JP2001501449A

JP2001501449A - 核酸分子の配列を決定するための方法および組成物

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Publication number: JP2001501449A
Application number: JP09527085A
Authority: JP
Inventors: ネス，ジェフリーヴァン; シー．タボーン，ジョン; ハウバート，ジェイ．ジェフリー; ティー．ムリガン，ジョン
Original assignee: ラピジーン，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 2001-02-06
Also published as: WO1997027331A2; CZ218498A3; JP2008183012A; KR100482917B1; NZ331044A; CN1212021A; CA2243560A1; DE69739304D1; KR19990081925A; ATE191750T1; DE69701671D1; DE69701671T3; PT868535E; EP0868535B1; ES2144846T3; ATE425175T1; BR9707056B1; AU2247397A; HUP9901321A3; DE69701671T2

Abstract

(57)【要約】核酸分子の配列を決定するための方法および化合物（それからの組成物を含む）が提供される。本方法は、複数の核酸配列を同時に決定し得る。化合物はタグとして使用されてタグ化核酸フラグメントを生成する。これは、選択された標的核酸分子に相補的である。各タグは特定のヌクレオチドと相関し、そして好ましい実施態様において、質量分析により検出可能である。タグ化フラグメントの長さによる分離の後、タグはタグ化フラグメントから切断される。好ましい実施態様において、タグは質量分析により検出され、そして核酸分予の配列はそれから決定される。本方法の個々の工程は、例えばシステムに組み込むことにより、自動化された様式で使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】核酸分子の配列を決定するための方法および組成物技術分野本発明は、一般に、核酸分子の配列を決定するための方法および組成物に関する。より詳細には、複数の核酸配列を同時に決定し得る方法および組成物に関する。発明の背景デオキシリボ核酸(DNA)配列決定は、生物学の基礎技術の１つである。それは分子生物学の中心であり、そして残りの生物学において急速に拡張する役割を果たす。ヒトゲノムプロジェクトは、全ヒト遺伝コードを読むための多国家の運動である。それはかつて生物学において行われた最大のプロジェクトであり、そして医学において重大な影響力を有し始めている。より安くそしてより早い配列決定技術の開発は、このプロジェクトの成功を保証する。実際、実質的な運動は、ヒトゲノムプロジェクトのNIHおよびDOE部門により資金援助されて配列決定技術が改良されている。しかし、現行法に実質的な影響はない（SulstonおよびWater ston，Nature 376:175，1995）。過去20年において、核酸配列の決定および分析は、生物学調査の基本要素の１つを形成した。これは、新しい研究道具および方法論に加えて、これら遺伝子の機能をより理解するために、ならびに新しい治療および診断を開発するために、科学者が遺伝子および遺伝子産物を研究することを可能にする。 1977年に開発された２つの異なるDNA配列決定方法論は、未だ現在広範に使用されている。簡潔には、ジデオキシターミネーターを利用するSangerにより記載（Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)74:5463，1977）された酵素法は、一本鎖テンプレートからのDNAポリメラーゼによるDNA鎖の合成を含む。サンガーの配列決定方法は、ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）が、通常のデオキシヌクレオチドと同様の様式で伸長する鎖中に組み込まれるという事実に依存する（より低い効率ではあるが）。しかし、ddNTPは、通常のデオキシヌクレオチド（dNTP）とは、それらが鎖伸長に必要な3'-OH基を欠いている点で異なる。ddNTPがDNA鎖中に組み込まれる場合、3'ヒドロキシ基の欠如は、新しいホスホジエステル結合の形成を妨げ、そしてDNAフラグメントがテンプレートDNAの塩基に相補的なddNTPで終結される。マキサムギルバート法（MaxamおよびGilbert，Proc．Natl．Acad．Sc i．(USA)74:560，1977）は、元のDNAの化学分解法を利用する（両方の場合において、DNAはクローニングされなければならない）。両方法は、特定の点から始まり、そして配列決定されるDNAフラグメントにおいて見出される各塩基で終結するフラグメントの集団を生成する。各フラグメントの終結は、元のDNAフラグメント内の特定の塩基の位置に依存する。DNAフラグメントはポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離され、そしてDNA塩基（アデニン、シトシン、チミン、グアニン；それぞれ、A、C、T、Gとしても知られる）の順序がゲルのオートラジオグラフから読まれる。扱いにくいDNAをプールする配列決定ストラテジー（ChurchおよびKieffer-Hig gins，Science，24:185，1988）が、DNA配列決定のより最近のアプローチの１つである。プールする配列決定ストラテジーは、多くのDNAテンプレートを（サンプル）をプールすることおよびプールとしてのサンプルを処理することからなる。処理の最後で配列情報を分けるために、目的のDNA分子は、セットのオリゴヌクレオチド「タグ」に最初に連結される。タグ化DNA分子は、96ウェルプレートにおいて、プールされ、増幅され、そして化学的に断片化される。プールされたサンプルの電気泳動後、DNAは固体支持体に移され、次いで一連の特定の標識されたオリゴヌクレオチドでハイブリダイズされる。次いで、これらの膜は、元のプール中に存在するタグと同じ数だけプローブされ、標準的なDNA配列決定法からのオートラジオグラフと同様のオートラジオグラフが各セットのプロービングにおいて生成する。従って、各反応およびゲルは、使用されるプローブの数だけ増加された通常の反応およびゲルから得られるデータと同じ量のデータを生じる。アルカリホスファターゼがレポーター酵素として使用される場合、1,2-ジオキセタン基質が使用され得る。これは化学ルミネセンスアッセイ形式で検出される。しかし、このプールするストラテジーの主な欠点は、配列が、配列決定ゲルをサザンブロットすることおよびこの膜をプール中の各クローンについて１回ハイブリダイズさせることによってのみ読まれ得ることである。配列決定方法論の進歩に加えて、速度の進歩が自動DNA配列決定装置の出現によりもたらされた。簡潔には、これらの方法は蛍光標識プライマーを使用する。これは放射性標識成分を利用する方法を置換する。蛍光色素は、配列決定プライマーまたはddNTP-ターミネーターのいずれかに結合される。現在自動化成分は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用する。これは線状増幅ストラテジーの開発をもたらした。現在の商業的な配列決定法はすべて、４ジデオキシ-ターミネーター反応物を１つのレーンにおいて泳動させ得る。各ジデオキシ-ターミネーター反応物は独特の蛍光プライマーで表される（各塩基タイプ（A、T、C、G）について１つの発蛍光団）。１つのみのテンプレートDNA（すなわち、DNAサンプル）が１レーンあたりに示される。現在のゲルは、64の異なるレーンにおいて64 サンプルまで同時に電気泳動し得る。異なるddNTP終結フラグメントは、光によるゲルレーンの照射、続く発蛍光団からの発光の検出により検出される。各電気泳動工程は約４〜６時間長である。各電気泳動分離は、約400〜600ヌクレオチド（nt）を決定し、それゆえ、約6000ntが１時間、１配列決定装置あたり配列決定され得る。核酸のモノマー組成の研究のための質量分析法の使用がまた記載されている（ Hignite，Biochemical Applications of Mass Spectrometry，WallerおよびDerm er(編)，Wiley-Interscience，第16章，527頁，1972）。簡潔には、より長いオリゴマーについて、有意に早い成功を、14塩基長までの保護合成オリゴヌクレオチドおよび４塩基長までの未保護オリゴのプラズマ脱着により得た。タンパク質について、ESI-MSのオリゴヌクレオチドへの適用性が示されている（Coveyら，R apid Comm．in Mass Spec．2:249-256，1988）。これらの種は、酸結合ホスホジエステル部分および／または末端リン酸部分に存在する電荷により溶液中でイオン化され、そしてナトリウム付加生成物に加えて、気相多価帯電分子アニオンを生じる。 100塩基未満のDNAを通常の酵素的ddNTP技術により配列決定することは、より長いDNAテンプレートについて行うことより複雑であるため、化学的分解がしばしば利用される。しかし、化学的分解法は、約50pmolの放射性³²P末端標識物質、６つの化学的工程、電気泳動分離、およびフィルムへの露光を必要とする。小さなオリゴヌクレオチド（<14nt）については、エレクトロスプレーイオン化(ES I)およびフーリエ変換(FT)質量分析法(MS)の組み合わせが、はるかに速くかつより感受性である。高解析能（10⁵）で測定される多価帯電イオンの解離産物は連続的な骨格開裂を表し、完全な配列を１分内にサブピコモル量のサンプルで提供する（Littleら、J．Am．Chem．Soc．116:4893，1994）。分子量測定について、 ESI/MSがより長いフラグメントまで拡大されている（Potierら、Nuc．Acids Res ．22:3895，1994）。ESI/FTMSは、従来の配列決定方法および100マー程度のヌクレオチドの点変異のための有用な補足物であるようである。最近、３×10^-13mol の50マーをローディングしたスペクトルデータが、より感受性のESI供給源を使用して得られている（Valaskovic，Anal．Chem．68:259，1995）。質量分析法によるDNA配列決定の他のアプローチは、DNAが個々のエレメントのアイソトープで標識され、そして質量分析が、様々なサイズのDNAの混合物が電気泳動により分離された後でアイソトープを区別さえすればよいものである。（上記の他のアプローチは、異なる長さのDNAオリゴヌクレオチドの分離および検出の両方を行う質量分析器の解析能を利用する。どうみても困難な提案である）。下記の手順の全ては、配列決定プライマーを１つのヌクレオチドで長さが変化する一連のDNAフラグメントに変換するためにサンガー手順を利用する。酵素的に合成したDNA分子のそれぞれは元のプライマー、目的のDNAの一部の複製された配列、およびジデオキシターミネーターを含む。すなわち、セットのDNA分子が生成される。これはプライマーを含み、そして互いに１つのヌクレオチド残基だけ長さが異なる。 Brennenら（Biol．Mass．Spec.，New York，Elsevier，219頁，1990）は、キャピラリー電気泳動により分離されたDNAフラグメントを検出可能にするDNA標識としての硫黄の４つの安定なアイソトープを使用する方法を記載した。ddNTPの αチオアナログを使用して、１つの硫黄アイソトープがDNAフラグメントのそれぞれに組み込まれる。それゆえ、４つのタイプのDNAフラグメント（ddTTP、ddAT P、ddGTP、ddCTP終結）のそれぞれは、末端ヌクレオチドにより独特に標識され得る；例えば、Aで終わるフラグメントについては³²S、Gについては³³S、Cについては³⁴S、およびTについては³⁶S、そして電気泳動カラムのために一緒に混合され、数ピコリットルの画分が改変インクジェットプリンターヘッドにより得られ、次いで、加熱炉における完全な燃焼に供される。このプロセスは、標識DNA のチオホスフェートをSO₂に酸化する。これは、四重極型または磁気セクター質量分析器における分析に供される。SO₂質量単位表示は、Aで終わるフラグメントについては64、Gについては65、Cについては66、およびTについては68である。カラムから現れるDNAフラグメントの解像度の維持は、十分に小さい画分を用いることに依存する。なぜなら質量分析器はキャピラリーゲルカラムに直接結合され、分析の速度は電気泳動の速度により決定されるからである。このプロセスは不幸にして高価であり、放射性ガスを遊離し、そして市販されていない。２つの他の基本的な制限もまた、このアプローチに影響を及ぼす：(a)質量64、65、66 、または68（同重量の夾雑物）を有する他の成分は許容され得ない、および(b) 硫黄アイソトープの天然％量（³²Sは95.0、³³Sは0.75、³⁴Sは4.2、および³⁶Sは0 .11）は、感受性および費用を支配する。³²Sは95％の天然量であるから、他のアイソトープは、夾雑する³²Sを排除するために、>99％まで濃縮されなければならない。<１％量であるアイソトープは、99％濃縮で得るために極めて高価である；たとえ³⁶Sを100倍精製したとしても、それは³⁶Sを含む程度以上に³⁴Sを含む。 Gilbertは、オリゴマー合成器、膜上のアレイ、ハイブリダイゼーションを検出する検出器、および中枢コンピューターを備える自動DNA配列決定装置（EPA,9 2108678.2）を記載した。この合成器は、任意の予想される配列の複数のオリゴマーを合成しそして標識する。オリゴマーが使用されて膜上の固定されたDNAをプローブする。検出器はハイブリダイゼーションパターンを同定し、次いでそのようなパターンを中枢コンピューターに送る。これは配列を構築し、次いでオリゴマーの合成の次のラウンドの配列を予測する。プロセスを反復することにより、DNA配列は自動様式で得られ得る。 Brennenはオリゴマーの連結に基づく核酸の配列決定法を記載した（米国特許第5,403,708号）。核酸テンプレートにハイブリダイズされる連結産物を形成するための方法および組成物が記載される。プライマーがDNAテンプレートにハイブリダイズされ、次いでランダム伸長オリゴヌクレオチドのプールがまた、リガーゼの存在下でプライムされたテンプレートにハイブリダイズされる。リガーゼ酵素は、ハイブリダイズしたオリゴマーをプライマーに共有結合的に連結する。改変により、Ｎヌクレオチドの間隔で区切られる、核酸テンプレート中の標的ヌクレオチド残基の第１のセットの１つ以上のメンバーのヌクレオチド配列が決定され得る。この方法において、標識された連結産物が形成される。ここで、連結産物中に組み込まれた標識の位置およびタイプが、標識ヌクレオチド残基が塩基対形成する、核酸テンプレート中のヌクレオチド残基に関する情報を提供する。 Kosterは、エキソヌクレアーゼによるDNAの分解後に質量分析によってDNAを配列決定する方法を記載した（PCT/US94/02938）。記載される方法は、DNA配列が直接決定される点で簡単であった（サンガー反応は使用されない）。DNAが標準的なベクターにクローニングされ、5'末端が固定され、次いで鎖が3'末端でエキソヌクレアーゼにより連続的に分解され、そして酵素産物（ヌクレオチド）が質量分析により検出される。 Weissらは、蛍光多重DNA配列決定のための自動ハイブリダイゼーション／映像装置を記載した（PCT/US94/11918）。方法は、酵素結合プローブを、代表的なサンガー反応から生じるサイズ分離したDNAフラグメントを含む膜にハイブリダイズさせる概念に基づく。配列決定情報の要求は、現存する配列決定機（例えば、ABI377およびPharmaci a ALF）により供給され得るものより大きい。現在の技術の主な制限のうちの１つは、現在のタグ化システムを使用して解決され得る少ない数のタグである。上記のChurchのプールシステムはより多くのタグを使用するが、これらのタグの使用および検出は労力がかかる。本発明は、上記の方法より速度および感受性が大いに増大した、核酸分子を配列決定するために利用し得る新規な組成物および方法を開示し、そして他の関連する利点を提供する。発明の要旨簡潔に述べれば、本発明は、核酸分子の配列を決定するための方法、化合物、組成物、キット、およびシステムを提供する。本発明の１つの局面において、核酸分子の配列を決定するための方法が提供される。本方法は、以下の工程を包含する：(a)選択された標的核酸分子に相補的なタグ化核酸フラグメントを生成する工程、ここで、タグは特定のヌクレオチドと相関し、そして非蛍光分光分析または電位差測定により検出可能である；(b)タグ化フラグメントを配列の長さにより分離する工程；(c)タグをタグ化フラグメントから切断する工程；および(d) 非蛍光分光分析または電位差測定によりタグを検出し、そしてそれによって核酸分子の配列を決定する工程。好ましい実施態様において、タグは、質量分析、赤外分析、紫外線分析、または定電位電流測定（potentiostatic amperometry）により検出される。別の局面において、本発明は以下の式の化合物を提供する： T^ms-L-X ここで、T^msは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Lは、T^ms-含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、T^ms-含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；Xは、他の部分との結合に際して基の活性を活性化するかまたは阻害するかのいずれかである、ヒドロキシル、アミノ、チオール、カルボン酸、ハロアルキル、およびそれらの誘導体から選択される官能基であるか、あるいは核酸フラグメントの3'末端以外でLに結合した核酸フラグメントである；ただし、化合物は、Xを介して固体支持体に結合されず、また250ダルトン未満の質量を有さない。別の局面において、本発明は、式T^ms-L-MOIを有する複数の化台物を含む組成物を提供する。ここで、T^msは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Lは、T^ms-含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、T^ms-含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；MOIは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、MOIの3'末端以外の位置でMOIに結合される；ならびに、ここで２つの化合物は、同じT^msも同じMOIも有さない。別の局面において、本発明は、水および式T^ms-L-MOIを有する化合物を含む組成物を提供する。ここで、T^msは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Lは、T^ms-含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、T^ms-含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；MOIは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、MOIの3'末端以外の位置でMOIに結合される。別の局面において、本発明は、複数のセットの化合物を含む組成物を提供する。各セットの化合物は、式T^ms-L-MOIを有する。ここで、T^msは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Lは、T^ms-含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、T^ms-含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；MOIは、核酸フラグメントであり、ここで、Ｌは、MOIの3'末端以外の位置でMOIに結合される；ここで、セット内において、全てのメンバーは同じT^ms基を有し、そしてMOIフラグメントは、ddAMP、ddGMP、ddCMP、およびd dTMPから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結する可変長を有する；ならびに、ここで、セット間において、T^ms基は少なくとも２amuだけ異なる。別の局面において、本発明は、前段落に記載される、第１の複数のセットの化合物を、式T^ms-L-MOIを有する、第２の複数のセットの化合物と組み合わせて含む組成物を提供する。ここで、T^msは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Lは、T^ms-含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、T^ms-含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；MOIは、核酸フラグメントであり、ここで、Lは、MOIの3'末端以外の位置でMOIに結合される；ならびに、ここで、第２の複数内の全てのメンバーは、ddAMP、ddGMP、 ddCMP、およびddTMPから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結するMOI 配列を有する；ただし、第１の複数の化合物に存在するジデオキシヌクレオチドは、第２の複数の化合物に存在するジデオキシヌクレオチドと同じではない。別の局面において、本発明は、DNA配列決定分析のためのキットを提供する。キットは、複数のコンテナセットを含む。各コンテナセットは、少なくとも５つのコンテナを含む。ここで、第１のコンテナはベクターを含み、第２、第３、第４および第５のコンテナは、式T^ms-L-MOIを有する化合物を含む。ここで、T^msは、質量分析により検出可能な有機基であり、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リン、およびヨウ素から選択される任意の原子を含む；Lは、T^ms-含有部分が化合物の残りの部分から切断されることを可能にする有機基であり、ここで、T^ms-含有部分は、化合物が質量分析に供される場合、１つのイオン化された荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む；MOIは、核酸フラグメントであり、ここで、Lは、MOIの3'末端以外の位置でMOIに結合される；例えば、第２、第３、第４および第５のコンテナのMOIは同一であり、そしてセットのコンテナ内のベクターの一部と相補的であり、そして各コンテナ内のT^ms基はキット内の他のT^ms基と異なる。別の局面において、本発明は、核酸分子の配列を決定するためのシステムを提供する。本システムは、タグ化核酸フラグメントを分離する分離装置、タグ化核酸フラグメントから、特定のヌクレオチドと相関し、そして電気化学的な検出により検出可能であるタグを切断する装置、および定電位電流測定装置を備える。本発明の他の実施態様において、４、５、10、15、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450または500を超える、異なりかつ独特のタグ化分子が、所定の同時の反応において利用され得る。ここで、各タグは、選択される核酸フラグメント、プローブ、または第１のもしくは第２のメンバーに独特であり、そして別々に同定され得る。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかとなる。さらに、種々の文献が以下に記載される。これらは、特定の手順または組成物（例えば、プラスミド）をより詳細に記載し、そしてそれゆえそれら全体が参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、化学的切断可能質量スペクトル分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成のための、カルボキシルアミド末端を有するタグを遊離させるフローチャートを示す。図２は、化学的切断可能質量スペクトル分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成のための、カルボキシル酸末端を有するタグを遊離させるフローチャートを示す。図３〜６および８は、36の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグのテトラフルオロフェニルエステルの組の合成のためのフローチャートを示す。図７は、36のアミンで終結する末端光化学的切断可能質量スペクトル分析タグの組の合成のためのフローチャートを示す。図９は、光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ酸の36のテトラフルオロフェニルエステルの対応する組から作製された36の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ化オリゴヌクレオチドの合成を示す。図10は、36のアミン末端光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ酸の36の対応する組から作製された36の光化学的切断可能質量スペクトル分析タグ化オリゴヌクレオチドの合成を示す。図11は、質量スペクトル分析による複数タグの同時検出を示す。図12は、α-シアノマトリックス単独の質量スペクトル図を示す。図13は、モジュラーで構築されるタグ化核酸フラグメントを示す。発明の詳細な説明簡潔に述べると、１つの局面において本発明は、目的の分子、またはその前駆体が不安定結合（単数または複数）を介してタグに連結されている化合物を提供する。従って、本発明の化合物は、一般式：Ｔ−Ｌ−Ｘを有するとして概説され得る。ここで、Ｔはタグ成分であり、Ｌは不安定な結合であるか、または不安定な結合を含むかのいずれかの連結成分であり、そしてＸは目的の分子成分(MOI)か、またはこれを介してMOIがT-Lに結合し得る官能基成分(L_h)のいずれかである。従って、本発明の化合物は、より詳細な一般式：Ｔ−Ｌ−MOIおよびＴ−Ｌ−Ｌ_h により表され得る。以下に詳細に記載する理由として、T-L-MOI化合物の組は、破壊されるべき不安定な結合（単数または複数）を生じる条件に目的をもって供され、従って、化合物の残りからのタグ部分を放出し得る。次いで、タグ部分は、１つ以上の分析技術により特徴付けられ、それによりタグ部分の構造に関する直接的情報、および（最も重要には）対応するMOIのアイデンティティに関する間接的情報を提供する。本発明の代表的化合物の単純な例示的な実施例（ここでＬは直接結合である）は、以下の構造(i)が参照される：構造(i)において、Ｔはカルボニル基に結合した窒素含有多環式芳香環部分であり、ＸはMOI（そして詳細にはアミン基において終結する核酸フラグメント）であり、ならびにＬは、アミド基を形成する結合である。アミド結合は、Ｔにおける結合に比較して不安定である。なぜなら、当該分野において理解されるように、アミド結合は、タグ成分中の結合は変化しないままの酸または塩基条件により化学的に切断（破壊）され得るからである。従って、タグ部分（すなわち、Ｔを含む切断産物）は、以下に示すように放出され得る：しかし、リンカーＬは、以下の例示的な実施例に示すように、直接結合ではあり得ず、以下に示す構造を有する本発明の別の代表的化合物が参照される： o-ニトロベンジルアミン部分（構造(ii)中の四角で囲んだ原子を参照のこと）を有する化合物は、光分解的に不安定であり、このような化合物の特定波長の化学線照射への曝露は、ベンジルアミン結合（構造(ii)の太線で示した結合を参照のこと）の選択的切断を生じることは周知である。従って、構造(ii)は、構造(i )と同じＴ基およびMOI基を有するが、リンカー基は複数の原子および結合を含み、この中には特定の不安定な結合が存在する。従って、構造(ii)の光分解は、以下に示すように、化合物の残りからタグ部分（Ｔを含む部分）を放出する。従って、本発明は、適切な切断条件への曝露に際して、切断反応を行いそれにより化合物の残りからタグ部分を放出する化合物を提供する。本発明の化合物は、タグ部分、MOI（またはその前駆体、L_h)、および２つの基を一緒に結合する不安定結合（単数または複数）によって記載され得る。あるいは、本発明の化合物は、形成される成分によって記載され得る。従って、化合物は、以下のように、タグ反応体、リンカー反応体およびMOI反応体の反応産物として記載され得る。タグ反応体は、化学ハンドル(T_h)および可変成分(T_vc)をからなり、タグ反応体は一般構造： T_vc-T_h を有するように理解される。この命名法を例示するために、構造(ii)の化合物を調製するために用いられ得るタグ反応体を示す構造(iii)が参照され得る。構造(iii)を有するタグ反応体は、以下に示すように、タグ可変成分およびタグハンドルを含む：構造(iii)において、タグハンドル(-C(=0)-A)は、T-L部分を形成するためにタグ反応体とリンカー反応体との反応のための接近手段を単純に提供する。構造(i ii)における基「Ａ」は、カルボキシル基が化学的に活性な状態にあり、従って他のハンドルに結合し得ることを示す。「Ａ」は、例えば、種々の他の可能性の中でも、水酸基またはペンタフルオロフェノキシであり得る。本発明は、以下により詳細に議論するタグ可変成分に結合され得る多数の可能なタグハンドルを提供する。従って、タグ可変成分は、式T-L-Xにおける「T」の部分であり、そしてまたLを切断する反応から形成されるタグ成分の部分であり得る。以下にまた詳細に議論するように、タグ可変成分は、本発明による化合物の組の調製において、個々のメンバーが分析技術により別のメンバーから区別され得るように組のメンバーが独特の可変成分を有することが所望されるので、タグ可変成分と命名される。１つの例として、構造(iii)のタグ可変成分は、以下の組の１つのメンバーであり得る。ここで、組のメンバーは、そのUVまたは質量スペクトルにより区別され得る：同様に、リンカー反応体は、リンカー不安定成分に隣接するその化学ハンドル（これらは少なくとも２つ必要であり、その各々はL_hとして示され得る）によっって記載され得る。ここでリンカー不安定成分は、必要な不安定部分(L²)および任意の不安定部分(L¹およびL³)を含み、ここで任意の不安定部分は、ハンドルL_h からＬ₂を分離するのに効果的に役立ち、そして必要な不安定部分は、リンカー不安定成分中で不安定結合を提供することに効果的に役立つ。従って、リンカー反応体は、一般式： L_h-L¹-L²-L³-L_h を有するものとして理解され得る。リンカー反応体を説明するために使用した命名法は、構造(iv)を考慮して例示され得、これは再度構造(ii)の化合物から得られる：構造(iv)が例示するように、原子は、ひとつより多くの機能的役割を果たし得る。従って、構造(iv)において、ベンジル窒素は、リンカー反応体をタグ反応体にアミド形成反応を介して結合させる化学ハンドルとして機能する。そして引き続いて、ベンジル炭素-窒素結合における光分解切断に特に感受性な不安定部分L² の構造の必要な部分としてもまた役立ち得る。構造(iv)はまた、リンカー反応体は、L¹基を有さず、L³基（この場合、メチレン基）を有し得ることを例示する。同様に、リンカー反応体は、L³基ではなくL¹基を有し得、またはL¹基およびL³ 基を有し得、あるいはL¹基およびL³基のどちらをも有し得ない。構造(iv)において、カルボニル基に隣接する基「Ｐ」の存在は、カルボニル基が反応から保護されていることを示す。この構造が与えられたことによって、タグ反応体(iii)の活性化されたカルボキシル基は、リンカー反応体(iv)のアミン基と完全に反応して、アミド結合を形成し、そして式T-L-L_hの化合物を与える。 MOI反応体は、目的の分子の適切に反応性形態である。目的の分子が核酸フラグメントである場合、適切なMOI反応体は、その5'水酸基を介してホスホジエステル基、次いでアミノ基で終結するアルキレン鎖に結合した核酸フラグメントである。次いで、このアミノ基は、それによりMOIをリンカーに結合し得る。構造( iv)のカルボニル基と反応（もちろん、カルボニル基の脱保護の後、そして好ましくは引き続くカルボニル基のアミン基との反応の活性化の後）し得、それによりMOIをリンカーに結合し得る。時系列で見た場合、本発明は、タグ反応体（化学タグハンドルおよびタグ可変成分を有する）、リンカー反応体（２つの化学的リンカーハンドルおよび必要な不安定部分および０〜２の任意の不安定部分を有する）、およびMOI反応体（目的成分の分子および目的ハンドルの化学的分子を有する）でT-L-MOIを形成するように理解される。従って、T-L-MOIを形成するために、タグ反応体およびリンカ一反応体が一緒に反応して最初にT-L-L_hを提供し、次いでMOI反応体はT-L-L_h および反応してT-L-MOIを提供するか、または（より好ましくない）リンカー反応体およびMOI反応体が一緒に反応して最初にL_h-L-MOIを提供し、次いでL_h-L-MO Iはタグ反応体と反応してT-L-MOIを提供するかのいずれかである。便宜の目的のために、式T-L-MOIを有する化合物は、このような化合物を形成するために使用され得るタグ反応体、リンカー反応体およびMOI反応体によって記載される。もちろん、式T-L-MOIの同じ化合物は、他の（代表的には、より面倒な）方法により調整され得、そしてこれは本発明のT-L-MOI化合物の範囲内にある。任意の事象において、本発明は、タグ部分が化合物の残りから放出されるような切断条件に供されるべきT-L-MOI化合物を提供する。タグ部分は、少なくともタグ可変成分を含み、そして代表的にはさらに、タグ反応体とリンカー反応体とを結合するために使用されたタグハンドルからのいくつかのまたは全ての原子、リンカーハンドルからのいくつかのまたは全ての原子、この基がT-L-MOIにおいて存在する場合不安定部分を必要に応じて含み、そしてL²の精密な構造および切断化学の性質に依存して必要な不安定部分L²のいくつかの部分をおそらくはさらに含む。便宜のために、タグ部分は、Ｔは代表的にはタグ部分の主要部分（質量において）を構成するので、T-含有部分として呼ばれ得る。本発明の１つの局面へこの導入が与えられるので、種々の成分（Ｔ、Ｌ、およびＸ）が詳細に説明される。この説明は、Ｔ、Ｌ、およびＸの説明において本明細書中に以下で使用される以下の特定の用語の定義から始まる。本明細書中に使用される場合、用語「核酸フラグメント」は、選択された標的核酸分子に相補的な（すなわち、その全部または部分に相補的な）分子であり、そして天然または合成由来あるいは組換え的に産生され（天然に存在しない分子を含む）、そして適切な場合２本鎖または１本鎖形態であり；そしてオリゴヌクレオチド（例えば、DNAまたはRNA）、プライマー、プローブ、核酸アナログ（例えば、PNA)、ポリメラーゼにより3'から5'末端の方向に伸張されるオリゴヌクレオチド、化学的または酵素的に切断される核酸、ジデオキシターミネーターによって終結させられるか、または3'または5'での重合を阻害する化合物により3'または5'末端でキャップされる核酸、およびこれらの組合せを含むことを意味する。核酸フラグメントの選択された標的核酸分子への相補性は、一般的に、フラグメントの長さ全体にかけて少なくとも約70％の特異的な塩基対形成を示すことを意味する。好ましくは、核酸フラグメントは、少なくとも約80％；そして最も好ましくは、約90％の特異的な塩基対形成を示す。ミスマッチ割合（従って、特異的な塩基対形成の割合）を決定するためのアッセイは、当該分野において周知であり、そして完全に塩基対形成したコントロールに参照される場合のTmの関数としてのミスマッチ割合に基づく。本明細書中で使用される用語「アルキル」は、単独または組み合わせて、１〜 10、好ましくは１個〜６個そしてより好ましくは１個〜４個の炭素原子を含む飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、デシルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルキレン」は、１個〜10個、好ましくは１個〜６個そしてより好ましくは１個〜４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなジラジカルの例は、メチレン、エチレン、(-CH₂- CH₂-)、プロピレンなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルケニル」は、単独または組み合わせて、２個〜10個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子全体において、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を有する飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エテニル、Ｅ-およびＺ-プロペニル、イソプロペニル、Ｅ-およびＺ-ブテニル、Ｅ-およびＺ-イソブテニル、Ｅ-およびＺ-ペンテニル、デセニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルケニレン」は、２個〜10個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を有する飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなジラジカルの例は、メチリデン(=CH₂)、エチリデン(-CH=CH-)、プロピリデン(-CH₂-CH=CH-)などを含むが、これらに限定されない。用語「アルキニル」は、単独または組み合わせて、２個〜10個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エチニル（アセチレニル）、プロピニル（プロパルジル）、ブチニル、ヘキシニル、デシニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルキニレン」は、単独または組み合わせて、２個〜10個、好ましくは２個〜６個そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子の全体において、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ジラジカルをいう。このようなラジカルの例は、エチニレン(-C≡C-)、プロピニレン(- CH₂-C≡C-)などを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせて、炭素原子の数が３個〜８個そしてより好ましくは３個〜６個の炭素原子の飽和環状配置をいう。このようなシクロアルキルラジカルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルキレン」は、シクロアルキルのジラジカル形態をいう。用語「シクロアルケニル」は、単独または組み合わせて、４個〜８個、好ましくは５個または６個の炭素原子および１つ以上の二重結合を含む環状炭素環をいう。このようなシクロアルケニルラジカルの例は、シクロペンテニル、シクロヘキシニル、シクロペンタジエニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルケニレン」は、シクロアルケニルのジラジカル形態をいう。用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、アズレニル、フルオレニル、およびアントラセニルからなる群から選択される炭素環（炭素および水素の全体からなる）芳香族基；またはフリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、オキサゾリル(oxazolyly)、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、2-ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、1,2, 3-オキサジアゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、1,3,5-トリアジニル、1,3,5-トリチアニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、3H-インドリル、インドリニル、ベンゾ[b]フラニル、2,3-ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾ[b]チオフェニル、IH -インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、4H-キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノオキサリニル、1,8-ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、およびフェノキサジニルからなる群から選択されるヘテロ環芳香族基をいう。本明細書中に定義される「アリール」基は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、1,2-ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシまたはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、脂肪族アシルまたは芳香族アシル、アルコキシ-カルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、モルホリノカルボニルアミノ、チオモルホリノカルボニルアミノ、N-アルキルグアニジノ、アラルキルアミノスルホニル；アラルコキシアルキル；N-アラルコキシウレア；N-ヒドルキシルウレア；N-アルケニルウレア；N,N-(アルキル、ヒドロキシル)ウレア：ヘテロシクリル；チオアリールオキシ-置換アリール；N,N-(アリール、アルキル)ヒドラジノ；Ar'-置換スルホニルヘテロシクリル；アラルキル-置換ヘテロシクリル；シクロアルキルおよびシクロアケニル置換-ヘテロシクリル；シクロアルキル-縮合アリール；アリールオキシ-置換アルキル；ヘテロシクリルアミノ；脂肪族アシルアミノカルボニルまたは芳香族アシルアミノカルボニル；脂肪族アシル-置換アルケニルまたは芳香族アシル-置換アルケニル；Ar'-置換アミノカルボニルオキシ；Ar',Ar'-ジ置換アリール；脂肪族アシル-置換アシルまたは芳香族アシル-置換アシル；シクロアルキルカルボニルアルキル；シクロアルキル-置換アミノ；アリールオキシカルボニルアルキル；ホスホロジアミジル酸またはエステル；からなる群から独立して選択される１個〜４個の置換基を、独立して含み得る。「Ar'」は、上記に定義されるように水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、1,2-ジオキシメチレン、1,2−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アルキルカルボニルオキシ、脂肪族アシルまたは芳香族アシル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、N-アルキル、またはN,N-ジアルキルウレアからなる群から選択される１個〜３個の置換基を有する炭素環またはヘテロ環アリール基である。用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせて、アルキルエーテルラジカルをいい、ここで、用語「アルキル」は上記のように定義される。適切なアルキルエーテルラジカルの例は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルケノキシ」は、単独または組み合わせて、アルケニル-O-式のラジカルをいい、ここで用語「アルケニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはエノールエーテルではない。適切なアルケノキシラジカルの例は、アリルオキシ、E-3-メチル-2-プロペノキシおよびZ-3-メチル-2-プロペノキシなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルキニルオキシ」は、単独または組み合わせて、アルキニル-O-式のラジカルをいい、ここで用語「アルキニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはイノールエーテルではない。適切なアルキノキシラジカルの例は、プロパルギルオキシ、2-ブチニルオキシなどを含むが、これらに限定されない。用語「チオアルコキシ」は式アルキル-S-のチオエーテルラジカルをいい、ここでアルキルは上記のように定義される。用語「アルキルアミノ」は、単独または組み合わせて、モノ-またはジ-アルキル-置換アミノラジカル（すなわち、式アルキル-NH-または(アルキル)₂-N-のラジカル）をいい、ここで、用語「アルキル」は上記のように定義される。適切なアルキルアミノラジカルの例は、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、t-ブチルアミノ、N,N-ジエチルアミノなどを含むが、これらに限定されない。用語「アルケニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルケニル-NH− または(アルケニル)₂N-のラジカルをいい、ここで用語「アルケニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはエナミンではない。このようなアルケニルアミノラジカルの例は、アリルアミノラジカルである。用語「アルキニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキニル-NH-または（アルキニル)₂N-のラジカルをいい、ここで用語「アルキニル」は上記のように定義され、但し、ラジカルはイナミンではない。このようなアルキニルアミノラジカルの例は、プロパルギルアミノラジカルである。用語「アミド」は、-N(R¹)-C(=0)-または-C(=O)-N(R¹)-のいずれかをいい、ここでR¹は本明細書中で水素ならびに他の基を含むと定義される。用語「置換アミド」は、R¹が水素ではない状況をいい、一方用語「非置換アミド」はR¹が水素である状況をいう。用語「アリールオキシ」は、単独または組み合わせて、式アリール-O-のラジカルをいい、ここでアリールは上記のように定義される。アリールオキシラジカルの例は、フェノオキシ、ナフトキシ、ピリジルオキシなどを含むが、これらに限定されない。用語「アリールアミノ」は、単独または組み台わせて、式アリール-NH-のラジカルをいい、ここでアリールは上記のように定義される。アリールアミノラジカルの例は、フェニルアミノ（アニリド）、ナフチルアミノ、2-、3-、および4-ピリジルアミノなどを含むが、これらに限定されない。用語「アリール縮合シクロアルキル」は、単独または組み合わせて、アリールラジカルと隣接する２原子を共有するシクロアルキルラジカルをいい、ここで用語「シクロアルキル」および「アリール」は、上記のように定義される。アリール縮合シクロアルキルラジカルの例は、ベンゾ縮合シクロブチルラジカルである。用語「アルキルカルボニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル -CONHのラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。用語「アルコキシカルボニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル-OCONH-のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。用語「アルキルスルホニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アルキル -SO₂NH-のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。用語「アリールスルホニルアミノ」は、単独または組み合わせて、式アリール -SO₂NH-のラジカルをいい、ここで用語「アリール」は上記のように定義される。用語「N-アルキルウレア」は、単独または組み合わせて、式アルキル-NH-CO-N H-のラジカルをいい、ここで用語「アルキル」は上記のように定義される。用語「N-アリールウレア」は、単独または組み合わせて、式アリール-NH-CO-N H-のラジカルをいい、ここで用語「アリール」は上記のように定義される。用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。用語「炭化水素ラジカル」は、１つの水素原子のみが独立した安定な分子であることを必要とする炭素および水素原子の配置をいう。従って、炭化水素ラジカルは炭素原子上に１つの空の原子価部位を有し、これを通じて炭化水素ラジカルは他の原子（単数または複数）に結合され得る。アルキル、アルケニル、シクロアルキルなどが、炭化水素ラジカルの例である。用語「炭化水素ジラジカル」は、２つの水素原子が独立した安定な分子であることを必要とする炭素および水素原子の配置をいう。従って、炭化水素ラジカルは１つまたは２つの炭素原子上に２つの空の原子価部位を有し、これを通じて炭化水素ラジカルは他の原子（単数または複数）に結合され得る。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレンなどが炭化水素ジラジカルの例である。用語「ヒドロカルビル」は、炭素および水素の全体が単一の原子価部位を有し、これを通じて別の部分に結合する任意の安定な配置をいう。従って、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール（アリール環の中へのヘテロ原子の組み込みを含まない）、アリールアルキル、アルキルアリールなどとして知られるラジカルを含む。炭化水素ラジカルは、ヒドロカルビルの別の名前である。用語「ヒドロカルビレン」は、炭素および水素の全体が２つの原子価部位を有し、これを通じて他の部分に結合する任意の安定な配置をいう。従って、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリーレン（アリーレン環の中へのヘテロ原子の組み込みを含まない）、アリールアルキレン、アルキルアリーレンなどを含む。炭化水素ジラジカルは、ヒドロカルビレンの別の名前である。用語「ヒドロカルビル-O-ヒドロカルビレン」は、酸素原子に結合したヒドロカルビル基をいい、ここで酸素原子は、同様にヒドロカルビレン基が他の部分に結合する２つの原子価部位の１つでヒドロカルビレン基に結合する。用語「ヒドロカルビル-S-ヒドロカルビレン」、「ヒドロカルビル-NH-ヒドロカルビレン」および「ヒドロカルビル-アミド-ヒドロカルビレン」は、等価の意味を有し、ここで酸素はイオウ、-NH-、またはアミド基でそれぞれ置換されている。用語N-(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレンは、ヒドロカルビレン基をいい、ここで２つの原子価部位の１つは窒素原子に結合し、そしてこの窒素原子は同時に水素およびヒドロカルビル基に結合する。用語N,N-ジ(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレンは、ヒドロカルビレン基をいい、ここで２つの原子価部位の１つは窒素原子に結合し、そしてこの窒素原子は同時に２つのヒドロカルビル基に結合する。用語「ヒドロカルビルアシル-ヒドロカルビレン」は、ヒドロカルビレン基の２つの原子価部位の１つにアシル(-C(=0)-)基を介して結合したヒドロカルビル基をいう。用語「ヘテロシクリルヒドロカルビル」および「ヘテロシリル」は、炭素原子および酸素、窒素、リン、およびイオウから選択された４つまでの原子（へテロ原子という）を含む、安定な原子の環状配置をいう。環状配置は、３個〜７個の原子のモノ環状環または８個〜11個の原子の２環状環の形態であり得る。環は、飽和または不飽和（芳香族環を含む）であり得、そして必要に応じてベンゾ縮合され得る。環中の窒素およびイオウ原子は、窒素の４級化形態を含む任意の酸化形態であり得る。ヘテロシクリルヒドロカルビルは、任意の環外炭素またはヘテロ原子で結合し得、安定な構造を作製する。好ましいヘテロシクリルヒドロカルビルは、１個または２個の窒素のヘテロ原子を含む５〜７員のモノ環状ヘテロ環を含む。置換ヘテロシクリルヒドロカルビルは、上記のように定義されるヘテロシクリルヒドロカルビルをいい、ここで少なくともその１つの環原子が環外に伸張する示された置換基に結合する。ヒドロカルビルおよびヒドロカルビレン基において、用語「１つ以上の水素が等しい数のフッ素に置換されている上記の任意の誘導体」は、炭素、水素およびフッ素原子を含み、それ以外の原子を含まない分子をいう。用語「活性エステル」は、容易に求核試薬（例えば、アミンおよびアルコールまたはチオール求核試薬）により置換可能な「脱離基」を含むエステルである。このような脱離基は周知であり、限定はしないがN-ヒドロキシスクシンイミド、 N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（ハライド）、テトラフルオロフェノレートを含むアルコキシ、チオアルコキシなどを含む。用語「保護エステル」は、マスクされたか、またはそうでなければ非反応性のエステル基をいう。例えば、Greene，「Protecting Groups In Organic Synthesis」を参照のこと。上記の定義を考慮して、本明細書全体に使用される他の化学用語は当業者に容易に理解され得る。用語は、単独またはそれらの任意の組合せで使用され得る。好ましいおよびより好ましいラジカルの鎖長は、このような全ての組合わせに適用される。Ａ．タグ化核酸フラグメントの作製上記のように、本発明の１つの局面は、各レーンで16タグより多くの使用を可能にする、DNA配列決定のための一般的なスキームを提供する；連続的な検出によってちょうど従来の蛍光ベース配列決定のようにタグが検出され得、そして配列はサイズ分離が生じるごとに読み取られる。このスキームは、タグ化分子のサイズ分離に基づく任意のDNA配列決定技術に適用し得る。本発明における使用のために適切なタグおよびリンカー、ならびに核酸配列決定のための方法は、以下により詳細に議論される。１．タグ本明細書中に使用される「タグ」は、一般に「目的分子」を独特に同定するために使用される化学部分をいい、そしてより詳細にはタグ可変成分ならびに任意のタグ反応物、タグ成分およびタグ部分において、それに最も密接に結合し得るものをいう。本発明において有用なタグは、いくつかの性質を有する： 1)他の全てのタグから区別され得る。他の化学部分からのこの区別は、タグ（特に、切断反応後）のクロマトグラフィーの挙動、その分光光度または電位差特性、またはこれらのいくつかの組合せに基づき得る。タグが有用に区別される分光光度法は、質量スペクトル分析法(MS)、赤外(IR)、紫外(UV)、および蛍光を含み、ここでMS、IR、およびUVが好ましく、そしてMSが最も好ましい分光光度法である。定電位電流測定は、好ましい電位差法である。 2)タグは、10^-22〜10^-6モルで存在する場合に検出され得る。 3)タグは、タグが独特に同定されると意図される、MOIに結合し得る化学的ハンドルを有する。結合は、MOIに直接的に、または「リンカー」基を介して間接的に形成され得る。 4)タグは、それが供される全ての操作(MOIへの結合および切断、およびタグが結合される間のMOIの任意の操作を含む）に対して化学的に安定である。 5)タグは、タグが結合している間のMOIについて行われる操作を有意に阻害しない。例えば、タグがオリゴヌクレオチドに結合されている場合、タグはオリゴヌクレオチドに行われるいかなるハイブリダイゼーションまたは酵素反応（例えば、PCR配列決定反応）を阻害してはならない。同様に、タグが抗体に結合される場合、抗体による抗原認識を有意に阻害してはならない。特定の分光光度または電位差法により検出されることを意図されるタグ部分は、その方法による検出の感度および特異性を増強する特性を有する。典型的には、タグ部分は、このような特性を有する。なぜなら、特性は、典型的にタグ部分の主要部分を構成するタグ可変成分の中に設計されているからである。以下の議論において、用語「タグ」の使用は、タグ部分（すなわち、タグ可変成分を含む切断産物）をいうが、タグ可変成分それ自体をいうこともまた考慮され得る。なぜなら、タグ可変性分は、典型的には独特に検出され得る特性を提供することを担うタグ部分の一部であるからである。式T-L-Xの化合物において、「T」部分は、タグ可変成分を含む。タグ可変成分が例えば、質量スペクトル分析法により特徴付けされるように設計されている場合、T-L-Xの「T」部分はT^msといわれ得る。同様に、T-L-XからのTを含む切断産物は、T^ms含有部分といわれ得る。以下の分光光度法および電位差法は、T^ms含有部分を特徴付けるために使用され得る。ａ．MSタグの特徴タグが質量分析（すなわち、MS読み取り可能タグ、また本明細書中でMSタグ、または「T^ms含有部分」といわれる）により分析され得る場合、タグの必須特性は、それがイオン化され得ることである。従って、MS読み取り可能タグの設計において、そこにMSのイオン化条件の下で正電荷または負電荷を有し得る化学官能性を取り込むことは、好ましい要素である。この特性は、特にエレクトロスプレーイオン化において、イオン形成の改善された効率およびより大きい検出の全体的な感度を与える。イオン化電位を維持する化学官能基は、T^msまたはＬあるいは両方に由来し得る。質量スペクトル分析により検出される分析物の相対的な感度を増加し得る因子は、例えば、Sunner，J．ら、Anal．Chem．60:1300-1307(19 88)に議論されている。負電荷を有することを容易にするために好ましい官能基は、有機酸（例えば、フェノール性水酸基、カルボン酸、リン酸、リン酸塩、テトラゾール、硫化尿素、パーフルオロアルコールおよびスルホン酸）である。イオン化条件下で正電荷を有することを容易にするために好ましい官能基は、脂肪族または芳香族アミンである。MSタグの増強された検出可能性を与えるアミン官能基の例は、四級アミン（すなわち、各々が炭素原子に対する４つの結合を有するアミン。Aebersold，米国特許第5,240,859号を参照のこと）および三級アミン（すなわち各々が炭素原子に対する３つの結合を有するアミン。これは、ピリジンに存在するようなC=N-C基を含む。Hessら、Anal．Biochem．224:373，199 5;Buresら、Anal．Biochem．224:364，1995を参照のこと）を含む。阻害された三級アミンが特に好ましい。３級および四級アミンは、アルキルまたはアリールであり得る。T^ms含有部分は、少なくとも１つのイオン化可能種を有さなくてはならないが、１つより多くのイオン化可能種を有し得る。好ましい電荷状態は、１つのタグ当たり１つのイオン化種である。従って、各T^ms含有部分（および各タグ可変成分）は、１つの阻害されたアミンまたは有機酸基のみを含むことが好ましい。 T^ms含有部分の一部を形成し得る適切なアミン含有ラジカルは、以下を含む：質量スペクトル分析によるタグの同定は、好ましくは分子量対電荷比(m/z)に基づく。MSタグの好ましい分子量範囲は約100〜2,000ダルトンであり、そして好ましくはT^ms含有部分は少なくとも約250ダルトン、より好ましくは少なくとも約 300ダルトン、そしてさらにより好ましくは少なくとも約350ダルトンの質量を有する。一般に、200〜250ダルトン未満の親イオンを有する部分を質量スペクトル分析で区別することは特に困難であり（精密な装置に依存する）、従って本発明のT^ms含有部分がこの範囲を超える質量を有することが好ましい。上記に説明したように、T^ms含有部分は、タグ可変成分に存在するもの以外、そして特にT^ms自体に存在するもの以外の原子を含み得る。従って、T^ms自体の質量は、T^ms含有部分が少なくとも約250ダルトンの質量を有する限り、約250ダルトンより少なくあり得る。従って、T^msの質量は、15（すなわち、メチルラジカル）〜約10,000ダルトンの範囲、そして好ましくは100〜約5,000ダルトンの範囲、そしてより好ましくは約200〜約1,000ダルトンの範囲であり得る。これらのタグが有意な量で１つより多くの同位体を有する原子を取り込む場合、質量スペクトル分析によりタグを区別することは比較的困難である。従って、質量スペクトル分析同定に意図される好ましいＴ基(T^ms基)は、炭素、少なくとも１つの水素およびフッ素、および酸素、窒素、イオウ、リンおよびヨウ素から選択される任意の原子を含む。他の原子はT^msに存在し得るが、その存在は質量スペクトル分析データの分析を幾分より困難にし得る。好ましくは、T^ms基は、水素原子および／またはフッ素原子に加えて、炭素、窒素および酸素のみを有する。フッ素は、T^ms基において有することがなお好ましい任意の原子である。水素と比較して、フッ素はもちろんより重い。従って、フッ素原子の存在は、水素原子よりもより高い質量のT^ms基を導き、それによりT^ms基は上記の説明のように所望される250ダルトンの質量に達し得、そしてこれを超え得る。さらに、水素のフッ素での置換は、T^ms含有部分により高い揮発性を与え、そして分析物のより高い揮発性は、質量スペクトル分析が検出方法として用いられる場合、感度を増強する。 T^msの分子式は、C_1-500N_0-100O_0-100S_0-10P_0-10H_αF_βI_δの範疇にあり、ここでａ、βおよびδの計は、そうでなければ充たされないC、N、O、S、およびP原子の原子価を充たすのに十分である。表示C_1-500N_0-100O_0-100S_0-10P_0-10H_αF_βI_δは、T^msが少なくとも１つを含み、そして１個〜500個の任意の数の炭素原子、さらに必要に応じて100個までの窒素原子（「N₀-」は、T^msが窒素原子を１つも含む必要がないことを意味する）、および100個までの酸素原子、ならびに10個までのイオウ原子および10個までのリン原子をT^msに含み得ることを意味する。符合α、β 、およびδは、T^ms中の水素、フッ素およびヨウ素の数を表し、ここで、これらの数の任意の２つは０であり得、そしてこれらの数の計はそうでなければ充たされないC、N、O、SおよびP原子の原子価の総計と等しい。好ましくは、T^msは、C₁ _-50 N_0-10O_0-100H_αF_βの範疇に入る分子式を有し、ここでαおよびβの計は部分に存在する水素およびフッ素原子の数にそれぞれ等しい。 b．IRタグの特徴有機化学基のIR検出には、２つの主な形態：ラマン散乱IRおよび吸収IRが存在する。ラマン散乱IRスペクトルと吸収IRスペクトルとは、相補的な分光学的方法である。一般に、ラマン励起は結合極性の変化に依存するが、IR吸収は結合双極子モーメントの変化に依存する。弱いIR吸収線は強いラマン吸収線となり、そしてその逆も成り立つ。波数は、IRスペクトルの特徴的な単位である。IRタグのための別々の適用を有する３つのスペクトル領域が存在する：12500〜4000cm^-1における近IR、4000〜600cm^-1における中程度のIR、600〜30cm^-1における遠IR。本明細書中に記載される使用（ここで化合物は、MOI、プローブ、またはプライマーを同定するためのタグとして機能する）のために、中程度のスペクトル領域が好ましい。例えば、カルボニル伸縮（1850〜1750cm^-1）は、カルボン酸、カルボン酸エステルおよびカルボン酸アミド、ならびに炭酸アルキルおよび炭酸アリール、カルバメート、ならびにケトンについて測定される。N-H変角（1750〜160cm^-1 ）は、アミン、アンモニウムイオン、およびアミドを同定するために使用される。1400〜1250cm^-1において、R-OH変角ならびにアミド中のC-N伸縮が検出される。芳香族置換パターンは、900〜690cm^-1（ArNH₂についてのC-H変角、N-H変角）において検出される。飽和C-H、オレフィン、芳香環、二重結合および三重結合、エステル、アセタール、ケタール、アンモニウム塩、N-O化合物（例えば、オキシム、ニトロ、N-オキシド、および硝酸塩）、アゾ、ヒドラゾン、キノン、カルボン酸、アミド、ならびにラクタムは全て、振動赤外相関データを有する（Pret schら，Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds，S pringer-Verlag，New York，1989を参照のこと）。好ましい化合物には、2230〜 2210cm^-1において非常に強いニトリル伸縮振動を示す芳香族ニトリルが含まれる。他の有用なタイプの化合物は、2140〜2100cm^-1の間に鋭い吸収バンドを引き起こす強い伸縮振動を有する芳香族アルキンである。第３のタイプの化合物は、21 60〜2120cm^-1領域において強い吸収バンドを示す芳香族アジドである。チオシアネートは、2275〜2263cm^-1において強い吸収を有する代表的な化合物である。 c．UVタグの特徴有機発色団のタイプおよびそれら各々のUV可視特性の編集が、Scott（Interpr etation of the UV Spectra of Natural Products，Permagon Press，New York ，1962）において与えられる。発色団は、特定の光吸収を担う原子、または原子もしくは電子の群である。共役系におけるπ→π^*の極大について、経験則が存在する（Pretschら，Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds，B65頁およびB70頁，Springer-Verlag，New York，1989を参照のこと）。好ましい化合物（共役系を有する）は、ｎ→π^*およびπ→π^*遷移を有する。そのような化合物は、以下によって例示される：アシッドバイオレット7、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローG、ブリリアントブルーG、コンゴーレッド、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンオキサレート、メタニルイエロー、メチレンブルー、メチルオレンジ、メチルバイオレットB、ナフトールグリーンB、オイルブルーN、オイルレッド0、4-フエェルアゾフェノール、サフラニンO(Safranie O)、ソルベントグリーン3、およびスダンオレンジG；これらの全てが市販されている（Aldrich，Milwaukee，WI）。他の適切な化合物は、例えば、Jane,I．ら，J．Chrom．323:191-225（1985）において表記されている。 d．蛍光タグの特徴蛍光プローブは、それらの吸収および蛍光放出の波長および強度によって、最も直接的に同定されそして定量される。放出スペクトル（蛍光およびりん光）は、吸収スペクトルよりも非常に感度が高く、そしてより特異的な測定を可能にする。励起状態の寿命および蛍光の異方性のような他の光物理的特性は、より広く使用されていない。最も一般的に有用な強度パラメータは、吸収についてのモル吸光係数（ε）および蛍光についての量子収量（QY）である。εの値は単一の波長において明示され（通常、プローブの極大吸収）、一方QYは全蛍光スペクトルプロフィールにわたる全光子放出の測定である。狭い最適バンド幅（＜20nm）が蛍光励起（吸収を介する）について通常使用され、一方蛍光検出バンド幅はより可変的であり、最大感度についての完全スペクトルから最大解像度についての狭いバンド（約20nm）までの範囲にわたる。プローブ分子あたりの蛍光強度は、ε とQYとの積に比例する。現在実用的に重要な、発蛍光団におけるこれらのパラメータの幅は、εについて約10,000〜100,000cm^-1M^-1であり、そしてQYについて0. 1〜1.0である。蛍光タグとして機能し得る化合物は、以下の通りである：フルオロセイン、ローダミン、ラムダブルー470、ラムダグリーン、ラムダレッド664、ラムダレッド665、アクリジンオレンジ、およびヨウ化プロピジウム、これらはL ambda Fluorescence Co．（Pleasant Gap，PA）から市販されている。蛍光化合物（例えば、ナイルレッド、テキサスレッド、lissamine^TM、BODIPY^TM）は、Mol ecular Probes（Eugene，OR）から市販されている。 e．電位差タグの特徴電気化学的検出（ECD）の原理は化合物の酸化および還元に基づいている。特定の印加された電位において、電子は供与されるかまたは受容されるかのいずれかであり、従って測定され得る電流を産生する。特定の化合物が電位差に供された場合、分子は作用電極の表面において、電子の喪失（酸化）または獲得（還元）による分子転位を受ける。そのような化合物は電子的であると言われ、そして電気化学的反応を受ける。EC検出器は、その上にHPLC溶出液が流れる電極表面に電圧を与える。カラムから溶出する電気的に活性な化合物は、電子を供与（酸化）するかまたは獲得（還元）するかのいずれかであり、即時に電流ピークを生じる。重要なことに、生じる電流の量は、分析物(analyte)の濃度および与えられた電圧の両方に依存し、各化合物は、そこにおいて酸化または還元が始まる特定の電圧を有する。現在最もポピュラーな電気化学的検出器は電流測定検出器であり、そこでは電位が一定に保たれており、そして電気化学的反応から生じる電流が次いで測定される。この種類の分光分析は現在「定電位電流測定」と呼ばれている。市販の電流測定器はESA，Inc.，Chelmfold，MAから入手できる。検出の効率が100％である場合、特殊化された検出器は「電量的」であると言われる。電量検出器は高感度であり、選択性および感度に関して多くの実用的な利点を有し、それによりこれらの種類の検出器はアレイにおいて有用となる。電量検出器において、分析物の所定の濃度についてのシグナル電流は、作用電極に対する印加された電位（電圧）の関数としてプロットされる。得られるS字型グラフは電流-電圧曲線または流体力学的ボルタマグラム（HDV）と呼ばれる。HDV は、活性電極に印加される電位の最良の選択を可能にし、これは観察されるシグナルを最大化することを可能にする。ECDの主要な利点は、サブフエムトモルの範囲における検出の電流レベルを有する、その固有の感度である。多数の化学物質および化合物が電気化学的に活性であり、それには多くの生化学物質、薬剤、および殺虫剤が含まれる。クロマトグラフィー上で共溶出する化合物は、それらの半波位（最大シグナルの半分における電位）が30〜60mVでしか相違しない場合でさえも、効果的に解析され得る。最近開発された電量センサーは、液体クロマトグラフィーに基づく分離における検出器として使用される場合、溶出する化合物の選択性、同定、および解析を提供する。従って、これらのアレイされた検出器は、検出器自身において達成される別の組の分離を加える。現在の計器は16チャンネルを有し、これらは原則として、データが獲得され得る速度によってのみ制限される。ECアレイ上で解析され得る化合物の数は、クロマトグラフィーによって制限される（すなわち、プレートの総数が制限される）。しかし、クロマトグラフィー上で共溶出する２以上の化合物が半波位において30〜60mVの相違を有する場合、アレイは化合物を区別可能である。電気化学的に活性である化合物の能力は、所有のEC活性基（すなわち、-OH、-O、-N、-S）に依存する。電量検出器を使用して首尾良く検出されている化合物には、以下が含まれる： 5-ヒドロキシトリプタミン、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニル−グリコール、ホモゲンチジン酸、ドーパミン、メタネフリン、3-ヒドロキシキヌレニン(3-hyd roxykynureninr)、アセトミノフェン、３−ヒドロキシトリプトホール(3-hydrox ytryptophol)、5-ヒドロキシインドール酢酸、オクタンスルホン酸、フェノール、o-クレゾール、ピロガロール、2-ニトロフェノール、4-ニトロフェノール、2, 4-ジニトロフェノール、4,6-ジニトロクレゾール、3-メチル-2-ニトロフェノール、2,4-ジクロロフェノール、2,6-ジクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、4-クロロ-3-メチルフェノール、5-メチルフェノール、4-メチル-2-ニトロフェノール、2-ヒドロキシアニリン、4-ヒドロキシアニリン、1,2-フェニレンジアミン、ベンゾカテキン、ブツロン、クロルトルロン、ジウロン、イソプロツロン、リニュロン、メトブロムロン、メトキスロン、モノリニュロン、モニュロン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、4-アミノ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシクマリン酸、7-メトキシクマリン、アピゲニン(apigeni n)バイカレイン、カフェイン酸、カテキン、センタウレイン、クロロゲン酸、ダイドゼイン(daidzein)、ダチスセチン、ジオスメチン、没食子酸エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、オイゲノール、オイパトリン(e upatorin)、フェルル酸、フィセチン、ガランギン(galangin)、没食子酸、ガルデニン(gardenin)、ゲニステイン、ゲンチジン酸、ヘスペリジン、イリゲニン、ケンフェロール(kaemferol)、ロイコヤニジン(leucoyanidin)、ルテオリン、マンゴスチン、モリン、ミリセチン、ナリンギン、ナリルチン(narirutin)、ペラルゴンジン(pelargondin)、ペオニジン(peonidin)、フロレチン(phloretin)、プラテンセイン、プロトカテキン酸(protocatechuic acid)、ラムネチン(rhamneti n)、ケルセチン、サクラネチン、スクテラレイン(scutellarein)、スコポレチン (scopoletin)、シリングアルデヒド、シリンジン酸(syringic acid)、タンゲリチン(tangeritin)、トロキセルチン(troxerutin)、ウンベリフェロン(umbellife rone)、バニリン酸、1,3−ジメチルテトラヒドロイソキノリン、6-ヒドロキシドーパミン、γ-サルソリノール、N-メチル-γ-サルソリノール、テトラヒドロイソキノリン、アミトリプチリン、アポモルヒネ、カプサイシン、クロルジアゼポキシド、クロルプロマジン、ダウノルビシン、デシプラミン、ドキセピン、フルオキセチン、フルアゼパム、イミプラミン、イソプロテレノール、メトキサミン、モルヒネ、モルヒネ -3-グルクロニド、ノルトリプチリン、オキサゼパム、フェニレフリン、トリミプラミン、アスコルビン酸、N-アセチルセロトニン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、3,4-ジヒドロキシマンデル酸（DOMA）、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）、3,4-ジヒドロキシフェニルグリコール（DHPG）、3-ヒドロキシアントラニル酸、2-ヒドロキシフェニル酢酸（2HPAC）、4-ヒドロキシ安息香酸（4HBAC）、5-ヒドロキシインドール -3-酢酸（5HIAA）、3-ヒドロキシキヌレニン、3-ヒドロキシマンデル酸、3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニルエチルアミン、4-ヒドロキシフェニル酢酸（4HPAC）、4-ヒドロキシフェニル乳酸（4HPLA）、5-ヒドロキシトリプトファン（5HTP）、5-ヒドロキシトリプトホール（5HTOL）、5-ヒドロキシトリプタミン（5HT）、 5-ヒドロキシトリプタミンスルフェート、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール（MHPG）、5-メトキシトリプタミン、5-メトキシトリプトファン、5-メトキシトリプトホール、3-メトキシチラミン（3MT）、3-メトキシチロシン（3-O M-DOPA）、5-メチルシステイン、3-メチルグアニン、ブホテニン、ドーパミン、ドーパミン-3-グルクロニド、ドーパミン-3-スルフェート、ドーパミン-4-スルフェート、エピネフリン、エピニン、葉酸、グルタチオン（還元型）、グアニン、グアノシン、ホモゲンチジン酸（HGA）、ホモバニリン酸（HVA）、ホモバニリルアルコール（HVOL）、ホモベラチン酸(homoveratic acid)、ホモバニリン酸スルフェート、ヒポキサンチン、インドール、インドール-3-酢酸、インドール-3- 乳酸、キヌレニン、メラトニン、メタネフリン、N-メチルトリプタミン、N-メチルチラミン、N,N-ジメチルトリプタミン、N,N-ジメチルチラミン、ノルエピネフリン、ノルメタネフリン、オクトパミン、ピリドキサール、ピリドキサールリン酸、ピリドキサミン、シネフリン(synephrine)、トリプトホール、トリプタミン、チラミン、尿酸、バニリルマンデル酸（vma）、キサンチン、およびキサントシン。他の適切な化合物は、例えば、Jane，I．ら，J．Chrom．323:191-225（19 85）およびMusch，G．ら，J．Chrom．348:97-110（1985）に記載される。これらの化合物は、当該分野で公知の方法によって式T-L-Xの化合物中に取り込まれ得る。例えば、カルボン酸基を有する化合物は、アミン、ヒドロキシルなどと反応し得、 TとLとの間にアミド、エステル、および他の結合を形成する。上記の特性に加え、そして意図される検出法に関係なく、タグはモジュール式化学構造を有することが好ましい。このことは、コンビナトリアルケミストリーの技術を使用する多数の構造的に関連するタグの構築において助けとなる。例えば、T^ms基はいくつかの特性を有することが望ましい。それはT^ms含有部分が質量分析に供された場合に単一のイオン化電荷状態を維持する官能基（より単純には、「質量分析感度エンハンサー」基、すなわちMSSEと呼ばれる）を含むことが望ましい。またそれは、T^ms含有部分のファミリーにおける１つのメンバーとして機能し得ることが望ましく、ここでファミリーのメンバーは各々が異なる質量/ 電荷の比を有するが、質量分析器においてほぼ同一の感度を有する。従って、ファミリーのメンバーは同一のMSSEを有することが望ましい。化合物のファミリーの作製を可能にするために、モジュール式合成スキームを介してタグ反応部を生成することが好都合であると見出されており、その結果タグ成分自身はモジュールを含んでいると見なされる。 T^ms基の構造への好ましいモジュール式アプローチにおいて、T^msは以下の式を有する： T²-(J-T³-)_n- ここで、T²は、15〜500ダルトンの質量幅を有する、炭素および１個以上の水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンから形成される有機部分であり；T³は、50〜1000ダルトンの質量幅を有する、炭素および１個以上の水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンから形成される有機部分であり； Jは、直接の結合であるか、または以下のような官能基である：アミド、エステル、アミン、スルフィド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオエーテル、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、Schiff塩基、還元型Sc hiff塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミド、または炭素-炭素結合；そしてnは１〜50の範囲の整数であり、これによって、nが１より大きい場合、各T³およびJは独立して選択される。モジュラー構造T²-(J-T³-)_n-は、T-L-X化合物のファミリーへの好都合な入口を提供し、ここでファミリーの各メンバーは異なるT基を有する。例えば、TがT^ms であり、そして各ファミリーメンバーが望ましくは同一のMSSEを有する場合、T³ 基の１つはMSSE構造を提供する。T^msの質量に関してファミリーのメンバー間の変動性を提供するために、T²基はファミリーメンバーの間で変動し得る。例えば、１つのファミリーメンバーはT²=メチルを有し得るが、別のものはT²=エチルを有し得、そして別のものはT²=プロピルを有し得る、などである。質量に「著しい」飛躍または大きな飛躍を提供するために、T³基はT-L-Xに有意の（例えば、百または数百の）質量単位を付加するように設計され得る。そのようなT³基は、分子量幅調節基（「WRA」）と言われ得る。WRAは、限界幅を超えて広がる質量を有するT²の単一のセットと共に作用する場合、非常に有用である。単一のセットのT²基は、単に１以上のWRA T³基をT^ms中に取り込むことにより、幅広い質量を有するT^ms基を作製するために使用され得る。従って、単純な例を使用すると、１セットのT²基がT^msについて250〜340ダルトンの質量幅を与える場合、例示的な数である100ダルトンをT³基として有する単一のWRAの付加は、同一のセットのT²基を使用しながら、350〜440ダルトンの質量幅へのアクセスを提供する。同様に、２つの100ダルトンMWA基の付加（各々がT³基として）は、450 〜540ダルトンの質量幅へのアクセスを提供し、ここでこのWRA基の増加的な付加は継続され得、T^ms基について非常に大きな質量幅へのアクセスを提供する。式T² -(J-T³-)_n-L-Xの好ましい化合物は、式R_VMC-(R_WRA)_W-R_MSSE-L-Xを有し、ここで、VWCは「T²」基であり、そしてWRAおよびMSSE基の各々は「T³」基である。この構造は図12に図示されており、そしてT^msの調製への１つのモジュール式アプローチを表す。式T²−(J-T³-)_n-において、T²およびT³は、好ましくは以下から選択される：ヒドロカルビル、ヒドロカルビル-O-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-S-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-NH-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-アミド- ヒドロカルビレン、N-(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、N,N-ジ(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、ヒドロカルビルアシル-ヒドロカルビレン、ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択される）、置換へテロシクリルヒドロカルビル（ここで、へテロ原子は酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択され、そして置換基は以下から選択される：ヒドロカルビル、ヒドロカルビル-O-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-NH-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-S-ヒドロカルビレン、N-(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、N,N-ジ(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビルアシル-ヒドロカルビレン）。さらに、T²および/またはT³は、１個以上の水素がフッ素で置き換えられているような、以前に表記された任意の潜在的T²/T³基の誘導体であり得る。また、式T²-(J-T³-)_n-に関して、好ましいT³は式-G(R²)-を有し、ここでＧは単一のR²置換基を有するC_1-6アルキレン鎖である。従って、Gがエチレン（-CH₂- CH₂-）である場合、１個または２個のいずれかのエチレン炭素はR²置換基を有し、そしてR²は以下から選択される：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール縮合シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アラルキル、アリール置換アルケニルもしくはアルキニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換シクロアルキル、ビアリール、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アラルコキシ、アリール置換アルケノキシもしくはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノもしくはアルキニルアミノ、アリール置換アルキルアミノ、アリール置換アルケニルアミノもしくはアルキニルアミノ、アリールオキシ、アリールアミノ、N-アルキル尿素置換アルキル、N-アリール尿素置換アルキル、アルキルカルボニルアミノ置換アルキル、アミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル置換アルキル、ヘテロシクリル置換アミノ、カルボキシアルキル置換アラルキル、オキソカルボシクリル縮合アリール、およびヘテロシクリルアルキル；シクロアルケニル、アリール置換アルキルおよびアラルキル、ヒドロキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アミノ置換アルキル、(アリール置換アルキルオキシカルボニルアミノ)置換アルキル、チオール置換アルキル、アルキルスルホニル置換アルキル、(ヒドロキシ置換アルキルチオ)置換アルキル、チオアルコキシ置換アルキル、ヒドロカルビルアシルアミノ置換アルキル、ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、ヒドロカルビル置換へテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、アルキルスルホニルアミノ置換アルキル、アリールスルホニルアミノ置換アルキル、モルホリノアルキル、チオモルホリノアルキル、モルホリノカルボニル置換アルキル、チオモルホリノカルボニル置換アルキル、[N-(アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル)-またはN,N-(ジアルキル、ジアルケニル、ジアルキニル、もしくは(アルキル、アルケニル)-アミノ]カルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルケンアミノカルボニル、ヘテロシクリルアミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアルケンアミノカルボニル置換アルキル、N,N-[ジアルキル]アルキレンアミノカルボニル、N,N-[ジアルキル]アルキレンアミノカルボニル置換アルキル、アルキル置換へテロシクリルカルボニル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニルアルキル、カルボキシル置換アルキル、ジルキルアミノ置換アシルアミノアルキル、および以下から選択されるアミノ酸側鎖：アルギニン、アルバラギン、グルタミン、S-メチルシステイン、メチオニン、ならびにそれらの対応するスルホキシドおよびスルホン誘導体、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、tert-ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アラニン、オルニチン、ヒスチジン、グルタミン、バリン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸、β-シアノアラニン、およびアロトレオニン；アリニルおよびヘテロシクリルカルボニル、アミノカルボニル、アミド、モノまたはジアルキルアミノカルボニル、モノまたはジアリールアミノカルボニル、アルキルアリールアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、モノまたはジアシルアミノカルボニル、芳香族または脂肪族アシル、必要に応じて以下から選択される置換基によって置換されたアルキル：アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、モノまたはジアルキルアミノ、モノまたはジアリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、モノまたはジアシルアミノ、アルコキシ、アルケノキシ、アリールオキシ、チオアルコキシ、チオアルケノキシ、チオアルキノキシ、チオアリールオキシ、およびヘテロシクリル。式T²-(J-T³-)_n-L-Xの好ましい化合物は、以下の構造を有する：ここでGは(CH₂)_1-6であり、それによって、単一の「G」で表される１つのかつ唯一のCH₂基上の水素が-(CH₂)_c-アミド-T⁴に置き換えられ；T²およびT⁴は、式C_1-2 ₅ N_0-9O_0-9H_αF_βの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、C、N 、および0原子の他の満たされていない結合価を満たすのに十分であり；アミドは以下の式であり：ここでR¹は水素またはC_1-10アルキルであり；cは０〜４の範囲の整数であり；そしてnは１〜50の範囲の整数であり、これによって、nが１より大きい場合、G、c 、アミド、R¹、およびT⁴は独立して選択される。さらに好ましい実施態様において、式T²-(J-T³-)_n-L-Xの化合物は以下の構造を有する：ここでT⁵は、式C_1-25N_0-9O_0-9H_αF_βの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、C、N、およびO原子の他の満たされていない結合価を満たすのに十分であり；そしてT⁵は三級または第四級アミンまたは有機酸を含み；mは０〜4 9の範囲の整数であり、そしてT²、T⁴、R¹、L、およびXは以前に定義されている。式T²-(J-T³-)_n-L-Xを有する別の好ましい化合物は、以下の特定の構造を有する：ここでT⁵は、式C_1-25N_0-9O_0-9H_αF_βの有機部分であり、それによって、αおよびβの合計は、C、N、およびO原子の他の満たされていない結合価を満たすのに十分であり；そしてT⁵は三級または第四級アミンまたは有機酸を含み；mは０〜4 9の範囲の整数であり、そしてT²、T⁴、c、R¹、「アミド」、L、およびXは以前に定義されている。 T⁵基を有する上記の構造において、-アミド-T⁵は、好ましくは以下の１つであり、これらは有機酸を「G」から伸びる遊離のアミノ基と反応させることにより好都合に調製され得る：上記の化合物がT⁵基を有し、そして「G」基が遊離のカルボキシル基（またはそれらの反応性等価体）を有する場合、以下が好ましい-アミド-T⁵基であり、これらは適切な有機アミンを「G」から伸びる遊離のカルボキシル基と反応させることにより好都合に調製され得る：本発明の３つの好ましい実施態様において、T-L-MOIは以下の構造を有する：あるいは以下の式を有する：あるいは以下の式を有する：ここでT²およびT⁴は、式C_1-25N_0-9O_0-9S_0-3P_0-3H_αF_βI_δの有機部分であり、それによって、α、β、およびδの合計は、C、N、O、S、およびP原子の他の満たされていない結合価を満たすのに十分であり；Gは(CH₂)_1-6であり、ここで各Gで表されるCH₂基上の１つのそして唯一の水素は-(CH₂)_c-アミド-T⁴に置き換えられており；アミドは以下の式であり：ここでR¹は水素またはC_1-10アルキルであり；cは０〜４の範囲の整数であり；「 C₂-C₁₀」は２〜10の炭素原子を有するヒドロカルビレン基を表し、「ODN-3'-OH 」は末端３'ヒドロキシル基を有する核酸フラグメント（すなわち、核酸フラグメントの３'末端以外において(C₁-C₁₀)に結合した核酸フラグメント）を表し；そしてnは１〜50の範囲の整数であり、これによって、nが１より大きい場合、G 、c、アミド、R¹、およびT⁴は独立して選択される。好ましくは、単一の炭素原子に結合した３個のヘテロ原子は存在しない。ここでT²およびT⁴は、式C_1-25N_0-9O_0-9H_αF_βの有機部分であり、それによって、αとβとの合計は、C、N、およびO原子の他の満たされていない結合価を満たすのに十分であり；Gは(CH₂)_1-6であり、ここで各Gで表されるCH₂基上の１つのそして唯一の水素は-(CH₂)_c-アミド-T⁴に置き換えられており；アミドは以下の式であり：ここでR¹は水素またはC_1-10アルキルであり；cは０〜４の範囲の整数であり；「 ODN-3'-OH」は末端３'ヒドロキシル基を有する核酸フラグメントを表し；そして nは１〜50の範囲の整数であり、nが１より大きい場合、G、c、アミド、R¹、およびT⁴は独立して選択される。上記で示されたT²-C(=O)-N(R¹)-基を含有する構造において、この基は式HN(R¹ )-のアミンを以下から選択される有機酸（これらは単に例示的であって、潜在的な有機酸の余すところのないリストを構成していない）と反応させることにより形成され得る：ギ酸、酢酸、プロピオール酸、プロピオン酸、フルオロ酢酸、2- ブチン酸、シクロプロパンカルボン酸、酪酸、メトキシ酢酸、ジフルオロ酢酸、 4-ペンチン酸、シクロブタンカルボン酸、3,3-ジメチル酢酸、吉草酸、N,N-ジメチルグリシン、N-ホルミル-Gly-OH、エトキシ酢酸、(メトキシチオ)酢酸、ピロール-2-カルボン酸、3-フロイン酸、イソオキサゾール-5-カルボン酸、trans-3- ヘキセン酸、トリフルオロ酢酸、ヘキサン酸、Ac-Gly-OH、2-ヒドロキシ-2-メチル酪酸、安息香酸、ニコチン酸、2-ピラジンカルボン酸、1-メチル-2-ピロールカルボン酸、2-シクロペンテン-1-酢酸、シクロペンチル酢酸、(S)-(-)-2-ピロリドン-5-カルボン酸、N-メチル-L-プロリン、ヘプタン酸、Ac-b-Ala-OH、2-エチル-2-ヒドロキシ酪酸、2-(2-メトキシエトキシ)酢酸、p-トルイン酸、6-メチルニコチン酸、5-メチル-2-ピラジンカルボン酸、2,5-ジメチルピロール-3-カルボン酸、4-フルオロ安息香酸、3,5-ジメチルイソオキサゾール-4-カルボン酸、3 -シクロペンチルプロピオン酸、オクタン酸、N,N-ジメチルスクシナミン酸(succ inamic acid)、フェニルプロピオン酸、ケイヒ酸、4-エチル安息香酸、p-アニス酸、1,2,5-トリメトキシピロール-3-カルボン酸、3-フルオロ-4-メチル安息香酸、Ac-DL-プロパルギルグリシン、3-(トリフルオロメチル)酪酸、1-ピペリジンプロピオン酸、N-アセチルプロリン、3,5-ジフルオロ安息香酸、Ac-L-Val-OH、インドール-2-カルボン酸、2-ベンゾフランカルボン酸、ベンゾトリアゾール-5-カルボン酸、4-n-プロピル安息香酸、3-ジメチルアミノ安息香酸、4-エトキシ安息香酸、4-(メチルチオ)安息香酸、N-(2-フロイル)グリシン、2-(メチルチオ)ニコチン酸、3-フルオロ-4-メトキシ安息香酸、Tfa-Gly-OH、2-ナフトエ酸、キナルジン酸、Ac-L-Ile-OH、3-メチルリンデン-2-カルボン酸、2-キノキサリンカルボン酸、1-メチルインドール-2-カルボン酸、2,3,6-トリフルオロ安息香酸、N-ホルミル-L-Met-OH、2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸、4-n-ブチル安息香酸、N-ベンゾイルグリシン、5-フルオロインドール-2-カルボン酸、4-n-プロポキシ安息香酸、4-アセチル-3,5-ジメチル-2-ピロール安息香酸、3,5-ジメトキシ安息香酸、2,6-ジメトキシニコチン酸、シクロヘキサンペンタン酸、2-ナフチル酢酸、4-(1H-ピロール-1-イル)安息香酸、インドール-3-プロピオン酸、m-トリフルオロメチル安息香酸、5-メトキシインドール-2-カルポン酸、4-ペンチル安息香酸、Bz-b-Ala-OH、4-ジエチルアミノ安息香酸、4-n-ブトキシ安息香酸、3- メチル-5-CF3-イソオキサゾール-4-カルボン酸、(3,4-ジメトキシフェニル)酢酸、4-ビフェニルカルボン酸、ピバロール-Pro-OH、オクタノール-Gly-OH、(2-ナフトキシ)酢酸、インドール-3-酪酸、4-(トリフルオロメチル)フェニル酢酸、5- メトキシインドール-3-酢酸、4-(トリフルオロメトキシ)安息香酸、Ac-L-Phe-OH 、4-ペンチルオキシ安息香酸、Z-Gly-OH、4-カルボキシ-N-(フル-2-イルメチル) ピロリジン-2-オン、3,4-ジエトキシ安息香酸、2,4-ジメチル-5-CO₂Et-ピロール -3-カルボン酸、N-(2-フルオロフェニル)スクシナミン酸、3,4,5-トリメトキシ安息香酸、N-フェニルアントラニル酸、3-フェノキシ安息香酸、ノナノイル-Gly -OH、2-フェノキシピリジン-3-カルボン酸、2,5-ジメチル-1-フェニルピロール- 3-カルボン酸、trans-4-(トリフルオロメチル)ケイヒ酸、(5-メチル-2-フェニルオキサゾール-4-イル)酢酸、4-(2-シクロヘキセニルオキシ)安息香酸、5-メトキシ-2-メチルインドール-3-酢酸、trans-4-コチニンカルボン酸、Bz-5-アミノ吉草酸、4-ヘキシルオキシ安息香酸、N-(3-メトキシフェニル)スクシナミン酸、Z- Sar-OH、4-(3,4-ジメトキシフェニル)酪酸、Ac-o-フルオロ-DL-Phe-OH、N-(4-フルオロフェニル)グルタミン酸、4'-エチル-4-ビフェニルカルボン酸、1,2,3,4- テトラヒドロアクリジンカルボン酸、3-フェノキシフェニル酢酸、N-(2,4-ジフルオロフェニル)スクシナミン酸、N-デカノイル-Gly-OH、(+)-6-メトキシ-a-メチル-2-ナフタレン酢酸、3-(トリフルオロメトキシ)ケイヒ酸、N-ホルミル-DL-L eu-OH、(R)-(+)-a-メトキシ-a-(トリフルオロメチル)フェニル酢酸、Bz-DL-Leu- OH、4-(トリフルオロメトキシ)フェノキシ酢酸、4-ヘプチルオキシ安息香酸、2, 3,4-トリメトキシケイヒ酸、2,6-ジメトキシベンゾイル-Gly-OH、3-(3,4,5-トリメトキシフェニル)プロピオン酸、2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェノキシ酢酸、N-(2, 4-ジフルオロフェニル)グルタミン酸、N-ウンデカノイル-Gly-OH、2-(4-フルオロベンジル)安息香酸、5-トリフルオロメトキシインドール-2-カルボン酸、N-(2 ,4-ジフルオロフェニル)ジグルコラミン酸、Ac-L-Trp-OH、Tfa-L-フェニルグリシン-OH、3-ヨード安息香酸、3-(4-n-ペンチルベンゾイル)プロピオン酸、2-フェニル-4-キノリンカルボン酸、4-オクチルオキシ安息香酸、Bz-L-Met-OH、3,4, 5-トリエトキシ安息香酸、N-ラウロイル-Gly-OH、3,5-ビス(トリフルオロメチル )安息香酸、Ac-5-メチル-DL-Trp-OH、2-ヨードフェニル酢酸、3-ヨード-4-メチル安息香酸、3-(4-n-ヘキシルベンゾイル)プロピオン酸、N-ヘキサノイル-L-Phe -OH、4-ノニルオキシ安息香酸、4'-(トリフルオロメチル)-2-ビフェニルカルボン酸、Bz-L-Phe-OH、N-トリデカノイル-Gly-OH、3,5-ビス(トリフルオロメチル) フェニル酢酸、3-(4-n-ヘプチルベンゾイル)プロピオン酸、N-ヘプタノイル-L-P he-OH、4-デシルオキシ安息香酸、N-(α,α,α-トリフルオロ-m-トリル)アントラニル酸、ニフルム酸(niflumic acid)、4-(2-ヒドロキシヘキサフルオロイソプロピル)安息香酸、N-ミリストイル-Gly-OH、3-(4-n-オクチルベンゾイル)プロピオン酸、N-オクタノイル-L-Phe-OH、4-ウンデシルオキシ安息香酸、3-(3,4,5-トリメトキシフェニル)プロピオニル-Gly-OH、8-ヨードナフトエ酸、N-ペンタデカノイル-Gly-OH、4-ドデシルオキシ安息香酸、N-パルミトイル-Gly-OH、およびN- ステアロイル-Gly-OH。これらの有機酸は、以下の１社以上から入手可能である：Advanced Chem Tech，Louisville，KY；Bachem Bioscience Inc.，Torrance， CA；Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA；Farchan Laboratories In c.，Gainesville FL；Lancaster Synthesis，Windham NH；およびMayBridge Che mical Company(c/o Ryan Scientific)，Columbia，SC。これらの企業からのカタログは、酸を同定するために上記で使用されている省略形を使用する。 f．タグを調製するための手段としてのコンビナトリアルケミストリーコンビナトリアルケミストリーは、大きな化学ライブラリの産生を導く一種の合成戦略である（例えば、PCT出願公表第WO 94/08051号を参照のこと）。これらのコンビナトリアルライブラリは、目的の分子（MOI）の同定のためのタグとして使用され得る。コンビナトリアルケミストリーは、種々の実在分子の巨大なアレイを生じるための、変化する構造の１組の異なる「構築ブロック」の、互いへの体系的かつ反復的な共有結合として定義され得る。構築ブロックは、以下のような多くの天然に存在する形態および合成の形態をとり得る：求核体、求電子体、ジエン、アルキル化剤またはアシル化剤、ジアミン、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質、有機モノマー、シントン、および上記形態の組合せ。構築ブロックを結合するために使用される化学反応は、アルキル化、アシル化、酸化、還元、加水分解、置換、脱離、付加、環化、縮合などである。このプロセスは化合物のライブラリを産生し得、それらはオリゴマーか、非オリゴマーか、またはそれらの組合せである。オリゴマーである場合、化合物は、分枝であるか、分枝でないか、または環状であり得る。組合せ方法によって調製され得るオリゴマー構造の例には、以下が含まれる：オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、ポリリピド、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリエーテル、ポリ（リン誘導体）(例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスファイト、ホスフィンアミドなど)、およびポリ（硫黄誘導体）(例えば、スルホン、スルホネート、スルファイト、スルホンアミド、スルフェンアミドなど)。１つの共通のタイプのオリゴマーコンビナトリアルライブラリは、ペプチドコンビナトリアルライブラリである。ペプチド化学および分子生物学における最近の技術革新により、数千万〜数億の異なるペプチド配列からなるライブラリの調製および使用が可能になっている。そのようなライブラリは、３つの広いカテゴリーに分類され得る。ライブラリの１つのカテゴリーは、可溶性の非支持体結合ペプチドライブラリの化学合成に関する（例えば、Houghtenら，Nature 354:84 ，1991）。第２のカテゴリーは、プラスチックピン、樹脂ビーズ、または綿のような支持体上に提示される、支持体結合ペプチドライブラリの化学合成に関する（Geysenら，Mol．Immunol．23:709，1986；Lamら，Nature 354:82，1991；Eich IerおよびHoughten，Biochemistry 32:11035，1993）。これら最初２つのカテゴリーにおいて、構築ブロックは、典型的にはL-アミノ酸、D-アミノ酸、非天然型アミノ酸、またはそれらのいくつかの混合物もしくは組合せである。第３のカテゴリーは、糸状ファージ粒子またはプラスミドの表面上のペプチドまたはタンパク質を調製するために、分子生物学アプローチを使用する（scottおよびCraig， Curr．Opinion Biotech．5:40，1994）。可溶性の非結合ペプチドライブラリは、タグとしての使用を含む、多くの適用に適切なようである。ペプチドライブラリにおける化学的多様性の利用可能なレパートリーは、過メチル化のような工程によって拡張され得る（Ostreshら，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 91:11138，1 994）。ペプチドコンビナトリアルライブラリの多数の改変体が、ペプチド骨格が修飾される場合、および/またはアミド結合が模倣基に置換されている場合に可能である。使用され得るアミド模倣基には、尿素、ウレタン、およびカルボニルメチレン基が含まれる。側鎖がα炭素よりもむしろ各アミノ酸のアミド窒素から生じるような骨格の再構築は、ペプトイドとして公知の化合物のライブラリを与える（Simonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:9367，1992）。他の共通のタイプのオリゴマーコンビナトリアルケミストリーは、構築ブロックが天然に存在するかまたは非天然型のヌクレオチドまたは多糖誘導体のいくつかの形態である場合、オリゴヌクレオチドコンビナトリアルケミストリーである。これには種々の有機基および無機基がリン酸結合を置換し得る場合、ならびに窒素または硫黄がエーテル結合中の酸素を置換する場合が含まれる（Schneider ら，Biochem．34:9599，1995；Freierら，J．Med．Chem．38:344，1995；Frank ，J．Biotechnology 41:259，1995；Schneiderら，公表PCT第WO 942052号；Ecke rら，Nucleic Acids Res．21:1853，1993）。より最近は、非オリゴマーの小分子化合物の集合体の組合せ生成が記載されている（DeWittら，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 90:690，1993；Bunlnら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA 91:4708，1994）。小分子ライブラリへの仕上げに適切な構造は、以下のような広い種類の有機分子を包含する：例えば、ヘテロ環状、芳香族、脂環式、脂肪族、ステロイド、抗生物質、酵素阻害剤、リガンド、ホルモン、薬剤、アルカロイド、オピオイド、テルペン、ポルフィリン、トキシン、触媒、ならびにそれらの組合せ。 g．タグのコンビナトリアル合成のための特異的方法多様な組のアミン含有MSタグの調製および使用のための２つの方法を以下に概説する。両方法において、コンビナトリアルケミストリーの技術を使用して多数のタグ化リンカーの同時並行合成を可能にするために、固相合成が使用される。第１の方法において、オリゴヌクレオチドからのタグの最終的な切断は、カルボキシルアミドの遊離を生じる。第２の方法において、タグの切断はカルボン酸を生成する。これらの方法において使用された化学的成分および結合要素を、以下のように略記する： R ＝樹脂 FMOC ＝フルオレニルメトキシカルボニル保護基 All ＝アリール保護基 CO₂H ＝カルボン酸基 CONH₂ ＝カルボン酸アミド基 NH₂ ＝アミノ基 OH ＝ヒドロキシル基 CONH ＝アミド結合 COO ＝エステル結合 NH₂-Rink-CO₂H ＝ 4-[(α-アミノ)-2,4-ジメトキシベンジル]-フェノキシ酪酸（Rinkリンカー） OH-1MeO-CO₂H ＝ (4-ヒドロキシメチル)フェノキシ酪酸 OH-2MeO-CO₂H ＝ (4-ヒドロキシメチル-3-メトキシ)フェノキシ酢酸 NH₂-A-COOH ＝側鎖に脂肪族または芳香族アミン官能基を有するアミノ酸 X1...Xn-COOH ＝独特の分子量を有するn種類のカルボン酸の組 oligol...oligo(n) ＝ n個のオリゴヌクレオチドの組 HBTU ＝ O-ベンゾトリアゾール−1-イル-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート方法１における工程の順序は以下の通りである： OH-2MeO-CONH-R ↓ FMOC-NH-Rink-CO₂H；カップリング（例えば、HBTU） FMOC-NH-Rink-COO-2MeO-CONH-R ↓ ピペリジン（FMOCを除去） NH₂-Rink-COO-2MeO-CONH-R ↓ FMOC-NH-A-COOH；カップリング（例えば、HBTU） FMOC-NH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R ↓ ピペリジン（FMOCを除去） NH₂-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R ↓ n個のアリコートに分割 ↓↓↓↓↓ n個の異なる酸X1...Xn-COOHとカップリング X1...Xn-CONH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R ↓↓↓↓↓ １％TFAを用いて樹脂からタグ化リンカーを切断 X1...Xn-CONH-A-CONH-Rink-CO₂H ↓↓↓↓↓ n個のオリゴ（oligol...oligo(n)）とカップリング（例えば、Pfpエステルを介して） X1...Xn-CONH-A-CONH-Rink-CONH-oligol...oligo(n) ↓ タグ化オリゴをプール ↓ 配列決定反応を実行 ↓ 配列決定反応由来の異なる長さのフラグメントを分離（例えば、HPLCまたはCEを介して） ↓ 25％〜100％TFAを用いてリンカーからタグを切断 X1...Xn-CONH-A-CONH ↓ 質量分析法により分析方法２における工程の順序は以下の通りである： OH-1MeO-CO₂-All ↓ FMOC-NH-A-CO₂H；カップリング（例えば、HBTU） FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO₂-All ↓ パラジウム（アリールを除去） FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO₂H ↓ OH-2MeO-CONH-R；カップリング（例えば、HBTU） FMOC-NH-A-COO−1MeO-COO-2MeO-CONH-R ↓ ピペリジン（FMOCを除去） NH₂-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R ↓ n個のアリコートに分割 ↓↓↓↓↓ n個の異なる酸X1...Xn-COOHとカップリング X1...Xn-CONH-A-COO−1MeO-COO-2MeO-CONH-R ↓↓↓↓↓ １％TFAを用いて樹脂からタグ化リンカーを切断 X1...Xn-CONH-A-COO−1MeO-CO₂H ↓↓↓↓↓ n個のオリゴ（oligol...oligo(n)）とカップリング（例えば、Pfpエステルを介して） X1...Xn-CONH-A-COO-1MeO-CONH-oligol...oligo(n) ↓ タグ化オリゴをプール ↓ 配列決定反応を実行 ↓ 配列決定反応由来の異なる長さのフラグメントを分離（例えば、HPLCまたはCEを介して） ↓ 25％〜100％TFAを用いてリンカーからタグを切断 X1...Xn-CONH-A-CO₂H ↓ 質量分析法により分析２．リンカー本明細書において使用される「リンカー」成分（またはＬ）は、「タグ」（またはＴ）を「目的の分子」（またはMOI）に共有結合性の化学的結合を介して連結するために使用される直接的な共有結合または有機的な化学基のいずれかを意味する。さらに、直接的な結合それ自身、またはリンカー成分内の一つ以上の結合は、T-L-X化合物（これはMOI成分を含む）の残りからＴが遊離される（言い換えれば、切断される）条件下で切断可能である。Ｔ内に存在するタグ可変成分は、切断条件に対して安定であるべきである。好ましくは、切断は、数分以内に、および好ましくは約15秒以下の内に迅速に達成され得る。一般に、リンカーは、タグの大きなセットの各々をMOIの類似の大きなセットの各々に連結するために使用される。代表的には、単一のタグ−リンカーの組合せは各MOIに結合される（種々のT-L-MOIを与えるために）が、いくつかの場合において、一つより多いタグ−リンカーの組合せは、各個々のMOIに結合され得る（種々の(T-L)n-MOIを与えるために）。本発明の別の実施態様において、二つ以上のタグが、リンカー上の複数の独立的な部位を介して単一のリンカーに結合され、次いでこの複数のタグ−リンカーの組合せは、個々のMOIに結合される（種々の(T)n-L-MOIを与えるために）。タグ化MOIのセットの種々の操作の後で、特定の化学的および／または物理的条件が、リンカー中の一つ以上の共有結合を切断するために使用され、これは、 MOIからのタグの遊離を生じる。切断可能な結合は、タグ、リンカー、およびMOI が、共に連結される場合、形成される同一の結合のいくつかがあってもよいし、なくてもよい。リンカーの設計は、大部分において、切断が達成され得る条件を決定する。従って、リンカーは、それらも特に影響を受けやすい切断条件によって同定され得る。リンカーが光不安定性（photolabile）である（すなわち、化学放射線への曝露によって切断される傾向がある）場合、リンカーはL^hVと命名され得る。同様に、命名L^acid、L^base、L^[O]、L^[R]、L^enz、L^elc、L^Δ、およびL^SS が、酸、塩基、化学的酸化、化学的還元、酵素の触媒活性（より単純には「酵素」）、電気化学的酸化または還元、高温（「熱」）、およびチオール交換のそれぞれに特に影響を受けやすいリンカーに言及するために使用され得る。リンカーの特定の型は、単一の型の切断条件に対して不安定であるが、一方リンカーの他の型はいくつかの型の切断条件に対して不安定である。さらに、複数のタグ（(T)n-L-MOI型構造を与える）を結合し得るリンカーにおいて、タグ結合部位の各々は、異なる切断条件に不安定に成り得る。例えば、リンカーに結合される二つのタグを有するそのリンカーにおいて、タグの一方は塩基に対してのみ不安定に成り得、そして他方は、光分解に対してのみ不安定に成り得る。本発明において有用なリンカーは、いくつかの属性を有する：１）リンカーは化学的ハンドル（L_h）を有し、それを介してリンカーはMOIに結合され得る。２）リンカーは、第二の別の化学的ハンドル（L_h）を有し、それを介してタグはリンカーに結合する。もし複数のタグが単一のリンカーに結合されるならば（ (T)n-L-MOI型構造）、次いで別のハンドルが各タグについて存在する。３）リンカーは、Ｔ含有部分が化合物の残り（これはMOIを含む）から遊離されるように切断を可能にする条件を例外として、供される全ての操作に対して安定である。従って、リンカーは、タグのリンカーへの結合の間、リンカーのMOI への結合の間、そしてタグおよびリンカー（T-L）がMOIに結合される間のMOIの任意の操作の間安定である。４）リンカーは、T-LがMOIに結合される間、MOI上で行われる操作に有意に干渉しない。例えば、T-Lがオリゴヌクレオチドに結合される場合、T-Lは、オリゴヌクレオチド上で行われる全てのハイブリダイゼーションまたは酵素反応（例えばPCR）に有意に干渉してはならない。同様に、T-Lが抗体に結合される場合、それは抗体による抗原認識に有意に干渉してはならない。５）タグの検出可能性に悪影響を与えない物理的または化学的プロセスを使用して、化合物の残りからのタグの切断は、高度に制御された様式で生じる。任意の所定のリンカーについて、リンカーが広範な種々のMOIに結合可能で、そして広範な種々のタグが、リンカーに結合可能であることが望ましい。このような柔軟性は、一旦調製されれば、いくつかの異なるセットのMOIを用いて使用されるT-L結合物のライブラリーを可能にするので、利点に富む。上記に説明されたように、好ましいリンカーは以下の式を有する。ここで、各L_hは、リンカーをタグ反応物および目的の反応物の分子と連結するために使用され得る反応性ハンドルである。L²はリンカーに不安定性を与えるので、L²はリンカーの不可欠な部分である。L¹およびL³は、ハンドルL_hからL²を分離するのに効果的に役立つ任意の基である。 L¹（これは、定義によって、L³よりＴに近い）は、必要とされる不安定部分L² からＴを分離するために役立つ。この分離は、切断反応がＴ含有部分の構造においてランダムな変化を生じ得る特定の反応性種（例えば、フリーラジカル）を生じる場合、有用であり得る。切断部位が、Ｔ含有部分からさらに離れている場合、切断部位で形成された反応性種が、Ｔ含有部分の構造を破壊する減少した可能性がある。さらに、L¹における原子は、代表的には、Ｔ含有部分に存在する場合、これらL¹原子は、Ｔ含有部分に望ましい質で特性を付与し得る。例えば、Ｔ含有部分が、T^m含有部分であり、そして妨害された（hindered）アミンがT^m含有部分の構造の部分として望ましく存在する（例えば、MSSEとして作用する）場合、妨害されたアミンはL¹不安定部分に存在し得る。他の例において、L¹および／またはL³は、単にリンカー成分中に存在し得る。なぜならば、リンカーの商業的な供給業者は、そのようなL¹および／またはL³基を有する形態でリンカーを販売するように選択しているからである。そのような例において、L¹および／またはL³基は、それらを組み込む化合物に対して性能利点を何ら特に寄与し得ないが、L¹および／またはL³基を有するリンカーを使用することに害はない（これらの基が、切断反応を阻害しない限り）。従って、本発明は、L¹および／またはL³基がリンカー成分中に存在することを可能にする。 L¹および／またはL³基は、直接的な結合（この場合において、基は実際には存在しない）、ヒドロカルビレン基（例えば、アルキレン、アリーレン、シクロアルキレンなど）、-O-ヒドロカルビレン（例えば、-O-CH₂-、0-CH₂CH(CH₃)-など）、またはヒドロカルビレン-(O-ヒドロカルビレン)_w-（ここでＷは、１〜約10 の範囲にある整数である）（例えば、-CH₂-O-Ar-、CH₂-(O-CH₂CH₂)₄-など）であり得る。固相合成法の出現があったので、特定の反応条件に不安定なリンカーに関する多くの文献が、展開されてきた。代表的な固相合成において、固体支持体は、反応性部位に不安定なリンカーを介して結合され、そして合成されるべき分子は、反応性部位で生成される。分子が完全に合成された場合、固体支持体−リンカー −分子構築物は、固体支持体から分子を遊離する切断条件に供される。この状況における使用のために、開発されてきた不安定なリンカー（またはこの状況において使用され得る）はまた、本発明におけるリンカー反応物として容易に使用され得る。 Lloyd-Willlams，Pら、「Convergent Solid-Phase Peptide Synthesis」、Tet rahedron Report No．347，49(48):11065-11133(1993)は、化学放射線（すなわち、光分解）ならびに酸、塩基、および他の切断条件に不安定なリンカーの広範な議論を提供する。不安定なリンカーについての情報のさらなる供給源は当該分野で周知である。上記のように、異なるリンカー設計は、異なる特定の物理的または化学的条件下で切断可能性（「不安定性」）を与える。種々の設計のリンカーを切断するのに役立つ条件の例は、酸、塩基、酸化、還元、フッ素、チオール交換、光分解、および酵素的な条件を含む。上記のリンカーについての一般的な基準を満足する切断可能なリンカーの例は当業者に周知であり、そしてPierce(Rockford,IL)から入手可能なカタログにおいて見出されるリンカーを含む。例は、以下を含む：・エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、ヒドロキルシアミンによって切断可能である（37℃にて３〜６時間で1M）アミン反応性架橋試薬；・ジスクシンイミジル酒石酸（DST）およびスルホ-DSTである（これは0.015M 過ヨウ素酸ナトリウムによって切断可能であるアミン反応性架橋試薬；・ビス[2-(スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン（BSOC OES）およびスルホ-BSOCOES（これらは塩基（pH11.6）によって切断可能なアミン反応性架橋試薬である）；・1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ(プロピオンアミド))ブタン（DPDPB）（チオール交換または還元によって切断可能であるピリジルジチオール架橋剤）；・N-[4-(p-アジドサリチルアミド)-ブチル]-3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド（APDP）（チオール交換または還元によって切断可能であるピリジルジチオール架橋剤）；・ビス-[β-4-(アジドサリチルアミド)エチル]-ジスルフィド（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）；・N-スクシンイミジル-(4-アジドフェニル)-l,3'ジチオプロピオネート（SADP ）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性の架橋剤）；・スルホスクシンイミジル-2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド) エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（SAED）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）；・スルホスクシンイミジル-2-(m-アジド-O-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3' ジチオプロピオネート（SAND）（チオール交換または還元によって切断可能である光反応性架橋剤）。タグを放出するために使用され得る切断可能なリンカーおよび切断条件の他の例は、以下である。シリル結合基は、フッ素によってかまたは酸条件下で切断され得る。3-、4-、5-、または6-置換-2-ニトロベンジルオキシまたは2-、3-、5- 、または6-置換-4-ニトロベンジルオキシ結合基は、光子源によって切断さ得る（光分解）。3-、4-、5、または6-置換-2-アルコキシフェノキシまたは2-、3-、 5-、または6-置換-4-アルコキシフェノキシ結合基は、Ce(NH₄)₂(NO₃)₆（酸化）によって切断され得る。NCO₂（ウレタン）リンカーは、水酸化物（塩基）、酸、またはLiALH₄(還元）によって切断され得る。3-ペンテニル、2-ブテニル、または1-ブテニル結合基は、O₃、O_SO₄/IO₄ ^-またはKMnO₄(酸化）によって切断され得る。2-[3-、4-、または5-置換フリル]オキシ結合基は、O₂、Br₂、MeOHまたは酸によって切断され得る。他の不安定な結合基の切断のための条件は、以下を含む：t-アルキルオキシ結合基は酸によって切断され得る；メチル（ジアルキル）メトキシまたは4-置換-2 -アルキル-1,3-ジオキサレン（dioxlane）-2-イル結合基は、H₃O⁺によって切断され得る；2-シリルエトキシ結合基は、フッ素または酸によって切断され得る； 2-(X)-エトキシ（ここでX=ケト、エステル、アミド、シアノ、NO₂、スルフィド、スルホキシド、スルホン）結合基は、アルカリ条件下で切断され得る；2-、3- 、4-、5-、または6-置換-ベンジルオキシ結合基は、酸または還元条件により切断され得る；2-ブテニルオキシ基は、(Ph₃P)₃RhCl(H)によって切断され得る、3- 、 4-、5-、または6-置換-2-ブロモフェノキシ結合基は、Li、Mg、またはBuLiによって切断され得る；メチルチオメトキシ結合基はHg²⁺によって切断され得る；2- (X)-エチルオキシ（ここでX=ハロゲン）結合基はZnまたはMgによって切断され得る；2-ヒドロキシエチルオキシ結合基は、酸化（例えば、Pb(OAc)₄を用いて）切断され得る。好ましいリンカーは、酸または光分解によって切断されるリンカーである。固相ペプチド合成のために開発されてきたいくつかの酸不安定リンカーは、タグを MOIに架橋するに有用である。これらのリンカーのいくつかは、Lloyd-Williams ら(Tetrahedron 49:11065-11133，1993)による最新の総説によって記載される。リンカーの一つの有用な型は、p-アルコキシベンジルアルコールに基づき、その内の二つ、4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸および4-(4-ヒドロキシメチル-3- メトキシフェノキシ)酪酸は、Advanced Chem Tech（Louisville，KY）から入手可能である。両方のリンカーが、ベンジルアルコールへのエステル結合を介してタグに結合され得、カルボン酸へのアミド結合を介してアミン含有MOIと結合され得る。これらの分子によって結合されたタグは、多様な濃度のトリフルオロ酢酸を用いてMOIから遊離される。これらの分子の切断は、タグ上のカルボン酸の遊離を生じる。関連するリンカー（例えば、2,4-ジメトキシ-4'-(カルボキシメチルオキシ)-ベンズヒドリルアミン（Advanced Chem TechからFMOC保護形態で入手可能）を介して結合されたタグの酸切断は、遊離されたタグ上のカルボン酸アミドの遊離を生じる。本願にとって有用な光不安定性リンカーはまた、固相ペプチド合成のために最も開発された部分であった（Lloyd-Williams総説を参照のこと）。これらのリンカーは、通常、2-ニトロベンジルエステルまたは2-ニトロベンジルアミドに基づく。文献において最近報告されている光不安定性リンカーの二つの例は、4-(4-( 1-Fmoc-アミノ)エチル)-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ)ブタン酸（HolmesおよびJones、J．Org．Chem．60:2318-2319，1995）および3-(Fmoc-アミノ)-3-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸（Brownら、Molecular Diversity 1:4-12，1995）である。両リンカーは、MOI上でカルボン酸を介してアミンに結合され得る。リンカーへのタグの結合は、タグ上のカルボン酸とリンカー上のアミンとの間でアミドを形成することによって作製される。光不安定性リンカーの切断は、通常、強度で350nm波長のUV光および当業者に公知の時間を用いて行われる。リンカーの切断は、タグ上の一級アミドの遊離を生じる。感光性リンカーの例は、ニトロフェニルグリシンエステル、exoおよびendo-2-ベンゾノルボルネリルクロライドおよびメタンスルホネート、および3-アミノ-3(2-ニトロフェニル)プロピオン酸を含む。酵素的切断の例には、エステル結合を切断するエステラーゼ、ホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼ、ペプチド結合を切断するプロテアーゼなどが挙げられる。好ましいリンカー成分は以下に示すようなオルト-ニトロベンジル構造を有する；ここでａ、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つの炭素原子は、-L³-Xで置換され、そしてL¹（好ましくは直接的な結合である）は、上記構造中のN(R¹)の左に存在する。このようなリンカー成分は、「ａ」と標識された炭素とN(R¹)間の結合の選択的な光誘導切断に感受性である。R¹の同一性は、切断反応にとって代表的には重要ではないが、しかしR¹は、好ましくは、水素およびヒドロカルビルより選択される。本発明は、上記の構造において、-N(R¹)が、-O-で置き換えられ得る。さらに上記構造において、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つ以上が、必要に応じて、アルキル、アルコキシ、フッ素、クロライド、ヒドロキシル、カルボキシレート、またはアミドで置換され得、ここでこれらの置換基は、各存在で独立して選択される。化学ハンドルL_hを有するさらに好ましいリンカー成分は、以下の構造を有する ; ここで、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅ位の一つ以上が、水素、アルキル、アルコキシ、フッ素、クロライド、ヒドロキシル、カルボキシレート、アミドで置換され、R¹ は水素またはヒドロカルビルであり、そしてR²は、-OHまたは別の部分とのカップリングのためにカルボン酸を保護しているかまたは活性化する基である。フルオロカーボンおよびヒドロフルオロカーボンは、別の部分とのカップリングへけてカルボン酸を活性化する好適な基である。３．目的の分子（MOI） MOIの例には、核酸、または核酸アナログ（例えば、PNA）、核酸のフラグメント（すなわち、核酸フラグメント）、合成核酸またはフラグメント、オリゴヌクレオチド（例えば、DNAまたはRNA）、タンパク質、ペプチド、抗体、または抗体フラグメント、レセプター、レセプターリガンド、リガンド対メンバー、サイトカイン、ホルモン、オリゴ糖、合成有機分子、薬物およびそれらの組合せが挙げられる。好ましいMOIの例には、核酸フラグメントが挙げられる。好ましい核酸フラグメントは、ベクターが、塩基配列決定に使用される場合、ベクターに存在する配列に相補的なプライマー配列である。好ましくは、核酸フラグメントは、フラグメントの3'末端以外、そして最も好ましくはフラグメントの5'末端でタグに直接的または間接的に結合される。核酸フラグメントは、購入され得るかまたは遺伝子データベースに基づいて調製され得る（例えば、Dibら、Nature 380:152-154 ，1996およびCEPH Genotype Database，http://www.cephb.fr）および商業的なメーカー（例えば、Promega，Madison，WI））本明細書中で使用されるMOIは、MOIをT-L-Lh化合物へ結合するに有用な官能基を含む誘導体を含む。例えば、ホスホジエステルがまたアルキレンアミンに結合される場合、５’末端にホスホジエステルを有する核酸フラグメントは、MOIである。このようなMOIは、例えば、米国特許第4,762,779号（本明細書に参考として援用される）に記載される。内部修飾を有する核酸フラグメントもまたMOIである。核酸フラグメントの例示的な内部修飾は、塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル）が、反応性官能基を付加するように修飾された場合である。このような内部修飾核酸フラグメントは、例えば、Glen Res earch，Herndon，VAから市販されている。核酸フラグメントの別の例示的な内部修飾は、核酸フラグメントの糖とホスフェート基の間に挿入される修飾ホスホジエステルを合成するために、塩基のホスホルアミデートが使用される場合である。塩基のホスホルアミデートは、このホスホルアミデート由来の部分を含む核酸フラグメントを別の部分（例えば、T-L-L_h化合物）に結合させる反応性基を含む。このような塩基性ホスホルアミデートは例えば、Clonetech Laboratorles，In c.，Palo Alto，CAから市販されている。４．化学ハンドル（L_h）化学ハンドルは、安定でしかし第１の分子の部分として存在する反応性原子配列であり、ここでハンドルは、第２の分子の部分として存在する相補的な化学的ハンドルと、２つの分子間で共有結合を形成するために化学反応を受け得る。例えば、これらの２つのハンドル間の反応が２つの分子を結合させる共有結合（特にエステル基）を形成するに際して、化学ハンドルは、水酸基であり得、そして相補的な化学ハンドルはカルボン酸基であり得る（またはその活性化誘導体（例えば、ヒドロフルオロアリールエステル））。化学ハンドルは、タグをリンカーに結合し、そしてリンカーをMOIに結合するに適切な多くの共有結合反応に使用され得る。このような反応に、アルキル化（例えば、エーテル、チオエーテルを形成する）、アシル化（例えば、エステル、アミド、カルバメート、ウレア、チオウレアを形成する）、ホスホリル化（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミドを形成する）、スルホニル化（例えば、スルホネート、スルホンアミドを形成する）、縮合（イミン、オキシム、ヒドラゾンを形成する）、シリル化、ジスルフィド形成、および光分解による反応性中間体（例えば、ニトレン、またはカルベン）の生成を含む。一般に、タグをリンカーに結合するに適切なハンドルおよび結合形成反応はまた、リンカーをMOIに結合するに適切であり、そしてその逆も同様である。いくつかの場合において、MOIは、先に修飾または誘導を受けて、リンカーを結合するに必要なハンドルを提供し得る。リンカーをMOIに結合するに特に有用な結合の一つの型は、ジスルフィド結合である。その形成は、リンカー上のチオール基（ハンドル）およびMOI上の別のチオール基の存在を必要とする。従って、緩やかな酸化条件は、２つのチオールをジスルフィドとして結合するに十分である。ジスルフィド形成はまた、過剰な適切なジスフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィド）を使用することによって誘導され得る。ジスルフィド形成は、容易に可逆であるので、ジスルフィドは所望ならばタグを遊離するための切断可能な結合としてもまた使用され得る。代表的には、これは、過剰の適切なチオール交換試薬（例えば、ジチオスレイトール）を使用して、同様の穏やかな条件下で達成される。アミド結合の形成は、タグ（またはリンカーを有するタグ）をオリゴヌクレオチドに結合するために特に興味深い。一次脂肪族アミンハンドルは、ホスホルアミダイト（例えば、6-モノメトキシトリチルヘキシルシアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（Glenn Research，Sterling，VAから入手可能））を有する合成オリゴヌクレオチドに容易に導入され得る。導入された一次アミンと比較した場合、天然のヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびグアノシン）上で見出されるアミンは、実際に非反応性である。反応性におけるこの相違は、アミドおよび導入された一次アミン（ヌクレオチドアミンではなく）を有する関連する結合基（例えば、ウレア、チオウレア、スルホンアミド）を選択的に形成する能力の基礎を形成する。 Molecular Probes catalog（Eugene，OR）に収載されるように、アミン反応性官能基には、活性化カルボン酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハライド、およびジクロロトリアゼンが部分的に挙げられる。活性エステルは、形成されるアミド生成物は極めて安定であるので、アミン修飾に優れた試薬である。さらに、これらの試薬は、脂肪族アミンと良好な反応性を有し、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチドアミンとの低い反応性を有する。活性エステルの例には、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、およびp-ニトロフェニルエステルが挙げられる。活性エステルは、実際にはカルボン酸を含む任意の分子から作製され得るので、活性エステルは有用である。活性エステルを作製する方法は、Bodansky（Princlples of Peptide Chemistry(第２版)，Springer Verlag，Lo ndon，1993）に収載される。５．リンカー結合代表的には、単一の型のリンカーが、特定のセットまたはファミリーのタグを特定のセットのまたはファミリーのMOIに結合するために使用される。本発明の好ましい実施態様において、単一の一様な手順が全ての種々のT-L-MOI構造を作製するために付随され得る。T-L-MOI構造のセットが大きい場合、これは、とくに利点に富む。なぜならば、それによってセットをコンビナトリアルケミストリーの方法または他の平行プロセシング技術を使用して調製することが可能となるからである。類似の方法において、単一の型のリンカーの使用は、単一の一様な手順を全ての種々のT-L-MOI構造を切断するために用いることを可能にする。さらに、これは、大きな七ットのT-L-MOI構造について利点に富む。なぜならば、セットは、平行、反復、および／または自動化方法でプロセスされ得るからである。しかし、本発明の他の実施態様では、リンカーの２つ以上が、異なるサブセットのタグを対応するサブセットのMOIを結合するために使用される。この場合において、選択的な切断条件が、各リンカーを独立に、他のサブセットのMOI上に存在するリンカーを切断することなしに切断するために使用され得る。多くの共有結合形成反応は、タグをリンカーに、そしてリンカーをMOIに接着するに適切である。このような反応は、アルキル化（例えば、エーテル、チオエーテルを形成する）、アシル化（エステル、アミド、カルバメート、ウレア、チオウレアを形成する）、リン酸化（例えば、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミドを形成する）、スルホニル化（例えば、スルホネート、スルホンアミドを形成する）、縮合（例えば、イミン、オキシム、ヒドラゾンを形成する）、シリル化、ジスルフィド形成、および光分解による反応性中間体（例えば、ニトレンまたはカルベン）の生成を含む。一般的に、タグをリンカーに結合するに適切なハンドルおよび結合形成反応はまた、リンカーをMOIに結合するに適切であり、逆も同様である。いくつかの場合において、MOIは、先の改変または誘導を受け得、リンカーを結合するに必要なハンドルを提供する。リンカーをMOIに結合するに特に有用な結合の一つの型は、ジスルフィド結合である。その形成は、リンカー上のチオール基（「ハンドル」）およびMOI上の別のチオール基の存在を必要とする。次いで、穏やかな酸化条件が、二つのチオール基をジスルフィドとして結合するに十分である。ジスルフィド形成はまた、過剰の適切なジスルフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィド）を使用することによって誘導され得る。ジスルフィド形成は、容易に可逆的であるので、ジスルフィドは所望ならばタグを遊離するための切断可能な結合として使用され得る。代表的には、これは、過剰の適切なチオール交換試薬（例えば、ジチオスレイトール）を使用して、同様に穏やかな条件下で達成される。アミド結合の形成は、タグをオリゴヌクレオチドに結合するために特に興味深い。一次脂肪族アミンハンドルは、ホスホルアミダイト（例えば、6-モノメトキシトリチルヘキシルシアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト（Gle nn Research，Sterllng，VAから入手可能）を有する合成オリゴヌクレオチドに容易に導入され得る。導入された一次アミンと比較した場合、天然のヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびグアノシン）上で見出されるアミンは、実際に非反応性である。反応性におけるこの相違は、アミドおよび導入した一級アミン（ヌクレオチドアミンではなく）を有する関連結合基（例えば、ウレア、チオウレア、スルホアミド）を選択的に形成する能力の基礎を形成する。 Molecular Probes catalog（Eugene，OR）に収載されるように、アミン反応性官能基には、活性化カルボン酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホンニルハライド、およびジクロロトリアゼンが部分的に挙げられる。活性エステルは、形成されるアミド生成物は極めて安定であるので、アミン修飾に優れた試薬である。さらに、これらの試薬は、脂肪族アミンと良好な反応性を有し、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチドアミンとの低い反応性を有する。活性エステルの例には、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、およびp-ニトロフェニルエステルが挙げられる。活性エステルは、実際にはカルボン酸を含む任意の分子から作製され得るので、活性エステルは有用である。活性エステルを作製する方法は、Bodansky（Principles of Peptide Chemistry(第２版)，Springer Verlag，Lo ndon，1993）に収載される。リンカーとして機能し得る多くの市販の架橋試薬が存在する（例えば、Pierce Cross-linkers，Pierce Chemical Co.，Rockford，ILを参照のこと）。これらの中に、ホモ二官能性イミドエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミジル（NH S）エステルによって例示されるホモ二官能性アミン反応性架橋試薬がある。連続的な反応を可能にする２つ以上の異なる反応性基を有するヘテロ二官能性架橋試薬が存在する。イミドエステルは、アルカリ性PHでアミンと迅速に反応する。 NHS-エステルは、一級アミンまたは二級アミンと反応させた場合、安定な生成物を与える。マレイミド、アルキルおよびアリールハライド、α-ハロアシルおよびピリジルジスルフィドは、チオール反応性である。マレイミドは、6.5〜7.5の pHの範囲でチオール（スルフヒドリル）基に対して特異的である。そしてアルカリ性pHは、アミン反応性になり得る。チオエーテル結合は、生理学的条件下で安定である。α-ハロアセチル架橋試薬は、ヨードアセチル基と反応し得るが、反応は非常に遅い。イミダゾールは、ヨードアセチル部分を含み、そしてスルフヒドリルに対して反応性である。ピリジルジスルフィドは、チオール基と反応して、ジスルフィド結合を形成し得る。カルボジイミドは、カルボキシルとヒドラジドの一級アミンをカップリングさせ、これはアシル−ヒドラジン結合の形成を生じる。アリールアジドは、UVまたは可視光に曝露されるまで化学的に不活性な光親和性試薬である。このような化合物が、250nm〜460nmで光分解される場合、活性アリールニトレンが形成される。反応性アリールニトレンは、比較的非特異的である。グリオキサールは、アルギニンのグアニジル部分に対して反応性である。本発明の一つの代表的な実施態様において、タグはまずリンカーに結合され、次いでタグとリンカーとの組合せは、MOIに結合され、構造T-L-MOIを生じる。あるいは、同一の構造が、リンカーをMOIへまず結合させ、次いでリンカーとMOIとの組合せをタグに結合させることによって形成される。例は、MOIがDNAプライマーまたはオリゴヌクレオチドである場合である。この場台において、タグは、代表的には、まずリンカーに結合され、次いでT-Lが、DNAプライマーまたはオリゴヌクレオチドに結合される。これは、次いで、例えば、配列決定反応において使用される。タグが、MOIに可逆的にMOIに結合し得る一つの有用な形態（例えば、オリゴヌクレオチドまたはDNA配列決定プライマー）は、化学的に不安定なリンカーを介する。リンカーについての一つの好ましい設計によって、リンカーを揮発性の有機酸（例えば、トリフルオロ酢酸（TFA））に曝露した場合切断することが可能になる。TFAは、特に、多くのMSイオン化の方法（これは電気スプレイを含む）に適合性である。以下に詳細に記載されるように、本発明は、核酸分子の配列を決定するための方法を提供する。本発明の方法によって形成され得る組成物は、以下の式の複数の化合物を含む： T^ms-L-MOI ここでT^msは、質量分析によって検出可能な有機基である。T^msは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含み得る。式において、Ｌは、切断条件への化合物の曝露に際して、T^ms含有部分を化合物の残りから切断させる有機基である。切断されたT^ms含有成分は、複数の化合物の各々が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持する官能基を含む。官能基は、三級アミン、四級アミン、または有機酸であり得る。式において、MOIは、MOIの5'末端を介して結合される核酸フラグメントである。用語「結合された」は、ＬおよびMOIの中間の化学基があり得ることを意味する（例えば、ホスホジエステル基および／またはアルキレン基）。核酸フラグメントはベクターの一部と相補的な配列を有し得、ここでそのフラグメントは核酸合成を開始し得る。組成物において、二つの化合物は、同一のT^msも同一MOIも有しない。言い換えれば、組成物は、複数の化合物を含み、ここで各化合物は、独特のT^msおよび独特の核酸フラグメントの両方を含む（それが、独特の塩基配列を有するという点で独特）さらに、組成物は、複数の化合物（ここで各化合物は独特のT^msを有するように定義され得、ここでT^msは、他の化合物が、質量分析によって同一のシグナルを提供するT^msを有さない点で独特である）。従って、組成物は、複数の化合物を含み、各々は、独特のマスを有するT^msを有する。組成物はまた、各化合物が独特の核酸配列を有するように規定される複数の化合物を有するように規定され得る。これらの核酸配列は、組成物が核酸配列決定のためのベクターに組合せられる場合、各化合物が唯一つのベクターのためのプライマーとして機能するように、意図的に独特である。独特のTms基を有する化合物のセットは、独特の核酸配列を有する同一のセットの化合物である。好ましくは、T^ms基は、任意の二つの異なる化合物のT^ms基の間で少なくとも２ amu、より好ましくは少なくとも３amu、およびさらにより好ましくは少なくとも４amu質量、分離している点で独特である。組成物において、少なくとも２つの異なる化合物が存在し、好ましくは２より多い異なる化合物が存在し、そしてより好ましくは４より多い異なる化合物が存在する。組成物は100以上の異なる化合物を含み得、各化合物は独特のT^msおよび独特の核酸配列を有する。例えば、核酸分子の配列を決定するのに有用である別の組成物は、水および式 T^ms-L-MOIの化合物を含み、ここでT^msは質量分析によって検出可能な有機基である。T^msは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含み得る。式において、Ｌは、切断条件への化合物の曝露に際して、T^ms含有部分を化合物の残りから切断させる有機基である。切断されたT^ms含有成分は、複数の化合物の各々が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持する官能基を含む。官能基は、三級アミン、四級アミン、または有機酸であり得る。式において、MOIは、M OIの5'末端を介して結合される核酸フラグメントである。水に加えて、この組成物は、約５〜約９の間に水溶液のpHを維持するために、緩衝液を含み得る。さらに、組成物は、酵素、塩（例えば、MgCl₂およびNaCl）、ならびにdATP、dGTP、dCTP、およびdTTPの一つを含み得る。好ましい組成物は水、T^ms-L-MOIならびにddATP、ddGTP、ddCTP、およびddTTPの一つ（一つのみ）を含む。このような組成物は、ジデオキシ配列決定法における使用に適切である。本発明はまた、複数のセットの化合物を含む組成物を提供し、ここで化合物の各セットは以下の式を有する： T^ms-L-MOI ここで、 T^msは、質量分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、T^ms含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでT^ms含有成分は、化合物が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミン、および有機酸から選択される官能基を含む。MOIは、ＬがMOIの5'末端でMOIに結合される核酸フラグメントである。セットにおいて、全てのメンバーは、同一のT^msを有し、そしてMOIフラグメントは、ddAMP、ddGMP、ddCMP、およびddTMPから選択される同一のジデオキシヌクレオチドで終結する可変性の長さを有し；そしてセットの間で、T^ms基は、少なくとも２amuづつ、好ましくは少なくとも３amuづつ異なる。複数のセットは、好ましくは、少なくとも５であり、そして100以上に番号付けし得る。上記のような第一の複数のセットを含む好ましい組成物において、さらに、以下の式を有する第二の複数のセットの化合物が存在する T^ms-L-MOI ここで、T^msは、質量分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、T^ms含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでT^ms含有成分は、化合物が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミン、および有機酸から選択される官能基を含む。MOIは、ＬがMOIの5'末端でMOIに結合される核酸フラグメントである。第二の複数において全てのメンバーは、dd AMP、ddGMP、ddCMP、およびddTMPから選択される同一のジデオキシヌクレオチドで終結するMOI配列を有する；ただし、第一の複数の化合物中に存在する同一のジデオキシヌクレオチドは、第二の複数の化合物に存在する同一のジデオキシヌクレオチドではない。本発明はまた、DNA配列解析のためのキットを提供する。キットは、複数のコンテナセットを含み、ここで各コンテナセットは少なくとも５つのコンテナを含み。第一のコンテナはベクターを含む。第２、第３、第４、および第５のコンテナは、以下の式の化合物を含む： T^ms-L-MOI ここで、T^msは、質量分析によって検出可能な有機基であり、これは、炭素、水素およびフッ素の少なくとも一つ、ならびに酸素、窒素、イオウ、リン、およびヨウ素より選択される任意の原子を含む。式において、Ｌは、T^ms含有部分を化合物の残りから切断させる有機基であり、ここでT^ms含有成分は、化合物が質量分析に供される場合、単一イオン化荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミン、および有機酸から選択される官能基を含む。MOIは、ＬがMOIの5'末端でMOIに結合される核酸フラグメントである。第２、第３、第４、および第５のコンテナについてのMOIは、セットのコンテナ内のベクターの一部と同一でありかつ相補的であり、各コンテナ内のT^ms基は、キット中の他のT^ms基と異なる。好ましくは、キットにおいて、複数は、少なくとも３である（すなわち、少なくとも３セットのコンテナである）。より好ましくは、少なくとも５セットのコンテナである。上記のように、本発明は、核酸分子の配列を決定するための組成物および方法を提供する。簡略には、このような方法は、一般的には（ａ）核酸分子の第１の末端から第２の末端まで選択された核酸分子（例えば、タグ化フラグメント）に相補的であるタグ化核酸フラグメントを生成する工程で、ここでタグは、特定のまたは選択されたヌクレオチドと相関性があり、そして任意の種々の方法によって検出され得る、工程と、（ｂ）連続的な長さでタグ化フラグメントを分離する工程と、（ｃ）タグ化フラグメントからタグを切断する工程と、（ｄ）タグを検出する工程と、を含み、そしてそれによって核酸分子の配列を決定する。この局面の各々は、以下でより詳細に議論される。Ｂ．配列決定方法および戦略上述のように、本発明は、核酸分子の配列を決定する方法を提供する。簡単にいえば、タグ化核酸フラグメントが調製される。核酸フラグメントは選択された標的核酸分子に相補的である。好ましい実施態様において、核酸フラグメントは、核酸分子の第一の末端から第二の末端へ、より好ましくは、５’末端から３’ 末端へと生成される。他の好ましい実施態様では、タグ化フラグメントは、５’ タグ化オリゴヌクレオチドプライマーまたはタグ化ジデオキシヌクレオチドターミネーターから生成される。タグ化核酸フラグメントのタグは、特定のヌクレオチドと相関的であり、そして分光分析（蛍光を含むが、好ましくは蛍光以外）または電位差測定により検出可能である。好ましい実施態様において、少なくとも５つのタグ化核酸フラグメントが生成され、各々のタグは核酸フラグメントに特有である。より詳細には、タグ化フラグメントの数は、一般的に５〜2000の範囲である。タグ化核酸フラグメントは、上記に示された化合物を含む種々の化合物から生成される。本発明の方法が本明細書中に記載される代表化合物および組成物の使用のみに限定されないことは、当業者にとって明らかである。タグ化核酸フラグメントの生成に続いて、タグ化フラグメントは連続的長さにより分離される。このような分離は種々の技術により実施され得る。より好ましい実施態様では、分離は液体クロマトグラフィー（LC）により、特に好ましくは HPLCによる。次に、このタグはタグ化フラグメントから切断される。結合を破壊してタグを放出するための特定の方法は、結合の切断に対する感受性の特定のタイプに基づいて選択される。例えば、光感受性の結合（すなわち、光によって破壊する結合）は、光に曝露される。放出されたタグは、分光分析または電位差測定により検出される。好ましい検出手段は、質量分析、赤外分光分析、紫外線分光分析、および定電位電流測定（例えば、電流検出器または電量検出器）である。１つ以上の工程が自動化され得る（例えば、機器の使用により）ことは、当業者により理解される。さらに、分離、切断、および検出工程は連続的様式で実施され得る（例えば、分離〜切断〜タグ検出を通してのタグ化フラグメントの連続流／連続流路）。例えば、種々の工程が系に取り込まれ、その結果工程は連続的な様式で実施される。このような系は、代表的には、機器または機器の組み合わせのフォーマットである。例えば、分離された（例えば、HPLCにより）タグ化核酸フラグメントは、切断のためのデバイス（例えば、光反応器（photo-reacto r）に流され得、そして次いでタグ検出器（例えば、質量分析計または電量検出器、または電流測定器）に流され得る。好ましくは、切断のためのデバイスは調節可能であり、その結果切断反応のための最適な波長が選択され得る。核酸配列決定のための本発明の方法が種々の目的のために実施され得ることは当業者には明らかである。例えば、本発明のそのような使用は、ウイルス、細菌、原核生物、および真核生物（例えば、哺乳動物）核酸分子の一次配列決定；変異検出；診断；法医学：同一性；および多型性検出を含む。１．配列決定方法上述のように、本発明の化合物を含む化合物は、酵素的分解方法および化学的分解方法の両方を含む種々の配列決定方法に利用され得る。簡潔にいうと、Sang er(Proc．Natl．Acad．Scl．（USA）74:5463，1977)によって記載される酵素的方法（これはジデオキシターミネーターを利用する）は、DNAポリメラーゼによる一本鎖テンプレートからのDNA鎖の合成を含む。配列決定のSanger方法は、そのジデオキシヌクレオチド（ddNTP）が、通常のデオキシヌクレオチドと同様に、成長する鎖に取り込まれる（より低効率であるが）という事実に依存する。しかし、ddNTPは通常のデオキシヌクレオチド（dNTP）とは、それが鎖伸長に必要な３’-OH基を欠くという点で異なる。ddNTPがDNA鎖に取り込まれた場合、３’- 水酸基の非存在は、新たなホスホジエステル結合の形成を妨げ、そしてDNAフラグメントは、テンプレートDNA中の塩基に相補的なddNTPを有して終結する。Maxa mおよびGilbertの方法(MaxamおよびGilbert;Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）74 :560，1977)は、元のDNAの化学分解方法を使用する（両方の場合において、DNA はクローン性でなければならない）。両方の方法は、特定の点で開始し、そして配列決定されるべきDNAフラグメントに見い出されるすべての塩基で終結するフラグメントの集団を生成する。各フラグメントの終結は元のDNAフラグメント内の特定の塩基の位置に依存する。DNAフラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、そしてDNA塩基（Ａ、Ｃ，Ｔ，Ｇ）の順番がゲルのオートラジオグラフィーから読まれる。２．エキソヌクレアーゼDNA配列決定 DNAヌクレオチド配列を決定するための手順はLabeltら(S．Labelt．H．Lehrac hおよびR．S．Goody，DNA5:173-7，1986;デオキシヌクレオシドα-チオトリホスフェートを使用するDNA配列決定の新たな方法）により、報告された。この方法の第一の工程において、４つのDNA（それぞれ異なるデオキシヌクレオシドホスホロチオエートが相当するモノホスフェートの代わりに別々に置換されている）は、DNAポリメラーゼにより触媒されるテンプレート指向性重合により調製される。第二の工程において、これらのDNAが厳密なエキソヌクレアーゼIII処理に供され、これはホスホロチオエート核酸間連結を有して終結するフラグメントのみを生成する。次いで、これらは、標準ゲル電気泳動技術により分離され得、そして配列が、現在使用される配列決定方法におけるように直接読まれ得る。Porter ら(K．W．Porter，J．Tomasz，F．Huang，A．SoodおよびB．R．Shaw，Biochemis try 34:11963-11969，1995;N7-シアノボラン-2'-デオキシグアノシン5'-3リン酸はDNAポリメラーゼの良い基質である)は、エキソヌクレアーゼ耐性でもあり、そして多数のポリメラーゼの良い基質である、ホウ素置換核酸アナログの新しい組を記述した：これらの塩基はまた、エキソヌクレアーゼDNA配列決定にも適する。３．多数の全長cDNAの配列決定のための簡略化した戦略 cDNA配列決定は、完全なヒトゲノム配列を生成することに代わる代替法として示唆されてきた。２つのアプローチが企てられた。第一のアプローチは、各々の cDNAクローンの一方の末端における単−DNA配列通過（pass）を通じての発現配列タグ（EST）の生成を含む。この方法は、発現配列の型の分布への新しい見地を与え、ゲノムフラグメントとの時折の有用な相同性を明らかにしたが、全体には我々の知識の土台に対してほとんどなにも迫加しない。なぜなら、それぞれのクローンからのデータの提供が不充分だからである。第二のアプローチは、cDNA の潜在的機能を表し得る完全なcDNA配列を生成することである。不幸にも、ほとんどのcDNAは1〜4キロベースの大きさの範囲であり、これは全長配列決定の自動化を妨げている。現在のところ、ラージスケールで高スループットの配列の生成のための最も効率的な方法は、ベクター／プライマー部位からの配列決定に由来し、これは、代表的にはそれぞれの側方（flank）から500塩基未満の配列を生じる。「プライマーウォーキング」のための15〜18塩基の長さの新たなオリゴヌクレオチドプライマーの合成は、各々の配列の閉合を可能にし得る。全長cDNA 配列決定のための代替戦略は、ユニバーサルプライマーを用いた配列決定に適した改変したテンプレートを生成することであるが、これは分子の重複した網羅を提供する。ショットガン配列決定方法は、各々のcDNAクローンからの別々のライブラリーを調製することによりcDNA配列決定研究に適用され得る。しかし、これらの方法は、1.5〜4.0キロベースフラグメントの解析のためには、特には使用されていない。なぜなら、それらは初期のクローニング段階の間に非常に労働集約的であるからである。そのかわりに、それらは、一般的に、標的配列が、λまたはコスミドインサートのような15〜40キロベースのオーダーである場合の計画に適用されている。４．cDNA とゲノム配列決定とのアナロジー cDNA配列決定において解析されるべき個々のクローンの代表的に異なるサイズにもかかわらず、ラージスケールのゲノムDNA配列決定のための必要事項との類似が存在する。１塩基当たりの低コストおよび高いスループットに加えて、全長 cDNA配列決定のための理想的な戦略は、高い正確性を有する。ゲノムDNA配列決定のために現在好まれている方法は、コスミドからのショットガン配列決定ライブラリーの調製、それに続くABI蛍光DNA配列決定機器を使用したランダム配列決定、および指向される努力による閉合（終止）を含む。全体として、蛍光ショットガンアプローチは現在の代替法法よりも効率および正確性の点で優れているということで合意がある。初期のショットガンライブラリーの品質は、配列アセンブリーの簡便さおよび品質についての決定的な要素である。入手可能なショットガンライブラリー手順の高い品質は、より小さいcDNAクローンの混合物を含む複台ショットガンライブラリーの生成のための戦略を促している。ここで、配列決定されるべき個々のクローンは、ライブラリー構築の前に混合され、そして、次いでランダム配列決定の後に、コンピューター解析の工程で同定される。個々のクローン間の連接部は、ライブラリー生成の間に、PCRによるかまたはベクターアーム配列の同定によるかのいずれかで標識される。クローンは、微生物学的方法によるかまたはPCRによるかの両方で調製され得る。PCRを使用した場合、間違いのリスクを最小化するために、３つの反応が各々のクローンについて使用される。一方通過配列決定（one pass sequencing）は、ゲノムDNAの新しい領域内の重要な配列の同定を加速するために設計された新しい技術である。簡潔にいえば、高品質ショットガンライブラリーが調製され、そして次いで、配列がサンプリングされて、80〜95％の網羅が得られる。コスミドについては、これは、代表的には約200試料である。本質的には、すべての遺伝子が、配列類似性（BLAST）またはエキソン構造（GRAIL2）スクリーニングのいずれかを使用してこの試料中において検出される少なくとも一つのエキソンをおそらく有している。「スキミング（skimming）」は、コスミドおよびP1へ成功して適用されている。一方通過配列決定は、潜在的に、ポジショナルクローニング計画において遺伝子を見出すための最も迅速でそして最も安価な方法である。出力は実質的に保証される。ほとんどの研究者は、現在、エキソントラッピングおよび関連技術のために、コスミドコンティグを開発している。コスミドは、配列決定スキミングに完全に適切である。P1および他のBACは、かなり、より安価である。なぜなら、ショットガンライブラリー構築および重複の最小化の両方において節約があるからである。５．ショットガン配列決定ショットガンDNA配列決定は、標的DNAのランダム断片化で始まる。次いで、ランダム配列決定がデータの主要部分を生成するために使用される。次いで、指向相（directed phase）がギャップを埋め合わせ、各々の鎖の両方向における網羅を確証する。ショットガン配列決定は、高正確性という利点を比較的低コストで提供する。この手順は比較的大きなフラグメントの解析に最も適しており、そしてラージスケールのゲノムDNA配列決定における方法の選択肢である。ショットガン配列決定を正確にそして費用効果的にするために重要な要素がいくつかある。主要な考慮すべき点は、生成されたショットガンライブラリーの品質である。なぜなら、インサートを有しないか、またはキメラインサートを有する任意のクローンが、続いて起こる配列決定を非効率的にするからである。別の考慮すべき点は、配列決定のランダムな相と指向相との慎重な平衡であり、その結果、不必要な配列決定による効率性の損失を最小限に抑え、高正確性が得られる。６．配列決定化学：タグ化ターミネーター化学現在利用可能な蛍光配列決定化学には２つタイプがある：色素プライマー（ここで、プライマーは蛍光で標識される）、および色素ターミネーター（ここで、ジデオキシターミネーターが標識される）。これらの化合物のそれぞれは、TaqD NAポリメラーゼまたはSequenase酵素のいずれかとともに使用され得る。Sequena se酵素は、G-Cリッチ領域、パリンドローム、単純反復、および他の解読困難配列を通って簡単に読むようである。Sequenaseはまた、混合物集合体の配列決定のためにも良い。Sequenase配列決定は、５μｇのテンプレート、一回の伸長、および多工程の洗浄プロセスを必要とする。タグ化プライマー配列決定は、Ａ、Ｃ，Ｇ，およびＴの各々についての４つの別々の反応、ならびに、労力を要する洗浄プロトコルを必要とする。Taqターミネーターサイクル配列決定化学は、最も強力な配列決定方法である。この方法においては、いかなる配列プライマーも使用され得る。テンプレートの必要量は比較的小さく、そして準備から洗浄までの全反応プロセスが、Sequenaseおよび色素プライマー化学に比較して充分簡単である。1.5μｇのDNAテンプレート、および4pmのプライマーのみが必要である。これに、調製済反応混合物が添加される。この混合物は緩衝液、酵素、dNTPおよび標識ジデオキシヌクレオチドから構成される。この反応は、一本のチューブで実施され得る。なぜなら、４つのジデオキシが異なった蛍光色素で標識されているからである。これらの標識ターミネーターはこの混合物中に過剰量存在している。なぜなら、それらは伸長の間の取り込みが困難だからである。未精製DNA では、これらの高分子量ジデオキシの取り込みは阻害され得る。プレミックスは、バンド圧縮を最小化するためにdITPを含む。DNAポリメラーゼとしてのTaqの使用は、反応が高温で行われて、２次構造の問題および非特異的プライマー結合を最小限にすることを可能にする。全カクテルは25サイクルの変性、アニーリング、および伸長がサーマルサイクラー中で受け、そして完了した反応物はSephadex G50（ Pharmacia．Piscataway NJ）カラムを通してスピンされ、真空デシケーター中での５分後に、ゲルロードの準備が出来る。７．プライマーの設計プライマーを設計する場合は、PCRプライマーを設計するときと同じ基準を使用するべきである。特に、プライマーは、好ましくは18から20ヌクレオチド長であり、そして３’末端塩基はＧまたはＣであるべきである。プライマーはまた、好ましくは、50℃より高いTmを有しているべきである。18ヌクレオチドより短いプライマーも作用するが推薦されない。プライマーが短くなるに従って、テンプレートDNAの１を超える部位に、それが結合する可能性が高くなり、そしてそのT mを低下させる。配列は、テンプレートとの100％のマッチを有するべきである。いかなるミスマッチ（特に３’末端に向かうミスマッチ）も配列決定能を大いに低下させる。しかし、結合する３’における約18塩基が存在する限り、５’テイルを有するプライマーが使用され得る。配列クロマトグラムからプライマーを設計する場合、高い信頼性を有する領域が使用されなければならない。標準クロマトグラムにおいて、350〜400塩基を通過して移動すると、ピークは、より広がり、ベースコールはさほど正確でなくなる。本明細書中で記載のように、プライマーは、それを介してリンカーまたはリンカータグが付着され得る５’ハンドルを有し得る。８．核酸テンプレート調製タグ化プライマーDNA配列決定で最も重要な因子は、テンプレートの品質である。簡潔にいえば、一つの一般的な間違った概念は、テンプレートが手動の配列決定の場合で機能する場合に、それが自動配列決定で機能するはずであるということである。実際に、反応が手動配列決定において機能する場合、それは自動配列決定において機能し得るが、しかし、自動配列決定ははるかにより感受性であり、そして蛍光配列決定法を利用した場合、品質の悪いテンプレートは、ほとんどデータを与えないか、全くデータを与えないかもしれない。高塩濃度、およびテンプレート調製の間に適切に抽出されなかった他の細胞物質（RNAを含む）は、同様に、正確な配列上方を得る能力を妨げる。多くのミニプレップおよびマキシプレッププロトコルは、手動の配列決定またはPCRには充分良いが、自動（タグ化プライマー）配列決定には充分良くはないDNAを生成する。さらに、フェノールの使用は、全く推奨されない。なぜなら、フェノールは螺旋構造中にインターカレートし得るからである。100％クロロホルムの使用で充分である。本明細書中で提供されるタグ化プライマー配列決定方法に特に好ましい多数のDNA調製方法が存在する。特に、塩化セシウム調製物またはQiagen（Chatsworth、CA）マキシプレップカラム（オーバーロードしないように慎重にする）を利用したマキシプレップが好ましい。ミニプレップについては、PromegaのMagic Mini prep（ Madison，WI）のようなカラムが利用され得る。PCRフラグメントまたは制限酵素切断フラグメントのようなDNAフラグメントを配列決定する場合、一般的に、所望のフラグメントを低融点アガロースゲルから切り出し、次いで、GeneClean（L aJolla，CA）のような製品で精製することが好ましい。ゲルから一本のバンドのみを切り出すことを確実にすることが重要である。PCRフラグメントについては、PCRプライマーまたは内部プライマーが、適切なフラグメントが配列決定されることを確証するために使用され得る。配列分析ソフトウェアからの最適の成績をあげるには、フラグメントは200塩基より大きくあるべきである。二本鎖または一本鎖のDNAがこの方法により配列決定され得る。配列決定の調製の場合、一般的に考慮するべきさらなる因子は、宿主株の選択である。ABI（Foster City，CA）およびQiagen（Chatsworth，CA）のような配列決定のための機器および試薬を販売する会社は、代表的に好ましい宿主株を推薦しており、そして以前に、DH5α、HB101，XL-1 Blue、JM109、MV1190のような株を推薦してきている。DNA調製物が非常にきれいだったとしても、配列を得ることを困難にし得る他の固有の因子がある。G-Cリッチなテンプレートは常に、通って配列決定するのが困難であり、そして二次構造もまた、問題を生じ得る。長い反復を通っての配列決定は、しばしば、困難であると判明する。例えば、Ta qがポリＴ伸展にそって移動するとき、この酵素はしばしばテンプレートを脱落して、そして、後方に跳ね戻り、Ｔをスキップする。これは、ポリＴ伸展中のＸ量のＴを有する伸長生成物およびポリＴ伸展中のX-1、X-2などの量のＴを有するフラグメントを生じる。正味の効果は、各々の位置において１塩基より多くが現れることであり、これは配列を読解不可能にする。９．分子的に異なるクローニングベクターの使用配列決定はまた、ユニバーサルクローニングベクター（M13）および相補的配列決定プライマーを利用して達成され得る。簡潔にいえば、既存のクローニングベクターについて、同じプライマー配列が使用され、そして４つのタグのみが使用され（各々のタグは異なるターミネーター（ddNTP）を表す異なるフルオロホアである）、各々の増幅プロセスは異なるコンテナにおいて行われなければならない（１コンテナ当たり１つのDNAサンプル）。すなわち、２つまたは異なるDNA サンプルを同一の増幅プロセス中で混合することは不可能である。４つのタグのみが利用可能な場合、１ゲルレーン当たり１つのDNA試料のみが泳動され得る。４つのタグのみで１つより多いDNAの配列を解明する（deconvolute）便利な手段はない（この意味で、当業者は、現在の技術を使用する場合、異なるDNA試料を混台したり汚染したりしないように非常に留意する）。１ゲルレーンまたはそれぞれの分離プロセス当たり複数の４つのタグが泳動される場合、実質的な利点が得られる。特に、本発明のタグを利用して、単一の増幅反応またはコンテナ中において１つ以上のDNA試料が処理され得る。複数の４つのタグが使用のために利用可能である場合、各々のタグの組は、増幅されるべき特定のDNA試料に対して割り当てられる。一つのタグの組は一連の４つの異なるタグから構成され、各々が独特な特性を有する。各々のタグは、異なるジデオキシターミネーター、ddATP、ddGTP、ddCTP、またはddTTPを表すように割り当てられる。この利点を使用するため、独特なプライミング部位が挿入された一連のベクターが生成されなければならない。独特なプライミング部位は、単に18ヌクレオチドの長さであり、これはベクターごとに異なる。残りのヌクレオチド配列は、ベクターごとに保存されている。各々の独特のベクターに対応する配列決定プライマーが調製（合成）される。各々の独特なプライマーは独特なタグの組を用いて誘導（または標識）される。これらのそれぞれの分子生物学の道具を有して、本発明において、単一のコンテナで複数の試料を処理することが可能である。第一に、配列決定されるべきDN A試料は複数のベクターにクローン化される。例えば、100の独特なベクターが入手可能な場合、100のライゲーション反応、プレート工程、およびプラークを拾う工程が実施される。第二に、各々のベクタータイプから１つの試料がプールされ、100の独特なDNAフラグメントまたは試料を含む100の独特なベクターのプールを作製する。それにより、所定のDNA試料は同定され、そして自動的にタグの組を伴うプライマーの組が割り当てられる。それぞれのプライマー、緩衝液、ポリメラーゼ（単数または複数）、ddNTP、dNTPおよび補因子は反応コンテナに添加され、そして増殖プロセスが実行される。次いで、反応物は分離工程に供され、それぞれの配列がタグの時間的出現によって確立される。複数のDNA試料をプールする能力は実質的な利点を有する。代表的なPCR反応の試薬コストは１試料当たり約2.00米国ドルである。本明細書中で記載の方法では、１試料当たりに基づく増幅のコストは少なくとも100倍低減され得る。試料作業が少なくとも100倍低減され得、そして材料コストが低減され得る。ラージスケール増幅ロボットに対する必要性は除去される。 10．切断可能質量分析タグ化のための配列決定ベクター本発明の切断可能質量分析タグ化（CMST）を用いて、それぞれの個々の配列決定反応が、分離が進むに従うと同時に独立に読まれ得る。CMST配列決定において、異なるプライマーが各々のクローニングベクターのために使用される：１プール当たり、20クローンが使用される場合、各々の反応は、20の異なるプライマーを有する。各々のプライマーはベクターの一つに対応し、そして各々のプライマーは独特のCMST分子でタグ化されている。４つの反応が、各々のプールされたDN A試料に対して実施され（各塩基につき一つ）、それゆえ、全てのベクターが４つのオリゴヌクレオチドプライマーを有し、各々が配列では同一であるが、異なる CMSタグでタグ化されている。４つの分離した配列決定反応物はプールされ、そしていっしよに泳動される。20試料がプールされる場合、80のタグが使用され（１試料当たり４塩基×20試料）、そして80全てが、ゲルが流れると同時に検出される。ベクターの構築は、ランダムな20マーを制限部位の両方の側にクローニングすることにより達成され得る。得られたクローンは、配列決定され、そしてベクターとして使用するための番号が選択される。２つのオリゴヌタレオチドが各々の選択されたベクターについて調製される。これは、制限部位の各々の側での配列に相同であり、そして各々が、３’末端が制限部位に向かうように配向されている物である。各々のプライマーの４つのタグ化調製物が調製され、配列決定反応における各塩基に一つであり、そして各々が独特のCMSタグで標識されている。 11．可逆的タグの使用による配列決定の利点配列決定および関連の技術において切断可能タグが使用される場合、実質的な利点がある。第一に、感度の増強が、測定の前の特定の時間にタグを集める能力と同様、より長い読み取り長さに貢献する。切断可能タグの使用は、ゲルの全範囲（例えば、1〜1500ヌクレオチド（nt））にわたってバンド幅を均等化するシステムの開発を可能にする。これは、450ntより長い読み取り長さを得る能力に多大なる影響を与える。切断可能な複数のタグ（MW同定因子）の使用はまた、複数のDNAが、単一のゲルレーンまたは分離プロセス上で泳動され得るという利点を有する。例えば、本明細書中に開示された方法論を使用して、少なくとも96のサンプルおよび４つの配列決定反応（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）を単一のレーンまたはフラグメントサイジングプロセス上で組み合わせることが可能である。独特なプライミング部位を有する複数のベクターが使用される場合、少なくとも、１ゲルレーン当たり384の試料が組み合わせられ得る（異なるターミネーター反応はこのスキームではいっしょには増幅され得ない）。切断可能タグを使用する能力が複数のベクターを使う能力と組み合わされた場合、見かけ上約10,000倍のDNA配列決定スループットの増加が達成される。さらに、本明細書中に記載のスキームにおいて、試薬の使用が低減され、使い捨てのものが低減され、消費者に対して作業コストが低減する結果になる。さらなる利点が、本明細書中に記載の全方法論にわたって、内部コントロールを処理する能力から得られる。試料の任意の組について、内部コントロール核酸が試料（単数または複数）中に入れられ得る。これは現在の仕様では可能ではない。この利点は、増幅プロセス、分離プロセス、タグ検出システムおよび配列決定アセンブリの制御を可能にする。これは、コントロールが常に全ての工程において試料から分離されている現在のシステムに対して莫大な利点である。本明細書中に記載の組成物および方法はまた、それらが本来モジュールであり、そしてそれぞれの技術のいずれかのタイプにおいて改善がなされた場合、任意のタイプの分離プロセスまたは方法に適合され得、そして、さらに、任意のタイプの検出系に適合され得るという利点を有する。例えば、本明細書中に記載された方法論はDNAフラグメントの分離を可能にする「束にされた（bundled）」CEアレー、または微小製造されたデバイスに結びつけられ得る。 C．DNA の分離分析を必要とするサンプルはしばしば、複合体マトリックス中の多数の成分の混合物である。未知の化合物を含むサンプルについては、成分は、それぞれ個々の成分が他の分析方法により同定され得るように互いに分離されなければならない。混合物中の成分の分離特性は一定の条件下で一定であり、従って一旦決定されると、これらは各成分を同定および定量するために使用され得る。このような手順は、クロマトグラフ的および電気泳動的な分析分離において代表的である。 1. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC) 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、溶液中に溶解された化合物を分離するためのクロマトグラフ的分離技術である。HPLC機器は、移動相のリザーバー、ポンプ、インジェクター、分離カラム、および検出器からなる。化合物は、サンプル混合物のアリコートをカラムに注入することにより分離される。混合物中の異なる成分は、これらの移動液相と固定相との間の分配挙動の差異に起因して異なる速度でカラムを通過する。最近、化学的に結合したアルキル鎖を有する非多孔性PS/DVB粒子でのIP-RO-HP LCは、一本鎖および二本鎖の両方の核酸の分析において類似の程度の分解能を提供するキャピラリー電気泳動に対して迅速な代案となることが示されている（Hu berら、Anal.Biochem.212:351,1993;Huberら、1993,Nuc.Acids Res.21:1061;Hub erら、Biotechniques 16:898,1993）。二本鎖DNAを鎖長の関数として保持するとは限らない（AT塩基対は正に荷電した固定相と、GC塩基対よりも強力に相互作用するので）イオン交換クロマトグラフィーとは対照的に、IP-RP-HPLCは、厳密なサイズ依存性分離を可能にする。 100mMのトリエチルアンモニウムアセテートをイオン対試薬として使用する方法が開発され、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、高速液体クロマトグラフィー（Oefnerら、Anal.Biochem.223:39,1994）の方法により、アルキル化された非多孔性2.3μＭポリ（スチレン-ジビニルベンゼン）粒子上で首尾良く分離され得た。記載された技術は、50〜200ヌクレオチドのサイズの範囲内においてわずか４〜８塩基対の長さが異なるPCR産物の分離を可能にした。 2. 電気泳動電気泳動は、電場内でのイオン（または本明細書中で記載される場合のような DNA）の移動度に基づく分離技術である。負に荷電したDNAは正極に向かって移動し、そして正に荷電したイオンは負極に向かって移動する。安全性の理由のために、一方の電極は通常は接地され、他方の電極は正または負にバイアスをかけられている。荷電した種は、これらの総電荷、サイズ、および形に依存する、異なる移動速度を有し、従って、分離され得る。電極装置は、高電圧電源、電極、緩衝液、および緩衝液のためのポリアクリルアミドゲルまたはキャピラリーチューブのような支持体からなる。オープンキャピラリーチューブが、多くのタイプのサンプルのために使用され、そして他のゲル支持体が、通常は、生物学的サンプル（例えば、タンパク質混合物またはDNAフラグメント）のために使用される。 3. キャピラリー電気泳動(CE) その種々の出現（フリーソリューション(free solution)、等速電気泳動、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル、ミセル動電の「クロマトグラフィー」）におけるキャピラリ一電気泳動(CE)は、非常にわずかなサンプル量である複雑な混合物の、迅速で高い分解能の分離のための方法として開発されている。MSの本来の感度および選択性との併用において、CE-MSは、生体分析のための潜在的に強力な技術である。本明細書中に開示される新規な適用において、これら２つの技術を調和させることは、配列決定法の現在の速度を数桁の規模で越える優れたDNA配列決定法に至る。 CEとエレクトロスプレーイオン化(ESI)との間の流速の対応および両方が溶液中でイオン種により促進される（そして主にイオン種のために使用される）という事実は、非常に魅力的な組み合わせについての基礎を提供する。ESIに基づく、四重極(quadrapole)質量分析計を有するキャピラリーゾーン電気泳動(CZE)およびキャピラリー等速電気泳動の両方の組み合わせが記載されている（Olivares ら、Anal.Chem.59:1230,1987;Smithら、Anal.Chem.60:436,1988;Looら、Anal.Ch em.179:404,1989;Edmondsら、J.Chroma.474:21,1989;Looら、J.Microcolumn Sep .1:223,1989;Leeら、J.Chromatog.458:313,1988;Smithら、J.Chromatog.480:211 ,1989;Greseら、J.Am.Chem.Soc.111:2835,1989）。小さなペプチドは、良好な（フェントモル）感度でCZE分析で容易に分析できる。 DNAフラグメントのための最も強力な分離方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)であり、一般にスラブゲルの型である。しかし、現代の技術の主な限界は、配列決定反応により生成されたDNAフラグメントのゲル電気泳動を実施するために必要とされる比較的長い時間である。増大した規模（10倍）が、超薄ゲルを利用するキャピラリー電気泳動の使用で達成され得る。第一の近似値に対するフリーソリューションにおいて、全てのDNAは、塩基の追加が質量および電荷の代償を生じる移動度と同じ移動度で移動する。ポリアクリルアミドゲルにおいて、DNAフラグメントはふるいにかけられ、そして長さの関数として移動し、そしてこのアプローチは、現在、CEに適用されている。１メーターあたりの著しいプレート数が、現在、架橋ポリアクリルアミドで達成されている（１メーターあたり10⁺⁷プレート、Cohenら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:9660,1988）。記載されるようにこのようなCEカラムは、DNA配列決定のために使用され得る。CE の方法は、原則として、標準的なシークエンサーにおけるスラブゲル電気泳動よりも25倍早い。例えば、１時間あたり約300塩基が解読され得る。分離速度は、スラブゲル電気泳動において過剰の熱生成を伴わずにゲルに適用され得る電場の規模により制限される。従って、CEのより大きな速度は、より高い電界強度の使用を介して達成され得る（CEにおいて300V/cm対スラブゲル電気泳動において10V /cm）。キャピラリーの型はアンペア数を減らし、従って、電源および生じる熱生成を減少する。 Smithおよび他の者（Smithら、Nuc.Acids.Res.18:4417,1990）は、処理能力を増大するために複数のキャピラリーを平行に使用することを示唆している。同様に、MathiesおよびHuang（MathiesおよびHuang、Nature 359:167,1992）は、分離がキャピラリーの平行のアレイ上で実施され、そして高い配列決定処理能力を示すキャピラリー電気泳動を導入した（Huangら、Anal.Chem.64:967,1992,Huang ら、Anal.Chem.64:2149,1992）。キャピラリー電気泳動の主な不利は、キャピラリー上にロードされ得る限定されたサンプル量である。分離前に、キャピラリーの初めに大量のサンプルを濃縮することにより、負荷能力（loadability）が増大し、そして検出レベルが数桁の規模で低くなり得る。CEにおける予備濃縮の最もポピュラーな方法は、サンプルの積層である。サンプルの積層は、最近、総説されている（ChienおよびBurgi、Anal.Chem.64:489A,1992）。サンプルの積層は、サンプル緩衝液とキャピラリー緩衝液との間のマトリックスの差異（pH、イオン強度）に依存し、その結果、サンプルのゾーンを横切る電場は、キャピラリー領域より大きくなる。サンプルの積層において、低濃度緩衝液中の大量のサンプルは、キャピラリーカラムの上部での予備濃縮のために導入される。キャピラリーは、同一成分であるが高濃度の緩衝液で充填される。サンプルのイオンがキャピラリー緩衝液およびより低い電場に到達した場合、これらは濃縮ゾーンに積層される。サンプルの積層は、１〜３桁の規模で検出性を増大する。予備濃縮の別の方法が、分析物のフリーゾーンCE分離の前に等速電気泳動(ITP )に適用される。ITPは、CEに代表的に関連する低いnL注入容量と対照的に、μｌ容量のサンプルをキャピラリーにロードさせる電気泳動的技術である。この技術は、分析物よりもそれぞれ高い移動度および低い移動度の２つの緩衝液（リーディングおよびトレーリングの電解液）の間にサンプルを挿入することに依存する。この技術は、本質的に、分析物が同じ速度で移動する純粋なゾーンに集中する濃縮技術である。リーディングおよびトレーリングの電解液のいくつかの選択の必要性および分離プロセスの間のカチオン種またはアニオン種のみを分離する能力のために、この技術は、現在、上記の積層方法よりもポピュラーではない。 DNA配列決定プロセスの核心は、DNAまたはオリゴヌクレオチドフラグメントの非常に選択的な電気泳動的分離である。これは、各フラグメントが解析され、そしてわずかなヌクレオチドが異なることから、著しい。1000フラグメント（1000 bp）までの分離が得られている。切断可能（cleavable）なタグを用いる配列決定のさらなる利点は、以下のようである。切断可能なタグが使用されて、DNAフラグメントがポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される場合、スラブゲルの型を使用する必要性はない。多数のサンプル（４〜2000）が併用されるので、現在の色素プライマーまたは色素ターミネーター方法（すなわち、ABI373シーケンサー）の場合のように、平行にサンプルを流す必要はない。平行なレーンを流す理由がないので、スラブゲルを使用する理由がない。従って、電気泳動的分離方法のためにチューブゲルの型が使用され得る。Grossman（Grossmanら、Gene t.Anal.Tech.Appl.9:9,1992）は、スラブゲルの型の代わりにチューブゲルの型が使用される場合、かなりの利点が得られることを示している。これは、スラブゲルと比較してチューブの型においてジュール熱を散逸するより優れた能力に起因し、この能力はより早い運転時間（50％まで）および高分子量のDNAフラグメント（1000ntを超える）のかなり高い分解能を生じる。長い解読は、ゲノム配列決定において重要である。従って、配列決定における切断可能なタグの使用は、ユーザーに最も高い分解能を有する最も効率的かつ敏感なDNA分離方法の使用を可能にするさらなる利点を有する。 4. マイクロ作製デバイス（microfabricated device）キャピラリー電気泳動(CE)は、DNA配列決定、法医学的分析、PCR産物分析、および制限フラグメントサイジングのための強力な方法である。CEは、キャピラリーゲルにかなりより高い電場が適用され得るので、従来のスラブPAGEよりもかなり迅速である。しかし、CEは、ただ１つのサンプルがゲルあたり処理される欠点を有する。この方法は、CEのより迅速な分離時間と、並行して複数のサンプルを分析する能力とを組み合わせる。マイクロ作製デバイスの使用の後ろにある基本的な概念は、レーンの寸法を約100μｍに縮小化することにより、電気泳動における情報密度を増加させる能力である。エレクトロニクス産業は、１ミクロン未満のサイズの特徴を有する回路を作製するようなマイクロ作製を日常的に使用する。キャピラリーアレイの電流密度は、キャピラリーチューブの外径で制限される。チャネルのマイクロ作製は、より密度の高いアレイを作製する。マイクロ作製はまた、ガラスファイバーを用いて可能でない物理的組立を可能にし、そしてチャネルをチップ上で他のデバイスに直接的に連結する。わずかなデバイスが、分離技術のためにマイクロチップ上で構築されている。ガスクロマトグラフ（Te rryら、IEEE Trans.Electron Device,ED-26:1880,1979）および液体クロマトグラフ（Manzら、Sens.Actuators B1:249,1990）が、シリコンチップ上で作製されているが、これらのデバイスは広く使用されていない。いくつかのグループが、マイクロ作製デバイスでの蛍光色素およびアミノ酸の分離を報告している（Manz ら、J.Chromatography 593:253,1992,Effenhauserら、Anal.Chem.65:2637,1993 ）。最近、WoolleyおよびMathies（WoolleyおよびMathies、Proc.Natl.Acad.Sci .91:11348,1994）は、ガラス基板上で多数の分離チャネルを作製するために使用され得るフォトリソグラフィーおよび化学的エッチングを示している。このチャネルは、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)分離マトリックスで充填される。これは、DNA制限フラグメントが、わずか２分で分離され得たことを示した。 D. タグの切断上記のように、異なるリンカーの設計は、異なる特定の物理的または化学的条件下で切断性(cleavability)（「不安定性」）を与える。種々の設計のリンカーを切断するように作用する条件の例は、酸、塩基、酸化、還元、フッ化物、チオール交換、光分解、および酵素的条件を含む。上記リンカーの一般基準を満足する切断性リンカーの例は、当該分野で周知であり、そしてPierce(Rockford,IL)から入手可能なカタログ中に見出される切断性リンカーを含む。例は、以下を含む：・エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）(EGS)、ヒドロキシルアミンにより切断可能であるアミン反応性架橋試薬（１M、37℃で３〜６時間）；・ジスクシンイミジルタルタレート(DST)およびスルホ-DST、これらは、0.015 Mの過ヨウ素酸ナトリウムにより切断可能なアミン反応性架橋試薬である；・ビス[2-(スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCO ES)およびスルホ-BSOCOES、これらは、塩基（pH11.6）により切断可能なアミン反応性架橋試薬である；・1,4-ジ-{3'-(2'-ピリジルジチオ(プロピオンアミド))ブタン(DPDPB)、チオール交換または還元により切断可能であるピリジルジチオール架橋剤；・N-[4-(p-アジドサリチルアミド)-ブチル]-3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド(APDP)、チオール交換または還元により切断可能であるピリジルジチオール架橋剤；・ビス-[β-4-(アジドサリチルアミド)エチル]-ジスルフィド、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；・N-スクシンイミジル-(4-アジドフェニル)-1,3'ジチオプロピオネート(SADP) 、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；・スルホスクシンイミジル-2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド）エチル-1,3'-ジチオプロピオネート(SAED)、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤；・スルホスクシンイミジル-2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3' ジチオプロピオネート(SAND)、チオール交換または還元により切断可能である光反応性架橋剤。タグを放出するために使用され得る切断性リンカーおよび切断条件の他の例は、以下のようである。シリル結合基は、フッ化物または酸性条件下により切断され得る。3-,4-,5-,または6-置換-2-ニトロベンジルオキシまたは2-,3-,5-,または6-置換-4-ニトロベンジルオキシ結合基は、光子の供給（光分解）により切断され得る。3-,4-,5-,または6-置換-2-アルコキシフェノキシまたは2-,3-,5-,または6 -置換-4-アルコキシフェノキシ結合基は、Ce(NH₄)₂(NO₃)₆（酸化）により切断され得る。NCO₂（ウレタン）リンカーは、水酸化物（塩基）、酸、またはLIAlH₄（還元）により切断され得る。3-ペンテニル、2-ブテニル、または1-ブテニル結合基は、O₃、OsO₄/IO₄ ^-、またはKMnO₄（酸化）により切断され得る。2-[3-,4-,または5-置換-フリル］オキシ結合基は、O₂、Br₂、MeOH、または酸により切断され得る。他の不安定な結合基の切断のための条件は、以下を含む：t-アルキルオキシ結合基は、酸により分解され得る；メチル（ジアルキル）メトキシまたは4-置換-2 -アルキル−1,3,-ジオキシラン-2-イル結合基は、H₃O⁺により分解され得る；2- シリルエトキシ結合基は、フッ化物または酸により分解され得る；2-(X)-エトキシ（ここで、X=ケト、エステルアミド、シアノ、NO₂、スルフィド、スルホキシド、スルホン）結合基は、アルカリ条件下で切断され得る；2-,3-,4-,5-,または 6-置換-ベンジルオキシ結合基は、酸によるかまたは還元的条件下で切断され得る；2-ブテニルオキシ結合基は、(Ph₃P)₃RhCl(H)により切断され得、3-,4-,5-, または6-置換-2-ブロモフェノキシ結合基は、Li、Mg、またはBuLiにより切断され得る；メチルチオメトキシ結合基は、Hg²⁺により切断され得る；2-(X)-エチルオキシ（ここで、X=ハロゲン）結合基は、ZnまたはMgにより切断され得る;2-ヒドロキシエチルオキシ結合基は、酸化（例えば、Pb(OAc)₄）により切断され得る。好ましいリンカーは、酸または光分解により切断され得るリンカーである。固相ペプチド合成のために開発されたいくつかの酸不安定なリンカーは、MOIにタグを結合するために有用である。いくつかのこれらのリンカーは、Lloyd-Willia msら（Tetrahedron 49:11065-11133,1993）により最近の総説に記載されている。一つの有用なタイプのリンカーは、p-アルコキシベンジルアルコールであり、その２つである4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸および4-(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)酪酸がAdvanced ChemTech(Loulsville,KY)より市販されている。両方のリンカーは、ベンジルアルコールへのエステル結合を介してタグに結合され得、そしてカルボン酸へのアミド結合を介してアミン含有MOIに結合され得る。これらの分子により結合されたタグは、種々のトリフルオロ酢酸の濃度を用いてMOIから放出される。これらのリンカーの切断は、タグ上でのカルボン酸の遊離を生じる。関連するリンカー（例えば、2,4-ジメトキシ-4'-(カルボキシメチルオキシ)-ベンズヒドリルアミン（Advanced ChemTechよりFMOC保護化形態で入手可能））を介して結合したタグの酸切断は、放出されたタグ上でのカルボン酸アミドの遊離を生じる。この適用に有用な感光性リンカーはまた、大多数が、固相ペプチド合成のために開発されている（Lloyd-Williamsの総説を参照のこと）。これらのリンカーは、通常は、2-ニトロベンジルエステルまたは2-ニトロベンジルアミドに基づく。文献に最近報告されている感光性リンカーの２つの例は、4-(4-(1-Fmoc-アミノ) エチル)-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ)酪酸（HolmesおよびJones、J.Org.Che m.60:2318-2319,1995）および3-(Fmoc-アミノ)-3-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸（Brownら、Molecular Diversity 1:4-12,1995）である。両方のリンカーは、カルボン酸を介してMOI上のアミンに結合され得る。タグのリンカーへの結合は、タグ上のカルボン酸とリンカー上のアミンとの間にアミドを形成することにより作製される。感光性リンカーの切断は、通常は、当該分野で公知の強度および時間で350nm波長のUV光を用いて実施される。光化学的切断のための装置の供給源の例は、Aura Industries Inc．(Staten Island,NY)およびAgrenetics(Wilm ington,MA)である。リンカーの切断は、タグ上の１級アミドの遊離を生じる。光切断性リンカーの例は、ニトロフェニルグリシンエステル、エキソ-およびエンド-2-ベンゾノルボルネイル(benzonorborneyl)クロライドおよびメタンスルホネート、ならびに3-アミノ-3(2-ニトロフェニル）プロピオン酸を含む。酵素的切断の例は、エステル結合を切断するエステラーゼ、ホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼ、ペプチド結合を切断するプロテアーゼなどを含む。 E. タグの検出検出方法は、代表的には、いくつかのタイプのスペクトル領域における吸収および発光に依存する。原子または分子が光を吸収する場合、入射エネルギーは、量子化された構造をより高いエネルギーレベルへ励起する。励起のタイプは、光の波長に依存する。電子は、紫外光または可視光により、より高い軌道に活性化され、分子振動は、赤外光により励起され、そして回転は、マイクロ波により励起される。吸収スペクトルは、波長の関数としての光の吸収である。原子または分子のスペクトルは、そのエネルギーレベル構造に依存する。吸収スペクトルは、化台物の同定に有用である。比吸光分光光度的方法は、原子吸光分光法(AA)、赤外分光法(IR)、およびUV-vis分光法(uv-vis)が含まれる。高エネルギーレベルに励起される原子または分子は、光線を放射することにより低いレベルに減衰し得る。光の発光は、遷移が同一スピン間の場合は蛍光と呼ばれ、遷移が異なるスピン間で生じる場合はリン光と呼ばれる。分析物の発光強度は、濃度（低濃度で）に直線的に比例し、そして発光種を定量するために有用である。比発光分光光度的方法は、原子発光分析(AES)、原子蛍光分析(AFS)、分子レーザー誘起蛍光(LIF)、およびＸ線蛍光(XRF)を含む。電磁波が物質を通過する場合、大部分の光線が元の方向で存続するが、少量が他の方向に散乱する。入射光として同一の波長で散乱する光は、Rayleigh散乱と呼ばれる。振動のために透明な固体中で散乱する光（フォノン）は、Brillouin 散乱と呼ばれる。Brillouin散乱は、代表的には、入射光から0.1〜１波数シフトする。分子中の振動または不透明な固体中の光学的フォノンにより散乱する光は、ラマン散乱と呼ばれる。ラマン散乱光は、入射光から4000波数と同じ量シフトする。特定の散乱分光学的方法は、ラマン分光法を含む。 IR分光法は、サンプルによる中間赤外光（mid−infrared light）の吸収の波長および強度の測定である。中間赤外光（2.5〜50μｍ、4000〜200cm^-1）は、分子振動をより高いエネルギーレベルに励起するのに十分にエネルギー性である。 IR吸収帯の波長は、化学結合の特定のタイプに特徴的であり、そしてIR分光法は、一般に、有機および有機金属分子の同定に最も有用である。近赤外光吸収分光法(NIR)は、サンプルによる近赤外光の吸収の波長および強度の測定である。近赤外光は、800nm〜2.5μｍ(12,500〜4000cm^-1)の範囲にわたり、そして分子振動の倍音および組み合わせをより高いエネルギーレベルに励起するのに十分にエネルギー性である。NIR分光法は、代表的には、有機の官能基（特にO-N、N-H、およびC=O）の定量的測定のために使用される。NIRの器械類の構成装置および設計は、uv-vis吸収分光計と同様である。光源は通常、タングステンランプであり、そして検出器は通常、PbS固体検出器(solid-state detector )である。サンプルホルダーは、ガラスまたは石英であり得、そして代表的な溶媒は、CCI₄およびCS₂である。NIR分光法の便利な器械類は、オンラインのモニタリングおよびプロセス制御に適している。紫外および可視吸収分光法(uv-vis)は、サンプルによる近紫外および可視光の吸収の波長および強度の測定である。真空UVの吸収は100〜200nm(10⁵〜50,000cm^-1 )、石英UVの吸収は200〜350nm（50,000〜28,570cm^-1)、および可視の吸収は35 0〜800nm(28,570〜12,500cm^-1)で起こり、そしてBeer-Lambert-Bouguetの法則により述べられる。紫外および可視光は、外殻電子をより高いエネルギーレベルに促進するのに十分にエネルギー性である。UV-vis分光法は通常、溶液中の分子および無機イオンまたは錯体に適用され得る。uv-visスペクトルは、スペクトルの広範な特徴により限定される。光源は、通常、UV測定については水素または重水素ランプであり、そして可視測定についてはタングステンランプである。これらの連続する光源の波長は、波長分離器（例えば、プリズムまたは格子モノクロメーター）を用いて選択される。スペクトルは波長分離器を走査することにより得られ、そして定量測定がスペクトルからまたは単一の波長で行われ得る。質量分析計は、イオン化された原子または分子の質量対電荷比(m/z)の差異を使用して、それらをお互いに分離する。それ故、質量分析法は、原子または分子の定量のために、そしてまた、分子についての化学的および構造的情報を決定するために有用である。分子は、化合物を同定するための構造的情報を提供する特有の断片化パターンを有する。質量分析計の一般的な操作は、以下のようである。気相イオンが作製され、イオンがその質量対電荷比に基づいて空間または時間で分離され、そして各質量対電荷比のイオンの量が測定される。質量分析計のイオン分離力は、分解能により述べられ、これはR=m/Δmとして定義される。ここで、mはイオン質量であり、そしてΔmは質量スペクトルにおける２つの分離可能なピークの間の質量の差異である。例えば、1000の分解能を有する質量分析計は、m/zが100.1のイオンからm/zが100.0のイオンを分離し得る。一般に、質量分析計(MS)は、イオン源、質量選択的な分析器、およびイオン検出からなる。磁気セクター型、四重極型、および飛行時間型の設計もまた、イオンを供給源領域から質量分析器に移すために、イオン光学の抽出および加速を必要とする。いくつかの質量分析器の設計（磁気セクター型MS、四重極型MS、または飛行時間型MS）の詳細は、以下で議論される。磁気セクター型MSのための一重集束型(focusing)分析器は、180、90、または60°の粒子ビーム経路を利用する。粒子に影響を与える種々の力は、異なる質量電荷比を有するイオンを分離する。二重集束型分析計では、静電気的分析器は、動力学的エネルギーの差異を有する粒子を分離するためにこのタイプの装置に加えられる。四重極型MSのための四重極型質量フィルターは、平行に配列された４つの金属ロッドからなる。印加電圧は，４つのロッドの間の中心である飛行経路を進み下りてくるイオンの軌道に影響を与える。所定のDCおよびAC電圧のために、特定の質量対電荷比のイオンのみが四重極型フィルターを通過し、そして全ての他のイオンはそれらの元の経路の外へ投げられる。質量スペクトルは、ロッド上の電圧が変化する際の四重極型フィルターを通過するイオンをモニターすることにより得られる。飛行時間型質量分析計は、異なる質量のイオンを分離するために、「ドリフト領域」を通過する移動時間の差異を使用する。これは、イオンがパルスで生成されるべきそして／またはパルスで抽出されるべきであるように、パルスモードで稼働する。パルスされた電場は、qVの動力学的エネルギー（ここで、qはイオン電荷であり、そしてVは、印加電圧である）で、全てのイオンを場のない(field- free)ドリフト領域へ向けて加速する。イオンの動力学的エネルギーは0.5mV²であるので、より軽いイオンはより重いイオンよりもより高い速度を有し、そしてより早くドリフト領域の末端の検出器に到達する。イオン検出器の出力は、時間の関数としてオシロスコープ上に示されて質量スペクトルを作成する。イオン形成手順は、質量分析の開始点である。化学イオン化は、分析分子（タグ）と反応する試薬イオンを使用して、プロトンまたはヒドリド移動によりイオンを形成する方法である。試薬イオンは、大過剰のメタン（タグに対して）を電子衝撃(EI)イオン源へ導入することにより生成される。電子衝突は、メタンとさらに反応してCH₅ ⁺およびC₂H₅ ⁺を形成するようなCH₄ ⁺およびCH₃ ⁺を生成する。タグをイオン化するような別の方法は、プラズマおよびグロー放電である。プラズマは、効率的に原子を励起しそしてイオン化する、熱く部分的にイオン化したガスである。グロー放電は、２つの電極間で維持された低圧のプラズマである。電子衝撃イオン化は、タングステンフィラメントから通常生成される電子ビームを使用して、気相の原子または分子をイオン化する。ビームからの電子は、電子を分析物の原子または分子から打ち落として、イオンを生成する。エレクトロスプレーイオン化は、非常に細い針および一組のスキマー(skimmer)を使用する。サンプル溶液は、原料チャンバにスプレーされ、液滴を形成する。液滴は、キャピラリーを抜け出る場合に電荷を有し、そして溶媒が気化するにつれて液滴は高い電荷を有する分析物分子を残して消失する。ESIは、気化またはイオン化が困難な大きな生物学的分子のために特に有用である。高速原子衝撃(FAB)は、脱離およびイオン化を引き起こす固体サンプルに衝突する中性原子（代表的には、XeまたはAr ）の高エネルギービームを使用する。これは、気相になることが困難な大きな生物学的分子のために使用される。FABは、ほとんど断片化を生じず、そして通常は、大きな分子イオンピークを示し、分子量決定に有用である。原子ビームは、電荷交換セルを介したイオン源からのイオンを加速することにより生成される。イオンは、中性原子との衝突において電子を捕捉して、高エネルギーの原子のビームを形成する。レーザーイオン化(LIMS)は、レーザーパルスが、サンプルの表面から物質を除去しそしていくつかのサンプル成分をイオン化するマイクロプラズマを生成する方法である。マトリックス補助(matrix-assisted)レーザー脱離イオン化(MALDI)は、大きな生物学的分子（例えば、タンパク質またはDNAフラグメント）を気化し、そしてイオン化するLIMS方法である。生物学的分子は、固体マトリックス（例えば、ニコチン酸）に分散される。UVレーザーパルスは、それらが質量分析計へ抽出され得るように、いくつかの大きな分子をイオン化形態で気相に運ぶマトリックスを除去する。プラズマ脱離イオン化(PD)は、反対方向に移動する２つの分裂フラグメントを生成する²⁵²Cfの崩壊を利用する。一方のフラグメントは、サンプルに衝突して１〜10の分析物イオンをたたき出す。他方のフラグメントは、検出器に衝突し、そしてデータ取得の開始を引き起こす。このイオン化方法は、大きな生物学的分子に特に有用である。共鳴イオン化(RIMS)は、１つ以上のレーザービームが気相原子または分子の遷移に対して共鳴するように調和されて、これのイオン化電位を越えて段階的な様式でこれを促進してイオンを生成する方法である。二次イオン化(SIMS)は、イオンビーム（例えば、³He⁺、¹⁶ O⁺、または⁴⁰Ar⁺）を使用し、これはサンプルの表面上に焦点を合わせられ、そして物質を気相に飛ばす。スパーク源は、電流を２つの電極を横切ってパルスすることにより固体サンプルにおける分析物をイオン化する方法である。タグは、これが付着する分子からの切断の前、その間、その後に荷電され得る。イオン化方法はイオン「脱離」に基づき、固体または液体表面からのイオンの直接的な形成または発光は、不揮発性および熱に不安定な化合物への適用を増大することを可能にする。これらの方法は、イオン化前の中性分子の気化の必要性を排除し、そして一般に分子種の熱分解を最小化する。これらの方法は、電界脱離（Becky、Principles of Field Ionization and Field Desorption Mass Spec trometry,Pergamon,Oxford,1977）、プラズマ脱離（SundqvistおよびMacfarlane 、Mass Spectrom.Rev.4:421,1985）、レーザー脱離（KarasおよびHillenkamp、A nal.Chem.60:2299,1988;Karasら、Angew.Chem.101:805,1989）、高速粒子衝撃（例えば、高速原子衝撃、FAB、および二次イオン質量分析、SIMS、Barberら、Ana l.Chem.54:645A,1982）、ならびに熱スプレー(TS)イオン化(Vesta1、Mass Spect rom.Rev.2:447,1983）を含む。熱スプレーは、液体クロマトグラフィーとのオンラインの組み合わせについて広範に適用される。連続流通(continuous flow)FAB 法（Caprioliら、Anal.Chem.58:2949,1986）はまた、顕著な可能性が示されている。イオン化／質量分析法の組み合わせのより完全なリストは、イオントラップ質量分析法、エレクトロスプレーイオン化質量分析法、イオンスプレー質量分析法、液体イオン化質量分析法、大気圧イオン化質量分析法、電子イオン化質量分析法、準安定原子衝撃イオン化質量分析法、高速原子衝撃イオン化質量分析法、 MALDI質量分析法、光イオン化飛行時間型質量分析法、レーザー液滴質量分析法、MALDI-TOF質量分析法、APCI質量分析法、ナノスプレー質量分析法、噴霧スプレーイオン化質量分析法、化学イオン化質量分析法、共鳴イオン化質量分析法、二次イオン化質量分析法、熱スプレー質量分析法である。不揮発性の生物学的化合物を分析できるイオン化方法は、適用性の重複する範囲を有する。イオン化効率は、マトリックス成分および化合物のタイプに非常に依存する。現在利用可能な結果は、TSについて上限の分子量は約8000ダルトンであることを示す（JonesおよびKrolik，Rapid Comm．Mass Spectrom.1:67,1987）。TSは、主に四重極型質量分析計と共に実行される（感度は、代表的には、より高い質量対電荷比(m/z)で非部分的に（disporportionately)影響される）。飛行時間型(TOF)質量分析計は市販され、そしてm/z範囲が検出器の能力によってのみ限定されるという利点を有する。最近、２つのさらなるイオン化方法が導入されている。これら２つの方法は、現在、マトリックス補助レーザー脱離（MALDI、K arasおよびHillenkamp、Anal.Chem.60:2299,1988；Karasら、Angew.Chem.101:80 5,1989）およびエレクトロスプレーイオン化(ESI)である。両方の方法論は、非常に高いイオン化効率を有する（すなわち、非常に高い[生成された分予イオン] ／[消費された分子]）。技術の最終的な可能性を規定する感度は、サンプルのサイズ、イオンの量、流速、検出効率、および実際のイオン化効率に依存する。エレクトロスプレーMSは、1960年代に最初に提示されたアイデアに基づく（Do leら、J.Chem.Phys.49:2240,1968）。エレクトロスプレーイオン化(ESI)は質量分析法による分析のための荷電した分子を生成する一つの手段である。簡単に述べると、エレクトロスプレーイオン化は、強い静電場に液体を噴霧することにより、高度に荷電した液滴を生成する。大気圧の乾燥バスのガス中で一般に形成される高度に荷電した液滴は、電荷の反発が凝集力を超えるまで、中性の溶媒のエバポレーションにより縮小し、「クーロン爆発（coulombic explosion）」に至る。イオン化の正確な機構は議論の余地があり、そしていくつかのグループが仮説を出している（Bladesら、Anal.Chem.63:2109-14,1991；Kebarleら、Anal.Che m.65:A972-86,1993；Fenn、J.Am.Soc.Mass.Spectrom.4:524-35,1993）。イオン形成の最終的なプロセスに関わらず、ESIは、穏やかな条件化で溶液から荷電した分子を生成する。少量の有機分子での有用な質量スペクトルデータを得る能力は、イオンの効率的な生成に依存する。ESIのイオン化の効率は、分子に関する正電荷の程度に関連する。イオン化の実験的な改良は、通常、酸性条件を使用することに関している。イオン化を改良する別の方法は、可能な場合に、四級アミンを使用する方法である（Aebersoldら、Protein Science 1:494-503,1992；Smithら、Anal.Chem. 60:436-41,1988を参照のこと）。エレクトロスプレーイオン化は、以下により詳細に記載される。エレクトロスプレーイオン生成は、２つの工程を必要とする：大気圧付近での高度に荷電した液滴の分散、次いで蒸発を導く条件である。分析物分子の溶液は、高い電位に保たれた針に通される。針の末端では、溶液は分散して分析物分子を含む、高度に荷電した液滴の小さなミストになる。小さな液滴は速やかに蒸発し、そして電界脱離または残りの蒸発によりプロトン化されたタンパク質分子が気相へと放出される。エレクトロスプレーは、一般に、キャピラリチューブからの液体のわずかな流れ（一般に1〜10μＬ/分）への高電場の適用により、生成される。３〜６kV の電位差は、代表的に、0.2〜2Ｒcm離れて配置されたキャピラリーと対電極との間に適用される（ここで、脱溶媒和の程度に依存するイオン、荷電したクラスター、およびさらに荷電した液滴は小口を介してMSによりサンプリングされ得る）。電場は、キャピラリーの末端で液体表面での電荷の蓄積を生じる。従って、液体の流速、抵抗率、および表面張力は、液滴の生成において重要なファクターである。高電場は、液体表面の破壊および高度に荷電した液滴の形成を生じる。正にまたは負に荷電した液滴は、キャピラリーのバイアスに依存して生成され得る。負のイオン形態は、電気的な放電を阻止する酸素のような電子捕捉剤の存在を必要とする。広範囲の液体は、真空中へ静電的にまたは噴霧剤の助けをかりてスプレーされ得る。噴霧のための電場のみの使用は、液体の電導率および誘電率の範囲に対するいくつかの実際的な制限の原因となる。10^-4M未満の水性電解質溶液に対応する、10^-5オーム未満の溶液電導率は、有用な液体の流速での安定なエレクトロスプレーのために、室温で必要である。ESI-MSに最も有用であると見出された形態において、適切な液体の流速は、液体の微細なミストとしての分散を生じる。キャピラリーからの短い距離は、液滴の直径をしばしば全く均一にし、そしておよそ１μｍにする。全てのエレクトロスプレーのイオン電流がより高い液体の流速のためにほんのわずかに増加することが、特に重要である。加熱はエレクトロスプレーを操作するために有用であるという証拠が存在する。例えば、わずかな加熱は、水溶液が容易にエレクトロスプレー化されることを可能にし、これはおそらく、粘性および表面張力の減少のためである。熱補助(thermally-assisted)およびガス噴霧補助(gas-nebulization-assisted)エレクトロスプレーは両方とも、より高い液体の流速を使用することを可能にするが、液滴の荷電の程度を減少する。分子イオンの形成は、最初の液滴群の蒸発をもたらす条件を必要とする。これは、乾燥ガスの中程度の温度（60℃未満）での流れにより、インターフェースを介した輸送の間の加熱により、および（特に、イオン捕獲方法の場合に）比較的低圧でのエネルギー性の衝突により、高圧で達成され得る。 ESIの基礎にある詳細なプロセスは不明のままであるが、ESIにより生成される非常に小さな液滴は、溶液中で正味の電荷を有するほとんどの種が残りの溶媒の蒸発の後に気相に移ることを可能にするようである。次いで、質量分析検出は、脱溶媒和の後に扱いやすいm/z範囲（四重極型装置については、4000ダルトン未満）を有し、そして十分な効率で生成され、伝導されるイオンを必要とする。広範囲の溶質は、ESI-MSで分析可能であることが既に見出されており、そして分子量に対するイオン化効率の実質的な相関関係の欠如は、高度に識別力がなくそして広範に適用可能なイオン化プロセスを示唆する。エレクトロスプレーのイオン「源」は、大気圧付近で機能する。エレクトロスプレー「源」は、代表的に、対電極に対して水溶液に電気的にバイアスをかけるための方法を組み入れている金属またはガラスのキャピラリーである。溶液（代表的には、分析物およびしばしば酢酸のような他の添加物を含む水-エタノール混合物）は、キャピラリーの末端へと流れる。本質的に任意の溶媒系に適合し得るESI源は、記載されている（Smithら、Anal.Chem.62:885,1990）。ESIについての代表的な流速は、１〜10μＬ/分である。ESI-MSインターフェースの主な必要条件は、イオンをサンプリングし、そして可能な限り効率的にイオンを高圧領域からMSへ運ぶことである。 ESIの効率は、非常に高く、極度に敏感な測定の原理を提供する。これは、本明細書中に記載される本発明に有用である。電流装置の性能は、１価に荷電した種について約２×10^-12Aまたは約10⁷カウント/秒である検出器において総イオン電流を提供し得る。装置の性能に基づいて、１価に荷電した種の10^-10Mまたは約 10^-18モル/秒ほどの低い濃度は、分析物が完全にイオン化される場合に、検出可能なイオン電流（約10カウント/秒）を示す。例えば、低いアトモルの検出限界が、キャピラリーゾーン電気泳動を有するESIインターフェースを使用して４級アンモニウムイオンについて得られている（Smithら、Anal.Chem.59:1230,1988）。1000の分子量の化合物については、電荷の平均数は１であり、荷電状態のおよその数は１であり、ピーク幅(m/z)は１であり、そして最大強度（イオン/秒）は１×10¹²である。非常にわずかなサンプルが、ESI質量スペクトルを得ることにおいて、実際に消費される（Smithら、Anal.Chem.60:1948,1988）。実質的なゲインもまた、セクター装置を有するアレイ検出器の使用により得られ得、これは、スペクトルの一部分の同時検出を可能にする。現在では、ESIにより形成された全てのイオンのわずか約10^-5しか検出されないので、装置の性能を制限するファクターへの注意は、改良された感度についての原理を提供し得る。本発明が、イオン化および検出の方法論における改良について意図しそして適合することは、当業者には、明らかである。インターフェースは、好ましくは、分離器械類（例えば、ゲル）と検出器（例えば、質量分析計）との間に配置される。インターフェースは、好ましくは、以下の特性を有する：(1)わずかな(discreet)時間間隔でDNAフラグメントを回収する能力、(2)DNAフラグメントの濃縮、(3)電気泳動の緩衝液および環境からのDNA フラグメントの取り出し、(4)タグのDNAフラグメントからの切断、(5)タグのDNA フラグメントからの分離、(6)DNAフラグメントの処分、(7)タグの揮発性溶液中への配置、(8)タグの気化およびイオン化、(9)タグを質量分析計へ誘導するエレクトロスプレーデバイスへのタグの配置または移動。インターフェースはまた、DNAフラグメントがゲルの底面から溶出するとDNAフラグメントを「回収する」能力を有する。ゲルは、スラブゲル、管状のゲル、キャピラリー等からなり得る。DNAフラグメントは、いくつかの方法により回収され得る。第一の方法は、DNAフラグメントが電極上でまたはその近辺で回収される電場の使用である。第二の方法は、DNAフラグメントが、液流をゲルの底面を通して流すことにより回収される方法である。両方法の局面は組み合わせられ、ここで、流れに回収されたDNAフラグメントは、後に、電場の使用により濃縮され得る。最終結果は、DNAフラグメントが分離方法が実施された環境から取り出されることである。つまり、DNAフラグメントは、電場の使用により一方の溶液タイプからもう一方の溶液タイプへと「ドラッグ(drag)」され得る。一旦、DNAフラグメントが適切な溶液（エレクトロスプレーおよび質量分析に適合する）中にあれば、タグはDNAフラグメントから切断され得る。次いで、DNA フラグメント（またはその残存物）が、電場の適用によりタグから分離され得る（好ましくは、タグは、DNAタグのDNAフラグメントの反対の電荷である）。次いで、タグは、電場または流れる液体の使用により、エレクトロスプレーデバイスに導かれる。蛍光タグは、それらの吸収および蛍光発光の波長および強度により最も直接的に同定され、そして定量され得る。連続する範囲の励起および発光波長(l_EX,l_S1,l_S2）を提供する従来の分光蛍光光度計は非常に順応性があるが、より特殊化された装置（例えば、フローサイトメーターおよびレーザー走査顕微鏡）は単一の固定された波長で励起可能なプローブを必要とする。最新の装置においては、これは、通常、アルゴンレーザーの 488nm線である。１プローブ分予あたりの蛍光強度は、生成物のeおよびQYに比例する。現在実用上重要である発蛍光団間のこれらのパラメーターの範囲は、εについては約10 ,000〜100,000cm^-1M^-1およびQYについては0.1〜1.0である。吸収が高強度の照明により飽和へとされる場合、励起された発蛍光団の不可逆的な破壊（光退色）が蛍光検出能を制限するファクターとなる。光退色の実際的な影響は、問題となる蛍光検出技術に依存する。デバイス（インターフェース）は、分離および検出工程の間に配置されて、サイズ分離およびタグ検出の連続する操作（リアルタイムで）を可能にし得ることは当業者に明らかである。これは、分離の方法論および器械類と検出の方法論および器械類とを一体にし、単一のデバイスを形成する。例えば、インターフェースは、分離技術と質量分析法または定電位電流測定による検出との間に配置される。インターフェースの機能は、主に、（例えば、質量分析の）タグの分析物からの放出である。インターフェースについてのいくつかの代表的な実行が存在する。インターフェースの設計は、切断性リンカーの選択に依存する。光山(light) または光(photo)切断性リンカーの場合、エネルギーまたは光子源が必要とされる。酸不安定リンカー、塩基不安定リンカー、またはジスルフィドリンカーの場合、試薬の添加がインターフェース内で必要とされる。熱不安定リンカーの場合、エネルギー熱源が必要とされる。酵素の添加が、酵素感受性リンカー（例えば、特異的なプロテアーゼとペプチドリンカー、ヌクレアーゼとDNAもしくはRNAリンカー、グリコシラーゼ、HRP、またはホスファターゼ）と切断後に不安定である（例えば、化学発光基質に類似する）リンカーについて必要とされる。インターフェースの他の特性は、最小のバンドの広がり、DNAの質量分析計への注入前のタグからの分離を含む。分離技術は、電気泳動的方法および技術、アフィニティー技術、サイズ保持（透析）、濾過などに基づく方法を含む。タグ（または、核酸-リンカー-タグ構築物）を濃縮し、電気泳動的にこれを捕捉し、次いでこれを選択されたイオン化方法の特定のタイプに適合する、代替(a lternate)試薬の流れに放出することがまた可能である。インターフェースはまた、マイクロビーズ上のタグ（または、核酸-リンカー-タグ構築物）を捕獲し、ビーズ（単数または複数）をチャンバに射出し、次いでレーザー脱離／気化を前もって形成し得る。流れにおいて代替緩衝液中へ抽出することもまた可能である（例えば、キャピラリー電気泳動緩衝液から透過性膜を越えて疎水性緩衝液へ）。いくつかの使用において、タグをインターフェースのさらなる機能を含む質量分析計へ断続的に送達することもまた望ましい。インターフェースの別の機能は、各カラムについての時間帯を交代しながら、タグを複数のカラムから質量分析計へと送達することである。タグを、時間で分離して単一のカラムから複数のMS 検出器へと送達すること、数ミリ秒間にタグの各セットを回収すること、次いで質量分析計に送達することもまた可能である。以下は、本発明において使用され得る分離および検出技術についての代表的な売手のリストである。Hoefer Scientific Instruments(San Franclsco,CA)は、配列決定アプリケーションについて電気泳動装置（Two Step^TM,Poker Face^TMII ）を製造する。Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ)は、DNA分離および配列決定のための電気泳動装置(PCR-SSCP分析のためのPhastSystem，DNA配列決定のためのM acroPhor System)を製造する。Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(ABI ,Foster City,CA)は、蛍光染料に基づく半自動シーケンサー(ABI373およびABI37 7)を製造する。Analytical Spectral Devlces(Boulder,CO)は、UV分光器を製造する。Hitachi Instruments(Tokyo,Japan)は、原子吸光分光器、蛍光分光器、LC およびGC質量分析器、NMR分光器、およびUV-VIS分光器を製造する。PerSeptive Biosystems(Framingham,MA)は、質量分析器(Voyager^TMElite)を生産する。Bruke r Instruments Inc.(Manning Park,MA)は、FTIR分光器(Vector22)、FT-ラマン分光器、飛行時間型質量分析器(Reflex II^TM)、イオン捕捉質量分析器(Esquire^TM) 、およびMaldi質量分析器を製造する。Analytical Technology Inc.(ATI,Boston ,MA)は、キャピラリーゲル電気泳動ユニット、UV検出器、およびダイオードアレイ検出器を作製する。Teledyne Electronic Technologies(Mountain View,CA)は、イオン捕捉質量分析器(3DQ Discovery^TMおよび3DQA pogee^TM)を製造する。Per kin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City,CA)は、エレクトロスプレーに適合するSCiex質量分析器(三重の四重極型LC/MS/MS、API 100/300)を製造する。Hewlett−Packard(Santa Clara,CA)は、質量選択的検出器(HP 5972A)、MA LDI-TOF質量分析器(HP G2025A)、ダイオードアレイ検出器、CEユニット、HPLCユニット(HP 1090)、ならびにUV分光器を生産する。Finnigan Corporation(San Jo se,CA)は、質量分析器（磁気セクター(MAT 95 S^TM)、四重極型分光器(MAT 95 SQ^TM )、および４つの他の関連する質量分析器）を作製する。Rainin(Emeryville,C A)は、HPLC装置を作製する。本明細書中に記載される方法および組成物は、特定のサンプルタイプおよびヌクレオチド同一性に対するマップとして作用する切断されるタグの使用を可能にする。各配列決定法の始めに、特定の（選択された）プライマーは、特定の独特のタグに割り当てられる。タグは、サンプルタイプ、ジデオキシターミネータータイプ（Sanger配列決定反応の場合）、または好ましくは両方のいずれかをマップする。特に、タグは、プライマータイプをマップし、次にはベクタータイプをマップし、次にはサンプルの同一性をマップする。タグはまた、タグ化プライマーが配置されるジデオキシヌクレオチド反応を参照してジデオキシターミネータータイプ(ddTTP,ddCTP,ddGTP,ddATP)をマップし得る。次いで、配列決定反応が実施され、そして得られるフラグメントはちようどよい時にサイズにより連続的に分離される。タグは、時間枠内にフラグメントから切断され、そして測定され、そして時間枠内で記録される。配列は、タグマップを時間枠と比較することにより構築される。つまり、全てのタグの同一性が、サイジング(sizing)工程の後にちょうどよい時に記録され、そして時間枠内で互いに関連する。サイジング工程は、１つのヌクレオチドの増加により核酸フラグメントを分離し、それ故、関連するタグの同一性は、一つのヌクレオチドの増加により分離される。ジデオキシターミネーターまたはヌクレオチドマップおよびサンプルタイプの予知により、配列は、直線的様式で容易に推定される。以下の実施例は、制限の目的ではなく例証の目的により提供される。他で述べない限り、実施例において使用されるような化学物質は、Aldrich Ch emical Company,Milwaukee,WIから入手され得る。以下の略語は、示される意味を有して、本明細書中で使用される： ANP=3-(Fmoc-アミノ)-3−(2-ニトロフェニル）プロピオン酸 NBA=4-(Fmoc-アミノメチル)-3-ニトロ安息香酸 HATU=O-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート DIEA=ジイソプロピルエチルアミン MCT=モノクロロトリアジン NMM=4-メチルモルホリン NMP=N-メチルピロリドン ACT357=Advanced ChemTech,Inc.,Loulsville,KYからのACT357ペプチド合成機 ACT=Advanced ChemTech,Inc.,Louisville,KY NovaBiochem=CalBiochem-NovaBiochem international,San Diego,CA TFA=トリフルオロ酢酸 Tfa=トリフルオロアセチル iNIP=N-メチルイソニペコ酸 Tfp=テトラフルオロフェニル DIAEA=2-(ジイソプロピルアミノ)エチルアミン MCT=モノクロロトリアゼン 5'-AH-ODN=5'-アミノヘキシル-末端化オリゴデオキシヌクレオチド実施例実施例１切断可能なMW同定因子配列決定における使用のための酸不安定性リンカーの調製 A.カルボキシルアミド末端を有する遊離タグのための化学的に切断可能な質量分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成図１は反応図を示す。工程A。 TentaGel S AC樹脂（化合物II；ACTより入手可能：1eq.）を、ACT357ペプチド合成装置（ACT）の回収コンテナ中でDMFに懸濁する。DMF中の化合物I（３ eq.）、HATU（３eq.）、およびDIEA（7.5eq.）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。樹脂へのIのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物IIIを得る。工程B。樹脂（化合物III）を、DMF中の25％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでDMF中の25％ピペリジンと混合し、そして10分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２ ×）で洗浄し、そして工程Ｃに直接用いる。工程C。工程Ｂからの脱保護樹脂をDMFに懸濁し、そしてDMF中の側鎖にアミン官能基を含むFMOC保護アミノ酸（化合物IV（例えば、α-N-FMOC-3-(3-ピリジル)- アラニン）Synthetech，Albany，ORより入手可能;３eq.）、HATU（３eq.）、およびDIEA（7.5eq.）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。樹脂ヘのIVのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物Vを得る。工程D。樹脂（化合物V）を工程Ｂに記載のようにピペリジンで処理し、FMOC基を除去する。次いで、脱保護樹脂を、ACT357によって、回収コンテナから16の反応コンテナへ均等に分配する。工程E。工程Dからの脱保護樹脂の16のアリコートをDMF中に懸濁する。各反応コンテナに、DMF中の適切なカルボン酸VI_1-16（R_1-16CO₂H；３eq.）、HATU（３eq. ）、およびDIEA（7.5eq.）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂のアリコートをNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのVI_1-16のカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物VII_1-16を得る。工程F。樹脂（化合物VII_1-16）のアリコートを、CH₂Cl₂（３×）で洗浄する。各反応コンテナに、CH₂Cl₂中の１％TFAを添加し、そしてコンテナを30分間振盪する。溶媒を、反応コンテナから個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートを CH₂Cl₂（２×）およびMeOH（２×）で洗浄し、そして濾過物を個々のチューブと合わせる。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物VIII_1-16を得る。工程G。各遊離カルボン酸VIII_1-16を、DMFに溶解する。各溶液にピリジン（1.05 eq.）を加え、続いてペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（1.1eq. ）を加える。混合物を、室温で45分間撹拌する。溶液をEtOAcで希釈し、１M aq. のクエン酸（３×）および５％ aq.のNaHCO₃（３×）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物IX_1-16を得る。 B. カルボキシル酸末端を有する遊離タグのための化学的に切断可能な質量分析タグのペンタフルオロフェニルエステルの合成図２は反応図を示す工程A。４-（ヒドロキシメチル）フェノキシ酪酸（化合物I；１eq.）を、CHCl₃ 中のDIEA（2.1eq.）およびアリルブロマイド（2.1eq.）と合わせ、そして２時間加熱還流する。混合物をEtOAcで希釈し、１N HCl（２×）、炭酸緩衝液（pH9.5 ）（２×）、および塩水（１×）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、そして真空で蒸発させ、化合物Iのアリルエステルを得る。工程B。工程Aからの化合物Iのアリルエステル（1.75eq.）を、CH₂Cl₂中で、側鎖にアミン官能基を含むFMOC保護アミノ酸（化合物II（例えば、α-N-FMOC-3-(3 -ピリジル）-アラニン）Synthetech，Albany，ORより入手可能;１eq.）、N-メチルモルフォリン（2.5eq.）およびHATU（1.1eq.）と合わせ、そして室温で４時間撹拌する。混合物をCH₂Cl₂で希釈し、１M aq.のクエン酸（２×）、水（１×）、および５％ aq.のNaHCO₃（２×）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、そして真空下で蒸発させる。化合物IIIをフラッシュクロマトグラフィー（CH₂Cl₂-->EtOAc）によって単離する。工程C。化合物IIIを、CH₂Cl₂に溶解し、Pd(PPh₃)₄（0.07eq.）およびN-メチルアニリン（２eq.）を添加し、そして混合物を室温で４時間撹拌する。混合物をCH₂ Cl₂で希釈し、１M aq.のクエン酸（２×）および水（１×）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、そして真空下で蒸発させる。化合物IVをフラッシュクロマトグラフィー（CH₂Cl₂-->EtOAc＋HOAc）によって単離する。工程D。 TentaGel S AC樹脂（化合物V；１eq.）を、ACT357ペプチド合成装置（Ad vanced ChemTech Inc．(ACT),Loulsville，KY）の回収コンテナ中でDMFに懸濁する。DMF中の化合物IV（３eq.）、HATU（３eq.）、およびDIEA（7.5eq.）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。樹脂へのIVのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物VIを得る。工程E。樹脂（化合物VI）を、DMF中の25％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでDMF中の25％ピペリジンと混合し、そして10分間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF （２×）で洗浄する。次いで、脱保護樹脂を、ACT357によって、回収コンテナから16の反応コンテナへ均等に分配する。工程F。工程Eからの脱保護樹脂の16のアリコートを、DMFに懸濁する。各反応コンテナに、DMF中の適切なカルボン酸VII_1-16（R_1-16CO₂H；３eq.）、HATU（３eq .）、およびDIEA（7.5eq.）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、そして樹脂のアリコートをNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２× ）で洗浄する。樹脂のアリコートへのVII_1-16のカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物VIII_1-16を得る。工程G。樹脂（化合物VIII_1-16）のアリコートを、CH₂Cl₂（３×）で洗浄する。各反応コンテナに、CH₂Cl₂中の１％TFAを添加し、そしてコンテナを30分間振盪する。溶媒を、反応コンテナから個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートを CH₂Cl₂（２×）およびMeOH（２×）で洗浄し、そして濾過物を個々のチューブに合わせた。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物IX_1-16を得る。工程H。各遊離カルボン酸IX_1-16を、DMFに溶解する。各溶液にピリジン（1.05eq .）を加え、続いてペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（1.1eq.）を加える。混合物を、室温で45分間撹拌する。溶液をEt0Acで希釈し、１M aq.のクエン酸（３×）および５％ aq.のNaHCO₃（３×）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物X_1-16を得る。実施例２ T-L-Xの光分解性切断の実証実施例13で調製されたT-L-X化合物を、室温で７分間、近紫外光で照射した。発光ピーク350nmを有するRayonett蛍光UVランプ（Southern New England Ultrav iolet Co.，Middletown，CT）を、UV光供給源として用いる。ランプを、試料を有するペトリ皿から15cm離して置く。SDSゲル電気泳動は、結合の＞85％がこれらの条件下で切断されることを示す。実施例３蛍光標識化プライマーの調製および発蛍光団の切断の実証オリゴヌクレオチドの合成および精製オリゴヌクレオチド（ODN）を、製造業者より供給される標準ホスホルアミダイト化学、またはH-ホスホネート化学（Glenn Research Sterling，VA）を用いて自動DNA合成装置で調製する。適切にブロックされたdA、dG、dC、およびＴホスホルアミダイトは、これらの形態で市販され、そして合成ヌクレオシドは、適切な形態に容易に変換され得る。オリゴヌクレオチドを、製造業者より供給される標準ホスホルアミダイト、またはH-ホスホネート化学を用いて調製する。オリゴヌクレオチドを、標準方法を適応することによって精製する。5'トリチル基を有するオリゴヌクレオチドを、12μｍ、300#Rainin（Emeryville，CA）Dynamax C -84.2×250mm逆相カラムを用いて、0.1N Et₃NH⁺OAc^-(pH7.0)中の15％〜55％MeCN の勾配で20分間、HPLCでクロマトグラフする。脱トリチル化を行う場合、オリゴヌクレオチドを、ゲル排除クロマトグラフィーによってさらに精製する。オリゴヌクレオチドの質の分析的チェックを、アルカリpHでPRPカラム（Alltech，Deer field，IL）、およびPAGEで行う。 2,4,6-トリクロロトリアジン誘導オリゴヌクレオチドの調製：5'末端アミン連結オリゴヌクレオチドの10〜1000μｇを、19℃〜25℃で30〜120分間、アルカリ（好ましくはpH8.3〜8.5）緩衝液において10％n-メチルピロリドン中の過剰の再結晶化塩化シアヌル酸と反応させる。最終反応条件は、0.15Mホウ酸ナトリウム（pH8.3）、２mg/mlの再結晶化塩化シアヌル酸、および500μｇ／mlのそれぞれのオリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌル酸を、G-50 Sephadex（P harmacla，Piscataway，NJ）カラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、活性化した精製オリゴヌクレオチドを、0.15Mホウ酸ナトリウム（pH8 .3）中の100倍モル過剰のシスタミンと室温で１時間反応させる。未反応のシスタミンを、G-50 Sephadexカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、得られたODNを、アミン反応性蛍光色素と反応させる。得られたODN調製物を、３つの部分に分け、そして各部分を(a)20倍モル過剰のTexas Re dスルホニルクロライド（Molecular Probes，Eugene，OR）、(b)20倍モル過剰の Lissamineスルホニルクロライド（Molecular Probes，Eugene，OR）(c)20倍モル過剰のフルオレセインイソチオシアネートのいずれかと反応させる。最終反応条件は、室温で１時間の0.15Mホウ酸ナトリウム（pH8.3）からなる。未反応の蛍光色素を、G-50 Sephadexカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。オリゴヌクレオチドから蛍光色素を切断するために、ODNを、１×10^-5モル濃度に調整し、次いで希釈物を、TE（TEは、0.01M Tris（pH7.0）、５mM EDTAである）中で作製する（12,3倍希釈）。100μｌ容量のODNに対して、25μｌの0.01M ジチオスレイトール（DTT）を添加する。コントロールの同一のセットに対しては、DTTを加えない。混合物を、室温で15分間インキュベートする。蛍光を、黒マイロタイタープレートにおいて測定する。溶液をインキュベーションチューブ（15 0μｌ）から取り出し、そして黒マイクロタイタープレート（Dynatek Laborator ies，Chantilly，VA）に入れる。次いで、プレートを、フルオレセインについては495nmの励起波長および520nmのモニター発光、Texas Redについては591nmの励起波長および612nmのモニター発光、およびLissamineについては570nmの励起波長および590nmのモニター発光で、Fluoroskan II蛍光光度計（Flow Laboratorie s，McLean，VA）を用いて直接読みとる。データは、蛍光色素をODNから切断した場合、相対的な蛍光が約200倍増加することを示す。実施例４タグ化M13配列プライマーの調製およびタグの切断の実証 2,4,6-トリクロロトリアジン誘導オリゴヌクレオチドの調製：1000μｇの5'末端アミン連結オリゴヌクレオチド（5'ヘキシルアミン-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'）（配列番号１）を、19℃〜25℃で30〜120分間、アルカリ（好ましくはpH8.3〜8. 5）緩衝液において10％n-メチルピロリドン中の過剰の再結晶化塩化シアヌル酸と反応させる。最終反応条件は、0.15Mホウ酸ナトリウム（pH8.3）、２mg/mlの再結晶化塩化シアヌル酸、および500μｇ/mlのそれぞれのオリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌル酸を、G-50 Sephadexカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、活性化した精製オリゴヌクレオチドを、0.15Mホウ酸ナトリウム（pH8 .3）中の100倍モル過剰のシスタミンと室温で１時間反応させる。未反応のシスタミンを、G-50 Sephadexカラムで、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、得られたODNを、種々のアミドと反応させる。得られたODN調製物を、12の部分に分割し、そして各部分を、（１）4-メトキシ安息香酸、（２） 4-フルオロ安息香酸、（３）トルイル酸、（４）安息香酸、（５）インドール -3-酢酸、（６）2,6-ジフルオロ安息香酸、（７）ニコチン酸N-オキシド、（８）2-ニトロ安息香酸、（９）5-アセチルサリチル酸、(10)4-エトキシ安息香酸、（11）桂皮酸、（12）3-アミノニコチン酸のいずれかのペンタフルオロフェニルエステル（25モル過剰）と反応させる。0.2Mホウ酸ナトリウム（pH8.3）中で、3 7℃で２時間反応させる。得られたODNを、G-50 Sephadexで、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製する。オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、ODNを、１×10^-5モル濃度に調整し、次いで希釈物を、50％Et0H（V/V）を含むTE（TEは、0.01M Tris（pH7.0 ）５mM EDTAである）中で希釈する（12,3倍希釈）。100μｌ容量のODNに対して、25μｌの0.01Mジチオスレイトール（DTT）を添加する。コントロールの同一のセットに対しては、DTTを加えない。インキュベーションは、室温で30分間である。次いで、NaClを0.1Mまで加え、そして２容量のEtOHを添加し、ODNを沈殿させる。ODNを、14,000×G、４℃で15分間の遠心分離によって溶液から除去する。上清を保存し、完全に乾燥する。次いで、ペレットを、25μｌのMeOHに溶解する。次いで、ペレットを、タグの存在について質量分析によって試験する。この研究に用いた質量分析計は、外部イオン供給源フーリエ変換質量分析計（ FTMS）である。MALDI分析のために調製した試料を、直接プローブの先端部に沈積し、そしてイオン供給源に挿入する。試料をレーザーパルスで照射する場合、イオンを供給源から抽出し、そして超伝導磁石の口径内に位置するFTMS分析装置のセルに焦点を合わせ、かつ輸送する長四重極イオンガイドに通過させる。スペクトルは、以下の情報をもたらす。以下の分子量での25〜100相対強度単位の強度において変化するピーク：（１）4-メトキシ安息香酸誘導体を示す212. lamu、（２）4-フルオロ安息香酸誘導体を示す200.1、（３）トルイル酸誘導体を示す196.1amu、（４）安息香酸誘導体を示す182.1amu、（５）インドール-3- 酢酸誘導体を示す235.2amu、（６）2,6-ジフルオロ安息香酸を示す218.1amu、（７）ニコチン酸N-オキシド誘導体を示す199.1amu、（８）2-ニトロベンズアミドを示す227.1amu、（９）5-アセチルサリチル酸誘導体を示す179.18amu、（10）4 -エトキシ安息香酸誘導体を示す226.1amu、（11）桂皮酸誘導体を示す209.1amu 、（12）3-アミノニコチン酸誘導体を示す198.1amu。結果は、MW同定因子がプライマーから切断され、そして質量分析によって検出され得ることを示す。実施例５ HPLC分離法、画分収集、MW同定因子切断、MW同定因子の質量（従って同一性）の決定、次いで配列の推定を用いた配列決定の実証以下のオリゴヌクレオチドは実施例４に記載のように調製される。上記の100μｇの各5'末端アミン連結オリゴヌクレオチドを、19℃〜25℃にて3 0〜120分間10％n-メチル-ピロリドンアルカリ（好ましくはpH8.3〜8.5）中の過剰の再結晶化塩化シアヌルと反応させる。最終的な反応条件は、0.15Mホウ酸ナトリウム、pH8.3、2mg/mlの再結晶化塩化シアヌルおよび500ug/mlの各オリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌルを、G-50 Sephadexカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、活性化精製オリゴヌクレオチドを、0.15Mホウ酸ナトリウム、pH8.3で１時間室温にて100倍モル過剰のシスタミンと反応させる。未反応のシスタミンを、G-50 Sephadexカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、誘導体化したODNを以下の特定のペンタフルオロフェニル−エステルと反応させる：（1）4−メトキシ安息香酸を有するDM0767、（２）4-フルオロ安息香酸を有するDMO768、（3）トルイル酸、（4）安息香酸を有するDMO769 、（5）インドール-3-酢酸を有するDM0770、（6）2,6-ジフルオロ安息香酸を有するDMO771，（7）ニコチン酸N-オキシドを有するDM0772、（8）2-ニトロ安息香酸を有するDMO773。 10ngのそれぞれの８つの誘導体化ODNを共に混合し、次いでHPLCによってサイズ分離する。混合物を25μｌの蒸留水に入れる。完全なサンプルを以下のカラムに注入する。LiChrospher 4000 DMAE、50〜10mmカラムを用いる（EM Separatｉo ns，Wakefield，RI）。溶出液Ａは20％ACN中の20mM Na₂HPO₄、pH7.4であり：溶出液Ｂは溶出液Ａ＋1M NaCl，pH7.4である。流速は１ml/分であり、そして検出はUV＠280nmである。グラジエントは以下の通りである：０分＠100％Ａおよび０％Ｂ、３分＠100％Ａおよび０％Ｂ，15分＠80％Ａおよび20％Ｂ、60分＠０％Ａおよび100％Ｂ、63分＠０％Ａおよび100％Ｂ、65分＠100％Ａおよび０％Ｂ、７０分＠100％Ａおよび０％Ｂ。画分を0.5分間隔で収集する。オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、100μｌの0.05Mジチオスレイトール（DTT）を各画分に添加する。インキュベーションは室温で30分間である。次いで、NaClを0.1Mになるように添加し、そして２容量のEtOHを添加してODN を沈殿させる。ODNを、14,000×Ｇで４℃にて15分間の遠心分離によって溶液から取り出す。上清を保存し、遠心分離しながら真空下で完全に乾燥させる。次いで、ペレットを25μｌのMeOH中に溶解させる。次いで、ペレットを、MW-同定因子の存在について質量分析によって試験する。同一のMALDI技術を、実施例４に記載のように使用する。以下のMW（タグ）を、時間の関数として質量スペクトル中で観察する。従って、タグの時間的出現は、212.1，200.1、196.1、182.1、235.2，218.1、 199.1、227.1である。212.1amuは4-メトキシ安息香酸誘導体を示し、200.1は4- フルオロ安息香酸誘導体を示し、196.1amuはトルイル酸誘導体を示し、182.1amu は安息香酸誘導体を示し、235.2amuはインドール-3-酢酸誘導体を示し、218.1am uは2,6-ジフルオロベンゼン誘導体を示し、199.1amuはニコチン酸N-オキシド誘導体を示し、227.1amuは2-ニトロベンズアミドを示すので、配列は-5'-ATGCATG- 3'-であると推定され得る。実施例６単一HPLC分離法における２つのDNAサンプルの配列決定の実証本実施例において、２つのDNAサンプルを単一の分離法において配列決定する。以下のオリゴヌクレオチドを、実施例１に記載のように調製する：上記の100μｇの各5'末端アミン連結オリゴヌクレオチドを、19℃〜25℃にて3 0〜120分間10％n-メチル-ピロリドンアルカリ（好ましくはpH8.3〜8.5）中の過剰の再結晶化塩化シアヌルと反応させる。最終的な反応条件は、0.15Mホウ酸ナトリウム、pH8.3、2mg/mlの再結晶化塩化シアヌルおよび500ug/mlの各オリゴヌクレオチドからなる。未反応の塩化シアヌルを、G-50 Sephadexカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、活性化精製オリゴヌクレオチドを、0.15Mホウ酸ナトリウム、pH8.3中で１時間室温にて100倍モル過剰のシスタミンと反応させる。未反応のシスタミンを、G-50 Sephadexカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。次いで、誘導体化ODNを以下の特定のペンタフルオロフェニル-エステルと反応させる：（1）4-メトキシ安息香酸を有するDMO767およびニコチン酸N-オキシドを有するDMO773、（2）4-フルオロ安息香酸を有するDMO768および2-ニトロ安息香酸を有するDMO774、（3）トルイル酸およびアセチルサリチル酸を有するDMO775、（4）安息香酸を有するDMO769および4-エトキシ安息香酸を有するDMO 776、（5）インドール-3-酢酸を有するDMO770およびケイ皮酸を有するDMO777、（6）2,6-ジフルオロ安息香酸を有するDMO771および3-アミノニコチン酸を有するDMO778。それ故、ODNの各セットに対して１つのタグが存在する。 10ngのそれぞれの12の誘導体化ODNを共に混合し、次いでHPLCによってサイズ分離する。混合物を25μｌの蒸留水に入れる。完全なサンプルを以下のカラムに注入する。LiChrospher 4000 DMAE、50〜10mmカラムを用いる（EM Separation， Wakefield，RI）。溶出液Ａは20％ACN中の20mM Na₂HPO₄、pH7.4であり；溶出液Ｂは溶出液Ａ＋1M NaCl、pH7.4である。流速は１ml/分であり、そして検出はUV ＠280nmである。グラジエントは以下の通りである：０分＠100％Ａおよび０％Ｂ、３分＠100％Ａおよび０％Ｂ、15分＠80％Ａおよび20％Ｂ、60分＠０％Ａおよび100％Ｂ、63分＠０％Ａおよび100％Ｂ、65分＠100％Ａおよび０％Ｂ、70分＠1 00％Ａおよび０％Ｂ。画分を0.5分間隔で収集する。オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、100μｌの0.05Mジチオスレイトール（DTT）を各画分に添加する。インキュベーションは室温で30分間である。次いで、NaClを0.1Mになるように添加し、そして２容量のEtOHを添加してODN を沈殿させる。ODNを、14,000×Ｇで４℃にて15分間の遠心分離によって溶液から取り出す。上清を保存し、遠心分離しながら真空下で完全に乾燥させる。次いで、ぺレットを25μｌのMeOH中に溶解させる。次いで、ペレットを、タグの存在について質量分析によって試験する。同一のMALDI技術を、実施例４に記載のように使用する。以下のMW（タグ）を、時間の関数として質量スペクトル中で観察する。セット#1に対するタグの時間的出現は、212.1，200.1．196.1．182.1、235.2, 218.1、199.1、227.1であり、そしてセット#2に対するタグの時間的出現は199.1 、227.1、179.1、226.1、209.1、198.1である。212.1amuは４−メトキシ安息香酸誘導体を示し、200.1は４-フルオロ安息香酸誘導体を示し、196.1amuはトルイル酸誘導体を示し、182.1amuは安息香酸誘導体を示し、235.2amuはインドール-3 -酢酸誘導体を示し、218.1amuは2,6-ジフルオロベンゼン誘導体を示し、199.1am uはニコチン酸N-オキシド誘導体を示し、227.1amuは2-ニトロベンズアミドを示し、179.18amuは5-アセチルサリチル酸誘導体を示し、226.lamuは4-エトキシ安息香酸誘導体を示し、209.1amuはケイ皮酸誘導体を示し、そして198.1amuは3-アミノニコチン酸を示すので、最初の配列は-5'-TATGCA-3'-であると推定され得、そして第２の配列は-5'-CGTACC-3'-であると推定され得る。従って、分離工程あたりに１つより多いDNAサンプルを配列決定し得る。実施例７式R_1-36-LYS(ε-lNIP)-ANP-TFPを有する化合物のセットの調製図３は、36のT-L-X化合物（X=L_h）のセットの平行合成を例示する。L_hは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、L²は、L_hおよび L²を連結するメチレン基であるL³を有するo-ニトロベンジルアミン基であり、T はモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、L²ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分R_1-36（これらのR基は本明細書中に記載のT²に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのα-アミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（N-メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのε-アミノ基を介して結合される。図３について言及する：工程A。 NovaSyn HMP樹脂（NovaBiochemより入手可能；１eq.）を、ACT357の回収コンテナ中のDMFに懸濁する。DMF中の化合物I（ACTより入手可能なANP；３eq.）、HATU（３eq.）およびNMM（7.5eq.）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。樹脂へのIのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物IIを得る。工程B。樹脂（化合物II）を、DMF中の25％ピペリジンと混合し、５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでDMF中の25％ピペリジンと混合し、そして10分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄し、そして工程Cに直接用いる。工程C。工程Ｂからの脱保護樹脂を、DMF中に懸濁し、DMF中の、側鎖に保護アミン官能基を含むFMOC保護アミノ酸（Fmoc-Lysine(Aloc)-OH、PerSeptive Biosyst emsより入手可能；３eq.）、HATU（３eq.）、およびNMM(7.5eq.)を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。Fmoc-Lys(Aloc)-OHの樹脂へのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物IVを得る。工程D。樹脂（化合物IV)を、CH₂Cl₂（２×）で洗浄し、次いで、CH₂Cl₂中の(PPh₃ )₄Pd(0)（0.3eq.）およびPhSiH₃（10eq.）の溶液に懸濁する。混合物を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をCH₂Cl₂（２×）で洗浄する。パラジウム工程を反復する。溶媒を除去し、樹脂をCH₂Cl₂（２×）、DMF中のN,N-ジイソピロピルエチルアンモニウムジエチルジチオカルバメート（２×）、およびDMF（２×）で洗浄し、化合物Vを得る。工程E。工程Dからの脱保護樹脂を、工程Cに記載のN-メチルイソニペコ酸とカップリングさせ、化合物VIを得る。工程F。 Fmoc保護樹脂VIを、ACT357によって、回収コンテナから36反応コンテナに等しく分配し、化合物VI_1-36を得る。工程G。樹脂（化合物VI_1-36）を工程Ｂに記載のピペリジンで処理し、FMOC基を除去する。工程H。工程Gからの脱保護樹脂の36アリコートを、DMF中に懸濁する。各反応コンテナに、DMF中の適切なカルボン酸（R_1-36CO₂H；３eq.）、HATU（３eq.）、およびNMM（7.5eq.）を添加する。コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂のアリコートをNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。樹脂のアリコートへのR_1-36CO₂Hのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物V III_1-36を得る。工程I。樹脂（化合物VIII_1-36）のアリコートをCH₂Cl₂（３×）で洗浄する。各反応コンテナに、90：５：５ TFA：H20：CH₂Cl₂を添加し、コンテナを120分間振盪する。溶媒を反応コンテナから個々のチューブに濾過する。樹脂のアリコートをCH₂Cl₂（２×）およびMeOH（２×）で洗浄し濾過物を個々のチューブに合わせる。個々のチューブを真空下で蒸発させ、化合物IX_1-36を得る。工程J。各々の遊離カルボン酸IX_1-36を、DMF中に溶解させる。各溶液に、ピリジン（1.05eq.）を添加し、続いて、テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（1.1eq.）を添加する。混合物を、室温で45分間撹拌する。溶液をEtOAcで希釈し、５％aq.のNaHCO₃（３×）で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させ、濾過し、そして真空下で蒸発させ、化合物X_1-36を得る。実施例８式R_1-36-LYS(ε-1NIP)-NBA-TFPを有する化合物のセットの調製図４は、36のT-L-X化合物（X=L_h）のセットの平行合成を例示する。L_hは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、L²は、L_hとL²との間で直接結合されるＬ³を有するｏ-ニトロベンジルアミン基であり（L_hはL²基の芳香環に直接結合する）、Tはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、L²ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分R_1-36（これらのR基は本明細書中に記載のT²に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのαアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（ N-メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのε-アミノ基を介して結合される。図４について言及する：工程A。 NovaSyn HMP樹脂を、実施例７の工程Aに記載の手順に従って、化合物I （Brownら、Molecular Diversity，１，４(1995)の手順に従って調製されたNBA ）とカップリングさせ、化合物IIを得る。工程B-J。樹脂（化合物II）を、実施例７の工程B〜Jに記載のように処理し、化合物X_1-36を得る。実施例９式1NIP-LYS(ε-R_1-36)-ANP-TFPを有する化合物のセットの調製図５は、36のT-L-X化合物（X=L_h）のセットの平行合成を例示する。L_hは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、L²は、L_hおよび L²を連結するメチレン基であるL³を有するｏ-ニトロベンジルアミン基であり、T はモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、L²ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分R_1-36（これらのR基は本明細書中に記載のT²に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのεアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（N-メチルイソニペコ酸を介して導入される）は、リジンのα-アミノ基を介して結合される。図５について言及する：工程A〜C。実施例７と同じ。工程D。樹脂（化合物IV）を、実施例５の工程Ｂに記載のピリジンで処理し、FMO C基を除去する。工程E。工程Dの樹脂上の脱保護αアミンを、実施例５の工程Ｃに記載のN-メチルイソニペコ酸とカップリングさせ、化合物Vを得る。工程F。実施例７と同じ。工程G。樹脂（化合物VI_1-36）を、実施例７の工程Dに記載のパラジウムで処理し、Aloc基を除去する。工程H〜J。化合物X_1-36を、実施例７と同様の様式で調製する。実施例１０式R_1-36-GLU(γ-DIAEA)-ANP-TFPを有する化合物のセットの調製図６は、36のT-L-X化合物（X=L_h）のセットの平行合成を例示する。L_hは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、L²は、L_hおよび L²を連結するメチレン基であるL³を有するｏ-ニトロベンジルアミン基であり、T はモジュラー構造を有する。ここでグルタミン酸のαカルボン酸基は、L²ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分R₁ _-36 （これらのR基は本明細書中に記載のT²に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、グルタミン酸のα- アミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（２-（ジイソプロピルアミノ）エチルアミンを介して導入される）は、グルタミン酸のγ-カルボン酸を介して結合される。図６について言及する：工程A〜B。実施例７と同じ。工程C。脱保護樹脂（化合物III）を、実施例７の工程Ｃに記載のカップリング方法を用いて、Fmoc-Glu-(OAl)-OHにカップリングさせ、化合物IVを得る。工程D。樹脂（化合物IV）上のアリルエステルを、CH₂Cl₂（２×）で洗浄し、CH₂ Cl₂中の(PPh₃)₄Pd(O)（0.3eq.）およびN-メチルアニリン（3eq.）の溶液と混合する。混合物を１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をCH₂Cl₂（２×）で洗浄する。パラジウム工程を反復する。溶媒を除去し、樹脂をCH₂Cl₂（２×）、DMF（２×）中のN,N-ジイソピロピルエチルアンモニウムジエチルジチオカルバメート、およびDMF（２×）で洗浄し、化合物Vを得る。工程E。工程Dからの脱保護樹脂を、DMF中に懸濁し、HATU（３eq.）およびNMM（7 .5eq.）を混合することによって活性化する。コンテナを15分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をNMP（１×）で洗浄する。樹脂を、２-（ジイソプロピルアミノ）エチルアミン（３eq.）およびNMM（7.5eq.）と混合する。コンテナを１時間振盪する。樹脂への２-（ジイソプロピルアミノ）エチルアミンのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物VIを得る。工程F〜J。実施例７と同じ。実施例１１式R_1-36-LYS(ε-lNIP)-ANP-LYS(ε-NH₂)-NH₂を有する化合物のセットの調製図７は、36のT-L-X化合物（X=L_h）のセットの平行合成を例示する。L_hはアミン（特に、リジン誘導部分のε−アミノ基）であり、L²は、L_hおよびL²を連結するカルボキサミド置換アルキレンアミノアシルアルキレン基であるＬ³を有するｏ-ニトロベンジルアミン基であり、Ｔはモジュラー構造を有する。ここでリジンのカルボン酸基は、L²ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、そして可変重量成分R_1-36（これらのR基は本明細書中に記載のT²に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して導入され得る）は、リジンのαアミノ基を介して結合される一方、質量分析感度エンハンサー基（N-メチルイソニペコ酸を介して誘導される）は、リジンのε-アミノ基を介して結合される。図７について言及する：工程A。 Fmoc-Lys(Boc)-SRAM樹脂（ACTより入手可能：化合物I）を、DMF中の25％ピペリジンと混合し、そして５分間振盪する。樹脂を濾過し、次いでDMF中の25 ％ピペリジンと混合し、そして10分間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をNMP（２ ×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄し、そして工程Ｂに直接用いる。工程B。 DMF中の樹脂（化合物II）、ANP（ACTより入手可能；３eq.）、HATU(３eq .)およびNMM（7.5eq.）を添加し、そして回収コンテナを１時間振盪する。溶媒を除去し、樹脂をNMP（２×）、MeOH（２×）、およびDMF（２×）で洗浄する。 Iの樹脂へのカップリングおよび洗浄工程を反復し、化合物IIIを得る。工程C〜J。樹脂（化合物III）を、実施例７の工程B〜Iのように処理し、化合物X_1-36 を得る。実施例１２式R_1-36-LYS(ε-TFA)-LYS(ε-1NIP)-ANP-TFPを有する化合物のセットの調製図８は、36のT-L-X化合物（X=L_h）のセットの平行合成を例示する。L_hは活性化エステル（特に、テトラフルオロフェニルエステル）であり、L²は、L_hおよび L²を連結するメチレン基であるL³を有するｏ-ニトロベンジルアミン基であり、T はモジュラー構造を有する。ここで第１のリジンのカルボン酸基は、L²ベンジルアミン基の窒素原子に結合されてアミド結合を形成し、質量分析感度エンハンサー基（N-メチルイソニペコ酸を介して誘導される）は、第１のリジンのε-アミノ基を介して結合され、第２のリジン分子は第１のリジンのα-アミノ基を介して第１のリジンに結合され、分子量調整基（トリフルオロアセチル構造を有する）は、第２のリジンのε-アミノ基を介して結合され、そして可変重量成分R_1-36 （これらのR基は本明細書中に記載のT²に対応し、そして本明細書中に一覧した特定のカルボン酸のいずれかを介して誘導され得る）は、第２のリジンのαアミノ基を介して結合される。図８について言及する：工程A〜E。これらの工程は、実施例７の工程A〜Eと同一である。工程F。樹脂（化合物VI）を、実施例７の工程Ｂに記載のピペリジンで処理し、F MOC基を除去する。工程G。脱保護樹脂（化合物VII)を、実施例７の工程Ｃに記載のカップリング方法を用いて、Fmoc-Lys(Tfa)-OHにカップリングし、化合物VIIIを得る。工程H〜K。樹脂（化合物VIII）を、実施例７の工程F〜Jに記載のように処理し、化合物XI_1-36を得る。実施例１３式R_1-36-LYS(ε-lNIP)-ANP-5'-AH-ODNを有する化合物のセットの調製図９は、実施例７のエステル由来の36のT-L-X（X=MOI、ここでMOIは核酸フラグメントである、ODN）のセットの平行合成を例示する（同じ手順が、他のT-L-X 化合物で用いられ得る、ここでXは活性化エステルである）。MOIを、T-Lに、MOI の5'末端を介して、ホスホジエステル-アルキレンアミン基により結合する。図９について言及する：工程A。化合物XII_1-36を、Van Nessら、Nucleic Acids Res.，19，3345(1991)の改変したビオチン化手順に従って調製する。200mMホウ酸ナトリウム（pH8.3、25 0mL）中に5'-アミノヘキシルオリゴヌクレオチド（化合物XI_1-36、１mg）の１つを有する溶液に、テトラフルオロフェニルエステル（実施例Ａからの化合物XII₁ _-36 、250mLのNMP中に100倍モル過剰）の１つを添加する。反応物を、周囲温度で一晩インキュベートする。未反応および加水分解したテトラフルオロフェニルエステルを、SephadexG-50クロマトグラフィーによって化合物XII_1-36から除去する。実施例１４式R_1-36-LYS(ε-lNIP)-ANP-LYS(ε(MCT-5'-AH-ODN)-NH₂を有する化合物のセットの調製図10は、実施例11のアミン由来の36のT-L-X（X=MOI、ここで、MOIは核酸フラグメントである、ODN）のセットの平行合成を例示する（同じ手順が、他のT-L-X 化合物で用いられ得、Xはアミンである）。MOIを、T-Lに、MOIの5'末端を介して、ホスホジエステル-アルキレンアミン基により結合する。図10について言及する：工程A。 5'-[6-(4,6-ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イルアミノ)ヘキシル]オリゴヌクレオチドXII_1-36を、Van Nessら、Nucleic Acids Res.，19，3345(1991)に記載のように調製する。工程B。 100mMホウ酸ナトリウム（pH8.3）中の１mg/mlの濃度の5'-[6-(4,6-ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イルアミノ)ヘキシル]オリゴヌクレオチド（化合物XI I_1-36）の１つを有する溶液を、R_1-36-Lys(e-iNIP)-ANP-Lys(e-NH₂)-NH₂（実施例11からの化合物X_1-36）より選択される、100倍モル過剰の１級アミンに添加した。溶液を室温で１晩混合する。未反応のアミンを、洗浄溶液としてH₂O（３× ）を用いて、3000MWカットオフ膜（Amlcon，Beverly，MA）を通す限外濾過によって除去する。化合物XIII_1-36を、100mLの用量に減少させることによって単離する。実施例15 CE分離法、画分収集、タグ切断、タグの質量（従って同一性）の決定、次いで配列推定を用いた配列決定の実証本実施例において、２つのDNAサンプルを単一の分離法において配列決定する。CE 器具使用 CE器具は、Applied Biosystems，Inc．（FosterCity，CA）から市販されている器具のブレッドボード版である。それは２つの緩衝チャンバーを囲むPlexigla sボックスからなり、これは熱制御ユニットで一定温度に維持され得る。電気泳動に必要な電圧は、磁気安全インターロックおよび適用電位を変化させる制御ユニットを有する高電圧パワーサプライ（Gamma High Voltage Research，OrmondB each，FL）によって提供される。オープンチューブ（open tube）キャピラリーに対するサンプル注入は、キャピラリーを横切る圧力差（真空注入）を生じさせるためにハンド真空ポンプの使用によって実施する。ゲル充填キャピラリーについては、サンプルを電場の適用によってチューブ中に電気泳動させる（電気運動的注入）。ゲル充填キャピラリーの調製 25cmに検出器窓を有する50センチメートル石英ガラスキャピラリー(375mm o.d .，50mm i.d.、Polymicro Technologies，Phoenix，AZ)(ここでポリイミドコーティングはキャピラリーから除去されている)を分離に用いる。キャピラリーの内部表面は、キャピラリー壁へのゲルの共有結合を可能にするために(メチアクリロキシプロピル)トリメトキシシラン((methyacryloxypropyl)trimethoxysilan e：MAPS)(Sigma，St．Louis，MO)で誘導体化する（Nashabehら、Anal Chem 63:2 148，1994）。手短には、カラムにトリフルオロ酢酸、脱イオン水、およびアセトンを連続的に流動させることにより、キャピラリーを清掃する。アセトン洗浄の後、50/50水/エタノール溶液中の0.2％MAPS溶液をキャピラリーに通し、そして室温で30分間そのままにしておく。溶液をアスピレーションによって除去し、そしてチューブを赤外線熱ランプ下で30分間乾燥させる。ゲル充填キャピラリーを、Huangら（J.Chromatography 600:289，1992）に記載された手順の改変法によって高圧下で調製する。５％のクロスリンカーおよび 8.3尿素を有する４パーセントのポリ（アクリルアミド）ゲルを、本明細書中に報告した全ての研究に用いる。3.8gのアクリルアミド、0.20gのN,N'-メチレンビス(アクリルアミド)、および50gの尿素を100mLのTBE緩衝液（90mM Trisホウ酸、 pH8.3，0.2mM EDTA）中に溶解させることによって、原液を作製する。架橋を、 10mLのN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）および250mLの10％アンモニウムパーサルフェート溶液で開始する。重合溶液を誘導体化カラムに迅速に通す。次いで、充填キャピラリーを、水を充填したスチールチューブ1×m×l/ 8 ln．i.d．×1/4in．o.d.中に配置し、HPLCポンプを用いて400バーまで圧力を上昇させ、そして一晩その圧力を維持させる。圧力を徐々に開放し、そしてキャピラリーを除去する。カラムの各末端からキャピラリーの短いセクションを使用する前に除去する。DNA フラグメントの分離および検出従来の電気泳動によって分離されたDNA配列決定反応の分析を、ABI 370A DNA シーケンサーで実施する。この器具は、製造業者の指示に従って調製された、サンプルウェルから検出領域まで26cmの距離を有するスラブ変性尿素ポリ(アクリルアミド)ゲル0.4mm厚を使用する。DNA配列決定反応物を、Taqポリメラーゼ（Pr omega Corp.，Madison，WI）を利用して製造業者によって記載されるように調製し、そして標準的手順によって調製されるM13mp19一本鎖DNAテンプレートにおいて実施する。配列決定反応物を、暗所で−20℃にて保存し、そしてサンプルをロードする直前にホルムアミド中で90℃にて３分間熱する。それらを、製造業者の指示に従ってピペットマンで370Aに載せ、そして10,000Vで10秒間の電気運動注入によってCEにロードする。底面電極の全ての液体を取り出し、そしてそれを新しい電解質と交換することにより10μｌの画分を操業（run）間に収集する。オリゴヌクレオチドからタグを切断するために、100μｌ0.05Mジチオスレイトール（DTT）を各画分に添加する。インキュベーションは室温で30分間である。次いで、NaClを0.1Mになるように添加し、そして２容量のEtOHを添加してODNを沈殿させる。ODNを、14,000×Ｇで４℃にて15分間の遠心分離によって溶液から取り出す。上清を保存し、遠心分離しながら真空下で完全に乾燥させる。次いで、ペレットを25μｌのMeOH中に溶解させる。次いで、ペレットを、タグの存在について質量分析によって試験する。同一のMALDI技術を、実施例４に記載のように使用する。以下のMW（タグ）を、時間の関数として質量スペクトル中で観察する。セット#1に対するタグの時間的出現は、212.1，200.1、196.1、182.1、235.2, 218.1、199.1、227.1であり、そしてセット#2に対するタグの時間的出現は199.1 、 227.1、179.1、226.1、209.1、198.1である。212.1amuは4-メトキシ安息香酸誘導体を示し、200.1は4-フルオロ安息香酸誘導体を示し、196.1amuはトルイル酸誘導体を示し、182.1amuは安息香酸誘導体を示し、235.2amuはインドール-3-酢酸誘導体を示し、218.1amuは2,6−ジフルオロベンゼン誘導体を示し、199.1amu はニコチン酸N-オキシド誘導体を示し、227.1amuは2-ニトロベンズアミドを示し、179.18amuは5-アセチルサリチル酸誘導体を示し、226.1amuは4-エトキシ安息香酸誘導体を示し、209.1amuはケイ皮酸誘導体を示し、そして198.1amuは3-アミノニコチン酸を示すので、最初の配列は-5'-TATGCA-3'-であると推定され得、そして第２の配列は-5'-CGTACC-3'-であると推定され得る。従って、分離工程あたりに１つより多いDNAサンプルを配列決定し得る。実施例１６質量分析による複数のタグの同時検出の実証本実施例は、質量分析による複数の化合物（タグ）を同時に検出する能力を記載する。この特定の実施例において、31の化合物をマトリタスと混合し、沈積し、そして固体支持体上で乾燥させ、次いで、レーザーで脱離させる。次いで、得られたイオンを、質量分析装置に導入した。以下の化合物（Aldrich，Milwaukee，WIより購入した）を、等モルベースでともに混合し、0.002Mベース（化合物当たり）の最終濃度とする：ベンズアミド（ 121.14）、ニコチンアミド（122.13）、ピラジンアミド（123.12）、3-アミノ-4 -ピラゾールカルボン酸（127.10）、2-チオフェンカルボキサミド（127.17）、4 -アミノベンズアミド（135.15）、トルミド（135.17）、6-メチルニコチンアミド（136.15）、3-アミノニコチンアミド（137.14）、ニコチンアミドN-オキシド（138.12）、3-ヒドロピコリンアミド（138.13）、4-フルオロベンズアミド（13 9.13）、桂皮酸アミド（147.18）、4-メトキシベンズアミド（151.17）、2,6-ジフルオロベンズアミド（157.12）、4-アミノ-5-イミダゾール-カルボキシアミド（162.58）、3,4-ピリジン-ジカルボキシアミド（165.16）、4-エトキシベンズアミド（165.19）、2,3-ピラジンジカルボキサミド（166.14）、2-ニトロベンズアミド（166.14）、３−フルオロ-4-メトキシ安息香酸（170.4）、インドール -3-アセトアミド（174.2）、5-アセチルサリチルアミド（179.18）、3,5-ジメトキシベンズアミド（181.19）、1-ナフタレンアセトアミド（185.23）、８-クロロ-3,5-ジアミノ-2-ピラジンカルボキシアミド（187.59）、4-トリフルオロメチル-ベンズアミド（189.00）、5-アミノ-5-フェニル-4-ピラゾール-カルボキサミド（202.22）、1-メチル-2-ベンジル-マロナメート（207.33）、4-アミノ-2,3,5 ,6-テトラフルオロベンズアミド（208.11）、2,3-ナフタレンジカルボン酸（212 .22）。化合物を、上記の濃度でDMSO中に入れる。次いで、１μｌの材料をα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリクス（１：10,000希釈後）と混合し、そして固体ステンレス支持体に沈積させる。次いで、材料を、Protein TOF Mass Spectrometer（Bruker，Manning Park，M A）を用いて、レーザーによって脱離させ、得られるイオンを、操作の直線および反射モードの両方で測定する。以下のm/z値を得る（図11）：データは、31個の化合物の22個が予想される質量のスペクトルを示し、31個の化合物の９個が予想される質量を超える+Ｈ質量（１原子質量単位、amu）のスペクトルを示したことを示した。後者の現象はおそらく、化合物内のアミンのプロトン化による。従って、31個の化合物の31個が、MALDI Mass Spectroscopyによって検出される。より重要なことに、実施例は、複数のタグが分光学的方法によって同時に検出され得ることを実証する。 α−シアノマトリクス単体（図12）は、146.2、164.1、172.1、173.1、189.1 、190.1、191.1、192.1、212.1、224.1、228.0、234.3のピークを示す。化合物をさらに精製しなかったので、スペクトルの他の同定された質量は、購入した化合物の夾雑物による。実施例17 MW-同定因子-標識プライマー、放射標識プライマー、MW同定因子-標識-ジデオキシターミネーター、蛍光-プライマーおよび蛍光-ジデオキシターミネーターを用いた配列決定のための手順Ａ．配列決定用ゲルの調製および電気泳動プロトコルは以下の通りである。４％、６％、または８％ポリアクリルアミドについて以下のレシピに従って、８Ｍ尿素、ポリアクリルアミドゲル(100・l)を調製する。尿素（550UA）をGｉbco/BRL（Gaithersburg，MD）から入手する。全ての他の材料をFisher（Fair Lawn，NJ）から入手する。手短には、尿素、MTBE緩衝液および水を組み合わせて、55℃で５分間インキュベートし、そして撹拌して尿素を溶解させる。この混合物を手短に冷却し、アクリルアミド/ビス-アクリルアミド溶液を添加および混合し、そして混合物全体を５分間減圧下で脱気する。APSおよびTEMED重合化薬剤を撹拌しながら添加する。完全なゲル混合物を、0.15mmのスペーサーを有するテープしたガラスプレートの間にただちに注いだ。プレートを、ALCONOX^TM（New，York，NY）界面活性剤および熱水で最初に清掃することによって調製し、二重蒸留水でリンスし、そして乾燥する。代表的には、刻み目で固定した（notched）ガラスプレートをシラン処理薬剤で処理し、次いで二重蒸留水でリンスする。注いだ後、ゲルをただちに水平に置き、ウェル形成コームを挿入し、適所で（into place）クランプし、そして少なくとも30分間ゲルを重合化させる。ローディングの前に、ゲルの底面の周りのテープおよびウェル形成コームを除去する。次いで、ゲルプレートに上部および下部緩衝液チャンバーをクランプし、そしてそれらのチャンバーに1×MTBE電気泳動緩衝液を添加することによって、垂直方向の電気泳動装置を構築する。サンプルウェルを、ランニング緩衝液を含有するシリンジでフラッシュし、そして各サンプルをロードする直前に、ゲルローディングチップを用いてランニング緩衝液でフラッシュし、尿素を除去する。１〜２μｌのサンプルを、ゲルローディングチップを有するPipettem an（R ainin，Emeryville，CA）を用いてロードし、次いで以下のガイドラインに従って電気泳動する（電気泳動の間、ゲルをファンで冷却する）。終結させた（ショートターミネーションで）各塩基特異的配列決定反応の混合物を、0.15mm×50cm×20cm変性５％ポリアクリルアミドゲル上にロードする：ロングターミネーションで終結させた反応の混合物を、代表的には半分に分け、そして２つの0.15mm×70cm×20cm変性４％ポリアクリルアミドゲル上にロードする。電気泳動の後、緩衝液をウェルから除去し、テープを除去し、そしてゲルプレートを分離する。ゲルを、40cm×20cmシートの3MM Whatmanペーパーに移し、プラスチックラップで覆い、そしてHoefer（San Francisco，CA）ゲルドライヤー上で25分間80℃にて乾燥させる。乾燥ゲルを、Kodak（New Haven，CT）XRP-1フィルムに露光する。シグナルの強度および放射標識が³²Ｐまたは³⁵Ｓのいずれであるかに応じて、露光時間は４時間から数日間に変化する。露光の後、フィルムを、現像液および定着液中で処理することによって現像し、水でリンスし、そして風乾する。次いでオートラジオグラムをライトボックスに入れ、配列を手作業で読み、そしてデータをコンピューターにタイプする。標識プライマーを用いたTaqポリメラーゼ触媒サイクル配列決定。各塩基特異的サイクル配列決定反応物は、それぞれＡおよびＣまたはＧおよびＴ反応のために約100または200ngの単離された一本鎖DNAを日常的に含む。二本鎖サイクル配列決定反応物は、標準的アルカリ溶解または珪藻土改変アルカリ溶解手順のいずれかを用いて単離された200または400ngのプラスミドDNAを同様に含有していた。テンプレートDNAを除く全ての試薬を、−20℃で保存した以前に分割した原液のプレミックスから１つのピペッティング工程で添加した。反応プレミックスを、反応緩衝液と塩基特異的ヌクレオチド混合物とを組み合わせることにより調製する。使用する前に、塩基特異的反応プレミックスを解凍し、希釈したTaq DNA ポリメラーゼおよび各末端標識ユニバーサルプライマーと組み合わせ、最終反応混合物を産生する。一旦上記混合物を調製すると、４つのアリコートの一本鎖または二本鎖DNAを、それぞれの0.2mlの薄壁の反応チューブ（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの反応物に対応する）の底にピペットし、次いでそれぞれの反応混合物のアリコートを、各チューブの側面に添加する。これらのチューブは、マイクロタイタープレートフォーマット中の96チューブ/保持器セットトレイの一部であり、Perki n Elmer Cetus Cycler 9600（Foster City，CA）に適合する。ストリップキャップで、チューブ/保持器セットトレイを封着し、プレートを手短に遠心分離する。次いでプレートを熱ブロックが95℃に予熱されたサイクラーに配置し、そしてサイクルプログラムをただちに開始する。サイクルプロトコルは、15〜30サイクルの：95℃変性；55℃アニーリング；72℃伸長；95℃変性；72℃伸長からなり； 95℃変性、および72℃伸長、４℃最終浸漬ファイルにつながる。この段階で、反応物を凍結し、そして数日間まで−20℃で保存し得る。プーリングおよび沈殿の前に、プレートを手短に遠心分離し、濃縮を再生する。プライマーおよび塩基特異的反応物をエタノール中にプールし、そして沈殿したDNAを遠心分離により収集し、乾燥させる。これらの配列決定反応物は、−20℃で数日間保存され得る。配列決定反応のプロトコルは以下の通りである。ＡおよびＣ反応については１ μｌ、ＧおよびＴ反応については２μｌの各DNAサンプル（M13テンプレートに対して100ng/ul、pUCテンプレートに対して200ng/ul）を、0.2mlの薄壁反応チューブの底にピペットする。AmpliTaqポリメラーゼ（N801-0060）は、Perkin-Elmer Cetus（Foster City，CA）に由来する。 24のクローンに対して、30μｌのAmpliTaq（５U/μｌ）、30μｌの５×Taq反応緩衝液、130μｌddH₂O、および190μｌの希釈Taqの混合物を調製する。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの塩基特異的混合物を、各塩基特異的ヌクレオチド/緩衝液プレミックスに塩基特異的プライマーおよび希釈Taqを添加することによって調製する：Ａ、Ｃ/Ｇ、Ｔ 60/120μｌ５×Taqサイクル配列決定混合物 30/60μｌ希釈Taqポリメラーゼ 30/60μｌ各蛍光末端標識プライマー 120/240μｌＢ．MW- 同定因子-標識ターミネーター反応を用いるTaqポリメラーゼ触媒サイクル配列決定 DNAサイクル配列決定における１つの問題は、プライマーが用いられる場合、反応条件が、ネスティッド（nested）フラグメントセット分布が反応混合物中のテンプレート濃度に高度に依存することである。標識ターミネーターを用いるDN Aサイクル配列決定反応のためのネスティッドフラグメントセット分布が、DNA濃度に対して上記のような標識プライマー反応で得られるのより大いに感受性が低いことが最近観察されている。さらに、ターミネーター反応は、テンプレートあたりにただ１つの反応チューブを必要とするが、一方、標識プライマー反応は４つのターミネーターのそれぞれに対して１つの反応チューブが必要である。下記のプロトコルは、96ウェルテンプレート単離に容易に調和し、そして96ウェル反応一掃手順もまた本明細書中に記載される。 0.5μｇの一本鎖または１μｇの二本鎖DNAを0.2mlのPCRチューブに入れる。１ μｌ（一本鎖テンプレートに対して）または４μｌ（二本鎖テンプレートに対して）の0.8μＭプライマーおよび9.5μｌのABI供給プレミックスを各チューブに添加し、そしてddH₂Oで最終容量を20μｌにする。手短に遠心分離し、そして製造業者に記載されるようなターミネータープログラム（すなわち、96℃の予熱、引き続いて96℃15秒間、50℃１秒間、60℃４分間の25サイクルを行い、次いで４ ℃保持につながる）を用いて通常通りにサイクルを行う。Centri-Sepカラム（Am icon，Beverly，MA）または以下に示されるG-50マイクロタイタープレート手順のいずれかを用いてスピンカラム精製を続ける。Ｃ．Centri-Sep カラムによるターミネーター反応一掃穏やかにカラムを軽くたたき、ゲル物質をカラムの底に沈降させることによって、カラムを調製する。カラム栓を取り除き、そして0.75ml dH₂Oを添加する。カラムに栓をし、それを数回反転させることによって混合する。ゲルを少なくとも30分間室温で水和させる。カラムは４℃で数日間保存可能である。４℃で保存したカラムを使用前に室温に暖める。カラムを反転させ、そしてゲルを沈降させることによって全ての気泡を除去する。上部端キャップを最初に除去し、次いで下部端キャップを取り除く。重力によってカラムを完全にドレインする。（注意：流動がただちに始まらない場合にはピペットバルブでカラムに穏やかな圧を適用する。）カラムを提供される洗浄チューブに挿入する。1300×ｇで２分間可変速度微小遠心分離器中でスピンして、液体を除去する。洗浄チューブからカラムを取り出し、そしてサンプル収集チューブにそれを挿入する。反応混合物（20μ ｌ）を注意深く取り出し、そしてゲル物質の上部にそれをロードする。サンプルをオイルで上塗りすることを必要とするサイクル器具中でインキュベートする場合には、オイルの下から反応物を注意深く取り出す。サンプル中の少量のオイル（＜1μｌ）は結果に影響しないが、サンプルでオイルを拾い上げることを避ける。サンプルを含有するピペットチップの末端のオイルは、清潔な表面（例えば、反応チューブ）上にチップを注意深く接触させることにより除去し得る。各カラムを一回のみ使用する。固定された角度のローターを有する可変速微小遠心分離器中で回転させ、最初の回転の時と同じ方向でカラムを配置する。減圧遠心分離器でサンプルを乾燥させる。熱を与えたり、乾燥させすぎたりしない。所望であれば、反応物をエタノールで沈殿させ得る。Ｄ．Sephadex G-50 充填マイクロタイター形式フィルタープレートによるターミネーター反応一掃 Sephadex（Pharmacia，Piscataway，NJ）は沈殿する；それ故、プレートに添加する前、さらに８〜10ウェル毎に充填した後にも再懸濁しなければならない。 400μｌの混合したSephadex G-50をマイクロタイターフィルタープレートの各ウェルに添加する。水を収集するためにマイクロタイタープレートの上面にマイクロタイターフィルタープレートを置き、そして遠心分離の間にそれらが飛び上がって離れないように側面をテープする。1500rpmで２分間回転させる。マイクロタイタープレート中に収集された水を廃棄する。水を収集するためにマイクロタイタープレートの上面にマイクロタイターフィルタープレートを置き、そして遠心分離の間にそれらが飛び上がって離れないように側面をテープする。さらに10 0〜200μｌのSephadex G-50を添加して、マイクロタイタープレートウェルを充填する。1500rpmで２分間回転させる。マイクロタイタープレート中に収集された水を廃棄する。水を収集するためにチューブを有するマイクロタイタープレートの上面にマイクロタイターフィルタープレートを置き、そして遠心分離の間にそれらが飛び上がって離れないように側面をテープする。20μｌのターミネーター反応物を各Sephadex G-50含有ウェルに添加する。1500rpmで２分間回転させる。収集した溶出物をSpecd-Vac中に約１〜２時間入れる。標識ターミネーターを用いたSequenase^TM（UBS，Cleveland OH）触媒配列決定。一本鎖ターミネーター反応は、約２μｇのフェノール抽出したM13基礎テンプレートDNAを必要とする。このDNAを変性させ、そしてDNA、プライマー、および緩衝液を65℃でインキュベートすることによってプライマーをアニールさせる。反応を室温に冷却した後に、α-チオ-デオキシヌクレオチド、標識ターミネーター、および希釈したSequenase TM DNAポリメラーゼを添加し、そしてこの混合物を37℃でインキュベートする。酢酸アンモニウムおよびエタノールを添加することによって反応を停止させ、そしてDNAフラグメントを沈殿させ、乾燥させる。取り込まれていないターミネーターの除去の援助のために、DNAペレットをエタノールで２回リンスする。乾燥した配列決定反応物は、数日間まで−20℃で保存可能である。二本鎖ターミネーター反応は、約５μｇの珪藻土改変アルカリ溶解ミニプレップ精製プラスミドDNAを必要とする。二本鎖DNAを、65℃で水酸化ナトリウム中にそのDNAをインキュベートすることによって変性させ、そしてインキュベーションの後、プライマーを添加し、そして酸-緩衝液を添加することによって反応物を中和する。次いで、反応緩衝液、α-チオ-デオキシヌクレオチド、標識色素- ターミネーター、および希釈Sequenase TM DNAポリメラーゼを添加し、そして反応を37℃でインキュベートする。酢酸アンモニウムを添加し、反応を停止させ、そいてDNAフラグメントを沈殿させ、リンスし、乾燥させ、そして保存する。一本鎖反応に関して： 1.5ml微小遠心チューブに以下のものを添加する：４μｌ ssDNA（2μｇ）４μｌ 0.8μＭプライマー２μｌ 10×MOPS緩衝液２μｌ 10×Mn²⁺/イソクエン酸緩衝液 12μｌ DNAを変性させ、そしてプライマーをアニールさせるために、反応物を65℃〜7 0℃で５分間インキュベートする。反応を15分間室温に冷却し、次いで手短に遠心分離して濃縮を再生する。各反応物に、以下の試薬を添加し、10分間37℃でインキュベートする。７μｌ ABIターミネーター混合物（カタログ番号401489）２μｌ希釈Sequenase TM（3.25Ｕ/μｌ）１μｌ２mM α-S dNTP 22μｌ未希釈のSeqenase TM（カタログ番号70775、United States Biochemicals，Cl eveland，OH）は13U/μｌであり、使用する前にUSB希釈緩衝液で1:4に希釈する。20μｌの9.5M酢酸アンモニウムおよび100μｌの95％エタノールを添加して反応を停止させ、そして混合する。氷水浴中で10分間DNAを沈殿させる。４℃にて微小遠心分離で10,00O×gで15分間遠心分離する。上清を注意深くデカントし、そして300μｌの70〜80％エタノールを添加することによってペレットをリンスする。混合し、そして15分間再び遠心分離し、上清を注意深くデカントする。リンス工程を繰り返して取り込まれていないターミネーターの効率的な除去を保証する。Speed-VacでDNAを５〜10分間（または乾燥するまで）乾燥させ、そして−20℃で乾燥した反応物を保存する。二本鎖反応に関して： 1.5ml微小遠心チューブに以下のものを添加する：５μｌ dsDNA（5μｇ）４μｌ 1N NaOH ３μｌ ddH₂O 65℃〜70℃で５分間反応をインキュベートし、次いで手短に遠心分離して濃縮を再生する。各反応物に以下の試薬を添加し、ボルテックスし、そして手短に遠心分離する：３μｌ８μＭプライマー９μｌ ddH₂O ４μｌ MOPS-酸緩衝液各反応物に、以下の試薬を添加し、そして37℃で10分間インキュベートする。４μｌ 10×Mn²⁺/イソクエン酸緩衝液６μｌ ABIターミネーターmi ２μｌ希釈Sequenase TM(3.25U/μｌ) １μｌ 2mM[α]-S-dNTP 22μｌ Unlted States Biochemicals由来の未希釈のSEQUENASE^TMは13U/μｌであり、使用する前にUSB希釈緩衝液で1:4に希釈するべきである。60μｌの８M酢酸アンモニウムおよび300μｌの95％エタノールを添加して反応を停止させ、そしてボルテックスする。氷水浴中で10分間DNAを沈殿させる。４℃にて微小遠心分離器中で10,000×gで15分間遠心分離する。上清を注意深くデカントし、そして300μ ｌの80％エタノールを添加することによってペレットをリンスする。サンプルを混合し、そして15分間再び遠心分離し、そして上清を注意深くデカントする。リンス工程を繰り返して取り込まれていないターミネーターの効率的な除去を保証する。Speed-VacでDNAを５〜10分間（または乾燥するまで）乾燥させる。Ｅ．配列決定ゲル調製、プレ電気泳動、サンプルローディング、電気泳動、データ収集、およびABI373A DNAシーケンサーにおける分析 DNA配列決定用のポリアクリルアミドゲルを、重合化の前にゲル混合物を濾過する以外は上記のように調製する。ガラスプレートを熱水、蒸留水、およびエタノールで注意深く清掃して、テープする前に潜在的な蛍光夾雑物を除去する。変性６％ポリアクリルアミドゲルを、0.3mm×89cm×52cmのテープしたプレート中に注ぎ、36ウェルコームを取り付ける。重合化の後、テープおよびコームをゲルから取り出し、そしてガラスプレートの外部表面を熱水で清掃し、そして蒸留水およびエタノールでリンスする。ゲルをABIシーケンサー中に組立て、そしてレーザー走査によりチェックする。ベースライン変化をABI-結合Macintoshコンピューターディスプレイで観察する場合、プレートを再清掃する。引き続いて、緩衝液ウェルを取り付け、電気泳動緩衝液を添加し、そしてゲルを30Wで10〜30分間プレ電気泳動する。サンプルローディングの前に、プールし、そして乾燥させた反応産物を、ボルテックスし、次いで90℃に熱することによってホルムアミド /EDTAローディング緩衝液中に再懸濁する。ロードされたサンプルの数および蛍光標識移動度ファイルを示すサンプルシートを、配列データ処理のために用いる Macintoshコンピューター上のABIデータ収集ソフトウェア内に作製する。シリンジでサンプルウェルを清掃した後、奇数番号の配列決定反応物を、扁平先端のゲルローディングチップを備えたマイクロピペッターを用いて各ウェルにロードする。次いで、ゲルを５分間電気泳動し、その後にウェルを再び清掃し、偶数番号のサンプルをロードする。色素プライマーおよび色素ターミネーターのために用いられるフィルターホイールをABI 373A CPU上で特定化する。代表的には、電気泳動およびデータ収集は、熱分配アルミニウムプレートを取り付けたABI 373A上で30Wで10時間である。データ収集の後、検出された蛍光シグナルを対応するスキャン番号に関連付ける画像ファイルをABIソフトウェアによって作製する。次いで、ソフトウェアは、シグナル強度に基づいてサンプルレーン位置を決定する。レーンをトラックした（track）後、各レーンに対するデータの横断面を抽出し、そしてベースラインサブトラクション、移動度計算、スペクトル逆重畳積分、および時間補正によって処理する。処理の後、NFS Shareを用いて配列データファイルをSPARCstaion 2に移す。プロトコル：36ウエルコームを用いて、上記のように、８M尿素、4.75％ポリアクリルアミドゲルを調製する。ローディング前に、ゲルプレートの外部表面を清掃する。下部スキャン（通常青色）線が、コンピューターデータ収集ウィンドウ上にディスプレイされるような800〜1000の強度値に対応するように、ゲルプレートを373A DNA Sequencer（Foster City，CA）中に組立てる。４色スキャン線のベースラインが平らでない場合には、ガラスプレートを再清掃する。アルミニウム熱分配プレートを張り付ける。ゲルを10〜30分間プレ電気泳動する。ローディング用のサンプルを調製する。各チューブの底に３μｌのFEを添加し、ボルテックスし、90℃に３分間熱し、そして遠心分離して濃縮を再生する。シリンジを用いて電気泳動緩衝液でサンプルウェルをフラッシュする（flush）。扁平先端のゲルローディングピペットチップを用いて、それぞれの奇数番号サンプルをロードする。少なくとも５分間ゲルをプレ電気泳動し、再びウェルをフラッシュし、次いでそれぞれの偶数番号のサンプルをロードする。電気泳動（30W、10時間）を開始する。データ収集の後、ABIソフトウェアはデータ分析ソフトウェアを自動的に開く。これは画像化ゲルファイルを作製し、各サンプルレーンに対するデータを抽出し、そしてデータを処理する。Ｆ．アンカーポリ(dT)プライマーを用いたロングポリ(A)テイルを含有するcDNA クローンの二本鎖配列決定ポリ(A)トラクト（tract）を含有するcDNAの二本鎖テンプレートは、ポリ(A) テイルの下流でアニールするベクタープライマーとアニールするベクタープライマーで配列決定することが困難である。これらのプライマーを用いた配列決定は、ロングポリ(T)ラダー、およびそれに続く読みとりが困難であり得る配列を生じる。この問題を回避するために、3'末端に(dT)₁₇および(dA)または(dC)または (dG)のいずれかを含有する３つのプライマーを設計し、プライマーを「アンカー（anchor）」し、そしてポリ(A)領域のすぐ上流の領域の配列決定を可能にするように設計した。このプロトコルを用いて、300bp以上の読みとり可能配列を入手し得る。これらのcDNAの反対側の鎖の配列を、ポリ(A)領域の上流の挿入物特異的プライマーを用いて決定した。cDNAのポリ(A)テイルからすぐ上流の配列を直接取得する能力は、cDNAから配列タグ化部位（STS）を産生する大規模な労力に対して特に重要であるはずである。プロトコルは以下の通りである。DNA合成機において3'末端に(dA)または(dC) または(dG)のアンカーを有するアンカーポリ(dT)₁₇を合成し、そしてOligonucle otide Purification Cartridges（Amicon，Beverly，MA）上で精製した後に使用する。アンカープライマーを用いた配列決定のために、0.2M水酸化ナトリウムおよび0.16mM EDTAを含有する50μｌの総容量中で65℃で10分間のインキュベーションによって5〜10μｇのプラスミドDNAを変性させる。３つのポリ(dT)アンカープライマー（それぞれ２pmol）を添加し、そして氷上に混合物をただちに配置する。５mlの５M酢酸アンモニウム、pH7.0を添加することによって溶液を中和する。 150μｌの冷95％エタノールを添加することによってDNAを沈殿させ、そして冷 70％エタノールで２回ペレットを洗浄する。５分間ペレットを乾燥させ、次いで MOPS緩衝液に再懸濁する。65℃で２分間溶液を加熱し、続いて15〜30分間室温にゆっくりと冷却することによってプライマーをアニールさせる。上記のプロトコルを用いる改変T7 DNAポリメラーゼおよびα-[³²P]dATP(＞1000 Ci/mmol)を用いて、配列決定反応を実行する。Ｇ．PCR およびランダムショットガンクローニングに基づくcDNA配列決定以下は、PCR増幅、ランダムショットガンクローニング、および自動化蛍光配列決定に基づいてクローン化cDNAを配列決定する方法である。このPCRに基づくアプローチは、通常の「ユニバーサル」正方向および逆方向プライミング部位と Stratagene Bluescriptベクターのマルチクローニング部位との間のプライマー対を使用する。これらの２つのPCRプライマー（正方向または−16bsプライマーとして配列5'-TCGAGGTCGACGGTATCG-3’（配列番号15）および逆方向または+19bs プライマーとして5'-GCCGCTCTAGAACTAG TG-3’（配列番号16）を有する）は、下記のランダムショットガン配列決定アプローチが実行され得るような1.2〜3.4kb サイズ範囲の十分な量のcDNA挿入物を増幅するために使用され得る。以下はプロトコルである。４つの100μｌ PCR反応物（それぞれは0.5mlのスナップキャップチューブ中に約100ngのプラスミドDNA、100pmolの各プライマー、5 0mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.5、1.5mM MgCl₂、0.2mMの各dNTP、および５ユニットのPE-Cetus Amplitaq）を、PE-Cetus48チューブDNA Thermal Cycler中で95℃ １分間、55℃１分間および72℃２分間の25サイクルインキュベートする。４つの反応物をプールした後、PCR産物を含有する水溶液を噴霧器中に入れ、約0.5〜1. 0mlのグリセロールを添加することによって2.0mlにし、そしてイソプロピルアルコール/ドライアイスまたは飽和した水性NaCl/ドライアイス浴のいずれかにそれを10分間配置することにより−20℃で平衡化する。25〜30psiの窒素圧力を2.5分間適用することにより、そのサンプルを−20℃で噴霧する。剪断されたPCR産物を濃縮するためのエタノール沈殿の後、以前に記載されたE.coli DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼとのインキュベーションによりフラグメントを平滑末端化およびリン酸化した。 0.4〜0.7kbの範囲のフラグメントを、低融点アガロースゲルからの溶出によって取得した。前述から、本発明の特定の実施態様が説明の目的のために本明細書中に記載されているが、種々の改変が発明の精神および範囲を逸脱することなく作製され得ることが理解される。従って、本発明は、添付される請求の範囲による以外には限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハウバート，ジェイ．ジェフリーアメリカ合衆国ワシントン 98005，ベルビュー，ノースイースト 30ティーエイチストリート 12740 (72)発明者ムリガン，ジョンティー. アメリカ合衆国ワシントン 98105，シアトル，17ティーエイチアベニューノースイースト 5823

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸分子の配列を決定する方法であって、該方法が、以下の工程： (a)選択された標的核酸分子に相補的なタグ化核酸フラグメントを生成する工程、ここでタグは、特定のヌクレオチドと相関し、そして分光分析または電位差測定により検出可能な有機部分である； (b)タグ化フラグメントを配列の長さにより分離する工程； (c)タグをタグ化フラグメントから切断する工程；および (d)分光分析または電位差測定によりタグを検出し、そしてそれによって核酸分子の配列を決定する工程を含む、方法。２．前記タグの検出が、質量分析、赤外分析、紫外分析、または定電位電流測定による、請求項１に記載の方法。３．前記タグ化フラグメントが、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、およびHPLCから選択される方法により、工程(b)において分離される、請求項１または２に記載の方法。４．前記タグ化フラグメントが、酸化、還元、酸不安定化、塩基不安定化、酵素的、電気化学的、熱、チオール交換、および光不安定化法から選択される方法により、工程(c)において切断される、請求項１または２に記載の方法。５．前記タグが、飛行時間型質量分析、四重極型質量分析、磁気セクター質量分析、または電気セクター質量分析により検出される、請求項２に記載の方法。６．前記タグが、電量測定検出器または電流測定検出器により検出される、請求項２に記載の方法。７．前記タグ化核酸フラグメントが、工程(a)において、5'末端から3'末端まで生成される、請求項１または２に記載の方法。８．工程(a)が４を超えるタグ化核酸フラグメントを生成し、そして各タグが核酸フラグメントに独特である、請求項１または２に記載の方法。９．工程(b)、(c)および(d)が、連続する様式で行われる、請求項１または２に記載の方法。１０．工程(b)、(c)および(d)が、システムにおいて連続する様式で行われる、請求項１または２に記載の方法。１１．１つ以上の工程が自動化されている、請求項１または２に記載の方法。１２．前記タグ化フラグメントがオリゴヌクレオチドプライマーから生成され、該プライマーはプライマーの3'末端以外でタグに結合される、請求項１または２に記載の方法。１３．前記タグ化フラグメントが、タグ化ジデオキシヌクレオチドターミネーターから生成される、請求項１または２に記載の方法。１４．少なくとも１つのタグ化核酸フラグメントが、請求項１６から３４のいずれか１項に記載の化合物である、請求項１または２に記載の方法。１５．前記タグの検出が、非蛍光分光分析または電位差測定による、請求項１、３〜４および７〜１４のいずれか１項に記載の方法。１６．以下の式を有する化合物：Ｔ^ms−Ｌ−Ｘここで、Ｔ^msは、質量分析により検出可能な有機基であり、該基は、炭素、少なくとも１個の水素およびフッ素、ならびに酸素、窒素、硫黄、リンおよびヨウ素から選択される任意の原子を含有する；Ｌは、独特のＴ^ms含有部分を化合物の残りから切断することを可能にする有機基であり、ここで、Ｔ^ms含有部分は、化合物が質量分析に供された際に、単一イオン化荷電状態を維持し、三級アミン、四級アミンおよび有機酸から選択される官能基を含む：およびＸは、核酸フラグメントである；ただし、該化合物は、Ｘを介して固体支持体に結合されず、また250ダルトン未満の質量も有さない。１７．Ｔ^msが、15〜10,000ダルトンの質量、およびＣ_1-500Ｎ_0-100Ｏ_0-100Ｓ_0-1 ₀ Ｐ_0-10Ｈ_αＦ_βＩ_δの分子式を有し、ここで、α、βおよびδの合計は、他の、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳ原子の満たされない原子価を満たすのに十分である、請求項１６に記載の化合物。１８．Ｔ^msおよびＬが官能基を介して互いに結合され、該官能基が、アミド、エステル、エーテル、アミン、スルフィド、チオエステル、ジスルフィド、チオエーテル、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカルバメート、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミドまたは炭素 −炭素結合から選択される、請求項１６に記載の化合物。１９．前記官能基が、アミド、エステル、アミン、ウレアおよびカルバメートから選択され、該基を介してＴ^msおよびＬが互いに結合される、請求項１８に記載の化合物。２０．Ｌが、Ｌ^hu、Ｌ^acid、Ｌ^base、Ｌ^[O]、Ｌ^[R]、Ｌ^enz、Ｌ^elc、Ｌ^Δ、およびＬ^ssから選択され、それぞれが、化学線、酸、塩基、酸化、還元、酵素、電気化学的、熱的、およびチオール交換により、Ｔ^ms含有部分を分子の残りから切断させる、請求項１６に記載の化合物。２１．Ｌ^huが、式Ｌ¹−Ｌ²−Ｌ³を有し、ここで、Ｌ²は、化学線を吸収してＸからのＴ^msの切断を促進する分子フラグメントであり、そしてＬ¹およびＬ³は独立して、直接結合または有機部分であり、ここで、Ｌ¹はＴ^msからＬ²を分離し、Ｌ³ はＬ²をＸから分離し、そしてＬ²が化学線を吸収するとき、Ｌ¹もＬ³も、結合が切断されない、請求項２０に記載の化合物。２２．-Ｌ²-Ｌ³が以下の式を有する、請求項２１に記載の化合物：ここで、ａ．ｂ、ｃ、ｄまたはｅの位置の１個の炭素原子は、-Ｌ³-Ｘで置換され、そして必要に応じて、ｂ、ｃ、ｄまたはｅのうちの１つ以上の位置は、アルキル、アルコキシ、フッ素、塩素、ヒドロキシル、カルボキシレート、またはアミドで置換される；およびＲ¹は、水素またはヒドロカルビルである。２３．-Ｌ³−Ｘが位置ａに位置する、請求項２２に記載の化合物。２４．Ｌ³が、直接結合、ヒドロカルビレン、-Ｏ-ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビレン-(Ｏ-ヒドロカルビレン)_n-Ｈから選択され、そしてｎが、１〜10 の整数である、請求項２１に記載の化合物。２５．-Ｌ-Ｘが以下の式を有する、請求項１６に記載の化合物：ここで、ｂ、ｃ、ｄまたはｅのうちの１つ以上の位置は、水素、アルキル、アルコキシ、フッ素、塩素、ヒドロキシル、カルボキシレートまたはアミドで置換される；Ｒ¹は、水素またはヒドロカルビルであり、そしてＲ²は、核酸フラグメントである。２６．Ｔ^msが以下の式を有する、請求項１６に記載の化合物：Ｔ²-(Ｊ-Ｔ³-)_n- Ｔ²は、炭素と、水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンのうちの１つ以上とから形成される有機部分であり、該部分は、15〜500ダルトンの質量を有する；Ｔ³は、炭素と、水素、フッ素、ヨウ素、酸素、窒素、硫黄、およびリンのうちの１つ以上とから形成される有機部分であり、該部分は、50〜1000ダルトンの質量を有する；Ｊは、直接結合または官能基であり、該官能基は、アミド、エステル、アミン、スルフィド、エーテル、チオエステル、ジスルフィド、チオエーテル、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカルバメート、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、スルホネート、スルホンアミド、または炭素−炭素結合から選択される；そしてｎは、１〜50の整数であり、ｎが１より大きい場合、Ｔ³およびＪは各々独立して選択される。２７．請求項２６に記載の化合物であって、Ｔ²が、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル-Ｏ-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-Ｓ-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-NH-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-アミド-ヒドロカルビレン、Ｎ-( ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、N,N-ジ(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、ヒドロカルビルアシル-ヒドロカルビレン、ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子（単数または複数）は、酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択される）、置換ヘテロシクリルヒドロカルビル（ここで、ヘテロ原子（単数または複数）は、酸素、窒素、硫黄、およびリンから選択され、そして該置換基は、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル-Ｏ-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-N H-ヒドロカルビレン、ヒドロカルビル-Ｓ-ヒドロカルビレン、Ｎ-(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、N,N-ジ(ヒドロカルビル)ヒドロカルビレン、およびヒドロカルビルアシル-ヒドロカルビレンから選択される）、ならびに上記のいずれかの誘導体（ここで、水素の１個以上が、等しい数のフッ素で置換される）から選択される化合物。２８．請求項２６に記載の化合物であって、Ｔ³が式-Ｇ(Ｒ²)-を有し、Ｇが１つのＲ²置換基を有するＣ_1-6アルキレンであり、そしてＲ²が以下から選択される、化合物：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール縮合シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アラルキル、アリール置換アルケニルまたはアルキニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換シクロアルキル、ビアリール、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アラルコキシ、アリール置換アルケノキシまたはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アリール置換アルキルアミノ、アリール置換アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アリールオキシ、アリールアミノ、Ｎ-アルキルウレア置換アルキル、Ｎ-アリールウレア置換アルキル、アルキルカルボニルアミノ置換アルキル、アミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル置換アルキル、ヘテロシクリル置換アミノ、カルボキシアルキル置換アラルキル、オキソカルボシクリル縮合アリールおよびヘテロシクリルアルキル；シクロアルケニル、アリール置換アルキル、およびアラルキル、ヒドロキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アルコキシ置換アルキル、アラルコキシ置換アルキル、アミノ置換アルキル、 (アリール置換アルキルオキシカルボニルアミノ)置換アルキル、チオール置換アルキル、アルキルスルホニル置換アルキル、(ヒドロキシ置換アルキルチオ)置換アルキル、チオアルコキシ置換アルキル、ヒドロカルビルアシルアミノ置換アルキル、ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、ヒドロカルビル置換ヘテロシクリルアシルアミノ置換アルキル、アルキルスルホニルアミノ置換アルキル、アリールスルホニルアミノ置換アルキル、モルホリノアルキル、チオモルホリノアルキル、モルホリノカルボニル置換アルキル、チオモルホリノカルボニル置換アルキル、[Ｎ-(アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル)-またはN,N-[ジアルキル、ジアルケニル、ジアルキニルもしくは(アルキル、アルケニル)アミノ]カルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキレンアミノカルボニル、ヘテロシクリルアミノカルボニル置換アルキル、ヘテロシクリルアルキレンアミノカルボニル置換アルキル、N,N-[ジアルキル]アルキレンアミノカルボニル、N,N-[ジアルキル]アルキレンアミノカルボニル置換アルキル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニル、アルキル置換ヘテロシクリルカルボニルアルキル、カルボキシル置換アルキル、ジアルキルアミノ置換アシルアミノアルキル、およびアミノ酸側鎖（アルギニン、アスパラギン、グルタミン、Ｓ-メチルシステイン、メチオニンならびに対応するそれらのスルホキシドおよびスルホン誘導体、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、te rt-ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アラニン、オルニチン、ヒスチジン、グルダミン、バリン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、β-シアノアラニン、ならびにアロスレオニン）；アリーニル（alynyl）およびヘテロシクリルカルボニル、アミノカルボニル、アミド、モノ-またはジアルキルアミノカルボニル、モノ-またはジアリールアミノカルボニル、アルキルアリールアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、モノ-またはジアシルアミノカルボニル、芳香族または脂肪族アシル、アルキル（これは、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、モノ-またはジアルキルアミノ、モノ-またはジアリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、モノ-またはジアシルアミノ、アルコキシ、アルケノキシ、アリールオキシ、チオアルコキシ、チオアルケノキシ、チオアルキノキシ、チオアリールオキシ、およびヘテロシクリルから選択される置換基で任意に置換される）。２９．以下の式を有する、請求項２６に記載の化合物：ここで、Ｇは、(CH₂)_1-6であり、ここで、各Ｇの唯一の該CH₂基上の水素は-(CH₂)_n-アミド-Ｔ⁴で置換される；Ｔ²およびＴ⁴は、式Ｃ_1-25Ｎ_0-9Ｏ_0-9Ｓ_0-3Ｐ_0-3Ｈ_αＦ_βＩ_δの有機部分であり、ここで、α、βおよびδの合計は、他の、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰ原子の満たされない原子価を満たすのに十分である；Ｒ¹は、水素またはＣ_1-10アルキルである；ｃは、０〜４の整数である；Ｘは、請求項１で定義される；およびｎは１〜50の整数であり、ｎが１以上の場合、Ｇ、ｃ、アミド、Ｒ¹およびＴ⁴ は独立して選択される。３０．以下の式を有する、請求項２９に記載の化合物：ここで、Ｔ⁵は、式Ｃ_1-25Ｎ_0-9Ｏ_0-9Ｓ_0-3Ｐ_0-3Ｈ_αＦ_βＩ_δの有機部分であり、ここで、α、βおよびδの合計は、他の、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰ原子の満たされない原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ⁵は、三級もレくは四級アミンまたは有機酸を含む；そしてｍは０〜49の整数である。３１．以下の式を有する、請求項２９に記載の化合物：ここで、Ｔ⁵は、式Ｃ_1-25Ｎ_0-9Ｏ_0-9Ｓ_0-3Ｐ_0-3Ｈ_αＦ_βＩ_δの有機部分であり、ここで、α、βおよびδの合計は、他の、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰ原子の満たされない原子価を満たすのに十分であり；そしてＴ⁵は、三級もしくは四級アミンまたは有機酸を含む；そしてｍは０〜49の整数である。３２．-アミド-Ｔ⁵が以下から選択される、請求項３０および３１のいずれかに記載の化合物：３３．-アミド-Ｔ⁵が以下から選択される、請求項３０および３１のいずれかに記載の化合物：３４．Ｔ²が、以下の有機酸の１つがアミン基と縮合した際にＴ²-Ｃ(=Ｏ)-Ｎ(Ｒ¹ )-を形成する構造を有する、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の化合物：ギ酸、酢酸、プロピオール酸、プロピオン酸、フルオロ酢酸、2-ブチン酸、シクロプロパンカルボン酸、酪酸、メトキシ酢酸、ジフルオロ酢酸、4-ペンチン酸、シクロブタンカルボン酸、3,3-ジメチルアクリル酸、吉草酸、N,N-ジメチルグリシン、Ｎ-ホルミル-Gly-OH、エトキシ酢酸、(メチルチオ)酢酸、ピロール-2 -カルボン酸、3-フロン酸、イソキサゾール-5-カルボン酸、トランス-3-ヘキセン酸、トリフルオロ酢酸、ヘキサン酸、Ac-Gly-OH、2-ヒドロキシ-2-メチル酪酸、安息香酸、ニコチン酸、2-ピラジンカルボン酸、1-メチル-2-ピロールカルボン酸、2-シクロペンテン-1-酢酸、シクロペンチル酢酸、(Ｓ)-(−)-2-ピロリドン-5-カルボン酸、Ｎ-メチル-Ｌ-プロリン、ヘプタン酸、Ac-b-Ala-OH、2-エチル-2-ヒドロキシ酪酸、2-(2-メトキシエトキシ)酢酸、ｐ-トルイル酸、6-メチルニコチン酸、5-メチル-2-ピラジンカルボン酸、2,5-ジメチルピロール-3-カルボン酸、4-フルオロ安息香酸、3,5-ジメチルイソキサゾール-4-カルボン酸、3-シクロペンチルプロピオン酸、オクタン酸、N,N-ジメチルスクシンアミド酸、フェニルプロピオール酸、ケイ皮酸、4-エチル安息香酸、p-アニス酸、1,2,5-トリメチルピロール-3-カルボン酸、3-フルオロ-4-メチル安息香酸、Ac-DL-プロパギルグリシン、3-(トリフルオロメチル)酪酸、1-ピペリジンプロピオン酸、Ｎ-アセチルプロリン、3,5-ジフルオロ安息香酸、Ac-Ｌ-Val-OH、インドール-2-カルボン酸、2-ベンゾフランカルボン酸、ベンゾトリアゾール-5-カルボン酸、4-n-プロピル安息香酸、3-ジメチルアミノ安息香酸、4-エトキシ安息香酸、4-(メチルチオ)安息香酸、Ｎ-(2-フロイル)グリシン、2-(メチルチオ)ニコチン酸、3-フルオロ-4-メトキシ安息香酸、Tfa-Gly-OH、2-ナフトエ酸、キナルジン酸、Ac-Ｌ-I le-OH、3-メチルインデン-2-カルボン酸、2-キノキサリンカルボン酸、1-メチルインドール-2-カルボン酸、2,3,6-トリフルオロ安息香酸、Ｎ-ホルミル-Ｌ-Met- OH、2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸、4-n-ブチル安息香酸、Ｎ-ベンゾイルグリシン、5-フルオロインドール-2-カルボン酸、4-n-プロポキシ安息香酸、4-アセチル-3,5-ジメチル-2−ピロールカルボン酸、3,5-ジメトキシ安息香酸、2,6-ジメトキシニコチン酸、シクロヘキサンペンタン酸、2-ナフチル酢酸、 4-(1H-ピロール−１-イル)安息香酸、インドール-3-プロピオン酸、m-トリフルオロメチル安息香酸、5-メトキシインドール-2-カルボン酸、4-ペンチル安息香酸、Bz-b-Ala-OH、4-ジエチルアミノ安息香酸、4-n-ブトキシ安息香酸、3-メチル-5-CF₃-イソオキサゾール-4-カルボン酸、(3,4-ジメトキシフェニル)酢酸、4- ビフェニルカルボン酸、ピバロイル-Pro-OH、オクタノイル-Gly-OH、(2-ナフトキシ)酢酸、インドール-3-酪酸、4-(トリフルオロメチル)フェニル酢酸、5-メトキシインドール-3-酢酸、4-(トリフルオロメトキシ)安息香酸、Ac-Ｌ-Phe-OH、4-ペンチルオキシ安息香酸、Ｚ-Gly-OH、4-カルボキシ-Ｎ-(フル-2-イルメチル)ピロリジン-2 -オン、3,4-ジエトキシ安息香酸、2,4-ジメチル-5-CO₂Et-ピロール-3-カルボン酸、Ｎ-(2-フルオロフェニル)スクシンアミド酸、3,4,5-トリメトキシ安息香酸、Ｎ-フェニルアントラニル酸、3-フェノキシ安息香酸、ノナノイル-Gly-OH、2- フェノキシピリジン-3-カルボン酸、2,5-ジメチル-1-フェニルピロール-3-カルボン酸、トランス-4-(トリフルオロメチル)ケイ皮酸、(5-メチル-2-フェニルオキサゾール-4-イル)酢酸、4-(2-シクロヘキセニルオキシ)安息香酸、5-メトキシ -2-メチルインドール-3-酢酸、トランス-4-コチニンカルボン酸、Bz-5-アミノ吉草酸、4-ヘキシルオキシ安息香酸、Ｎ-(3-メトキシフェニル)スクシンアミド酸、Ｚ-Sar-OH、4-(3,4-ジメトキシフェニル)酪酸、Ac-o-フルオロ-DL-Phe-OH、Ｎ -(4-フルオロフェニル)グルタミン酸、4'-エチル-4-ビフェニルカルボン酸、1,2 ,3,4-テトラヒドロアクリジンカルボン酸、3-フェノキシフェニル酢酸、Ｎ-(2,4 -ジフルオロフェニル)スクシンアミド酸、Ｎ-デカノイル-Gly-OH、(＋)-6-メトキシ-a-メチル-2-ナフタレン酢酸、3-(トリフルオロメトキシ)ケイ皮酸、Ｎ-ホルミル-DL-Trp-OH、(Ｒ)-(＋)-α-メトキシ-α-(トリフルオロメチル)フェニル酢酸、Bz-DL-Leu-OH、4-(トリフルオロメトキシ)フェノキシ酢酸、4-ヘプチルオキシ安息香酸、2,3,4-トリメトキシケイ皮酸、2,6-ジメトキシベンゾイル-Gly-O H、3-(3,4,5-トリメトキシフェニル)プロピオン酸、2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェノキシ酢酸、Ｎ-(2,4-ジフルオロフェニル)グルタミン酸、Ｎ-ウンデカノイル-Gly-OH、2-(4-フルオロベンゾイル)安息香酸、5-トリフルオロメトキシインドール-2-カルボン酸、Ｎ-(2,4-ジフルオロフェニル)ジグリコールアミド酸、Ac -Ｌ-Trp-OH、Tfa-Ｌ-フェニルグリシン-OH、3-ヨード安息香酸、3-(4-n-ペンチルベンゾイル)プロピオン酸、2-フェニル-4-キノリンカルボン酸、4-オクチルオキシ安息香酸、Bz-Ｌ-Met-OH、3,4,5-トリエトキシ安息香酸、Ｎ-ラウロイル-Gl y-OH、3,5-ビス(トリフルオロメチル)安息香酸、Ac-5-メチル-DL-Trp-OH、2-ヨードフェニル酢酸、3-ヨード-4-メチル安息香酸、3-(4-n-ヘキシルベンゾイル) プロピオン酸、Ｎ-ヘキサノイル-Ｌ-Phe-OH、4-ノニルオキシ安息香酸、4'-(トリフルオロメチル)-2-ビフェニルカルボン酸、Bz-L-Phe-OH、Ｎ-トリデカノイル -Gly-O H、3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル酢酸、3-(4-n-ヘプチルベンゾイル) プロピオン酸、Ｎ-ヘプタノイル-Ｌ-Phe-OH、4-デシルオキシ安息香酸、Ｎ-(α ，α，α-トリフルオロ-m-トリル)アントラニル酸、ニフルム酸（Niflumic acid ）、4-(2-ヒドロキシヘキサフルオロイソプロピル)安息香酸、Ｎ-ミリストイル- Gly-OH、3-(4-n-オクチルベンゾイル)プロピオン酸、Ｎ-オクタノイル-Ｌ-Phe-O H、4-ウンデシルオキシ安息香酸、3-(3,4,5-トリメトキシフェニル)プロピオニル-Gly-OH、8-ヨードナフトエ酸、Ｎ-ペンタデカノイル-Gly-OH、4-ドデシルオキシ安息香酸、Ｎ-パルミトイル-Gly-OH、およびＮ-ステアロイル-Gly-OH。３５．２つの化合物が同じＴ^msも同じＸも有さない、請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の複数の化合物を含む組成物。３６．前記複数は２より大きい、請求項３５に記載の組成物。３７．前記複数は４より大きい、請求項３５に記載の組成物。３８．前記核酸フラグメントがベクターの一部と相補的な配列を有し、ここで該フラグメントがヌクレオチド合成を開始し得る、請求項３５に記載の組成物。３９．前記複数のメンバーのＴ^ms基は少なくとも２amuだけ異なる、請求項３５に記載の組成物。４０．前記複数のメンバーのＴ^ms基は少なくとも４amuだけ異なる、請求項３５に記載の組成物。４１．水および請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。４２．約５から約９までのpHを有する緩衝液をさらに含む、請求項４１に記載の組成物。４３．酵素ならびにdATP、dGTP、dCTPおよびdTTPのうちの１つをさらに含む、請求項４１に記載の組成物。４４．酵素ならびにddATP、ddGTP、ddCTPおよびddTTPのうちの１つをさらに含む、請求項４１に記載の組成物。４５．請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の、複数のセットの化合物を含む組成物；ここでセット内において、全てのメンバーは同じＴ^ms基を有し、そして核酸フラグメントは、ddAMP、ddGMP、ddCMPおよびddTMPから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結する可変長を有する；およびここでセット間において、Ｔ^ms 基は少なくとも２amuだけ異なる。４６．前記複数が少なくとも３である、請求項４５に記載の組成物。４７．前記複数が少なくとも５である、請求項４５に記載の組成物。４８．請求項４５に記載の第１の複数のセットの化合物、および請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の第２の複数のセットの化合物を含む組成物；ここで、第２の複数内の全てのメンバーは、ddAMP、ddGMP、ddCMP、およびddT MPから選択される同じジデオキシヌクレオチドで終結する核酸配列を有する；ただし、第１の複数の化合物に存在するジデオキシヌクレオチドは、第２の複数の化台物に存在するジデオキシヌクレオチドと同じではない。４９．DNA配列決定分析のためのキットであって、該キットは複数のコンテナセットを含み、各コンテナセットは少なくとも５つのコンテナを含み、ここで第１のコンテナはベクターを含み、第２、第３、第４および第５のコンテナは請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の化合物を含む；および第２、第３、第４および第５のコンテナ内の核酸フラグメントは同一であり、そしてセットのコンテナ内のベクターの一部と相補的であり、そして各コンテナ内のT^ms基はキット内の他のT^ms基と異なる。５０．前記複数が少なくとも３である、請求項４９に記載のキット。５１．前記複数が少なくとも５である、請求項４９に記載のキット。５２．請求項１に記載の方法において使用するために適切なシステムであって、該システムは、タグ化核酸フラグメントを分離する分離装置、タグ化核酸フラグメントから、特定のヌクレオチドと相関し、そして電気化学的な検出により検出可能であるタグを切断する装置、および定電位電流測定のための装置を含む。