JP2001523952A

JP2001523952A - アンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択するプロセス

Info

Publication number: JP2001523952A
Application number: JP53701798A
Authority: JP
Inventors: マイケルジェイ．レーン; アルバートエス．ビナイト; ブライアンデー．ファルダス
Original assignee: ティーエムテクノロジーズ，インク．
Priority date: 1997-02-24
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2001-11-27
Also published as: US6060248A; WO1998037242A1; AU6186398A; EP0975795A1

Abstract

(57)【要約】所望の自由エネルギ変異度を有する核酸配列上の部位を同定する方法を開示する。本方法は、例えば医療用のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択するなどにおいて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】アンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択するプロセス発明の分野本発明は、所定値の自由エネルギ変異度を有するヌクレオチド配列を選択するための手段に関する。本方法により、mRNAなどの核酸により提供されるものなど、一組の候補から、例えば薬物としての利用に向けてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択することが可能となる。発明の背景アンチセンス医療には、細胞内に位置する、典型的にはRNA分子である目的の核酸に結合する外生のオリゴヌクレオチドの投与が含まれる。アンチセンスという術語は、このオリゴヌクレオチドが、細胞産物をコードしているmRNA分子（「センス鎖」）に対して典型的には相補であるために与えられたものである。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを利用してmRNAの発現を阻害できること、ひいては生体内でのたんぱく質の発現を阻害できることは、よく文献化されている。しかしながら、ある所定のmRNAに対し、適切な相補の−オリゴヌクレオチド（又は複数のオリゴヌクレオチド）を選択することは、必ずしも容易ではない（例えば、ここに参考文献として編入することとするCrooke，S.T．FASEB J．7:533-539( 1993)を参照されたい）。アンチセンス剤は、一般には目的のRNA分子のすべてに継続的に結合することで、これらを不活化するか、又は内生のリボヌクレアーゼ H(RnaseH)活性の基質となるものでなければならない。本発明の方法により生成されるRNA/オリゴヌクレオチド複合体のRnaseH蒸解に対する感受性は、標準的方法(例えば、ここに参考文献として編入することとするDonia,B.P.,et al.,J.Bio l.Chem.268(19):14514-14522(1993);Kawasaki，A.M.，et al.，J.Med.Chem.6(7) :831-841(1993)を参照されたい)を用いて評価することができる。発明の概要従来の技術には、ある用途において、所定のmRNAに対してどの相補オリゴヌクレオチドが有用であるかを判断する効率的な手段を提供するものがない。より短い塩基（１５から２００）のアンチセンス分子が臨床用途には好適である。実際には、最小１５塩基のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが好ましい。本発明には、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、mRNAなど、ある核酸により提供される一組の候補から選択するための方法が含まれる。具体的には、本発明は、例えばアンチセンス・オリゴヌクレオチドを設計する際に、mRNA上で所望のレベルの自由エネルギ変異度を呈する所望の配列位置を決定するなどの手段を提供することにより、現在用いられている経験則を減ずるものである。ある態様では、本発明は、自由エネルギ変異度の高い核酸配列上の部位を同定する方法を特徴とする。これにより、例えばアンチセンスなどのオリゴヌクレオチドの結合にとって好ましい部位の決定が可能となる。当該方法には、以下のステップのうちのいくつか又はすべてが含まれる。すなわち、ヌクレオチド配列、例えば目的遺伝子のなかの配列、を提供するステップと、前記ヌクレオチド配列を、塩基対位置の関数の自由エネルギとみなすステップと、ある塩基対を中心としたＸウィンドウの自由エネルギを、前記ヌクレオチド配列のうちの複数の塩基対について、すべてのウィンドウ、又は、２とＹとの間の少なくとも複数のウィンドウ・サイズに関して計算するステップであって、ただしこのときＹは３と1,000との間、より好ましくは２と100との間の整数である、ステップと、各ウィンドウ・サイズについて、配列に沿った自由エネルギ分布を構築し、好ましくは（自由エネルギがウィンドウ・サイズに比例するという事実を考慮に入れるために）標準の大きさに対してこの分布を正規化するステップと（この計算の結果は図１に示されるように表にすることができる）、各塩基対位置のすべてのウィンドウについて中間の正規化自由エネルギ値を見つけるステップ（この結果は図２のように表にすることができる。これはまた「キャリヤ」（原語：carrier）も表す。）と、ある位置の中間値を減算し、各塩基位置の中間からの偏差を提供することで、高い変異度を示す配列を決定するステップと、である。この結果は図３に示すように表にすることができる（図２及び３の点「ａ」は高い変異度に相当する）。いくつかの実施例では、自由エネルギ値は、当該ヌクレオチド配列の少なくともＺパーセントの塩基における複数のウィンドウ・サイズについて計算されるが、ただしこのときＺは、当該ヌクレオチド配列の塩基対のうちの少なくとも５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０又は９０％である。別の実施例では、本発明は、ある核酸配列上の最適化なリガンド結合部位を同定する方法を提供するものである。本方法は、ある核酸配列を提供するステップと、この核酸配列の複数の塩基対のそれぞれにおける少なくとも二つのウィンドウ・サイズについて自由エネルギ値を計算するステップと、各塩基対における各ウィンドウ・サイズに関するこの自由エネルギ値を標準の大きさに正規化するステップと、ある塩基対における各正規化自由エネルギ値の、この塩基対における中間正規化自由エネルギ値からの偏差を計算するステップと、正規化自由エネルギ値から大きな偏差が計算される位置にある塩基対を、少なくとも一つのその他の塩基対から選択することで、この核酸配列上の最適なリガンド結合部位を同定するステップと、を含む。いくつかの実施例では、自由エネルギ値は、当該ヌクレオチド配列の少なくともＺパーセントの塩基における複数のウィンドウ・サイズについて計算され、ただしこのときＺは、当該ヌクレオチド配列の塩基対のうちの少なくとも５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０又は９０％である。いくつかの実施例では、自由エネルギ値は、複数の塩基対のそれぞれにおける少なくともＮ個のウィンドウ・サイズについて計算され、ただしこのときＮは少なくとも２，５，１０，１５，２０，３０，４０又は５０ウィンドウ・サイズである。別の態様では、本発明は、予め規定されたRNA配列内の好適なアンチセンス配列相補体を決定する方法を提供するものであり、これらは一般的には変異度の高い配列である。（ここで用いられる場合の高い変異度とは、例えばその配列中のその他の変異度に対して、など、相対的パラメータであってもよい。あるいは、予め規定された値に対するものでもよい。）別の態様では、本発明により、最適な二本鎖自由エネルギ又は変異度の、しかし候補領域内のアンチセンス候補部位での長さは可変の、数組の（例えば２，３，４又はそれ以上の組の）配列、例えばアンチセンス・オリゴヌクレオチドが提供される。別の態様では、本発明により、等エネルギの、又は等可変度のオリゴヌクレオチド、例えば、候補領域内の所定の長さのアンチセンス候補、が提供される。さらに別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド、（例えば２，３，４又はそれ以上の組の）オリゴヌクレオチド、候補領域内の、予め選択された融解温度、Tmの、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの設定に役立つものである。概略的には、当該方法により、所望の自由エネルギ変異度特性を備えた配列の同定、選択、及びマッチングが可能となる。本発明の方法は以下のうちのいずれにも利用が可能である。所定のアンチセンス標的内の最良のアンチセンス候補領域、又はサブ配列の決定。このような配列は、長さの増加分の関数である平均エネルギの幅広い変化を呈するものである。前もって同定された候補領域を含めた、１０から２００塩基長の最良のアンチセンス・オリゴヌクレオチド候補を得る上で、配列の組成と組み合わせて考えたときの、Ｔｍ、自由エネルギ及び長さなどの望ましい特徴の設計。様々なウィンドウ・サイズで（例えば増加させつつ）、配列組成の違いの明らかな配列組成を提供すること。本発明のいかなる方法にも、例えば合成（化学又は生化学法によるもの）、又は担体、例えば液体、例えば水を含む、反応混合液中に配することによる、ある配列を提供するステップを含めてもよい。図面の簡単な説明図１は、ウィンドウ・サイズと、例示したDNA配列上の位置との関数である正規化されたエネルギの図である。図２は、図１のデータを重ねた図である。図３は、例示したDNA配列上のエネルギ分布の変異度の図である。発明の詳細な説明本発明は、オリゴヌクレオチドの最良のハイブリダイゼーションが起きる、予め選択されたmRNA上の塩基位置を決定する方法を提供するものである。mRNAはmR NA前駆体（hnRNA）でもよく、従って転写されない領域がスプライシングされずに含まれていてもよく、そしてこのmRNA/mRNA前駆体には、様々な細胞内成分が結合することのできる多様な制御配列が含まれていることに留意されたい。例えば、1000個の塩基の目的mRNA分子上のアンチセンスをランダムにデザインしようとすると、所定の長さ、例えば30個の塩基のオリゴヌクレオチドを選び、 mRNAの位置１で始まり、このmRNAの位置１から３０までに相補の３０量体を合成し、その後、位置２で始まり、位置３１で終わる第二の３０量体を合成する。こうして合成プロセスを繰り返していき、最終的には[1000塩基mRNA-2(30塩基アンチセンス長)+2]=942個の３０塩基のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを作製することになる。同様に、もちろん１９量体を最適な長さとして選び、[1000塩基m RNA-2(19塩基アンチセンス長)+2]=964個の１９塩基のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを作製することがあるかも知れない。実際のところ、あるmRNAの最良のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを見いだそうと、mRNAの長さよりも短い長さのこのような相補オリゴヌクレオチドをすべて合成し、このそれぞれでたんぱく質合成を阻害しようと試みることもできるかも知れない。しかしながら、実際にはこの方法は膨大な作業であろう。明らかに、薬剤として大きな規模で利用するのに適した長さでありながら、生体内で活性を呈するようなアンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択するプロヤスは、目的のアンチセンス・オリゴヌクレオチドに狙わせるのに「最良の」mRNA配列を同定することにより、容易となるであろう。本方法を、一例としての目的核酸配列(LDH M72545、塩基位置は64-924:この配列はGENBANKから入手可能である)から採ったデータを参照しながら以下に解説する。ゲノムDNA上で比較的に「反応性の」部位を判定するための当該アルゴリズムは、その配列依存性の融解自由エネルギから見た二本鎖DNAの図を基にしている。これにより、DNA配列がエネルギ輪郭として提供されるが、この輪郭を正しく詳細に見ると、アンチセンス医療薬に狙わせるのに最適である特異部位を直接決定することができる。この方法には６つのステップがあるが、少なくとも一つのステップ（４）は選択に応じてとるステップであると考えられる。（１）DNA配列の自由エネルギ図：Ｎ個の塩基対(bp)から成るDNA配列については、各ｂｐｉには融解自由エネルギ値、ΔGi,を割り当てることができる。 ΔG_i=ΔG^H-B _i+(ΔG^S _i,i-1+ΔG^S _i,i+1)/2 ただしこのときΔＧ^H-B _i は、(A-T又はG-C型の塩基対に対し)典型的には二つの値しかとることができない水素結合間の自由エネルギであり、ΔGS_i,i-1+ΔG^S _i,i+1 は、bpとbpsi+1とi-1との間の積み重ね相互作用にとって最も近い配列依存性の積み重ね自由エネルギである。この等式を用いると、各bpに、一つの融解の自由エネルギを割り当てることができる。（２）自由エネルギウィンドウの構築：この方法では、２から２００塩基対を含むウィンドウを個々に調べる。各ウィンドウ・サイズに監視、塩基対１から始め、そのウィンドウ中の塩基対の付加自由エネルギを合計し、第一点として表にする。次にウィンドウを一塩基対分移動させ、新しい一つの塩基対を含むが前のウィンドウの一番目の塩基対の自由エネルギは含まず、その間に介在するすべての塩基対の自由エネルギを含む、新しいウィンドウの自由エネルギを決定する。このプロセスを、考察下にあるVNA配列の端に最後のウィンドウが到達するまで、続ける。各ウィンドウ・サイズを式で表すと、j=bpsで開始する10-42塩基対、=1 ,N-j+1では、各ウィンドウの自由エネルギは、 ΔG_j ^w=Σ_i=s,j+s-1(ΔG_i) で表される。このように、ΔG_j ^wの値を塩基対の位置に対して表にすると、この特定のウィンドウ・サイズ、ｊ、のためのエネルギ輪郭が生じる。ΔG_j ^wの大きさはｊの大きさと共に増加するために、異なるウィンドウ・サイズについて構築されたエネルギ輪郭の相対的特徴を直接比較することは難しい。（３）異なるウィンドウ・サイズで構築されたエネルギ輪郭の直接的比較：このような直接的比較を簡単に行なうために、異なる値のｊに関して決定されたΔ G_j ^wの値を、二つのウィンドウ・サイズｊの最大自由エネルギ差に対して正規化する。このように、各ウィンドウに関して正規化された自由エネルギは、 <ΔG_j ^w>=|(ΔG_j ^w-ΔG_j ^w(min))|/|(ΔG_j ^W(max)-ΔG_j ^w(min))| で表され、ただしこのときΔG_j ^w(max)及びΔG_j ^w(min)はサイズｊの配列上のすべてのウィンドウで観察された自由エネルギの最大最小である。こうして、異なるウィンドウ・サイズで構築された自由エネルギ輪郭は、０と１との間の値を持つ、塩基対位置に対する相対的自由エネルギの分布から成る。図１は、一例としてのDNA配列(LDH M72545，塩基位置は64-924から)上のウィンドウ・サイズ及び位置の関数として正規化されたエネルギの図である。ウウィンドウ・サイズは、各位置に対し１０から４２までの範囲で異なっており、各塩基対位置及びウィンドウ・サイズに関するエネルギ輪郭を表にした。（４）［選択的ステップ］異なるウィンドウ・サイズで構築された重複エネルギ輪郭：これらのエネルギ輪郭のより直接的な比較は、これらを、図２に示すように「オーバープロットする」例えば一つのデータ群を別のものの上に作図する）ことである。融解安定性の分布の特徴が明白であり、調べた範囲にわたって、ごくわずかにウィンドウ・サイズに依存しているようである。大きさの最も低い領域は安定性が最も小さく、大きさが最も高い領域は最も安定である。同じ一般的特徴が図２に示された分布関数のすべてで観察されるが、分布の「平均的」形状に見えるものについては小さな偏差（１０から２０％の桁）がある。これらの分布から、DNA安定性には、水素結合と、最も近いものの積み重ねとが貢献していることが直接読み取れる。分布のこの顕著な特徴は、一般には、配列中のA-T 又はG-C型の塩基対の量によって決定される。例えば、図２の重ね書きした表のピークは、相対的にG-Cのパーセンテージの高い領域を表すものである。「底」については逆のことが言え、この領域ではA-T型塩基対のパーセンテージが大きいことを表す。底に対してピークのエネルギが相対的に高いため、ウィンドウ・サイズの効果はこのピークでより顕著である。（５）ウィンドウ・サイズ平均からの偏差から標的可能な領域が明らかになる：図２に見られる異なるウィンドウ・サイズに関する分布の平均的傾向からの重なった「ノイズ」又は偏差は、DNA安定性に対する、最も近いものの積み重ねの影響の証拠である。分離できるのはこのノイズ・パターンである。分布関数のこの成分をより良く調べるために、各ウィンドウ・サイズに関して決定された、すべての正規化エネルギに渡る平均を各塩基対位置、ｓについて決定した。つまり、 <ΔG^w>_ave(s)=Σ_j＜ΔG_j ^w>(s)/4N_w であるが、ただしこのときNwはウィンドウ・サイズの数である。そこで、 δ<ΔG^w>_ave(s)=<ΔG^w>_ave(s)-<ΔG_j ^w>(s) を差として決定し、図３に示すように各ウィンドウ・サイズについて配列位置に対する表にした。その結果、「ノイズ」パターンの最大値は、塩基対位置上の０を中心とした-0.20と+0.20との間にあった。注目すべきことに、予め選択されたノイズ基準よりも範囲の大きないくつかの領域が、このパターンから現れた。これらの領域は図３に明確に見られ（例えば図３の「Ａ」と付けた点は変異度が大きい）、ウィンドウ・サイズを変化させたとき、そしてその値を上述したように全配列について基準化した後では、配列依存の安定性に最も高い変異度が見られる。これらは、配列特異的アンチセンス医療にとって好ましい標的である。（６）配列の選択： δ<ΔG^w)_ave(s)vss(δ<ΔG^w>_ave(s))の表に見られる「変異度最大点」から両側に向かって100個の、200塩基の配列（その他の長さ、例えば150,100,又は50塩基を用いてもよい）を、mRNA配列から明らかにして、さらなる調査をこれに行なった。これらの200量体をそのままアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして用いてもよいかも知れないが、この選択された200量体のサブ配列である、例えば約50,40,30,又はそれより少ない塩基を含む、より小さなオリゴマを用いる方がより好ましい。この200量体中の最適なアンチセンス候補オリゴマは、比較的に不安定な領域を両側に持つ、２から１０個の塩基から成るより安定な領域を含んでいることであろう。用途によっては、すべて、予め規定された最適二本鎖自由エネルギを持つが、可変の長さの異なるような数組のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択することが好ましい場合もある。これは、200塩基対領域のエネルギ分布をスキャンし、計算された安定性の自由エネルギが同じである１５から３０塩基対長の様々なものを決定することで行われる。別の用途では、ある所定の長さの等エネルギアンチセンス候補を数組、選択することが好ましいかも知れない。これは、200塩基対領域のエネルギ分布をスキャンし、計算された自由エネルギが同じである所定長さの様々なものを決定することで行われる。別の用途では、予め選択された融解温度T_mのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを選択することが好ましいかも知れない。これは、公式 T_m=(ΔH_D+ΔH_nue)/)ΔS_D+ΔS_nue+ln(αC_T) を用いて行われるが、ただしこのときΔH_D及びΔS_Dは、特定の配列について計算される融解エンタルピ及びエントロピである。核生成のエントロピはΔS_nueであり、我々の等式作製の上での特定の種類の標的のための定数とみなされている。つまり、これはオリゴマの長さに依存しないのである。対照的に、二本鎖核生成のエンタルピΔH_nueは本来、基本的に静電的であり、従って配列の長さ、G-Cのパーセンテージ、及び塩濃度に依存する。合計の鎖濃度はC_Tであり、αはそのオリゴマに関連した配列縮退を適切に反映する因子である。全体的には、選択されるオリゴマの安定性は従って、G-Cのパーセンテージ及び長さの変更で調節することができる。以上、本発明をアンチセンス・オリゴヌクレオチドの設計にとって適した標的である配列の選択に関して解説してきたが、ここで説かれた方法を用いれば、核酸に結合させることのできるその他のリガンドとの相互作用を行なわせるのに適した核酸配列の（コドンDNA又は非コドンDNAあるいはRNAを含む、しかしこれらに限らず）領域を同定することができることは理解されよう。このようなその他のリガンドには、以下のうちの一つ又はそれ以上が含まれる。配列特異的態様で核酸に結合する化合物（例えば、配列特異的切断酵素、例えばEcoRI,HaeIII,BamHI及びBgllを含む制限エンドヌクレアーゼ、又は酵素あるいは特異配列に結合するその他の分子、例えば、核酸のコードする産物の発現を調節する分子など）又は配列非特異的態様で核酸に結合する化合物（例えば、DNaseI又はミクロコッカーレス・エンドヌクレアーゼ）、たんばく質、酵素や、例えば同じ鎖の一原子、相補配列の一原子、又は別の分子の一原子など、核酸のある原子と別の原子の間の共有結合又は非共有結合、例えば水素結合を破壊又は形成することなどにより、それが結合した核酸の構造を変化させる酵素又はその他の分子（それらの作動物質又は拮抗物質）、核酸の一方又は両方の鎖を切断する酵素及びその作用物質又は拮抗物質、核酸をメチル化又はアルキル化する酵素及びそれらの作用物質又は拮抗物質、例えば二本鎖のプライマを必要とするポリメラーゼなど、核酸の合成を促進又は触媒する酵素及びそれらの作用物質又は拮抗物質、DNAポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼＩ又はTaqポリメラーゼ及びそれらの作用物質又は拮抗物質、核酸の一次又は二次構造を変化させる酵素、例えばトポイソメラーゼ、又は組換え又は複製に関連する酵素及びそれらの作用物質又は拮抗物質、DNA結合リガンド及びそれらの作用物質又は拮抗物質、突然変異誘起物質、遺伝子発現を向上させる化合物及びそれらの作用物質又は拮抗物質、二本鎖核酸に挿入される化合物及びそれらの作用物質又は拮抗物質、第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸を含む反応混合液に接触させたときに少なくともｎ倍、二本鎖形成速度を加速させる化合物であって、このときのｎが２以上1,000以下の整数である、化合物、二本鎖形成の自由エネルギをｎ倍減少させる化合物であって、このときのｎが１以上1,000以下の整数である、化合物、小型分子、例えば何らかの金属有機化合物、何らかの複素環式化合物、又は核酸に結合する何らかのたんぱく質、細胞核中でのDNAの構造オルガニゼーション又はヒストン及びヌクレオソームを含むD NAのパッケージングに関連するたんぱく質又はその他の分子、核酸結合性の突然変異誘発物質又は発癌物質又はそれらの作用物質あるいは拮抗物質、ウィルスたんばく及びそれらの作用物質又は拮抗物質。このように、本発明の方法は幅広い用途を有するものである。当業者であれば、ごく通常の実験を行なうのみで、ここに説明された特定の手法の等価物を数多く認識され、また確認できることであろう。このような等価物は本発明の範囲内にあると見なされ、また以下の請求の範囲の包含するところである。ここで引用された文献及び特許出願の内容はすべて、参考文献としてここに編入されたものである。その他の実施例は以下の請求の範囲に包含される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月１４日（１９９８．１２．１４）【補正内容】請求の範囲（翻訳文）１．所望の自由エネルギ変異度を有する核酸配列上の部位を同定する方法であって、長さＺのヌクレオチド配列を提供するステップと、ある塩基対を中心とした複数のウィンドウの自由エネルギを、前記ヌクレオチド配列のうちの複数の塩基対について計算するステップであって、ウィンドウ・サイズの数は２とＹとの間であり、Ｙは３と１００との間の整数である、ステップと、各ウィンドウ・サイズについて、配列に沿った自由エネルギ分布を構築し、標準の大きさに対して前記分布を正規化するステップと、各塩基対位置のすべてのウィンドウについて中間正規化自由エネルギ値を決定するステップと、ある一つの位置に関する前記中間値を減算し、各塩基位置の中間値からの偏差を提供して、前記所望の自由エネルギ変異度を有する部位を決定することにより、前記所望の自由エネルギ変異度を有する前記核酸配列上の複数の前記部位を同定する、ステップとを含む、方法。２．前記複数の塩基対が、前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも５０％の塩基対を含む、請求項１に記載の方法。３．ある核酸配列上の最適なリガンド結合部位を同定する方法であって、ある核酸配列を提供するステップと、前記核酸配列の複数の塩基対のそれぞれにおける少なくとも二つのウィンドウ・サイズについて自由エネルギ値を計算するステップと、各塩基対における各ウィンドウ・サイズに関する前記自由エネルギ値を標準の大きさに正規化するステップと、ある塩基対における各正規化自由エネルギ値の、前記塩基対における中間正規化自由エネルギ値からの偏差を計算するステップと、正規化自由エネルギ値からの大きな偏差が計算される位置にある塩基対を、少なくとも一つのその他の塩基対から選択することで、前記核酸配列上の最適なリガンド結合部位を同定するステップとを含む、方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ファルダスブライアンデー. アメリカ合衆国 01754 マサチューセッツ州メイナード、ベルビューテラス４

Claims

【特許請求の範囲】１．所望の自由エネルギ変異度を有する核酸配列上の部位を同定する方法であって、長さＺのヌクレオチド配列を提供するステップと、ある塩基対を中心とした複数のウィンドウの自由エネルギを、前記ヌクレオチド配列のうちの複数の塩基対について計算するステップであって、ウィンドウ・サイズの数は２とＹとの間であり、Ｙは３と１００との間の整数である、ステップと、各ウィンドウ・サイズについて、配列に沿った自由エネルギ分布を構築し、標準の大きさに対して前記分布を正規化するステップと、各塩基対位置のすべてのウィンドウについて中間正規化自由エネルギ値を決定するステップと、ある一つの位置に関する前記中間値を減算し、各塩基位置の中間値からの偏差を提供して、所望の自由エネルギ変異度を有する部位を決定するステップとを含む、方法。２．前記複数の塩基対が、前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも５０％の塩基対を含む、請求項１に記載の方法。３．ある核酸配列上の最適なリガンド結合部位を同定する方法であって、ある核酸配列を提供するステップと、前記核酸配列の複数の塩基対のそれぞれにおける少なくとも二つのウィンドウ・サイズについて自由エネルギ値を計算するステップと、各塩基対における各ウィンドウ・サイズに関する前記自由エネルギ値を標準の大きさに正規化するステップと、ある塩基対における各正規化自由エネルギ値の、前記塩基対における中間正規化自由エネルギ値からの偏差を計算するステップと、正規化自由エネルギ値からの大きな偏差が計算される位置にある塩基対を、少なくとも一つのその他の塩基対から選択することで、前記核酸配列上の最適なリガンド結合部位を同定するステップとを含む、方法。