 5-substituovaná-furyl)-oxyskupina se dá jako vazebná štěpit působením kyslíku, bromu, methanolu ěi kyselinou.

Podmínky odštěpení dalších jiných labilných vazebných skupin zahrnují: t-alkyloxyskupina jako vazebná složka se dá štěpit kyselinou, methyl(dialkyl)methoxylová nebo 4-substituovaná

2- alkyl-l,3-dioxolan-2-ylová vazebná skupina se dá šzěpit ionty H^0⁺, 2-silyloxy-vazebná skupina je štěpitelná fluorem nebo kyselinou, vazebné skupiny typů 2-(X)-ethoxy, kde X znamená ketoskupinu, skupinu esterovou, amidovou, kyanovou, nitroskupinu,. skupinu sulfidickou, sulfoxidovou nebo sulfonovou se dají odštěpit v alkalickém prostředí,2-, 3-, 4-, 5- nebo 6-substituované běnzyloxy-vazebné skupiny se mohou štěpit působením kyselin nebo za redukčních podmínek, 2-butenyloxy-vazebné skupiny se dají štěpit působením působením sloučeniny vzorce )^Pj^RhCl(H)

3- , 4-, 5- nebo β-substituované 2-bromfenoxy-vazebné skupiny lze štěpit lithiem, hořčíkem nebo butyllithiem, methylthiomethoxylové vazebné skupiny se mohou štěpit kationty dvojmocné rtuti, vazebné skupiny typu 2-(X)-ethoxy-, kde X znamená halogen, lze štěpit zinkem nebo hořčíkem, 2-hydroxyethyloxylové vazebné skupiny se dají štěpit oxidačně, například použitím octanu olovičitého.

Za výhodné vazebné skupiny lze pokládat ty, které se dají štěpit kyselinou nebo fotolyzou. Některé vazebné skupiny, labilní v kyselém prostředí, byly připraveny pro peptidové syntézy na pevné fázi a dají se použít pro vazbu značené složky na LIOI,

ííěkteré z vazebných skupin jsou nověji popsány v přehledném článku Llloyd-Williams-e a spol., Tetrahedron 4.9, 1106511133 (1993). Jeden použitelný tyk je založen na p-alkoxybenzylalkoholech, z nich dva jsou dostupné od Advanced Chem.Tech. (Louisville, KY), totiž 4-hydroxymethylfenoxyoctová kyselina a 4-(4-hydroxymethyl-2-methoxyfenoxy)-máselná kyselina. Obě vazebné skupiny se napojí na značenou složku použitím esterové vazby na benzylalkohol a na MOI s obsahem aminoskupiny amidovou vazbou karboxylové kyseliny. Značené složky těchto molekul lze uvolnit z vazby na MOI použitím kyseliny trifluoroctové o různých koncentracích. Štěpení těchto vazebných složek se projeví uvolněním karboxylové skupina na značené složce. Štěpení značených složek, navázaných podobnými vazebnými složkami, jako je 2,4-dime thoxy-4 '-(kar boxyrae thy loxy )-benzhydrylamin se projeví uvolněním kar boxylamidu na takto uvolněné značené složce. Zmíněná látka je dostupná od Advanced Chem.Tech. jako PMOC-chráněná forma.

Fotolabilní vazehné složky, použitelné pro toto aplikování, byly z největší míry vyvinuty pro peptidovou syntézu na pevné fázi (viz přehled Lloyd-Williams). Takové vazebné složky jsou obvykle založeny na 2-nitrobenzylesterech nebo 2_nitrobenzylamidech. Dva příklady fotolabilních vazebných slořek, které byly uvedeny v poslední době v literatuře, jsou: 4-Jjr-(l-Fmoc-amino)-ethylJ^-2methoxy-5-nitrofenoxybutanová kyselina, Holmes a Jones, J.Org. Chem. 60, 2318-2319 (1993) a 3-(Fmoc-amino)-3-(2-nitrofenyl)propionová kyselina, Brown a spol., Molecular Diversity 1, 4-12 (1995). Obě vazebné__složky mohou být navázány pomocí karboxylové skupinyÝa amin^na molekule MOI. Napojení znpčené části na vazebnou vložku se provede formou amidu mezi karboxylovou skupinou na značené složce a aminoskupinou na vazebné vložce. Stepem fotolabilních vazebných složek se obvykle provede ultrafialovým světlem vlnové délky 350 nm za intensit a dob, které jsou odborníkům jasné. Jako příklady obchodně dostupných přístrojů pro fotochemické štěpení lze uvést Aura Industries Inc.(3taten Island, KY) a Agrenetics (Wilmington, MA). Štěpení

-98vazebné složky se projeví uvolněním primární amidoskupiny na značené složce. Jako příklady fotoštěpitelných vazebných složek je možno uvést nitrofenylestery glycinu, exo- a endo2-benzonorborneylchloridy a methansulfonáty, dále 3-amino-3(2-rnitrofenyl)-propionovou kyselinu. Příklady enzymového štěpení zahrnují esterasy, štěpící esterovou vazbu, nukleasy, které štěpí fosfodiesterovou vazbu a proteasy, štěpísí peptidové vazby atd.

E. Detekce značených složek

Detekční postupy se typicky zakládají na absorpci a emisi v určité oblasti spektra. Pokud atomy nebo molekuly absorbují světlo, pak jejich vstupní energie excituje kvantovanou strukturu na vyšší energetickou hladinu. Typ excitace je závislý na vlnové délce světal. Elektrony jsou posunovány na vyšší orbitaly ultrafialovým nebo viditelným světlem, molekulární vibrace infračerveným soektrem a rotace jsou buzeny mikrovlnami. Absorpční spektrum je absorpcí světla ve funkci vlnové délky. Spektrum atomu nebo molekuly závisí na energetické hladině struktury. Absorpční spektra jsou vhodná pro identifikování sloučenin. Specifické absorpční spektroskopické postupy zahrnují atomovou absorpční spektroskopii (AA), infračervenou spektroskopii (IR) a ultrafialovou spektroskopii (UV-vůs).

Atomy nebo molekuly, které byly excitovány na vyšší energetické hladiny, mohou klesnout na nižší hladinu emisní radiací. Tato emise světla je označována jako fluorescence, má-li transjpise mezi oběma stavy týž spin, nebo fosforescence, dojde-li k přechodu mezi stavy s různým spinem. Emisní intenzita analyzované látky je lineárně úměrná’koncentraČi (za nízkých koncentrací) a dá se použít pro kvantifikování emitujícího zdroje. Specifické emisní spektroskopické postupy zahrnují atomovou emisní spektroskopii (AES), atomovou fluorescenční spektroskopii (APS), molekulární, laserem indukovanou fluorescenci (LIP) a fluorescenci paprsky X (XRP).

Pokud elektromagnetické záření prochází nějakou látkou, pak větší podíl z největší míry prochází původním směrem, ale malý podíl se rozptýlí do dalších směrů. Světlo, jež se rozptýlí • · • · • ·

-99za stejné vlnové délky’, jako světlo příchozí se nazývá Rayleighovým rozptylem. Světlo, jež se rozptýlí průhlednou pevnou látkou v důsledku vibrací (fonony) se nazývá Brillouin-ovým rozptylem. Toto je typicky posunuto o 0,1 až 1 vlnových čísel ve srovnání s dopadajícím světlem. Světlo se rozptyluje v důsledku vibrací v molekulách nebo nebo v opakních pevných podíles optický mi fonony a to je označováno jako Ramanovo světlo. Ramanovo rozptýlené světlo je posun až i o 4000 vlnových čísel ve srovnání s dopadajícím světlem. Specifické rozptylové spektroskopické postupy zahrnují tedy Raman-ovu spektroskopii.

Infračervená spektroskopie je měřením vlnové délky a intenzity absorpce středního infračerveného světla vzorkem. Střední infračervené světlo (2,5 až 50 yim, 4000 - 200cm ^) je energeticky dostačující k tomu, aby excitovalo molekulární vibrace na vyšší energetické hladiny. Vlnové délky infračervených absorpčních pásů jsou charakteristikou specifických typů chemických vazeb a infračervená spektroskopie se obecně nejvíce používá k identifikování organických a orgahometalických molekul.

Blízká infračervená absorpční spektroskopie (NIR) je měřením vlnové délky a intenzity absorpce blízkého infračerveného světla vzorkem. Spadá do rozsahu 800 nm-2,5 jjm (12.500 až 4000 cm’'¹') a energeticky dostačuje k. excitování vyšších hladin a pro kombinace molekulárních vibrací na vyšší energetické hladiny. NIR. spektroskopie se typicky používá pro kvantitativní zjištování organických funkčních skupin, zvláště hydroxylových, N-H skupin a skupin kar bonylových. Složky a označení NIR instrumentace se podobá UV-vis absorpčním spektrometrům. Zdrojem světla je obvykle wolframová lampa a detektorem obvykle detektor s pevným sirníkem olovnatým.' Držáky vzorku mohou být skleněné nebo z křemene, typickými rozpouštědly jsou chlorid uhličitý a sírouhlík. Běžné přístroje pro NIRspektroskopii umožňují současné monitorování a kontrolu postupu.

Ultrafialová_Sp_ektroskopie a absorpční spektroskopie ve viditelné části spektra (UV-vis) je měřením vlnové délky a inten·· ·· • · » · · I

-100-.....

žity absorpce vzorkem v blízké ultrafialové oblasti a ve viditelné části světla. K absorpci ve vakuu UV dochází při 100 až 2 00 nm;(10^ - 50 000 cn”·'·) UV (křemen) při 200 až 35B nm; (50 000 až 28 570 cm”^) a viditelné světlo při 350 až 800 cm;

(28 570 až 12 500 cm”\ to za označení Beer-Lambert-Bouguet-ův zákon. Ultrafialové a viditelné světlo je energeticky dostačující k tomu, aby posunulo vnější elektrony na vyšší energetické hladiny. UV-vis-spektroskopie se může obvykle použít ve spojitosti s molekulami a anorganickými ionty či komplexy v roztoku. UV-vis spektra jsou omezena širokými rysy spektra. Zdrojem světla je obvykle vodíková nebo deuteriová lampa pro ultrafialové záření a wolframová lampa pro viditelné záření. Vlnové délky těchto kontinuálních zdrojů světla se zvolí separátorem vlnové v

délky, jako je hranol nebo stupňový monochrometor. Spektra, tató dosažená stupňováním separatoren vlnové délky’ a kvantitativní měření lze provést ze spektra nebo použitím jediné vlnové délky.

Hmotnostní spektrometry využívají rozdílu v poměru hmot.nost/náboj (m/z) ionizovaných atomů Či molekul k jejich vzájemnému oddělení. Hmotnostní spektrometrie je tedy vhodná pro kvantové zjištění atomů či molekul, jakož i pro zjištění chemického a strukturního složení molekul. Molekuly mají rozdílné fragmenteční sklony, což vede k strukturním informacím a k identifikování sloučenin. Obecný postup při práci s hmotnostním spektrometrem je tento: vytvoří se plynná fáze iontů, ionty se oddělí prostorově či časově na základě jejich poměru m/z a změří se množství iontů každého z poměrů m/z. Schopnost dělit ionty hmotnostním spektrometrem je. dána, rozlišením, .definovaným.jako R = rn/ď^m, _; kde m znamená hmotnost iontu a je rozdíl hmotnosti mezi dvěma rozlišitelnými píky v hmotnostním spektru. Tak například hmotnostní spektrometr s rozlišovací schopností 1000 can rozliší ion s hodnotou m/z 100,0 od iontus hodnotou m/z 100,1.

Hmotnostní spektrometr (IvíS) sestává obecně z iontového zdroje, analyzátoru,rozlišujícího hmotnost a detektoru iontů. Magnetický sektor, auadrupol a zařízení pro dobu průletu vyžadují také optickou extrakci a akceleraci iontů, aby se totiž ionty dostaly ze zdroje iontů to hmotnostního analyzátoru. Podrobnosti některých provedení hmotnostních analyzátorů(magnetický sektor

-101MS, auadrupol LIS a doba průletu MS) jsou zde uvedeny dále. Jednoduchý zaostřovacá analyzátor pro magnetický sektor MS používá paprskovou dráhu částeček 180, 90 nebo 60 stupňů. Různá zařízení, ovlivňující částečky oddělených iontů Různými poměry hmotnost/nábo j . V double-zaostřovacím analyzátoru je přidán elektrostatický analyzátor k oddělení částeček s různými kinetickými energiemi,

Quadrupolní hmotnostní filtr pro quadrupolní hmotnostní spektrometrii je tvořen čtyřmi kovovými tyčinkami, uspořádanými paralelně. Použité voltové napětí ovlivňuje přenos iontů, pohybujících se dolů paprskem světla mezi čtyřmi tyčinkami. Při určitém voltovém napětí DC a AC pouze ionty s určitým poměrem hmotnost/náboj projdou quadrupolním filtrem a všechny ostatní vybočí z jejich původního směru. Hmotnostní ppektrum se získá monitorováním iontů, procházejích quadrupolním filtrem, jak se mění voltové napětí na tyčinkách.

Hmotnostní spektrometry typu doba průletu využívají rozdílů v době průletu driftovou oblastí k oddělení iontů s lišícími se hmotnostmi. Pracuje pulzujícím· způsobem, takže ionty se $usí tvořit pulsy a/nebo extrahovat v pulsech. Pulsované elektrické pole urychluje všechny ionty do driftové oblasti bez elektrického pole s kinetickou energií qV, kde q znamená náboj iontu a V je použité voltové napětí. Protože kinetická energie iontů = 0,5 mV , ©ají lehčí ionty vyšší rychlost než těžší ionty a dosahují do pásma detektoru na konci driftového pásma rychleji. Vývod z iontového detektoru se přenese na osciloskop ve funkci času za vzniku hmotnostního spektra.

Způsob tvorby iontů je výchozím bodem pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Chemická ionizace je způsob, který používá reagující ion pro reakci s molekulou analyzované látky (v tomto v

případě značené složky) za vzniku iontů bud transferem protonu nebo hydridu. Reagující ionty se vytvoří zavedením velkého nadbytku methanu (ve vztahu k značené složce) do elektronového zdroje dopadu na ionty (El). Srážka s elektrony se projeví vznikem CH^⁺ a GH₃, které dále reagují s methanem za vzniku GH^ a CgH^⁴. Dalším postupem pro ionizování značených složek plazma a doutnavý výboj. Plazmou je horký, částečně ionizovaný plyn,

-102který účinně excituje a ionizuje atomy. Doutnavý výboj je nízkotlaková plazma, udržovaná mezi dvěma elektrodami. Elektronová impaktní ionizace používá elektronový paprsek, zpravidla generovaný vláknem wolframu, k ionizování atomů či molekul doutnavého výboje. Elektron z paprsku narazí na elektron analyzovaných atomů či molekul za vzniku iontů. Ionizování elektrosprejem využívá velmi jemné jehličky nebo serie stěračů. Roztok vzorku se vstřikuje do komůrky zdroje za vzniku kapiček, ty nesou náboj, když opouštějí kapiláru a jak se rozpouštědlo odpaří, kapičky zmizí, zanechávajíce vysoce nabité molekuly analyzované látky. ESI se zvláště hodí pro velké biologické molekuly, které lze nesnadno změnit na páru nebo ionizovat. Bombardování rychlými atomy (FAB) využívá paprsek neutrálních atomů o vysoké energii, typicky xenonu nebo argonu, který narazí do pevného vzorku za vzniku a průběhu desorpce a ionizování. Postup se používá pro velké biologické molekuly, které lze nesnadno převést do plynné fáze. FAB způsobí malou fragmentaci a obvykle vznikne velký molekulární iontový pík, použitelný pro stanovení hmotnosti molekuly. Atomový paprsek vznikne akcelerováním iontů ze zdroje iontů buňkou pro výměnu náboje. Ionty pohltí elektron při srážce s neutrálními atomy za vzniku paprsku atomů o vysoké energii. Laser-ová ionizace (LIMS) je způsob, kdy dopadem laseru se oddělí materiál z povrchu vzorku za vzniku mikroplazmy, jež ionizuje některou z dalších složek. Laserová desorpční ionizace za podpory matrice (láALDIj) je variací laserové ionizace při zplyňování a ionizování velkých biologických molekul, jako jsou proteiny nebo fragmenty DNA. Biologické molekuly se dispergují v pevné matrici, jako je kyselina nikotinová. Ultrafialový l^ser odloupne matrici, jež unáší některou z' velkých molekul, přenese ji do plynné fáze v ionizovaném stavu, takže se může dostat do hmotnostního spektrometru. Flazmadesorpční ionizování (FD) využívá rozpad Cf, kdy vznikají dva štěpné fragmenty, pohybující se v opačných směrech. Jeden fragment narazí do vzorku a vyrazí odtud 1 až 10 analyzovatelných • φ φ

-103iontů. Druhý fragment narazí na detektor a zahájí začátek snímání dat. Tento ionizační postup je zvláště vhodný pro velké biologické molekuly. ResonanČní ionizace (RIMS) je postup, _ge j_{eden v}i_Ce laser-ových paprsků vyladí do resonance k transmisi atomů či molekul v plynné fázi, aby ji posunul postupně nad odpovídající ionizační potenciál za vzniku iontu. Sekundární ionizace (SIMS) využívá paprsek iontu, jako je některý z ³Ke⁺, ^0⁺, nebo 4θή_Γ ⁺, ten se zaměří na povrch vzorku a rozpráší materiál do plynné fáze. Jiskřící zdroj je způsob, jímž se ionizuje analyzovaná látka v pevných vzorcích pulsováním elektrického proudu mezi dvěma elektrodami.

Značená složka může být nabita před, během nebo po štěpení od molekuly, na kterou byla připojena. Ionizační postupy založené na iontové desorpci, přímá tvorba nebo emise iontů z pevných či kapalných povrchů umožnily zvýšenou aplikovatelnost na netěkavé a tepelně labilní sloučeniny. Tyto postupy eliminují nutnost neutrálních molekul zplynit se před ioni.zováním a obecně minimalizují tepelnou degradaci těchto molekulárních typů. Do těchto postupů patří desorpce pole, viz Bečky, Principles of ffield Ionization and Field Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford, 1977, plazmová desorpce, v?Lz Sundqvist a Mac Farlane, Mass Spectrom.Rev. 4, 421 (1985), laserová desorpce, viz Karas a Hillenkamp, Anal.Chem. 60, 2299 (1988), dále Karas a spol., Angevj.Chem. 101, 805,(1989), bombardování rychlými částečkami, bapř. rychlé atomové bombardování, FAB a sekundární iontová hmotnostní spektrometrie, SIMS, viz Barber a spol., Anal.Chem. 54, 645A (1982), termosprejová ionizace, viz Vestal, Mass Spectrom.Rev. 2_, 447 (1983). Termosprej se často používá při současné kombinaci s kapalinovou chromatografií. Kontinuální průtokové FAB postupy, viz Caprioli a spol., Anal.

Chem. 58, 2949 (1986) mají rovněž významnou důležitost. Dokonalejší vyjmenování kombinací ionizování a hmotnostní spektrometrie uvádí:

• · • · • · · • ··

-104 )trii se zachycení''jontů, elektronově-sprejosrometrii, iontově-sprejovou hmotnostní Línově ionizační hmotnostní spektrometrii, í spektrometrii za norm. tlaku, elektronověú spektrometrii, metastabilními atomy bombar)tnostní spektrometrii, rychlými atomy bombardi;nostní spektrometrii, MALDI hmotnostní -Ionizační průletovou hmotnostní spektroipičkovou hmotnostní spektrometrii, MALDI-TOF ;trii, APGI hmotnostní spektrometrii, nanoí spektrometrii, párove-sprejovou monizační ítrii, chemiky ionizační hmotnostní spektroLonizační .^hmotnostní spektrometrii, ' hmotnostní spektrometrii, termosprejovou itrii.

ipy, pokud se použijí na netěkavé biologické rozsahy použitelnosti. Ionizační provedení kompozicích matrice a typu látek. Z běžně plyne, že horní mezí molekulární hmotnosti altonů, viz Jones a Krolik, Rapid Oomm.Nass.

7). Protože TS se prakticky provádí jen s stními spektrometry, citlivost velmi trpí poměrů m/z, tedy hmotnost k náboji. Průletové ;try (TOP) jsou komerčně dostupné a mají výrozmezí m/z je omezeno jen výkonností de' popsány dva nové způsoby ionizačních postupů. íu nyní označovány jako laser-ová desórpce za I), viz Karas a Hillenkamp, Anal.Chem. 60, : spol., Angew.Chem. lOl, 805 (1989) a zování (ESI). Oba postupy se vyznačují velmi inností, tj. velmi vysokým poměrem produkce 'spotřeba molekul. Citlivost, což je konečný , postupu, je závislá na velikosti vzorku, •okove rychlosti, účinnosti detekce a účinná ce.

trie se zakládá na těch Dole a spol., jová ionizace (ESI) n molekulám pro anaL: elektrosprejová ioni5ek zmizením kapa? nabité částečky,

2a norm. tlaku, se La, až náboj odpuzo‘kulombické explosroverzní a hypotézy Lz Blades a spol., spol·, Anal.Chem. Spectrom. 4, 524-35 .by iontů, ESI vede )odmínek. ;

;ností spektrometrií cládá na dostatečně ’ pomocí ESI se vztahuje .ekulou. Experimentální •užitím podmínek kyišit ionizování bylo ovsem možno, viz •503 (1992), Smith bněji popisuje takto.

:a stupně: dispergování = tlaku s následným .. Roztok analyzovaných ti vysokého elektr. rguje jako mlha malých, ekuly analyzované piček a postupem .volní protonová né sprej obvykle vyža• ··

-105Elektrosprejová hmotnostní spektrometrie se zakládá na myšlénce, kterou vyslovil v šedesátých letech Dole a spol., J.Chem.Phys. 49. 2240 (1968). Elektrosprejová ionizace (ESI) jest jednou možností, pak dospět k nabitým molekulám pro analýzu hmotnostní spektrometrií. V krátkosti: elektrosprejová ioni zace vede ke vzniku vysoce nabitých částeček zmizením kapalin v silném elektrostatickém poli. Vysoce nabité Částečky, vytvořené zpravidla v toku suchého plynu za norm.tlaku, se smrsknou odpařením neutrálního rozpouštědla, až náboj odpuzováním překoná koheživní síly, což vede k kulombické explozi. Přesný mechanizmus ionizování j.e kontroverzní a hypotézy v tomto směru vyslovilo několik skupin, viz Blades a spol., Anal.Chem. 63. 2109-14 (1991), Kebarle a spol., Anal.Chem.

65, A972-86 (1993), Penn, J.Amer.Soc.Mass Spectrom. 4, 524-35 (1993). Bez zřetele na vlastní způsob tvorby iontů, ESI vede k nabitým mokelulám z roztoku za mírných podmínek.

Možnost získat použitelné údaje hmotností spektrometrií malých množství organických molekul se zakládá na dostatečně účinné produkci iontů. Účinnost ionizování pomocí ESI se vztahuj k míře pozitivních nábojů, spojených s molekulou. Experimentální zvýšení ionizování se obvykle spojuje s použitím podmínek kyselého prostředí. Jinou možností, jak zlepšit ionizování bylo použití kvartérnizovaných aminů, je-li to ovšem možno, viz Aebersold a spol., Protein Science 1, 494-503 (1992), Smith a spol., Anal.Chem. 60, 436-41 (1988).

Elektrosprejové ionizování se podrobněji popisuje takto. Vznik iontů elektrosprejováním vyžaduje dva stupně: dispergování vysoce nabitých částeček v blízkosti norm.tlaku š následným vytvořením podmínek, indikujících odpaření. Roztok analyzovaných molekul se vede jehlou, udržovanou za velmi vysokého elektr. potenciálu. Na konci jehly se roztok disperguje jako mlha malých vysoce nabitých částeček, obsahujících molekuly analyzované látky. Dojde k rychlému odpaření malých kapiček a postupem desorpce pole nebo konečným odpařením se uvolní protonované proteinové molekuly do plynné fáze.Elektrosprej obvykle vyža00

000·0

0« 00 0 0 0 4

0 00

00 » 0 0 4 » 0 00

0 0 4

0 4

00

-106duje použití vysokého elektrického pole na malý průtok kapaliny, obecně 1-10 ul/min z kapilární trubičky. Potenciální rozdíl 3-6 kV se obvykle využije mezi kapilárou a protielektrodou, umístěnou v odstupu 0,2 až 2 cm (kde ionty, nabité shluky a i nabité částečky, v závislosti na míře vymizení rozpouštědla, se mohou testovat jako vzorky hmotnostní spektrometrií malým otvůrkem. Výsledkem elektrického pole je akumulace náboje na povrchu kapaliny na konci kapiláry; takže průtoková rychlost kapaliny, rezistivita a povrchové napětí jsou důležitými faktory při tvorbě kapiček. Výsledkem vysokého elektrického pole je rozrušení povrchu kapaliny a tvorba vysoce nabitých kapiček. Může dojít ke vzniku kladně nebo záporně nabitých kapiček v závislosti na předpětí kapiláry. Vytvoření negativně nabitých iontů vyžaduje přítomnost elektronových skavengerů, jako je kyslík ke znemožnění elektrického vybití.

Elektrostaticky lze sprejovat do vakua velké množství různých kapalin, případně za pomoci zmlžujícího činidla.

Použití pouhého elektrického pole pro zmizení je spojeno s určitými omezeními ve spojitosti s vodivostí kapaliny a di-5 elektrickou konstantou.Vodivost roztoku pod asi 10 ohmů je nutná za teploty místnosti pro stabilní elektrosprej za použitelných průtokových rychlostí, odpovídajících vodnému roztoku elektrolytu pod 10 M. Při provedení postupu, nejužitečnějšího pro ESI-MS se projeví průtoková rychlost kapaliny dispergováním kapaliny ve formě jemné mlhy. Krátká vzdálenost od kapiláry k průměru kapiček je často takřka jednotná a řáddvě kolem 1 pm. Zvláště důležité je to, že celkový elektrosprejový iontový proud se zvýší jen nepatrně při vyšších průtokových rychlostech kapaliny. Jsou zde podklady pro tvrzení, že zahřívání je vhodné pro elektrosprejové manipulování. Tak například mírné zahřátí vodného roztoku vede k snazšímu elektrosprejování, pravděpodobně v důsledku snížení viskozity a povrchového napětí. Pomoc jak z hlediska teploty, tak i zmizení plynem dovoluje elektrosprejování provádět za vyšších průtokových rychlostí, a_le za poklesu rozsahu nabití částeček. Tvorba molekulárních

-107• · · ββββ ·· · · · • · ·

Ο Ο 9 9 iontů vyžaduje podmínky, za nichž dojde k odpaření původní populace kapiček. Toho lze docílit za vyšších tlaků proudem •suchého plynu za mírných teplot, řádově pod 60° C, zahříváním během převodu kapaliny stykovou plochou a - zvláště pak v případě postupů, zachycujících ionty - energetickými srážkami za poměrně nízkého tlaku.

Ačkoliv podrobnosti postupů, spadajících do rozsahu ESI zůstávají neurčité, pak velmi male kapičky, vzniklé při ESI se zdají dovolovat u všech možností přenos čistého náboje v roztoku na plynnou fázi po odpaření zbývajícího rozpouštědla. Hmotnostní spektrometrické detegování potom vyžaduje, aby ionty měly únosné rozmezí m/z (tedy pod 4000 daltónů pro quadrupolní zařízení) po zbavení se rozpouštědla, jakož i aby vznikaly a byly přenášeny s dostatečnou účinností. Velký počet rozpustných látek, u nichž byla zjištěna možnost použití při BSI-MS, postrádání zásadní závislosti účinnosti ionizování na molekulové hmotnosti vede k názoru, že jde o velmi hodnotný a široce aplikovatelný ionizační postup.

funkce elektrosprejového iontového zdroje v blízkosti norm. tlaku: zdrojem je obvykle kovová nabo skleněná kapilára, zahrnující způsob elektrického předpětí kapalného roztoku vztažmo k protielektrodě. Roztoky, obvykle zo použití směsi vody a methanolu, obsahující analyzovanou látku a často další přísady, jako je kyselina octová, proudí z koncovky kapiláry. Byl popsánu zdroj ESI, viz Smith a spol., Anal.Qhem. 62, 885 (1990), kterým lze uzpůsobit v podstatě jakýkoli kapalinový systém. Typická průtoková rychlost pro ESI je 1 až 10 ul/min. Zásadním požadavkem stykové plochy ESÍ-MS je shromáždit a přenést ionty z oblasti vysokého tlaku do oblasti Ι.Ί3 tak účinně, jak je to jen možno.

Účinnost ESI může být velmi vysoká, což je podkladem pro mimořádně citlivá měření, což je právě vhodné pro zde popisovaný vynález. Přístrojový výkon z hlediska proudu může vyústit v celkovém proudu iontů u detektoru asi 2 x 10 A nebo 10 pulsů/s pro jednoduše nabité druhy. Ha podkladě výkonu přístroje vedou “ÍO™ _n0b_{o as}j_ 10 ¹⁸ mol/s jedkoncentrace tak nízké, jako je 10 • 9

-108Mezivrstva má také schopnost shromáždit fragmenty DNA, jak se eluují ode dna gelu* Gelem může být tabulka gelu, trubička gelu, kapilára atd. Fragmenty DNA se mohou jímat několika způsoby.Prvým je použití elektrického pole, kdy se jímají fragmenty DNA na elektrodě nebo v její blízkosti. Druhou možností je provedení, kdy se fragmenty DNA jímají tak,že se vede proud plynu u dna gelu. Předpoklady obou dvou postupů lze kombinovat, jímají-li se fragmenty DNA proudem plynu, který se potom může zhustit použitím elektrického pole. Konečným výsledkem je to, že se fragmenty DNA vyjmou z prostředí, ve kterém došlo k jejich oddělení. Takže fragmenty DNA mohou být uneseny z roztoku jednoho typu do jiného použitím elektrického pole.

Pokud jsou již fragmenty DNA v odpovídajícím roztoku (kompatibilním s elektropprejem a hmotnostní spektrometrií), lze odštěpit z fragmentu DNA značenou složku. Fragment DNA (nebo jeho zbytky) se mohou oddělit od značené složky použitím elektrického pole, s výhodou, má-li značená složka opačný náboj ve srovnání s kombinací DNA-značená složka. Značená složka se potom dostaně do elektrosprejového zařízení použitím elektrického pole nebo proudu kapaliny.

Fluoreskující značené složky lze identifikovat a kvantitativně vyhodnotit ponejvíce přímo dle absorpčních a fluorescenčních emisí vlnových délek a intenzit.

Zatím co běžný spektrofluorometr je mimořádně pružný a poskytuje kontinuální rozsah excitačních a emisních vlnových délek (1θ_χ, l_gl, ¹S2 specialisovanější přístroje, jako je průtokový cytometr a stupňové laser-ové mikroskopy vyžadují vzorky, excitovatelné za jediné pevné vlnové délky.

U současných přístrojů jde o 488-nm linii argonového laseru.

Fluorescenční intenzita na vzorek molekuly je úměrná produkt z a QY. Rozsah těchto parametrů mezi fluorofory současně praktické důležitosti činí asi 10 000 až 100 000 cm 'DM pro a 0,1 až 1,0 pro QY.

-1,,-1 • ··

-109Fokud se absorpce položí proti nasycení použitím iluminací o vysokých intenzitách, pak ireverzibilní destrukce excitovaného fluoroforu (foto-blednutí) se stane faktorem, omezujícím možnost důkazu a stanovení pomocí fluorescence. Praktický dopad foto-blednutí závisí na postupu techniky fluorescenční detekce.

Je jasné, že určité opatření (mezipovrch) lze vřadit mezi stupně dělení a detekce k umožnění kontinuálních postupů a dělení velikosti a důkazu značené složky (v konkrétní době).

To spojuje m&tody dělení a instrumentační s metodami detekce a instrumentačními do jediného opaření. Tak například mezivrstva se vloží mezi postup dělení a detekce hmotnostní spektrometrií nebo potenciostatickou amperometrii.

Funkcí mezivrstvy je v prvé řadě uvolnění (např.hmotnostní spektrometrií) značené složky z analyzovaného podílu, Je zde několik příkladných sežisení mezivrstvy. Ráz mezivrstvy je závislý na volbě štěpitelných vazebných složekV případě vazebných složek, štěpitelných světlem nafo fotoštěpitelných je nurná energie nebo zdroj fotonů. V případě vazebných složek, labilních v kyselém prostředí, v alkalickém prostředí nebo disulfidických je nutné přidání vhodného činidla do mezi. vrstvy. V případě vezebných složek, labilních za tepla, je nutný tepelný zdroj. Fřidání enzymů je nutné pro vazebné složky, citli« vé na enzymy, jako je tomu u specifických proteasových a peptidových vazebných složek, nukleasových a DNA- či RNA-vazebných složek, glykosylasy, HRF nebo fosfatasy a vazebných složek, které nejsou stálé po provedeném štěpení (například podobné chemiluminiscenčním substrátům). Další charakteristiky mezivrstev zahrnují minimální rozšiřování pásu, oddělení DNA of značených složek přád injikováním do hmotnostního spektrometru. Postupy dělení zahrnují ty, které se zakládají na elektroforetických metodách a technikách, afinitních postupech, retenci dle velikosti (dialyza), filtraci apod.

Také je možné koncentrovat značené složky (nebo sestavy nukleová kyselina-vazebná složka- značená složka), jímaje • ·

-110elektroforeticky a pak uvolnit do jiného reakčního toku, který je kompatibilní s příslušným typem zvoleného ionizačního postupu. Mezivrstva může být rovněž schopná zachytit značené složky (nebo sestavy nukleová kyselina_Tvazetibá složka-značená složka) na mikrokuličkách, s následným vstřelením kuliček do dalšího prostoru, kde dojde k laser-ové desorpci a odpaření, Také je možné extrahovat tok do jiného J>ufru (například z pufru pro kapilární elektroforezu do hydrofobného pufru pomocí permeabilní membrány). Může být žádoucí v některých případech přepravit značené složky bezprostředně do hmotnostního spektrometru, což zahrnuje další funkci meziwstvy. A další funkcí mezivrstvy je přepravit značené složky z většího počtu kolonek do hmotnostního spektrometru s rotační dobou štěrbiny pro každou kolonku. Také lze přepravit značené složky s jediné kolonky do většího počtu hmotnostně-spektrálních detektorů, oddělit je časově, jímat každou sadu značených složek po několik milisekund s následnou přepravou do hmotnostního spektrometru.

Dále je výčet representativních prodejců pro technologie dělaní a detekce k použití dle tohoto vynálezu;

Hoefer Scientific Instruments (San Prancisco, CA): elektroforezní zařízení; (Tv/o Step™, Poker Páce^11,1 II) pro sekvenční aplikace; 'Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), elektroforetická zařízení pro dělení a sekvencování DNA (PhastSystem pro PCR-SSCP analýzu, MacroPhor Sy&tem pro sekvencování DNA), Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (ABI, Poster City, CA): semiautomatizovaná sekvenční zařízení na základě fluorescenčních barviv (ABI377);

Análytical Spectral Devices (Boulder, CO), UV-spektrometry;

Hitachi Instruments (Tokyo, Japonsko), atomové absorpční spektrometry, fluorescenční spektrometry, LC a GC hmotnostní spektrometry, NMR-soektrometry a UV-VIS spektrometry;. PerSeptive Bio. systems (Pramingham, MA), hmotnostní spektrometry (Voyager Elitě) Bruker Instruments lne. (Manning Park, MA), PTIR-spektrometry (Vector 22), PT-raman spektrometry, průtokové hmotnostní spektroΦττ tu metry (Reflex II ),Ion Trap Mass Spectrometer (Bsquire Ό a Maldi Mass Spectrometer; Analytical Technology lne. (ATI, Boston, MA) kapilárne-gélová elektroforezní zařízení, UV-detektory, detek• · • · · 9 9 «· · · • · · · · ·· · · ·· · • 9 9 9 99 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 99 ·· ·· ··

-111tory s diodovým uspořádáním, Teledyne Electronic Technologies (Ilountain View, CA): Ion Trap Mass Spectrometer (3 DO Discovery a 3 DQ Apogee , Perkin Elmer/Applied Siosystems 'Division (Poster City, CA), Sciex Mass Spectrometer (tripple quadrupole LC/MS/MS, API 100/300), kompatibilní s elektrosprejem, Hewlett-Packard (Santa Clara, CA) :hmotnostní selektivní detektory (HP 5972A), MALDI-TOF Mass Spectrometers (HP G 2O25A), Diodě Array Detectors ,· CE unites, HPLC units (HP 1090) jako

UV-spektrometry; Finnigan Corporation (San Jose, CA): hmotnostní TM spektrometry (magnetický sektor MAT 95 S ‘), quadrupolní TM spektrometry (MAT 95 SQ ') a čtyři další podobné hmotnostní spektrometry; Rainin (Emeryville, CA), zařízení Jíro vysokotlakovou kapalinovou chromatografií.

Postupy a kompozice zde popisované dovolují použití štěpir telných značených složek k mapování vzorků spedifikovaného typu a k průkazu nukleotidové identity. Ha počátku každého sekvenčního postupu se zvolený primér označé specielním jednotným značením tou kterou složkou. Značené složky zmapují typ vzorku, typ didesoxy terminátoru (v případě Danger-ovy sekvenční reakce) nebo s výhodou typy oba. Specificky značená složka zmapuje primérní typ, jímž je dále zmapován vektorový typ a tím se zmapuje identita vzorku. Značená složka se můge rovněž použít k mapování didesoxy terminátoru typu ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP s odkazem do které didesoxynukleotidové reakce byla značená složka priméru umístěna. Provede se potom sekvenční reakce a vzniklé fragmenty se sekvenčně dělí dle velikosti v závislosti na času.

Značené složky se odštěpují z fragmentů v časovém.rámei_ a rovněž v časovém rámci se měří a zaznamenávají. Sekvence se konstruuje srovnáním mapy značené..?·.' složky s Časovým rámcem. Znamená to, že totožnosti značené složky se zaznamenávají v době po nasazení a vzájemné vztahy k sobě se týkají rovněž časového rámce. Stupeň dělení dle velikosti oddělí fragmenty nukleové kyseliny o jeden nukleotidový přírůstek a proto identity takto odvozených značených částí se liší jedním nuklemtidovým inkrementem. Z předchozí znalosti didesoxy-terminátoru anebo nukleotidové mapy a téhož tápu se lineárním způsobem snadno dedukuje sekvence.

• · · · • · ·· • · · · · • · · ·· ··

-112Příklady provedení vynálezu

Další příklady jsou· připojeny pouze se zřetelem na objasnění, v žádném případě nemají charakter omezovači.

Pokud není uvedeno jinak, pak chemická činidla, použitá v příkladech, lze získat od Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI. Použity tyly tyto dále uvedené zkratky:

ANP = kyselina 3-(Pmon-amino)-3-(2~nitrofenylpropionová,

NBA = kyselina 4-(Pmoc-aminomethyl-3-nitrobenzoová,

HATU = 0-7-azabenzotriazol-l-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorfosfát,

DIEA = diisopropylethylamin,

LíCT = monochlortriazin,

NMIsí = 4 -me t hy Imo r f o 1 i η,

NMP = N-methylpyrrolidon

ACT357 = syntézní látka ACT-357 peptidů, Advanced Chem.Tech.Inc.,

Louisville, KY,

ACT « Advanced Chem.Tech., Inc., Louisville, KY

KovaBiochem = CalBiochem.NovaBiochem International, San Diego, CA

TFA = kyselina trifluoroctová

Tfa = trifluoracetyl iNIP = kyselina N-methylisonápekotova

Tfp = tetrafluorfenyl

DIAEA = 2-(diisopropylamino)-ethy lamin

MCT % mono chlor tria zen

-AH-ODN = 5'-aminohexyl na konci oligodesoxynukleotidu, oba podíly dohromady. ....... Příklady

Příklad 1 Příprava vazebných složek, labilních v kyselém prostředí k použití sekvenčních, štěpitelných složek, identifikujících mol.hmotnost

A. Syntéza pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných, hmotnostne-spektroskopických značených složek, to k uvolnění značených složek s karboxyamidovou koncovkou.

Reakční schéma: viz vyobr.l ·· ·· • · · © © © ·· • · · · Λ · • · · © ·· ·· • · · · 4 • · I ·· ··

-113Stupen A·

V dimethylformamidu se suspenduje 1 ekp. pryskyřice TentaGel S AC (sloučenina II, dostupná od ACT) v nádobce pro peptidový syntetizátor(ACT357) i po přidání 3 ekv.sloučeniny I a 7,5 ekv.DIEA v dimethylformamidu se nádobka se směsí látek potřepává hodinu. Po oddestilování rozpouštědla se pryskyřice promyje 2x pomocí NMP, 2x mothanolem a 2x dimethylformamidem. Navázání sloučeniny I na pryskyřici a stupně promývání se opakují, čímž se získá látka III.

Stupen B.

Pryskyřice (sloučenina III) se smíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu, a vše se protřepává 5 minut. Pryskyřice se odfiltruje, a po přidání 25% piperidinu v dimethylformamidu se potřepává 10 minut. Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se promyje 2 x použitím NMP, 2 x methanolem a 2 x dimethylformamidem. Následuje další přímé použití ve stupni C.

Stupen G

Krycích skupin zbavená pryskyřice ze stupně B se suspenduje v dimethylformamidu, a potom se přidá do reakční směsi aminokyselina, chráněná PMOC, obsahující aminovou funkci ve svém postranním řetězci (sloučenina IV, například <%.-N-PM0C-3(3-pyridyl)-alanin (dostupný u Synthetech, Albany, OR, 3 ekv), HATU (3 ekv), a DIEA (7,5 ekv) v dimethylformamidu. Obsah nádobky se potřepává po dobu hodiny. Po oddestilování rozpouštědel se pryskyřice promyje použitím NMP (2x), methanolu (2x) a dimethylformamidu (2x). Navázání IV na pryskyřici a stupně promývání se opakují, až se získá sloučenina V.

Stupen D

Pryskyřice (sloučenina V) se v reakci s piperidinem, jak je to popsáno ve stupni B, zbaví FMOC-skupin. Pryskyřice, zbavená krysích skupin, se rovnoměrně rozdělí působením ACT357 s původní reakční nádobky do 16 reakčních nádobek.

Stupeň E alikvotních částí pryskyřice, zbavené chránících skupin ze stupně D se suspenduje v dimethylformamidu. Do každé

• ·· • · • β

-114zbreakčních nádobek se přidá odpovídající vhodná karboxylová (R kyselina VI-, ,/a DIBA (7,5 eKv)

..gCOOH , 3 ekv), HATU (3 ekvivalenty), vletíme thylf ormamidu, obsah nádobek se protřepává hodinu, rozpouštědlo se oddestiluje a alikvotní podíly pryskyřice se promyjí použitím NIvIP (2x), methanolu (2x) a dimethylformamidu (2x). Navázání sloučenin na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují za vzniku sloučenin VII.

Stupeň F

Alikvatní podíly pryskyřice (sloučeniny VlI-^g) se vždy promyjí třikrát methylenchloridem. Do každé nádobky se přidá l%ní roztok kyseliny trifluoroctové a methylenchloridu, obsah se protřepává 30 minut, rozpouštědlo se potom vydestiluje z jednotlivých reakčníčh nádobek do individuálních trubiček. Alikvotní podíl pryskyřice se promyje vždy dvakrát methylendichlcrióem a methanolem, filtrát?/ se spojí do individuálních trubiček, obsah se vždy zahustí ve vakuu za vzniku sloučenin ^VIII1-16·

Stupeň G

Každá z těchto volných karboxylových kyselin VlII^^g se odděleně rozpustí v dimethylformamidu, do každého z roztoků se přidá 1,05 ekv.pyridinu a poóom 1,1 ekv. pentafluorfenylesteru kyseliny trifluoroctové. Směsi se míchají 45 minut za teploty místnosti, roztoky se zředí přidáním ethylesteru kyseliny octové a po promytí třikrát za použití 1 M vodného roztoku kyseliny citrónové a třikrát 5%ním vodným roztokem - · · hydrogenuhličitanu sodného a po vysušení bezvodým síranem sodným a filtraci se zahuštěním ve vakuu získají sloučeniny ^IXl-l6

B. Syntéza pentafluoresterů chemicky štěpitelných značených složek s přihlédnutím k hmotnostní spektroskopii k uvolnění značených složek s koncovkou karboxylové kyseliny

Reakční schéma, viz vyobr.2 • · · ·· · · ···· I » ···· · · 4 »· · ·· · o ·* © β

-115Stupeň A

V prostředí chloroformu se zahřívá 2 hodiny do varu pod zpětným chladičem směs 1 ekv. kyseliny 4-Chydroxymethyl)fenoxymáselné (sloučenina I) a 2,1 ekv. diisopropyldiethylaminu (DIEA) a 2,1 ekv.allylbromidu. Směs se dále zředí efchylesterem kyseliny octové, rgztok se promyje dvakrát 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, dvakrát uhličitanovým pufrem (pH 9,5) a jednou solankou, načež se vysuší bezvodým síranem sodným. Zahuštěním ve vakuu se takto izoluje allylester sloučeniny I. Stupen B

V prostředí methylendichloridu se smísí 1,75 ekv. allylesteru sloučeniny I ze stupně Asi ekv. FMOC-chráněné aminokyseliny s amino-funkcí v postranním řetězci, např. jako je

-N-F0MC-3-(3-pyridyl)-alanin (Syntetech, Albany, OR) a po přidání 2,5 ekv. N-methylmorf olinu a 1,1 ekv. 0-7-azabenzo±riazol-l-yl-N,N,N ',N '-tetramethyluroniumhexafluorfosfátu se reakční směs míchá za teploty místnosti po 4 hodiny. Potom se zředí methylendichloridem, roztok se promyje dvakrát 1 M vodným roztokem kyseliny citrónové, jednou vodou a dvakrát 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší se bezvodým síranem sodným a po filtraci se filtrát zahustí ve vakuu. Sloučenina III se izoluje bleskovou chromatografií —·} ethylester kyseliny octové.

Stupeň C

Sloučenina III se rozpustí v methylendichloridu, přidá se 0,07 ekv. tetra-(trifenylfosfinyiy-palladia a 1 ekv. N-methylanilinu, reakční směs se míchá 4 hodiny za teploty místnosti, fcředé se methylendichloridem, promyje 1 M vodným roztokem kyseliny citrónové a to dvakrát, potom jednou vodou, a po vysušení bezvodým síranem sodným .se filtrát zahustí ve vakuu. Sloučenina IV se izoluje bleskovou chromatografií CHgC]^—·) ethylester kyseliny octové 4- kyselina octová

Stupen D

V dimethylformamidu se suspenduje 1 ekv. pryskyřice TentaGel • ·

-116AC (sloučenina V) v kolekční nádobce syntetizéru peptidu AGT 357 (Advanced Chem.Tech.Inc., ACT, Louisville, KY). Po přidání v

ekv. sloučeniny IV, 3 ekv HATU (viz stupen B) a 7,5 ekv. diisopropylethylaminu se reakční nádoba potřásá po dobu hodiny. Po oddestilování rozpouštědla se získaná pryskyřice promyje dvakrát N-methylpyrrolidonem, dvakrát methanolem a dvakrát dimethyIformamidem. Navázání látky vzorce IV na pryskyřici, jakož i stupňe. promývání se opakují, získá se tak látka vzorce VI.

Stupen B

Pryskyřičná látka VI se smíchá v dime thy Iformamidu s obsahem 25% piperidinu, po potřepávání 5 minut se pryskyřice odfiltruje, znovu smíchá s 25% piperidinu v dimethyIformamidu a směs se potřepává 10 minut. Rozpouštědlo se oddestiluje, pryskyřice se promyje dvakrát N-methylpyrrolidonem, dvakrát methanolem a dvakrát dimethyIformamidem. Pryskyřice, zbavená .chránících skupin se pak rozdělí rovnoměrně dle ACT357 z kolekční nádobky do 16 reakčních nádobek.

Stupeň P

Všech 16 alikvotníoh podílů pryskyřice, zbavené chránících skupin ze stupně B se suspenduje v dine thy Iformamidu, do každé z reakčních nádobek se přidá odpovídající vhodná karboxylové kyselina VII^_^g, tedy obecného vzorce R-^_-^gC00H, a to 3 ekv, dají se 3 ekv. HATU (viz stupen B) a 7,5 ekv. diisopropylethy1aminu v dimethyIformamidu, nádoba se protřásává hodinu, rozoř i pouštědla se oddestilují a alikvotní podíly pryskyřice se promyjí použitím N-methylpyrrolidonu dvakrát, methanolu a dimethylformemidu rovněž vždy dvakrát. Navázání kyselin vzorce VII^__^g na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují, vzniknou sloučeniny VIII^_^g.

v

Stupen G my j í

Alikvotní podíly pryskyřice třikrát methylenchloridem, (sloučeniny VIII^_^g se prodo každé z reakčních nádobek se • ·

-117přidá methylenchlorid s obsahem 1% kyseliny trifluoroctové, po míchání 10 minut se rozpouštědlo filtruje z reakčních nádobek do jednotlivých trubiček. Alikvotní podíly pryskyřice se promyjí vždy dvaktát methylendichloridem, a methanolem, filtráty se spojí do individuálních trubiček a zahuštěním těchto ve vakuu se získají sloučeniny .

Stupeň H

Každá z volných kar boxylových kyselin IX^^g se rozpustí v dimethylformamidu, ke každému z roztoků se přidá 1,05 ekv. pyridinu, dále 1,1 ekv. pentafluorfenylesteru kyseliny trifluoroctové, reakční směsi se míchají za teploty místnosti po 45 minut, roztoky se zředí ethylesterem kyseliny octové s následným promytím vždy třikrát 1 ií vodným roztokem kyseliny citrónové a 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Následuje vysušení bezvodým síranem sodným, filtrace a zahuštění ve vakuu. Výsledek: sloučeniny Xp_p£·

Příklad 2

Důkaz fotolytického štěpení T-L-X

Sloučenina T-L-X, jak byla připravena v příkladu 11, se ozáří blízkým ultrafialovým světlem (7 minut, teplota místnosti). Jako zdroj ultrafialového světla se použijr Rayonett fluorescence UV lamp (Southern Nern England Ultraviolet Co., Middletov/n, CT) s emisním pikem 350 nm. Lampa se umístí ve vzdálenosti 15 cm od ?etri-ho misek se vzorky. Podle SDS gelové elektroforezy nad 85% konjugátů bylo rozštěpeno za těchto podmínek. ‘ - -= - .

Příklad 3

Příprava fluoreskujících značených primérů a důkaz štěpení fluoroforu

Syntéza a čistění oligonukleotidů

Oligonukleotidy (ODN) se připraví na automatizovaných DNA syntetizérech za použití standardní fosforamiditové chemie (dle

' -118výrobce), nebo H-fosfonátoré chemie (Glenn Research Sterling,

VA). Vhodné blokované dA, dG. dC a T fosforamidity jsou takto obchodně dostupné a syntetické nukleozidy je možno snadno převést do odpovídající vhodné formy. Oligonukleotidy se připraví použitím standardního fosforamiditů, přímo dodávaného, nebo N-fosfonátovou chemií. Oligonukleotidy se Čistí úpravou běžných postupů.Oligonukleotidy s 5 '-trity Íovou skupinou se chromqtografují vysokotlakovou kapalinovou chromatografií za použití reverzní fázové kolony, 12 mikrometrů, 300 // Rainin (Emeryville, CA) Dynamax C-8, 4,2 na 250 mm s užitím gradientu 15% až 55% acetonitrilu v 0,1 N Et^NH⁺0Ac , pH 7,0, 20 minut. Po provedeném detritylování se oligonukleotidy dále čistí gélovou exkluzní chromatografií. Analytická kontrola kvality oligonukleotidů se provede na PRP-koloně (Alltech, Deerfield, IL) v alkalické oblasti a použitím PAGE.

Příprava 2,4,6-trichlortriazinových derivátů oligonukleotidů:

Po dobu 30 až 120 minut a za teploty 19 až 25°C reagují v alkalickém pufru (pH 8,3 až 8,5) spolu 1000 pg vázaného oligonukleotidu s 5 '-amino koncovkou s nadbytkem překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové. Reakce se dokončí v 0,15 M roztoku bori-r tanu sodného při pH 8,3 za/přidání 3,2 mg/ml překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové a 500 ug/ml odpovídajícího oligonukleotidu. Nezřeagováný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní exkluzní chromatografií dle velikosti na G-50 Sephadexu (Pharmacia, Piscataway, NJ) koloně.

Aktivovaný vyčištěný oiigonukleotid potom reaguje s molárně 100-násobným nadbytkem cystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného (pH 8,3) hodinu za. teploty místnosti. Nezreagovený cystamin na koloně G-50 Sephadexu (viz výše) a deriváty ODN potom reagují s amino-reaktivními fluorofory. Deriváty ODN jako přípravky v

se rozdělí na 3 části a každá z nich reaguje bud

a) s dvacetinásobkem molárním Texas Red-sulfonylchloridu (Molecular Probes, Eugene, OR), nebo ··· * • · • 4 4

-119b) s dvacetinásobkem molárním Lissamine-sulfonylchloridu (Molecuůar Probes, Eugene, OR), nebo

c) s dvacetinásobkem molárním isothiokyanatanu fluoresceinu. Konečnými reakčními podmínkami je 0,15 M roztok boritanu sodného (pH 8,3), hodina, teplota místnosti. Nezreagované fluorochromy se odstraní na koloně G-50 Sephadex, viz zde výše.

K odštěpení fluorochromu z oligonukleotidy se ODN upraví na koncentraci 1 . 10“^ molární s následným 12,3-násobným zředěním v TE (TE je 0,01 LI Tris, pH 7,0, 5 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové). Do ohjemů ODN ůdOppldá po 25 ja! 0,01 M di^hiothreitolu (DTT). Do totožné serie sady kontrolních vzorků se DDT nepřidá. Směs se ponechá stát 15 minut za teploty místnosti, a fluorescence se změří na černé mikrotitrační destičce. Z inkubačních trubiček se vyjme roztok (150 mikrolitrů) a umístí se na černé mikrotitrační destičce (Dynatek Laboratories, Chantilly, VA). Z destiček se přímo provede odečet za použití fluorometru Pluoroskan II (Plow Laboratories, McLea.n, VA) za použití excitační vlnové délky 495 nm a monitorováním emise při 520 nm pro fluorescein za použití excitační vlnové délky 591 nm a monitorováním emise při 612 nm pro Texas Red, dále za použití excitační vlnové délky 570 nm a monitorováním při 590 nm pro lissamine.

Moly	fluorochromu	RPU neodštepený	RPU odštěpený	RPU volný
1,0 .	105I.I	6,4	1200	1343
3,3 .	106M	2,4	451	456
1,1 .	io6m	0,9	135	130
3,7 .	io7m	0,3	44	48
1,2 o	io7m	0,12	15,3	16,0
4,1 .	107M	0,14	4,9	5,1
1,4 .	10¾	0,13	2,5	2,8
4,5 .	10¾	0,12	0,8	0,9
	Z údajů zde	uvedených plyne,	že dojde asi	k 200-násob
nému	zvýšení relativní fluorescence,	byl-li fluorochrom odčte

• · • ff o 6 · · · · • •••••ff · · · ·

-12 Ορθή z ODN.

Příklad 4

Příprava značených M13 sekvenčních primérů a důkaz odštěpení značené složky

Příprava 2,4,6-trichlortriazinových derivátů oligonukleotidů: Provede se reakce 1000 jig vázgných oligonukleotidů s 5'-amino koncovkou (5'—hexylamin-TGTAAAACGACGGGCAST-3. ( sekvence ID, č.l) s nadbytkem překryštelovaného chloridu kyseliny kyanurové v 10%ním alkalickém N-methylpyrrolidonovém pufru (pH 8,3-8,5), 30 až 120 minut, 19 až 25°G. Konečné reakční podmínky: 0,15 lvi roztok boritanu sodného, pH 8,3, 2 mg/ml překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové a 500 jjg/ml odpovídajícího oligonukleotidu. Nezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní chromatografováním na koloně G-50 Sephadexu, jak to bylo popsáno zde již výše.

Pak se provede reakce aktivovaného vyčištěného oligonukleotidu ye stonásobkem nadbytku cystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného při pH 8,3. 1 hodinu za teploty místnosti. Nezreagovaný cystamin se odstraní chromátograficky na koloně G-50 Sephadexu, viz zde výše. Deriváty ODN pak reagují s různými amidy. Deriváty ODN se potom rozdělí na 12 dílů a provede se reakce každé části (25 mol.nadbytek) s pentafluorfenylesterem kyseliny, buď

1) 4-methoxybenzoové,

2) p-fluorbenzoové,

3) toluové,

4) benzoové,

5) indol-3-dctové,

6) 2,6-difluorbenzoové,

7) N-oxidu nikotinové,

8) 2-nitrobenzoové,

9) 5-acetylsalicylové,

10) 4-ethoxybenzoové,

11) skořicové,

12) 3-aminonikotinové.

«6 · · · · · · é ··· ···· ·· *· ·9 ··

-121Reakční doba: 2 hodiny, 37° C v 0,2 M vodného roztoku boritanu sodného, pH 8,3. Deriváty ODN se čistí gelovou exkluzní chromatografií na G-50 Sephadexu.

K odštěpení značené složky z oligonukleotidu se koncentrace ODN upraví na 10“³ molární s následným zředěním 12,3-krát použitím TE (TE je 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM kyseliny ethylendiamin tetraoctové) s 50% ethanolu (objem na objem). K objemům po 100 μΐ ODN se přidá po 25 pl 0,01 M roztoku dithiothreitolu (DTT).

Do totožné sady kontrolních DDT se nepřidá. Inkubační doba: 30 minut, teplota místnosti. Dále se přidá roztok chloridu sodného (0,1 M) a dvěma objemy ethanolu se vysráží ODN. Ta se pak izoluje z roztoku odstředěním 14.000 x G, 4 C, 15 minut. Látka nad sedlinou se uchová a dokonale vysuší, kulička se potom rozpustí v 25 pl methanolu. Kulička se dále testuje hmotnostní spektrometrií se zřetelem na přítomnost značené složky.

Hmotnostním spektrometrem, použitým při této práci, byl esterní iontový zdroj Fohrier-ova transformního hmotnostního spektrometru (FTMS). Vzorky, připravné analýzou MALDI se nanesou na hrot sondy a vše se vsune do zdroje iontů. Je-li vzorek ozářen laserovým pulsem, extrahujísse ionty ze zdroje a přecházejí do dlouhého kvadrupolního vodiče iontů, který je zaměří a přepraví do FTMS analytické buňky, umístěné v otvoru supravodivého magnetu.

Ze spektra lze vyčíst tyto informace: Píky, lišící se z hlediska intenzity od 25 do 100 jednotek relativní intenzity s odpovídajícími mol.hmotnostmi:

(1)	212,	1 amu..	•odpovídá	derivátu	kyseliny	4-methoxybenzoové,
2)	200,	1 amu		derivátu	kyseliny	4-fluorbenzoové,
(3)	136,1	amu		derivátu	kyseliny	toluové,
(4)	182,1	amu		derivátu	kyseliny	benzoové
(5)	235,2	amu		derivátu	kyseliny	indol-3-octové,
(6)	218,1	amu		derivátu	kyseliny	2,6-difluorbenzoové,
(7)	199,1	amu		derivátu	N-oxidu	kyseliny nikotinové,
(8)	227,1	amu		2-nitrobenzamidu,

• · • β « 99 * »· · · ·♦ ···« « • · · · 9 · * · · 8 · 9 9 9 9

-122(9) 179,18 amu ...odpovídá derivátu kyseliny 5.-acetylosalicylové (10) 226,1 amu··· odpovídá derivátu kyseliny 4-ethoxybenzoové, (11) 209,1 amu... odpovídá derivátu kyseliny skořicové, (12) 198,1 amu derivátu kyseliny 3-aminonikotinové

Z výsledků je patrné, že složky, definující mol.hmotn. se odštěpují z primérů a jsou zjistitelné hmotnostní spektrometrií .

Příklad 5

Průkaz sekvencování za použití postupu vysokotlakové kapalinové chromátografie, jimání frakcí, odštěpení složek, definujících mol.hmotnost, stanovení hmotnosti (a tedy i identity) složky, definující hmotnost a odtud dedukování sekvence

Dále uvedené oligonukleotidy se připraví, jako v příkladu 4

DM0 767:'5-hexylamin-TGTAAAACGACGGCGAGT-3 Sekv.ID č.l)

DM0 768: *5-hexylamin»TGTAAAACGACGGCCAGTA-3 '(sekv.ID č.2)

DM0 769: '5-hexylaminTGTAAAACGACGGCCAGTAT-3'(sekv.ID č.3)

DM0 770: ^-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTATG-3'(sekv.ID S.4)

DM0 771: 5 '-hexylamin-TGIAAAACGACGGCCAGTAATGC-3 ' (sekv.ID.č.5)

DM0 772: 5 '-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTAATGCA-3'(sekv.ID.č.6) DM0 773 : 5 '-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTATGCAT-3 '(sekv. ID. č.7) DM0 774: 5 '-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTATGCCATG.3 '(sekv.ID.č.8)

Provede se, reakce 100 jug každého z 5 '-koncovnkau vázaného amino nukleotidu, jak byl popsán zde výše s nadbytkem překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové v 10%ním alkalickém n-methylpyrrolidonovém pufru (oH 8,3 až s výhodou 8,5) za teploty 19 až 25 °C po dobu 30 až 120 minut. Konečné reakční podmínky: 0,15 M roztok boritanu sodného (pH 8,3), 2 mg/ml překryštelovaného chloridu kyseliny kyanurové a 500 ug/ml odpovídajícího oligonukleotidu. Nezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní velikostní vylučovací chromatografií na koloně Sephadex-u G.50 ·© ·© ·'·

-124• · * - Σ • ·· · · « • · · · ··· ί • · · · ·.

·« ·· «

Na aktivované čisté oligonukleotidy se potom působí stonásobným molárním nadbytkem 0,15 M roztoku boritanu sodného (pH 8,3) po dobu hodiny za teploty místnosti. Nezreagovaný cystamin se odstraní velikostní vylučovací chromatografií na koloně Sephadex-u G-50. Na deriváty kyseliny ODN se pak působí jedním z dále uvedených pentafluoresterů kyselin:

1)	DM0767	4-methoxybenzoové kyseliny,
2)	DM0768	4-fluorbenzoové kyseliny,
3)		toluové kyseliny
4)	DM0769	benzoové kyseliny
5)	DM0770	indol-3-octové kyseliny,
6)	DM0771	2,6-difluorbenzoové kyseliny
7)	DM0772	N-oxidem nikotinové kypeliny
8)	DM0773	2-nitrobenzoové kyseliny.

» >

ng každého z osmi derivátů ODN se smíchá dohromady s následným dělenímndle velikosti pomocí vyso Oblakové kapalinové chromátografie. Směs se vnese do 25 pl destilované vody, a veškerý vzorek se injikuje na dále uvedenou kolonu:

A LiChrospher 4000DMAB, 50-10 mm kolona se použije (EM Separations, Wakefield, RI). Elx^ační činidlo A: 20 mm dinatriumhydrogenfosfátu v 20% AON, pH 7,4, eluční činidlo B odpovídá elučnímu činidlu A s přidáním 1 M roztoku chloridu sodného, pH 7,4. Rychlost průtoku.;: 1 ml/min, detekce ultrafialovým světlem 280 nm. Gradient je tento: 0 min(^) 100% A a 0% B, min(čL)lOO% A a 0% B, 15 min(^)80% A a 20% B, 60 min(^0 %A a 100% B, 63 min:(^ 0 % A a 100% B, 65 min:@100% A a 0 % B, min 100% A a 0 % B. Frakce se jímají s odstupen 0,5 minuty.

Pro odštěpení značených složek z oligonukleotidů se přidá do každé frakce 100 pl 0,05 M roztoku dithiothreitolu (DTT). Inkubování 30 minut za teploty místnosti, chloridem sodným se doplní koncentrace na 0,1 M a ethanolem se vysráží všechna ODN. Tyto podíly se z roztoku získají odstředěním (14 000 x G), 15 minut, 4°C. Kapalný podíl nad sedlinou se uchová, dokonale se vysuší za centrifugování ve vakuu. Kuličky se potom rozpustí v

-12525 pl methanolu a testují se hmotnostní spektrometrií na přítomnost látek, identifikujících mol.hmotnost. Použije se tatáž metoda MALDI, jak to bylo popsáno v příkladu 4. Dále uvedené mol.hmotnosti (značených složek) byly pozorovány v hmotnostním spektru ve funkci času:

Frakce // 1	Doba 0,5	mol.hmotn. 0	Frakce // Doba	mol.hmotn 0
26	13
2	1,0	0	27	13,5	0
3	1,5	0	28	14	0
4	2,0	0	29	14,5	0
5	2,5	0	30	15	0
6	3,0	0	31	15,5	212,1
7	3,5	0	32	16	212,1
8	4,0	0	33	16,5	212,1
9	4,5	0	34	17	212,1 200,1
10	5,0	0	35	17,5	200,1
11	5,5	0	36	18	200,1
.12	6,0	0	37	18,5	200,1
13	6,5	0	38	19	200,1 196,1
14	7,0	0	39	19,5	200,1 196,1
15	7,5	0	40	20	196,1
16	8,0	0	41	20,5	196,1
17	8,5	0	42	21	196.1 182.1
18	9,0	o.	43	21,5	182,1
19	9,5	0	44	22	182,1
20	10,0	0	45	22,5	182,1 235,2
21	10,5	0	46	23	235,2
22	11	0	47	23,5	235,2
23	11,5	0	48	24	235,2 218,1
24 25	12 12,5	0 0	49	24,5	218,1

pokr • ·

44 ► · · «

I 4 44 ·<· 4 4

4 I

4 4 4

-126pokr.

Frakce M Doba	mol.hmotn. Frakce	Doba	mol.hmotn
50	25	218,1	55	27,5	227,1
51	25,5	218,1	56
	199,1	28	0
52	26	199,1	57	28,5	0
53	26,5	199.1 227.1	58	29	0
54	27	22$,1	59	29,5	0
			60	30	0
	Zjištění značených složek v	závislosti na	čase	je tedy:
212,1,	200,1, 196,1,	182,1, 235,2,	218,1, 199,1,	227.1	• Protože

212.1 amu odpovádá kyselibě 4-methoxybenzoové, teůy derivátu,

200.1 odpovídá derivátu kyseliny 4-fluorbenzoové, 196,1 amu odpovídlá derivátu kyseliny toluové, 182,1 amu derivátu kyseliny benzoové, 235,2 amu derivátu kyseliny indol-3-octové,

218.1 amu derivátu kyseliny 2,6-difluorbenzoové, 199,1 amu derivátu N.oxidu kyseliny nikotinové, 227,1 amu odpovídá

2-nitrobenzamidu, sekvence lze odvodit jako -5 '-ATGCATG-3 '-.

Přiklad 6

Důkaz sekvencování dvou vzorků DNA při jediném dělícím postupu vysokotlakovou kapalinovou chromatografií.

V tomto příkladu byly dva vzorky DNA sekvencovány jediným postupem dělení.

Dále uvedené oligo nukleotidy jsou ty, jak byly připraveny v příkladu 1j

DM0 767 i 5’*-hexylamin-TGTAAAAGGAGGGCCAAGT-3 '(sekv. ID č.l) .... _ . DM0 768: 5 '-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTA-3 '-(sekv. ID č.2)

DM0 769: 5 '-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTA®-3 '(sekv. ID č.3)

DM0 770: 5 *-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTATG-3 '-(sekv.ID č.4)

DM0 771: 5 '-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGTATGC-3 '-(sekv, ID č.5) DM0 772: 5'-hexylamin-TGIAAAACGACGGCCAGIATGCA-3'-(sekv. ID S.6) DM0 775: 5 '-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGC-3 '(sekv. ID, c.9) • · • ·

-127·

DMO 776: 5 *-hexylaminTGTAAAACGACGGCCAGCG-3 * (sekv. ID č.10)

DM0 777í 5 '-hexylaminTGTAAAACGACGGCCAGCGT-3 '(sekv. ID č.U)

DM0 778: 5*-hGxylamin-TGTAAAACGACGGCCAGCGTA-3*(sekv. ID č.12) DMO 779: 5'-hexylamÍn-TGTAAAACGACGGCCAGCGTAC-3'-(sekv. ID č. 13) DMO 780: 5'-hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGCGTACC-3 ' (sekv. ID č.14)

Provede se reakce každého z 5 '-koncovkou aminovázaného oligonukleotidu, jak byly popsány zde výše, s nadbytkem překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové v alkalizovanéra roztoku 10% N-methylpyrrolidonu (pH 8,3 až s výhodou 8,5) jako pufru za teploty 19°C až 25°C po dobu 30 až 120 minut· Konečnými reakč nimi podmínkami: 0,15 M roztok boritanu sodného (pH 8,3) na 2 mg/ml překryštelovaného chloridu kyseliny kyanurové a 500 jíg/ml příslušného oligonukleotidu. Nezreagovaný chlorid kyseliny kyanu rové se odstraní velikostně vylučovací chromatografií na koloně ??

Sephadex-u G-50.

Potom se provede reakce aktivovaného vyčištěného oligonukleotidu se stonásobkem (molárne) nadbytku oystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného (pH 8,3) hodinu za teploty místnosti. Nezreagovaný cystamin se odstraní velikostně vylučovací chromatografií na koloně Sephadex—u G—50. Potom se provede reakce derivátů QDN s odpovídajícím pentafluorfenylesterem takto:

1) DM0767 s kyselinou 4-methoxybenzoovou a DM0773 s N-oxidem kyseliny nikotinové,

2) DM0768 s kyselinou 4-f luor benzoovou a DM0774 s kyselinou

2-nitrobenzoovou,

3) s kyselinou toluovou a DM0775 s kyselinou acetylsalicylovoh,

4) DM0769 s kyselinou benzoovou a DM0776 s kyselinou 4-ethoxybenzoovou,

5) DM0770 s kyselinou indol-3-octovou a DM0777 s kyselinou skořicovou,

6) DM0771 s kyselinou 2,6-dif luor benzoovou a DM0778 s kyselinou

3-aminonikotinovou. Takže jedna ze znasených složek pro každou sadu ODN.

0«

-1280 0 0 0 0 0«

00 0 · 00 0 0 0 0 000 0 «

0 0 0 0 « » 00 00 ··

Z každého z 12 derivátů ODN se 10 ng smíchá dohromady a velikostně se dělí vysokotlakovou kapalinovou chromatografií· Směs se vnese do 25 pl destilované vody a vzorek jako celek se injikuje do dále uvedené kolony: A Lichrospher 4000,DMAE, 50-10 mm (EM Separations, Wakefield Rl). Eluční činidlo A je 20 mM dinatriumhydrogenfosfátu v 20% AON, pH 7,4, eluční činidloB je eluční činidlo A + 1 M roztok chloridu sodného (pH 7,4)· Průtoková rychlost: 1 ml/min, důkafc při(© 280 nm. Gradient byl tento: 0 min (© 100% A a 0% B, 3 min©) 100% A a O^B, 15 min© 80% A a 20% B, 60 min©0% A a 100% B, 63 min © 0% A a 100% B, 65 min© 100% A a 0 % B, 70 min 100% A a 0 % B. Frakce se odebrírají v intervalech 0,5 minut·

Pro odštěpení značené složky z oligonukleotidu se přidá do každé frakce 10θ pl 0,05 M roztoku dithiothreitolu (DTT).

Inkubace; JO minut za teploty místnosti, následuje přidání chloridu sodného na koncentraci 0,1 M a dvěma objemy ethanolu dojde k vysrážení složek ODN. Ty se odstraní z roztoku odstředěním při 14.000 x G, 4°C, 15 minut. Kapaliny nad sedlinami se uchovají, vysuší se dokonale ve vakuu za odstřelování, perličky se potom rozpustí v 25 pl methanolu a testují se hmotnostní spektrometrií se zřetelem na přítomnost značených složek. Použije se tentýž postup MALDI, jako v příkladu 4. Dále uvedené hmotnosti značených slo-

žek byly	pozorovány	v hmotnostní]	n spektru ve	funkci	časuj
Frakce /4	Doba	mol.hmotn.	Frakce #	Doba	mol.hmotn.
1	0,5	0	31	15,5	212,1 199,1
2	1,0	0	32	16	212,1 199,1
3	/ 1,5	— 0	33 -	1696	212,1 199,1
4	2,0	0	34	17	212,1

200,1

199.1

227.1

2,5 0 35 17,7 200,1

199.1

227.1

3,0 0 36 18 200,1

227,1 pokr.

·· ··

9

	-129-	• · ···9999	99 99 4	• 9 9
Frakce // 7	Doba 3,5	mol.hmotn·, 0	Frakce // 37	Doba 18,5	mol.hmotn 200,1 227,1
					179,18
8	4,0	0	38	19	200,1 196,1 179,18
9	4,5	0	39	19,5	200,1 196,1 179,18
10	5,0	0	40	20	196.1 179,18 226.1
11	5,5	0	41	20,5	196.1 226.1
12	6,0	0	42	21	196.1 182.1
					226,1
13	6,5	0	43	21,5	182,1 226,1 209,1
14	7,0	0	44	22	182,1 209,1
15	7,5	0	45	22,5	182,1 235,2 209,1
s·					198,1
lé	8,0	0	46	23	235,2 198,1
17	- 8,5	0 .	47	23,5	235,2 198,1
18	9,0	0	48	24	235,2 198,1
					218,1
19 20 21 22 23	9,5 10,0 10.5 11 11.5	0 0 0 0 0	49 50 51 52 53	24.5 25 25.5 26 26,5	218,1 218,1 0 0 0

ΦΦ ► « ·· • φ φφ • φ φ φ φ · φφ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ

-130 βΟ β ΟΟΦβ

Prakce /4 24	Doba 12	mol.hmotn. Frafcce //	Doba mol.hmotn
0	54	27	0
25	12,5	0	55	27,5	0
26	13	0	56	28	0
27	13,5	0	57	28,5	0
28	14	0	58	29	0
29	14,5	0	59	29,5	0
30	15	0	60	30	0
Časové	zjištění	značených	složek pro sadu	M 1 je 212,1
200,1, 196,1,	182,1 235,2, 218,1	, 199,1, 227,1 a	totéž pro	sa-
du & 2 199,1	, 227,1,	179,1, 226	,1, 209,1, 198,1	• Protože

212.1 amu znamená derivát kyseliny 4-methoxybenzoové, 200,1 derivát kyseliny 4-fluorbenzoové, 196,1 amu derivát kyseliny toluové, 182,1 amu derivát kyseliny benzoové, 235,2 amu derivát kyseliny indol-3-octové, 218,1 amu derivát kyseliny 2,6-difluorbenzoové, 199,1 amu derivát N-oxidu kyseliny nikotinové,

227.1 2-nitrobenzamid, 179,18 amu derivát kyseliny 5-acetylsalicylové, 226,1 amu derivát kyseliny 4-ethoxybenzoové, 209,1 amu derivát Kyseliny skořicové a 198,1 amu derivát kyseliny 3aminonikotinové, lze prvou sekvenci označit jako -5 '-TATGCA-3a druhou jako 5 '-CGTACC-3'- Takže je tedy možno sekvencovat více než J vzorek DNA v jednom stupni dělení.

gřáklad 7

Příprava sady sloučenin vzorce R^^^-Lys( £ -iNIP)-ANP-TPP

Na vyobr.3 je doložeba paralelní syntéza sady sloučenin (36) T-L-X (X = L. ), kde L_u je aktivovaný ester (zvláště tetra2 n ' n o fluoréster), L je o-nitrobehzylaminová skupina, kde 1» znamení methylenovou skupinu, spojující a L , T má modulární strukť ru, kde karboxylová skupina lysinu byla připojena na dusíkový o

atom L benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby, a slož &1-36 ⁸ variabilní mol.hmotností (kde R skupiny odpovídají T ,

-131»· ·· • rf • rf • · ·· • rf · rf · rf rf · rf« rf·

HATU, jak to zde již bylo uvedeno a mohou se zavést použitím kterékoli ze zde specifikovaných karboxylových kyselin) je vázána prostřednictvím ol -aminoskupiny lysinu, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostní spektrometrie (zavedená použitím kyseliny N-methylisonipekotové) je vázána ξ -aminoskupinou lysinu·

S odkazem na vybr.3s

Stupen A

V dimethylformamidú se suspenduje pryskyřice Nova Syn HMP (Nova Biochem, 1 ekv) v jímací nádobce pro ACT357· V dimet hylformamidovém roztoku se přidá: 3 ekv. látky I(od ACT),3 ekx

7,5 ekv· 4-methylmorfolinu, nádobka se potřásá po dobu hodiny, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promyje vždy dvakrá· N-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem, navázání sloučeeniny I na pryskyřici ₀ stupně promývání se opakují a zíáká se tím látka II.

Stupeň B

Po promíchání pryskyřice (látka II) s 25% piperidinu v dimethylformamidú se směs protřepává 5 minut, pryskyřice se odfiltruje a po přidání 25% piperidinu v dimethylforamidu se vše znovu profeřepává 10 minut. Po odstranění rozpouštědel se pryskyřice promyje vždy dvakrát N-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem a použije pak přímo pro stupeň C. Stupen C

Pryskyřice ze stupně B, zbavená chránících skupin, se suspenduje v dimethylformamidú a k suspensi se přidá PMOC-chráněná aminokyselina, obsahující chráněnou amino-funkci v postra ním řetězci (Pmoc-lysin(Aloc)-OH od PerSeptive Biosystema, a t v množství 3 ekv., dále 3 ekv.HATU a 7,5 ekv. 4-methylmorfoli v dimethylforamidům vše se protřepává hodinu, rozpouštědla se odstraní a pryskyřice se promyje vždy dvakrát N-methylpyrrc lidonem, methanolem a dimethylformamidem. Navázání Fmoc-Lys(AI na pryskyřici a stupně promývání se opakují, získá se tak látl

-132

• · • · :·· »· • · · · • · ·· ··· · · • · · oo oo

Stupen D

J*ryskyřice (látka IV) se promyje dvakrát methylendichloridem, suspenduje se potom v roztoku 0,3 ekv· tetra(trifenylfosfinyl)-palladia (0) a 10 ekv· fenylsilanu v methylendichloridu. Reakční směs se potřásá hodinu, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promyje dvakrát methylendichloridem, palladiový stupeň se opakuje, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promyje dvakrát methylendichloridem, dále vždy dvakrát použitím Ν,Ν-diisopropylethylamoniumdiethyldithiokarbamátu v dimethyIformamidu a dimethylformamidem. Získá se tak látka V. Stupeň E

Pryskyřice ze stupně D, zbavená chránících skupin, se váže na kyselinu N-methylisonipekotovou, jak je to popsáno ve stupni C a získá se tím látka VI·

Stupeň P

Pryskyřice ze stupně VI s Pmoc-chránícími skupinami se rozdělí rovnoměrně dle ACT357 z původní nádobky do 36 reakčních nádobek: získají se tak látka Vl^^g.

Stupeň G

Na pryskyřice (látky' Vl^g) se působí piperidinem, jak je to popsáno ve stupni B, aby se tím odstranily skupiny PMOC. Stupeň H alikvotních podílů pryskyřice ze stupně G se po odstranění chránících skupin suspenduje v dimethyIformamidu· Do každé reakční nádobky se přidá v množství 3 ekv·odpovídájící karboxylová kyselina (R^^COOH), 3 ekv.HATU a 7,5 ekv· 4-methylmorfolinu v dimethylformamidu, po potřásání hodinu se rozpouštědla odstraní a alikvotní podíly pryskyřice se promyjí vždy dvakrát N-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem. Navázání kyselin R^^COOH na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují, získají se tím látky vzorce VlII^^g.

·· • ·· o * · • · · ··

-133Stupen I

Alikvitoní podíly pryskyřice (látky VIII^_^g) se promyjí třikrát methylendichloridem, do každé nádobky se přidá směs kyseliny trifluoroctové, vody a methylendichloridu 90 : 5 : 5, vše se protřásá 120 minut a rozpouštědla se odfiltrují z reakčních nádobek do individuálních trubiček. Následuje promytí té které pryskyřice dvakrát methylenduchloridem a methanolem, filtráty se slijí do' individuálních trubiček a zahuštěním ve vakuu se získají sloučeniny IX^^g.

Stupeň J volných

Každá z _ karboxylových kyselin se odděleně rozpustí v dimethyIformamidu, ke každém z roztoků se přidá 1,05 ekv. pyridinu, potom 1,1 ekv. tetrafluoresteru kyseliny trifluoroctové a směsi se míchají 45 minut za teploty místnosti. Po zředění roztoků ethylesterem kyseliny octové a trojím promytí 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vysušení bezvodým síranem sodným se po filtraci zahuštěním filtrátu ve vakuu fcískají sloučeniny ^„35 ·

Příklad 8

Příprava sady sloučenin vzorce R^__^g-Lys( % -iNIP)-NBA TPP

Na vyobr.4 je doložena úaralelní syntéza sady 36 sloučenin vzorce T-L-X (X « L^), kde znamená aktivovaný ester (zvláště tetrafluorfenylester), L² je o-nitrobenzylaminová skupina s tím, že 1? znamená přímou vazbu mezi L,a 1 , kde L^ je skupina vázaná přímo na aromatický kruh skupiny L , T má modulární strukturu, kde karboxylová skupiny lysinu je vázána na dusíkový atom benzylo aminové skupiny. L za vzniku amidické vazby a složka s variabilní hmotností (kde R odpovídá významem skupině T , jak zde již byla definována a může se zavést použitím kterékoli z karboxylovýeh kyselin, jak zde byly definovány) je vázána na cZ-aminoskupinu lysinu, zatím co skupina, podporující hmotnostní spektrometrii (zavedená použitím kyseliny N-methylisonipekotové) je vázána E-aminoskupinou lysinu.

99

9 9

99 >99 9 9

9 * > · ·· • 1

-134S odvoláním na vyobr«4 Stupeň A

Podle postupu, popsaného ve stupni A příkladu 7 se naváže na pryskyřici NovaSyn HMP sloučenina I (NBA, připravená dle postupu Brown-a a spol·, Molecular Diversity 1, 4 (1995) a získá se tak sloučenina II·

Stupně B až J

Pryskyřice (slofačenina II) se zpracuje, jak je to popisováno ve stupních B až J příkladu 7: výsledkem jsou sloučeniny ^Σ1-36·

Příklad 9

Příprava sady sloučenin vzorce iNIP-Lys( -R_n-^g)-ANP-TPP

Navyobr,5 je paralelní syntéza sady 36 sloučenin vzorce T-L-X (X = L_h) , kde L^ znamená aktivovaný ester (specificky tetrafluorfenylester), 1? o-nitrobenzylaminovou skupinu s tím, o v 2 že li znamená methylenovou skupinu, jež spojuje L^ a L , T má modulární strukturu, kde karboxylové skupina lysinu je vázána na dusíkový atom L benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby a variabilní složka R^g (kde skupiny R odpovídají •T², jak to zde již bylo definováno, a mohou se zavést použitím kterékoli ze zde specifikovaných karboxylových kyselin) je vázána £_aminoskupinou lysinu, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostního spektra (zavedená použitím kyseliny N-methylnipekotové) je vázána ot-aminoskupinou lysinu.

S odvoláním na vyobr.5 Stupně A až Cs stejně jako v příkladu 7 Stupeň D __

Na pryskyřici (sloučenina IV) se působí piperidiňem, jak se to popisuje ve stupni B příkladu 7, aby se ták odstranily skupiny PMOC.

Stupeň E

Použitím postupu, popsanéjo ve stupni C příkladu 7 se pů··

-135-

·· ·· • · • · · • ·· • fc · · • · · • ·· sobí na krycí skupiny zbavený ςΖ-amin na pryskyřici ze stupně D kyselinou N-methylisonipekotovou: výsledkem jsou sloučeniny vzorce V.

Stupen F: totéž jako v příkladu 7

Stupen G:

Na pryskyřice (sloučeniny Vl^^g se působí sloučeninou palladia, jak to bylo popsáno ve stupni D příkladu 7 se zřetelem na odstranění skupiny Aloe.

Stupně H až J:

Sloučeniny ^„3^ se připraví stejně, jako v příkladu 7.

Příklad 10

Příprava sady sloučenin vzorce R^_^g-Glu( ^-DIABA )~ANP-TFP

Na vyobr.6 je paralelní syntéza sady 36 sloučenin vzorce T-L-X (X s 1^), kde L^ znamená aktivovaný ester (specificky tetrafluorfenylester), L² je o-nitrobenzylaminová skupina s tím, že L znamená methylenovou skupinu, jež spojuje a L ,

T má modulární strukturu, kde ^-karboxylová skupina kyseliny glutamové je navázána na dusíkový atom L -benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby a složka ^^„35 s variabilní hmotnostní kde skupiny R odpovídají T², jak to zde již bylo uvedeno a mohou se zavést použitím kterékoli ze specifikovaných, zde již uvedených kyselin) je vázána ‘X-aminoskupinou kyseliny glutamové, zatím co skupina, zvyšující citlivost hmotnostního spektra - zavedená použitím ²-(diisopropylaminp)-ethylaminu je vázána karboxylovou skupinou kyselin glutamové.

S odvoláním na vyobr. 6

Stupně A-B : totéž jako v příkladu 7

Stupen C:

Postupem popsaným ve stupni C příkladu 7 se podobným postupem naváže na pryskyřici, zbavenou chránících skupin (látka III) působením Fmoc-Glu-(OAL)-OH slofaóenina IV Stupeň D:

Allyltster pryskyřice (sloučenina IV) se promyje dvakrát methylendichloridem a smíchá se s 0,3 ekv. tetra(trifenylfosfi nyl)-palladia a 3 ekv. N-methylanilinu v methylendichloridu.

Po hodinovém protřepávání se rozpouštědlo odstraní a pryskyři·

-156ce se promyje dvakrát methylendichloridem. Palladiový stupen se opakuje, rozpouštědlo se opět odstraní a pryskyřice se promyje vřdy dvakrát použitím methylendichloridu, N,N-diisopropylethylamoniumdiethyldithiokarbamátu v,prostředí dimethylformamidu a znovu dvakrát dimethylformamidem, získá se tak sloučenina V.

Stupeň E

Pryskyřice, zbavená chránících skupin ze stupně D se suspenduje v dimethylformamidu a aktivuje přidáním 3 ekv HATU a 7,5 ekv 4-methylmorfolinu. Nádobky se protřásají 15 minut, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promyje jednou N-methylpyrrolidonem, smíchá se dále se 3 ekv. 2-(diisopropylamino)-ethylaminu a 7,5 ekv. N-methylmorfolinu, nádobky se potřásají hodinu; navázání 2-(diisopropylamino)-ethylaminu na pryskyřici, jakož i stupně promývání se opakují, výsledkem je sloučenina VI.

Stupně P až Jí totéž jako v příkladu 7

Příklad 11

Příprava sady sloučenin vzorce R^__g^-Lys-( £iNIP) ANP-Lys(j-NHgJ-NHg Na vyobr.7 je zachycena paralelní syntéze 36 sloučenin vzorce

T-L-X (ž s L^), přičemž v uvedené sadě znamená aminoskupinu (specificky ξ-aminoskupinu části, odvozené od lysinu), Ir znamená o-nitrobenzylaminovou skupinu s tím, že L znamená karboxamido-substituovanou alkylenaminoacylaikylenovou skupinu, jež spojuje 1^ a I , T má modulární strukturu, kde karboxylová skupina lysinu byla navázána na dusíkový atom l²-benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby a složka R^^g s variabilní hmotností (kde skupiny R odpovítají T², jak to zde již bylo definováno a mohou se zavést použitím kterékoli zde již specifikované karboxylové kyseliny) jsou vázány -aminoskupinou lysinu, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostní spskérometiie, zavedená použitím kyseliny isonipekotové, je vázána

-aminoskupinou lysinu,

S odvoláním na vyobr.7

Stupen A

Směs 25% piperidinu v dimethylformamidu a Pmoc-Lys(Boc)SRAM-pr skyřice (od ACT), látky I se protřepává 5 minut, pryskyřiče se odfiltruje, smíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu * ·

-137999 • · * a následuje další protřepávání 10 minut. Po odstranění rozpouštědla se pryskyřice promyje vždy dvakrát N-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem, použije se pak přímo ve stupni B.

Stupeň B

Smíchá se pryskyřice (sloučenina II), 3.ekv. ANP (od ACT), 3 ekv.HATU a 7,5 ekv. 4-methylmoffolinu v dimethylformamidu a reakční nádoba se protřepává hodinu. Po odstranění rozpouštědla se pryskyřice promyje vždy dvakrát N-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem, navázání látky I na pryskyřice a stupně promývání se opakují, získá se tak sloučenina III.

Stupně C až J

Pryskyřice (sloučenina III se zpracuje podobně jako ve stupních B až I příkladu 7, získají se tím sloučeniny X^^g.

Příklad 12

Příprava sady sloučenin vzorce ^Rl-36“^Lys( t-TPA)-Lys( £-iINP)-ANP-TPP

Na vyobr.8 je zachycena paralelní syntéza sady 36 sloučenin T-L-X (X = 1^), kde L_h znamená aktivovaný ester (specificky tetrafluorfenylester), L² znamená o-nitrofenylaminovou skupinu s tím, že znamená methylenovou skupinu, jež váže o ns Γ, T má modulární strukturu, kde karboxylová skupina prvého lysinu je vázána na dusíkový atom L -benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby a skupina, podporující citlivost hmotnostní spektrometrie, zavedená použitím kyseliny N-methylisonípekoťové, je vázána £ -aminoskupinou prvého lysinu, druhá molekula lysinu pak je navázána na prvý lysin o(-aminosku pinou prvého lysinu, skupina, upravující mol.hmotnost- se strukt trifluoracetylovou - je vázána ^-aminoskupinou druhého lysinu a složkq R]__36 ^s variabilní hmotností (kde skupiny R odpovídají

138-

v

Τ , jak to zde již bylo definováno a mohou se zavést použitím kterékoli ze zde již specifikovaných karboxylových kyselin) je vázána C\,-aminoskupinou druhého lysinu.

S odvoláním na vyobr.8

Stupně A až B: totožné se stupni A až E příkladu 7

Stupeň P

Na pryskyřici (sloučeninu VI) se působí piperidinem, jak je to popsáno ve stupni B příkladu 7 se zřetelem na odstranění skupin PMOC.

Stupeň G

Pryskyřice, zbavená chránících skupin (sloučenina VII) se spojí s Pmoc-Lys(Tfa)-OH použitím postupu ze stupně C příkladu 7: výsledkem je sloučenina VIII.

Stupně H až K

Pryskyřice (sloučenina VIII) se zpracuje jako ve stupních P-J příkladu 7 za vzniku sloučenin X^-36·

Příklad 13.

Příprava sady sloučenin vzorce ^Rl-36“^L3řs( k-iNIP)-ANP-5 '-AH-ODN

Na vyobr.9 je zachycena paralelní syntéza sady 36 sloučenin vzorce T-L-X (X · MOI, kde MOI znamená fragment nukleové kyseliny,,QDN) jako derivátů esterů z příkladu 7 (stejný postup by se mohl použít pro další sloučeniny T-L-X, kde X znamená aktivovaný ester). MOI je navázán na T-L 5 -koncovkou MOI a to skupinou fosfodiesteralkylenaminovou,

S odvoláním na vyobr.9

Stupeň A . ,. -------Sloučeniny Xll^g se připraví modifikovaným biotinylačním postupem, viz Van Ness a spol·, Nucl.Acids Res. lj), 3345 (1991). Do roztoku jednoho z 5 *-aminohexyloligonukleotidů (sloučeniny Xl^^g, vždy 1 mg) v 200 mM roztoku boritanu sodného (pH, 8,3), 250 ml se přidá jeden z tetrafluorfenylesterů (sloučeniny X^^é z příkladu A, stonásobný molární nadbytek v

250 ml N-methylpyrrolidonu)· Reakce se ponechá za teploty místnosti po dobu noci, nezreagované a hydrolyzované tetra-fluorfenylestery se odstraní ze sloučenin Xll^^g chromatografií na koloně Sephadex G-50.

Příklad 14

Příprava sady sloučenin vzorce ^Rl-6~^Lys( δ-iNIPMNP-Lys [t-(MCT-5 '-AH-ODNj-NHg

Na vyobr. 10 je zachycena paralelní syntéza sady 36 sloučenin T-L-X (X s MOI, kde MOI znamená fragment nukleoté kyseliny, ODN), odvozených od aminů z příkladu 11 (týž postup by se mohl použít pro další sloučeniny T-L-X, kde X znamená amin). MOI je navázána na T-L 5 '-koncovkou MOI použitím skupiny fosfodiesteralkýlenáminové.

S odvoláním na vyobr.10 Stupen A

Podobně, jak to popisuje Van Ness a spol·, Nucl.Acids Res. 19. 3345 (1991) se připraví 5 '-U-(4,6-dichlor-l,3,5-triazin-2-ylsmino)-hexyl) -oligonukleotidy Xll^^g ·

Stupeň B

Do roztoku koncentrace 1 mg/ml jednoho z 5'-(β-(4,6-dichlor-l, 3,5-triazin-2-ylamino)-hexylJ-oligo nukleotidu (sloučeniny ΧΙΙ·^„·^θ) v 100 mM roztoku boritanu sodného (pH 8,3) se přidá nadbytek, a to stomolární primárního aminu, zvoleného ze skupiny R_1-36-Lys( ^-iinD^ANP-Lysí^“^)-!^ (sloučeniny Χ_χβ -36 ⁵⁵ Příkladu 11© Získaný roztok se míchá za teploty místnosti přes noc.Nezreagovaný amin se odstraní ultrafiltrací použitím membrány průřezu 3000 MW (Amicon, Beverly, MA) za trojnásobného použití vody při promývání · Sloučeniny XIII^_^^ se izolují zahuštěním objemu na 100 ml.

Příklad 15

Důkaz sekvencování použitím CE-dělícího postupu, jímáním frakcí, odštěpením značené složky, stanovením hmotnosti (a tedy identity) značené složky a odtud dedukováním sekvence.

140V tomto příkladu byla dva vzorky DNA sekvencovány shodným způsobem přípravy·

Postup práce s CE

Přístroj CE je široce použitelnou verzí přístroje, dodávaného od Applied Biosystems, Ino.(Poster City, CA)·

Jsou to malé krabičky z plexi-skla, obsahující dvě komůrky pufrovací, které lze udržovat na konstantní teplotě použitím zařízení, kontrolujícího právě teplotu· Voltáž, potřebná pro elektrofořezu, je dána zdrojem vysoko-voltového napětí (Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, Pl) s magnetickou bezpečnostní vložkou a kontrolním zařízením, kterým lze měnit použitý potenciál. Vzorkové injekce do otevřených kapilárních trubiček se vsunou použitím ručního vakuového čerpadla, čímž se vyvine diferenční tlak celou kapilárou (vakuové vstřikování)· Při použití kapilár plněným gélem se vzorky přeneseou do trubiček elektroforeticky použitím elektrického pole (elektrokinetická injekce).

Příprava kapilár, plněných gélem

Zatavené skleněné kapiláry délky 50 cm (vnější průměr 375 mm, vnitřní průměr 50 mm), výrobce Polymicro Technologies, Phoenix, AZ s detekčními okénky ve vzdálenosti 25 cm (kde polyamidové krytí bylo sejmuto z kapiláry) se použijí pro dělení. Vnitřní povrch kapilár se fcpatří vrstvou (methylakryloxypropyl)-trimethoxysilanu (MAPS, Sigma, St.Louis, MO), aby se umožnilo kovalentní přilnutí gélu na stěnu kapiláry, viž Nashabed a spol·, Anal.Chem. 63. 2148 (1994)· Kapiláry se vyčistí následným průtokem kyseliny trifluoroctové, vody, prostí iontů a acetonem· Po acetonovém promytí se zavede do kapiláry 0,2%ní roztok MAPS ve směsi vody a ethanolu 50/50, vše se ponechá 30 minut za teploty místnosti, roztok se odstraní odsátím a trubičky se suší 30 minut pod infračervenou vyhřív_ecí Jampuu.

Kapiláry, plněné gélem se připrací za vysokého tlaku úpravou postupu, který popsal Huang a spol., J.Chrom. 600.

289 (1992). Použije se 4%ní póly (akry amidový) gel s 5% zesí?? tovače a 8,3 močoviny , jak je to tamže uvedeno. Zásobní

-141roztok se připraví rozpuštěním 3,8 g akrylamidu, 0,20 g N,Ν'me t hýle nbis( akry lamidu) a 50 g močoviny v 100 ml pufru TBE (90 mM tris-borátu, pH, 8,3, 0,2 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové) · Zesítění se iniciuje pomocí 10 ml Ν,Ν,Ν',Ν*tetraměthylethylendiaminu (TEMED) a 250 ml 10%ního roztoku persíranu amonného· Polymerující roztok se rychle zavede do upravené kolony, naplněné kapiláry se potom umístí v ocelové trubici 1 x m x 0,3 cm vnitřního průměru na 0,6 cm vnějšího průměru, naplněných vodou a tlak se zvýší na 400 bar použitím vysokotlakového kapalinového chromatografického čerpadla a tlak se takto udržuje po dobu noci. Potom se tlak postupně uvolní a kapiláry se vyjmou ▼ Po krátkém oddělení kapiláry od každého konce kolony lze kapiláru použít·

Dělení a detekce DNA-fragmentů

Analýza DNA-sekvenčních reakcí po oddělení běžnou elektroforezou se provede na sekvenčním zařízení ABI 370A pro DNA-sekvenci. Toto zařízení využívá desku polyakrylamidového gélu, děna turu jí čího močovinu, tlouětka 0,4 mm se vzdáleností 26 cm vzorku proti detekční oblasti, to podle instrukcí výrobce· DNA-sekvenční reakce se připraví, jak to popisuje výrobce za použití polymerasy značených složek (Promega Corp·, Madison, WI) a provedou se na M13mpl9 jednoduchém provazci DNA-templátu, připraveném standardizovanými postupy. Sekvencované reakce se uchovávají v temnu při -20°C s vyhřátím na 90°C po 3 minuty ve formamidu právě před nanesením vzorku.

Ty se nanesou na 370 A pipetováním dle instrukcí výrobců a na CW elektrokinetickou injekcí při 10 000 V po 10 sekund. Během pochodu se jímají frakce (celkem 10) po pl, a to tak, že se odstraní veškerá kapalina ode dna elektrody a nahradí se novým elektrolytenu

Pro odštěpení značené složky z oligonukleotidů se přidá do každé frakce 100 pl 0,05 M roztoku dithiothreitolu (DTT).

Po inkubování 30 minut za teploty místnosti se přidá 0,1 M roztok chloridu sodného a 2 objemy ethanolu k vysrážení ODN, ty se odstraní z roztoku odstředěním, 14 OOOx G, 4°C, 15 minut.

• · • ····

-142

Kapalina nad sedlinou se uchová a dokonale se vysuší ve vakuu za odstřelování. Kuličky se potom rozpustí v 25 pl methanolu s následným testováním hmotnostní spektrometrií na přítomnost značených složek. Použije se týž postup MALDI, jako v příkladu 4. Tyto dále uvedené molekulární hmotnosti (značených složek) byly pozorovány v hmotnostním spektru ve funkci času:

Pracce M	Doba	mol .hmotn·	Frakce	Doba	mol·hmotn
1	1	0	29	29	212,1
2	2	0	30	30	312,1
3	3	0	31	31	212,1
4	4	0	32	32	212,1
5	5	0			199,1
6	6	0	33	33	212,1
7	7	0			199,1
8	8	0	34	34	212,1
9	9	0			200,1
10	10	0			199,1
11	11	0			227,1
12	12	0	35	35	200,1
13	13	0			199,1
14	14	0			227,1
15	15	0	36	36	200,1
16	16	0			227,1
17	17	0	37	37	200,1
18	18	0			227,1
19	19	0			179,18
20	20	0	38	38	200,1
21	- 21	0			196,1
22	22	0			179,18
23	23	0	39	39	200,1
24	24	0			196,1
25	25	0			179,18
26	26	0	40	40	196,1
27	37	0			179,18
28	28	MO			226,1
			41	41	196,1

226,1.

pokr.

«·

-143-

Frakce //	Doba	mol.hmotn	Frakce	Doba	mol.hmotn
42	42	196,1	49	49	218,1
		182,1	50	50	218,1
		226,1	51	51	0
43	43	182,1	52	52	0
		226,1	53	53	0
		209,1	54	54	0
44	44	182,1	55	55	0
		209,1	56	56	0
45	45	182,1	57	57	0
		235,2	58	58	0
		209,1	59	59	0
	4.	198,1	60	60	0
46	46	235,2 198,1
47	47	235,2
		198,1
48	48	235,2 198.1 218.1

časové zjištění značených složek pro sadu 1 je 212,1 200,1, 196,1, 182,1, 235*2, 218,1, 199,1, 227,1 a pro sadu &

199,1, 2 27,1, 179,1, 226,1, 209,1, 198,1. Protože 212,l amu znamená derivát kyseliny 4ůmethoxybenzoová, znamená 200,1 derivát kyseliny 4-fluorbenzoové, 196,1 amu derivát kyseliny toluové,

182.1 amu derivát kyseliny benzoové, 235,2 amu derivát kyseliny indol-3-octové, 218,1 amu derivát kyseliny 2,6-difluorbenzoové,

199.1 amu derivátN-oxidu kyseliny nikotinové, 227,1 amu derivát

2-nitrobenzamidu, 179,18 am derivát kyseliny 5-acetylsalicylové,

226.1 amu derivát kyseliny 4-ethoxybenzoové, 209,1 amu derivát kyseliny skořicové, a 198,1 amu derivát kyseliny 3-aminonikotinové. Prvou sekvence lze dedukovat ja£o -5 '-TATGCA-3 a druhou sekvenci jako -5'-CGTACC-3*-, Takže je možno sekvencovat více než jeden vzorek DNA v jednom stupni dělení.

Příklad 16

Důkaz současného detegování většího počtu značených složek hmotnostní spektrometrií

V tomto příkladu se popisuje možnost a schopnost současného detegování většího počtu sloučenin (značených složek) hmotnostní spektrometrií· V tomto,příkladu bylo 31 sloučenin smícháno s matricí, po nánosu a sušení na pevném podkladu následovala desorpce Laser-em. Vzniklé ionty byly vedeny do hmotnostního spektrometru*

Dále uvedené sloučeniny (od Aldrich, Milwaukee, WI) byly navzájem promíchány n_a ekvimolární bázi na konečnou koncentraci 0,002 M (na sloučeninu): benzamid (121,14), amid kyseliny nikotinové (122,13), pyrazinamid (I23ipl2),kyselina 3-amino-4-pyrazolkarboxylová (127,10), 2-thiofenkarboxamid (127,17),

4-aminobenzamid (135,15), tolumid (135,17), 6-methylnikotinamid (136,15), 3-aminonikotinamid (137,14), N-oxid nikotinamidu (138,12), 3-hydroxypikolinamid (138,13), 4-fluorbenzamid (139,13), amid kyseliny skořicové (147,18), 4-methoxybenzamid (151,17), 2,6-difluorbenzamid (157,12), 4-amino-5imidazolkarboxamid (162,58), 3,4-pyridin-dikarboxamid (165,16),

4-ethoxybenzamid (165,19), 2,3-pyrazindikarboxamid (166,14), 2.nitrobenzamid (166,14), 3-fůuor-4-methoxybenzoová kyselina (170,4), indol-3-acetamid (174,2), 5-acetylsalicylamid (179,18),

3,5-dime thoxy benzamid (181,19), l-naftalenacet_amid (185,23), 8-chlor-3,5-diamino-2-pyrazinkarboxamid (187,59), 4-trifluormethylbenzamid (189,00), 5-amino-5-fenyl-4-pyrazolkarboxamid (202.22) , l-methyl-2-benzylmalonamát (207,33), 4-amino-2,3,5,6tetraf luor benzamid (208,11), 2,3-naftalendikarboxylová kyselina (212.22) . Sloučeniny byly vneseny ve výše uvedené koncentraci do dimethylsulfoxidu, 1 Jil materiálu byl potom smíchán s matricí kyseliny <<-kyan-4-hydroxyskořicoví (po zředění 1 : 10 000) a nanesen na pevný podklad z nerezové oceli.

Potom byl materiál desorbován laser-em za užití Protein TOP Mass Spectrometer (Bruker, Manning Park, MA) a vzniklé ionty byly proměřeny jak lineárním, tak reflexním operačním postupem · Byly pozorovány tyto dále uvedené hodnoty m/z, viz vyobr.ll.

-145benzamid (121,14) nikotinamid (122,13) pyrazinamid (123,12) kyselina 3-amino-4-pyrazolkarboxylová (127,10)

2- thiofenkarboxamid (127,17)

4-amino benzamid (135,15) toluraid (135,17)

6-methylnikotinamid (136,15)

3- aminonikotinamid (137,14)

N-oxid nikotinamidu (138,12)

3- hydroxypikolinamid (138,13)

4- fluorbenzamid (139,13) amid kyseliny skořicové (147,18)

4-me thoxybenzamid (151,17)

2,6-difluor benz₈mid(157,12 )

4-amino-5-imidazolkarboxamid (162,88)

3,4-pyridin-dikarboxamid (165,16)

4-sthoxybenzamid (165,19) 2,3-pyrazindikarboxamid (166,14)

2- nitrobenzamid (16.6,14),

3- fluor-4-methoxybenzoová kyselina (170,4) indol-3-acetamid (174,2

5-acetylsalixylamid (179,18)

3,5-dimethoxybenzamid (181,19)

1-naftalenacetamid (185,23)

-1468-chlor-3,5-diami no-2-pyrazinkarboxamid (1$,5 9)

188,2

189.2 4-trifluormethylbenzamid (189,00

190.2

191.2

192.3

5-amino-5-fenyl-4-pyrazolkarboxamid (202,22)

203.2

203.4 l-methyl-2-benzylmalonamát (207.33)

4-amino-2,3,5,6-tetrafluorbenzamid (208,11)

212.2 2,3-naftalendikarboxylová kyselina (212,22)

219.3

221,2

228,2

234,2

237.4

241.4 údajů je jasné, že z 31 sloučenin se 22 objevilo ve spektru s přepokládanou hmotností, 9 z 31 se objevilo ve spektru s hmotností η + Η (1 atomová hmotn.jednotka, amu) ve srovnání s předpokládanou hmotností. Podléze uvedený jev je pravděpodobně důsledkem protonování aminu ve sloučenině. Takže z 31 sloučenin jich bylo 31 dokázáno použitím hmotnostní xpektroskopie MALDI. Ale důležitější je zjištění, že lze touto spektroskopickou metodou zjistit současně větší počet značených složek.

Sama <D-kyan-matrice (viz vyobr. 12) má píky při 146,2 164,1, 172,1 , 173#1, 189,1, 190,1, 191,1, 192,1, 212,1, 224,1, 228,Q, 243,3. Další ve spektru zjištěné hmotnosti odpovídají nečistotám v koupených látkách, nebylo totiž vynaloženo žádné úsilí na jejich přečištění.

• ·· • · · ·· ··

-147Příklad 17

Postup sekvencování se značenými priméry, identifikujícími mol.hmotnost, radio-značenými priméry, značenými didesoxyterminátory, identifikujícími mol.hmotnost, fluoreskujícími priméry a fluoreskujícími didesoxyterminátory

A. Příprava sekvenčních gélů a elektroforeza

Postupuje se dle tohoto protokolu: připraví se polyakrylamidové gély s 8 M močovinou podle dále uvedeného předpisu (10θ ml) pro 4%, 6% nebo 8% pólyakrylamid.

999 • · ·	4%	5%	6%
močovina	48 g	48 g	48 g
40% akrylamid/bisakrylamid	10 ml	12,5 ml	15 ml
10X MTBE	10 ml	10 ml	10 ml
15% APS	5Q0 pl	500 pl	500 pl
TEMED	50 pl	50 pl	50 pl

Močovina (55O5QA) byla získána od Gibco/BRL (Gaitherburg, MD), všechny ostatní materiály od Fisher-a (Fair Lawn, NJ).

Směs močoviny, pufru MTBE a vody ge inkubuje 3 minuty za teploty 55°C za míchání, aby se rozpustila močovina. Směs se krátce ochladí, přidá se roztok akrylamidu/bisakrylamidu, po dobrém promíchání se směs odplyní 5 minut použitím vakua. Za míchání se přidají APS a TEMED jako polymeraČní činidla. Takto připravená kompletní gelová směs se bezprostředně vlije dvě skleněné desky s rozporkami 0,15 mm. Desky se připraví nejprve vyčistěním za použití ALOONOX™ (Ney York, NY) jako detergentu a pak použitím vody horké s následným dvojím opláchnutím destilovanou vodou a = vysušením. Skleněná deska se zářezy se typicky upraví silanizujícím činidlem a opláchne se dvakrát destilovanou vodou. Po vlití se gel bezprostředně rozlije vodorovně, vsune se sonda, tvořící žlábky, vše se sevře a gel se nechá polymerovat nejméně 30 minut. Před vlastním nanášením se odstraní přelep kolem spodní části gélu a odstrabí se také sonda, tvořící žlábky.

Vše se spojí s vertikálním zařízením pro elektroforezu připojením pevně horních a dolních pufrovacích komůrek ke gélovým deskám a do komůrek se vnese elektroforezní pufr IX MTBE.

·· .14$:

Vzorky ye potom nestříknou použitím injekční stříkačky, obsahující použitý pufr a bezprostředně před nanesením každého vzorku se každý žlábek propláchne použitým pufrem za použití špičatých předmětů, k odstranění močoviny· Do každého žlábku se nanese 1 až 2 mikrolitry vzorku za použití pipety (Rainin, I&eryville, CA) použitím špičatého předmětu pro nanášení gelu a následuje elektroforeza podle dále uvedeného programu ( během elektroforesy je gél chlazen Větrákem.

Zakončení reakce polyakrylamidového gelu krátce dlouze dlouze

5%, 0,15 mm na 50 cm na 20 cm 4%, 015 ^mm na 70 cm na 20 cm 4%, 0,15 mm na 70 cm na 20 cm

Podmínky elektroforezy

2,25 hod/22 mA 8-9 hod/15 mA 20-24 hod /15 mA

Každá bázicky specifickou sekvenční reakcí zakončené směs ( s krátkým terminováním) se nanese na 0,15 mm na 50 cm na 20 cm denaturující 5% pólyakrylamidový gel; reakce zakončené dlouhým terminováním se z hlediska směsí rozdělí na 2 poloviny s nanesením na dvě 0,15 mm na 70 cm na 20 cm denaturující 4% polyakrylamidové gely·

Po skončené elektroforeze se ze žlábků odstraní puft, odstraní se krycí proužek a gelové destičky se rozdělí· Gel se přenese na list papíru WJjatman 3MM 40 cm na 20 om, pokryje se plastovým obalem a suší v Hoefer-ově gelové sušárně (San

Prancisco, CA) 25 minut při 80°C. Sušený gel se exponuje na film Kodak XRP-1 (New Haven, CT). V závislosti na intenzitě ' 32 signálu a i na tom, zda značení bylo provedeno použitím P nebo ³⁵S kolísá exponování od 4 hodin do několika dnů· Po _ exponování se filmy vyvolají postupem ve vývojce a ustalovači, opláchnou vodou a suší na vzduchu. Autoradiogram se potom umístí do čtečky, sekvence se ručně odečtou a data se zanesou do počítače.

Cyklus sekvencování, katalyzovaný polymerasou značených složek za použití značených primérů.

Každá bázicky-specifieká cyklická sekvenční reakce zahrnuje použití asi 100 nebo 200 ng izolovaných jednoprovazcovýc] DNA pro reakce A, C, nebo G či T v tom kterém případě.

··

-149····

Dvouprovazcové cyklické sekvenční reakce podobné zahrnují použití asi 200 až 400 ng DNA, izolovaného plasmidu za použití buď běžného alkalického lyzováné nebo postupu, založeného na lyžování alkalickém, ale modifikovaném diatomácnímu hlinkami. Všechny reakční složky s výjimkou templátu DNA se přidají v jednom pipetovaoím stupni z předsměsi dříve již zmíněného alikvotního zásobního roztoku, chlazeného na -20°C. Reakční předsměsi se připraví spojením reakčního pufru s bázicky-specifickými nukleotidovými směsmi. Před použitím se bazicky-specifické přesm+si nechají roztát a spojí se se zředěnou DNA polymerasou značených složek a s individuálně zakončenými univerzálními priméry, takže se tím pořídí konečné reakční směsi. Jakmile již byly připraveny, odpipetují se 4 alikvotní podíly jednoči dvouprovazcové DNA na dno 0,2 ml tenkostěnných reakčních trubiček, jak to odpovídá reakcím A, C, G a T a potom se alikvotní podíl odpovídající reakční směsi přidá po straně do každé trubičky. Tyto trubičky jsou částí 96ti-Členného zásobníku formátu mikrotitrační destičky, zapadající do Perkin.Elmer Cetus Cycler 9600 (Poster City, CA). Kloboučky krytí se připevní na sestavu trubiček/zásobníku a deska se krátce odstředí. Potom se deska umístí do cyklizačního zařízení, jehož obal byl předehřát na 95°C a ihned se zahájí cyklizační program. Protokol cyklizace je tento: 15 až 30 cyklů, denaturaae (95° C), anelování (55° C), prodloužení (72° C), denaturování (95° C), prodlužování (72° C), denaturování (9|° C)a prodlužování (72° C), posléz s nasáknutím při 4°C do skladování informací.

V tomto stavu lze reakce zmrazit a uchovávat při -20° C až po několik dnů. Před sléváním a vysrážením se deska krátce odstředí, aby se předešlo kondenzaci. Priméry a bázicky-specifické reakce se slijí do ethanolu, vysrážená DNA se shromáždí odstředěním a pak se vysuší. Tyto sekvenční reakce se mohou skladovat po několik dnů při -20° C.

Protokol pro sekvenční reakce je tento: pro reakce A a C:

pl, pro reakce G a T: 2 pl kibici'lvi vzorku DNA (100 ng/ul pro templáty M13 a 200 ng/ul pro templáty pUC) se pipetují na dno tenkostěnné reakční trubičky objemu 0,2 ml. Amplifikační polymerasa znsčených složek byla od Perkin-Elmer Cetus (Poster City, CA).

• · • ···· ·· ··

-150Připraví se směs 30 pl Ampli-značené složky (5U/pl), 30 pl 5X reakční^pufru pro značenou složku, 130 yl destilované (dvakrát) vody a 190 jol zředěné značené složky pro 24 klonů,

A, C, G a T bázicky-specifické směsi se připraví přidáním bázicky-specifického priméru a zředěné značené složky do každé předsměsi bazicky specifického nukleotidu a pufru.

A, C/G,T

60/120 pl 5 X cyklická sekvenční směs pro značenou složku 30/60 ,ul zředěná polymerasa značené složky

30/60 jul odpovídající fluorescenčně na konci značený primér

120/240 ul

B. Cyklus sekvencování, katalyzovaný polymerasou značené složky za použití terminační reakce se značeným identifikátorem mol.hmotnosti

Jedním z problémů dekvencování cyklu DNA je to, že použijí-li se priméry, pak reakční podmínky jsou takové, že distribuce sady zesítěného fragmentu závisí značně na koncentraci templátu v reakční směsi. Nyní bylo pozorováno, že distribuce zesítěných fragmentů při reakčních podmínkách sekvencování cyklu DNA za použití značených terminátorů je mnohem méně citlivá na koncentraci DNA, než jak by se toho dosáhlo při reakcích se značenými priméry, popsanými výše. Navíc pak terminátorové reakce vyžadují pouze jednu reakční trubičku pro templát, zatím co reakce se značenými priméry potřebují samostatnou reakční trubičku pro každý ze 4 terminátorů. Dále uvedený protokol lze snadno dódržet za izolování templátu na 96 žlábcích a postupem čistění reakcí na 96 žlábcích, jak se to zde popisuje.

Umístí se 0,5 jig jednoprovazcové nebo 1 jig dvouprovazcové DNA v trubičkách PCR, 0,2 ml. Přidá se 1 pl (pro jednoprovazcové templáty) “ ‘ 1 (pro dvouprovazcové templáty) 0,8 uM přiméru

a 9,5 yl (dodávané od ABI) do k_aždé trubičky a dvakrát destilovanou vodou se upraví konečný objem na 20 pl.

• ·

Po krátkém odstředění se postupuje dále dle terminátorového programu, jak to popisuje výrobce, tedy předehřát na 96 °C, cyklů 15 sekund/96⁰ Cm 1 sekunda/50° C, 4 minuty/60° C a pak vázání při 4° C, Postupuje se použitím čistění výtlačnou kolonou bud Centri-Sep (Amicon, Beverly, MA) nebo použitím postupu na G-50 mikrótitracní destičce, jak je to ještě popisováno zde dále.

C. Čistění terminátorové reakce pomocí kolony pro odstředivé dělení.

Kolona se připraví něžným naklepáváním na kolonu, aby totiž gelový materiál klesl ku dnu kolony. Uzávěr kolony se sejme, vlije se 0,75 ml destilované vody, kolona se uzavře a několikrát převrátí, aby se obsah promíchal. Asi 30 minut se ponechá k hydrataci gelu za teploty místnosti a kolona či kolony se uchovávají několik dní při 4° 0, před použitím se nechají vytemperovat na teplotu místnosti. Jakékoli bublinky vzduchu se odstraní převrácením kolony a umožněním gelu klesnout. Odstraní se nejprve horní uzávěr, potom spodní uzávěr a kolona se nechá vysušit, to vlastní tíhou (poznámka; pokud odtek nezačne bezprostředně automaticky, je třeba mírného tlaku na kolonu nafouknutím pipetou). Kolona se vsune do připravené promývací trubičky s následným protáčením mikroodstředivkou s měnitelnou rychlostí 2 minuty,

1300 xg, aby se tak odstranila tekutina. Kolona se vyjme z promývací trubičky a vsune se do trubičky pro sbírání vzorku, pečlivě se odebere reakční směs:t (20 pl) a n_anese se na vršek gelového materiálu. Pokud se vzorky inkubují v cyklickém přístroji, kde je třeba překrytí olejem, pečliwě se vyjme reakční směs pod olejem. Je třeba vyvarovat se ulpění oleje na vzorku, ačkoliv malá množství oleje (pod 1 ul) ve vzorku výsledek neovlivní. Olej na konci pipetového ústí, obsahující vzorek, se dá odstranit něžným dotykem konce pipety na čistý povrch (například reakční trubičku). Jedna kolona se použije pouze jednou^Protáčení na mikroodstředivce s měnitelnou rychlostí se stanoveným uhlem rotoru se provede tak, že se kolona orientuje přesně tak, jako při prvém protáčení. Vzorek se suší ve vakuové sušárně; nepoužije se teplo, aniž se vzorek přesuší. Je-li to třeba, může se reakční vzorek vysrážet ethanolem.

-152D. Koncové čistění terminátorové reakce použitím filtračních desek mikrotitračního formátu s náplní Sephadex-u G-50

S ephadex (Pharmacia, Pisca taway, N J) má tende nci sedime ntovat, je tedy třeba jej resuspendovat před .nanesením na desku a vždy po naplnění každých 8 až 10 žlábků. Do každého žlábku mikrotitrační filtrační desky se vnese 400 pl promíchaného Sephadex-u G-50, nad mikrotitrační deskou se umístí arch mikrotitračního filtračního papíru, aby zachytil vodu, a strany se uzavřou tak, aby nedošlo k uniku obsahu během odštředování, to se provede 2 minuty za 1500 otáček za minutu. Voda, jež se shromáždí na mikrotitrační desce není k potřebě a odstraní se, opět se na mikrotitrační desce umístí mikrotitrační filtr k zachycení vody a uzavřou se strany tak, aby nedošlo k úniku během odstřeďování Přidá se další podíl 100 až 200 pl Sephadex-u G-50 k doplnění žlábků na mikrotitrační desce, dále protáčení 2 minuty, 1500 otáček za minutu. Voda, jež se shromáždí na mikrotitračních deskách, se odstraní, mikrofiltrační filtr se umístí had mikrotitračními deskami k zachycení vody, a strany se uzavřou, aby nedošlo k úniku hmoty během odstřeďdvání, Do každého žlábku s obsahem Sephadex-u G-50 se přidá 20 pl terminátoru, dále protáčení 2 minuty, 1500 otáček za minutu. Shromážděný výtok se umístí na asi hodinu až dvě v rychle pracujícím evakuátoru.

Sekvencování sekvenasou^ (UPS, Cleveland,0H) s použitím značených terminátorů.

Reakce jednoprovazcového terminátoru vyžadují asi 2 pg fenolem extrahovaného templátu DNA na bázi M13. DNA se denaturuje a primér se anelujeinkubováním DNA, primérů a pufru při 65° C. Po ochlazení na teplotu místnosti se přidají ol-deoxy nukleotidy, značené terminátory a zředěná DNA polymerasa sekvenasy TM a reakční směs se uchovává při 37° 0. Průběh reakce se zastaví přidáním octanu amonného a ethanolu, dojde k vysrážení fragmentů DNA, v

ty se vysuší. Při odstranovávání nezařazených terminátorů se kuličky DNA opláchnou dvakrát ethanolem. Bušené sekvenční reakční produkty se mohou uchovávat při _20°C až po několik dnů.

-153

Reakce dvouprovazcového terminátoru vyžadují asi 5 fig plasmidu DNA, vyčištěného modifikovanou alkalickou lyzou za použití diatomázní hlinky. Dvouprovazcová DNA se denaturuje inkubováním v roztoku hydroxidu sodného při 65°C, po inkubování se přidá primér a reakční směs se neutralizuje přidáním kyselého pufru. Smíchají se potom reakční pufr, cí-thiodesoxynukleotidy, a zředěná DNA polymerasa sekvenasy TM a reakční směs se uchovává při 37°C, reakce se zastaví přidáním octanu amonného, fragmenty DNA se vysrážejí, propláchnou, suší a uchovají.

Pro jednoprovazcovou reakci:

do 1,5 ml mikrocentrifugové trubičky se vnese:

ul ss DNA (2 xxg) pl 0,8 uM priméru

nl

Při denaturování DNA a anelování priméru se uchovává reakční směs po 5 minut při 65 až 70° C. Reakční směs se pak nechá vychladnout během 15 minut na teplotu místnosti, krátce se odstředuje k podpoře kondenzace. Do každé z reakčníčh směsí se přidají dále uvedené reakční složky a následným uchováváním 10 minut za teploty 37°C.

jíl směsi AB1 terminátoru (č.katalogu 401489) yxl zředěné sekvenasy TM (3,25 U/ul) ul 2 mM οζ-S dNTP pl celkový objem incl.výše uvedené směsi

Neředěná sekvenasa TM (č.katalogu 70775, United States

Biochemicals, Cleveland, OH) obsahuje 13 U/pl a zředí se 1 : 4 pomocí USB-ředícího pufru před použitím. Přidá se pak 20 jal

9,5 M roztoku octanu amonného a 100 pl 95%níto ethanolu k zastavení reakce a promíchání reakční směsi.

• ·

V lázni z ledu a vody &e vysráží DNA během 10 minut, odstředuje se 15 minut při 4° C na mikroodstředivce, 10 000 xg. Kapalina nad sedlinou se pečlivě oddekantuje a kuličky se opláchnou přidáním 300 pl 70-80% ethanolu. Po promíchání následuje opět odstřelování a pečlivé oddekantování kapaliny nad sedlinou.

Stupeň promývání se opakuje, aby se tak zajistilo účinné odstranění nevřazeného terminátoru. DNA se suší 5 až 10 minut) nebo až do sucha) ve vakuové sušárně Speed-Vac a suché reakční produkty se uchovávají za teploty -20° C.

Pro dvouprovazcovou reakci:

do 1,5 ml mikrocentrifugové trubičky se vnese:

pl ds DNA (5 pg) ul 1 N roztoku hydroxidu sodného pl dvanrát destilované vody

Reakční směs se inkubuje fca teploty 65 až 70° C 5 minut, potom se krátce odstředuje k podpoře kondenzace. Do každé reakční směsi se přidají tato dále uvedená činidla s následným provířením a odstředěním:

ul 8 uM priméru pl dvakrát destilované vody pl kyselého pufru MOPS

Dále se do každé reakční směsi přidají dále uvedená činidla a inkubováním 10 minut při 37° C.

pl 10X Mn²⁺/isocitrátového >ufru pl ABI terminátoru mi pl zředěné sekvenasy TM (3,25 U/pl) μΐ 2 hM ( ct)-S-dNTP pl celkový objem ~

Nezředěná sekvenasa^ (United States Biochemicals) odpovídá 13 U/ul a před použitím se má ředit 1 ΐ 4 USB ředícím pufrem Reakce se pak zastaví přidáním 60 pl 8 M roztoku ocfcénu • ·

-155amonného a 300 ul 95%ního ethanolu s promícháním. V lázni z ledu a vody se vysráŽí DNA během 10 minut, při 4° C následuje odstředování 15 minut. 10 000 xg, kapalina nad pevným podílem se pečlivě oddekantuje, kuličky se promyjí přidáním 300 jpl 80%ního ethanolu, vzorek se promíchá ' a znovu odstřeďuje 15 minut, pečlivě se oddekantuje kapalina nad sedlinou a. stupen promývéní se opakuje, aby se tak zajistilo účinné odstranění nevřazených terminátorů. DNA se suší 5 až 10 minutí nebo až do vysušení) za použití Speed-Vac.

E. Příprava sekvenčního gelu, před-elektroforeza, nanesení vzorku, elektroforeza, sejmutí údajů a analýza ABI 373A DNA sekvenceru

Polyakrylamidové gely pro sekvencování DNA se připravují jak je torpopisováno zde výše s výjimkou potud, že se gelová směs filtruje před polymerováním. Skleněné desky se pečlivě očistí horkou vodou, destilovanou vodou a ethanolem, aby se odstranily možné fluoreskující nečistoty před vlastním značením. Denaturované 6%ní polyakrylamidové gély se vlijí na desky 0,3 mm na 89 cm na 52 cm, vzorované a vybavené 36 žlábky. Po polymerování se odstraní krytí z gelu a vnější povrch skleněných desek se očistí horkou vodou, opláchne destilovanou vodou a ethanolem. Gel se shromáždí v sekvent^čním zařízení ABI a _pajc sleduje laser-ovým počítačem. Zásadní změny byly pozorovány na počítačovém display-i ABI-associated Macintosh Computer, desky byly znovu očištěny, potom byly připojeny pufrované žlábky, pufr elektroforezy a gel byl před-elektroforezován 10 až 30 minut při 30 W. Před nanesením vzorku byly spojené reakční produkty po vysušení resugpendovány v pufru z formamidu a kyseliny ethylendiamintetraoctové promícháním s následným vysušením při 90° C. Vzorkový list byl vsunut do ”ABI data collection software, Macintosh Computer”, čímž se vyznačí počet nanesených vzorků a pohyblivost fluorescenčně značených částí k použití pro zkracování sekvenčních údajů. Po vyčistění žlábků • ♦ • · • ·

použitím injekční stříkačky byly liše-čí slova né sekvenční reakce naneseny do odpovídajících žlábků použitím mikropipety, vybavené ploše uspořádaným zakončením pro nanášení gelu. Gel se potom elektroforezuje 5 minut dříve,než se žlábky znovu vyčistí a shromáždí se sudě-číSlované vzorky· Filtrační koloběh, použitý pro barevné primery a barevné terminátory je specifikován pro ABI 373A CPU. Typické údaje pro elektroforezu a sejmutí dat jsou: 10 hodin/30 W pro ABI 737A za vybavení hliníkovou desk_ou pro distribuování teploty. Po shromáždění všech dat se vytvoří soubor celkového obrazu na ABI software ve vztahu zjištěného signálu fluorescence k odpovídajícímu počtu rastrů. Software potom stanoví pozici cesty vzorku na základě intenzit signálu. Poté co byly vysledovány zmíněné cesty, extrahuje se průřez dat pro každou cestu s následnou základní subtrakoí, propočtem pohyblivosti, spektrálního zjištění a časových korekcí. Po provedení postupu se soubor sekvenčních dat přenese na SPARC-station 2 za použití NFS .Share.

Protokol: připraví se 8 M roztok močoviny, polyakrylamidové gely, jak je to popsáno výše, za použití podkladu s 36 žlábky.

Předl nanášením se očistí vnější povrch gélových desek. Gélové desky se umístí v ABI 363A DBA-sekvenČním zařízení (Poster City,

CA) tak, že nižší zjištění (obvykle modrá čá±a) odpovídá hodnotě intenzity 800 až 1000 na display-i obrazu pro shromáždění počítačových údajů. Pokud základní linie čtyřbarevného vzorků linií není plochá, třeba znovu vyčistit skleněné desky. Připojí se hliníková deska, distribuující teplotu, následuje před-elektroforeza gélu po 10 až 39 minut, potom příprava vzorků pro nanášení; na dno každé trubičky se přidají 3 pl FE, po promíchání se vše vyhřeje na 90°C (3 minuty) a odstřeďováním se podporuje kondenzace. Vgorek se vypláchne elektroforezním pufrem za použití injekční stříkačky.

Za použití injekční stříkačky s plochým zakončením pro nanášení gelu se nanese naždý z liše-Číslovaných vzorků, následuje předelektroforeza gelu nejméně po 5 minut, žlábky se vypláchnou znovu, a nanos® se každý z sudě-číslováných vzorků. Následuje elektro» foréza (30 W, 10 godin). Po shromáždění údajů ABI-software automaticky pořídí analytické údaj®, jež vytvoří obrazec gélových náplní • ·

-157-

vyělení údaje pro každý jednotlivý vzorek i procesní údaje.

P. Sekvencování dvouprovazcových klonů. DNA, obsahujících dlouhá póly(A)-zákoncení za použití zakotvených póly(dT)primérů

Dvouprovazcové templáty DNA, obsahující dlouhé poly(A)trakce, se obtížně sekvencují s vektorovými priméry, které se anelují směrem dolů po póly(A)-zakonČení. Výsledek sekvencování s těmito priméařy vyústí v dlouhém poly(T) žebříčku s následnou sekvencí, jež je těžko k přečtení. Aby se tento problém obešel, byly zvoleny 3 priméry obsahující (dT) a každý z nich na 3'-konci buď (dA), nebo (dC) nebo (dG), aby označily zakotvení primérů a umožnily sekvencování oblasti bezprostředně směrem nahoru po oblasti póly(A). Při použití tohoto postupu lze docílit 300 bp sekvenci, kterou lze přečíst. Sekvence na obrácené straně provazce takových cDNA byla zjištěna použitím vsunutých primérů směrem vzhůru po oblasti póly(A). Možnost přímo získat sekvenci bezprostředně směrem vzhůru od poly(A)-zakončení kyselin cDNA by měla mít obzvláštní důležitost se zřetelem na úsilí generovat sekvenčně značená místo (STSs) z kyselin cDNA.

Protokol postupu je tento:

Syntetizují se zakotvené póly (άΤ)^γ se zakotvenými (dA), nebo (dC) nebo (dG) na 3'-koncovce na syntetickém zařízení pro

DNA a po vyčistění se použijí na Oligonucleotide Purification « _r Cartridges (Amicon, Beverly, MA). Pro sekvencování se zakotvenými priméry se děna turu je 5 až 10 pg plasmidů DNA v celkovém objemu 50 yl, obsahujícím 0,2 M roztoku hydroxidu sodného a 0,16 mM roztoku kyseliny ethylendiamintetraoctové inkubováním 10 minut za teploty 65° C. Přidají se 3 poly(dT)-zakotvené priméry (3 pmol každého z nich) a směs se bezprostředně umístí v ledu. Roztok se neutralizuje přidáním 5 ml 5 M roztoku octanu amonného, pH 7,0.

DNA se vysráží přidáním 150 pl ^hlazeného 95%ního ethanolu, • ·

-158-..· a kuličky se promyjí dvakrát vychlazeným 70%ním ethanolem.

Dále se kuličky suší 5 minut a resuspendují v pufru MOPS.

Priméry se analují zahřátím roztoku na 65° C po 2 minuty s následným pomalým ochlazením (15 až 30 minut) na teplotu místnosti. Sekvenční reakce se provede použitím modifikované T7 DNA polymerasy a OÍ,-(³²P)dATP (nad 1000 Ci/mmol) za použití výše uvedeného protokolu.

G. Sekvencování kyselin cDNA na základě PCR a klonování náhodným nástřelem

Dále je popisován postup sekvencování klonovaných kyselin cDNA na základe PCR-amplifikací, klonování náhodným nástřelem a automatizovaného sekvencování s využitím fluorescence. Tento postup, založený na PCR, využívá primární pár mezi obvyklým univerzálním” postupem vpřed a reverzními značenými stranami a větší počet klonujících míst Stratagene Bluescript vector—u. Mohou se použít tyto dva PCR—priméry a to se sekvencí 5'-TCGAGGTCGACGGTATCG-3' (sekvence ID č.15) pro směr vpřed a -l6bs primér a 5 '-GCCGCTCTAGAACTAG TG-3'- (sekv. ID č.16) pro reverzinebo +19bs priméru pro amplifikování dostatečných množství kyselin cDNA jako vsuvek do rozsahu velikosti 1,2 až

3.4 kb tak, že sekvenční postup náhodným nastřelováním, popisovaný dole, se může doplnit.

Toto je použitelný protokol:

Inkubují se čtyři směsi PCR po 100 pl, každá obsahující asi ihOO ng plasmidu DNA, 100 pmol každého priméru, 50 mM roztoku chloridu draselného, 10 mM roztoku hydrochloridu Tris, pH 8,5,

1.5 mM roztoku chloridu horečnatého, 0,2 mM každého z dNTP a 5 jednotek- PE-Cetus Amplitaq’’ v 0,5 ml uzavřených trubičkách pro 25 cyklů 1 minutu při 95°C, 1 minutu při 55°C, a 2 minuty při 72°C v PE-Cetus 48 tube DNA Thermal Cycler. Po spojení 4 reakčních směsí pe vodný roztok, obsahující produkt PCR, umístí v rozprašovacím zařízení, objem se upraví na 2,0 ml přidáním asi • ·

-1590,5 až 1,0 ml glycerolu a teplota se upraví na -20°C vsunutím do!lázně buď z isopropylalkoholu a ledu, nebo nasyceného vod' ného roztoku chloridu sodného a ledu na 10 minut. Vzorek se rozpráší při -20° C použitím tlaku dusíku 25 až 30 psi) po

2,5 minut. Po následném vysrážené ethanolem prokoncentrování prodloužených PCR-produktů se fragmenty tupě zakončí a fosfory lují inkubováním a Klenow-ovým fragmentem DNA polymerasy z Escherichia coli a T4 polynukleotidovou kinasou, jak to zde již bylo popsáno. Eluováním z nízkotajícího agarosového gelu se získají fragmenty v rozsahu 0,4 až 0,7 kb.

Z předchozího popisu, ačkov byla zde popisována specifická provedení se zřetelem na ozřejmění tohoto vynálezu, je patrné, že jsou zde možné četné variace, aniž by se vybočilo z rozsahu tohoto vynálezu.Vynález je tedy omezen zněním připojených nároků.

·· ·· ··

160Sekvenční přehled

1. Obecné informace (i) žadatelé: Ven Ness, Jeffrey

Tabone, John 0 Howbert, J.Jeffry Mulligan, John T., (ii) název přihlášky :Způsoby a kompozice pro stanovení sekvence molekul nukleových kyselin, (iii$ počet sekvencí: 16 (iV) adresa pro korespondenci: SEED and BERRY

6300 Columbia Center, 701 Pifth Avenue Seattle, Washington, USA, ZIP 98104-7092 (v) počítačové formy

Medium type: Floppy disk

Computer: IBM PC, comj>atieie

Operating System: PC-DOS/MS-DOS

Software: Patentln Release // 1,0, Version // 1

2. Informace pro sekvenci ID, č.l (i) Sekvenční charakteristiky (A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyseliny (C) provazec: jednoduchý (D) topologie: lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.l

TGTAAAACGA CGGCCAGT sekv. ID č.2 sekvenční charakteristiky párů bází nukleová kyselina jednoduchý (A) délka (B) typ (C) provazec:

(D) topologie: lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.2 TGTAAAACGA CGGCAGTA sekv.ID š.3 sekvenční charakteristika • fc fcfc

-161

(A)	délka	20 párů bází
(B)	typ	nukleová kyselina
(C)	provazeo	jednoduchý
(D)	topologie	lineární
Sekvenční des	kripce, sekv.	, ID č.3
TGTAAAACGA CGGCCAGTAT sekv.č.4 (A) délka	21 párů bází
(B)	typ	nukleová kyselina
(C)	provazeo	jednoduchý
(D)	topologie	lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.4 TGTAAAACGA CGGCCAGTAT G sekv.č.5 (A) délka 22 párů bází (B) fyp nukleová kyselina (C) provazeo jednoduchý (D) topologie lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID c.5

TGTAAAACGA CGGCCAGTAT GC sekv.č.6 (A) délka (B) typ (C) provazeo (D) topologie párů $>ází nukleová kyselina jednoduchý lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.6

TGTAAAACGA CGGCCAGTAT GCA sekvence č.7 (A) délka (B) typ (C) provazeo (D) topologie

4 párů bází nukleová kyselina jednoduchý lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.7

TGTAAAACGA CGGCCAGTAT GCAT sekvence č.8 (A) délka 25 párů bází (B) typ nukleová kyselina ·· ·· • · · · • · ·· • · · · · • « · ·· ·♦ • · ·« • · · · • · ·

-162(C) provazec (D) topologie jednoduchý lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.8
TGTAAAACGA CGGCCAGTAT GCATG
sekvence č.9	- , . - -. . .... _ . - --
(A) délka	18 párů bází
(B) typ	nukleová kyselina
(C) provazec	Jednoduchý
(D) topologie	lineární
Sekvenční deskripce, sekv. ID č.9
TGTAAAACGA CGGCCACG
sekvence č.10
(A) délka	19 párů bází
(B) typ	nukleová kyselina
(C) provazec	jednoduchý
(D) topologie	lineární
Sekvenční deskripce, sekv.ID	č.10
TGTAAAACGA CGGCCAGCG
sekvence č.ll
(A) délka	20 párů bází
(B) typ	nukleová kyselina
(C) provazec	jednoduchý
(D) topologie	lineární
Sekvenční deskripce, sekv. ID č.ll
TGTAAAACGA CGGCCAGCGT
sekvence č.12
(A) délka	21 párů bází
(B) typ	nukleová kyselina
(C) provazec	jednoduchý
(D) topologie	lineární
Sekvenční deskripce, sekv ID	' č.12
TGTAAAACGA CGGCCAGCGT A
sekvence č.13
(A) délka	22 pásů bází
(B) typ	nukleová kyselina
(C) provazec	jednoduchý
(D) topologie	lineární

-163Sekvenční deskripce, sekv. ID č.13 TGTAAAACGA CGGCCAGCGT AC

sekvence o. 14
(A) délka	23 párů bází
(B) typ	nukleová kyselina
(C) provazec	jednoduchý
(D) topologie	lineární
Sekvenční deskripce, sekv. ID	č.14
TGTAAAACGGCCACGT ACC
sekvence č.15
(A) délka	18 párů bází
(B) typ	nukleová kyselina
(C) provazec	jednoduchý
(D) topologie	lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.15 TCGAGGTCGA CGGTATCG sekvence č.l6 (A) délka 18 páeů bází (B) typ nukleová kyselina (C) provazec: jednoduchý (D) topologie lineární

Sekvenční deskripce, sekv. ID č.l6 GCCGCTCTAG AACTAGTG

MeO

-164Vyobrazení I

stupen A

-·

stupen B piperidin stupen C FMOC—NH COOH

stupen D piperidin

-165pokr. Vyobr.1

stupen D piperidin rozdělit do 16 reaktorů

stupeň F, zředit kys.trifluoroctovou

1-16 ''

NH

stupen G, pentafluoresteř

MeO

-166Vyobrazení 2

stupen A allylbroniá, DIEA X = H - ·> allyl

stupeň B

PM0C-NH\^C00H

II

o li

FMOC-NH_X/

Á

stupen E piperidin

VI

' · · • · • · · · • · · · · • · · · · 4 • · · · 4 ····· ·· ··

-167R.

pokr .Vyobr .2

stupen B

V'\/. rozdělit do 16 reaktorů stupen F VII-^.^g-COOH

H o

stupen G zředena kys.trifluor octová

IX,

COOH stupeň H pentafluorester kys, trifluoroctové

1-16

R

^Xl-16 • · • ·

-168Emo c-NH;

Vyobrazení 3

HOr

NovaSyn HMP prysk. KATU, NMM stupen A

HO·

EmocNH

stupen B piperidin

O /°2 v

/ stupen C _— \ Fmoc-Lys(Aloc)-OH ^°2

HATU Mí

III

Emo ciíH it

O

Aloe stuneň D β_θ6Η₅)₃Ρ]₄Μ(^{ο) c}6^H5^SiH3

HOr

EmocHN

stupen E kys.N=methylisonipekotová HATU, NMM

-169-

stupeň G, piperidin

-170pokr. Vyobr.3 stupen G

^VIIIl-36

Stupen I FTA Á 1^0 :

DCIví 90 : 5 : 5 ·· · · ·· ·· • · ···· ·· • · · · · · · pokr.Vyobr.3

-171ψβ tupen I

iAí 1' o

o

^Ll-36

IX

1-36 stupen J tetrafluorfenylester kyseliny trifluoroctové, pyridin, dimethylformamid

1-36

X.

Vyobrazení 4

stupeň C

Pmoc-Lys-(Aloc)-OH

HATU, M

• ·

-172stupen A

......... ...... >...........

HO^jg)

UovaSyn HMP pryskyřice HATU, M

• ·

W\ stupeň F, rozdělit do 36 reaktorků ··

-173 i ·’

Λ Λ. Λ Λ Λ pokr.Vyobr.4

stupen G, piperidin

1-36

pokr.Vyobr .4

-174······ • · 4 » · ·· ·· · · • · 4 ·· ·· v* stupen H X36-COOH, HATU, Nffl

itupeň I TFA : H₂0 : DCM 90 V 5 : 5

IX

1-36

stupen J tetrafluorester kys.trifluoroctové pyridin, dimethylformamid • · • ·

-175pokr .Vyobr. 4 stupen J ξ /

IX

1-36

-176-

piPSRIQITÍ stupen 3

stupen D piperidin

v

VI

pokr.Vyobr.5 VI v

tupen F rozdělit do 36 reektorků

AlocHN [(c₆H₅)₃pj₄ía(0)

CgHjSiK,

• · ·· ··

-178Vyobrazení 6

... stupen A_ ' hcA© ⁼

Nova Syn-HMP pryskyřice NATU, líffl

stupeň CL

Pmo c-G-lu( OA i) -OH HA TU NMM

PmocHM

).

OAi

IV stupen D

L<°6^H5>3^p1^W <°>

lí-methylanilin

PmocHN

stupen B

2-(diisopropylamino) ethalamin HATU, Kíffi

FmocHN

stupen P

·· ·· ·· ·· ·· β · · · · · · · · · a a ··· · a · ·

-179pokr. Vyobr. 6 k stupeň F rozdělit do 36 reaktorků

Fmo cHH

v stupen G piperidin

stupen H ^r1-36^COOH HATU, NMM

NO^

CH lií o

TFA : x 'CM

1-36

IX

1-36

H

Mí

V III

1-36 v

stupen J

BocHN

-180Vyobrazení 7 stupeň A pipěr

FmocHH

Pmoc-Lys(Boc)-SRAM pryskyřice

BocH

uh₂

IV

Fmo c-Lys(Aloe)-OH

HATU, NMM

FmocHN

BocHKs^^x

4/

stupen B

C^H^SiH^

NHAloc

V ·· ·· ·· ·· · · • · ···· · · · · • · · · · · ··· • « · · · · · · · · · · • · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ··

FmocHN-

N

II I H .

II v

stupen B

HATU, ffiM

4/

BocHH $ y stupeň 0 piperidin

III

BocHlD /

V°6^H5⁾3^P1^{M í0)}'

FmocHN

VI stupen F kys.N-methylisonipekotova

HATU, NMM

-181VI pokr.Vyobr.7 ψ stupen F

• · '· -182Vyobrazení 8

NO.

Fmoc

stupen A

HO

NovaSyn HMP pryskyřice HATU NMM

NO.

Fmoc

Fmo cHN

stupen C

Fmo c-Ly s(aloc)-OH NATU NMM 4¾

NHAloc

IV

H₂H stupen D

LUéWV'^{3 <0)} c₆h₅síh₃ stupeň B \|/piperidini

III

0'

Fmo cHN

stupen E

N-me t hy1i so rďpekotová kyselina

HATU NMM \ NH_n

V

Fmo. cHN

upen F piperidin

HgN

VII

• ·

-183pokr.Vyobr. 8

VII stupen G

Pmo c-Ly s(T fa)-ÓH NA TU NMM

V

s) rozdělit do 36 reservoárků b) piperidin

NHTfa VIII

I '6 °^’^H

HN

STUPEN I

HATU ffl

V36-GOOH

J^Hg

IX,

1-36

NHTfa

V*

0.x. ΝΉ JJ

Aě q.

stupen J TPA:H_9n:DCM 90:5:5

Ύ-36 ^XI1_36

TTfa

X

1-36

1-36

stupen K tetrafluorester kyseliny trifluoroctové pyridi^n, dimethylformamid ··

-184-

• 4

-18544 ·· • · · · · ··

4 4 4

4 4 4

44 • 4 4 • 4 4

báze stupen A 100 mM boritan sodný pH 8,3

1igonukleotid£

5’-aminohexyl-znače né oligonukleotidy * ^1-36

t

WO 97/27325

186- “pCT/ŮŠ97/b*1046 r-í

H

Μ H C

	•H
	4-=
	03
	O
	c
	+3
X3	<~ť		CN
O	A
ffi	O		ÍN
°P	ε
Pí		CN
N	'©		CN
		ι-Ί	-
Ή C	o 03	O
>o	ř.	CN
A	ř>
©
	•H
<H	ε
CL·'	r~'
R	©
	>
O
O
O	©
	03
o	CCí
r-5	r-í

CM n

CM

-2>

r-i ® fl

-Q ·.

O

Fgj A > © f4 O . N (—I

M

P )©

-σ ©

>ÍH to

130 150 Π0 190 210 230 •K u

CD o

rs o o o

WO 97/27325

187 ·· ·· ·· ··

·· · ·· · · · ···>··· ·· ·· · ·

PCTZUS97/01046

Vyobrazení 12

Vzorek σ obsahem pouze ς^-kyan-matrice

WO 97/27325 /4^<Í89Vyobrazení 13 ·· · · • 9 · ··« · ©· ·· k 9 9 9 » · ·· » · · · · ► · · · ·* ·· ·· . ··

I * · « ► · ·· • 9 9 9 4 © © 4 ·· ··

PCT/US97/01046

Složka s ^uP^rava v . rozsahu proměnlivou _hmotDt hmotnost

Fotoodšt. vazebná • složky oligonukleotid s 5 -eminohe· xylovým zakončením

Rvv

N—(C₂— C_l0)— ODN— 3—OH podpora citlivosti hmotn.

spektroskop.

Claims (42)

1· Způsob stanovování sekvence molekuly nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (a) přípravu fragmentů značenýchnukleových kyselin, které jsou komplementární ke zvolené molekule nukleové kyseliny přičemž značená složka je korelativní s příslušným nukleotidem a zjistitelná nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky, (b) dělí se značené fragmenty dle sekvenční délky, (c) odštěpí se značené složky ze značených fragmentů, a (d) zjistí se značené složky nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometričky a odtud se stanoví sekvence molekuly nukleové kyseliny·

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se zjištění značených složek provádí hmotnostní, infračervenou nebo ultrafialovou spektrometrií nebo potenciostatickou amperometrií.

3. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se značené fragmenty dělí ve stupni (b) způsobem, zvoleným z gelové elektroforezy, kapilární elektroforezy, mikrokanálkové elektroforezy nebo vysokotlaková kapalinové chromatografie.

4. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se značené fragmenty odštěpí ve stupni (c) postupem, zvoleným z oxidace, redukce, lability v kyselém nebo alkalickém přostředí, enzymově, elektrochemicky, tepelně, thiolovou = .. výměnou,a fotolabilnímipostupy. ______ _ _ _ ____________

5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se značené složky zjištují průletovou hmotnostní spektrometrií, quadrupolní hmotnostní spektrometrií, magnetickou nebo elektrickou sektorovou hmotnostní spektrometrií.

6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se • · • ·

-191značené složky zjišžují coulometrickými nebo amperometrickými detektory.

7· Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se značený fragment nukleové kyseliny generuje ve stupni (a) z 5'-koncovky na 3'-koncovku.

8. Způsob,podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se ve stupni (a) generuje více než 4 značené fragmenty nukleové kyseliny a každá znašená složka je jednoznačná pro fragment nukleové kyseliny.

9. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se stupně (b), (c) a (d) provádějí kontinuálním postupem.

10. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyzačující se tím, že se stupně (b), (c) a (d) provádějí kontinuálním způsobem v jediném zařízení.

11· Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jeden nebo více stupnu se provádí automatizovaným postupem.

12. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se značené fragmenty generují z oligonukleotidových primérů, které jsou spojeny se značenou složkou v jakémkoli jiném postavení, než je 3 *-koncovka priméru.

13. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se značené fragmenty generují ze značených didesoxynukeltidových terminátorů.

14. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že nejméně jeden značený fragment nukleové kyseliny je sloučeninou podle kteréhokoli z nároků 16 až 34.

15. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1, 3-4 a 7-14, vyznaceujísí se tím, že se detekce značených složek provádí nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky.

16. Sloučenina vzorce T -L-X, kde

T^ms znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně další atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod • ·

ZfL-194· • · · · · · · · · · • · · · · · · · · • ♦ · rf· ·· ·· · · · • ···· ··· • ••β ·· ·· ·· ··

L znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T¹“⁸ odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže Τ⁰¹⁸ zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina Sledována hmotnostní spektrometrií, a je zvolena ze skupiny terč.-sminů, kvart.amoniových zbytků a organických kyselin,

X znamená funkční skupinu, jako je hydroxylová, aminoskupina, thiolová, karboxylová, halogenalkylová a jejich deriváty, které buď aktivují nebo inhibují účinnost skupiny při spojování s dalšími částicemi, nebo je tó fragment nukleové kyseliny, nevázáný na L jakkoli jinak, než 3'-koncovkou fragmentu nukleové kyseliny to za omezení, že sloučenina není vázána na pevný podklad prostřednictvím X, aniž má hmotnost pod 250 daltonů.

J7, Sloučenina podle nároku l6, kde T¹¹¹⁸ má hmotnost od 15 do 10 000 daltonů a molekulární vzorec ^C1-500^K0-100°0-100^S0-10o7-10^H^^P^¹ ύ’ ^{kde sou}°^et ř^a 3® dostačující k uspokojení všech jinak nenasycených valencí na atomech uhlíku, dusíku, kyslíku, fosforu a síry.

18. Sloučenina podle nároku 1$, kde skupiny T^ms a L jsou spolu vázány funkční skupinou, zvolebou ze skupiny amidové, esterové, etherové, aminové, sulfidické, thioesterové, disulfidické, thioetherové, močoviny, thiomočoviny, karbamátové, thiokarbamátové, Schiff-ovy báze, redukované Schiff-ovy báze, iminu, oximu, hydrazonu, fosfátu, fosfonátu, fosforamidu, fosfonamidu, sulfonátu, sulfonamidu nebo vazby uhlíku na uhlík.

-19. Sloučenina podle nároku 1^θν kde funkční skupina je zvolena z amidové, esterové, aminové skupiny, močoviny nebo karbamátu. = ?20. Sloučenina podle nárokulú-, kde L je zvolena ze skupiny, kterou tvoří L^hv, L^⁸, ^^ζζβ,1^(θ’, 1^(R), L^ens, L^a L^ss, kde aktinické záření, kyseliny, báze, oxidace, redukce, enzymy, elektrochemická, tepelná a thiolová výměna v tom kterém případě způsobují části, obsahující T možnost odštěpit se od zbytku molekuly.

-19521. Sloučenina podle nároku kde L^hv má vzorec lA-L²-L , kde L² je molekulární fragment absorbující aktinické záření, což podporuje odStěpení i” od Σ a l¹ i X, znamenají nezávisle přímou vazbu nebo organickou eásfc, kde L odděluje L² od T^ms a odděluje L² od X s tím, * že ani ^ed na ze skupin ΐΛ _nepodlehne vazebnému štěpení, pokud L absorbuje aktinické záření.

2 3,

22.. Sloučenina podle nárokuji , kde L -L ma vzorec kde jeden z uhlíkových atomů v postaveních a, b, c nebo d či e je substituován skupinou -L -X a případně jedna či více z poloh b, c, d nebo e je substituována alkylem, alkoxyskupinou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxylovou nebo amidovou, R^ znamená vodík nebo hydrokarbylový zbytek.

23. Sloučenina podle nároku 22, kde -L-X je umístěna v poloze 4.

3 ”

24. Sloučenina podle nároku 21 kde L znamená přímou vazbu, skupinu hydrokarbylenovou, O-hydrokar by lenovou, nebo hydrokarbylen-^-hydrokarbylenovou)_Q, dále vodík a n je celé kladné číslo od nuly do deseti.

25·* Sloučenina podle nároku 16, kde -L-X má vzorec • 9 kde jedna či více poloh b, c, d nebo e je substituována vodíkem, skupinou alkyiovou či alkoxylovou, fluorem, Chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxylovou nebo amidovou, a R¹ znamená vodík nebo hydrokarbylovou skupinu.

26v Sloučenina podle nároku^, kde T^ms má vzorec T²-(J-T³-) kde znamená organickou Částici, vytvořenou uhlíkem a jedním či více atomů vodíku, fluoru, jodu, kyslíku, dusíku, síry, a fosforu, mající hmotnost 15 až 500 daltonů, pak znamená organickou částici, vytvořenou uhlíkem a jedním či více atomů vodíku, fluoru, jodu, kyslíku, dusíku, síry a fosforu s hmotností 50 až 1000 daltonů

J znamená přímou vazbu, nebo funkční skupinu, jako je amidová, esterová, aminová, sulfidická, etherová, thioesterová, disulfidická, thioetherová, močovina, thiomočovina, karbamátová či thiokarbamátová skupina, Schiff-ova báze, redukovaná Schiffova báze, imin, oxim, hydrazon, fosfát, fosfonát, fosforamid, fosfonamid, sulfonát, sulfonamid nebo vazba uhlíku na uhlík a n je celé kladné číslo od 1 do 50 a pokud n je větší než 1, každá ze skupin T a J se volí vzájemně nezávisle.

27 Sloučenina podle nároku kde T² znamená skupinu hydrokarbylovou, hydrokarbyl-O-hydrokarbylenovou, hydrokarby1-S-hydrokarbylenovou, hy drokarby1—NH-hydrokarbylenovou, hydrokarby1-amido-hydrokarbylenovou, N-(hydrokarbyl)-hydrokarbylenovou, N,N-di(hydrokarbyl)-hydrokarbylenovou, hydrokarbylacylhydrokarbylenovou, heterocyklyl-hydrokarbylenovou, kde heteroatom či heteroatomy jsou zvoleny z atomů kyslíku, dusíku, síry a fosforu, substituovanou heterocyklyl-hydrokarbylovou, kde heteroatom či heteroatomy jsou zvoleny ze skupiny kyslík,dusík, síra a fosfor, a substituenty mohou být skupiny hydrokarbylové, hydrokarbylO-hydrokarbylenové, hydrokarbyl-NH-hydrokarbylenové, hydrokarbyl-S-hydrokarbylenovou, N-(hydrokarbyl)-hydrokarbylenové, N,N-di• · (hydrokarbyl)-hydrokarbylenové a hydrokarbylacyl-hydrokarbylenové jakož i deriváty kterékoli z předchozích skupin, kde je jeden vodík či více vodíků nahrazen stejným počtem atomů fluoru.

. Sloučenina podle nároku, kde má vzorec o

G(R )-, kde G znamená alkylenovou skupinu s jedním až šesti atomy uhlíku s jediným substituentem R s tím,; že/. R může znamenat skupinu alkylovou, alkenylovou, alkinylovou, cykloalkylovou, arylanelovanou cykloalkylovou, cykloalkenylovou, arylovou, aralkylovou, aryl-substituovanou alkenylovou či alkinylovou, cykloalkyl-substituovanou alkylovou, cykloalkenyl-substituovanou cykloalkylovou, biarylovou, alkoxylovou, alkenoxylovou, alkinoxylovou, aralkoxylovou, aryl-substituovanou alkenoxylovou či alkinoxylovou, alkylamino-, alkenylamino- nebo alkinylaminoskupinu, dále aryl-substituovanou alkylamino-, alkenylamino- Či alkinylaminoskupinu, aryloxylovou, arylaminoskupinu, N-alkylmočovinou substituovanou alkylovou skupinu, N-arylmočovinou substituovanou alkylovou skupinu, alkylkarbonylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, aminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu,skuoinu heterocyklylovou, heterocyklylsubstituovanou alkylovou skupinu či takže substituovanou aminoskupinu, karboxyalkylsubstituovanou aralkylovou skupinu, oxokarbocyklylanelovanou arylovou skupinu, skupinu heterocyklylaikylovou, cykloalkenylovou, arylsubstituovanou alkylovou a aralkylovou, hydroxysubstituovanou alkylovou, alkoxysubstituovanou alkylovou, aralkoxysubstituovanou alkylovou, alkoxysubstituovanou alkylovou, aralkoxysubstituováno alkylovou, aminosubstituovanou alkylovou, (arylsubstituovanou alkyloxykarbonylamino)-substituovanou alkylovou, thiolsubstituovanou alkylovou, alkylsulfonylsubstituovanou alkylovou, (hydroxysubstituovanou alkylthip)-substituovanou alkylovou, thioalkoxysubstituovanou alkylovou, hydrokarbylacylaminosubstituovanou alkylovou, heterocyklylacylaminosubstituovanou alkylovou, hydrokarbylsubstituovanou-heterocyklylacylamino-substituova nou alkylovou, alkylsulfonylaminosubstituovanou alkylovou, • ·

-198arylsulfonylaminosubstituovanou alkylovou, morfolinoalkylovou, thiomorfolinoalkylovou, morfolinokarbonylsubstituovanou alkylovou, thiomorfolinokarbonylsubstituovanou^ alkylovou, (n-(alkyl, alkenyl nebo alkinyl)^- či N,N-Qdialkyl, dialkenyl, dialkinyl nebo (alkyl, alkenyD-aminoj-karbonylsubstituovanou alkylovou, heterocyklylaminokarbonylovou, heterocyklylalkylenaminokarbonylovou, substituovanou alkylovou, N,N-(dialkyl)-alkylenaminokarbonylovou, N,N-(dialkyl)alkylenaminokarbonylsubstituovanou alkylovou, alkylsubstituo-r vanou heterocyklylkarbonylovou, alkylsubstituovanou heterocy kly lkar bony laiky lovou, karboxysubstituovanou alkylovou, dialkylaminosubstituovanou acylaminoalkylovou a aminokyselinový postranní řetězec, zvolený z argininu, asparaginu, glutaminu, S-methylcysteinu, methioninu a odpovídajících sulfoxidů i sulfonň i odpovídajících jejich derivátů, glycinu, leucinu, isoleucinu, allo-isoleucinu, terc.-leucinu, norleucinu, fenylalaninu tyrosinu, tryptofanu, prolinu, alaninu, ornithinu, histidinu, glutaminu, valinu, threoninu, šeřinu, kyseliny asparagové, -kyanalaninu a allothreoninu, alynyl a heterocyklylkarbonyl, aminokarbony1, amido, mono- nebo dialkyl aminokarbony1, mono nebo diarylaminokarbonyl, alkylarylaminokarbonyl, diarylaminokarbonyl, mono- nebo diacylaminokarbonyl, aromaticky nebo alifaticky acylových či alkylových skupin, případně substituovaných takovými substituenty, jako jsou aminoskupiny, skupiny karboxylová, hydroxylová, merkaptomono- nebo dialkylaminoskupiny, mono- nebo diarylaminoskupiny, alkylarylaminoskupiny, diarylaminoskupiny, mono- nebo diacylaminoskupiny, skupiny alkoxylové, alkenoxylové, aryloxylové, thioalkoxyloví, thioalkenoxylové, thioalkinoxylové, thioaryloxylové a heterocyklylové·

29. Sloučenina podle nároku ^6 vzorce

-199T⁴

I amid kde G znamená skupinu (CHg)-^, kde vodíkový atom na jedné, ale pouze na jedné methylenové skupině každé skupiny G je nahrazen skupinou -(CíL^-amid-T⁴, a T⁴ jsou organické částice vzorce ^i„25^NO-9^GO-9^S0-3 kde součet 4 ,(ř>a P dostačuje k uspokojení všech jinak nenasyce ných vazeb na atomecg uhlíku, dusíku, kyslíku, síry a fosforu, amid má vzorec -N-C- _nebo

R¹ £1

R¹ znamená vodík nebo alkylovou skupinu s jedním až šesti atomy uhlíku, c je celé kladné číslo od 0 do 4

Σ má významy, jak byly uvedeny v nároku 1, a n je celé kladné číslo od 1 do 50 a to tak, že je-li n větší než 1, pak významy G,c, amidu, R¹ a T⁴ se volí vzájemně nezávisle ·

I

30· Sloučenina podle nároku 29 vzorce kde Op znamená organickou částici vzorce 0_{η O}cN_{n Q}0_{n Q}S_{n Q} ^0-3¹¹^¹^¹^ ^kd® součet **,/°a 4 dostačuje k uspokojení všech jinak nenasycených valencí na atomech uhlíku, dusíku, • ff · · ff •ff ♦ · ·· • · ··· · · ff · »4 kyslíku, síry a fosforu a 3; znamená terč.- nebo kvart.-amin nebo organickou kyselinu, m pak je celé kladné číslo od 0 do

49.

»-v kde T znamená organickou částici vzorce ^Cl-25^NO-9°O-9^SO-3 ^P0-3“

H, ,fide součet dostačuje k uspokojení všech nenasycených valencí na atomech uhlíku, dusíku, kyslíku, síry a 5 fosforu a T zahrnuje terč.-aminy, nebo kvart.aminy nebo karboxylové kyseliny, m je celé kladné číslo v rozsahu 0-49.

32. Sloučenina podle nároku 39 nebo 31, kde skupina

-amid-T^ je zvolena z

-HNC0

-•®^-<OX⁰-⁽⁰2^C10⁾-^I'⁽⁰l-⁰10\ (Oi-c₁₀) /“Ά

-KH0-(C_o-0₁₀)

-^ΗΗΓ\)^Β-^(Ο1-°1Ο- ^a o \_/ o I-1

33«

Sloučenina podle kteréhokoli z nároků .39 a 31, kde skupina -amid-T^ je zvolena z

99 99

9 9 9 99 · · « • · · 99 99 ···9

9 9 9 9 9 · ·

.......

-⁰,^ra-<⁰i-⁰io·

O

-^H-(_Cl-C_l0)-N O „ _ \ •CNH -(C..-C- )-N tí 1 1θ^ζ \ o V θΐ”θ1ο N <Μΐθ’

ÍF -W-«W2 o

^(ci“^cio5

34 Sloučenina podle kteréhokoli z nároků?*?, až 3θ, kde T má strukturu, jež je výsledkem kondenzace aminoskupiny za vzniku T -C(=O)-N-(R')- s některou z dále uvedených organických kyselin: mravenčí, octová, propiolová, propionová, fluoroctová, 2-butinová, cyklopropankarboxylová, máselná, methoxyoctová , difluoroctové, 4-rpentinová, cyklobutankarboxylová, 3,3-dimethylakrylová, valerová, Ν,Ν-dimethylglycin, N-formyl-Gly-OH, ethoxyoctová, (methylthio)-octová, pyrrol-2-karboxylová, 3-furoová, isoxazol-5-karboxylová, trans-3-hexenová, trifluoroctohá, hexanová,.Ac-Gly-OH, 2-hydroxy-3-methylmáselná, benzoová, nikotinová, 2-pyrazinkarboxylová, 1-methyl-2-pyrrolkarboxylová, 2-cyklopentenl-octoiřá, cyklopentyloctová, (S)-(-)-2-pyrrolidon-5-karboxylová, N-methyl-L-prolin, heptanová, Ao-b-Ala-OH, 2-ethyl-2«hydroxymáselná, 2-(2-methoxyethoxy)-octová, p-toluová, 6-methylnikotinová,

5-methyl-2-pyrazinkarboxylová, 2,5-dimethylpyrrol-3-karboxylová,

-2024 4444

4-fluorhenzoová, 3,5-dimethylisoxazol-4-karboxylová, 3-cyklopě ntylpropio nová, oktanová, Ν,ΊΤ-dimethylsukcinamová, fenylpropiolová, skořicová, 4-ethylbenzoová, p-anisová, 1,2,5-trimethylpyrrol-3-karboxylová, 3»»fluor-4-methylbenzoová, Ac-DL-propargylglycin, 3-(trifluórmethyl)-máselná, 1-piperidinpropionová, N-acetylprolin, 3,5-difluorbenzoová, Ac-L-Val-OH, indol-2-karboxylová, 2-benzofursnkarboxylová, benzotriazol-5-karboxylová, 4-n-propylbenzoová, 3-dimethylaminobenzoová, 4-ethoxybenzoová, 4-(methylthio)-benzoová, Tfa-Gly-OH, 2-naftoová, chinaldová, Ac-L-Ile-OH, 3-methylinden-2-karboxylová, 2-chinoxalinkarboxylová, l-methylindol-2-karboxylová, 2,3,6-trifluorbenzoová, N-formyl-L-Met-OH, 2-^2-(2-methoxyethoxy)-ethoxy|-octová, 4-nbutylbenzoová, N-benzoylglycin, 5-fluorindol-2-karboxylová, 4-n-propoxybenzoová, 4-acety1-3,5-dimethy1-2-pyrrolkarboxylová,

3,5-dimethoxybenzoová, 2536-dimethoxynikotinová, cyklohexanpentanová, 2-naftyloctová, 4<-lH-pyrrol-l-yl) benzoová, indol-3propionová, m-trifluormethylbenzoová, 5-methoxyindol-2-karboxylová, 4-pentylbenzoová, Bz-b-Ala-OH, 4-diethylaminobenzoová, 4-n-butoxybenzoová, 3-methyl-5-trifluormethyl-3-isoxazol-4-karboxylová, (3,4-dimethoxyfenyl)-octová, 4-bifenylkarboxylová, pivaloyl-Pro-OH, oktanoyl-Gly-OH, 2-nafthoxyoctová, indol-3máselná, 4-(trifluormethyl)-fenyloetová, 5-methoxyindol-3-octová, 4-(trifluormethoxy)-benzoová, Ac-L-Phe-OH, 4-pentyloxybenzoová, Z-Gly-OH, 4-karboxy-N-(fur-2-ylmethyl)-pyrrolidin-2-on, 3,4-diethoxybenzoová, 2,4-dimethy1-5-ethoxykarbonyl-pyrrol-3-karboxylová, N-(2-fluorfenyl)-sukcinamová, 3,4,5-trimethoxybenzoová, N-fenylanthranilová, 3-fenoxybenzoová, nonanoyl-Gly-OH, 2-feaoxypyridin-3-karboxylová, 2,5-dimethyl-1-fenylpyrrol-3-karboxylová, trans-4-(trifluořmethyl)«rskořicová, (5-methyl-2-fényloxazol-4yl)-octová, 4-(2-cyklohexenyloxy)-benzoová, 5-methoxy-2-methylindol-3-octová, trans-4-kotininkrboxylová, Bz-5-aminovalerová, 4-hexyloxybenzoová, N-(3-methoxyfenyl)-sukcinamová, Z-Sar-OH,

4-(3,4-dime thoxyfe ny1)-máselná, A c-o-fluor-DL-Phe-OH, N- (4-fluorfenyl)-glutaramová, 4* -ethyl-4-bifenylkarboxylová, 1,2,3,4-tetrahydroakridinkarboxylová, 3-fenoxyfenyloctová, ΪΤ—(2,4-difluorfeny l)-sukcinamová, N-dekanoyl-Gly-OH, (+)-6-methoxy-a-methyl-2naftalenoctová, 3-(trifluormethoxy)-skořicová , N-formyl-DL-Trp-OH, (r)-(₊)-^-methoxy- g(.-( trifluormethyl)-fenyloctová, Bz-DL-Leu-OH, > ) Ί ' ·) · Ο ) J ) > » ) ·>

> ) ) ·»·»)·» ·» ·» » ο

1 Ο » Ό

Ί ο

3 1 ·> >

Ί ť>

» Ί

1 ·) > ’ ) 5) ι » ) » > >

Λ> ·> 1 > Ο ) ) »>

) > » ¹

-2034-(trifluormethoxy)-fenox octová, 4-heptyloxybenzoová, 2,3,4V* ·»'*- ' ' * trime thoxy skořicová, 2,6-dime thoxy benzoyl-Gly-OH/ 3-(3/4,5- ’ trime thoxyfe nyl)-propionová, 2,3,4,5,6-pe nt afluorfe noxyoctová, N-(2,4-dif luorf enyl)-glptaramová, N-undeka noyl-Gly-OH, ;2ý (4- - '.· fluorbe nzoyl)-benzoová, 5 -trif luorme thoxy indol-2-karboxylová,

N-(2,4-difluorfenyl)-diglykolárnová, Ac-L-Trp.OH, Tfa-L-fenyl\ . π r* · *· * Γ l“» 4 ? *“·.*· * -i^v' ’ glycin-OH, 3-jodbenzoová,, 3-(4n-pentylbenžoyl)-propionová,

2 -f e nyÍ-4-chi nolinkár boxylová, 4-oktylbe n zo o vá J B z-L-Me t-OH,

3,4,5-trimethoxýbenzoová, 'N-lauroyl-Gly-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-bénzoová, Ac-5-methyl-DL-Trp-OH, '2-jodfenyloctová, ^:

3-jod-4-methýlbenzoová/ 3-(4-n-hexylběnzoýl)-propionová, N-hexanoyl-L-Phe-OH, 4-nonyloxybenzoová, .4 f-(trifluormethyl)-2bifenylkarboxylová, Bz-L-Phe-OH, N-tridekanoyl-Gly-OH, 3,5-bis( tarif luorme thyX)-f eny loctová, 3-(4-n-heptylbenzoyl)-propionová,

N heptanoyl-L-Phe-OH, 4-decyloxybenzoová, N-íd^K^-trifluor-mtolyl)-anthranilová, niflumová, 4-(2-hydroxyhexafluorisopropyl)benzoová, N-myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-oktylbenzoyl)-propionová, N-oktanoyl-L-Phe-OH, 4-undecyloxybenzoová, 3-(3,4,5-trimethoxy, . _f t “ - t J _; , i , <

fenyl)-propionyl-Glý-OH/-8-jodnáftoová, N-pentadekanoýl-Gly-OH,

4-dódecyloxybenzoová, N-palmitoyl-Gly-OH a N-stearoyl-Gly-OH.

35. Kompozice, obsahující větší počet sloučenin podle kteréhokoli z nároků 16 až 34, kde nikoli dva sloučeniny mají buď tutéž skupinu Τ¹⁰³ nebo tutéž skupinu X (v

-» r'.

f /· ·· ·· ·· ► · · I > · ··

204

3’δ Kompozice pádle nároku 35 , kde větší počet znamená více než 2.

37 4, Kompozice podle nároku 35, kde větší počet zněměná více než 4.

38» Kompozice podle nároku 35, kde fragment nukleové kyseliny má sekvenci komplementární k části vektoru, kde je fragment schopný iniciovat nukleotidovou syntézu.

39 Kompozice podle nároku 35, kde skupiny T^mS různých členů většího množství se liší nejméně o 2 amu.

40 Kompozice podle nároku 35, kde skupiny T^ms různých členů většího množství se lisí nejméně o 4 amu.

41.

kteréhokoli

Kompozice, obsahující vodu a z nároků 16 až 34.

sloučeninu podle ,

42. Kompozice podle nárokuji, obsahující dále ještě puft o hodnotě pH od asi 5 do asi 9.

.-

43· Kompozice podle nároku 41, obsahující dále ještě enzym a jednu z látek čLATP, dGTP, dCTP a dTTP.

44· Kompozice podle nároku 41, obsahující dále ještě anzym a jednu z látek dčLATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP.

·· *· • · · · • · ··

-20545o Kompozice, obsahující větší počet sad sloučenin podle kteréhokoli z nároků 16 až 34, kde v téže sadě mají všechny členy stejnou skupinu T^ms a fragmenty nukleové kyseliny variabilních délek, zakončené týmž didesoxy nukeltidem, zvoleným z ddAMP, ddGMP, ddCMP a dd TMP, a kdeže uvnitř sady se skupiny T^ms liší nejméně o dva amu.

46. Kompozice podle nároku 45, kde větší počet znamená nejméně 3.

47· Kompozice podle nároku 45, kde větší počet znamená nejméně 5.

48. Kompozice, obsahující prvý větší počet sad sloučenin podle nároku 45 a druhý větší počet sloučenin podle kteréhokoli z nároků 16 až 34 kde všechny členy uvnitř druhého většího počtu mají sekvenci nukleové kyseliny, jež je zakončena týmž nukleotidem ze skupiny ddAMP, ddGMP, ddCMP a ddTMP, to z£ omezení, že didesoxy nukleotid, příroraný v prvých sloučeninách prvého většího množství není totožný s týmž didesaocynukleotidem, který je přítomný ve sloučeninách druhého většího množství.

49 Sestava (kit) pro sekvenční analýzu DNA, obsahující větší počet sad zásobníčků, kde každá sada obsahuje nejméně 5 zásobníčků, z nichž prvý obsahuje vektpr a druhý, třetí, čtvrtý a pátý obsahují sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 16 až 34, a fragment nukleové kyseliny ve druhém, třetím, čtvrtém a pátém zásobníčků je totožný a komplementární s částí vektoru uvnitř sady zásobníčků a skupina T¹³¹³ v každém ze zásobníčků se liší od dalších skupin T v sestavě.

50. Sestava (kit) podle nároku 49, kde větší počet znamená nejméně 3

51. Sestava (kit) podle nároku 49, kde větší počet znamená nejméně 5.

·· ·· • · · · • · ·· • · · · · • · · · • A · · ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · ·· ··

52. System vhodný k použití postupu podle nároku 1, obsahující dělící zařízení, jež dělí značené fragmenty nukleové kyseliny, zařízení, jež odštěpuje ze značených fragmentů nukleové kyseliny značenou složku, jež je korelativní s příslušným nukleotidem a zjistitelná elektrochemickou detekcí, jakož u zařízení pro potenciometriokou amperometrii.