DE69701671T2

DE69701671T2 - Verfahren und zusammenstellungen zur sequenzbestimmung von nukleinsäuremolekulen

Info

Publication number: DE69701671T2
Application number: DE69701671T
Authority: DE
Inventors: Jeffry Howbert; T. Mulligan; C. Tabone; Jeffrey Van Ness
Original assignee: Rapigene Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 2000-08-10
Anticipated expiration: 2017-01-24
Also published as: EP0868535B1; DE69701671T3; JP2001501449A; HUP9901321A2; DE69701671D1; GR3033733T3; PT868535E; ATE425175T1; JP2008183012A; AU717435B2; ES2144846T5; AU2247397A; CZ218498A3; NZ331044A; BR9707056B1; DE69739304D1; ATE191750T1; HUP9901321A3; EP0868535B9; CA2243560A1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Zusammensetzungen zum Bestimmen der Sequenz von Nukleinsäuremolekülen und genauer gesagt, Verfahren und Zusammensetzungen, die die Bestimmung vielfacher Nukleinsäuresequenzen simultan ermöglichen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Sequenzieren von Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist eine der grundlegenden Techniken der Biologie. Es ist von grundlegender Bedeutung für die Molekularbiologie und spielt eine sich schnell ausweitende Rolle im Rest der Biologie. Das Humangenom-Projekt ist eine multinationale Anstrengung, um den gesamten menschlichen genetischen Code zu lesen. Es ist das größte Projekt, das jemals in der Biologie unternommen wurde, und hat bereits begonnen, eine große Wirkung auf die Medizin zu haben. Die Entwicklung preiswerterer und schnellerer Sequenziertechnologie wird den Erfolg dieses Projekts sicherstellen. In der Tat sind wesentliche Bemühungen von den NIH- und DOE-Zweigen des Humangenom-Projekts finanziert worden, um die Sequenziertechnologie zu verbessern, jedoch ohne eine wesentliche Wirkung auf gegenwärtige Praktiken (Sulston and Waterston, Nature 376: 175, 1995).
In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Bestimmung und Analyse von Nukleinsäuresequenz einen der Bausteine biologischer Forschung gebildet. Dies, zusammen mit neuen Forschungswerkzeugen und -methodologien hat es Wissenschaftlern ermöglicht, Gene und Genprodukte zu studieren, um die Funktion dieser Gene besser zu verstehen sowie um neue Therapeutika und Diagnostika zu entwickeln.
Zwei verschiedene DNA-Sequenziermethodologien, die 1977 entwickelt wurden, sind heute immer noch in weitverbreiteter Verwendung. Kurz gesagt, beinhaltet die von Sanger beschriebene enzymatische Methode (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74: 5463, 1977), die Didesoxyterminatoren verwendet, die Synthese eines DNA-Stranges von einer einzelsträngigen Matrize durch eine DNA-Polymerase. Das Sanger-Sequenzierverfahren hängt von der Tatsache ab, daß Didesoxyriukleotide (ddNTPs) in den wachsenden Strang auf die selbe Art wie normale Desoxynukleotide eingebaut werden (obgleich mit einer niedrigeren Effizienz). Jedoch unterscheiden sich ddNTPs von normalen Desoxynukleotiden (dNTPs) darin, daß ihnen die 3'-OH&supmin;Gruppe fehlt, die zur Kettenelongation notwendig ist. Wenn ein ddNTP in die DNA-Kette eingebaut wird, verhindert die Abwesenheit der 3'-Hydroxy-Gruppe die Bildung einer neuen Phosphodiesterbindung, und das DNA-Fragment wird mit dem ddNTP terminiert, das zu der Base in der Matrizen-DNA komplementär ist. Das Verfahren nach Maxam und Gilbert (Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74: 560, 1977) verwendet eine chemische Abbaumethode der ursprünglichen DNA (in beiden Fällen muß die DNA klonal sein). Beide Verfahren produzieren Populationen von Fragmenten, die an einem bestimmten Punkt anfangen und an jeder Base terminieren, die in dem DNA-Fragment gefunden wird, das sequenziert werden soll. Die Termination jedes Fragments hängt von der Lage einer bestimmten Base innerhalb des ursprünglichen DNA-Fragments ab. Die DNA-Fragmente werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt, und die Reihenfolge der DNA- Basen (Adenin, Cytosin, Thymin, Guanin; auch als A, C, T bzw. G bekannt) wird von einem Autoradiograph des Gels abgelesen.
Eine aufwendige DNA-Pooling-Sequenzierstrategie (Church und Kieffer-Higgins, Science 24: 185, 1988) ist eine der neueren Vorgehensweisen bei der DNA-Sequenzierung. Eine Pooling-Sequenzierstrategie umfaßt ein Vereinigen einer Anzahl von DNA-Matrizen (Proben) und Verarbeiten der Proben als Pools. Um die Sequenzinformation am Ende der Verarbeitung aufzutrennen, werden die interessierenden DNA-Moleküle an einen Satz von Oligonukleotid- "Tags" am Anfang ligier. Die markierten DNA-Moleküle werden vereinigt, amplifiziert und chemisch fragmentier in 96-Napf-Platten. Nach Elektrophorese der vereinigten Proben wird die DNA auf einen festen Träger übertragen und dann mit einer sequenziellen Reihe spezifischer markierter Oligonukleotide hybridisier. Diese Membranen werden dann so viele Male sondiert, wie es Tags in dem ursprünglichen Pool gibt, was bei jedem Sondierungs-Satz Autoradiographen produziert, die ähnlich denjenigen aus Standard-DNA-Sequenzierverfahren sind. So ergibt jede Reaktion und Gel eine Menge an Daten, die derjenigen äquivalent ist, die aus herkömmlichen Reaktionen und Gelen erhalten wird, multipliziert mit der Anzahl an verwendeten Sonden. Wenn alkalische Phosphatase als das Reporer-Enzym verwendet wird, kann 1,2-Dioxetan-Substrat verwendet werden, das in einem chemilumineszenten Assay- Format nachgewiesen wird. Der Hauptnachteil dieser Pooling-Strategie ist jedoch, daß die Sequenzen nur durch Southern-Blotting des Sequenziergels und Hybridisieren dieser Membran, einmal für jeden Klon in dem Pool, gelesen werden kann.
Zusätzlich zu den Fortschritten bei Sequenziermethodologien haben Fortschritte hinsichtlich der Geschwindigkeit aufgrund der Ankunft automatisierter DNA-Sequenzierung stattgefunden. Kurz gesagt, verwenden diese Verfahren Fluoreszenz-markierte Primer, die Verfahren ersetzen, welche radioaktiv-markierte Komponenten verwendeten. Fluoreszierende Farbstoffe werden entweder an die Sequenzier-Primer oder die ddNTP-Terminatoren angehängt. Roboter-Komponenten verwenden jetzt Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Technologie, die zur Entwicklung linearer Amplifizierungsstrategien geführt hat. Gegenwärtiges kommerzielles Sequenzieren ermöglicht, daß alle vier Didesoxyterminator-Reaktionen auf einer einzigen Spur laufen gelassen werden. Jede Didesoxyterminator-Reaktion wird durch einen einzigartigen fluoreszierenden Primer (ein Fluorophor für jeden Basentyp: A,T,C,G) repräsentiert. Nur eine Matrizen-DNA (d. h. DNA-Probe) wird pro Spur repräsentiert. Gegenwärtige Gele ermöglichen die simultane Elektrophorese von bis zu 64 Proben in 64 verschiedenen Spuren. Verschiedene ddNTP-terminierte Fragmente werden durch Bestrahlung der Gelspur mit Licht nachgewiesen, gefolgt vom Nachweis des emittierten Lichts von dem Fluorophor. Jeder Elektrophoreseschritt ist ungefähr 4-6 Stunden lang. Jede Elektrophorese-Auftrennung löst ungefähr 400-600 Nukleotide (nt) auf, deshalb können ungefähr 6000 nt pro Stunde pro Sequenzierer sequenziert werden.
Die Verwendung von Massenspektrometrie für die Studie von monomeren Bestandteilen von Nukleinsäuren ist ebenso beschrieben worden (Hignite, In Biochemical Applications of Mass Spectrometry, Waller and Dermer (eds), Wiley-Interscience, Kapitel 16, S. 527, 1972). Kurz gesagt, wurde für größere Oligomere signifikanter früher Erfolg erreicht durch Plasma- Desorption für geschützte synthetische Oligonukleotide, die bis zu 14 Basen lang waren, und für nicht-geschützte Oligos bis zu 4 Basen Länge. Wie mit Proteinen ist die Anwendbarkeit von ESI-MS auf Oligonukleotide demonstriert werden (Covey et al., Rapid Comm. in Mass Spec. 2: 249-256, 1988). Diese Spezies werden in Lösung ionisiert, wobei die Ladung auf den sauren Phosphodiesterbrücken und/oder terminalen Phosphat-Einheiten verbleibt, und ergeben in der Gasphase vielfach geladene, Molekülanionen, zusätzlich zu Natrium-Addukten.
Sequenzieren von DNA mit < 100 Basen mit der gewöhnlichen enzymatischen ddNTP- Technik ist komplizierter, als es für größere DNA-Matrizen ist, so daß manchmal chemischer Abbau verwendet wird. Jedoch erfordert das chemische Abbauverfahren ungefähr 50 umol mit radioaktivem ³²P endmarkierten Materials, sechs chemische Schritte, elektrophoretische Auftrennung und Film-Exponieren. Für kleine Oligonukleotide (< 14 nts) ist die Kombination aus Elektrospray-Ionisation (ESI) und Fourier-Transform(FT)-Massenspektrometrie (MS) viel schneller und empfindlicher. Dissoziationsprodukte von vielfach geladenen Ionen, die bei hoher (10&sup5;) Auflösungsleistung gemessen werden, repräsentieren aufeinanderfolgende Rückgrat-Spaltungen, was die volle Sequenz in weniger als einer Minute an einer Sub-Pikomol- Menge an Probe bereitstellt (Little et al., J. Am Chem. Soc. 116: 4893, 1994). Für Molekulargewichts-Messungen ist ESI/MS auf größere Fragmente ausgedehnt worden (Potier et al., Nuc. Acids Res. 22: 3895, 1994). ESI/FTMS scheint eine wertvolle Ergänzung zu klassischen Verfahren zum Sequenzieren und zum genauen Bestimmen von Mutationen bei Nukleotiden zu sein, die so groß wie 100-mere sind. Spektrale Daten sind vor kurzem erhalten worden, bei denen 3 · 10&supmin;¹³ mol eines 50-mers geladen worden ist, unter Verwendung einer empfindlicheren ESI-Quelle (Valaskovic, Anal. Chem. 68: 259, 1995).
Die andere Vorgehensweise zur DNA-Sequenzierung mit Massenspektrometrie ist eine, bei der DNA mit individuellen Isotopen eines Elements markiert wird und die massenspektrale Analyse einfach die Isotope unterscheiden muß, nachdem Mischungen von Größen von DNA mit Elektrophorese getrennt worden sind (die andere oben beschriebene Vorgehensweise verwendet die Auflösungsleistung des Massenspektrometers, um die DNA-Oligonukleotide verschiedener Länge sowohl aufzutrennen und nachzuweisen, ein bestenfalls schwieriges Unterfangen). Alle der unten beschriebenen Prozeduren verwenden die Sanger-Prozedur, um einen Sequenzier-Primer in eine Reihe von DNA-Fragmenten umzuwandeln, die sich hinsichtlich der Länge um ein Nukleotid unterscheiden. Die enzymatisch synthetisierten DNA- Moleküle enthalten jedes den ursprünglichen Primer, eine replizierte Sequenz eines Teils der interessierenden DNA und den Didesoxyterminator. D. h. ein Satz von DNA-Molekülen wird produziert, die den Primer enthalten und sich hinsichtlich der Länge voneinander durch einen Nukleotidrest unterscheiden.
Brennen et al. (Biol. Mass Spec., New York, Elsevier, S. 219, 1990) hat Verfahren beschrieben, um die vier stabilen Isotope von Schwefel als DNA-Markierungen zu verwenden, die es einem ermöglichen, DNA-Fragmente nachzuweisen, die durch Kapillarelektrophorese aufgetrennt worden sind. Unter der Verwendung von α-thio-Analogen der ddNTPs wird ein einzelnes Schwefelisotop in jedes der DNA-Fragmente eingebaut. Deshalb können jedes der vier Typen von DNA-Fragmenten (ddTTP, ddATP, ddGTP, ddCTP-terminiert) einzigartig entsprechend dem terminalen Nukleotid markiert werden; z. B., 325 für Fragmente, die in A enden, ³³S für G, ³&sup4;S für C und ³&sup6;S für T, und zusammengemischt für eine Elektrophorese-Säule, werden Fraktionen von einigen wenigen Picolitern durch einen modifizierten Tintenstrahldrucker-Kopf erhalten und dann vollständiger Verbrennung in einem Ofen unterworfen. Dieser Prozeß oxidiert die Thiophosphate der markierten DNA zu SO&sub2;, das einer Analyse in einem Quadrupol- oder Magnetsektor-Massenspektrometer unterworfen wird. Die SO&sub2;- Masseneinheitsrepräsentierung ist 64 für Fragmente, die in A enden, 65 für G, 66 für C und 68 für T. Aufrechterhaltung der Auflösung der DNA-Fragmente, wie sie aus der Säule herauskommen, hängt davon ab, hinreichend kleine Fraktionen zu nehmen. Da der Massenspektrometer direkt an die Kapillargel-Säule gekoppelt ist, wird die Analyserate durch die Elektrophoreserate bestimmt. Dieser Prozeß ist leider teuer, setzt radioaktives Gas frei und ist nicht kommerzialisiert worden. Zwei andere grundlegende Einschränkungen wirken ebenfalls auf diesen Ansatz ein: (a) Keine anderen Bestandteile mit Massen 64, 65, 66 oder 68 (isobare Verunreinigungen) können toleriert werden, und (b) die prozentualen natürlichen Vorkommen der Schwefelisotope (³²S ist 95,0, ³³S ist 0,75, ³&sup4;S ist 4,2 und ³&sup6;S ist 0,11) bestimmen über die Empfindlichkeit und Kosten. Da ³²S 95% natürlich vorkommend ist, müssen die anderen Isotope auf > 99% angereichert werden, um kontaminierendes ³²S zu eliminieren. Isotope, die < 1% vorkommend sind, sind ziemlich teuer in 99%-iger Anreicherung zu erhalten; sogar, wenn ³&sup6;S 100-fach aufgereinigt wird, enthält es ebenso viel oder mehr ³&sup4;S, als es ³&sup6;S enthält.
Gilbert hat einen automatisierten DNA-Sequenzierer beschrieben, der einen Oligomer- Synthesizer, einen Aufbau auf einer Membran, einen Detektor, der Hybridisierung nachweist, und einen Zentralcomputer umfaßt. Der Synthesizer synthetisiert und markiert vielfache Oligomere von willkürlicher vorhergesagter Sequenz. Die Oligomere werden verwendet, um immobilisierte DNA auf Membranen zu sondieren. Der Detektor identifiziert Hybridisierungsmuster und schickt diese Muster an einen Zentralcomputer, der eine Sequenz konstruiert und dann die Sequenz der nächsten Runde der Synthese von Oligomeren vorhersagt. Durch einen iterativen Prozeß kann eine DNA-Sequenz auf eine automatisierte Art erhalten werden. Brennen hat ein Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren beschrieben auf der Grundlage der Ligation von Oligomeren (US-Patent Nr. 5,403,708). Verfahren und Zusammensetzungen sind beschrieben zum Bilden eines Ligationsprodukts, das an eine Nukleinsäurematrize hybridisiert ist. Ein Primer wird an eine DNA-Matrize hybridisiert, und dann wird ein Pool von Zufalls-Extensions-Oligonukleotiden ebenfalls an die geprimte Matrize in der Anwesenheit von Ligase(n) hybridisiert. Das Ligase-Enzym ligiert die hybridisierten Oligomere kovalent an den Primer. Modifikationen erlauben die Bestimmung der Nukleotidsequenz eines oder mehrerer Mitglieder eines ersten Satzes an Target-Nukleotidresten in der Nukleinsäurematrize, die in Intervallen von N Nukleotiden angeordnet sind. Bei diesem Verfahren wird das markierte, ligierte Produkt gebildet, wobei die Position und die Art von Markierung, die in das Ligationsprodukt eingebaut ist, Informationen hinsichtlich des Nukleotidrests in der Nukleinsäurematrize bereitstellt, mit dem der markierte Nukleotidrest basengepaart ist.
Koster hat ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA mit Massenspektrometrie nach Abbau der DNA durch eine Exonuklease beschrieben (WO-A-9 421 822). Die beschriebene Methode ist einfach, in dem Sinne, daß die DNA-Sequenz direkt bestimmt wird (die Sanger-Reaktion wird nicht verwendet). Die DNA wird in Standard-Vektoren kloniert, das 5'-Ende wird immobilisiert, und die Stränge werden dann sequenziell am 3'-Ende über eine Exonuklease abgebaut, und das enzymatische Produkt (Nukleotide) werden durch Massenspektrometrie nachgewiesen.
Weiss et al. haben eine automatisierte Hybridisierungs-/Bildgebungs-Vorrichtung für Fluoreszenz-Multiplex-DNA-Sequenzieren beschrieben (WO-A-9 511 961). Das Verfahren beruht auf dem Konzept, enzymgebundene Sonden an eine Membran zu hybridisieren, die größenaufgetrennte DNA-Fragmente enthält, die aus einer typischen Sanger-Reaktion stammen.
WO-A-9 504 160 offenbart ein Markierungsreagens, das eine Analyteneinheit umfaßt, die zwei Analytenreste hat, welche an eine Markierungs-Einheit gebunden sind, die eine Reporter-Gruppe hat. Eine Bibliothek dieser Reagentien wird verwendet, um Nukleinsäuren zu sequenzieren.
Jacobson et al. (G. A. T. A., Band 8, S. 223-29 1991) offenbart ein Markierungsreagens, das eine anorganische Markierung umfaßt.
WO-A-9 528 640 offenbart ein Markierungsreagens und Assay-System, wobei relevante Nukleotidgruppen und entsprechende Reportergruppen auf beiden Seiten eines einfachen Linkers zugefügt werden.
Der Bedarf an Sequenzierinformation ist größer, als durch die gegenwärtig existierenden Sequenziermaschinen, wie etwa dem ABI377 und dem Pharmacia ALF geliefert werden kann. Eine der Hauptlimitationen der gegenwärtigen Technologie ist die kleine Anzahl an Markierungen, die aufgelöst werden können unter Verwendung des gegenwärtigen Markierungssystems. Das Church-Pooling-System, das oben diskutiert worden ist, verwendet mehr Markierungen, aber die Verwendung und der Nachweis dieser Markierungen ist mühsam.
Die vorliegende Erfindung offenbart neue Zusammensetzungen und Verfahren, die verwendet werden können, um Nukleinsäuremoleküle mit stark erhöhter Geschwindigkeit und Empfindlichkeit gegenüber den oben beschriebenen Verfahren zu sequenzieren, und stellt weiterhin andere verwandte Vorteile bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren, Verbindungen, Zusammensetzungen, Kits und Systeme bereit zum Bestimmen der Sequenz von Nukleinsäuremolekülen. Unter einem Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Bestimmen der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, das umfaßt:
(a) Erzeugen markierter Nukleinsäurefragemente, die zu einem ausgewählten Target- Nukleinsäuremolekül komplementär sind, wobei eine Markierung eine organische Einheit ist, die mit einem bestimmten Nukleotid korrelativ und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist;
(b) Auftrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge;
(c) Abspalten der Markierungen von den markierten Fragmenten; und
(d) Nachweisen der Markierungen mit Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls daraus. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Markierungen mit Massenspektrometrie, Infrarot-Spektrometrie, Ultraviolett- Spektrometrie oder potentiostatischer Amperometrie nachgewiesen.
Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung eine Verbindung der Formel bereit:
Tms-L-X
wobei,
Tms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid, und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Jod;
L eine organische Gruppe ist, die ermöglicht, eine einzigartige Tms-enthaltende Einheit von dem Rest der Verbindung abzuspalten, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzigen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und tertiäres Amin, quartäres Amin oder organische Säure ist; und
X ein Nukleinsäurefragment ist;
unter den Bedingungen, daß die Verbindung nicht an einen festen Träger durch X gebunden ist noch eine Masse von weniger als 250 Dalton hat.
Es wird eine Zusammensetzung offenbart, die eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel Tms-L-MOI umfaßt, wobei Tms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod; L eine organische Gruppe ist, die ermöglicht, eine Tms-enthaltende Einheit von dem Rest der Verbindung abzuspalten, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzigen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure; MOI ein Nukleinsäurefragment ist, wobei L an das MOI an einer Stelle konjugiert ist, die nicht das 3'-Ende des MOI ist; und wobei keine zwei Verbindungen entweder dasselbe Tms oder dasselbe MOI haben.
Es wird eine Zusammensetzung offenbart, die Wasser und eine Verbindung der Formel Tms- L-MOI umfaßt, wobei Tms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, welche Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod; L eine organische Gruppe ist, die ermöglicht, eine Tms-enthaltende Einheit von dem Rest der Verbindung abzuspalten, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzigen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure; und MOI ein Nukleinsäurefragment ist, wobei L an das MOI an einer Stelle, die nicht das 3'-Ende des MOIs ist, konjugiert ist.
Es wird eine Zusammensetzung offenbart, die eine Mehrzahl an Sätzen von Verbindungen umfaßt, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel Tms-L-MOI hat, wobei Tms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, welche Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod; L eine organische Gruppe ist, die ermöglicht, eine Tms-enthaltende Einheit von dem Rest der Verbindung abzuspalten, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzigen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure; MOI ein Nukleinsäurefragment ist, wobei L an das MOI an einer Stelle, die nicht das 3'-Ende des MOIs ist, konjugiert ist; wobei innerhalb eines Satzes alle Mitglieder dieselbe Tms-Gruppe haben und die MOI-Fragmente variable Längen haben, die mit demselben Didesoxynukleotid terminieren, das ausgewählt ist aus ddAMP, ddGMP, ddCMP und ddTMP, und wobei zwischen den Sätzen sich die Tms-Gruppen um wenigstens 2 amu unterscheiden.
Es wird eine Zusammensetzung offenbart, die eine erste Mehrzahl an Sätzen von Verbindungen, wie in dem vorhergehenden Paragraphen beschrieben, in Kombination mit einer zweiten Mehrzahl an Sätzen von Verbindungen umfaßt, die die Formel Tms-L-MOI haben, wobei Tms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod; L eine organische Gruppe ist, die ermöglicht, eine Tms-enthaltende Einheit von dem Rest der Verbindung abzuspalten, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzigen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure; MOI ein Nukleinsäurefragment ist, wobei L an das MOI an einer Stelle, die nicht das 3'-Ende des MOIs ist, konjugiert ist; und wobei alle Mitglieder innerhalb der zweiten Mehrzahl eine MOI- Sequenz haben, die mit demselben Didesoxynukleotid terminiert, das ausgewählt ist aus ddAMP, ddGMP, ddCMP und ddTMP; unter der Bedingung, daß das Didesoxynukleotid, das bei den Verbindungen der ersten Mehrzahl vorliegt, nicht dasselbe Didesoxynukleotid ist, das bei den Verbindungen der zweiten Mehrzahl vorliegt.
Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung einen Kit zur DNA-Sequenzanalyse bereit. Der Kit umfaßt eine Mehrzahl an Behälter-Sätzen, wobei jeder Behälter-Satz wenigstens fünf Behälter umfaßt, wobei ein erster Behälter einen Vektor enthält, ein zweiter, dritter, vierter und fünfter Behälter Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten, so daß das Nukleinsäurefragment für den zweiten, dritten, vierten und fünften Behälter identisch und komplementär zu einem Teil des Vektors innerhalb des Satzes von Behältern ist, und die Tms- Gruppe innerhalb eines jeden Behälters von den anderen Tms-Gruppen in dem Kit verschieden ist.
Unter einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein System zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bereit. Das System umfaßt eine Trennungsapparatur, die markierte Nukleinsäurefragmente auftrennt, eine Apparatur, die von einem markierten Nukleinsäurefragment eine Markierung abspaltet, die mit einem bestimmten Nukleotid korrelativ und durch elektrochemischen Nachweis nachweisbar ist, und eine Apparatur zur potentiostatischen Amperometrie.
Innerhalb anderer Ausführungsformen der Erfindung können 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450 oder mehr als 500 verschiedene und einzigartige markierte Moleküle innerhalb einer gegebenen Reaktion simultan verwendet werden, wobei jede Markierung für ein ausgewähltes Nukleinsäurefragment, Sonde oder erstes oder zweites Mitglied einzigartig ist und separat identifiziert werden kann.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und angehängten Zeichnungen offenbar werden. Zusätzlich werden verschiedene Literaturangaben unten dargelegt, die in größerem Detail gewisse Prozeduren oder Zusammensetzungen (z. B. Plasmide, etc.) beschreiben und deshalb durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mitaufgenommen werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch abspaltbaren Massenspektroskopie-Markierungen, um Markierungen mit Carboxylamid-Termini freizusetzen.
Fig. 2 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch abspaltbaren Massenspektroskopie-Markierungen, um Markierungen mit Carbonsäure-Termini freizusetzen.
Fig. 3-6 und 8 zeigen das Flußdiagramm für die Synthese von Tetrafluorphenylestern eines Satzes von 36 photochemisch abspaltbaren Massenspektroskopie- Markierungen.
Fig. 7 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese eines Satzes von 36 Aminterminierten photochemisch abspaltbaren Massenspektroskopie-Markierungen.
Fig. 9 zeigt die Synthese von 36 photochemisch abspaltbaren Massenspektroskopiemarkierten Oligonukleotiden, die aus dem entsprechenden Satz von 36 Tetrafluorphenylestern von photochemisch abspaltbaren Massenspektroskopie- Markierungs-Säuren gemacht worden sind.
Fig. 10 zeigt die Synthese von 36 photochemisch abspaltbaren Massenspektroskopiemarkierten Oligonukleotiden, die aus dem entsprechenden Satz von 36 Aminterminierten photochemisch abspaltbaren Massenspektroskopie-Markierungen gemacht worden sind.
Fig. 11 illustriert den gleichzeitigen Nachweis vielfacher Markierungen mit Massenspektrometrie.
Fig. 12 zeigt das Massenspektrogramm der alpha-Cyano-Matrix allein.
Fig. 13 zeigt ein modular konstruiertes markiertes Nukleinsäurefragment.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung unter einem Aspekt Verbindungen bereit, wobei ein interessierendes Molekül oder Vorläufer dazu an eine Markierung über eine labile Bindung (oder labile Bindungen) gebunden ist. So können Verbindungen der Erfindung dahingehend betrachtet werden, daß sie die allgemeine Formel haben:
T-L-X
wobei T der Markierungs-Bestandteil ist, L der Linker-Bestandteil ist, der eine labile Bindung entweder ist oder enthält, und X entweder der Bestandteil "interessierendes Molekül" (MOI) oder ein funktioneller Gruppen-Bestandteil (Lh) ist, durch den das MOI an T-L geknüpft wer den kann. Verbindungen der Erfindung können deshalb durch die spezifischeren allgemeinen Formeln repräsentiert werden:
T-L-MOI und T-L-Lh
Aus im einzelnen unten beschriebenen Gründen können Sätze von T-L-MOI-Verbindungen absichtlich Bedingungen ausgesetzt werden, die bewirken, daß die labile(n) Bindung(en) bricht (brechen), was somit eine Markierungs-Einheit von dem Rest der Verbindung freisetzt. Die Markierungs-Einheit wird dann durch eine oder mehrere analytische Techniken charakterisiert, um dadurch direkte Information über die Struktur der Markierungs-Einheit und (am wichtigsten) indirekte Informationen über die Identität des entsprechenden MOIs bereitzustellen.
Als ein einfaches illustratives Beispiel einer repräsentativen Verbindung der Erfindung, wobei L eine direkte Bindung ist, wird auf die folgende Struktur bezug genommen (i):
In Struktur (i) ist T eine Stickstoff-enthaltende polycyclische aromatische Einheit, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist, X ist ein MOI (und spezifisch ein Nukleinsäurefragment, das in einer Amingruppe terminiert) und L ist die Bindung, die eine Amidgruppe bildet. Die Amidbindung ist labil, relativ zu den Bindungen in T, weil, wie auf dem Gebiet bekannt, eine Amidbindung chemisch gespalten (aufgebrochen) werden kann durch Säure- oder Base- Bedingungen, welche die Bindungen innerhalb des Markierungs-Bestandteils unverändert lassen. Deshalb kann eine Markierungs-Einheit (d. h. das Spaltprodukt, das T enthält) wie unten gezeigt, freigesetzt werden:
Der Linker L kann jedoch mehr als nur eine direkte Bindung sein, wie in dem folgenden erläuternden Beispiel gezeigt, wobei auf eine andere repräsentative Verbindung der Erfindung mit der Struktur (ii), die unten gezeigt ist, Bezug genommen wird:
Es ist gut bekannt, daß Verbindungen mit einer ortho-Nitrobenzylamin-Einheit (siehe Atome innerhalb der Struktur (ii) in einem Kästchen) photolytisch instabil sind, dahingehend, daß das Aussetzen solcher Verbindungen gegenüber aktinischer Strahlung einer spezifizierten Wellenlänge selektive Spaltung der Benzylamin-Bindung verursacht (siehe Bindung, die mit einer dicken Linie in Struktur (ii) bezeichnet ist). So hat Struktur (ii) dieselben T- und MOI- Gruppen wie Struktur (i), jedoch enthält die Linker-Gruppe mehrere Atome und Bindungen, unter denen es eine besonders labile Bindung gibt. Photolyse von Struktur (ii) setzt damit eine Markierungs-Einheit (T-enthaltende Einheit) aus dem Rest der Verbindung frei, wie unten gezeigt.
Die Erfindung stellt damit Verbindungen bereit, die, bei Aussetzen gegenüber geeigneten Spaltungs-Bedingungen, eine Spaltungs-Reaktion eingehen, um eine Markierungs-Einheit aus dem Rest der Verbindung freizusetzen. Verbindungen der Erfindung können im Hinblick auf die Markierungs-Einheit; das MOI (oder einen Vorläufer dazu, Lh), und die labile(n) Bindung(en), die die beiden Gruppen zusammen verbinden, beschrieben werden. Alternativ können die Verbindungen der Erfindung hinsichtlich der Bestandteile beschrieben werden, aus denen sie gebildet werden. So können die Verbindungen als das Reaktionsprodukt eines Markierungs-Reaktanten, eines Linker-Reaktanten und eines MOI-Reaktanten, wie folgt, beschrieben werden.
Der Markierungs-Reaktant umfaßt einen chemischen Griff (Th) und einen variablen Bestandteil (Tvc) so daß gesehen wird, daß der Markierungs-Reaktant die allgemeine Struktur hat:
Tvc-Th
Um diese Nomenklatur zu illustrieren, kann Bezug genommen werden auf Struktur (iii), die einen Markierungs-Reaktanden zeigt, der verwendet werden kann, um die Verbindung von Struktur (ii) herzustellen. Der Markierungs-Reaktant mit Struktur (iii) enthält einen variablen Markierungs-Bestandteil und einen Markierungs-Griff, wie unten gezeigt:
In Struktur (iii) stellt der Markierungs-Griff (-C(= O)-A) einfach einen Weg bereit, um den Markierungs-Reaktanten mit dem Linker-Reaktanten umzusetzen, um eine T-L-Einheit zu bilden. Die Gruppe "A" in Struktur (iii) zeigt an, daß die Carboxylgruppe in einem chemisch aktiven Zustand ist, so daß sie zur Kopplung mit anderen Griffen bereit ist. "A" kann z. B. eine Hydroxylgruppe oder Pentafluorphenoxy unter vielen anderen Möglichkeiten sein. Die Erfindung stellt eine große Zahl an möglichen Markierungs-Griffen bereit, die an einen variablen Markierungs-Bestandteil gebunden sein kann, wie unten im einzelnen diskutiert. Der variable Markierungs-Bestandteil ist somit ein Teil des "T" in der Formel T-L-X und wird ebenso Teil der Markierungs-Einheit sein, die sich aus der Reaktion bildet, die L spaltet.
Wie ebenso unten im einzelnen diskutiert, ist der variable Markierungs-Bestandteil so genannt, weil, bei der Herstellung von Sätzen von Verbindungen gemäß der Erfindung, es erwünscht ist, daß Mitglieder eines Satzes einzigartige variable Bestandteile haben, so daß die einzelnen Mitglieder voneinander durch eine analytische Technik unterschieden werden können. Als ein Beispiel kann der variable Markierungs-Bestandteil von Struktur (iii) ein Mitglied des folgenden Satzes sein, wobei Mitglieder des Satzes durch ihre UV- oder Massenspektren unterschieden werden können:
Ebenso kann der Linker-Reaktant im Hinblick auf seine chemischen Griffe beschrieben werden (es gibt notwendigerweise wenigstens zwei, von denen jeder als Lh bezeichnet werden kann), die einen labilen Linker-Bestandteil flankieren, wobei der labile Linker-Bestandteil die erforderliche labile Einheit (L²) und fakultative labile Einheiten (L¹ und L³) umfaßt, wobei die fakultativen labilen Einheiten im Effekt dazu dienen, L² von den Griffen Ln zu trennen, und die erforderliche labile Einheit dazu dient, eine labile Bindung innerhalb des labilen Linker- Bestandteils bereitzustellen. Somit kann der Linker-Reaktant so gesehen werden, daß er die allgemeine Formel hat:
Lh-L¹-L²-L³-Lh
Die Nomenklatur, die verwendet wird, um den Linker-Reaktanten zu beschreiben, kann im Hinblick auf Struktur (iv) illustriert werden, die sich wieder von der Verbindung von Struktur (ii) ableitet:
Wie Struktur (iv) illustriert, können Atome in mehr als einer funktionellen Rolle dienen. So funktioniert in Struktur (iv) der Benzyl-Stickstoff als ein chemischer Griff dadurch, daß er ermöglicht, den Linker-Reaktanten mit dem Markierungs-Reaktanten über eine Amid bildende Reaktion zu verbinden, und dient anschließend auch als ein notwendiger Teil der Struktur der labilen Einheit L² dadurch, daß die Benzyl-Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung besonders empfindlich gegenüber photolytischer Spaltung ist. Struktur (iv) illustriert ebenso, daß ein Linker-Reaktant eine L³-Gruppe (in diesem Fall eine Methylen-Gruppe) haben kann, obwohl er keine L¹-Gruppe hat. Ebenso können Linker-Reaktanten eine L¹-Gruppe haben, aber nicht eine L³-Gruppe, oder können L¹- und L³-Gruppen haben oder können weder L¹- noch L³-Gruppe haben. In Struktur (iv) zeigt die Anwesenheit der Gruppe "P", direkt neben der Carbonylgruppe, daß die Carbonylgruppe vor einer Reaktion geschützt ist. Ist diese Konfiguration gegeben, kann die aktivierte Carboxylgruppe des Markierungs-Reaktanten (iii) sauber mit der Amingruppe des Linker-Reaktanten (iv) reagieren, um eine Amidbindung zu bilden und eine Verbindung der Formel T-L-Lh zu ergeben.
Der MOI-Reaktant ist eine in geeigneter Weise reaktive Form eines interessierenden Moleküls. Wo das interessierende Molekül ein Nukleinsäurefragment ist, ist ein geeigneter MOI- Reaktant ein Nukleinsäurefragment, das durch seine 5'-Hydroxylgruppe an eine Phosphodiestergruppe und dann an eine Alkylenkette gebunden ist, die in einer Aminogruppe terminiert. Diese Aminogruppe kann dann mit der Carbonylgruppe von Struktur (iv) reagieren, (nachdem natürlich die Carbonylgruppe von ihrer Schutzgruppe befreit wurde und, bevorzugt, nachdem in Folge die Carbonylgruppe zu einer Reaktion mit der Amingruppe aktiviert wurde), um dadurch das MOI an den Linker zu binden.
Wenn in einer chronologischen Reihenfolge betrachtet, wird gesehen, daß die Erfindung einen Markierungs-Reaktanten (mit einem chemischen Markierungs-Griff und einem variablen Markierungs-Bestandteil), einen Linker-Reaktanten (mit zwei chemischen Linker-Griffen, einer erforderlichen labilen Einheit und 0-2 fakultativen labilen Einheiten) und einen MOI- Reaktanten (mit einem Bestandteil "interessierendes Molekül" und einem chemischen Griff "interessierendes Molekül") nimmt, um T-L-MOI zu bilden. Somit werden, um T-L-MOI zu bilden, entweder der Markierungs-Reaktant und der Linker-Reaktant zuerst zusammen umgesetzt, um T-L-Lh bereitzustellen, und dann wird der MOI-Reaktant mit T-L-Lh umgesetzt, um T-L-MOI bereitzustellen, oder ansonsten (weniger bevorzugt) werden der Linker-Reaktant und der MOI-Reaktant zusammen zuerst umgesetzt, um Lh-L-MOI bereitzustellen, und dann wird Lh-L-MOI mit dem Markienmgs-Reaktanten umgesetzt, um T-L-MOI bereitzustellen. Aus Bequemlichkeitsgründen werden Verbindungen mit der Formel T-L-MOI im Hinblick auf den Markierungs-Reaktanten, den Linker-Reaktanten und den MOI-Reaktanten beschrie ben, die verwendet werden können um solche Verbindungen zu bilden. Natürlich könnten dieselben Verbindungen der Formel T-L-MOI durch andere (typischerweise arbeitsreichere) Verfahren hergestellt werden, und fallen immer noch innerhalb des Umfangs der erfindungsgemäßen T-L-MOI-Verbindungen.
In jedem Fall sieht die Erfindung vor, daß eine T-L-MOI-Verbindung Spaltungsbedingungen unterworfen wird, so daß eine Markierungs-Einheit aus dem Rest der Verbindung freigesetzt wird. Die Markierungs-Einheit wird wenigstens den variablen Markierungs-Bestandteil umfassen und wird typischerweise zusätzlich einige oder alle der Atome aus dem Markierungs- Griff umfassen, einige oder alle der Atome aus dem Linker-Griff, der verwendet wurde, um den Markierungs-Reaktanten mit dem Linker-Reaktanten zu verbinden, die fakultative labile Einheit L¹, wenn diese Gruppe bei T-L-MOI vorhanden war, und wird vielleicht einen Teil der erforderlichen labilen Einheit L² enthalten, in Abhängigkeit von der genauen Struktur von L² und der Natur der Spaltungschemie. Der Einfachheit halber kann die Markierungs-Einheit als die T-enthaltende Einheit bezeichnet werden, weil T typischerweise den Hauptteil (im Hinblick auf Masse) der Markierungs-Einheit ausmachen wird.
Nachdem diese Einführung in einen Aspekt der vorliegenden Erfindung gegeben worden ist, werden die verschiedenen Bestandteile T, L und X im einzelnen beschrieben werden. Diese Beschreibung beginnt mit den folgenden Definitionen gewisser Begriffe, die hiernach beim Beschreiben von T, L und X verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Nukleinsäurefragment" ein Molekül, das zu einem ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekül komplementär ist (d. h. komplementär zu dem gesamten oder einem Teil davon), und kann aus der Natur stammen oder synthetisch oder rekombinant produziert sein, einschließlich nicht-natürlich vorkommender Moleküle, und kann in doppel- oder einzelsträngiger Form sein, wo angemessen; und schließt ein Oligonukleotid (z. B. DNA oder RNA), einen Primer, eine Sonde, ein Nukleinsäureanalogon (z. B. PNA), ein Oligonukleotid, das in eine 5'- zu 3'-Richtung durch eine Polymerase verlängert wird, eine Nukleinsäure, die chemisch oder enzymatisch gespalten wird, eine Nukleinsäure, die mit einem Didesoxyterminator terminiert wird oder am 3'- oder 5'-Ende mit einer Verbindung gecapped ist, die Polymerisierung am 5'- oder 3'-Ende verhindert, und Kombinationen davon ein. Die Komplementarität eines Nukleinsäurefragments zu einem ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekül bedeutet im allgemeinen das Aufweisen von wenigstens unge fähr 70% spezifischer Basenpaarung über die Länge des Fragments. Vorzugsweise weist das Nukleinsäurefragment wenigstens ungefähr 80% spezifische Basenpaarung auf; und am bevorzugtesten wenigstens ungefähr 90%. Assays zum Bestimmen des prozentualen Anteils an Fehlpaarung (und damit der prozentualen spezifischen Basenpaarung) sind auf dem Gebiet gut bekannt und beruhen auf dem prozentualen Anteil an Fehlpaarung als eine Funktion des Tm, in Bezug gesetzt zu der vollständig basengepaarten Kontrolle.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Alkyl", alleine oder in Kombination, auf ein gesättigtes, geradkettiges oder verzweigtkettiges Kohlenwasserstoffradikal, das 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6 und bevorzugter 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele solcher Radikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Isoamyl, Hexyl, Decyl und ähnliche. Der Begriff "Alkylen" bezieht sich auf ein gesättigtes, geradkettiges oder verzweigtkettiges Kohlenwasserstoff-Diradikal, das 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6 und bevorzugter 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele solcher Diradikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methylen, Ethylen, (-CH&sub2;-CH&sub2;-), Propylen und ähnliche.
Der Begriff "Alkenyl", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Kohlenwasserstoffradikal mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindung in einer Gesamtheit von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele solcher Radikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Ethenyl, E- und Z-Propenyl, Isopropenyl, E- und Z-Butenyl, E- und Z- Isobutenyl, E- und Z-Pentenyl, Decenyl und ähnliche. Der Begriff "Alkenylen" bezieht sich auf ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Kohlenwasserstoff-Diradikal mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in einer Gesamtheit von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele solcher Diradikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methyliden (=CH&sub2;), Ethyliden (-CH=CH-), Propyliden (CH&sub2;-CH=CH-) und ähnliche.
Der Begriff "Alkinyl", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Kohlenwasserstoff-Radikal mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- Dreifachbindung in einer Gesamtheit von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele solcher Radikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Ethinyl (Acetylenyl), Propinyl (Propargyl), Butinyl, Hexinyl, Decinyl und ähnli che. Der Begriff "Alkinylen" alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein geradkettiges oder verweigtkettiges Kohlenwasserstoff-Diradikal mit wenigstens einer Kohlenstoff- Kohlenstoff-Dreifachbindung in einer Gesamtheit von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele solcher Radikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Ethinylen (-C C-), Propinylen (-CH&sub2;-C C-) und ähnliche.
Der Begriff "Cycloalkyl", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf eine gesättigte, cyclische Anordnung von Kohlenstoffatomen, die von 3 bis 8 und vorzugsweise von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen zählen. Beispiele solcher Cycloalkylradikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und ähnliche. Der Begriff "Cycloalkylen" bezieht sich auf eine Diradikalform von einem Cycloalkyl.
Der Begriff "Cycloalkenyl", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf eine cyclische Kohlenstoffverbindung, die 4 bis 8, vorzugsweise 5 oder 6 Kohlenstoffatome und eine oder mehrere Doppelbindungen enthält. Beispiele solcher Cycloalkenyl-Radikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cyclopentadienyl und ähnliche. Der Begriff "Cycloalkenylen" bezieht sich auf eine Diradikal-Form eines Cycloalkenyls.
Der Begriff "Aryl" bezieht sich auf eine Kohlenstoff-cyclische (die lediglich Kohlenstoff und Wasserstoff umfaßt) aromatische Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Phenyl, Naphthyl, Indenyl, Indanyl, Azulenyl, Fluorenyl und Anthracenyl umfaßt; oder auf eine heterocyclische aromatische Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Furyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, Oxyzolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, 2-Pyrazolinyl, Pyrazolidinyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1,3,5-Triazinyl, 1,3,5-Trithianyl, Indolizinyl, Indolyl, Isoindolyl, 3H- Indolyl, Indolinyl, Benzo[b]furanyl, 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Benzo[b]thiophenyl, 1H- Indazolyl, Benzimidazolyl, Benzthiazolyl, Purinyl, 4H-Chinolizinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, 1,8-Naphthyridinyl, Pteridinyl, Carbazolyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl und Phenoxazinyl umfaßt.
"Aryl"-Gruppen, wie in dieser Anmeldung definiert, können unabhängig einen bis vier Substituenten enthalten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die umfaßt: Wasserstoff, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cyano, Carboxy, Carboalkoxy, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino, Alkinylamino, aliphatisches oder aromatisches Acyl, Alkoxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, Morpholinocarbonylamino, Thiomorpholinocarbonylamino, N-Alkyl-guanidino, Aralkylaminosulfonyl; Aralkoxyalkyl; N-Aralkoxyharnstoff; N.- Hydroxylharnstoff; N-Alkenylharnstoff; N,N-(Alkyl, hydroxyl)harnstoff; Heterocyclyl; Thioaryloxy-substituiertes Aryl; N,N-(Aryl, alkyl)hydrazino; Ar'-substituiertes Sulfonylheterocyclyl; Aralkyl-substituiertes Heterocyclyl; Cycloalkyl- und Cycloalkenyl-substiuiertes Heterocyclyl; Cycloalkyl-kondensiertes Aryl; Aryloxy-substituiertes Alkyl; Heterocycylamino; aliphatisches oder aromatisches Acylaminocarbonyl; aliphatisches oder aromatisches Acyl-substituiertes Alkenyl; Ar' -substituiertes Aminocarbonyloxy; Ar',Ar'-disubstituiertes Aryl, aliphatisches oder aromatisches Acyl-substituiertes Acyl; Cycloalkylcarbonylalkyl; Cycloalkyl-substituiertes Amino; Aryloxycarbonylalkyl; Phosphorodiamidylsäure oder -ester.
"Ar'" ist eine Kohlenstoff-cyclische oder heterocyclische Arylgruppe, wie oben definiert, die eine bis drei Substituenten hat, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Wasserstoff, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, 1,2- Dioxymethylen, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Alkylcarbonyloxy, aliphatisches oder aromatisches Acyl, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, N-Alkyl- oder N,N-Dialkylharnstoff umfaßt.
Der Begriff "Alkoxy", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Alkylether-Radikal, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist. Beispiele geeigneter Alkylether-Radikale schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n- Butoxy, Isobutoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy und ähnliche.
Der Begriff "Alkenoxy", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkenyl-O-, wobei der Begriff "Alkenyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß das Radikal nicht ein Enolether ist. Beispiele von geeigneten Alkenoxy-Radikalen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Allyloxy, E- und Z-3-Methyl-2-Propenoxy und ähnliche.
Der Begriff "Alkinyloxy", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkinyl-O-, wobei der Begriff "Alkinyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß das Radikal nicht ein Inolether ist. Beispiele von geeigneten Alkinoxy-Radikalen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Propargyloxy, 2-Butinyloxy und ähnliche.
Der Begriff "Thioalkoxy" bezieht sich auf ein Thioether-Radikal der Formel Alkyl-S-, wobei Alkyl wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Mono- oder Di- Alkyl-substituiertes Aminoradikal (d. h., ein Radikal der Formel Alkyl-NH- oder (Alkyl)2-N-), wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist. Beispiele von geeigneten Alkylamino- Radikalen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methylamino, Ethylamino, Propylamino, Isopropylamino, tert-Butylamino, N,N-Diethylamino und ähnliche.
Der Begriff "Alkenylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkenyl-NH- oder (Alkenyl)2 N-, wobei der Begriff "Alkenyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß das Radikal nicht ein Enamin ist. Ein Beispiel solcher Alkenylamino- Radikale ist das Allylamino-Radikal.
Der Begriff "Alkinylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkinyl-NH- oder (Alkinyl)2 N-, wobei der Begriff "Alkinyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß das Radikal nicht ein Inamin ist. Ein Beispiel solcher Alkinylamino- Radikale ist das Propargylamino-Radikal.
Der Begriff "Amid" bezieht sich auf entweder N(R¹)-C(=O)- oder -C(=O)-N(R')-, wobei R' hierin definiert wird, daß es Wasserstoff sowie andere Gruppen einschließt. Der Begriff "substituiertes Amid" bezieht sich auf die Situation, wo R¹ nicht Wasserstoff ist, während der Begriff "nicht-substituiertes Amid" sich auf die Situation bezieht, wo R¹ Wasserstoff ist.
Der Begriff "Aryloxy", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Aryl-O-, wobei Aryl wie oben definiert ist. Beispiele von Aryloxyradikalen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Phenoxy, Naphthoxy, Pyridyloxy und ähnliche.
Der Begriff "Arylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Aryl-NH-, wobei Aryl wie oben definiert ist. Beispiele von Arylamino-Radikalen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Phenylamino (Anilido), Naphthylamino, 2-,3- und 4- Pyridylamino und ähnliche.
Der Begriff "Aryl-kondensiertes Cycloalkyl", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Cycloalkyl-Radikal, das zwei angrenzende Atome mit einem Aryl-Radikal teilt, wobei die Begriffe "Cycloalkyl" und "Aryl" wie oben definiert sind. Ein Beispiel eines Arylkondensierten Cycloalkyl-Radikals ist das Benzo-kondensierte Cyclobutyl-Radikal.
Der Begriff "Alkylcarbonylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkyl-CONH, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkoxycarbonylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkyl-OCONH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkylsulfonylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkyl-SO&sub2;NH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Arylsulfonylamino", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Aryl-SO&sub2;NH-, wobei der Begriff "Aryl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "N-Alkylharnstoff", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Alkyl-NH-CO-NH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "N-Arylharnstoff", alleine oder in Kombination, bezieht sich auf ein Radikal der Formel Aryl-NH-CO-NH-, wobei der Begriff "Aryl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom und Jod.
Der Begriff "Kohlenwasserstoff-Radikal" bezieht sich auf eine Anordnung von Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen, die nur ein einzelnes Wasserstoffatom benötigen, um ein unabhängiges, stabiles Molekül zu sein. So hat ein Kohlenwasserstoff-Radikal eine offene Valenzstelle an einem Kohlenstoffatom, durch die das Kohlenwasserstoff-Radikal an ein anderes (andere) Atom(e) gebunden sein kann. Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, etc. sind Beispiele von Kohlenwasserstoff-Radikalen.
Der Begriff "Kohlenwasserstoff-Diradikal" bezieht sich auf eine Anordnung von Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen, die zwei Wasserstoffatome benötigen, um ein unabhängiges, stabiles Molekül zu sein. Somit hat ein Kohlenwasserstoff-Radikal zwei offene Valenzstellen an einem oder zwei Kohlenstoffatomen, durch die das Kohlenwasserstoff-Radikal an ein anderes (andere) Atom(e) gebunden sein kann. Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Cycloalkylen etc. sind Beispiele von Kohlenwasserstoff-Diradikalen.
Der Begriff "Hydrocarbyl" bezieht sich auf jede stabile Anordnung, die lediglich Kohlenstoff und Wasserstoff umfaßt, mit einer einzelnen Valenzstelle, an der es an eine andere Einheit gebunden ist, und schließt somit Radikale ein, die bekannt sind als Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl (ohne Heteroatom-Einbau in den Arylring), Arylalkyl, Alkylaryl und ähnliche. Kohlenwasserstoff-Radikal ist ein anderer Name für Hydrocarbyl.
Der Begriff "Hydrocarbylen" bezieht sich auf jede stabile Anordnung, die lediglich Kohlenstoff und Wasserstoff umfaßt, mit zwei Valenzstellen, an denen sie zu anderen Einheiten gebunden ist, und schließt somit Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Cycloalkylen, Cycloalkenylen, Arylen (ohne Heteroatom-Einbau in den Arylenring), Arylalkylen, Alkylarylen und ähnliche ein. Kohlenwasserstoff-Diradikal ist ein anderer Name für Hydrocarbylen.
Der Begriff "Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen" bezieht sich auf eine Hydrocarbylgruppe, die an ein Sauerstoffatom gebunden ist, wobei das Sauerstoffatom ebenso an eine Hydrocarbylengruppe an einer der beiden Valenzstellen gebunden ist, an der die Hydrocarbylengruppe an andere Einheiten gebunden ist. Die Begriffe "Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen", "Hydrocarbyl- NH-hydrocarbylen" und "Hydrocarbyl-amid-hydrocarbylen" haben äquivalente Bedeutungen, wobei Sauerstoff durch Schwefel, NH bzw. eine Amidgruppe ersetzt worden ist.
Der Begriff N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen bezieht sich auf eine Hydrocarbylengruppe, wobei eine der zwei Valenzstellen an ein Stickstoffatom gebunden ist und das Stickstoffatom gleichzeitig an einen Wasserstoff und eine Hydrocarbylgruppe gebunden ist. Der Begriff N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen bezieht sich auf eine Hydrocarbylengruppe, wobei eine der beiden Valenzstellen an ein Stickstoffatom gebunden ist und das Stickstoffatom gleichzeitig an zwei Hydrocarbylgruppen gebunden ist.
Der Begriff "Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen" bezieht sich auf eine Hydrocarbylgruppe, die durch eine Acyl(-C(=O)-)-Gruppe an eine der beiden Valenzstellen der Hydrocarbylengruppe gebunden ist.
Die Begriffe "Heterocyclylhydrocarbyl" und "Heterocyclyl" beziehen sich auf eine stabile cyclische Anordnung von Atomen, die Kohlenstoffatome und bis zu 4 Atomen (als Heteroatome bezeichnet) einschließen, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel. Die cyclische Anordnung kann in der Form eines monocyclischen Rings von 3-7 Atomen oder eines bicyclischen Rings von 8-11 Atomen sein. Die Ringe können gesättigt oder ungesättigt (einschließlich aromatischer Ringe) sein und können fakultativ Benzo-kondensiert sein. Stickstoff und Schwefelatome im Ring können in jeder oxidierten Form sein, einschließlich der quaternisierten Form von Stickstoff. Ein Heterocyclylhydrocarbyl kann an jeden beliebigen endocyclischen Kohlenstoff oder Heteroatom angehängt sein, was in der Schaffung einer stabilen Struktur resultiert. Bevorzugte Heterocyclylhydrocarbyle schließen 5-7-gliedrige monocyclische Heterocyclen ein, die eine oder zwei Stickstoff-Heteroatome enthalten.
Ein substituiertes Heterocyclylhydrocarbyl bezieht sich auf ein Heterocyclylhydrocarbyl wie oben definiert, wobei wenigstens ein Ringatom davon an einen angezeigten Substituenten gebunden ist, der sich vom Ring erstreckt.
Bei Bezugnahme auf Hydrocarbyl- und Hydrocarbylengruppen bezieht sich der Begriff "Derivate von irgendeinem der vorhergehenden, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe durch eine gleiche Anzahl an Fluoriden ersetzt ist" auf Moleküle, die Kohlenstoff, Wasserstoff und Fluorid-Atome, aber keine anderen Atome enthalten.
Der Begriff "aktivierter Ester" ist ein Ester, der eine "Abgangsgruppe" enthält, die leicht durch ein Nukleophil verdrängbar ist, wie etwa ein Amin-, ein Alkohol- oder ein Thiol- Nukleophil. Solche Abgangsgruppen sind gut bekannt und schließen, ohne Einschränkung, N- Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, Halogen (Halogenide), Alkoxy einschließlich Tetrafluorphenolaten, Thioalkoxy und ähnliche ein. Der Begriff "geschützter Ester" bezieht sich auf eine Estergruppe, die maskiert ist oder auf andere Weise nicht reaktiv (siehe z. B. Greene, "Protecting Groups in Organic Synthesis").
Im Hinblick auf die obigen Definitionen können andere chemische Begriffe, die in dieser Anmeldung verwendet werden, von Fachleuten leicht verstanden werden. Begriffe können alleine oder in irgendeiner Kombination davon verwendet werden. Die bevorzugten und be vorzugteren Kettenlängen der Radikale finden ihre Anwendung auf alle solche Kombinationen.

A. ERZEUGUNG VON MARKIERTEN NUKLEINSÄUREFRAGMENTEN

Wie oben bemerkt, stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein allgemeines Schema zum DNA-Sequenzieren bereit, das die Verwendung von mehr als 16 Markierungen in jeder Spur erlaubt; mit kontinuierlichem Nachweis können die Markierungen nachgewiesen und die Sequenz gelesen werden, während die Größenauftrennung stattfindet, genau wie bei konventionellem Sequenzieren auf der Grundlage von Fluoreszenz. Dieses Schema ist auf jede der DNA-Sequenziertechniken anwendbar, die auf Größenauftrennung von markierten Molekülen beruht. Geeignete Markierungen und Linker zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren werden unten genauer diskutiert.

1. Markierungen

"Markierung", wie hierin verwendet, bezieht sich im allgemeinen auf eine chemische Einheit, die verwendet wird, um auf einzigartige Weise ein "interessierendes Molekül" zu identifizieren, und bezieht sich spezifischer auf den variablen Markierungs-Bestandteil sowie das, was auch immer am nächsten daran gebunden ist in jedem der Markierungs-Reaktanten, Markierungs-Bestandteile und Markierungs-Einheiten.
Eine Markierung, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, besitzt mehrere Attribute: 1) Sie ist in der Lage, von allen anderen Markierungen unterschieden zu werden. Diese Unterscheidung von anderen chemischen Einheiten kann auf dem chromatographischen Verhalten der Markierung beruhen (insbesondere nach der Spaltungsreaktion), ihrer spektroskopischen oder potentiometrischen Eigenschaften, oder einer Kombination davon. Spektroskopische Verfahren, durch die Markierungen brauchbar unterschieden werden können, schließen Massenspektroskopie (MS), Infrarot (IR), Ultraviolett (UV) und Fluoreszenz ein, wobei MS, JR und UV die bevorzugten und MS die am meisten bevorzugten spektroskopischen Verfahren sind. Potentiometrische Amperometrie ist ein bevorzugtes potentiometrisches Verfahren.
2) Die Markierung ist in der Lage, nachgewiesen zu werden, wenn sie in 10&supmin;²² bis 10&supmin;&sup6; Mol vorhanden ist.
3) Die Markierung besitzt einen chemischen Griff, durch den sie an das MOI angehängt werden kann, welches die Markierung auf einzigartige Weise identifizieren soll. Das Anhängen kann direkt an dem MOI erfolgen oder indirekt durch eine "Linker"-Gruppe.
4) Die Markierung ist chemisch stabil gegenüber allen Manipulationen, denen sie ausgesetzt wird, einschließlich Anhängen und Abspalten von dem MOI, und jedweden Manipulationen des MOI, während die Markierung daran angehängt ist.
5) Die Markierung stört die Manipulationen nicht signifikant, die an dem MOI durchgeführt werden, während die Markierung daran angehängt ist. Z. B. darf, wenn die Markierung an ein Oligonukleotid angehängt ist, die Markierung nicht signifkant die Hybridisierung oder enzymatischen Reaktionen (z. B. PCR-Sequenzierreaktionen) stören, die an dem Oligonukleotid durchgeführt werden. Auf ähnliche Weise darf, wenn die Markierung an einen Antikörper angehängt ist, die Antigen-Erkennung durch den Antikörper nicht signifikant stören.
Eine Markierungs-Einheit, die durch bestimmte spektroskopische oder potentiometrische Verfahren nachgewiesen werden soll, sollte Eigenschaften besitzen, die die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises durch dieses Verfahren verstärken. Typischerweise wird die Markierungs-Einheit diese Eigenschaften haben, weil sie in den variablen Markierungs- Bestandteil hineinkonstruiert wurden, der typischerweise den Hauptteil der Markierungs- Einheit ausmachen wird. In der folgenden Diskussion bezieht sich die Verwendung des Wortes "Markierung" typischerweise auf die Markierungs-Einheit (d. h. das Abspaltungsprodukt, das den variablen Markierungs-Bestandteil enthält), kann jedoch ebenso so betrachtet werden, daß es sich auf den markierungsvariablen Bestandteil selbst bezieht, weil das der Anteil der Markierungs-Einheit ist, der typischerweise dafür verantwortlich ist, die einzigartig nachweisbaren Eigenschaften bereitzustellen. Bei Verbindungen der Formel T-L-X wird der "T"- Teil den variablen Markierungs-Bestandteil enthalten. Wo der variable Markierungs- Bestandteil so konstruiert wurde, um z. B. durch Massenspektrometrie charakterisiert zu werden, kann der "T"-Teil des T-L-X als Tms bezeichnet werden. Ebenso kann das Spaltprodukt aus T-L-X, das T enthält, als die Tms-enthaltende Einheit bezeichnet werden. Die folgenden spektroskopischen und potentiometrischen Verfahren können verwendet werden, um Tms- enthaltende Einheiten zu charakterisieren.

a. Eigenschaften von MS-Markierungen

Wenn eine Markierung mit Massenspektrometrie analysierbar ist (d. h. eine MS-lesbare Markierung ist, hierin ebenso bezeichnet als eine MS-Markierung oder "Tms-enthaltende Einheit"), ist die wesentliche Eigenschaft der Markierung, daß sie in der Lage ist, ionisiert zu werden. Somit ist es ein bevorzugtes Element bei der Konstruktion von MS-lesbaren Markierungen, darin eine chemische Funktionalität einzubauen, die eine positive oder negative Ladung unter Ionisationsbedingungen in der MS tragen kann. Dieses Merkmal verleiht verbesserte Effizienz der Ionenbildung und höhere Gesamtempfindlichkeit des Nachweises, insbesondere bei Elektrospray-Ionisation. Die chemische Funktionalität, die eine ionisierte Ladung unterstützt, kann sich von Tms oder L oder beiden ableiten. Faktoren, die die relative Empfindlichkeit, daß ein Analyt durch Massenspektrometrie nachgewiesen wird, erhöhen können, werden z. B. in Sunner, J., et al., Anal. Chem. 60: 1300-1307 (1988) diskutiert.
Eine bevorzugte Funktionalität, um das Tragen einer negativen Ladung zu erleichtern, ist eine organische Säure, wie etwa phenolisches Hydroxyl, Carbonsäure, Phosphonat, Phosphat, Tetrazol, Sulfonylharnstoff, Perfluoralkohol und Sulfonsäure.
Eine bevorzugte Funktionalität, um das Tragen einer positiven Ladung unter Ionsiationsbedingungen zu erleichtern, sind aliphatische oder aromatische Amine. Beispiele von Aminfunktionellen Gruppen, die erhöhte Nachweisbarkeit von MS-Markierungen ergeben, schließen quartäre Amine (d. h. Amine, die vier Bindungen haben, jede zu Kohlenstoffatomen, siehe Aebersold, U. S. Patent No. 5,240,859) und tertiäre Amine (d. h. Amine, die drei Bindungen haben, jede zu Kohlenstoffatomen, was C=N-C-Gruppen einschließt, wie sie z. B. in Pyridin vorliegen, siehe Hess et al., Anal. Biochem. 224: 373, 1995; Bures et al., Anal. Biochem. 224: 364, 1995). Gehinderte tertiäre Amine sind besonders bevorzugt. Tertiäre und quartäre Amine körnen Alkyl oder Aryl sein. Eine Tms-enthaltende Einheit muß wenigstens eine ionisierbare Spezies tragen, kann aber mehr als eine ionisierbare Spezies besitzen. Der bevorzugte Ladungszustand ist eine einzelne ionisierte Spezies pro Markierung. Entsprechend wird es bevorzugt, daß jede Tms-enthaltende Einheit (und jeder variable Markierungs-Bestandteil) nur eine einzelne gehinderte Amin- oder organische Säure-Gruppe enthält.
Geeignete Amin-enthaltende Radikale, die Teil der Tms-enthaltenden Einheit bilden können, schließen die folgenden ein:
Die Identifizierung einer Markierung durch Massenspektrometrie beruht bevorzugt auf ihrem Verhältnis Molekülmasse zu Ladung (m/z). Der bevorzugte Molekülmassenbereich von MS- Markierungen ist von ungefähr 100 bis 2.000 Dalton, und bevorzugt hat die Tms-enthaltende Einheit eine Masse von wenigstens ungefähr 250 Dalton, bevorzugter wenigstens ungefähr 300 Dalton und noch bevorzugter wenigstens ungefähr 350 Dalton. Es ist im allgemeinen für Massenspektrometer schwierig, zwischen Einheiten zu unterscheiden, die Molekülionen unter etwa 200-250 Dalton haben (abhängig von dem genauen Instrument), und somit haben bevorzugte Tms-enthaltende Einheiten der Erfindung Massen oberhalb dieses Bereichs.
Wie oben erklärt, kann die Tms-enthaltende Einheit andere Atome als die enthalten, welche in dem variablen Markierungs-Bestandteil vorliegen, und in der Tat andere als in Tms selbst vorhanden sind. Entsprechend kann die Masse von Tms selbst weniger als ungefähr 250 Dalton sein, solange, wie die Tms-enthaltende Einheit eine Masse von wenigstens ungefähr 250 Dalton hat. Somit kann die Masse von Tms von 15 (d. h. ein Methylradikal) bis ungefähr 10.000 Dalton reichen und reicht bevorzugt von 100 bis 5.000 Dalton, und reicht bevorzugter von ungefähr 200 bis ungefähr 1.000 Dalton.
Es ist relativ schwierig, Markierungen mittels Massenspektrometrie zu unterscheiden, wenn diese Markierungen Atome enthalten, die mehr als ein Isotop in signifikanter Menge haben. Entsprechend enthalten bevorzugte T-Gruppen, die zur massenspektroskopischen Identifizierung gedacht sind (Tms-Gruppen), Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod. Während andere Atome in dem Tms vorhanden sein können, kann ihre Anwesenheit die Analyse der massenspektralen Daten ein wenig schwieriger gestalten. Bevorzugt haben die Tm³-Gruppen nur Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff-Atome zusätzlich zu Wasserstoff und/oder Fluorid.
Fluorid ist ein fakultatives, jedoch bevorzugtes Atom zur Einbeziehung in eine Tms-Gruppe, Im Vergleich mit Wasserstoff ist Fluorid natürlich viel schwerer. Somit führt die Anwesenheit von Fluoridatomen anstelle von Wasserstoffatomen zu Tms-Gruppen von höherer Masse, wodurch ermöglicht wird, daß die Tms-Gruppe eine Masse von größer als 250 Dalton erreicht und überschreitet, was, wie oben erklärt, wünschenswert ist. Zusätzlich verleiht der Ersatz von Wasserstoff durch Fluorid der Tms-enthaltenden Einheit größere Flüchtigkeit, und größere Flüchtigkeit des Analyten verstärkt die Empfindlichkeit, wenn Massenspektrometrie als das Nachweisverfahren verwendet wird.
Die Molekülformel von Tms fällt innerhalb des Bereichs von C&sub1;&submin;&sub5;&sub0;&sub0;N&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;O&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;S&sub0;&submin;&sub1;&sub0;P&sub0;&submin;&sub1;&sub0;HαFβIδ, wobei die Summe von α, β und δ ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen. Die Bezeichnung C&sub1;&submin;&sub5;&sub0;&sub0;N&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;O&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;S&sub0;&submin;&sub1;&sub0;P&sub0;&submin;&sub1;&sub0;HαFβIδ be deutet, daß Tms wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält und jede Zahl von 1 bis 500 Kohlenstoffatomen enthalten kann, zusätzlich dazu, daß es fakultativ soviel wie 100 Stickstoffatome ("N&sub0;&submin;" bedeutet, daß Tms keine Stickstoffatome enthalten muß) und soviel wie 100 Sauerstoffatome und soviel wie 10 Schwefelatome und soviel wie 10 Phosphoratome enthält. Die Symbole α, β und δ repräsentieren die Zahl von Wasserstoff-, Fluorid- und Iodidatomen in Tms, wobei jeweils zwei dieser Zahlen Null sein können und wobei die Summe dieser Zahlen gleich der Gesamtheit der ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome ist. Vorzugsweise hat Tms eine Molekülformel, die innerhalb des Bereichs von C&sub1;&submin;&sub5;&sub0;N&sub0;&submin;&sub1;&sub0;O&sub0;&submin; &sub1;&sub0;HαFβ fällt, wobei die Summe von α und β der Zahl von Wasserstoff bzw. Fluoridatomen gleicht, die in der Einheit vorhanden sind.

b. Eigenschaften von IR-Markierungen

Es gibt zwei Hauptformen von IR-Nachweis von organischen chemischen Gruppen: Raman- Streuungs-IR und Absorptions-IR. Raman-Streuungs-IR-Spektren und Absorptions-IR- Spektren sind komplementäre spektroskopische Verfahren. Im allgemeinen hängt die Raman- Anregung von Bindungspolarisierbarkeitsveränderungen ab, während IR-Absorption von Bindungsdipolmomentveränderungen abhängt. Schwache IR-Absorptionslinien werden starke Raman-Linien und umgekehrt. Die Wellenzahl ist die charakteristische Einheit für IR- Spektren. Es gibt drei spektrale Regionen für IR-Markierungen, die getrennte Anwendungen haben: Nah-IR bei 12500 bis 4000 cm&supmin;¹, Mittel-IR bei 4000 bis 600 cm&supmin;¹ und Fern-IR bei 600 bis 30 cm&supmin;¹. Für die hierin beschriebenen Verwendungen, bei denen eine Verbindung als eine Markierung dienen soll, um ein MOI, Sonde oder Primer zu identifizieren, wären die mittleren spektralen Regionen bevorzugt. Z. B. würde die Carbonyl-Streckschwingung (1850 bis 1750 cm&supmin;¹) für Carbonsäuren, Carbonsäureester und -amide, und Alkyl- und Arylcarbonate, Carbamate und Ketone gemessen. N-H-Deformationsschwingungen (1750 bis 160 cm') würden verwendet werden, um Amine, Ammoniumionen und Amide zu identifizieren. Bei 1400 bis 1250 cm&supmin;¹ wird R-OH&supmin;Deformationsschwingung nachgewiesen sowie die C-N- Streckschwingung in Amiden. Aromatische Substitutionsmuster werden bei 900 bis 690 cm&supmin;¹ nachgewiesen (C-H-Deformationsschwingung, N-H-Deformationsschwingung für ArNH&sub2;). Abgesättigtes C-H, Olefine, aromatische Ringe, Doppel- und Dreifachbindungen, Ester, Acetale, Ketale, Ammoniumsalze, N-O-Verbindungen, wie etwa Oxime, Nitro, N-Oxide und Nitrate, Azo, Hydrazone, Chinone, Carbonsäuren, Amide und Lactame besitzen alle Infrarotkorrelations-Schwingungsdaten (siehe Pretsch et al., Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, Springer-Verlag, New York, 1989). Bevorzugte Verbindungen würden ein aromatisches Nitril einschließen, das eine sehr starke Nitril-Streckschwingung bei 2230 bis 2210 cm&supmin;¹ aufweist. Andere nützliche Typen von Verbindungen sind aromatische Alkine, die eine starke Streckschwingung haben, die zu einer scharfen Absorptionsbande zwischen 2140 und 2100 cm&supmin;¹ führt. Ein dritter Verbindungstyp sind die aromatischen Azide, die eine intensive Absorptionsbande im Bereich von 2160 bis 2120 cm&supmin;¹ aufweisen. Thiocyanate sind für Verbindungen repräsentativ, die eine starke Absorption bei 2275 bis 2263 cm&supmin;¹ haben.

c. Eigenschaften von UV Markierungen

Eine Zusammenstellung von organischen Chromophor-Typen und ihren jeweiligen UVsichtbaren Eigenschaften wird in Scott (Interpretation of the UV Spectra of Natural Products, Permagon Press, New York, 1962) gegeben. Ein Chromophor ist ein Atom oder eine Gruppe von Atomen oder Elektronen, die für die bestimmte Lichtabsorption verantwortlich sind. Empirische Regeln existieren für die π, π*-Maxima in konjugierten Systemen (siehe Pretsch et al., Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, Seite B65 und B70, Springer-Verlag, New York, 1989). Bevorzugte Verbindungen (mit konjugierten Systemen) würden n, π*- und π, π*-Übergänge besitzen. Solche Verbindungen werden beispielhaft belegt durch Acid Violet 7, Acridinorange, Acridingelb G, Brilliantblau G, Kongorot, Kristallviolett, Malachitgrün-Oxalat, Metanilgelb, Methylenblau, Methylorange, Methylviolett B, Naphtolgrün B, Ölblau N, Ölrot O, 4-Phenylazophenol, Safranin O, Solvent Green 3 und Sudanorange G, die alle kommerziell erhältlich sind (Aldrich, Milwaukee, WI). Andere geeignete Verbindungen sind z. B. aufgelistet in Jane, L, et al., J. Chrom. 323: 191-225 (1985).

d. Eigenschaften einer Fluoreszenz-Markierung

Fluoreszierende Sonden werden identifiziert und am direktesten durch ihre Absorptions- und Fluoreszenz-Emissions-Wellenlängen und -Intensitäten quantifiziert. Emissionsspektren (Fluoreszenz und Phosphoreszenz) sind viel empfindlicher und erlauben genauere Messungen als Absorptionsspektren. Andere photophysikalische Eigenschaften, wie etwa Anregungszustand-Lebensdauer und Fluoreszenzanisotropie werden weniger weit benutzt. Die allgemein nützlichsten Intensitätsparameter sind der molare Extinktionskoeffizient (&epsi;) für Absorption und die Quantenausbeute (QY) für Fluoreszenz. Der Wert von &epsi; wird bei einer einzelnen Wellenlänge spezifiziert (gewöhnlich dem Absorptionsmaximum der Sonde), während QY ein Maß für die Gesamtphotonenemission über das gesamte Fluoreszenzspektralprofil ist. Eine enge optische Bandbreite (< 20 nm) wird gewöhnlich zur Fluoreszenzanregung (über Absorption) verwendet, während die Fluoreszenznachweis-Bandbreite viel variabler ist, wobei sie vom vollen Spektrum für maximale Empfindlichkeit bis zu einem engen Band (-20 nm) für maximale Auflösung reicht. Fluoreszenzintensität pro Sondenmolekül ist dem Produkt aus &epsi; und QY proportional. Der Bereich dieser Parameter unter Fluorophoren von gegenwärtiger praktischer Wichtigkeit ist näherungsweise 10.000 bis 100.000 cm&supmin;¹M&supmin;¹ für &epsi; und 0,1 bis 1,0 für QY. Verbindungen, die als fluoreszierende Markierungen dienen können, sind wie folgt: Fluorescein, Rhodamin, Lambdablau 470, Lambdagrün, Lambdarot 664, Lambdarot 665, Acridinorange und Propidiumiodid, die kommerziell von Lambda Fluorescence Co. (Pleasant Gap, PA) erhältlich sind. Fluoreszierende Verbindungen, wie etwa Nilrot, Texasrot, LissaminTM, BODIPYTMS sind von Molecular Probes (Eugene, OR) erhältlich.

e. Eigenschaften von potentiometrischen Markierungen

Das Prinzip des elektrochemischen Nachweises (ECD) beruht auf Oxidation oder Reduktion von Verbindungen, die bei bestimmten angelegten Spannungen Elektronen entweder abgeben oder aufnehmen, wodurch ein Strom produziert wird, der gemessen werden kann. Wenn bestimmte Verbindungen einer Potentialdifferenz ausgesetzt werden, gehen die Moleküle eine molekulare Umordnung an der Oberfläche der Arbeitselektroden ein unter dem Verlust (Oxidation) oder Gewinn (Reduktion) von Elektronen, von solchen Verbindungen sagt man, daß sie elektronisch sind und elektrochemische Reaktionen durchlaufen. EC-Detektoren legen eine Spannung an eine Elektrodenoberfläche an, über die das HPLC-Elutionsmittel strömt. Elektroaktive Verbindungen, die von der Säule eluieren, geben entweder Elektronen ab (oxidieren) oder erhalten Elektronen (reduzieren), was eine Stromspitze in Echtzeit erzeugt. Wichtigerweise hängt die erzeugte Strommenge von sowohl der Konzentration des Analyten als auch der angelegten Spannung ab, wobei jede Verbindung eine spezifische Spannung hat, an der sie anfängt zu oxidieren oder reduzieren. Der gegenwärtig populärste elektrochemische Detektor ist der amperometrische Detektor, bei dem das Potential konstant gehalten wird und der in der elektrochemischen Reaktion erzeugte Strom dann gemessen wird. Dieser Typ von Spektrometrie wird gegenwärtig "potentiostatische Amperometrie" genannt. Kommerzielle Amperometer sind von ESA, Inc., Chelford, MA, erhältlich.
Wenn die Effizienz des Nachweises 100% ist, werden die spezialisierten Detektoren "coulometrisch" genannt. Coulometrische Detektoren sind empfindlich, die eine Anzahl an praktischen Vorteilen hinsichtlich Selektivität und Empfindlichkeit haben, was diese Typen Detektoren in einer Anordnung nützlich macht. Bei coulometrischen Detektoren wird für eine gegebene Konzentration Analyt der Signalstrom als eine Funktion des angelegten Potentials (Spannung) an die Arbeitselektrode aufgetragen. Der resultierende sigmoidale Graph wird die Strom-Spannungs-Kurve oder hydrodynamisches Voltammagramm (HDV) genannt. Das HDV ermöglicht die beste Auswahl von angelegtem Potential an die Arbeitselektrode, die es einem ermöglicht, das beobachtete Signal zu maximieren. Ein Hauptvorteil von ECD ist seine inhärent Empfindlichkeit mit gegenwärtigen Nachweisniveaus im Subfemtomol-Bereich.
Zahlreiche Chemikalien und Verbindungen sind elektrochemisch aktiv, einschließlich vieler Biochemikalien, Pharmazeutika und Pestiziden. Chromatographisch co-eluierende Verbindungen können wirksam aufgelöst werden, sogar wenn ihre Halbwellenpotentiale (das Potential bei halbmaximalem Signal) sich nur um 30-60 mV unterscheiden.
Kürzlich entwickelte coulometrische Sensoren stellen Selektivität, Identifizierung und Auflösung von co-eluierenden Verbindungen bereit, wenn sie als Detektoren bei Trennungen auf Flüssigchromatographie-Basis verwendet werden. Deshalb fügen diese angeordneten Detektoren einen weiteren Satz von Auftrennungen hinzu, die im Detektor selbst erreicht werden. Gegenwärtige Instrumente besitzen 16 Kanäle, die im Prinzip nur durch die Rate begrenzt sind, mit der Daten erhalten werden können. Die Anzahl an Verbindungen, die auf der EC- Anordnung aufgelöst werden können, ist chromatographisch begrenzt (d. h. Bodenzahlbegrenzt). Jedoch ist die Anordnung, wenn zwei oder mehrere Verbindungen, die chromatographisch co-eluieren, einen Unterschied in den Halbwellen-Potentialen von 30-60 mV haben, in der Lage, die Verbindungen zu unterscheiden. Die Fähigkeit einer Verbindung, elektrochemisch aktiv zu sein, hängt von dem Besitz einer EC-aktiven Gruppe ab (d. h. -OH, -O, - N, -S).
Verbindungen, die erfolgreich nachgewiesen worden sind unter Verwendung von coulometrischen Detektoren, schließen S-Hydroxytryptamin, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol, Homogentisinsäure, Dopamin, Metanephrin, 3-Hydroxykynurenin, Acetominophen, 3- Hydroxytryptophol, S-Hydroxyindolessigsäure, Octansulfonsäure, Phenol, o-Cresol, Pyrogallol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 4,6-Dinitrocresol, 3-Methyl-2- nitrophenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,6-Dichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 4-Chlor-3- methylphenol, 5-Methylphenol, 4-Methyl-2-nitrophenol, 2-Hydroxyanilin, 4-Hydroxyanilin, 1,2-Phenylendiamin, Benzokatechin, Buturon, Chlortholuron, Diuron, Isoproturon, Linuron, Methobromuron, Metoxuron, Monolinwon, Monuron, Methionin, Tryptophan, Tyrosin, 4- Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, 4-Hydroxycumarsäure, 7-Methoxycumann, Apigenin, Baicalein, Kaffeesäure, Catechin, Centaurein, Chlorogensäure, Daidzein, Datiscetin, Diosmetin, Epicatechingallat, Epigallocatechin, Epigallocatechingallat, Eugenol, Eupatorin, Ferulasäure, Fisetin, Galangin, Gallussäure, Gardenin, Genistein, Gentisinsäure, Hesperidin, Irigenin, Kaempferol, Leucoyanidin, Luteolin, Mangostin, Morin, Myricetin, Naringin, Narirutin, Pelargondin, Peonidin, Phloretin, Pratensein, Protocatechusäure, Rhamnetin, Quercetin, Sakuranetin, Scutellarein, Scopoletin, Syringaldehyd, Syringasäure, Tangeritin, Troxerutin, Umbelliferon, Vanillinsäure, 1,3-Dimethyltetrahydroisochinolin, 6-Hydroxydopamin, r-Salsolinol, N-Methyl-r-salsolinol, Tetrahydroisochinolin, Amitriptylin, Apomorphin, Capsaicin, Chlordiazepoxid, Chlorpromazin, Daunorubicin, Desipramin, Doxepin, Fluoxetin, Flurazepam, Imipramin, Isoproterenol, Methoxamin, Morphin, Morphin-3-glucoronid, Nortriptylin, Oxazepam, Phenylephrin, Trimipramin, Ascorbinsäure, N-Acetylserotonin, 3,4- Dihydroxybenzylamin, 3,4-Dihydroxymandelsäure (DOMA), 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC), 3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), 3,4-Dihydroxyphenylglycol (DHPG), 3- Hydroxyanthranilsäure, 2-Hydroxyphenylessigsäure (2HPAC), 4-Hydroxybenzoesäure (4HBAC), 5-Hydroxyindol-3-essigsäure (5HIAA), 3-Hydroxykynurenin, 3- Hydroxymandelsäure, 3-Hydroxy-4-methoxyphenylethylamin, 4-Hydroxyphenylessigsäure (4HPAC), 4-Hydroxyphenylmilchsäure (4HPLA), S-Hydroxytryptophan (5HTP), 5- Hydroxytryptophol (5HTOL), 5-Hydroxytryptamin (5HT), 5-Hydroxytryptaminsulfat, 3- Methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG), 5-Methoxytryptamin, 5-Methoxytryptophan, 5- methoxytryptophol, 3-Methoxytyramin (3MT), 3-Methoxytyrosin (3-OM-DOPA), 5- Methylcystein, 3-Methylguanin, Bufotenin, Dopamin, Dopamin-3-glucuronid, Dopamin-3- sulfat, Dopamin-4-sulfat, Epinephrin, Epinin, Folsäure, Glutathion (reduziert), Guanin, Guanosin, Homogentisinsäure (HGA), Homovanillinsäure (HVA) Homovanillylalkohol (HVOL), Homoveratrumsäure, hva-Sulfat, Hypoxanthin, Indol, Indol-3-essigsäure, Indol-3-milchsäure, Kynurenin, Melatonin, Metanephrin, N-Methyltryptamin, N-Methyltyramin, N,N- Dimethyltryptamin, N,N-Dimethyltyramin, Norepinephrin, Normetanephrin, Octopamin, Pyridoxal, Pyridoxalphosphat, Pyridoxamin, Synephrin, Tryptophol, Tryptamin, Tyramin, Harnsäure, Vanillylmandelsäure (vma), Xanthin und Xanthosin ein. Andere geeignete Verbindungen sind in z. B. Jane, I. et al. J. Chrom. 323: 191-225 (1985) und Musch, G., et al., J. Chrom. 348: 97-110 (1985) dargelegt. Diese Verbindungen können in Verbindungen der Formel T-L- X mit auf dem Gebiet bekannten Verfahren eingebaut werden. Zum Beispiel können Verbindungen, die eine Carbonsäuregruppe haben, mit Amin, Hydroxyl etc. umgesetzt werden, um Amid-, Ester- und andere Bindungen zwischen T und L zu bilden.
Zusätzlich zu den obigen Eigenschaften und ohne Rücksicht auf das beabsichtigte Nachweisverfahren wird es bevorzugt, daß die Markierung eine modulare chemische Struktur hat. Dies hilft bei der Konstruktion einer großen Anzahl strukturell verwandter Markierungen unter Verwendung der Techniken der kombinatorischen Chemie. Zum Beispiel hat die Tms -Gruppe wünschenswerterweise mehrere Eigenschaften. Wünschenswerterweise enthält sie eine funktionelle Gruppe, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Tms- enthaltende Einheit Massenspektrometrie unterworfen wird (einfacher bezeichnet als "Massenspektrometrie-Empfindlichkeitsverstärker"-Gruppe, oder MSSE). Ebenso kann sie wünschenswerterweise als ein Mitglied in einer Familie von Tms-enthaltenden Einheiten dienen, in der die Mitglieder der Familie jedes ein unterschiedliches Verhältnis Masse/Ladung haben, jedoch näherungsweise dieselbe Empfindlichkeit im Massenspektrometer haben. Somit haben die Mitglieder der Familie wünschenswerterweise dieselbe MSSE. Um die Erzeugung von Familien von Verbindungen zu ermöglichen, wurde es bequem gefunden, Markierungsreaktanten vermittels eines modularen Syntheseschemas zu erzeugen, so daß die Markierungs- Bestandteile selbst so gesehen werden können, daß sie Module umfassen.
In einem bevorzugten modularen Ansatz für die Struktur der Tms-Gruppe hat Tms die Formel
T²-(J-T³-)n-
wobei T² eine organische Einheit ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet wird, mit einem Massenbereich von 15 bis 500 Dalton; T³ eine organische Einheit ist, gebildet aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, mit einem Massenbereich von 50 bis 1000 Dalton; J eine direkte Bindung oder eine funktionelle Gruppe ist, wie etwa Amid, Ester, Amin, Sulfid, Ether, Thioester, Disulfid, Thioether, Harnstoff, Thioharnstoff, Carbamat, Thiocarbamat, Schiff sche Base, reduzierte Schiff sche Base, Imin, Oxim, Hydrazon, Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Sulfonat, Sulfonamid oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, jedes T³ und J unabhängig ausgewählt ist.
Die modulare Struktur T²-(J-T³)n- stellt einen bequemen Zugang zu Familien der T-L-X- Verbindungen bereit, in denen jedes Mitglied der Familie eine unterschiedliche T-Gruppe hat. Zum Beispiel kann, wenn T Tms ist und jedes Familienmitglied wünschenwerterweise dieselbe MSSE hat, eine der T³-Gruppen diese MSSE-Struktur bereitstellen. Um Variabilität unter Mitgliedern einer Familie hinsichtlich der Masse von Tms bereitzustellen, kann die T²-Gruppe unter Familienmitgliedern variiert werden. Zum Beispiel kann ein Familienmitglied T²- Methyl haben, während ein anderes T²=Ethyl hat und ein anderes T²=Propyl hat, etc..
Um "grobe" oder große Sprünge hinsichtlich der Masse bereitzustellen, kann eine T³-Gruppe konstruiert werden, die in signifikantem Maße (z. B. eine oder mehrere hundert) Masseeinheiten zu T-L-X hinzufügt. Eine solche T³-Gruppe kann als ein Molekulargewichtsbereich- Einstellungsgruppe ("WRA") bezeichnet werden. Eine WRA ist ziemlich nützlich, wenn man mit einem einfachen Satz T²-Gruppen arbeitet, die Massen haben werden, die sich über einen beschränkten Bereich erstrecken. Ein einzelner Satz T²-Gruppen kann verwendet werden, um Tms-Gruppen mit einem weiten Massenbereich zu erzeugen, indem einfach eine oder mehrere WRA-T³-Gruppen in die Tms eingebaut werden. Um ein einfaches Beispiel zu gebrauchen, stellt, wenn ein Satz von T²-Gruppen einen Massebereich von 250-340 Dalton für die Tms liefert, das Hinzufügen einer einzelnen WRA mit einer beispielhaften Zahl von 100 Dalton als eine T³-Gruppe Zugang zum Massebereich von 350-440 Dalton bereit, während derselbe Satz T²-Gruppen verwendet wird. In ähnlicher Weise stellt die Zugabe von zwei 100 Dalton MWA-Gruppen (jede als eine T³-Gruppe) Zugang zum Massebereich von 450-540 Dalton bereit, wobei dieses inkrementale Hinzufügen von WRA-Gruppen fortgesetzt werden kann, um Zugang zu einem sehr großen Massebereich für die Tms-Gruppe bereitzustellen. Bevorzugte Verbindungen der Formel T²-(J-T³-)n-L-X haben die Formel RVWC-(RWRA)w-RMSSE-L-X, wobei VWC eine "T²"-Gruppe ist und jede der WRA- und MSSE-Gruppen "T³"-Gruppen sind. Diese Struktur wird in Fig. 13 illustriert und stellt einen modularen Ansatz für die Herstellung von Tms dar.
In der Formel T²-(J-T³-)"-, werden T² und T³ vorzugsweise ausgewählt aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-amid-hydrocarbylen, N-(hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N- Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen, Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen, Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, substituiertem Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor und die Substituenten ausgewählt sind aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N- Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen und Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen. Zusätzlich kann T² und/oder T³ ein Derivat jedes der zuvor aufgelisteten potentiellen T²/T³-Gruppen sein, so daß ein oder mehrere Wasserstoffe durch Fluoride ersetzt sind.
Ebenso hat in Anbetracht der Formel T²-(J-T³-)n- ein bevorzugtes T³ die Formel -G(R²)-, wobei G eine C&sub1;&sub6;-Alkylenkette ist mit einem einzelnen R²-Substituenten. Damit kann, wenn G Ethylen (-CH&sub2;-CH&sub2;-) ist, jeder der beiden Ethylenkohlenstoffe einen R²-Substituenten haben, und R² ist ausgewählt aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl-kondensiertem Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Aryl-substituiertem Alkenyl oder Alkinyl, Cycloalkylsubstituiertem Alkyl, Cycloalkenyl-substituiertem Cycloalkyl, Biaryl, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Aralkoxy, Aryl-substituiertem Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryl-substituiertem Alkylamino, Aryl-substituiertem Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryloxy, Arylamino, N-Alkylharnstoff-substituiertem Alkyl, N- Arylharnstoff-substituiertem Alkyl, Alkylcarbonylamino-substituiertem Alkyl, Aminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylsubstituiertem Alkyl, Heterocyclylsubstituiertem Amino, Carboxyalkyl-substituiertem Aralkyl, Oxocarbocyclyl-kondensiertem Aryl und Heterocyclylalkyl; Cycloalkenyl, Aryl-substituiertem Alkyl und Aralkyl, Hydroxysubstituiertem Alkyl, Alkoxysubstituiertem Alkyl, Aralkoxy-substituiertem Alkyl, Alkoxysubstituiertem Alkyl, Aralkoxy-substituiertem Alkyl, Amino-substituiertem Alkyl, (Arylsubstituiertem Alkyloxycarbonylamino)-substituiertem Alkyl, Thiol-substituiertem Alkyl, Alkylsulfonyl-substituiertem Alkyl, (Hydroxysubstituiertem Alkylthio)-substituiertem Alkyl, Thioalkoxy-substituiertem Alkyl, Hydrocarbylacylamino-substituiertem Alkyl, Heterocyclylacylamino-substituiertem Alkyl, Hydrocarbyl-substituiertem-Heterocyclylacylaminosubstituiertem Alkyl, Alkylsulfonylamino-substituiertem AIkyl, Arylsulfonylaminosubstituiertem Alkyl, Morpholinoalkyl, Thiomorpholinoalkyl, Morpholinocarbonylsubstituiertem Alkyl, Thiomorpholinocarbonyl-substituiertem Alkyl, [N-(Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl)- oder N,N,-[Dialkyl, Dialkenyl, Dialkinyl oder (Alkyl, Alkenyl)-amino]carbonylsubstituiertem Alkyl, Heterocyclylaminocarbonyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonyl, He terocyclylaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonylsubstituiertem Alkyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbonyl, N,N- [Dialkyl]alkylenaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonyl-alkyl, Carboxyl-substituiertem Alkyl, Dialkylamino-substituiertem Acylaminoalkyl und Aminosäureseitenketten, ausgewählt aus Arginin, Asparagin, Glutamin, S-Methylcystein, Methionin und entsprechende Sulfoxid- und Sulfonderivate davon, Glycin, Leucin, Isoleucin, allo-Isoleucin, tert-Leucin, Norleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Prolin, Alanin, Ornithin, Histidin, Glutamin, Valin, Threonin, Serin, Asparaginsäure, beta-Cyanoalanin und allo-Threonin; Alinyl und Heterocyclylcarbonyl, Aminocarbonyl, Amido, Mono- oder Dialkylaminocarbonyl, Mono- oder Diarylaminocarbonyl, Alkylarylaminocarbonyl, Diarylaminocarbonyl, Mono- oder Diacylaminocarbonyl, aromatischem oder aliphatischem Acyl, Alkyl, das fakultativ substituiert ist mit Substituenten, ausgewählt aus Amino, Carboxy, Hydroxy, Mercapto, Mono- oder Dialkylamino, Mono- oder Diarylamino, Alkylarylamino, Diarylamino, Mono- oder Diacylamino, Alkoxy, Alkenoxy, Aryloxy, Thioalkoxy, Thioalkenoxy, Thioalkinoxy, Thioaryloxy und Heterocyclyl.
Eine bevorzugte Verbindung der Formel T²-(J-T³-)n-L-X hat die Struktur:
wobei G(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub6; ist, so daß ein Wasserstoff an einer und nur einer der CH&sub2;-Gruppen, repräsentiert durch ein einzelnes "G", durch -(CH&sub2;) Amid-T&sup4; ersetzt wird; T² und T&sup4; organische Einheiten der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;HαFβ sind, so daß die Summe von α und β ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; Amid
ist;
R¹ Wasserstoff oder C&sub3;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl ist; c eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 4 ist; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, G, c, Amid, R¹ und T&sup4; unabhängig ausgewählt werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform hat eine Verbindung der Formel T²-(J-T³-)n-L- X die Struktur:
wobei T eine organische Einheit der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;HαFβ ist, so daß die Summe von α und β ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; und T&sup5; ein tertiäres oder quartäres Amin oder eine organische Säure einschließt; m eine ganze Zahl im Bereich von 0-49 ist, und T², T&sup4;, R¹, L und X zuvor definiert worden sind. Eine andere bevorzugte Verbindung mit der Formel T²-(J-T³-)n-L-X hat die besondere Struktur:
wobei T eine organische Einheit der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;HαFβ ist, so daß die Summe von α und β ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; und T&sup5; ein tertiäres oder quartäres Amin oder eine organische Säure einschließt; m eine ganze Zahl im Bereich von 0-49 ist, und T², T&sup4;, c, R¹, "Amid", L und X zuvor definiert worden sind.
In den obigen Strukturen, die eine T&sup5;-Gruppe haben, ist -Amid-T&sup5; vorzugsweise eines der folgenden, die bequemerweise hergestellt werden durch Umsetzen von organischen Säuren mit freien Aminogruppen, die von "G" ausgehen:
Wo die obigen Verbindungen eine T&sup5;-Gruppe haben und die "G"-Gruppe eine freie Carboxylgruppe hat (oder ein reaktives Äquivalent davon), sind dann die folgenden bevorzugte -Amid-T&sup5;-Gruppen, die bequemerweise durch Umsetzen des passenden organischen Amins mit einer freien Carboxylgruppe hergestellt werden können, die von einer "G"-Gruppe ausgeht:
In drei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung hat T-L-MOI die Struktur:
oder die Struktur:
oder die Struktur:
wobei T² und T&sup4; organische Einheiten der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;0&sub0;&submin;&sub9;S&sub0;&submin;&sub3;P&sub0;&submin;&sub3;HαFβIδ sind, so daß die Summe von α, β und δ ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen; G(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub6; ist, wobei ein und nur ein Wasserstoff an den CH&sub2;- Gruppen, repräsentiert durch jedes G, durch -(CH&sub2;)-Amid-T&sup4; ersetzt ist; Amid
ist;
R¹ Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl ist; c eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 4 ist; "C&sub2;-C&sub1;&sub0;" eine Hydrocarbylengruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen repräsentiert, "ODN-3'-OH" ein Nukleinsäurefragment mit einer terminalen 3'-Hydroxylgruppe repräsentiert (d. h. ein Nukleinsäurefragment, das mit (C&sub1;-C&sub1;&sub0;) an einem Ende des Nukleinsäurefragments verbunden ist, das nicht das 3'-Ende ist); und n eine ganze Zahl im Bereich von I bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, dann G, c, Amid, R¹ und T&sup4; unabhängig ausgewählt werden. Vorzugsweise sind nicht drei Heteroatome an ein einzelnes Kohlenstoffatom gebunden.
Wobei T² und T&sup4; organische Einheiten der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9; sind, so daß die Summe von α, β und δ ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; G (CH&sub2;)16 ist, wobei ein und nur ein Wasserstoff an den CH&sub2;-Gruppen, repräsentiert durch jedes G, durch -(CH&sub2;) Amid-T&sup4; ersetzt ist; Amid
ist;
R¹ Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl ist; c eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 4 ist; "ODN-3'- OH" ein Nukleinsäurefragment mit einer terminalen 3'-Hydroxylgruppe repräsentiert; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, G, c, Amid, R¹ und T&sup4; unabhängig ausgewählt werden.
In Strukturen, wie oben dargestellt, die eine T²-C(=O)-N(R¹)-Gruppe enthalten, kann diese Gruppe gebildet werden durch Umsetzen eines Amins der Formel HN(R¹)- mit einer organischen Säure, ausgewählt aus den folgenden, die lediglich beispielhaft sind und keine erschöpfende Liste potentieller organischer Säuren bilden: Ameisensäure, Essigsäure, Propiolsäure, Propionsäure, Fluoressigsäure, 2-Butinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Buttersäure, Methoxyessigsäure, Difluoressigsäure, 4-Pentinsäure, Cyclobutancarbonsäure, 3,3- Dimethylacrylsäure, Valeriansäure, N,N-Dimethylglycin, N-Formyl-Gly-OH, Ethoxyessigsäure, (Methylthio)essigsäure, Pyrrol-2-carbonsäure, 3-Furancarbonsäure, Isoxazol-5- carbonsäure, trans-3-Hexensäure, Trifluoressigsäure, Hexansäure, Ac-Gly-OH, 2-Hydroxy-2- methylbuttersäure, Benzoesäure, Nicotinsäure, 2-Pyrazincarbonsäure, 1-Methyl-2- pyrrolcarbonsäure, 2-Cycloperiten-1-essigsäure, Cyclopentylessigsäure, (S)-(-)-2-Pyrrolidon- 5-carbonsäure, N-Methyl-L-prolin, Heptansäure, Ac-b-Ala-OH, 2-Ethyl-2- hydroxybuttersäure, 2-(2-Methoxyethoxy)essigsäure, p-Toluylsäure, 6-Methylnicotinsäure, 5- Methyl-2-pyrazincarbonsäure, 2,5-Dimethylpyrrol-3-carbonsäure, 4-Fluorbenzoesäure, 3,5- Dimethylisoxazol-4-carbonsäure, 3-Cyclopentylpropionsäure, Octansäure, N,N- Dimethylsuccinamidsäure, Phenylpropiolsäure, Zimtsäure, 4-Ethylbenzoesäure, p-Anissäure, 1,2,5-Trimethylpyrrol-3-carbonsäure, 3-Fluor-4-methylbenzoesäure, Ac-DL-Propargylglycin, 3-(Trifluormethyl)buttersäure, 1-Piperidinpropionsäure, N-Acetylprolin, 3,5- Difluorbenzoesäure, Ac-L-Val-OH, Indol-2-carbonsäure, 2-Benzofurancarbonsäure, Benzotriazol-5-carbonsäure, 4-n-Propylbenzoesäure, 3-Dimethylaminobenzoesäure, 4- Ethoxybenzoesäure, 4-(Methylthio)benzoesäure, N-(2-Furoyl)glycin, 2- (Methylthio)nicotinsäure, 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure, Tfa-Gly-OH, 2-Naphthoesäure, Chinaldinsäure, Ac-L-Ile-OH, 3-Methylinden-2-carbonsäure, 2-Chinoxalincarbonsäure, 1- Methylindol-2-carbonsäure, 2,3,6-Trifluorbenzoesäure, N-Formyl-L-Met-OH, 2-[2-(2- Methoxyethoxy)ethoxy]essigsäure, 4-n-Butylbenzoesäure, N-Benzoylglycin, 5-Fluorindol-2- carbonsäure, 4-n-Propoxybenzoesäure, 4-Acetyl-3,5-dimethyl-2-pyrrolcarbonsäure, 3,5- Dimethoxybenzoesäure, 2,6-Dimethoxynicotinsäure, Cyclohexanpentansäure, 2- Naphthylessigsäure, 4-(1H-Pyrrol-1-yl)benzoesäure, Indol-3-propionsäure, m- Trifluormethylbenzoesäure, 5-Methoxyindol-2-carbonsäure, 4-Pentylbenzoesäure, B2-b-Ala- OH, 4-Diethylaminobenzoesäure, 4-n-Butoxybenzoesäure, 3-Methyl-5-CF3-isoxazol-4- carbonsäure, (3,4-Dimthoxyphenyl)essigsäure, 4-Biphenylcarbonsäure, Pivaloyl-Pro-OH, Octanoyl-Gly-OH, (2-Naphthoxy)essigsäure, Indol-3-buttersäure, 4- (Trifluormethyl)phenylessigsäure, 5-Methoxyindol-3-essigsäure, 4- (Trifluormethoxy)benzoesäure, Ac-L-Phe-OH, 4-Pentyloxybenzoesäure, Z-Gly-OH, 4- Carboxy-N-(fur-2-ylmethyl)pyrrolidin-2-on, 3,4-Diethoxybenzoesäure, 2,4-Dimethyl-5- CO&sub2;Et-pyrrol-3-carbonsäure, N-(2-Fluorphenyl)succinamidsäure, 3,4,5-Trimethoxybenzoesäure, N-Phenylanthranilsäure, 3-Phenoxybenzoesäure, Nonanoyl-Gly-OH, 2-Phenoxypyridin-3-carbonsäure, 2,5-Dimethyl-1-phenylpyrrol-3-carbonsäure, trans-4-(Trifluormethyl)zimtsäure, (5-Methyl-2-phenyloxazol-4-yl)essigsäure, 4-(2-Cyclohexenyloxy)benzoesäure, 5-Methoxy-2-methylindol-3-essigsäure, trans-4-Cotinincarbonsäure, Bz-5-Aminovaleriansäure, 4-Hexyloxybenzoesäure, N-(3-Methoxyphenyl)succinamidsäure, Z-Sar-OH, 4- (3,4-Dimethoxyphenyl)buttersäure, Ac-o-Fluor-DL-Phe-OH, N-(4- Fluorphenyl)glutaminsäure, 4'-Ethyl-4-biphenylcarbonsäure, 1,2,3,4- Tetrahydroacridincarbonsäure,3 -Phenoxyphenyl-essigsäure, N-(2,4- Difluorphenyl)succinamidsäure, N-Decanoyl-Gly-OH, (+)-6-Methoxy-a-methyl-2- naphthalinessigsäure, 3-(Trifluormethoxy)zimtsäure, N-Formyl-DL-Trp-OH, (R)-(+)-a- Methoxy-a-(trifluormethyl)phenylessigsäure, Bz-DL-Leu-OH, 4-(Trifluormethoxy)- phenoxyessigsäure, 4-Heptyloxybenzoesäure, 2,3,4-Trimethoxyzimtsäure, 2,6-Dimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionsäure, 2,3,4,5,6-Pentafluorphenoxyessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)glutaminsäure, N-Undecanoyl-Gly-OH, 2-(4-Fluorbenzoyl)- benzoesäure, 5-Trifluormethoxyindol-2-carbonsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)diglycolamidsäure, Ac-L-Trp-OH, Tfa-L-Phenylglycin-OH, 3-Iodbenzoesäure, 3-(4-n-Pentylbenzoyl)- propionsäure, 2-Phenyl-4-chinolincarbonsäure, 4-Octyloxybenzoesäure, Bz-L-Met-OH, 3,4,5- Triethoxybenzoesäure, N-Lauroyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)benzoesäure, Ac-5 - Methyl-DL-Trp-OH, 2-Iodphenylessigsäure, 3-Iod-4-methylbenzoesäure, 3-(4-n-Hexylbenzoyl)propionsäure, N-Hexanoyl-L-Phe-OH, 4-Nonyloxybenzoesäure, 4' -(Trifluormethyl)- 2-biphenylcarbonsäure, B2-L-Phe-OH, N-Tridecanoyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)- phenylessigsäure, 3-(4-n-Heptylbenzoyl)propionsäure, N-Heptanoyl-L-Phe-OH, 4-Decyloxybenzoesäure, N-(α,α,α-Trifluor-m-tolyl)anthranilsäure, Nifluminsäure, 4-(2-Hydroxyhexafluorisopropyl)benzoesäure, N-Myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-Octylbenzoyl)propionsäure, N- Octanoyl-L-Phe-OH, 4-Undecyloxybenzoesäure, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionyl-Gly- OH, 8-Iodnaphthoesäure, N-Pentadecanoyl-Gly-OH, 4-Dodecyloxybenzoesäure, N-Palmitoyl-Gly-OH und N-Stearoyl-Gly-OH. Diese organischen Säuren sind von einem oder mehreren der Advanced ChemTech, Louisville, KY; Bachem Biöscience Inc., Torrance, CA; Cablochem-Novablochem Corp., San Diego, CA; Farchan Laboratories Inc., Gainesville FL; Lancaster Synthesis, Windham NH; und Mayßridge Chemical Company (c/o Ryan Scientific), Columbia, SC, erhältlich. Die Kataloge von diesen Gesellschaften verwenden die Abkürzungen, die oben verwendet werden, um die Säuren zu identifizieren.

f. Kombinatorische Chemie als ein Mittel zum Herstellen von Markierungen

Kombinatorische Chemie ist ein Typ der Synthesestrategie, die zu der Herstellung großer chemischer Bibliotheken führt (siehe z. B. PCT-Anmeldung, Veröffentlichungs-Nr. WO 94/08051). Diese kombinatorischen Bibliotheken können als Markierungen zur Identifizierung von interessierenden Molekülen (MOIs) verwendet werden. Kombinatorische Chemie kann definiert werden als die systematische und wiederholte kovalente Verbindung eines Satzes verschiedener "Bausteine" variierender Strukturen miteinander, um eine große Anordnung verschiedener Moleküleinheiten zu ergeben. Die Bausteine können viele Formen annehmen, sowohl natürlich vorkommend als auch synthetisch, wie etwa Nukleophile, Elektrophile, Di ene, alkylierende oder acylierende Mittel, Diamine, Nukleotide, Aminosäuren, Zucker, Lipide, organische Monomere, Synthons und Kombinationen der obigen. Chemische Reaktionen, die verwendet werden, um die Bausteine zu verbinden, können Alkylierung, Acylierung, Oxidation, Reduktion, Hydrolyse, Substitution, Eliminierung, Addition, Cyclisierung, Kondensation und ähnliche beinhalten. Dieser Prozeß kann Bibliotheken von Verbindungen herstellen, die oligomer, nicht-oligomer oder Kombinationen davon sind. Wenn oligomer, können die Verbindungen verzweigt, nicht-verzweigt oder cyclisch sein. Beispiele von oligomeren Strukturen, die mit kombinatorischen Verfahren hergestellt werden können, schließen Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Polylipide, Polyester, Polyamide, Polyurethane, Polyharnstoffe, Polyether Poly(phosphorderivate), z. B. Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide, Phosphite, Phosphinamide, etc., und Poly(schwefelderivate), z. B. Sulfone, Sulfonate, Sulfite, Sulfonamide, Sulfenamide etc., ein.
Ein häufiger Typ einer oligomeren kombinatorischen Bibliothek ist die kombinatorische Peptid-Bibliothek. Jüngere Innovationen in der Peptidchemie und Molekularbiologie haben ermöglicht, daß Bibliotheken, die 10 bis 100 Millionen verschiedener Peptidsequenzen umfas sen, hergestellt und verwendet werden. Solche Bibliotheken können in drei große Kategorien unterteilt werden. Eine Kategorie Bibliotheken beinhaltet die chemische Synthese löslicher, nicht an einen Träger gebundener Peptid-Bibliotheken (z. B. Houghten et al., Nature 354: 84, 1991). Eine zweite Kategorie beinhaltet die chemische Synthese an einen Träger gebundener Peptid-Bibliotheken, die auf festen Trägern präsentiert werden, wie etwa Plastiknadeln, Harzperlen oder Baumwolle (Geysen et al., Mol. Immunol. 23: 709, 1986; Lam et al., Nature 354: 82, 1991; Eichler und Houghten, Biochemistry 32 : 11035, 1993). In diesen ersten beiden Kategorien sind die Bausteine typischerweise L-Aminosäuren, D-Aminosäuren, nicht- natürliche Aminosäuren oder eine Mischung oder Kombination davon. Eine dritte Kategorie verwendet molekularbiologische Ansätze, um Peptide oder Proteine auf der Oberfläche filamentöser Phagenpartikeln oder Plasmiden (Scott und Craig, Curr. Opinion Biotech. 5: 40,1994) herzustellen. Lösliche, nicht an einen Träger gebundene Peptid-Bibliotheken scheinen für eine Anzahl von Anwendungen, einschließlich der Verwendung als Markierungen, geeignet zu sein. Das zur Verfügung stehende Repertoire chemischer Diversitäten in Peptid-Bibliotheken kann durch Schritte, wie etwa Permethylierung (Ostresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 11138, 1994) ausgedehnt werden.
Zahlreiche Varianten kombinatorischer Peptid-Bibliotheken sind möglich, bei denen das Peptid-Rückgrat modifiziert ist und/oder die Amidbindungen durch mimetische Gruppen ersetzt worden sind. Amid-mimetische Gruppen, die verwendet werden können, schließen Harnstoffe, Urethane und Carbonylmethylengruppen ein. Umstrukturierung des Rückgrats, so daß Seitenketten von den Amidstickstoffen jeder Aminosäure ausgehen, eher als von den α- Kohlenstoffen, ergibt Bibliotheken von Verbindungen, die als Peptoide bekannt sind (Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 9367, 1992).
Ein weiterer häufiger Typ einer oligomeren kombinatorischen Bibliothek ist die kombinatorische Oligonukleotid-Bibliothek, bei der die Bausteine eine Form von natürlich vorkommenden oder nicht-natürlichen Nukleotid- oder Polysaccharid-Derivaten sind, einschließlich derjenigen, bei denen verschiedene organische und anorganische Gruppen die Phosphatbindung ersetzen können und Stickstoff oder Schwefel Sauerstoff in einer Etherbindung ersetzen kann (Schneider et al., Biochem. 34: 9599, 1995; Freier et al., J. Med. Chem. 38: 344, 1995; Frank, J. Biotechnology 41: 259, 1995; Schneider et al., veröffentlichte PCT-WO94/2052: Ecker et al., Nucleic Acids Res. 21: 1853, 1993).
Neuerdings ist die kombinatorische Herstellung von Sammlungen von Verbindungen mit nicht-oligomerem kleinen Molekül beschrieben worden (DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90 : 690, 1993; Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91 : 4708, 1994). Strukturen, die zum Ausarbeiten in Klein-Molekül-Bibliotheken geeignet sind, umfassen eine breite Vielfalt organischer Moleküle, z. B. Heterocyclen, Aromaten, Alicyclen, Aliphaten, Steroiden, Antibiotika, Enzyminhibitoren, Liganden, Hormone, Arzneimittel, Alkaloide, Opioide, Terpene, Porphyrine, Toxine, Katalysatoren sowie Kombinationen davon.

g. Spezifische Verfahren für die kombinatorische Synthese von Markierungen

Zwei Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines unterschiedlichen Satzes von Aminenthaltenden MS-Markierungen sind unten beschrieben. In beiden Verfahren wird Festphasen-Synthese angewendet, um die gleichzeitige parallele Synthese einer großen Anzahl markierter Linker zu ermöglichen, unter Verwendung der Techniken der kombinatorischen Chemie. Beim ersten Verfahren resultiert die gelegentliche Spaltung der Markierung von dem Oligonukleotid in der Freisetzung eines Carboxylamids. Beim zweiten Verfahren produziert die Spaltung der Markierung eine Carbonsäure. Die chemischen Bestandteile und verknüpfenden Elemente, die bei diesen Verfahren verwendet werden, sind wie folgt abgekürzt:
R = Harz
FMOC = Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe
All = Allyl-Schutzgruppe
CO&sub2;H = Carbonsäuregruppe
CONH&sub2; = Carbonsäureamidgruppe
NH&sub2; = Aminogruppe
OH = Hydroxylgruppe
CONH = Amidverknüpfung
COO = Esterverknüpfung
NH&sub2;-Rink-CO&sub2;H = 4-[(α-Amino)-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxybuttersäure (Rink- Linker)
OH-1MeO-CO&sub2;H = (4-Hydroxymethyl)phenoxybuttersäure
OH-&sub2;MeO-CO&sub2;H = (4-Hydroxymethyl-3-methoxy)phenoxyessigsäure
NH&sub2;-A-COOH = Aminosäure mit aliphatischer oder aromatischer Amin- Funktionalität in der Seitenkette
X1....Xn-COOH = Satz von n verschiedenen Carbonsäuren mit einzigartigen Molekulargewichten
oligo1 ... oligo(n) = Satz von n Oligonukleotiden
HBTU = O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'- Tetramethyluroniumhexafluorphosphat
Die Abfolge von Schritten in Verfahren 1 ist wie folgt.

Analysiere mit Massenspektrometrie

2. Linker

Ein "Linker-Bestandteil" (oder L), wie hierin verwendet, bedeutet entweder eine direkte kovalente Bindung oder eine organische chemische Gruppe, die verwendet wird, um eine "Markierung" (oder T) mit einem "interessierenden Molekül" (oder MOI) durch kovalente chemische Bindungen zu verbinden. Zusätzlich ist die direkte Bindung selbst oder eine oder mehrere Bindungen innerhalb des Linker-Bestandteils unter Bedingungen spaltbar, was ermöglicht, daß T von dem Rest der T-L-X-Verbindung (einschließlich des MOI-Bestandteils) freigesetzt (in anderen Worten, abgespalten) wird. Der variable Markierungs-Bestandteil, der, innerhalb von T vorhanden ist, sollte gegenüber den Spaltungsbedingungen stabil sein. Vorzugsweise kann die Spaltung schnell erreicht werden; innerhalb von einigen wenigen Minuten und vorzugsweise innerhalb von ungefähr 15 Sekunden oder weniger.
Im allgemeinen wird ein Linker verwendet, um jede Markierung aus einem großen Satz von Markierungen mit jedem MOI aus einem ähnlich großen Satz von MOIs zu verbinden. Typischerweise wird eine einzelne Markierungs-Linker-Kombination an jedes MOI angehängt (um verschiedene T-L-MOI zu ergeben), aber in einigen Fällen kann mehr als eine Markierungs-Linker-Kombination an jedes individuelle MOI angehängt sein (um verschiedene (T- L)n-MOI zu ergeben). In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwei oder mehrere Markierungen an einen einzelnen Linker über vielfache, unabhängige Stellen an dem Linker gebunden, und diese vielfache Markierungs-Linker-Kombination wird dann an ein individuelles MOI gebunden (um verschiedene (T)n-L-MOI zu ergeben).
Nach verschiedenen Manipulationen des Satzes von markierten MOIs werden spezielle chemische und/oder physikalische Bedingungen verwendet, um eine oder mehrere kovalente Bindungen in dem Linker zu spalten, was zu der Freisetzung der Markierung aus den MOIs führt. Die spaltbare(n) Bindung(en) kann (können), muß (müssen) aber nicht einige derselben Bindungen sein, die gebildet wurden, wenn die Markierung, Linker und MOI zusammen verknüpft wurden. Die Konstruktion des Linkers wird zu einem großen Teil die Bedingungen bestimmen, unter denen Spaltung erreicht werden kann. Entsprechend können die Linker durch die Spaltungsbedingungen identifiziert werden, gegenüber denen sie besonders empfindlich sind. Wenn ein Linker photolabil ist (d. h. zur Spaltung neigt bei Ausgesetztsein gegenüber aktinischer Strahlung), kann dem Linker die Bezeichnung Lhν gegeben werden. Ebenso können die Bezeichnungen LSäure, LBase L[O], L[R], Lenz, Lelc, LΔ und LSS verwendet werden, um Linker zu bezeichnen, die besonders empfindlich sind gegenüber Spaltung durch Säure, Base, chemische Oxidation, chemische Reduktion, der katalytischen Aktivität eines Enzyms (einfacher "Enzym"), elektrochemischer Oxidation oder Reduktion, erhöhter Temperatur ("thermisch"), bzw. Thiolaustausch.
Bestimmte Typen von Linker sind gegenüber einem einzelnen Typ von Spaltungsbedingung labil, während andere gegenüber mehreren Typen von Spaltungsbedingungen labil sind. Zusätzlich kann bei Linkern, die in der Lage sind, vielfache Markierungen zu binden (um Strukturen vom (T)n-L-MOI-Typ zu ergeben), jede der Markierungs-Bindestellen gegenüber verschiedenen Spaltungsbedingungen labil sein. Z. B. kann in einem Linker, der zwei Markierungen an sich gebunden hat, eine der Markierungen labil nur gegenüber Base sein und die andere labil nur gegenüber Photolyse.
Ein Linker, der bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, besitzt mehrere Eigenschaften:
1) Der Linker besitzt einen chemischen Griff (Lh), durch den er an ein MOI angehängt werden kann.
2) Der Linker besitzt einen zweiten, separaten chemischen Griff (Lh), durch den die Markierung an den Linker angehängt ist. Wenn vielfache Markierungen an einen einzelnen Linker angehängt sind (Strukturen vom (T)n-L-MOI-Typ), dann existiert ein separater Griff für jede Markierung.
3) Der Linker ist gegenüber allen Manipulationen stabil, denen er unterworfen ist, mit der Ausnahme der Bedingungen, die eine Spaltung ermöglichen, so daß eine T-enthaltende Einheit von dem Rest der Verbindung, einschließlich des MOIs freigesetzt wird. Damit ist der Linker während Anhängen der Markierung an den Linker, Anhängen des Linkers an das MOI und jedweder Manipulation des MOI, während die Markierung und Linker (T-L) daran angehängt sind, stabil.
4) Der Linker stört nicht signifikant bei den Handhabungen, die an dem MOI durchgeführt werden, während der T-L daran angehängt ist. Z. B. darf, wenn der T-L an ein Oligonukleotid angehängt ist, der T-L Hybridisierungs- oder enzymatische Reaktionen (z. B. PCT), die an dem Oligonukleotid durchgeführt werden, nicht signifikant stören. Auf ähnliche Weise darf, wenn der T-L an einen Antikörper angehängt ist, er die Antigenerkennung durch den Antikörper nicht signifikant stören.
5) Abspaltung der Markierung von dem Rest der Verbindung findet in einer sehr kontrollierten Weise statt, unter Verwendung physikalischer oder chemischer Prozesse, die die Nachweisbarkeit der Markierung nicht nachteilig beeinflussen.
Für jeden gegebenen Linker wird bevorzugt, daß der Linker an eine große Vielfalt an MOIs anhängbar ist, und daß eine große Vielfalt von Markierungen an den Linker anhängbar sind. Solche Flexibilität ist vorteilhaft, da sie ermöglicht, daß eine Bibliothek von T-L-Konjugaten, wenn erst einmal hergestellt, mit mehreren verschiedenen Sätzen von MOIs verwendet werden kann.
Wie oben erklärt, hat ein bevorzugter Linker die Formel
Lh-L¹-L²-L³-Lh
wobei jedes Lh ein reaktiver Griff ist, der verwendet werden kann, um den Linker mit einem Markierungs-Reaktanten und einem Reaktanten "interessierendes Molekül" zu verknüpfen. L² ist ein wesentlicher Teil des Linkers, da L² dem Linker Labilität verleiht. L¹ und L³ sind fakultative Gruppen, die im Effekt dazu dienen, L² von den Griffen Lh zu trennen.
L¹ (das per Definition näher an T ist als L³ dies ist), dient dazu, T von der erforderten labilen Einheit L² zu trennen. Diese Trennung kann nützlich sein, wenn die Spaltungsreaktion besonders reaktive Spezies (z. B. freie Radikale) erzeugt, die Zufallsveränderungen in der Struktur der T-enthaltenden Einheit verursachen können. Da die Spaltungsstelle weiter von der T- enthaltenden Einheit getrennt ist, gibt es eine reduzierte Wahrscheinlichkeit, daß reaktive Spezies, die an der Spaltungsstelle gebildet werden, die Struktur der T-enthaltenden Einheit stören werden. Ebenso können, da die Atome in L¹ typischerweise in der T-enthaltenden Einheit vorhanden sein werden, diese L¹-Atome eine erwünschte Qualität der T-enthaltenden Einheit verleihen. Z. B. kann, wo die T-enthaltende Einheit eine Tms-enthaltende Einheit ist und ein gehindertes Amin wünschenswerterweise als Teil der Struktur der Tms-enthaltenden Einheit vorhanden ist (um z. B. als ein MSSE zu dienen), das gehinderte Amin in der L¹- labilen Einheit vorhanden sein.
In anderen Fällen können L¹ und/oder L³ in einem Linker-Bestandteil vorhanden sein, nur weil der kommerzielle Lieferant eines Linkers es wählt, den Linker in einer Form mit solch einer L¹- und/oder L³-Gruppe zu verkaufen. In solch einem Fall gibt es keinen Schaden beim Verwenden von Linkem mit L¹- und/oder L³-Gruppen, (solange wie diese Gruppen nicht die Spaltungsreaktion inhibieren), sogar obwohl sie den Verbindungen keinen besonderen Leistungsvorteil verleihen, die sie eingebaut haben. Damit ermöglicht die vorliegende Erfindung, daß L¹- und/oder L³-Gruppen in dem Linker-Bestandteil vorhanden sind.
L¹- und/oder L³-Gruppen können eine direkte Bindung sein (in welchem Fall die Gruppe im Effekt nicht vorhanden ist), eine Hydrocarbylengruppe (z. B. Alkylen, Arylen, Cycloalkylen, etc.), -O-Hydrocarbylen (z. B., -O-CH&sub2;-, O-CH&sub2;CH(CH&sub3;)-, etc.) oder Hydrocarbylen-(Ohydrocarbylen)w, wobei w eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 10 ist (z. B. -CH&sub2;- O-Ar-, -CH&sub2;-(O-CH&sub2;CH&sub2;)&sub4;-, etc.).
Mit der Ankunft von Festphasensynthese hat sich ein großes Volumen von Literatur entwickelt hinsichtlich von Linkem, die gegenüber spezifischen Reaktionsbedingungen labil sind.
Bei einer typischen Festphasensynthese wird ein fester Träger durch einen labilen Linker an eine reaktive Stelle gebunden, und ein zu synthetisierendes Molekül wird an der reaktiven Stelle erzeugt. Wenn das Molekül vollständig synthetisiert worden ist, wird das feste Träger- Linker-Molekülkonstrukt Spaltungsbedingungen unterworfen, was das Molekül von dem festen Träger freisetzt. Die labilen Linker, die zur Verwendung in diesem Kontext entwickelt worden sind (oder die in diesem Kontext verwendet werden können), können ebenso leicht als der Linker-Reaktant in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Lloyd-Williams, P., et al., "Convergent Solid-Phase Peptide Synthesis", Tetrahedron Report No. 347, 49(48): 11065-11133 (1993) stellt eine ausgedehnte Diskussion von Linkem bereit, die gegenüber aktinischer Strahlung (d. h. Photolyse) sowie Säure, Base und anderen Spaltungsbedingungen labil sind. Zusätzliche Informationsquellen über labile Linker sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Wie oben beschrieben, werden verschiedene Linkerkonstruktionen Spaltbarkeit ("Labilität") unter verschiedenen spezifischen physikalischen oder chemischen Bedingungen verleihen. Beispiele von Bedingungen, die dazu dienen, verschiedenen Konstruktionen von Linkem abzuspalten, schließen Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Fluorid, Thiolaustausch, Photolyse und enzymatische Bedingungen ein.
Beispiele von spaltbaren Linkem, die die allgemeinen Kriterien für die oben aufgelisteten Linker erfüllen, werden für Fachleute gut bekannt sein und schließen diejenigen ein, welche in dem Katalog gefunden werden, der von Pierce (Rockford, IL) erhältlich ist. Beispiele schließen ein:
- Ethylenglycobis(succinimidylsuccinat) (EGS), ein Amin-reaktives Quervernetzungsreagens, das durch Hydroxylamin spaltbar ist (1 M bei 37ºC für 3-6 Stunden);
- Disuccinimidyltartarat (DST) und sulfo-DST, die Amin-reaktive Quervernetzungsreagentien sind, spaltbar durch 0,015 M Natriumperiodat;
- Bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES) und sulfo-BSOCOES, die Amin-reaktive Quervernetzungsreagentien sind, spaltbar durch Base (pH 11,6);
- 1,4-Di-[3'-(2'-pyldithio(propionamido))butan (DPDPB), ein Pyridyldithiol- Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-[4-(p-Azidosalicylamido)-butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid (APDP), ein Pyridyldithiol-Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Bis-[beta-4-(azidosalicylamido)ethyl]-disulfid, ein photoreaktiver Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'dithiopropionat (SADP), ein photoreaktiver Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcumann-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAED), ein photoreaktiver Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'dithiopropionat (SAND), ein photoreaktiver Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist. Andere Beispiele spaltbarer Linker und die Spaltungsbedingungen, die verwendet werden können, um Markierungen freizusetzen, sind wie folgt. Eine Silyl-Verknüpfungsgruppe kann durch Fluorid oder unter sauren Bedingungen gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6- substituierte-2-Nitrobenzyloxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4-Nitrobenzyloxy- Verknüpfungsgruppe kann durch eine Photonenquelle gespalten werden (Photolyse). Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte-2-Alkoxyphenoxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte-4- Alkoxyphenoxy-Verknüpfungsgruppe kann durch Ce(NH&sub4;)&sub2;(NO&sub3;)&sub6; (Oxidation) gespalten werden. Ein NCO&sub2; (Urethan)-Linker kann durch Hydroxyd (Base), Säure oder LiAlH&sub4; (Reduktion) gespalten werden. Eine 3-Pentenyl, 2-Butenyl, oder 1-Butenyl-Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub3;, OSO&sub4;/IO&sub4;&supmin; oder KMnO&sub4;(Oxidation) gespalten werden. Eine 2-[3-, 4- oder 5- substituierte-Furyl]oxy-Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub2;, Br&sub2;, MeOH oder Säure gespalten werden.
Bedingungen zur Spaltung anderer labiler Verknüpfungsgruppen schließen ein: tert-Alkyloxy- Verknüpfungsgruppen können durch Säure gespalten werden; Methyl(dialkyl)methoxy- oder 4-substituierte-2-Alkyl-1,3-dioxan-2-yl-Verknüpfungsgruppen können durch H30+ gespalten werden; 2-Silylethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Fluorid oder Säure gespalten werden; 2-(X)-Ethoxy (wobei X=Keto, Esteramid, Cyano, NO&sub2;, Sulfid, Sulfoxid, Sulfon)- Verknüpfungsgruppen können unter alkalischen Bedingungen gespalten werden; 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte Benzyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure oder unter reduzierenden Bedingungen gespalten werden; 2-Butenyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch (Ph&sub3;P)&sub3;RhCl(H) gespalten werden; 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte-2-Bromphenoxy- Verknüpfungsgruppen können durch L¹, Mg oder BuLi gespalten werden; Methylthiomethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Hg&sub2;&spplus; gespalten werden; 2-(X)-Ethyloxy- (wobei X = ein Halogen) -Verknüpfungsgruppen können durch Zn oder Mg gespalten werden; 2- Hydroxyethyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Oxidation (z. B. mit Pb(OAc)&sub4;) gespalten werden.
Bevorzugte Linker sind die, die durch Säure oder Photolyse gespalten werden. Mehrere der säurelabilen Linker, die für die Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden sind, sind zum Verknüpfen von Markierungen mit MOIs nützlich. Einige dieser Linker werden in einem kürzlich erschienenen Überblick von Lloyd-Williams et al. (Tetrahedron 49 : 11065-11133, 1993) beschrieben. Ein nützlicher Typ Linker beruht auf Alkoxybenzylalkoholen, von denen zwei 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure und 4-(4-Hydroxymethyl-3 - methoxyphenoxy)buttersäure, kommerziell von Advanced ChemTech (Louisville, KY) erhältlich sind. Beide Linker können an einer Markierung über eine Esterverknüpfung zu dem Benzylalkohol angehängt werden und an ein Amin-enthaltendes MOI über eine Amidverknüpfung zu der Carbonsäure. Markierungen, die durch diese Moleküle verknüpft sind, werden aus dem MOI mit variierenden Konzentrationen von Trifluoressigsäure freigesetzt. Die Spaltung dieser Linker resultiert in der Freisetzung einer Carbonsäure an der Markierung. Säurespaltung der Markierungen, die durch verwandte Linker angehängt sind, wie etwa 2,4- Dimethoxy-4'-(carboxymethyloxy)-benzhydrylamin (erhältlich von Advanced ChemTech in einer FMOC-geschützten Form), resultiert in der Freisetzung eines Carbonsäureamids an der freigesetzten Markierung.
Die photolabilen Linker, die für diese Anwendung nützlich sind, sind ebenso zum größten Teil für Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden (siehe Übersicht von Lloyd-Williams). Diese Linker beruhen gewöhnlich auf 2-Nitrobenzylestern oder 2-Nitrobenzylamiden. Zwei Beispiele photolabiler Linker, über die vor kurzem in der Literatur berichtet worden ist, sind 4-(4-(1-Fmoc-amino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (Holmes und Jones, JJ Org. Chem. 60: 2318-2319, 1995) und 3-(Fmoc-amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al., Molecular Diversity 1: 4-12, 1995). Beide Linker können über die Carbonsäure an ein Amin an dem MOI angehängt sein. Das Anhängen der Markierung an den Linker wird erreicht durch Bilden eines Amids zwischen einer Carbonsäure auf der Markierung und dem Amin auf dem Linker. Spaltung von photolabilen Linkem wird gewöhnlich durchgeführt mit UV-Licht bei einer Wellenlänge von 350 nm bei Intensitäten und Zeiten, die Fachleuten bekannt sind. Spaltung der Linker resultiert in der Freisetzung eines primären Amids auf der Markierung. Beispiele von photospaltbaren Linkem schließen Nitrophenylglycinester, exo- und endo-2-Benzonorborneylchloride und Methansulfonate und 3-Amino-3(2- nitrophenyl)propionsäure ein. Beispiele enzymatischer Spaltung schließen Esterasen, die Esterbindungen spalten werden, Nukleasen, die Phosphodiesterbindungen spalten werden, Proteasen, die Peptidbindungen spalten, etc. ein.
Ein bevorzugter Linker-Bestandteil hat eine ortho-Nitrobenzylstruktur wie unten gezeigt:
wobei ein Kohlenstoffatom an Positionen a, b, c, d, oder e mit -L³-X substituiert ist und L¹ (das vorzugsweise eine direkte Bindung ist) zur Linken von N(R¹) in der obigen Struktur vorliegt. Ein solcher Linker-Bestandteil ist gegenüber selektiver, photoinduzierter Spaltung der Bindung zwischen dem Kohlenstoff, markiert "a", und N(R¹) empfindlich. Die Identität von R¹ ist nicht typischerweise wesentlich für die Spaltungsreaktion, jedoch wird R¹ vorzugsweise ausgewählt aus Wasserstoff und Hydrocarbyl. Die vorliegende Erfindung sorgt dafür, daß in der obigen Struktur -N(R¹)- durch -O- ersetzt werden könnte. Ebenso können in der obigen Struktur eine oder mehrere der Positionen b, c, d oder e fakultativ mit Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert sein, wobei diese Substituenten bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt werden.
Ein weiter bevorzugter Linker-Bestandteil mit einem chemischen Griff Lh hat die folgende Struktur:
wobei eine oder mehrere der Positionen b, c, d oder e mit Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert ist, R¹ Wasserstoff oder Hydrocarbyl ist und R² oder eine Gruppe ist, die eine Carbonsäure zum Koppeln mit einer anderen Einheit entweder schützt oder aktiviert. Fluorkohlenstoff und Fluorkohlenwasserstoffgruppen sind bevorzugte Gruppen, die eine Carbonsäure zum Koppeln mit einer anderen Einheit aktivieren.

3. Interessierendes Molekül (MOI)

Beispiele von MOIs schließen Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloge (z. B. PNA), Fragmente von Nukleinsäuren (d. h. Nukleinsäurefragmente), synthetische Nukleinsäuren oder Fragmente, Oligonukleotide (z. B. DNA oder RNA), Proteine, Peptide, Antikörper oder Antikörperfragmente, Rezeptoren, Rezeptorliganden, Mitglieder eines Ligandenpaars, Cytokine, Hormone, Oligosaccharide, synthetische organische Moleküle, Arzneimittel und Kombinationen davon ein.
Bevorzugte MOIs schließen Nukleinsäurefragmente ein. Bevorzugte Nukleinsäurefragmente sind Primersequenzen, die zu in Vektor vorliegenden Sequenzen komplementär sind, wobei die Vektoren zum Basensequenzieren verwendet werden. Bevorzugt ist ein Nukleinsäurefragment direkt oder indirekt an einer Markierung an einem anderen als dem 3' -Ende des Fragments angehängt; und am bevorzugtesten am 5'-Ende des Fragments. Nukleinsäurefragmente können gekauft oder auf der Grundlage von genetischen Datenbanken hergestellt werden (z. B. Dib et al., Nature 380: 152-154, 1996 und CEPH Genotype Database, http://www.cephb.fr) und kommerziellen Verkäufern (z. B. Promega, Madison, WI).
Wie hierin verwendet, schließt MOI Derivate eines MOI ein, die eine Funktionalität enthalten, die beim Verknüpfen des MOIs an eine T-L-Lh-Verbindung nützlich ist. Z. B. ist ein Nukleinsäurefragment, das einen Phosphodiester am 5 '-Ende hat, wobei der Phosphodiester auch an ein Alkylenamin gebunden ist, ein MOL. Ein solches MOI wird z. B. in US-Patent 4,762,779 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme miteinbezogen wird. Ein Nukleinsäurefragment mit einer internen Modifizierung ist ebenso ein MOI. Eine beispielhafte interne Modifizierung eines Nukleinsäurefragments ist, wenn die Base (z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin, Uracil) modifiziert worden ist, um eine reaktive funktionelle Gruppe zuzufügen. Solche intern modifizierten Nukleinsäurefragmente sind kommerziell erhältlich z. B. von Glen Research, Herndon, VA. Eine andere beispielhafte interne Modifizierung eines Nukleinsäurefragments ist, wenn ein abasisches Phosphoramidat verwendet wird, um einen modifizierten Phosphodiester zu synthetisieren, der zwischen einer Zucker- und einer Phosphatgruppe eines Nukleinsäurefragments angeordnet ist. Das abasische Phosphoramidat enthält eine reaktive Gruppe, die ermöglicht, daß ein Nukleinsäurefragment, das diese Phosphoramidat-abgeleitete Einheit enthält, mit einer anderen Einheit verbunden wird, z. B. einer T-L-Lh-Verbindung. Solche abasischen Phosphoramidate sind kommerziell von z. B. Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA erhältlich.

4. Chemische Griffe (Lh)

Ein chemischer Griff ist eine stabile, jedoch reaktive Atomanordnung, die als Teil eines ersten Moleküls vorliegt, wobei der Griff eine chemische Reaktion mit einem komplementären chemischen Griff eingehen kann, der als Teil eines zweiten Moleküls vorliegt, um eine kovalente Bindung zwischen den beiden Molekülen zu bilden. Z. B. kann der chemische Griff eine Hydroxylgruppe sein und der komplementäre chemische Griff kann eine Carbonsäuregruppe (oder ein aktiviertes Derivat davon, z. B. ein Hydrofluorarylester) sein, wonach die Reaktion zwischen diesen beiden Griffen eine kovalente Bindung bildet (spezifisch eine Estergruppe), die die beiden Moleküle miteinander verbindet.
Chemische Griffe können verwendet werden in einer großen Anzahl kovalenter bindungsbildender Reaktionen, die zum Anhängen von Markierungen an Linker und von Linkern an MOIs geeignet sind. Solche Reaktionen schließen Alkylierung (z. B. um Ether, Thioether zu bilden), Acylierung (z. B. um Ester, Amide, Carbamate, Harnstoffe, Thioharnstoffe zu bilden), Phosphorylierung (z. B. um Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide zu bilden), Sulfonylierung (z. B. um Sulfonate, Sulfonamide zu bilden), Kondensation (z. B. um Imine, Oxime, Hydrazone zu bilden), Silylierung, Disulfidbildung und Erzeugung von reaktiven Intermediaten, wie etwa Nitrenen oder Carbenen, durch Photolyse ein. Im allgemeinen sind Griffe und bindungsbildende Reaktionen, die sich zum Anhängen von Markierungen an Linker eignen, ebenso geeignet zum Anhängen von Linkem an MOIs und umgekehrt. In einigen Fällen kann das MOI vorher Modifizierung oder Derivatisierung eingehen, um den Griff bereitzustellen, der zum Anhängen des Linkers benötigt wird.
Ein Typ von Bindung, der zum Anhängen von Linkem an MOIs besonders nützlich ist, ist die Disulfidbildung. Ihre Bildung erfordert das Vorhandensein einer Thiolgruppe ("Griff") an dem Linker und eine andere Thiolgruppe an dem MOI. Milde oxidierende Bedingungen reichen dann aus, um die zwei Thiole miteinander als ein Disulfid zu verbinden. Disulfidbildung kann ebenso durch Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Disulfid- Austauschreagens induziert werden, z. B. Pyridyldisulfide. Weil Disulfidbildung leicht umkehrbar ist, kann das Disulfid ebenso als die spaltbare Bindung zum Freisetzen der Markierung verwendet werden, wenn erwünscht. Dies wird typischerweise unter ähnlich milden Bedingungen erreicht, unter Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Thiolaustausch- Reagens, z. B. Dithiothreitol.
Von besonderem Interesse für die Bindung von Markierungen (oder Markierungen mit Linkem) an Oligonukleotide ist die Bildung von Amidbindungen. Primäre aliphatische Amingriffe können leicht an synthetischen Oligonukleotiden mit Phosphoramiditen, wie etwa 6- Monomethoxytritylhexylcyanoethyl-N-N-diisopropylphosphoramidit (erhältlich von Glenn Research, Sterling, VA), eingeführt werden. Die an natürlichen Nukleotiden gefundenen Amine, wie etwa Adenosin und Guanosin, sind praktisch nicht reaktiv, im. Vergleich mit dem eingeführten primären Amin. Dieser Unterschied in der Reaktivität bildet die Grundlage der Fähigkeit, selektiv Amide oder verwandte Bindungsgruppen (z. B. Harnstoffe, Thioharnstoffe, Sulfonamide) mit dem eingeführten primären Amin und nicht den Nukleotidaminen zu bilden.
Wie in dem Katalog von Molecular Probes (Eugene, OR) aufgelistet, schließt eine partielle Aufzählung amin-reaktiver funktioneller Gruppen aktivierte Carbonsäureester, Isocyanate, Isothiocyanate, Sulfonylhalogenide und Dichlortriazene ein. Aktive Ester sind hervorragende Reagentien zur Amin-Modifizierung, da die gebildeten Amidprodukte sehr stabil sind. Ebenso haben diese Reagentien gute Reaktivität mit aliphatischen Aminen und geringe Reaktivität mit den Nukleotidaminen von Oligonukleotiden. Beispiele von aktiven Estern schließen N- Hydroxysuccinimidester, Pentafluorphenylester, Tetrafluorphenylester und p- Nitrophenylester ein. Aktive Ester sind nützlich, da sie aus praktisch jedem Molekül gemacht werden können, das eine Carbonsäure enthält. Verfahren, um aktive Ester zu machen, sind in Bodansky aufgelistet (Principles of Peptide Chemistry (2d ed.), Springer Verlag, London, 1993).

5. Linkerbindung

Typischerweise wird ein einziger Typ von Linker verwendet, um einen besonderen Satz oder Familie von Markierungen an einen besonderen Satz oder Familie von MOIs zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann eine einzelne uniforme Prozedur befolgt werden, um alle die verschiedenen T-L-MOI-Strukturen zu erzeugen. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn der Satz von T-L-MOI-Strukturen groß ist, da er ermöglicht, daß der Satz unter Verwendung der Verfahren der kombinatorischer Chemie oder anderer paralleler Verarbeitungstechnologie hergestellt wird. Auf eine ähnliche Weise erlaubt die Verwendung eines einzelnen Typs von Linker, daß eine einzelne uniforme Prozedur zum Spalten all der verschiedenen T-L-MOI-Strukturen angewendet wird. Wiederum ist dies vorteilhaft für einen großen Satz von T-L-MOI-Strukturen, da der Satz auf eine parallele, wiederholte und/oder automatisierte Weise verarbeitet werden kann.
Es gibt jedoch eine andere Ausführungform der vorliegenden Erfindung, bei der zwei oder mehrere Typen Linker verwendet werden, um verschiedene Teilsätze von Markierungen an die entsprechenden Teilsätze von MOIs zu binden. In diesem Fall können selektive Spaltungsbedingungen verwendet werden, um jeden der Linker unabhängig zu spalten, ohne die auf anderen Teilsätzen von MOIs vorhandenen Linker zu spalten.
Eine große Zahl an kovalente Bindung-bildender Reaktionen sind zum Anhängen von Markierungen an Linker und von Linkem an MOIs geeignet. Solche Reaktionen schließen Alkylierung (z. B. um Ether, Thioether zu bilden), Acylierung (z. B. um Ester, Amide, Carbamate, Harnstoffe, Thioharnstoffe zu bilden), Phosphorylierung (z. B. um Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide zu bilden), Sulfonylierung (z. B. um Sulfonate, Sulfonamide zu bilden), Kondensation (z. B. um Imine, Oxime, Hydrazone zu bilden), Silylierung, Disulfidbildung und die Erzeugung von reaktiven Intermediaten, wie etwa Nitrene oder Carbene, durch Photolyse ein. Im allgemeinen sind Griffe und bindungsbildende Reaktionen, die sich zum Anhängen von Markierungen an Linker eignen, ebenso geeignet zum Anhängen von Linkem an MOIs und umgekehrt. In einigen Fällen kann das MOI vorher Modifizierung oder Derivatisierung eingehen, um den Griff bereitzustellen, der zum Anhängen des Linkers benötigt wird.
Ein Typ von Bindung, der zum Anhängen von Linkem an MOIs besonders nützlich ist, ist die Disulfidbindung. Ihre Bildung erfordert das Vorhandensein einer Thiolgruppe ("Griff") an dem Linker und eine andere Thiolgruppe an dem MOI. Milde oxidierende Bedingungen genügen dann, um die beiden Thiole miteinander als ein Disulfid zu verbinden. Disulfidbildung kann ebenso durch Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Disulfidaustauschreagens, z. B. Pyridyldisulfide, induziert werden. Weil Disulfidbildung leicht umkehrbar ist, kann das Disulfid ebenso als die spaltbare Bindung zum Freisetzen der Markierung verwendet werden, wenn erwünscht. Dies wird typischerweise unter ähnlich milden Bedingungen erreicht, unter Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Thiolaustauschreagens, z. B. Dithiothreitol.
Von besonderem Interesse zum Binden von Markierungen an Oligonukleotide ist die Bildung von Amidbindungen. Primäre aliphatische Amingriffe können auf leichte Weise an synthetische Oligonukleotide mit Phosphoramiditen (wie etwa 6-Monomethoxytritylhexylcyanoethyl- N,N-diisoproylphosphoramidit (erhältlich von Glenn Research, Sterlin, VA) eingeführt werden. Die an natürlichen Nukleotiden, wie etwa Adenosin und Guanosin, gefundenen Amine sind praktisch nicht reaktiv im Vergleich zu dem eingeführten primären Amin. Dieser Unterschied hinsichtlich der Reaktivität bildet die Grundlage der Fähigkeit, selektiv Amide und verwandte Bindungsgruppen (z. B. Harnstoffe, Thioharnstoffe, Sulfonamide) mit dem eingeführten primären Amin und nicht den Nukleotidaminen zu bilden.
Wie in dem Katalog von Molecular Probes (Eugene, OR) aufgelistet, schließt eine teilweise Aufzählung von Amin-reaktiven funktionellen Gruppen aktivierte Carbonsäureester, Isocyanate, Isothiocyanate, Sulfonylhalogenide und Dichlortriazene ein. Aktive Ester sind hervorragende Reagentien zur Aminmodifizierung, da die gebildeten Amidprodukte sehr stabil sind. Ebenso haben diese Reagentien gute Reaktivität mit aliphatischen Aminen und geringe Reaktivität mit den Nukleotidaminen von Oligonukleotiden. Beispiele aktiver Ester schließen N- hydroxysuccinimidester, Pentafluorphenylester, Tetrafluorphenylester und p-Nitrophenylester ein. Aktive Ester sind nützlich, weil sie von praktisch jedem Molekül gemacht werden kön nen, das eine Carbonsäure enthält. Verfahren, um aktive Ester zu machen, sind bei Bodansky (Principles of Peptide Chemistry (2d ed.), Springer Verlag, London, 1993) aufgelistet.
Zahlreiche kommerzielle quervernetzende Reagentien existieren, die als Linker dienen können (z. B. siehe Pierce Cross-linkers, Pierce Chemical Co., Rockford, 1L). Unter diesen sind homobifunktionelle Amin-reaktive quervernetzende Reagentien, die durch homobifunktionelle Imidoester und N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)-Ester beispielhaft veranschaulicht werden. Es existieren ebenso heterobifunktionelle quervernetzende Reagentien, die zwei oder mehr verschiedene reaktive Gruppen besitzen, die sequenzielle Reaktionen ermöglichen. Imidoester reagieren schnell mit Aminen bei alkalischem pH. NHS-Ester ergeben stabile Produkte, wenn sie mit primären oder sekundären Aminen umgesetzt werden. Maleimide, Alkyl- und Aryl-Halogenide, alpha-Halogenacyle und Pyridyldisulfide sind Thiol-reaktiv. Maleimide sind spezifisch für Thiol(Sulfhydryl)-Gruppen im pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 und können bei alkalischem pH Amin-reaktiv werden. Die Thioether-Verknüpfung ist stabil unter physiologischen Bedingungen. Alpha-Halogenacetyl-quervernetzende Reagentien enthalten die Iodacetylgruppe und sind gegenüber Sulfhydrylen reaktiv. Imidazole können mit der Iodacetyl- Einheit reagieren, aber die Reaktion ist sehr langsam. Pyridyldisulfide reagieren mit Thiolgruppen, um eine Disulfidbindung zu bilden. Carbodümide koppeln Carboxyle an primäre Amine von Hydraziden, was zur Bildung einer Acyl-Hydrazinbindung führt. Die Arylazide sind Photoaffinitätsreagentien, die chemisch inert sind, bis sie UV- oder sichtbarem Licht ausgesetzt werden. Wenn solche Verbindungen bei 250-460 nm photolysiert werden, wird ein reaktives Arylnitren gebildet. Das reaktive Arylnitren ist relativ unspezifisch. Glyoxale sind gegenüber dem Guanidinylteil von Arginin reaktiv.
In einer typischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Markierung zunächst an einen Linker gebunden, dann wird die Kombination aus Markierung und Linker an ein MOI gebunden, um die Struktur T-L-MOI zu erzeugen. Alternativ wird dieselbe Struktur gebildet, indem zuerst ein Linker an ein MOI gebunden und dann die Kombination aus Linker und MOI an eine Markierung gebunden wird. Ein Beispiel ist, wenn das MOI ein DNA- Primer oder -Oligonukleotid ist. In diesem Fall wird die Markierung typischerweise zuerst an einen Linker gebunden, dann wird das T-L an einen DNA-Primer oder ein -Oligonukleotid gebunden, der dann z. B. in einer Sequenzierreaktion verwendet wird.
Eine nützliche Form, bei der eine Markierung reversibel an ein MOI angehängt werden könnte (z. B. ein Oligonukleotid oder DNA-Sequenzierprimer), ist durch einen chemisch labilen Linker. Eine bevorzugte Konstruktion für den Linker ermöglicht es, daß der Linker gespalten wird, wenn er einer flüchtigen organischen Säure, z. B. Trifluoressigsäure (TFA) ausgesetzt wird. Insbesondere TFA ist mit den meisten Verfahren der MS-Ionisation, einschließlich Elektrospray, kompatibel.
Wie im einzelnen unten beschrieben, stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls bereit. Eine Zusammensetzung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gebildet werden kann, umfaßt eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel:
Tms-L-MOI
wobei Tms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist. Tms enthält Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und kann fakultative Atome, einschließlich Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod enthalten. In der Formel ist L eine organische Gruppe, welche ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung bei Aussetzen der Verbindung gegenüber Spaltungsbedingungen gespalten wird. Die gespaltene Tms-enthaltende Einheit schließt eine funktionelle Gruppe ein, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn jede der Mehrzahl der Verbindungen Massenspektrometrie unterworfen wird. Die funktionelle Gruppe kann ein tertiäres Amin, quartäres Amin oder eine organische Säure sein. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, das an L über das 5'-Ende des MOI konjugiert ist. Der Begriff "konjugiert" bedeutet, daß es chemische Gruppen zwischen L und dem MOI geben kann, z. B. eine Phosphodiestergruppe und/oder eine Alkylengruppe. Das Nukleinsäurefragment kann eine zu einem Teil eines Vektors komplementäre Sequenz haben, wobei das Fragment in der Lage ist, Nukleotidsynthese auszulösen.
In der Zusammensetzung haben keine zwei Verbindungen entweder dasselbe Tms oder dasselbe MOI. In anderen Worten schließt die Zusammensetzung eine Mehrzahl von Verbindungen ein, wobei jede Verbindung sowohl ein einzigartiges Tms als auch ein einzigartiges Nukleinsäurefragment hat (einzigartig darin, daß es eine einzigartige Basensequenz hat). Zusätzlich kann die Zusammensetzung so beschrieben werden, daß sie eine Mehrzahl von Verbindungen hat, wobei jede Verbindung so definiert ist, daß sie ein einzigartiges Tms hat, wobei das Tms darin einzigartig ist, daß keine andere Verbindung ein Tms hat, das dasselbe Signal durch Massenspektrometrie bereitstellt. Die Zusammensetzung enthält deshalb eine Mehrzahl an Verbindungen, von denen jede ein Tms mit einer einzigartigen Masse hat. Die Zusammensetzung kann auch so beschrieben werden, daß sie eine Mehrzahl von Verbindungen hat, wobei jede Verbindung so definiert ist, daß sie eine einzigartige Nukleinsäuresequenz hat. Diese Nukleinsäuresequenzen sind absichtlich einzigartig, so daß jede Verbindung als ein Primer für nur einen Vektor dienen wird, wenn die Zusammensetzung mit Vektoren zum Nukleinsäuresequenzieren kombiniert wird. Der Satz von Verbindungen, der einzigartige Tms-Gruppen hat, ist derselbe Satz an Verbindungen, der einzigartige Nukleinsäuresequenzen hat.
Vorzugsweise sind die Tms-Gruppen darin einzigartig, daß es wenigstens eine 2 amu-, bevorzugter wenigstens eine 3 amu- und noch bevorzugter wenigstens eine 4 amu-Massentrennung zwischen den Tms-Gruppen von zwei beliebigen verschiedenen Verbindungen gibt. Bei der Zusammensetzung gibt es wenigstens 2 verschiedene Verbindungen, bevorzugt gibt es mehr als 2 verschiedene Verbindungen und bevorzugter gibt es mehr als 4 verschiedene Verbindungen. Die Zusammensetzung kann 100 oder mehr verschiedene Verbindungen enthalten, wobei jede Verbindung ein einzigartiges Tms und eine einzigartige Nukleinsäuresequenz hat.
Eine andere Zusammensetzung, die z. B. beim Bestimmen der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls nützlich ist, schließt Wasser und eine Verbindung der Formel Tms-L-MOI ein, wobei Tms eine organische Gruppe ist, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist. Tms enthält Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und kann fakultative Atome enthalten, einschließlich Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung bei Aussetzen der Verbindung gegenüber Spaltungsbedingungen abgespalten wird.
Die abgespaltene Tms-enthaltende Einheit schließt eine funktionelle Gruppe ein, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn jede der Mehrzahl an Verbindungen Massenspektrometrie unterworfen wird. Die funktionelle Gruppe kann ein tertiäres Amin, quartäres Amin oder eine organische Säure sein. Bei der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, das an seinem 5'-Ende angehängt ist.
Zusätzlich zu Wasser kann diese Zusammensetzung einen Puffer enthalten, um den pH der wässrigen Zusammensetzung innerhalb des Bereichs von ungefähr 5 bis ungefähr 9 aufrecht zuerhalten. Weiterhin kann die Zusammensetzung ein Enzym, Salze (wie etwa MgCl&sub2; und NaCl) und eines von dATP, dGTP, dCTP und δTTP enthalten. Eine bevorzugte Zusammensetzung enthält Wasser, Tms-L-MOI und eines (und nur eines) von ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP. Eine solche Zusammensetzung ist zur Verwendung bei dem Didesoxy- Sequenzierverfahren geeignet.
Die Erfindung stellt ebenso eine Zusammensetzung bereit, die eine Mehrzahl von Sätzen von Verbindungen enthält, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel hat:
Tms-L-MOI
wobei
Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod. L ist eine organische Gruppe, die ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten wird, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ist ausgewählt aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. Das MOI ist ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an dem 5'-Ende des MOI konjugiert ist.
Innerhalb eines Satzes haben alle Mitglieder dieselbe Tms-Gruppe, und die MOI-Fragmente haben variable Längen, die in demselben Didesoxynukleotid, ausgewählt aus ddAMP, ddGMP, ddCMP und ddTMP, terminieren; und unter den Sätzen unterscheiden sich die Tms- Gruppen um wenigstens 2 amu, bevorzugt um wenigstens 3 amu. Die Mehrzahl an Sätzen ist bevorzugt wenigstens 5 und kann 100 oder mehr zählen.
In einer bevorzugten Zusammensetzung, die eine erste Mehrzahl an Sätzen, wie oben beschrieben, umfaßt, ist zusätzlich eine zweite Mehrzahl an Sätzen von Verbindungen vorhanden mit der Formel
Tms-L-MOI
wobei Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare, organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod. L ist eine organische Gruppe, die ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten wird, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ist ausgewählt aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. MOI ist ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an dem 5'-Ende des MOI konjugiert ist. Alle Mitglieder innerhalb der zweiten Mehrzahl haben eine MOI-Sequenz, die mit demselben Didesoxynukleotid terminiert, das ausgewählt ist aus ddAMP, ddGMP, ddCMP und ddTMP; unter der Bedingung, daß das bei den Verbindungen der ersten Mehrzahl vorhandene Didesoxynukleotid nicht dasselbe Didesoxynukleotid ist, das bei den Verbindungen der zweiten Mehrzahl vorhanden ist.
Die Erfindung stellt ebenso einen Kit zur DNA-Sequenzanalyse bereit. Das Kit umfaßt eine Mehrzahl an Behälter-Sätzen, wobei jeder Behälter-Satz wenigstens fünf Behälter einschließt. Der erste Behälter enthält einen Vektor. Der zweite, dritte, vierte und fünfte Behälter enthält Verbindungen der Formel:
Tms-L-MOI
wobei Tms eine organische, durch Massenspektrometrie nachweisbare Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod. L ist eine organische Gruppe, die ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit von dem Rest der Verbindung abgespalten wird, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ist ausgewählt aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. MOI ist ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an dem 5'-Ende des MOI konjugiert ist. Das MOI für den zweiten, dritten, vierten und fünften Behälter ist identisch und zu einem Teil des Vektors innerhalb des Satzes von Behältern komplementär, und die Tms- Gruppe innerhalb jedes Behälters ist von den anderen Tms-Gruppen in dem Kit verschieden.
Vorzugsweise ist innerhalb des Kits die Mehrzahl wenigstens 3, d. h. es sind wenigstens drei Sätze von Behältern. Bevorzugter gibt es wenigstens 5 Sätze von Behältern.
Wie oben bemerkt, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von Nukleinsäuremolekülen bereit. Kurz gesagt, umfassen solche Verfahren im allgemeinen die Schritte: (a) Erzeugen von markierten Nukleinsäurefragmenten, die zu einem ausgewählten Nukleinsäuremolekül (z. B. markierten Fragmenten) von einem ersten Terminus zu einem zweiten Terminus eines Nukleinsäuremoleküls komplementär sind, wobei eine Markierung mit einem besonderen oder ausgewählten Nukleotid korrelativ ist und durch irgendeines einer Vielfalt von Verfahren nachgewiesen werden kann, (b) Auftrennen der markierten Fragmente nach sequenzieller Länge, (c) Abspalten einer Markierung von einem markierten Fragment und (d) Nachweisen der Markierungen und dadurch Bestimmen der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls. Jeder der Gesichtspunkte wird unten in größerem Detail diskutiert werden.

B. SEQUENZIERVERFAHREN UND -STRATEGIEN

Wie oben bemerkt, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls bereit. Kurz gesagt, werden markierte Nukleinsäurefragmente hergestellt. Die Nukleinsäurefragmente sind zu einem ausgewählten Target- Nukleinsäuremolekül komplementär. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäurefragmente von einem ersten Terminus zu einem zweiten Terminus eines Nukleinsäuremoleküls hergestellt, und bevorzugter von einem 5'-Terminus zu einem 3'-Terminus. In anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die markierten Fragmente von 5'- markierten Oligonukleotidprimern oder markierten Didesoxynukleotidterminatoren erzeugt. Eine Markierung eines markierten Nukleinsäurefragments ist mit einem bestimmten Nukleotid korrelativ und ist durch Spektrometrie nachweisbar (einschließlich Fluoreszenz, aber bevorzugt eine andere als Fluoreszenz), oder durch Potentiometrie. In einer bevorzugten Ausführungsform werden wenigstens fünf markierte Nukleinsäurefragmente erzeugt, und jede Markierung ist für ein Nukleinsäurefragment einzigartig. Genauer gesagt, wird die Zahl von markierten Fragmenten im allgemeinen von ungefähr 5 bis 2000 reichen. Die markierten Nukleinsäurefragmente können aus einer Vielfalt von Verbindungen erzeugt werden, einschließlich derjenigen, die oben dargestellt sind. Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf nur die Verwendung der hierin beschriebenen repräsentativen Verbindungen und Zusammensetzungen beschränkt sind.
Nachfolgend zu der Erzeugung von markierten Nukleinsäurefragmenten werden die markierten Fragmente nach sequenzieller Länge aufgetrennt. Eine solche Auftrennung kann mit einer Vielfalt von Techniken durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Auftrennung durch Flüssigchromatographie (LC) durchgeführt, und besonders bevorzugt ist HPLC. Als nächstes wird die Markierung von dem markierten Fragment abgespalten. Das besondere Verfahren zum Brechen einer Bindung, um die Markierung freizusetzen, wird ausgewählt auf der Grundlage des besonderen Typs von Empfindlichkeit der Bindung gegenüber Spaltung. Z. B. wird eine lichtempfindliche Bindung (d. h. eine, die durch Licht bricht) gegenüber Licht ausgesetzt werden. Die freigesetzte Markierung wird durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen. Bevorzugte Nachweismittel sind Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Ultraviolettspektrometrie und potentiostatische Amperometrie (z. B. mit einem amperometrischen Detektor oder coulometrischen Detektor).
Es wird von einem Fachmann erkannt werden, daß einer oder mehrere der Schritte automatisiert sein können, z. B. durch Verwendung eines Instruments. Zusätzlich können die Trennungs-, Spaltungs- und Nachweisschritte auf eine kontinuierliche Weise durchgeführt werden (z. B. kontinuierlicher Flußkontinuierlicher flüssiger Durchgang der markierten Fragmente durch Auftrennung bis Spaltung bis Markierungsnachweis). Zum Beispiel können die verschiedenen Schritte in ein System eingebaut sein, so daß die Schritte auf eine kontinuierliche Weise durchgeführt werden. Ein solches System ist typischerweise im Instrumenten- oder Kombination von-Instrumenten-Format. Zum Beispiel können markierte Nukleinsäurefragmente, die aufgetrennt werden (z. B. durch HPLC) in eine Vorrichtung zur Spaltung fließen (z. B. einen Photoreaktor) und dann in einen Markierungsdetektor (z. B. einen Massenspektrometer oder coulometrischen oder amperometrischen Detektor). Vorzugsweise ist die Vorrichtung zur Spaltung regulierbar, so daß eine optimale Wellenlänge für die Spaltungsreaktion ausgewählt werden kann.
Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Nukleinsäuresequenzierung für eine Vielfalt von Zwecken durchgeführt werden können. Zum Beispiel schließt eine solche Verwendung der vorliegenden Verfahren Primärsequenzbestimmung für virale, bakterielle, prokaryotische und eukaryotische (z. B. Säugetier-) Nukleinsäuremoleküle ein; Mutationsnachweis; Diagnostik, Forensik; Identität und Nachweis von Polymorphismus.

1. Sequenzierverfahren

Wie oben bemerkt, können Verbindungen, einschließlich der der vorliegenden Erfindung, für eine Vielfalt von Sequenzierverfahren verwendet werden, einschließlich sowohl enzymatischer als auch Verfahren mit chemischem Abbau. Kurz gesagt, beinhaltet das von Sanger beschriebene enzymatische Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74: 5463, 1977), das Didesoxyterminatoren verwendet, die Synthese eines DNA-Stranges von einer einzelsträngigen Matrize durch eine DNA-Polymerase. Das Sanger-Verfahren zum Sequenzieren hängt von der Tatsache ab, daß Didesoxynukleotide (ddNTPs) in den wachsenden Strang auf die selbe Weise eingebaut werden wie normale Desoxynukleotide (jedoch in einer niedrigeren Effizienz). Jedoch unterscheiden sich ddNTPs von normalen Desoxynukleotiden (dNTPs) darin, daß ihnen die 3'-OH-Gruppe fehlt, die zur Kettenelongation notwendig ist. Wenn ein ddNTP in die DNA-Kette eingebaut wird, verhindert die Abwesenheit der 3'-Hydroxygruppe die Bildung einer neuen Phosphodiesterbindung, und das DNA-Fragment wird mit dem zu der Base in der Matrizen-DNA komplementären ddNTP terminiert. Das Maxam und-Gilbert-Verfahren (Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74: 560, 1977) verwendet ein chemisches Abbauverfahren der ursprünglichen DNA (in beiden Fällen muß die DNA klonal sein). Beide Verfahren erzeugen Populationen von Fragmenten, die an einem bestimmten Punkt anfangen und an jeder Base terminieren, die in dem DNA-Fragment gefunden wird, das sequenziert werden soll. Die Termination jedes Fragments hängt ab von der Stelle der bestimmten Base innerhalb des ursprünglichen DNA-Fragments. Die DNA-Fragmente werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt, und die Reihenfolge der DNA-Basen (A, C, T, G) wird von einem Autoradiograph des Gels abgelesen.

2. Exonuklease-DNA-Sequenzierung

Eine Prozedur zum Bestimmen von DNA-Nukleotidsequenzen wurde von Labeit et al. berichtet (S. Labeit, H. Lehrach & R. S. Goody, DNA 5: 173-7, 1986; A new method of DNA sequencing using deoxynucleoside alpha-thiotriphosphates). Im ersten Schritt des Verfahrens werden vier DNAs, von denen jede separat mit einem unterschiedlichen Desoxynukleosidphosphorthioat anstelle des entsprechenden Monophosphats substituiert ist, durch Matri zen-gerichtete Polymerisierung erzeugt, die durch DNA-Polymerase katalysiert ist. Im zweiten Schritt werden diese DNAs stringenter Exonuklease-III-Behandlung unterworfen, was nur Fragmente erzeugt, die mit einer Phosphorthioat-Internukleotid-Verknüpfung terminiert. Diese können dann durch Standard-Gelelektrophorese-Techniken aufgetrennt werden, und die Sequenz kann direkt abgelesen werden wie in gegenwärtig verwendeten Sequenzierverfahren. Porter et al. (K. W. Porter, J. Tomasz, F. Huang, A. Sood & B. R. Shaw, Biochemistry 34: 11963-11969, 1995; N7-cyanoborane-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate is a good substrate for DNA polymerase) beschrieb einen Satz Bor-substituierter Nukleotidanaloge, die auch Exonuklease-resistent und gute Substrate für eine Zahl von Polymerasen sind: diese Basen sind auch zum Exonuklease-DNA-Sequenzieren geeignet.

3. Eine vereinfachte Strategie zum Sequenzieren großer Anzahlen von cDNAs voller Länge

cDNA-Sequenzieren ist als eine Alternative zum Erzeugen der vollständigen humanen Genomsequenz vorgeschlagen worden. Zwei Ansätze sind unternommen worden. Der erste beinhaltet die Erzeugung von exprimierten Sequenz-Markierungen (ESTs) durch einen einzelnen DNA-Sequenz-Pass an einem Ende jedes cDNA-Klons. Dieses Verfahren hat Einblicke in die Verteilung der Typen exprimierter Sequenzen gegeben und hat gelegentliche nützliche Homologie mit genomischen Fragmenten enthüllt, hat aber insgesamt wenig zu unserer Kenntnisgrundlage hinzugefügt, da nicht-ausreichende Daten von jedem Klon bereitgestellt werden. Der zweite Ansatz ist, eine vollständige cDNA-Sequenz zu erzeugen, die die mögliche Funktion der cDNAs anzeigen kann. Leider sind die meisten cDNAs von einem Größenbereich von 1-4 Kilobasen, was die Automatisierung der Sequenzbestimmung in voller Länge behindert. Gegenwärtig ist das effizienteste Verfahren zur Sequenzerzeugung in großem Maßstab und hohem Durchsatz das Sequenzieren von einer Vektor/Primer-Stelle ausgehend, was typischerweise weniger als 500 Basen von Sequenzen von jeder Flanke ergibt. Die Synthese neuer Oligonukleotidprimer der Länge 15-18 Basen zum "Primer-Walking" kann den Abschluß jeder Sequenz ermöglichen. Eine alternative Strategie zum cDNA-Sequenzieren in voller Länge ist, modifizierte Matrizen zu erzeugen, die zum Sequenzieren mit einem universellen Primer geeignet sind, aber für eine überlappende Abdeckung der Moleküle sorgen.
Shotgun-Sequenzierverfahren können auf cDNA-Sequenzierstudien angewandt werden, indem eine separate Bibliothek von jedem cDNA-Klon erzeugt wird. Diese Verfahren sind jedoch nicht in großem Umfang für die Analyse der 1,5-4,0 Kilobasen-Fragmente verwendet worden, da sie während der anfänglichen Klonierungsphase sehr arbeitsintensiv sind. Statt dessen sind sie im allgemeinen auf Projekte angewendet worden, wo die Target-Sequenz von der Größenordnung von 15 bis 40 Kilobasen ist, wie etwa bei Lambda- oder Cosmid-Inserts.

4. Analogie von cDNA- mit genomischem Sequenzieren

Trotz der typischerweise unterschiedlichen Größe der individuellen Klone, die beim cDNA- Sequenzieren analysiert werden sollen, gibt es Ähnlichkeiten mit den Erfordernissen zum genomischen DNA-Sequenzieren auf großem Maßstab. Zusätzlich zu niedrigen Kosten pro Base und einem hohen Durchsatz wird die ideale Strategie zum cDNA-Sequenzieren in voller Länge eine hohe Genauigkeit haben. Die favorisierte gegenwärtige Methodologie zum genomischeri DNA-Sequenzieren beinhaltet die Herstellung von Shotgun-Sequenzier-Bibliotheken aus Cosmiden, gefolgt von Zufalls-Sequenzierung unter Verwendung von ABI-Fluoreszenz- DNA-Sequenzier-Instrumenten und Abschluß (Finishing) durch gerichtete Anstrengungen. Insgesamt herrscht Übereinstimmung, daß der Fluoreszenz-Shotgun-Ansatz gegenwärtigen Alternativen hinsichtlich Effizienz und Genauigkeit überlegen ist. Die anfängliche Shotgun- Bibliothek-Qualität ist eine wesentliche Determinante der Leichtigkeit und Qualität des Sequenzaufbaus. Die hohe Qualität der erhältlichen Shotgun-Bibliothek-Prozedur hat eine Strategie zur Produktion multipler Shotgun-Bibliotheken vorbereitet, die Mischungen der kleineren cDNA-Klone enthalten. Hier werden die einzelnen zu sequenzierenden Klone vor der Konstruktion der Bibliothek gemischt und dann nach einer Zufallssequenzierung identifiziert, im Stadium der Computer-Analyse. Verbindungen zwischen einzelnen Klonen werden während der Bibliothekserzeugung entweder durch PCR oder durch Identifzierung von Vektorarm-Sequenz markiert.
Klone können sowohl durch mikrobielle Verfahren oder durch PCR hergestellt werden. Wenn PCR verwendet wird, werden drei Reaktionen von jedem Klon verwendet, um das Risiko von Fehlern zu minimieren.
Ein-Pass-Sequenzieren ist eine neue Technik, die angelegt ist, die Identifzierung wichtiger Sequenzen innerhalb einer neuen Region von genomischer DNA zu beschleunigen. Kurz gesagt, wird eine Shotgun-Bibliothek hoher Qualität erzeugt, und dann werden die Sequenzen in Proben eingeteilt, um 80-95% Abdeckung zu erhalten. Für ein Cosmid wären dies typischerweise ungefähr 200 Proben. Es ist wahrscheinlich, daß im wesentlichen alle Gene wenigstens ein Exon in dieser Probe nachgewiesen haben unter Verwendung von entweder Sequenzähnlichkeits (BLAST)- oder Exonstruktur (GRAIL2)-Screening.
"Skimming" ist erfolgreich auf Cosmide und Pls angewendet worden. Ein-Pass-Sequenzieren ist potentiell die schnellste und am wenigsten teuere Art, um Gene in einem positionalen Klonierungsprojekt zu finden. Der Ausgang ist praktisch sichergestellt. Die meisten Forscher entwickeln gegenwärtig Cosmid-Contigs zum Exon-Trapping und verwandte Techniken.
Cosmide sind vollständig geeignet zum Sequenz-Skimming. P1 und andere BACs könnten beträchtlich billiger sein, da es Einsparungen gibt sowohl bei der Erzeugung der Shotgun- Bibliothek als auch der Minimierung von Überlappungen.

5. Shotgun-Sequenzieren

Shotgun-DNA-Sequenzieren fängt mit einer Zufallsfragmentierung der Target-DNA an. Zufallssequenzieren wird dann verwendet, um die Mehrzahl der Daten zu erzeugen. Eine gerichtete Phase vervollständigt dann Lücken, wobei Abdeckung jedes Stranges in beide Richtungen sichergestellt wird. Shotgun-Sequenzieren bietet den Vorteil von hoher Genauigkeit bei relativ niedrigen Kosten. Die Prozedur ist am besten für die Analyse von relativ großen Fragmenten geeignet und ist das Verfahren der Wahl beim genomischen DNA-Sequenzieren auf großem Maßstab.
Es gibt mehrere Faktoren, die wichtig sind, um Shotgun-Sequenzieren genau und kosteneffektiv zu machen. Eine Hauptüberlegung ist die Qualität der Shotgun-Bibliothek, die erzeugt wird, da alle Klone, die keine Inserts haben oder chimäre Inserts haben, zu darauffolgendem ineffizienten Sequenzieren führen werden. Eine andere Überlegung ist das sorgfältige Ausbalancieren der Zufalls- und der gerichteten Phasen des Sequenzierens, so daß hohe Genauigkeit erhalten wird mit einem minimalen Verlust an Effizienz durch überflüssiges Sequenzieren.

G. Seguenzier-Chemie: Markierte-Terminator-Chemie

Es gibt zwei Typen von gegenwärtig erhältlicher Fluoreszenz-Sequenzier-Chemie: Die Dye- Primer-Chemie, bei der der Primer Fluoreszenz-markiert wird, und die Dye-Terminator- Chemie, bei der die Didesoxyterminatoren markiert sind. Jede dieser Chemien kann mit entweder Taq-DNA-Polymerase oder Sequenase-Enzymen verwendet werden. Das Sequenase- Enzym scheint leicht durch G-C-reiche Regionen, Palindrome, einfache Repeats und andere, schwer zu lesende Sequenzen zu lesen. Sequenase ist ebenso zum Sequenzieren von gemischten Populationen gut. Sequenase-Sequenzieren erfordert 5 ug Matrize, eine Extension und einen Multi-Schritt-Säuberungsprozeß. Sequenzieren mit markiertem Primer erfordert vier separate Reaktionen, eine für jedes der A, C, G und T, und dann ein arbeitsaufwendiges Säuberungsprotokoll. Die Taq-Terminator-Zyklus-Sequenzier-Chemie ist das robusteste Sequenzierverfahren. Mit diesem Verfahren kann jeder Sequenzierprimer verwendet werden. Die Menge an benötigter Matrize ist relativ klein, und der gesamte Reaktionsprozeß vom Ansatz zur Säuberung ist angemessen leicht im Vergleich mit der Sequenase- und der Dye- Primer-Chemie. Nur 1,5 ug DNA-Matrize und 4 um Primer werden benötigt. Dazu wird ein fertiger Reaktionsmix hinzugefügt. Dieser Mix besteht aus Puffer, Enzym, dNTPs und markierten Didesoxynukleotiden. Diese Reaktion kann in einem Röhrchen gemacht werden, da jedes der vier Didesoxys mit einem unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoff markiert ist. Diese markierten Terminatoren liegen bei diesem Mix im Überschuß vor, da sie schwierig während der Extension einzubauen sind. Mit schmutziger DNA kann der Einbau dieser Didesoxys hohen Molukulargewichts inhibiert werden. Der Premix schließt dITP ein, um Bandenkompression zu minimieren. Die Verwendung von Taq als die DNA-Polymerase ermöglicht es, die Reaktionen bei hohen Temperaturen laufen zu lassen, um Sekundärstrukturprobleme sowie nicht-spezifische Primer-Bindung zu minimieren. Der gesamte Cocktail durchläuft 25 Zyklen Denaturierung, Annealing und Extension in einem thermischen Cycler, und die abgeschlossene Reaktion wird durch eine Sephadex G50-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) zentrifugiert und ist zum Laden auf ein Gel nach fünf Minuten in einem Vakuum-Dessikator bereit.

7. Primer-Konstruktion

Bei der Konstruktion von Primern sollten dieselben Kriterien verwendet werden wie zur Konstruktion von PCR-Primern. Insbesondere sollten die Primer vorzugsweise 18 bis 20 Nukleotide lang sein, und die 3'-End-Base sollte ein G oder ein C sein. Primer sollten ebenso bevorzugt eine Tm von mehr als 50ºC haben. Primer, die kürzer als 18 Nukleotide sind, werden funktionieren werden, sind aber nicht empfohlen. Je kürzer der Primer, desto größer die Wahrscheinlichkeit, daß er an mehr als einer Stelle auf der Matrizen-DNA bindet und desto niedriger sein Tm. Die Sequenz sollte 100% Übereinstimmung mit der Matrize haben. Jede Fehlpaarung, insbesondere zum 3'-Ende hin, wird die Sequenzierfähigkeit stark verringern.
Jedoch können Primer mit 5'-Schwänzen verwendet werden, solange, wie es ungefähr 18 Basen am 3' gibt, die binden. Wenn man einen Primer aus einem Sequenz-Chromatogramm konstruiert, muß ein Bereich mit hoher Zuverlässigkeit verwendet werden. Wenn man über 350 bis 400 Basen auf einem Standard-Chromatogramm hinausgeht, werden die Spitzen breiter, und die Basen-Benennungen sind nicht mehr so genau. Wie hierin beschrieben, kann der Primer einen 5'-Griff besitzen, durch welchen ein Linker oder eine Linkermarkierung angehängt werden kann.

8. Herstellung einer Nukleinsäurematrize

Der wichtigste Faktor beim DNA-Sequenzieren mit markiertem Primer ist die Qualität der Matrize. Kurz gesagt, ist eine häufige Fehlauffassung die, daß, wenn eine Matrize beim manuellen Sequenzieren funktioniert, sie beim automatisierten Sequenzieren funktionieren sollte. Tatsächlich kann, wenn eine Reaktion beim manuellen Sequenzieren funktioniert, sie beim automatisierten Sequenzieren funktionieren, jedoch ist automatisiertes Sequenzieren viel empfindlicher, und eine Matrize schlechter Qualität kann zu wenigen oder keinen Daten führen, wenn Fluoreszenz-Sequenzierverfahren verwendet werden. Hohe Salzkonzentrationen und anderes Zellmaterial, das während der Herstellung der Matrize nicht richtig extrahiert worden ist, einschließlich RNA, kann ebenso die Fähigkeit verhindern, genaue Sequenzinformation zu erhalten. Viele Mini- und Maxi-Prep-Protokolle erzeugen DNA, die zum manuellen Sequenzieren oder PCR gut genug ist, aber nicht zum automatisierten Sequenzieren (mit markiertem Primer). Ebenso wird die Verwendung von Phenol überhaupt nicht empfohlen, da Phenol in die Helixstruktur interkalieren kann. Die Verwendung von 100% Chloroform reicht aus. Es gibt eine Anzahl von DNA-Herstellungsverfahren, die besonders bevorzugt sind für die hierin vorgesehenen Sequenzierverfahren mit markiertem Primer. Insbesondere Maxi- Preps, die Cäsiumchlorid-Präparationen benützen, oder Qiagen (Chatsworth, CA) Maxi-Prep- Säulen (wobei man vorsichtig sein sollte, diese nicht zu überladen) werden bevorzugt. Für Mini-Preps können Säulen wie etwa Promega's Magic Mini-Prep (Madison, WI) verwendet werden. Beim Sequenzieren von DNA-Fragmenten, wie etwa PCR-Fragmenten oder Restriktionsgeschnittenen Fragmenten, wird es im allgemeinen bevorzugt, das erwünschte Fragment aus einem niedrig schmelzenden Agarosegel auszuschneiden und dann mit einem Produkt, wie etwa GeneClean (La Jolla, CA) aufzureinigen. Es ist sehr wichtig, sicherzustellen, daß nur eine Bande aus dem Gel ausgeschnitten wird. Für PCR-Fragmente können die PCR- Primer oder internen Primer verwendet werden, um sicherzustellen, daß das passende Frag ment sequenziert wurde. Um optimale Leistung aus der Sequenzanalyse-Software zu erhalten, sollten die Fragmente größer als 200 Basen sein. Doppelsträngige oder einzelsträngige DNA kann mit diesem Verfahren sequenziert werden.
Ein zusätzlicher Faktor, der im allgemeinen beim Herstellen von DNA zur Sequenzierung berücksichtigt wird, ist die Auswahl des Wirt-Stammes. Gesellschaften, die Ausrüstung und Reagentien zum Sequenzieren verkaufen, wie etwa ABI (Foster City, CA) und Qiagen (Chatsworth, CA) empfehlen typischerweise bevorzugte Wirt-Stämme und haben früher Stämme empfohlen, wie etwa DH5 alpha, HB101, XL-1 Blue, JM109, MV1190. Sogar wenn die DNA-Präparationen sehr sauber sind, gibt es andere inhärente Faktoren, die es schwierig machen können, eine Sequenz zu erhalten. G-C-reiche Matrizen sind immer schwierig durchzusequenzieren, und Sekundärstruktur kann ebenso Probleme verursachen. Sequenzieren durch lange Repeats stellt sich oft als schwierig heraus. Zum Beispiel fällt, während Taq einen Poly-T-Abschnitt entlangläuft, das Enzym oft von der Matrize und springt wieder auf, wobei es ein T überspringt. Dies führt zu Extensions-Produkten mit der Menge X von Ts in dem Poly-T-Abschnitt und Fragmenten mit X-1, X-2 etc. Mengen von T5 in dem Poly-T- Abschnitt. Der Netto-Effekt ist, daß mehr als eine Base in jeder Position zu sein scheint, was es unmöglich macht, die Sequenz zu lesen.

9. Verwendung von molekular unterschiedlichen Klonierungsvektoren

Sequenzieren kann ebenso unter Verwendung eines universellen Klonierungsvektors (M13) und komplementären Sequenzierprimern erreicht werden. Kurz gesagt, wird für gegenwärtige Klonierungsvektoren dieselbe Primersequenz verwendet, und nur 4 Markierungen werden verwendet (jede Markierung ist ein unterschiedlicher Fluorophor, der einen unterschiedlichen Terminator repräsentiert (ddNTP)), jeder Amplifizierungsprozeß muß in verschiedenen Behältern stattfinden (eine DNA-Probe pro Behälter). D. h. es ist unmöglich, zwei oder verschiedene DNA-Proben in demselben Amplifizierungsprozeß zu mischen. Mit nur 4 zur Verfügung stehenden Markierungen kann nur eine DNA-Probe pro Gelspur laufengelassen werden. Es gibt kein bequemes Mittel, um die Sequenz von mehr als einer DNA-Probe mit nur 4 Markierungen zu entschlüsseln. (In dieser Hinsicht verwenden Forscher auf dem Gebiet große Sorgfalt, verschiedene DNA-Proben nicht zu vermischen oder zu kontaminieren, wenn gegenwärtige Technologien verwendet werden).
Ein wesentlicher Vorteil wird erhalten, wenn Vielfache von 4 Markierungen pro Gelspur oder jeweiligem Auftrennungsprozeß laufengelassen werden können. Insbesondere kann unter Verwendung von Markierungen der vorliegenden Erfindung mehr als eine DNA-Probe in einer einzelnen Amplifizierungsreaktion oder Behälter verarbeitet werden. Wenn Vielfache von 4 Markierungen zur Verwendung erhältlich sind, kann jeder Markierungssatz einer bestimmten DNA-Probe, die amplifiziert werden soll, zugeordnet werden. (Ein Markierungssatz umfaßt eine Reihe von 4 unterschiedlichen Markierungen, jede mit einer einzigartigen Eigenschaft.) Jeder Markierung wird zugeordnet, daß sie einen unterschiedlichen Didesoxyterminator, ddATP, ddGTP, ddCTP oder ddTTP repräsentiert. Um diesen Vorteil anzuwenden, muß eine Reihe von Vektoren erzeugt werden, in denen eine einzigartige Priming-Stelle inseriert wird. Eine einzigartige Priming-Stelle ist einfach ein Abschnitt von 18 Nukleotiden, der sich von Vektor zu Vektor unterscheidet. Die verbleibende Nukleotidsequenz ist von Vektor zu Vektor konserviert. Ein Sequenzierprimer wird hergestellt (synthetisiert), der jedem einzigartigen Vektor entspricht. Jeder einzigartige Vektor ist abgeleitet von (oder markiert) mit einem einzigartigen Markierungssatz.
Mit diesen jeweiligen molekularbiologischen Werkzeugen zur Hand, ist es bei der vorliegenden Erfindung möglich, vielfache Proben in einem einzelnen Behälter zu verarbeiten. Als erstes werden DNA-Proben, die sequenziert werden sollen, in die Vielzahl von Vektoren kloniert. Zum Beispiel werden, wenn 100 einzigartige Vektoren zur Verfügung stehen, 100 Ligationsreaktionen, Ausplattierungsschritte und das Picken von Plaques durchgeführt. Als zweites wird eine Probe von jedem Vektortyp vereinigt, was einen Pool von 100 einzigartigen Vektoren ergibt, der 100 einzigartige DNA-Fragmente oder -Proben enthält. Eine gegebene DNA-Probe wird deshalb identifiziert und automatisch einem Primersatz mit dem assoziierten Markierungssatz zugeordnet. Die jeweiligen Primer, Puffer, Polymerase(n), ddNTPs, dNTPs und Cofaktoren werden dem Reaktionsbehälter zugegeben, und der Amplifizierungsprozeß wird durchgeführt. Die Reaktion wird dann einem Auftrennungsschritt unterworfen, und die jeweilige Sequenz wird aus der zeitlichen Erscheinung von Markierungen festgestellt. Die Fähigkeit, vielfache DNA-Proben zu vereinigen, hat wesentliche Vorteile. Die Reagens- Kosten einer typischen PCR-Reaktion ist ungefähr $ 2,00 pro Probe. Mit dem hierin beschriebenen Verfahren könnten die Kosten der Amplifizierung auf einer pro-Proben-Grundlage um wenigstens einen Faktor von 100 reduziert werden. Probenhantierung könnte um einen Faktor von wenigstens 100 reduziert werden, und Materialkosten könnten reduziert werden. Der Bedarf nach Amplifizierungsrobotern auf großem Maßstab würde beseitigt werden.

10. Sequenziervektoren zum abspaltbaren Massenspektroskopie-Markieren

Unter Verwendung von abspaltbarem Massenspektroskopie-Markieren (CMST) der vorliegenden Erfindung kann jede einzelne Sequenzierungsreaktion unabhängig und gleichzeitig gelesen werden, während die Auftrennung fortschreitet. Beim CMST-Sequenzieren wird ein unterschiedlicher Primer für jeden Klonierungsvektor verwendet: Jede Reaktion hat 20 verschiedene Primer, wenn 20 Klone pro Pool verwendet werden. Jeder Primer entspricht einem der Vektoren, und jeder Primer wird mit einem einzigartigen CMST-Molekül markiert. Vier Reaktionen werden an jeder vereinigten DNA-Probe (eine für jede Base) durchgeführt, so hat jeder Vektor vier Oligonukleotidprimer, jeder identisch hinsichtlich der Sequenz, aber mit einer unterschiedlichen CMS-Markierung markiert. Die vier getrennten Sequenzierreaktionen werden vereinigt und zusammen laufengelassen. Wenn 20 Proben vereinigt werden, werden 80 Markierungen verwendet (vier Basen pro Probe mal 20 Proben), und alle 80 werden gleichzeitig nachgewiesen, während das Gel gefahren wird.
Die Konstruktion der Vektoren kann erreicht werden durch Klonieren eines statistischen 20- mers auf beiden Seiten einer Restriktionsstelle. Die resultierenden Klone werden sequenziert, und eine Anzahl zur Verwendung als Vektoren gewählt. Zwei Oligonukleotide werden für jeden gewählten Vektor hergestellt, eines homolog zu der Sequenz an jeder Seite der Restriktionsstelle und jedes so orientiert, daß das 3'-Ende zu der Restriktionsstelle hin gerichtet ist. Vier markierte Präparationen jedes Primers werden hergestellt, eine für jede Base bei den Sequenzierungsreaktionen und jede mit einer einzigartigen CMS-Markierung markiert.

11. Sequenziervorteile aufgrund der Verwendung von reversiblen Markierungen

Es gibt wesentliche Vorteile, wenn abspaltbare Markierungen beim Sequenzieren und verwandten Technologien verwendet werden. Als erstes wird ein Anstieg der Empfindlichkeit zu längeren Leselängen beitragen, was ebenso die Fähigkeit tun wird, Markierungen für eine spezifizierte Zeitperiode vor der Messung zu sammeln. Die Verwendung von abspaltbaren Markierungen erlaubt die Entwicklung eines Systems, das die Bandbreite über den gesamten Bereich des Gels angleicht (z. B. 1-1500 Nukleotide (nt)). Dies wird großen Einfluß auf die Fähigkeit haben, Leselängen größer als 450 nt zu erhalten.
Die Verwendung von abspaltbaren multiplen Markierungen (MW-Identifikatoren) hat ebenso den Vorteil, daß vielfache DNA-Proben auf einer einzelnen Gelspur oder Auftrennungsprozeß laufengelassen werden können. Zum Beispiel ist es möglich, unter Verwendung der hierin offenbarten Methodologien wenigstens 96 Proben und 4 Sequenzierreaktionen (A, G, T, C) auf einer einzelnen Spur oder einem Fragment-Größentrennprozeß zu kombinieren. Wenn vielfache Vektoren verwendet werden, die einzigartige Priming-Stellen haben, dann können wenigstens 384 Proben pro Gelspur kombiniert werden (die unterschiedlichen Terminatorreaktionen können nicht zusammen mit diesem Schema amplifziert werden). Wenn die Fähigkeit, abspaltbare Markierungen zu verwenden, mit der Fähigkeit kombiniert wird, multiple Vektoren zu verwenden, wird ein apparenter 10.000-facher Anstieg im DNA-Sequenzier- Durchsatz erreicht. Ebenso wird in den hierin beschriebenen Schemata der Reagens- Verbrauch verringert, der Abfall nimmt ab, mit einer daraus resultierenden Abnahme der Betriebskosten für den Verbraucher.
Ein zusätzlicher Vorteil wird aus der Fähigkeit erhalten, interne Kontrollen während der gesamten, hier beschriebenen Methodologien hindurch zu verarbeiten. Für jeden Satz von Proben kann eine interne Kontroll-Nukleinsäure in die Probe(n) eingebracht werden. Dies ist nicht möglich mit den gegenwärtigen Anordnungen. Dieser Vorteil erlaubt die Kontrolle des Amplifizierungsprozesses, des Auftrennungsprozesses, des Markierungsnachweis-Systems und des Sequenzaufbaus. Dies ist ein immenser Vorteil gegenüber gegenwärtigen Systemen, bei denen die Kontrollen immer von den Proben in allen Schritten getrennt sind.
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren haben ebenso den Vorteil, daß sie hinsichtlich ihrer Natur modular sind und auf jeden Typ von Auftrennungsprozeß oder -verfahren angepaßt werden können und zusätzlich auf jeden Typ von Nachweissytem angepaßt werden können, während Verbesserungen in beiden Typen der jeweiligen Technologien gemacht werden. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Methodologien mit "gebündelten" CE-Anordnungen oder Mikrosystemen gekoppelt werden, die die Auftrennung von DNA-Fragmenten ermöglichen.

C. AUFTRENNUNG DER DNA-FRAGMENTE

Eine Probe, die Analyse erfordert, ist oft eine Mischung vieler Komponenten in einer komplexen Matrix. Für Proben, die unbekannte Verbindungen enthalten, müssen die Bestandteile voneinander getrennt werden, so daß jeder einzelne Bestandteil durch andere analytische Verfahren identifiziert werden kann. Die Auftrennungseigenschaften der Bestandteile in einer Mischung sind konstant unter konstanten Bedingungen, und sie können deshalb, wenn sie erst einmal bestimmt sind, verwendet werden, um jeden der Bestandteile zu identifizieren und quantifizieren. Solche Prozeduren sind bei chromatographischen und elektrophoretischen analytischen Auftrennungen typisch.

1. Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) ist eine chromatographische Auftrennungstechnik, um Verbindungen aufzutrennen, die in Lösung aufgelöst sind. HPLC- Instrumente bestehen aus einem Reservoir einer mobilen Phase, einer Pumpe, eines Injektors, einer Trennungssäule und eines Detektors. Verbindungen werden aufgetrennt durch Injizieren eines Aliquots der Probenmischung auf die Säule. Die verschiedenen Bestandteile in der Mischung laufen durch die Säule in verschiedenen Raten aufgrund von Unterschieden in ihrem Aufteilungsverhalten zwischen der mobilen flüssigen Phase und der stationären Phase.
Vor kurzem ist gezeigt worden, daß IP-RO-HPLC auf nicht-porösen PS/DVB-Teilchen mit chemisch gebundenen Alkylketten schnelle Alternativen zur Kapillarelektrophorese bei der Analyse von sowohl einzel- als auch doppelsträngigen Nukleinsäuren sind, indem sie ähnliche Auflösungsgrade bereitstellen (Huber et al., 1993, Anal.Biochem., 212, S. 351; Huber et al., 1993, Nuc. Acids Res., 21, S. 1061; Huber et al., 1993, Biotechniques, 16, S. 898). Im Gegensatz zur Ionenaustausch-Chromatographie, die nicht immer doppelsträngige DNA als eine Funktion der Stranglänge beibehält (da AT-Basenpaare mit der positiv-geladenen stationären Phase stärker als GC-Basenpaare wechselwirken), ermöglicht IP-RP-HPLC eine strikt größenabhängige Auftrennung.
Ein Verfahren ist entwickelt worden unter Verwendung von 100 mM Triethylammoniumacetat als ionenpaarendes Reagens, bei dem Phosphodiester-Oligonukleotide auf alkylierten, nicht-porösen 2,3 uM Poly(styrol-divinylbenzol)-Teilchen mit Hilfe von Hochleistungs- Flüssigkeits-Chromatographie erfolgreich aufgetrennt werden konnten (Oefner et al., 1994, Anal. Biochem., 223, S. 39). Die beschriebene Technik ermöglichte die Auftrennung von PCR-Produkten, die sich nur um 4 bis 8 Basenpaare hinsichtlich der Länge innerhalb eines Größenbereichs von 50 bis 200 Nukleotiden unterschieden.

2. Elektrophorese

Elektrophorese ist eine Auftrennungstechnik, die auf der Beweglichkeit von Ionen (oder DNA, wie es der hierin beschriebene Fall ist) in einem elektrischen Feld basiert. Negativgeladene DNA wandert zu einer positiven Elektrode, und positiv-geladene Ionen wandern zu einer negativen Elektrode. Aus Sicherheitsgründen ist eine Elektrode gewöhnlich geerdet, und die andere ist positiv oder negativ vorgespannt. Geladene Spezies haben unterschiedliche Wanderungsraten in Abhängigkeit von ihrer Gesamtladung, Größe und Form und können deshalb aufgetrennt werden. Ein Elektrodenapparat besteht aus einer Hochspannungs- Stromversorgung, Elektroden, Puffer und einem Träger für den Puffer, wie etwa ein Polyacrylamidgel oder ein Kapillarröhrchen. Offene Kapillarröhrchen werden für viele Typen von Proben verwendet, und die anderen Gelträger werden gewöhnlich verwendet für biologische Proben, wie etwa Proteinmischungen oder DNA-Fragmente.

3. Kapillarelektrophorese (CE)

Kapillarelektrophorese (CE) in ihren verschiedenen Manifestationen (in freier Lösung, Isotachophorese, isoelektrisches Fokussieren, Polyacrylamidgel, mizellare elektrokinetische "Chromatographie") entwickelt sich als ein Verfahren für schnelle Hochauflösungs- Auftrennungen von sehr kleinen Probenvolumina komplexer Mischungen. In Kombination mit der inhärenten Empfindlichkeit und Selektivität von MS ist CE-MS eine potentielle leistungsstarke Technik zur Bioanalyse. Bei der hierin offenbarten neuen Anwendung wird die Schnittstelle dieser beiden Verfahren zu besseren DNA-Sequenzierverfahren führen, die die gegenwärtigen Sequenzierverfahren um mehrere Größenordnungen in den Schatten stellen.
Die Entsprechung zwischen CE und Elektrospray-Ionisations(ESI)-Durchflußraten und die Tatsache, daß beide erleichtert werden durch (und hauptsächlich verwendet werden für) ionische Spezies in Lösung, stellen die Grundlage für eine äußerst attraktive Kombination bereit. Die Kombination von sowohl Kapillarzonen-Elektrophorese (CZE) und Kapillar- Isotachophorese mit Quadrupol-Massenspektrometern, die auf ESI basieren, sind beschrieben worden (Olivares et al., Anal. Chem. 59: 1230, 1987; Smith et al., Anal. Chem. 60: 436, 1988, Loo et al., Anal. Chem. 179: 404, 1989; Edmonds et al., J. Chroma. 474: 21, 1989; Loo et al., J. Microcolumn Sep. 1: 223, 1989; Lee et al., J. Chromatog. 458: 313, 1988; Smith et al., J. Chromatog. 480: 211, 1989; Grese et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2835, 1989). Kleine Peptide sind gegenüber CZE-Analyse mit guter (Femtomol) Empfindlichkeit leicht zugänglich.
Das stärkste Auftrennungsverfahren für DNA-Fragmente ist Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE), im allgemeinen in einem Slabgel-Format. Die Hauptbeschränkung der gegenwärtigen Technologie ist jedoch die relativ lange Zeit, die erforderlich ist, um die Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten durchzuführen, die bei den Sequenzierungsreaktionen erzeugt worden sind. Ein Anstieg der Größenordnung (10-fach) kann erreicht werden durch die Verwendung von Kapillarelektrophorese, die ultradünne Gele verwendet. In freier Lösung wandert die gesamte DNA in einer ersten Annäherung mit derselben Beweglichkeit, da das Hinzufügen einer Base zum Ausgleich von Masse und Ladung führt. Bei Polyacrylamidgelen werden DNA-Fragmente gesiebt und wandern als eine Funktion der Länge, und dieser Ansatz ist nun auf CE angewandt worden. Bemerkenswerte Bodenzahlen pro Meter sind jetzt mit quervernetztem Polyacrylamid erreicht worden (10&spplus;&sup7; Böden pro Meter, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85 : 9660, 1988). Solche CE-Säulen, wie beschrieben, können zum DNA-Sequenzieren verwendet werden. Das Verfahren von CE ist im Prinzip 25- mal schneller als Slabgel-Elektrophorese in einem Standardsequenzierer. Zum Beispiel können ungefähr 300 Basen pro Stunde gelesen werden. Die Auftrennungsgeschwindigkeit wird bei der Slabgel-Elektrophorese durch die Größe des elektrischen Felds beschränkt, das an das Gel ohne übermäßige Hitzeproduktion angelegt werden kann. Deshalb wird die größere Geschwindigkeit von CE durch die Verwendung von höheren Feldstärken erreicht (300 V/cm bei CE gegen 10 V/cm bei der Slabgel-Elektrophorese). Das Kapillarformat reduziert die Stromstärke und damit die Leistung und resultierende Hitzeerzeugung.
Smith und andere (Smith et al., Nuc. Acids. Res. 18: 4417, 1990) haben die parallele Verwendung von multiplen Kapillaren vorgeschlagen, um den Durchsatz zu erhöhen. Ebenso haben Mathies und Huang (Mathies und Huang, Nature 359: 167, 1992) Kapillarelektrophorese eingeführt, bei der Auftrennungen auf einer parallelen Anordnung von Kapillaren durchgeführt werden, und demonstrierten ein Sequenzieren mit hohem Durchsatz (Huang et al., AnaL Chem. 64: 967, 1992, Huang et al., Anal. Chem. 64: 2149, 1992). Der Hauptnachteil von Kapillarelektrophorese ist die begrenzte Menge an Probe, die auf die Kapillare geladen werden kann. Durch Konzentrieren einer großen Probenmenge am Anfang der Kapillare vor der Auftrennung wird die Ladbarkeit erhöht, und die Nachweisniveaus können um mehrere Größenordnungen erniedrigt werden. Das populärste Verfahren der vorherigen Aufkonzentration bei CE ist Probenstapelung. Probenstapelung ist vor kurzem in einer Übersicht dargestellt worden (Chien und Burgi, Anal. Chem. 64: 489A, 1992). Probenstapelung hängt von dem Matrixunterschied, (pH, Ionenstärke) zwischen dem Probenpuffer und dem Kapillarpuffer ab, so daß das elektrische Feld quer über die Probenzone größer ist als in der Kapillarregion. Bei der Probenstapelung wird ein großes Probenvolumen in einem Puffer niedriger Konzentration zur vorherigen Aufkonzentration am Kopf der Kapillarsäurle eingeführt. Die Kapillare wird mit einem Puffer derselben Zusammensetzung gefüllt, aber in höherer Konzentration. Wenn die Probenionen den Kapillarpuffer und das niedrigere elektrische Feld erreichen, stapeln sie sich in eine konzentrierte Zone. Probenstapelung hat die Nachweisbarkeiten um 1-3 Größenordnungen erhöht.
Ein anderes Verfahren zur vorherigen Aufkonzentration ist, Isotachophorese (ITP) vor der Freizonen-CE-Auftrennung der Analyten anzuwenden. ITP ist eine Elektrophorese-Technik, die es ermöglicht, daß Proben-Mikrolitervolumina auf die Kapillare geladen werden im Gegensatz zu den niedrigen nL-Injektionsvolumina, die typischerweise mit CE assoziiert sind. Die Technik beruht auf Einführen der Probe zwischen zwei Puffern (Leading- und Trailing- Elektrolyten) von höherer bzw. niedrigerer Mobilität als der Analyt. Die Technik ist inhärent eine Konzentrationstechnik, wobei die Analyten sich in reine Zonen konzentrieren, die mit derselben Geschwindigkeit wandern. Die Technik ist gegenwärtig weniger populär als die oben beschriebenen Stapelungsverfahren wegen des Bedarfs für mehrere Wahlmöglichkeiten von Leading- und Trailing-Elektrolyten und der Fähigkeit, nur kationische oder anionische Spezies während eines Auftrennungsprozesses zu trennen.
Das Herz des DNA-Sequenzierprozesses ist die bemerkenswert selektive elektrophoretische Auftrennung von DNA- oder Oligonukleotid-Fragmenten. Sie ist bemerkenswert, weil jedes Fragment aufgelöst wird und sich um nur ein Nukleotid unterscheidet. Auftrennungen von bis zu 1000 Fragmenten (1000 bp) sind erhalten worden. Ein weiterer Vorteil des Sequenzierens mit abspaltbaren Markierungen ist wie folgt. Es gibt kein Erfordernis, ein Slabgel-Format zu verwenden, wenn DNA-Fragmente durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt werden, wenn abspaltbare Markierungen verwendet werden. Da zahlreiche Proben kombiniert werden (4 bis 2000), gibt es keinen Bedarf, Proben parallel laufen zu lassen, wie es der Fall ist mit gegenwärtigen Dye-Primer- oder Dye-Terminator-Verfahren (d. h. ABI373- Sequenzierer). Da es keinen Grund gibt, parallele Spuren zu fahren, gibt es keinen Grund, ein Slabgel zu verwenden. Deshalb kann man ein Röhrengel-Format für das elektrophoretische Auftrennungsverfahren verwenden. Grossman (Grossman et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 9,1992) hat gezeigt, daß ein beträchtlicher Vorteil erlangt wird, wenn ein Röhrengel-Format anstelle eines Slabgel-Formats verwendet wird. Dies ist aufgrund der größeren Fähigkeit, Joule-Wärme in einem Röhrenformat abzuleiten im Vergleich mit einem Slabgel, was zu schnelleren Laufzeiten (um 50%) und viel höherer Auflösung von DNA-Fragmenten hohen Molekulargewichts (größer als 1000 nt) führt. Lange Ablesungen sind beim Genomsequenzieren wesentlich. Deshalb hat die Verwendung abspaltbarer Markierungen beim Sequenzieren den zusätzlichen Vorteil, daß dem Benutzer ermöglicht wird, das effizienteste und empfindlichste DNA-Auftrennungsverfahren zu verwenden, das auch die höchste Auflösung hat.

4. Mikrosysteme

Kapillarelektrophorese (CE) ist ein leistungsfähiges Verfahren zum DNA-Sequenzieren, für forensische Analyse, PCR-Produktanalyse und Restriktionsfragment-Größenbestimmung. CE ist weit schneller als herkömmliche Slab-PAGE, da mit Kapillargelen ein weit höheres Potentialfeld angelegt werden kann. CE hat jedoch den Nachteil, daß nur eine Probe pro Gel verarbeitet werden kann. Das Verfahren kombiniert die schnelleren Trennungszeiten von CE mit der Fähigkeit, vielfache Proben parallel zu analysieren. Das der Verwendung von Mikrosystemen zugrundeliegende Konzept ist die Fähigkeit, die Informationsdichte in der Elektrophorese durch Verkleinerung der Spurendimensionen auf ungefähr 100 Mikrometer zu erhöhen. Die Elektronikindustrie verwendet routinemäßig Mikrotechnologie, um Schaltkreise mit Merkmalen von weniger als einem Mikron in der Größe herzustellen. Die gegenwärtige Dichte von Kapillaranordnungen ist durch den äußeren Durchmesser der Kapillarröhre beschränkt. Die Erzeugung von Kanälen auf Mikro-Maßstab erzeugt eine höhere Dichte an Anordnungen. Mikrotechnologie erlaubt auch physische Anordnungen, die mit Glasfasern nicht möglich sind, und verknüpft die Kanäle direkt an andere Vorrichtungen auf einem Chip. Wenige Vorrichtungen sind auf Mikrochips für Trennungstechnologien konstruiert worden. Ein Gaschromatograph (Terry et al., IEEE Trans. Electron Device, ED-26: 1880, 1979) und ein Flüssigchromatograph (Manz et al., Sens. Actuators B1: 249, 1990) sind auf Silikonchips erzeugt worden, aber diese Vorrichtungen sind nicht verbreitet verwendet worden. Mehre Gruppen haben die Trennung von fluoreszenten Farbstoffen und Aminosäuren auf mikrotechnologisch hergestellten Vorrichtungen berichtet (Manz et al., J. Chromatography 593: 253, 1992, Effenhauser et al., Anal. Chem. 65: 2637, 1993). Vor kurzem haben Woolley und Mathies (Woolley und Mathies, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 11348, 1994) gezeigt, daß Photolitho graphie und chemisches Ätzen verwendet werden kann, um große Anzahlen von Trennungskanälen auf Glassubstraten zu machen. Die Kanäle werden mit Hydroxyethylzellulose (HEC)- Trennungsmatrizen gefüllt. Es wurde gezeigt, daß DNA-Restriktionsfragmente in sowenig wie zwei Minuten aufgetrennt werden konnten.

D. ABSPALTUNG VON MARKIERUNGEN

Wie oben beschrieben, werden unterschiedliche Linker-Konstruktionen Spaltbarkeit ("Labilität") unter verschiedenen spezifischen physischen oder chemischen Bedingungen verleihen. Beispiele von Bedingungen, die dazu dienen, verschiedene Konstruktionen von Linkem zu spalten, schließen Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Fluorid, Thiolaustausch, Photolyse und enzymatische Bedingungen ein.
Beispiele von spaltbaren Linkem, die die allgemeinen Kriterien für oben aufgelistete Linker erfüllen, werden für Fachleute wohlbekannt sein und schließen diejenigen ein, die in dem von Pierce (Rockford, IL) erhältlichen Katalog gefunden werden. Beispiele schließen ein:
- Ethylenglycobis(succinimidylsuccinat) (EGS), ein Amin-reaktives Quervernetzungsreagens, das durch Hydroxylamin spaltbar ist (1 M bei 37ºC für 3-6 Stunden);
- Disuccinimidyltartarat (DST) und sulfo-DST, die Amin-reaktive quervernetzende Reagentien sind, spaltbar durch 0,015 M Natriumperiodat;
- Bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES) und sulfo-BSOCOES, die Amin-reaktive, quervernetzende Reagentien sind, die durch Base spaltbar sind (pH 11,6);
- 1,4-Di-[3'-(2'-pyridyldithio(propionamido))butan (DPDPB), ein Pyridyldithiol- Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-[4-p-Azidosalicylamido]-butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid (APDP), ein Pyridyldithiol-Quervemetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Bis-[beta-4-(azidosalicylamido)ethyl]-disulfid, ein photoreaktiver Quervemetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'dithiopropionat (SADP), ein photoreaktiver Quervernetzer, der durch Thiolaustäusch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcumann-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAED), ein photoreaktiver Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'dithiopropionat (SAND), ein photoreaktiver Quervernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist. Andere Beispiele spaltbarer Linker und die Spaltungsbedingungen, die verwendet werden können, um die Markierungen freizusetzen, sind wie folgt. Eine Silyl-Verknüpfungsgruppe kann durch Fluorid oder unter sauren Bedingungen gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6- substituierte-2-Nitrobenzyloxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte-4-Nitrobenzyloxy- Verknüpfungsgruppe kann durch eine Photonenquelle gespalten werden (Photolyse). Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte-2-Alkoxyphenoxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte-4- Alkoxyphenoxy-Verknüpfungsgruppe kann durch Ce(NH&sub4;)&sub2;(NO&sub3;)&sub6; (Oxidation) gespalten werden. Ein NCO&sub2; (Urethan)-Linker kann durch Hydroxid (Base), Säure oder LiAlH&sub4; (Reduktion) gespalten werden. Eine 3-Pentenyl, 2-Butenyl oder 1-Butenyl-Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub3;, OSO&sub4;/IO&sub4;&supmin; oder KMnO&sub4; (Oxidation) gespalten werden. Eine 2-[3-, 4- oder 5- substituierte Furyl]oxy-Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub2;, Br&sub2;, MeOH oder Säure gespalten werden.
Bedingungen für die Spaltung von anderen labilen Verknüpfungsgruppen schließen ein: Tert- Alkyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure gespalten werden; Methyl(dialkyl)methoxy- oder 4-substituierte-2-Alkyl-1,3-dioxlan-2-yl-Verknüpfungsgruppen können durch H&sub3;O&spplus; gespalten werden; 2-Silylethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Fluorid oder Säure gespalten werden; 2-(X)-ethoxy (wobei X = Keto, Esteramid, Cyano, NO&sub2;, Sulfid, Sulfoxid, Sulfon)-Verknüpfungsgruppen können unter alkalischen Bedingungen gespalten werden; 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte Benzyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure oder unter reduktiven Bedingungen gespalten werden; 2-Butenyloxy- Verknüpfungsgruppen können gespalten werden durch (Ph&sub3;P)&sub3;RhCl(H), 3-, 4-, 5- oder 6- substituierte-2-Bromphenoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Li, Mg oder BuLi gespal ten werden; Methylthiomethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Hg²&spplus; gespalten werden; 2-(X)-ethyloxy(wobei X = ein Halogen)-Verknüpfungsgruppen können durch Zn oder Mg gespalten werden; 2-Hydroxyethyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Oxidation gespalten werden (z. B. mit Pb(OAc)&sub4;).
Bevorzugte Linker sind diejenigen, die durch Säure oder Photolyse gespalten werden. Mehrere der Säure-labilen Linker, die zur Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden sind, sind zum Verknüpfen von Markierungen an MOIs nützlich. Einige dieser Linker sind in einer jüngeren Übersicht von Lloyd-Williams et al. beschrieben (Tetrahedron 49: 11065-11133, 1993). Ein nützlicher Typ von Linker beruht auf p-Alkoxybenzyl-Alkoholen, von denen zwei, 4- Hydroxymethylphenoxyessigsäure und 4-(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)buttersäure, kommerziell von Advanced ChemTech (Louisville, KY) erhältlich sind. Beide Linker können an eine Markierung über eine Esterverknüpfung zu dem Benzylalkohol angehängt werden und an ein Amin-enthaltendes MOI über eine Amidverknüpfung zu der Carbonsäure. Markierungen, die durch dieser Moleküle verknüpft sind, werden von dem MOI mit verschiedenen Konzentrationen von Trifluoressigsäure freigesetzt. Die Spaltung dieser Linker resultiert in der Freisetzung einer Carbonsäure an der Markierung. Säurespaltung von Markierungen, die durch verwandte Linker angehängt sind, wie etwa 2,4-Dimethoxy-4'-(carboxymethyloxy)- benzhydrylamin (erhältlich von Advanced ChemTech in FMOC-geschützter Form) resultiert in der Freisetzung eines Carbonsäureamids auf der freigesetzten Markierung.
Die photolabilen Linker, die zu dieser Anwendung nützlich sind, sind ebenso zum größten Teil für die Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden (siehe Lloyd-Williams Übersicht). Diese Linker beruhen gewöhnlich auf 2-Nitrobenzylestern oder 2-Nitrobenzylamiden. Zwei Beispiele von photolabilen Linkern, von denen kürzlich in der Literatur berichtet worden ist, sind 4-(4-(1-Fmoc-amino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (Holmes und Jones, J Org. Chem. 60: 2318-2319, 1995) und 3-(Fmoc-amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al., Molecular Diversity 1: 4-12, 1995). Beide Linker können über die Carbonsäure an ein Amin auf dem MOI angehängt werden. Das Anhängen der Markierung an den Linker wird gemacht durch Bilden eines Amids zwischen einer Carbonsäure auf der Markierung und dem Amin auf dem Linker. Die Spaltung von photolabilen Linkem wird gewöhnlich mit UV- Licht von 350 nm Wellenlänge bei Intensitäten und Zeiten durchgeführt, die Fachleuten bekannt sind. Beispiele kommerzieller Quellen von Instrumenten zur photochemischen Spaltung sind Aura Industries Inc. (Staten Island, NY) und Agrenetics (Wilmington, MA). Spaltung der Linker führt zu der Freisetzung eines primären Amids auf der Markierung. Beispiele von photospaltbaren Linkem schließen Nitrophenylglycinester, Exo- und Endo-2- benzonorboneylchloride und Methansulfonate und 3-Amino-3(2-nitrophenyl)propionsäure ein. Beispiele enzymatischer Spaltung schließen Esterasen, die Esterbindungen spalten werden, Nukleasen, die Phosphodiesterbindungen spalten werden, Proteasen, die Peptidbindungen spalten werden, etc. ein.

E. NACHWEIS VON MARKIERUNGEN

Nachweisverfahren beruhen typischerweise auf der Absorption und Emission in irgendeinem Typ von Spektralfeld. Wenn Atome oder Moleküle Licht absorbieren, regt die ankommende Energie eine quantisierte Struktur zu einem höheren Energieniveau an. Die Art der Anregung hängt von der Wellenlänge des Lichts ab. Elektronen werden auf höhere Orbitale durch Ultraviolett- oder sichtbares Licht gehoben, molekulare Schwingungen werden durch Infrarotlicht angeregt, und Rotationen werden durch Mikrowellen angeregt. Ein Absorptionsspektrum ist die Absorption von Licht als eine Funktion der Wellenlänge. Das Spektrum eines Atoms oder Moleküls hängt von seiner Energieniveaustruktur ab. Absorptionsspektra sind zur Identifizierung von Verbindungen nützlich. Spezifische Absorptions-spektroskopische Verfahren schließen Atomabsorptionsspektroskopie (AA), Infrarotspektroskopie (IR) und UV-vis- Spektroskopie (uv-vis) ein.
Atome oder Moleküle, die auf hohe Energieniveaus angeregt werden, können auf niedrigere Niveaus abklingen durch das Emittieren von Strahlung. Diese Lichtemission wird Fluoreszenz genannt, wenn der Übergang zwischen Zuständen desselben Spins ist, und Phosphoreszenz, wenn der Übergang zwischen Zuständen unterschiedlichen Spins stattfindet. Die Emissionsintensität eines Analyten ist linear proportional zur Konzentration (bei niedrigen Konzentrationen) und ist nützlich zum Quantifizieren der emittierenden Spezies. Spezifische Emissions-spektroskopische Verfahren schließen Atomemissionsspektroskopie (AES), Atomfluoreszenzspektroskopie (AFS), Moleküllaser-induzierte Fluoreszenz (LIF) und Röntgenfluoreszenz (XRF) ein.
Wenn elektromagnetische Strahlung durch Materie läuft, setzt sich der Hauptteil der Strahlung in ihrer ursprünglichen Richtung fort, aber ein kleiner Bruchteil wird in andere Richtungen gestreut. Licht, das bei derselben Wellenlänge wie das ankommende Licht gestreut wird, wird Rayleigh-Streuung genannt. Licht, das in transparenten Feststoffen aufgrund von Vibrationen gestreut wird (Phononen), wird Brillouin-Streuung genannt. Brillouin-Streuung ist typischerweise um 0,1 bis 1 Wellenzahl von dem einfallenden Licht verschoben. Licht, das aufgrund von Vibrationen in Molekülen oder optischen Phononen in undurchsichtigen Feststoffen gestreut wird, wird Raman-Streuung genannt. Raman-gestreutes Licht wird um soviel wie 4000 Wellenzahlen von dem einfallenden Licht verschoben. Spezifische Streuungsspektroskopische Verfahren schließen Raman-Spektroskopie ein.
IR-Spektroskopie ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Mittel- Infrarotlicht durch eine Probe. Mittel-Infrarotlicht (2,5-50 um, 4000-200 cm&supmin;¹) ist energetisch ausreichend, um molekulare Vibrationen auf höhere Energieniveaus anzuregen. Die Wellenlänge von IR-Absorptionsbanden sind charakteristisch für spezifische Typen chemischer Bindung, und IR-Spektroskopie ist im allgemeinen am nützlichsten zur Identifizierung von organischen und organometallischen Molekülen.
Nah-Infrarot-Absorptionsspektroskopie (NIR) ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Nah-Infrarotlicht durch eine Probe. Nah-Infrarotlicht überspannt den 800 nm - 2,5 um (12.500-4000 cm&supmin;¹-Bereich und ist energetisch ausreichend, um Obertöne und Kombinationen von Molekülvibrationen auf höhere Energieniveaus anzuregen. NIR- Spektroskopie wird typischerweise zur quantitativen Messung organischer funktioneller Gruppen verwendet, insbesondere O-H, N-H und C=O. Die Bestandteile und die Konstruktion der NIR-Instrumentierung sind UV-vis-Absorptions-Spektrometern ähnlich. Die Lichtquelle ist gewöhnlich eine Wolframlampe, und der Detektor ist gewöhnlich ein PbS-Festzustands- Detektor. Probenhalter können Glas oder Quarz sein, und typische Lösungsmittel sind CCl&sub4; und CS2. Die bequeme Instrumentierung von NIR-Spektroskopie macht sie geeignet für Online-Überwachung und -Verarbeitungskontrolle.
Ultraviolett und sichtbare Absorptions-Spektroskopie (UV-vis)-Spektroskopie ist die Messung der Wellenlänge und Intensität von Absorption von Nah-Ultraviolett und sichtbarem Licht durch eine Probe. Absorption im Vakuum-UV findet bei 100-200 nm statt; (10&sup5;- 50.000 cm&supmin;¹) Quarz-UV bei 200-350 nm; (50.000-28.570 cm&supmin;¹) und sichtbares bei 350- 800 nm; (28.570-12.500 cm&supmin;¹) und wird durch das Beer-Lambert-Bouguet-Gesetz beschrieben. Ultraviolettes und sichtbares Licht sind energetisch ausreichend, um äußere Elektronen auf höhere Energieniveaus anzuregen. UV-vis-Spektroskopie kann gewöhnlicherweise auf Moleküle und anorganische Ionen oder Komplexe in Lösungen angewandt werden. Die UV- vis-Spektren sind durch die breiten Merkmale der Spektren begrenzt. Die Lichtquelle ist gewöhnlich eine Wasserstoff oder Deuterium-Lampe für UV-Messungen und eine Wolfram- Lampe für sichtbare Messungen. Die Wellenlängen dieser kontinuierlichen Lichtquellen werden mit einem Wellenlängen-Separator ausgewählt, wie etwa einem Prisma oder einem Gitter-Monochromator. Spektren werden durch Abtasten mit dem Wellenlängen-Separator erhalten, und quantitative Messungen können von einem Spektrum oder bei einer einzelnen Wellenlänge gemacht werden.
Massenspektrometer verwenden den Unterschied im Verhältnis Masse-zu-Ladung (m/z) von ionisierten Atomen oder Molekülen, um sie voneinander zu trennen. Massenspektrometrie ist deshalb zur Quantifizierung von Atomen oder Molekülen und ebenso zum Bestimmen von chemischen und strukturellen Informationen über Moleküle nützlich. Moleküle haben unterschiedliche Fragmentierungsmuster, die strukturelle Informationen bereitstellen, um Verbindungen zu identifizieren. Der allgemeine Betrieb eines Massenspektrometers ist wie folgt. Gasphase-Ionen werden erzeugt, die Ionen werden in Raum oder Zeit auf der Grundlage ihres Verhältnisses Masse-zu-Ladung getrennt, und die Quantität der Ionen jedes Verhältnisses Masse-zu-Ladung wird gemessen. Die Ionentrennkraft eines Massenspektrometers wird durch die Auflösung beschrieben, die definiert ist als R = m / delta m, wobei m die Ionenmasse ist und delta m der Unterschied in Masse zwischen zwei auflösbaren Spitzen in einem Massenspektrum. Zum Beispiel kann ein Massenspektrometer mit einer Auflösung von 1000 ein Ion mit einer m/z von 100,0 von einem Ion mit einer m/z von 100,1 auflösen.
Im allgemeinen besteht ein Massenspektrometer (MS) aus einer Ionenquelle, einem massenselektiven Analysator und einem Ionendetektor. Die Magnetsektor-, Quadrupol- und Flugzeit- Konstruktionen erfordern ebenso Extraktions- und Beschleunigungs-Ionenoptiken, um Ionen aus der Quellregion in den Massenanalysator zu überführen. Die Details mehrerer Massenanalysatorkonstruktionen (für Magnetsektor-MS, Quadrupol-MS oder Flugzeit-MS) werden unten diskutiert. Einzelne Fokussierungsanalysatoren für Magnetsektor-MS verwenden einen Teilchenstrahlweg von 180, 90 oder 60 Grad. Die verschiedenen Kräfte, die das Teilchen beeinflussen, trennen Ionen mit unterschiedlichen Masse/Ladung-Verhältnissen auf. Mit Doppelfokussierungs-Analysatoren wird ein elektrostatischer Analysator bei diesem Typ von Instrument zugefügt, um Teilchen mit Unterschieden hinsichtlich der kinetischen Energien zu trennen.
Ein Quadrupol-Massenfilter für Quadrupol-MS besteht aus vier Metallstangen, die parallel angeordnet sind. Die angelegten Spannungen beeinflussen die Bahn von Ionen, die sich entlang des Flugwegs bewegen, der zwischen den vier Stäben zentriert ist. Für gegebene Gleich- und Wechselspannungen laufen nur Ionen eines bestimmten Masse/Ladungs-Verhältnisses durch den Quadrupolfilter, und alle anderen Ionen werden aus ihrem ursprünglichen Weg herausgeworfen. Ein Massenspektrum wird durch Überwachen der Ionen erhalten, die durch den Quadrupolfilter laufen, während die Spannungen auf den Stäben variiert werden.
Ein Flugzeit-Massenspektrometer verwendet die Unterschiede hinsichtlich der Durchgangszeit durch eine "Drift-Region", um Ionen verschiedener Massen zu trennen. Er arbeitet in einem pulsierten Modus, so daß Ionen in Pulsen produziert und/oder in Pulsen extrahiert werden müssen. Ein gepulstes elektrisches Feld beschleunigt alle Ionen in eine feldfreie Drift- Region mit einer kinetischen Energie von qV, wobei q die Ionenladung und V die angelegte Spannung ist. Da die ionenkinetische Energie 0,5 mV² ist, haben leichtere Ionen eine höhere Schnelligkeit als schwerere Ionen und erreichen den Detektor am Ende der Drift-Region früher. Der Ausgang eines Ionendetektors wird auf einem Oszilloskop als eine Funktion der Zeit dargestellt, um das Massenspektrum zu erzeugen.
Der Ionenbildungsprozeß ist der Ausgangspunkt für massenspektrometrische Analysen. Chemische Ionisation ist ein Verfahren, das ein Reagens-Ion verwendet, um mit den Analyten- Molekülen (Markierungen) zu reagieren, um Ionen zu bilden durch entweder eine Proton- oder Hydridtransfer. Die Reagens-Ionen werden produziert durch Einführen eines großen Überschusses an Methan (relativ zu der Markierung) in eine Elektronenstoß(EI)-Ionenquelle. Elektronenzusammenstöße produzieren CH&sub4;&spplus; und CH&sub3;&spplus;, die weiter mit Methan reagieren, um CH&sub5;&spplus; und C&sub2;H&sub5;&spplus; zu bilden. Ein anderes Verfahren, um Markierungen zu ionisieren, ist durch Plasma und Glühentladung. Plasma ist ein heißes, teilweise ionisiertes Gas, das im Effekt Atome anregt und ionisiert. Eine Glühentladung ist ein Plasma unter niedrigem Druck, das zwischen zwei Elektroden gehalten wird. Elektronenstoß-Ionisation verwendet einen Elektronenstrahl, gewöhnlich erzeugt aus einem Wolframfilament, um Gasphasenatome oder - moleküle zu ionisieren. Ein Elektron aus dem Strahl schlägt ein Elektron aus Analytenatomen oder -molekülen heraus, um Ionen zu erzeugen. Elektrospray-Ionisation verwendet eine sehr feine Nadel und eine Reihe von Abstreifern. Eine Probenlösung wird in die Quellenkammer gesprüht, um Tröpfchen zu bilden. Die Tröpfchen tragen Ladung, wenn sie aus der Kapillare austreten, und während das Lösungsmittel verdampft, verschwinden die Tröpfchen, wobei sie hochgeladene Analytenmoleküle hinterlassen. ESI ist besonders nützlich für große biologische Moleküle, die schwierig zu verdampfen oder ionisieren sind. Bombardierung mit schnellen Atomen (FAB) verwendet einen Hochenergiestrahl neutraler Atome, typischerweise Xe oder Ar, der auf eine fest Probe trifft, was Desorption und Ionisation verursacht. Es wird verwendet für große biologische Moleküle, die schwierig in die Gasphase zu bringen sind. FAB verursacht wenig Fragmentierung und ergibt gewöhnlicherweise einen großen Molekülionenpeak, was sie nützlich macht für Bestimmungen des Molekulargewichts. Der Atomstrahl wird erzeugt durch Beschleunigen von Ionen aus einer Ionenquelle durch eine Ladungsaustauschzelle. Die Ionen nehmen ein Elektron bei Kollisionen mit neutralen Atomen auf, um einen Strahl von Hochenergieatomen zu bilden. Laserionisation (LIMS) ist ein Verfahren, bei dem ein Laserpuls Material von der Oberfläche einer Probe ablöst und ein Mikroplasma erzeugt, das einige der Probenbestandteile ionisiert. Matrix-assistierte Laserdesorptions-Ionisation (MALSI) ist ein LIMS-Verfahren zum Verdampfen und Ionisieren von großen biologischen Molekülen, wie etwa Proteinen oder DNA-Fragmenten. Die biologischen Moleküle werden in einer festen Matrix, wie etwa Nicotinsäure, zerstreut. Ein UV-Laser-Puls löst die Matrix ab, die einige der großen Moleküle in einer ionisierten Form in die Gasphase trägt, so daß sie in einen Massenspektrometer extrahiert werden können. Plasmadesorptionsionisation (PD) verwendet den Zerfall von ²&sup5;²Cf, was zwei Fissionsfragmente erzeugt, die sich in entgegengesetzte Richtungen bewegen. Ein Fragment trifft auf die Probe, was 1-10 Analytenionen herausschlägt. Das andere Fragment trifft auf einen Detektor und löst den Start der Datenaufnahme aus. Dieses Ionisationsverfahren ist besonders nützlich für große biologische Moleküle. Resonanzionisation (RIMS) ist ein Verfahren, bei dem ein oder mehrere Laserstrahlen in Resonanz mit Übergängen eines Gasphasenatoms oder -moleküls eingestellt werden, um es schrittweise über sein Ionisationspotential zu heben, um ein Ion zu erzeugen. Sekundärionisation (SIMS) verwendet einen Ionenstrahl, wie etwa ³He&spplus;, ¹&sup6;O&spplus;, oder &sup4;&sup0;Ar&spplus;; wird auf die Oberfläche einer Probe fokussiert und versprüht Material in die Gasphase. Funkenquelle ist ein Verfahren, das Analyten in festen Proben durch Pulsen eines elektrischen Stroms über zwei Elektroden ionisiert.
Eine Markierung kann geladen werden vor, während oder nach der Spaltung von dem Molekül, an das sie angehängt ist. Ionisationsverfahren, auf der Grundlage von Ionen- "Desorption", der direkten Bildung oder Emission von Ionen aus festen oder flüssigen Oberflächen, haben die verstärkte Anwendung auf nicht-flüchtige und thermisch labile Verbindun gen ermöglicht. Diese Verfahren eliminieren den Bedarf nach der Verflüchtigung neutraler Moleküle vor der Ionisation und minimieren im allgemeinen den thermischen Abbau der molekularen Spezies. Diese Verfahren schließen Felddesorption (Becky, Principles of Field Ionisation and Field Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford, 1977), Plasmadesorption (Sundqvist und Macfarlane, Mass Spectrom. Rev. 4: 421, 1985), Laserdesorption (Karas und Hillenkamp, Anal. Chem. 60: 2299, 1988, Karas et al., Angew. Chem. 101: 805, 1989), Bombardierung mit schnellen Teilchen (z. B. Bombardierung mit schnellen Atomen, FAB, und Sekundärionen-Massenspektrometrie, SIMS, Barber et al. Anal. Chem. 58: 54: 645A, 1982) und Thermospray (TS)-Ionisation (Vestal, Mass Spectrom. Rev. 2: 447, 1983) ein. Thermospray wird verbreitet auf die Online-Kombination mit Flüssigchromatographie angewendet. Die kontinuierlichen Fluß-FAB-Verfahren (Caprioli et al., Anal. Chem. 58: 2949, 1986) haben ebenso signifikantes Potential gezeigt. Ein vollständigeres Auflisten von Ionisations- Massenspektrometrie-Kombinationen ist: Ionenfallen-Massenspektrometrie, Elektrospray- Ionisations-Massenspektrometrie, Ionenspray-Massenspektrometrie, Flüssigionisations- Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation bei atmosphärischem Druck, Elektronenionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Bombardierung mit metastabilen Atomen, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Bombardierung mit schnellen Atomen, MALDI-Massenspektrometrie, Photo-Ionisations-Flugzeit- Massenspektrometrie, Lasertröpfchen-Massenspektrometrie, MALDI-TOF- Massenspektrometrie, APCI-Massenspektrometrie, Nanospray-Masserispektrometrie, Nebelspray-Ionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit chemischer Ionisation, Resonanz-Ionisations-Massenspektrometrie, Sekundär-Ionisations-Massenspektrometrie, Thermospray-Massenspektrometrie.
Die Ionisationsverfahren, die für nicht-flüchtige biologische Verbindungen zugänglich sind, haben überlappende Bereiche der Anwendbarkeit. Ionisationswirksamkeiten sind hochabhängig von Matrixzusammensetzung und Verbindungstyp. Gegenwärtig verfügbare Resultate zeigen an, daß die obere Molekülmasse für TS ungefähr 8000 Dalton ist (Jones und Krolik, Rapid Comm. Mass Spectrom. 1: 67, 1987). Da TS hauptsächlich mit Quadrupol- Massenspektrometern praktiziert wird, leidet die Empfindlichkeit typischerweise disporportional bei höheren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen (m/z). Flugzeit-(TOF)- Massenspektrometer sind kommerziell erhältlich und besitzen den Vorteil, daß der m/z- Bereich nur durch die Detektor-Effizienz begrenzt ist. Vor kurzem sind zwei zusätzliche Ionisationsverfahren eingeführt worden. Diese beiden Verfahren werden jetzt als Matrix assistierte Laserdesorption (MALDI, Karas und Hillenkamp, Anal. Chem. 60 : 2299, 1988; Karas et al., Angew. Chem. 101: 805, 1989) und Elektrospray-Ionisation (ESI) bezeichnet. Beide Methodologien haben sehr hohe Ionisationseffizienz (d. h. sehr hoch [erzeugte Molekülionen]/[verbrauchte Moleküle]). Die Empfindlichkeit, die das letztendliche Potential der Technik definiert, hängt ab von der Probengröße, Quantität der Ionen, Durchflußrate, Nachweiseffizienz und tatsächlicher Ionisationseffizienz.
Elektrospray-MS beruht auf einer Idee, die zuerst in den 1960ern vorgeschlagen worden ist (Dole et al., J. Chem. Phys. 49: 2240, 1968). Elektrospray-Ionisation (ESI) ist ein Mittel, um geladene Moleküle zur Analyse durch Massenspektroskopie zu erzeugen. Kurz gesagt, erzeugt Elektrospray-Ionisation hochgeladene Tröpfchen durch Vernebeln von Flüssigkeiten in einem starken elektrostatischen Feld. Die hochgeladenen Tröpfchen, die allgemein in einem Trockenbadgas bei Atmosphärendruck gebildet werden, schrumpfen durch Verdampfen des neutralen Lösungsmittels, bis die Ladungsabstoßung die kohäsiven Kräfte überwindet, was zu einer "Coulomb'schen Explosion" führt. Der exakte Mechanismus der Ionisation ist kontrovers, und mehrere Gruppen haben Hypothesen aufgestellt (Blades et al., Anal. Chem. 63: 2109-14, 1991; Kebarle et al., Anal. Chem. 65: A972-86, 1993; Fenn, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 4: 524-35, 1993). Ohne Rücksicht auf den letztendlichen Prozeß der Ionenbildung produziert ESI geladene Moleküle aus Lösung unter milden Bedingungen.
Die Fähigkeit, nützliche massenspektrale Daten an kleinen Mengen eines organischen Moleküls zu erhalten, hängt von der effizienten Produktion von Ionen ab. Die Effizienz der Ionisation für ESI steht in Bezug zu dem Ausmaß der positiven Ladung, die mit dem Molekül assoziiert ist. Experimentelle Verbesserung der Ionisation hat gewöhnlicherweise das Verwenden von sauren Bedingungen beinhaltet. Ein anderes Verfahren, um die Ionisation zu verbessern, ist es gewesen, quartäre Amine, wenn möglich, zu verwenden (siehe Aebersold et al., Protein Science 1: 494-503; 1992; Smith et al., Anal. Chem. 60: 436-41. 1988).
Elektrospray-Ionisation wird in größerem Detail wie folgt beschrieben. Elektrospray- Ionenerzeugen erfordert zwei Schritte: Verteilung von hochgeladenen Tröpfchen bei nahezu Atmosphärendruck, gefolgt von Bedingungen zum Induzieren von Verdampfung. Eine Lösung von Analyten-Molekülen wird durch eine Nadel geführt, die auf hohem elektrischen Potential gehalten wird. Am Ende der Nadel zerteilt sich die Lösung in einen Nebel kleiner hochgeladener Tröpfchen, die die Analytenmoleküle enthalten. Die kleinen Tröpfchen ver dampfen schnell, und durch einen Prozeß der Felddesorption oder Restevaporation werden protonierte Proteinmoleküle in die Gasphase freigesetzt. Ein Elektrospray wird im allgemeinen durch Anwendung eines hohen elektrischen Feldes auf einen kleinen Fluß von Flüssigkeit (im allgemein 1-10 ul/min) aus einem Kapillarröhrchen erzeugt. Eine Potentialdifferenz von 3-6 kV wird typischerweise zwischen der Kapillare und der 0,2-2 cm entfernt befindlichen Gegenelektrode angelegt (wo Ionen, geladene Cluster und sogar geladene Tröpfchen, abhängig von dem Grad der Desolvation, durch das MS durch eine kleine Öffnung untersucht werden können). Das elektrische Feld führt zu einer Ladungsakkumulation auf der Flüssigoberfläche am Kapillarterminus; damit sind die Flüssigkeitsflußrate, Widerstandsfähigkeit und Oberflächenspannung wichtige Faktoren bei der Erzeugung von Tröpfchen. Das hohe elektrische Feld führt zu einem Zerreißen der Flüssigkeitsoberfläche und Bildung von hochgeladenen flüssigen Tröpfchen. Positiv oder negativ geladene Tröpfchen können erzeugt werden, abhängig von der kapillaren Vorspannung. Der Negativ-Ionen-Modus erfordert das Vorhandensein eines Elektronenfängers, wie etwa Sauerstoff, um elektrische Entladungen zu inhibieren.
Ein weiter Bereich von Flüssigkeiten kann elektrostatisch in Vakuum gesprüht werden oder mit der Hilfe eines Vernebelungsmittels. Die Verwendung von nur elektrischen Feldern zur Vernebelung führt zu einigen praktischen Einschränkungen auf dem Bereich der Flüssigkeitsleitfähigkeit und dielektrischen Konstante. Lösungs-Leitfähigkeit von weniger als 10&supmin;&sup5; Ohm ist erforderlich bei Zimmertemperatur für ein stabiles Elektrospray bei nützlichen Flüssigkeitsflußraten, entsprechend einer wäßrigen Elektrolytlösung von < 10&supmin;&sup4; M. In dem für ESI-MS am nützlichsten befundenen Modus führt eine angemessene Flüssigkeitsflußrate zur Zerstreuung der Flüssigkeit als einen feinen Nebel. In einer kurzen Distanz von der Kapillare ist der Tröpfchendurchmesser oft ziemlich uniform und von der Größenordnung von 1 um. Von besonderer Wichtigkeit ist, daß der gesamte Elektrospray-Ionenstrom nur geringfügig ansteigt für höhere Flüssigkeitsflußraten. Es gibt Hinweise darauf, daß Erwärmen zum Manipulieren des Elektrosprays nützlich ist. Z. B. ermöglicht geringfügiges Erwärmen, daß wäßrige Lösungen leicht in Elektrospray überführt werden können, vermutlich aufgrund der verringerten Viskosität und Oberflächenspannung. Sowohl thermisch assistierte als auch Gas- Vernebelungs-assistierte Elektrosprays ermöglichen, daß höhere Flüssigkeitsflußraten verwendet werden, senken aber das Ausmaß der Tröpfchenladung. Die Bildung von Molekülionen erfordert Bedingungen, die eine Verdampfung der anfänglichen Tröpfchenpopulation bewirken. Dies kann bei höheren Drücken durch einen Strom von trockenem Gas bei mäßigen Temperaturen (< 60ºC), durch Erwärmen während des Transports durch die Schnittstelle und (besonders im Fall von Ionenfallen-Verfahren) durch energetische Kollisionen bei relativ niedrigen Drücken erreicht werden.
Obwohl die detaillierten Prozesse, die ESI zugrundeliegen, unsicher bleiben, scheinen die sehr kleinen Tröpfchen, die durch ESI produziert werden, es zu ermöglichen, daß beinahe jede Spezies, die eine Nettoladung in Lösung trägt, in die Gasphase nach Verdampfung von Restlösungsmittel überführt wird. Massenspektrometrischer Nachweis erfordert dann, daß die Ionen nach Desolvatisierung einen behandelbaren m/z-Bereich (< 4000 Dalton für Quadrupol- Instrumente) haben sowie mit ausreichender Effizienz erzeugt und überführt werden können. Der weite Bereich von gelösten Stoffen, von denen bereits gefunden wurde, daß sie ESI-MS zugänglich sind, und der Mangel an wesentlicher Abhängigkeit der Ionisationseffizienz vom Molekulargewicht legen einen in hohem Maße nicht-diskriminierenden und breit anwendbaren Ionisationsprozeß nahe.
Die Elektrospray-Ionen-"Quelle" arbeitet bei nahezu atmosphärischem Druck. Die Elektrospray-"Quelle" ist typischerweise eine Metall- oder Glaskapillare, die ein Verfahren zur elektrischen Vorspannung der flüssigen Lösung relativ zu einer Gegenelektrode umfaßt. Lösungen, typischerweise Wasser-Methanol-Mischungen, die den Analyten und oft andere Zusatzstoffe, wie etwa Essigsäure enthalten, fließen zu dem Kapillarterminus. Eine ESI-Quelle ist beschrieben worden (Smith et al., Anal. Chem. 62: 885, 1990), die im wesentlichen jedes Lösungsmittelsystem unterbringen kann. Typische Flußraten für ESI sind 1-10 ul/min. Das Haupterfordernis einer ESI-MS-Schnittstelle ist es, Ionen so wirkungsvoll wie möglich zu samplen und aus dem Bereich hohen Drucks in das MS zu transportieren.
Die Wirksamkeit von ESI kann sehr hoch sein, was die Grundlage für extrem empfindliche Messungen legt, was nützlich für die hierin beschriebene Erfindung ist. Gegenwärtige Instrumentenleistung kann einen Gesamt-Jonenstrom am Detektor von ungefähr 2 · 10&supmin;¹² A oder ungefähr 10&sup7; Zählungen/s für einzeln geladene Spezies bereitstellen. Auf der Grundlage der Instrumentenleistung werden Konzentrationen, so niedrig wie 10&supmin;¹&sup0; M oder ungefähr 10&supmin;¹&sup8; Mol/s einer einzeln geladenen Spezies einen nachweisbaren Ionenstrom ergeben (ungefähr 10 Zählungen/s), wenn der Analyt vollständig ionisiert ist. Z. B. sind niedrige Attomol- Nachweisgrenzen fir quartäre Ammoniumionen unter Verwendung einer ESI-Schnittstelle mit Kapillarzonenelektrophorese erhalten worden (Smith et al., Anal. Chem. 59: 1230, 1988). Für eine Verbindung vom Molekulargewicht 1000 ist die durchschnittliche Anzahl an Ladungen 1, die näherungsweise Zahl von Ladungszuständen ist 1, die Peak-Breite (m/z) ist 1 und die maximale Intensität (Ion/s) ist 1 · 10¹².
Bemerkenswert wenig Probe wird tatsächlich beim Erhalten eines ESI-Massenspektrum verbraucht (Smith et al., Anal. Chem. 60: 1948, 1988). Erhebliche Gewinne können ebenso durch die Verwendung von Array-Detektoren mit Sektor-Instumenten erzielt werden, was den gleichzeitigen Nachweis von Teilen des Spektrums ermöglicht. Da gegenwärtig nur 10&supmin;&sup5; aller durch ESI gebildeten Ionen nachgewiesen werden, kann die Aufmerksamkeit gegenüber Faktoren, die die Instrumentenleistung beschränken, eine Grundlage bereitstellen für erhöhte Empfindlichkeit. Es wird für Fachleute offensichtlich sein, daß die vorliegende Erfindung Verbesserungen bei den Ionisations- und Nachweismethodologien in Erwägung zieht und miteinbezieht.
Bevorzugt wird eine Schnittstelle zwischen das Auftrennungsinstrument (z. B. Gel) und den Detektor (z. B. Massenspektrometer) gebracht. Die Schnittstelle hat vorzugsweise die folgenden Eigenschaften: (1) die Fähigkeit, die DNA-Fragmente in diskreten Zeitintervallen zu sammeln, (2) die DNA-Fragmente zu konzentrieren, (3) die DNA-Fragmente aus den Elektrophorese-Puffern und -Milieu zu entfernen, (4) die Markierung von dem DNA-Fragment abzuspalten, (5) die Markierung von dem DNA-Fragment abzutrennen, (6) das DNA- Fragment zu verwerfen, (7) die Markierung in eine flüchtige Lösung zu plazieren, (8) die Markierung zu verflüchtigen und zu ionisieren und (9) die Markierung in eine Elektrospray- Vorrichtung zu bringen oder zu transportieren, die die Markierung in einen Massenspektrometer einführt.
Die Schnittstelle hat ebenso die Fähigkeit, DNA-Fragmente zu "sammeln", während sie aus dem Boden eines Gels eluieren. Das Gel kann aus einem Slabgel, einem Röhrengel, einer Kapillare etc. bestehen. Die DNA-Fragmente können durch mehrere Verfahren gesammelt werden. Das erste Verfahren ist das der Verwendung eines elektrischen Felds, wobei DNA- Fragmente auf oder nahe einer Elektrode gesammelt werden. Ein zweites Verfahren ist das, bei dem die DNA-Fragmente durch Leiten eines Flüssigkeitsstroms am Boden eines Gels vorbei gesammelt werden. Aspekte beider Verfahren können kombiniert werden, wobei die DNA in einem fließenden Strom gesammelt wird, der später durch Verwendung eines elektrischen Felds konzentriert werden kann. Das Endresultat ist das, daß DNA-Fragmente aus dem Milieu, unter dem das Auftrennungsverfahren durchgeführt wurde, entfernt werden. D. h. DNA-Fragmente können von einem Lösungstyp zu einem anderen durch Verwendung eines elektrischen Felds "gezogen" werden.
Wenn die DNA-Fragmente in der geeigneten Lösung sind (kompatibel mit Elektrospray- und Massenspektrometrie), kann die Markierung von dem DNA-Fragment abgespalten werden. Das DNA-Fragment (oder Reste davon) kann dann von der Markierung durch Anlegen eines elektrischen Felds getrennt werden (vorzugsweise hat die Markierung gegenteilige Ladung zu der DNA-Markierung). Die Markierung wird dann in die Elektrospray-Vorrichtung durch die Verwendung eines elektrischen Felds oder einer strömenden Flüssigkeit eingeführt.
Fluoreszenz-Markierungen können am direktesten durch ihre Absorptions- und Fluoreszenz- Emissions-Wellenlängen und -Intensitäten identifiziert und quantifiziert werden.
Während ein herkömmlicher Spektrofluorometer extrem flexibel ist, und kontinuierliche Bereiche der Anregungs- und Emissions-Wellenlängen (1Ex, 1S1, 1S2) bereitstellt, erfordern spezialisierte Instrumente, wie etwa Flußcytometer oder Laser-Scanning-Mikroskope Sonden, die bei einer einzelnen festgelegten Wellenlänge anregbar sind. Bei gegenwärtigen Instrumenten ist dies gewöhnlich die 488 nm-Linie des Argon-Lasers.
Fluoreszenz-Intensität pro Sondenmolekül ist proportional dem Produkt aus e und QY. Der Bereich dieser Parameter unter Fluorophoren von gegenwärtiger praktischer Wichtigkeit ist näherungweise 10.000 bis 100.000 cm&supmin;¹M&supmin;¹ für &epsi; und 0,1 bis 1,0 für QY. Wenn die Absorption durch hochintensive Beleuchtung in Richtung Sättigung getrieben wird, wird die irreversible Zerstörung des angeregten Fluorophors (Fotobleichung) der Faktor, der die Fluoreszenz- Nachweisbarkeit limitiert. Die praktische Auswirkung der Fotobleichung hängt von der jeweiligen Fluoreszenz-Nachweistechnik ab.
Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, daß eine Vorrichtung (eine Schnittstelle) zwischen die Trenn- und Nachweisschritte gebracht werden kann, um den kontinuierlichen Betrieb der Größentrennung und des Markierungsnachweises (in Echtzeit) zu erlauben. Dies vereinigt die Trennungsmethodologie und -Instrumentierung mit der Nachweismethodologie und -Instrumentierung, was eine einzelne Vorrichtung ergibt. Z. B. ist eine Schnittstelle zwi schen eine Trennungstechnik und den Nachweis durch Massenspektrometrie oder potentiostatische Amperometrie zwischengeschaltet.
Die Funktion der Schnittstelle ist hauptsächlich die Freisetzung der (z. B. Massenspektrometrie) Markierung vom Analyten. Es gibt mehrere repräsentative Implementierungen der Schnittstelle. Die Konstruktion der Schnittstelle hängt ab von der Auswahl an spaltbaren Linkem. Im Falle von licht- oder photospaltbaren Linkem ist eine Energie- oder Photonenquelle erforderlich. Im Fall eines säurelabilen Linkers, eines basenlabilen Linkers oder eines Disulfid-Linkers ist die Zugabe von Reagens in der Schnittstelle erforderlich. Im Falle von wärmelabilen Linkem ist eine Energiewärmequelle erforderlich. Enzymzugabe ist für einen enzymempfindlichen Linker erforderlich, wie etwa eine spezifische Protease und einen Peptid- Linker, eine Nuklease und einen DNA- oder RNA-Linker, eine Glykosylase, HRP oder Phosphatase und einen Linker, der nach Spaltung instabil ist (ähnlich zu chemilumineszenten Substraten). Andere Eigenschaften der Schnittstelle schließen minimale Bandenverbreiterung, Trennung der DNA von Markierungen vor der Injektion in einen Massenspektrometer ein. Trenntechniken schließen diejenigen ein, die auf Elektrophorese-Verfahren und -Techniken, Affinitätstechniken, Größenretention, Dialyse, Filtration und ähnlichem beruhen.
Es ist ebenso möglich, die Markierungen (oder das Nukleinsäure-Linker-Markierungs- Konstrukt) zu konzentrieren, elektrophoretisch einzufangen und dann in einen alternativen Reagensstrom freizusetzen, der mit dem ausgewählten bestimmten Ionisations-Verfahrenstyp kompatibel ist. Die Schnittstelle kann ebenso in der Lage sein, Markierungen (oder das Nukleinsäure-Linker-Markierungs-Konstrukt) auf Mikroperlen einzufangen, die Perle(n) in eine Kammer einzuschießen und dann Laser-Desorption/Verdampfung durchzuführen. Es ist ebenso möglich, im Fluß in einen alternativen Puffer hineinzuextrahieren (z. B. aus Kapillarelektrophoresepuffer in hydrophobe Puffer über eine permeable Membran). Es kann ebenso bei einigen Verwendungen wünschenswert sein, Markierungen in den Massenspektrometer intermittierend abzugeben, was eine weitere Funktion der Schnittstelle umfassen würde. Eine andere Funktion der Schnittstelle ist es, Markierungen aus vielfachen Säulen in einen Massenspektrometer abzugeben, mit einem rotierenden Zeitspalt für jede Säule. Es ist ebenso möglich, Markierungen aus einer einzelnen Säule in Vielfach-MS-Detektoren, getrennt durch Zeit, abzugeben, jeden Satz von Markierungen für einige wenige Millisekunden zu sammeln und dann an einen Massenspektrometer abzugeben.
Das folgende ist eine Liste repräsentativer Verkäufer für Trenn- und Nachweistechnologien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Hoefer Scientific Instruments (San Francisco, CA), stellt Elektrophorese-Ausrüstung her (Two StepTM, Poker Face TM II) für Sequenzieranwendungen. Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) stellt Elektrophorese- Ausrüstung für DNA-Trennungen und -Sequenzierung her (PhastSystem für PCR-SSCP- Analyse, MacroPhor-System für die DNA-Sequenzierung). Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (ABI, Foster City, CA) stellt semi-automatisierte Sequenzierer auf der Grundlage von Fluoreszenzfarbstoffen her (ABI373 und ABI377). Analytical Spectral Devices (Boulder, CO) stellt UV-Spektrometer her. Hitachi Instruments (Tokyo, Japan) stellt Atomabsorptionsspektrometer, Fluoreszenz-Spektrometer, LC- und GC-Massenspektrometer, NMR-Spektrometer und UV-VIS-Spektrometer her. PerSeptive Biosystems (Framingham, MA) stellt Massenspektrometer (VoyagerTM Elite) her. Bruker Instruments Inc. (Manning Park, MA), stellt FTIR-Spektrometer (Vector 22), FT-Raman-Spektrometer, Flugzeit- Massenspektrometer (Reflex IITM), Ionenfallen-Massenspektrometer (EsquireTM) und einen Maldi Massenspektrometer her. Analytical Technology Inc. (ATI, Boston, MA) macht Kapillar-Gelelektrophorese-Einheiten, UV-Detektoren und Dioden-Array-Detektoren. Teledyne Electronic Technlologies (Mountain View, CA) stellt einen Ionenfallen-Massenspektrometer (3DQ DiscoveryTM und den 3DQ ApogeeTM) her. Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (Foster City, CA) stellt einen Sciex-Massenspektrometer her (Dreifachquadrupol LC/MS/MS, den API 100/300), der mit Elektrospray kompatibel ist. Hewlett-Packard (Santa Clara, CA) stellt massenselektive Detektoren (HP 5972A), MALDI-TOF Massenspektrometer (HP G2025A), Dioden-Array-Detektoren, CE-Einheiten, HPLC- Einheiten (HP1090), sowie UV- Spektrometer her. Finnigan Corporation (San Jose, CA) stellt Massenspektrometer (Magnetsektor (MAT 95 STM), Quadrupol-Spektrometer (MAT 95 5QTM) und vier andere verwandte Massenspektrometer her. Rainin (Emeryville, CA) stellt HPLC-Instrumente her.
Die hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen erlauben die Verwendung von abgespaltenen Markierungen, um als Karten für bestimmte Probentypen und Nukleotid- Identitäten zu dienen. Am Beginn eines jeden Sequenzierverfahrens wird einem bestimmten (ausgewählten) Primer eine bestimmte einzigartige Markierung zugeordnet. Die Markierungen kartieren auf entweder einen Probentyp, einen Didesoxyterminator-Typ (im Fall einer Sanger-Sequenzierreaktion) oder vorzugsweise beide. Insbesondere kartiert die Markierung auf einen Primertyp, der seinerseits auf einen Vektortyp kartiert, der seinerseits auf eine Probenidentität kartiert. Die Markierung kann ebenso auf einen Didesoxyterminator-Typ kartie ren (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP) durch Bezug darauf, in welche Didesoxynukleotid- Reaktion der markierte Primer gegeben wird. Die Sequenzierungsreaktion wird dann durchgeführt, und die resultierenden Fragmente werden sequenziell nach ihrer Größe mit der Zeit aufgetrennt.
Die Markierungen werden von den Fragmenten in einem Zeitrahmen abgespalten und in einem Zeitrahmen gemessen und aufgenommen. Die Sequenz wird durch Vergleich der Markierungskarte mit dem Zeitrahmen konstruiert. D. h. alle Markierungsidentitäten werden über die Zeit nach dem Größentrennungsschritt aufgenommen und werden miteinander in einem Zeitrahmen in Beziehung gesetzt. Der Größentrennungsschritt trennt die Nukleinsäurefragmente durch ein Inkrement von einem Nukleotid, und deshalb sind die verwandten Markierungsidentitäten durch ein Inkrement von einem Nukleotid getrennt. Durch Vorkenntnis der Didesoxyterminator- oder Nukleotid-Karte und des Probentyps wird die Sequenz leicht auf eine lineare Weise abgeleitet.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
Sofern nicht anders angegeben, können Chemikalien, wie sie in den Beispielen verwendet werden, von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, erhalten werden. Die folgenden Abkürzungen mit den angezeigten Bedeutungen werden hierin verwendet:
ANP = 3-(Fmoc-amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure
NBA = 4-(Fmoc-aminomethyl)-3-nitrobenzoesäure
HATU = O-7-Azabenzotriazol-1-yl-N,N,N',N' -Tetramethyluroniumhexafluorphosphat
DIEA = Diisopropylethylamin
MCT = Monochlortriazin
NMM = 4-Methylmorpholin
NMP = N-Methylpyrrolidon
ACT357 = ACT357-Peptidsynthesizer von Advanced ChemTech, Inc. Louisville, KY
ACT = Advanced ChemTechn, Inc., Louisville, KY
Novaßiochem = CalBiochem-Novaßiochem International, San Diego, CA
TFA = Trifluoressigsäure
Tfa = Trifluoracetyl
iNIP = N-Methylisonipecotinsäure
Tfp = Tetrafluorphenyl
DIAEA = 2-(Diisopropylamino)ethylamin
MCT = Monochlortriazen
5'-AH-ODN = Oligodesoxynukleotid mit 5'-Aminohexyl-Schwanz

BEISPIELE

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG VON SÄURELABILEN LINKERN ZUR VERWENDUNG BEIM SEQUENZIEREN MIT ABSPALTBAREN MW-IDENTIFIKATOREN

A. Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch abspaltbaren Massenspektroskopie-Markierungen, um Markierungen mit Carboxylamid-Termini freizusetzen.

Fig. 1 zeigt das Reaktionsschema
Schritt A: TentaGel S AC-Harz (Verbindung 11; erhältlich von ACT; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357-Peptidsynthesizers (ACT) suspendiert. Verbindung I (3 Äq.) HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben, und das Sammelgefäß für eine Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz gewaschen mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X). Das Koppeln von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindung III zu ergeben.
Schritt B: Das Harz (Verbindung III) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 Minuten geschüttelt. Das Harz wird gefiltert, dann gemischt mit 25% Piperidin in DMF und für 10 Minuten geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz gewaschen mit NMP (2X), MeOH (2X), und DMF (2X) und direkt in Schritt C verwendet.
Schritt C: Das von Schutzgruppen befreite Harz aus Schritt B wird in DMF suspendiert und dazu wird eine FMOC-geschützte Aminosäure zugegeben, die eine Aminfunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Verbindung IV, z. B. alpha-N-FMOC-3-(3-pyridyl)-alanin, erhältlich von Synthetech, Albany, OR; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF. Das Gefäß wird für eine Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz gewaschen mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X). Das Koppeln von IV an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt D: Das Harz (Verbindung V) wird mit Piperidin behandelt, wie in Schritt B beschrieben, um die FMOC-Gruppe zu entfernen. Das von der Schutzgruppe befreite Harz wird dann von dem ACT357 aus dem Sammelgefäß in 16 Reaktionsgefäße gleich aufgeteilt.
Schritt E: Die 16 Aliquots des von der Schutzgruppe befreiten Harzes aus Schritt D werden in DMF suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß wird die passende Carbonsäure VI&sub1;&submin;&sub1;&sub6; (R¹&submin; &sub1;&sub6;CO&sub2;H; 3 äq), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für eine Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und die Aliquots Harz gewaschen mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X). Das Koppeln von VI&sub1;&submin;&sub1;&sub6; an die Aliquots Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindungen VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; zu ergeben.
Schritt F: Die Aliquots Harz (Verbindungen VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6;) werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (3X) gewaschen. Jedem der Reaktionsgefäße wird 1% TFA in CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben und die Gefäße für 30 Minuten geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhrchen gefiltert. Die Aliquots Harz werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) und MeOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhrchen kombiniert. Die einzelnen Röhrchen werden in vacuo verdampft, was Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; bereitstellt.
Schritt G: Jede der freien Carbonsäuren VIII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; wird in DMF aufgelöst. Jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) zugegeben, gefolgt von Pentafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, gewaschen mit 1 M wäßr. Zitronensäure (3X) und S % wäßr. NaHCO&sub3; (3X), getrocknet über Na&sub2;SO&sub4;, gefiltert und in vacuo verdampft, was Verbindungen IX&sub1;&submin;&sub1;&sub6; bereitstellt.

B. Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch abspaltbaren Massenspektroskopie-Markierungen, um Markierungen freizusetzen mit Carbonsäure-Termini Fig. 2 zeigt das Reaktionsschema.

Schritt A: 4-(Hydroxymethyl)phenoxybuttersäure (Verbindung I, 1 Äq.) wird mit DIEA (2,1 Äq.) und Allylbromid (2,1 Äq.) in CHCl3 kombiniert und unter Rückfluß für 2 h erhitzt. Die Mischung wird mit EtOAc verdünnt, gewaschen mit 1 N HCl (2X), pH 9,5 Carbonatpuffer (2X) und Salzlake (1X), getrocknet über Na&sub2;SO&sub4; und in vacuo verdampft, um den Allylester von Verbindung I zu ergeben.
Schritt B: Der Allylester von Verbindung I aus Schritt A (1,75 Äq.) wird mit einer FMOCgeschützten Aminosäure in CH&sub2;Cl&sub2; kombiniert, die eine Aminfunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Verbindung 11, z. B. alpha-N-FMOC-3-(3-pyridyl)-alanin, erhältlich von Synthetech, Albany, OR; 1 Äq.), N-Methylmorpholin (2,5 Äq.) und HATU (1, 1 Äq.) und bei Zimmertemperatur für 4 Stunden gerührt. Die Mischung wird mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt, mit 1 M wäßr. Zitronensäure (2X), Wasser (1X) und 5% wäßr. NaHCO&sub3; (2X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo verdampft. Die Verbindung III wird durch Flash- Chromatographie (CH&sub2;Cl&sub2; → EtOAc) isoliert.
Schritt C: Die Verbindung III wird in CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst, Pd(PPh&sub3;)&sub4; (0,07 Äq.) und N- Methylanilin (2 Äq.) werden zugegeben, und die Mischung bei Zimmertemperatur für 4 Stunden gerührt. Die Mischung wird mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt, mit 1 M wäßr. Zitronensäure (2X) und Wasser (1X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo verdampft. Die Verbindung IV wird durch Flash-Chromatographie (CH&sub2;Cl&sub2;→EtOAc + HOAc) isoliert.
Schritt D: TentaGel S AC-Harz (Verbindung V; 1 Äq.) wird mit DMF in dem Sammelgefäß des ACT357-Peptidsynthezisers suspendiert (Advanced ChemTech Inc. (ACT), Louisville, KY). Die Verbindung IV (3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DFM werden zugegeben und das Sammelgefäß für eine Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz gewaschen mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X). Das Koppeln von IV an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritt E: Das Harz (Verbindung VI) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 Minuten geschüttelt. Das Harz wird gefiltert, dann gemischt mit 25% Piperidin in DMF und für 10 Minuten geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz gewaschen mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X). Das von der Schutzgruppe befreite Harz wird dann durch den ACT357 von dem Sammelgefäß in die 16 Reaktionsgefäße gleich aufgeteilt.
Schritt F: Die 16 Aliquots von von der Schutzgruppe befreitem Harz aus Schritt E werden in DMF suspendiert. Jedem Reaktionsgefäß wird die passende Carbonsäure VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6;(R¹&submin;&sub1;&sub6;CO&sub2;H; 3 Äq.) zugegeben, HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF. Die Gefäße werden für eine Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Aliquots Harz gewaschen mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X). Das Koppeln von VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; an die Aliquots Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindungen V111116 zu ergeben.
Schritt G: Die Aliquots Harz (Verbindung VIII&sub1;&submin;&sub1;&sub6;) werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (3X) gewaschen. Jedem der Reaktionsgefäße wird 1% TFA in CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben und die Gefäße für 30 Minuten geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhrchen gefiltert. Die Aliquots Harz werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) und MeOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhrchen kombiniert. Die einzelnen Röhrchen werden in vacuo verdampft, was Verbindungen IX&sub1;&submin;&sub1;&sub6; bereitstellt.
Schritt H: Jede der freien Carbonsäuren IX, 16 wird in DMF aufgelöst. Jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) zugegeben, gefolgt von Pentafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, gewaschen mit 1 M wäßr. Zitronensäure (3X) und 5% wäßr. NaHCO&sub3; (3X), getrocknet über Na&sub2;SO&sub4;, gefiltert und in vacuo verdampft, was Verbindungen X&sub1;&submin;&sub1;&sub6; bereitstellt.

BEISPIEL 2

DEMONSTRATION VON PHOTOLYTISCHER SPALTUNG VON T-L-X

Eine T-L-X-Verbindung, wie in Beispiel 13 hergestellt, wurde mit Nah-UV-Licht 7 Minuten bei Zimmertemperatur bestrahlt. Eine Rayonett-Fluoreszenz-UV-Lampe (Southern New England Ultraviolet Col, Middletown, CT) mit einem Emissionspeak bei 350 nm wird als eine UV-Lichtquelle verwendet. Die Lampe wird in einer 15 cm-Distanz von den Petrischalen mit den Proben aufgestellt. SDS-Gelelektrophorese zeigt, daß > 85% des Konjugats unter diesen Bedingungen gespalten wird.

BEISPIEL 3

HERSTELLUNG VON FLUORESZENZ-MARKIERTEN PRIMERN UND DEMONSTRATION DER ABSPALTUNG DES FLUOROPHORS

Synthese und Aufreinigung von Oligonukleotiden

Die Oligonukleotide (ODNs) werden auf automatisierten DNA-Synthesizern hergestellt unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie, bereitgestellt vom Verkäufer, oder der H- Phosphonat-Chemie (Glenn Research Sterling, VA). Passend blockierte dA, dG, dc, und T- Phosphoramidite sind in diesen Formen kommerziell erhältlich, und synthetische Nukleoside können auf leichte Weise in die geeignete Form umgewandelt werden. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-, vom Verkäufer geliefert, oder der H-Phosphonat-Chemie hergestellt. Oligonukleotide werden durch Anpassungen von Standard-Verfahren aufgereinigt. Oligonukleotide mit 5'-Tritylgruppen werden per HPLC chromatografiert unter Verwendung einer 12 Mikrometer, 300# Rainin (Emeryville, CA) Dynamax C-8 4,2 · 250 mm-Umkehrphasensäule, wobei ein Gradient von 15% bis 55% MeCN in 0,1 N Et&sub3;NH&spplus;OAc&supmin;, pH 7,0 über 20 Minuten verwendet wird. Wenn die Detritylierung durchgeführt ist, werden die Oligonukleotide durch Gelausschlußchromatographie weiter aufgereinigt. Analytische Überprüfungen der Qualität der Oligonukleotide werden mit eine PRP-Säule (Alltech, Deerfield, IL) bei alkalischem pH und mit PAGE durchgeführt.
Herstellung von 2,4,6-Trichlortriazin-abgeleiteten Oligonukleotiden: 10 bis 1000 ug eines 5'- terminalen Amin-verknüpften Oligonukleotids werden mit einem Überschuß umkristallisierten Cyanursäurechlorids in 10% n-Methyl-pyrrolidon in alkalischem Puffer (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) bei 19ºC bis 25ºC für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen umfassen 0,15M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertes Cyanursäurechlorid und 500 ug/ml jeweiliges Oligonukleotid. Das nicht-umgesetzte Cyanursäurechlorid wird durch Größenausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt.
Das aktivierte, aufgereinigte Oligonukleotid wird dann mit einem hundertfachen molaren Überschuß von Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für eine Stunde bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Größenausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden dann mit Aminreaktiven Fluorochromen umgesetzt. Die abgeleitete ODN-Zubereitung wird in drei Teile aufgeteilt, und jeder Teil wird mit entweder (a) einem 20-fachen molaren Überschuß von Texasrot-Sulfonylchlorid (Molecular Probes, Eugene, OR), mit (b) einem 20-fachen molaren Überschuß von Lissamin-Sulfonylchlorid (Molecular Probes, Eugene, OR), (c) einem 20- fachen molaren Überschuß von Fluoresceinisothiocyanat umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen umfassen 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Die nicht-umgesetzten Fluorochrome werden durch Größenausschluß-Chromatographie auf einer G-50 Sephadexsäule entfernt.
Um das Fluorochrom von dem Oligonukleotid abzuspalten, werden die ODNs auf 1 · 10&supmin;&sup5; molar eingestellt, und dann werden Verdünnungen gemacht (12,3-fache Verdünnungen) in TE (TE ist 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA). Zu 100 ul-Volumina ODNs wird 25 ul 0,01 M Dithiothreitol (DTT) zugegeben. Einem identischen Satz von Kontrollen wird kein DTT zugegeben. Die Mischung wird für 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Fluoreszenz wird auf einer schwarze Mikrotiter-Platte gemessen. Die Lösung wird aus den Inkubationsröhrchen (150 ul) entfernt und auf eine schwarze Mikrotiter-Platte gebracht (Dynatek Laboratories, Chantilly, VA). Die Platten werden dann direkt abgelesen unter Verwendung eines Fluoroskan 11 Fluorometers (Flow Laboratories, Molean, VA) unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 495 nm und unter Überwachung der Emission bei 520 nm für Fluorescein, unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 591 nm und unter Überwachung der Emission bei 612 nm für Texasrot und unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 570 nm und unter Überwachung der Emission bei 590 nm für Lissamin.
Die Daten zeigen an, daß es einen ungefähr 200-fachen Anstieg an relativer Fluoreszenz gibt, wenn das Fluorochrom von dem ODN abgespalten wird.

BEISPIEL 4

HERSTELLUNG VON MARKIERTEN M13-SEQUENZPRIMERN UND DEMONSTRATION DER AB SPALTUNG VON MARKIERUNGEN

Herstellung von 2,4,6-Trichlortriazin-abgeleiteten Oligonukleotiden: 1000 ug 5'-terminales Amin-verknüpftes Oligonukleotid (5'-Hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ") (Seq. ID No. 1) werden mit einem Überschuß von umkristallisiertem Cyanursäurechlorid in 10% n- Methyl-pyrrolidon-alkalischem (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) Puffer bei 19 bis 25ºC für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen umfassen 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertes Cyanursäurechlorid und 500 ug/ml jeweiliges Oligonukleotid. Das nicht-umgesetzte Cyanursäurechlorid wird durch Größenausschluß- Chromatographie auf einer G-50 Sephadexsäule entfernt.
Das aktivierte, aufgereinigte Oligonukleotid wird dann mit einem 100-fachen molaren Überschuß von Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Größenausschluß-Chromatographie auf einer G-50 Sephadexsäule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden dann mit einer Vielfalt von Amiden umgesetzt. Die abgeleitete ODN-Zubereitung wird in 12 Portionen aufgeteilt, und jede Portion wird umgesetzt (25-molarer Überschuß) mit den Pentafluorphenylestern von entweder: (1) 4-Methoxybenzoesäure, (2) 4-Fluorbenzoesäure, (3) Toluylsäure, (4) Benzoesäure, (5) Indol-3-essigsäure, (6) 2,6-Difluorbenzoesäure, (7) Nicotinsäure-N-oxid, (8) 2- Nitrobenzoesäure, (9) 5-Acetylsalicylsäure, (10) 4-Ethoxybenzoesäure, (11) Zimtsäure, (12) 3-Aminonicotinsäure. Die Reaktion findet statt für 2 Stunden bei 37ºC in 0,2 M Naßorat pH 8,3. Die abgeleiteten ODNs werden durch Gelausschluß-Chromatographie auf G-50 Sephadex aufgereinigt.
Um die Markierung von dem Nukleotid abzuspalten, werden die ODNs auf 1 · 10&supmin;&sup5; molar eingestellt, und dann werden Verdünnungen gemacht (12,3-fache Verdünnung) in TE (TE ist 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA) mit 50% EtOH (Vol/Vol). Zu 100 ul-Volumina von ODNs wird 25 ul 0,01 M Dithiothreitol (DTT) zugefügt. Einem identischen Satz von Kon trollen wird kein DTT zugefügt. Inkubation ist für 30 Minuten bei Zimmertemperatur. NaCl wird dann auf 0,1 M zugegeben, und 2 Volumina EtOH werden zugegeben, um die ODNs zu fällen. Die ODNs werden aus der Lösung durch Zentrifugation bei 14.000 · G bei 4ºC für 15 Minuten entfernt. Die Überstände werden verwahrt, vollständig getrocknet. Das Pellet wird dann in 25 ul MeOH aufgelöst. Das Pellet wird dann mit Massenspektrometrie auf das Vorhandensein von Markierungen getestet.
Der Massenspektrometer, der bei dieser Arbeit verwendet wird, ist ein Fourier-Transform- Massenspektrometer (FTMS) mit externer Ionenquelle. Proben, die zur MALDI-Analyse hergestellt worden sind, werden auf der Spitze einer direkten Sonde deponiert und in die Ionenquelle eingeführt. Wenn die Probe mit einem Laserpuls bestrahlt wird, werden Ionen aus der Quelle extrahiert und in eine lange Quadrupol-Ionenführung geleitet, die fokussiert und sie zu einer FTMS-Analysatorzelle transportiert, die sich innerhalb der Bohrung eines supraleitenden Magneten befindet.
Die Spektren ergeben die folgende Information. Peaks, die in der Intensität variieren von 25 bis 100 relativen Intensitätseinheiten bei den folgenden Molekulargewichten: (1) 212,1 amu, was 4-Methoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, (2) 200,1, was 4-Fluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, (3) 196,1 amu, was Toluylsäure-Derivat anzeigt, (4) 182,1 amu, was Benzoesäure- Derivat anzeigt, (5) 235,2 amu, was Indol-3-essigsäure-Derivat anzeigt, (6) 218,1 amu, was 2,6-Difluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, (7) 199,1 amu, was Nicotinsäure-N-oxid-Derivat anzeigt, (8) 227,1 amu, was 2-Nitrobenzamid anzeigt, (9) 179,18 amu, was 5- Acetylsalicylsäure-Derivat anzeigt, (10) 226,1 amu, was 4-Ethoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, (11) 209,1 amu, was Zimtsäure-Derivat anzeigt, (12) 198,1 amu, was 3- Aminonicotinsäure-Derivat anzeigt.
Die Resultate zeigen an, daß die MW-Identifikatoren von den Primern abgespalten werden und durch Massenspektrometrie nachweisbar sind.

BEISPIEL 5

DEMONSTRATION DER SEQUENZIERUNG UNTER VERWENDUNG EINER HPLC- AUFTRENNUNGSMETHODE, DES SAMMELNS VON FRAKTIONEN, DES ABSPALTENS DER MW- IDENTIFIKATOREN, DES BESTIMMENS DER MASSE (UND DAMIT DER IDENTITÄT) DES MW- IDENTIFIKATORS UND DANN DES ABLEITENS DER SEQUENZ

Die folgenden Oligonukleotide werden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt:
100 ug jedes der 5'-terminalen Amin-verknüpften Oligonukleotide, die oben beschrieben sind, werden mit einem Überschuß umkristallisierten Cyanursäurechlorids in 10% n-Methylpyrrolidon-alkalischem (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) Puffer bei 19ºC bis 25ºC für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen umfassen 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertes Cyanursäurechlorid und 500 ug/ml des jeweiligen Oligonukleotids. Das nicht-umgesetzte Cyanursäurechlorid wird durch Größenausschlußchromatographie auf einer G-50 Sephadex-Säule entfernt.
Das aktivierte aufgereinigte Oligonukleotid wird dann mit einem 100-fachen molaren Überschuß von Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Größenausschlußchromatographie auf einer G-50 Sephadex-Säule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden dann mit einem bestimmten Pentafluorphenylester der folgenden umgesetzt: (1) DM0767 mit 4- Methoxybenzoesäure, (2) DM0768 mit 4-Fluorbenzoesäure, (3) Toluylsäure, (4) DM0769 mit Benzoesäure, (5) DM0770 mit Indol-3-essigsäure, (6) DM0771 mit 2,6- Difluorbenzoesäure, (7) DM0772 mit Nicotinsäure-N-oxid, (8) DM0773 mit 2- Nitrobenzoesäure.
10 ng jedes der acht abgeleiteten ODNs werden zusammengemischt und dann nach der Größe aufgetrennt mit HPLC. Die Mischung wird in 25 ul destilliertes Wasser gebracht. Die gesamte Probe wird auf die folgende Säule injiziert. Eine LiChrospher 4000 DMAE, 50-10 mm- Säule wird verwendet (EM Separations, Wakefield, R¹). Elutionsmittel A ist 20 mM Na&sub2;HPO&sub4; in 20% ACN, pH 7,4; Elutionsmittel B ist Elutionsmittel A + 1 M NaCl, pH 7,4. Die Durchflußrate ist 1 ml/min. und der Nachweis erfolgt bei UV @ 280 nm. Der Gradient ist wie folgt: 0 Min. @ 100% A und 0% B, 3 Min. @ 100% A und 0% B, 15 Min. @ 80% A und 20% B, 60 Min. @ 0% A und 100% B, 63 Min. @ 0% A und 100% B, 65 Min. @ 100 % A und 0% B, 70 Min. @ 100% A und 0% B. Fraktionen werden in 0, 5-minütigen Intervallen gesammelt.
Um die Markierungen von dem Oligonukleotid abzuspalten, wird 100 u1 0,05 M Dithiothreitol (DTT) jeder Fraktion zugegeben. Die Inkubation dauert 30 Minuten bei Zimmertemperatur. NaCl wird dann auf 0,1 M zugegeben, und 2 Volumina EtOH werden hinzugegeben, um die ODNs auszufällen. Die ODNs werden aus der Lösung durch Zentrifugation bei 14.000 · G bei 4ºC für 15 Minuten entfernt. Die Überstände werden aufbewahrt, vollständig getrocknet unter Vakuum mit Zentrifugation. Die Pellets werden dann in 25 ul MeOH aufgelöst. Das Pellet wird dann mit Massenspektrometrie auf die Anwesenheit von MW-Identifikatoren getestet. Dieselbe MALDI-Technik wird verwendet, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die folgenden MWs (Markierungen) werden in den Massenspektren als eine Funktion der Zeit beobachtet:
Die zeitliche Erscheinung der Markierung ist damit 212,1, 200,1, 196,1, 182,1, 235,2, 218,1, 199,1, 227,1. Da 212,1 amu das 4-Methoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, 200,1 das 4- Fluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, 196,1 amu das Toluylsäure-Derivat anzeigt, 182,1 amu das Benzoesäure-Derivat anzeigt, 235,2 amu das Indol-3-essigsäure-Derivat anzeigt, 218,1 amu das 2,6-Difluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, 199,1 amu das Nicotinsäure-N-oxid-Derivat anzeigt, 227,1 amu das 2-Nitrobenzamid anzeigt, kann die Sequenz als -5'-ATGCATG-3'- deduziert werden.

BEISPIEL 6

DEMONSTRATION DER SEQUENZIERUNG VON ZWEI DNA-PROBEN IN EINEM EINZELNEN HPLC- TRENNUNGSVERFAHREN

In diesem Beispiel werden zwei DNA-Proben in einem einzelnen Trennungsverfahren sequenziert.
Die folgenden Oligonukleotide werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt:
100 ug jedes der 5'-terminal-Amin-verknüpften Oligonukleotide, die oben beschrieben sind, werden mit einem Überschuß umkristallisierten Cyanursäurechlorids in 10% n-Methylpyrrolidon-alkalischem (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) Puffer bei 19ºC bis 25ºC für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen umfassen 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertes Cyanursäurechlorid und 500 ug/ml jeweiliges Oligonukleotid. Das nicht-umgesetzte Cyanursäurechlorid wird durch Größenausschluß- Chromatographie auf einer G-50 Sephadex-Säule entfernt.
Das aktivierte aufgereinigte Oligonukleotid wird dann mit einem 100-fachen molaren Überschuß Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Größenausschluß-Chromatographie auf einer G-50 Sephadex-Säule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden dann mit einem be stimmten Pentafluorphenylester der folgenden umgesetzt: (1) DM0767 mit 4- Methoxybenzoesäure und DM0773 mit Nicotinsäure-N-oxid, (2) DM0768 mit 4- Fluorbenzoesäure und DM0774 mit 2-Nitrobenzoesäure, (3) Toluylsäure und DM0775 mit Acetylsalicylsäure, (4) DM0769 mit Benzoesäure und DM0776 mit 4-Ethoxybenzoesäure, (5) DM0770 mit Indol-3-essigsäure und DM0777 mit Zimtsäure, (6) DM0771 mit 2,6- Difluorbenzoesäure und DM0778 mit 3-Aminonicotinsäure. Deshalb gibt es eine Markierung für jeden Satz ODNs.
10 ng jedes der 12 abgeleiteten ODNs werden zusammengemischt und dann nach ihrer Größe getrennt durch HPLC. Die Mischung wird in 25 ul destilliertes Wasser gebracht. Die gesamte Probe wird auf die folgende Säule injiziert. Eine LiChrospher 4000 DMAE, 50-10 mm-Säule wird verwendet (EM Separations, Wakefield, R¹). Elutionsmittel A ist 20 mM Na&sub2;HPO&sub4; in 20 % ACN, pH 7,4; Elutionsmittel B ist Elutionsmittel A + 1 M NaCl, pH 7,4. Die Durchflußrate beträgt 1 ml/min. und der Nachweis erfolgt bei UV @ 280 nm. Der Gradient ist wie folgt: 0 Min. @ 100% A und 0% B, 3Min. @ 100% A und 0% B, 15 Min. @ 80% A und 20% B, 60 Min. @ 0% A und 100% B, 63 Min. @ 0% A und 100% B, 65 Min. @ 100% A und 0 % B, 70 Min. @ 100% A und 0% B. Fraktionen werden in 0,5-minütigen Intervallen gesammelt.
Um die Markierungen von dem Oligonukleotid abzuspalten, werden 100 ul 0,05 M Dithiothreitol (DTT) jeder Fraktion zugegeben. Die Inkubation dauert 30 Minuten bei Zimmertemperatur. NaCl wird dann auf 0,01 M hinzugegeben, und 2 Volumina EtOH werden zugegeben, um die ODNs zu fällen. Die ODNs werden aus der Lösung durch Zentrifugation bei 14.000 · G bei 4ºC für 15 Minuten entfernt. Die Überstände werden aufbewahrt, vollständig getrocknet unter Vakuum mit Zentrifugation. Die Pellets werden dann in 25 ul MeOH aufgelöst. Das Pellet wird dann mit Massenspektrometrie auf die Anwesenheit von Markierungen getestet. Dieselbe MALDI-Technik wird wie in Beispiel 4 beschrieben verwendet. Die folgenden MWs (Markierungen) werden in den Massenspektren als eine Funktion der Zeit beobachtet. Fraktion # Zeit MWs Fraktion # Zeit MWs
Das zeitliche Erscheinen der Markierungen für Satz #1 ist 212,1, 200,1, 196,1, 182,1, 235,2, 218,1, 199,1, 227,1, und das zeitliche Erscheinen der Markierungen für Satz #2 ist 199,1, 227,1, 179,1, 226,1, 209,1, 198,1. Da 212,1 amu das 4-Methoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, 200,1 das 4-Fluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, 196,1 amu das Toluylsäure-Derivat anzeigt, 182,1 amu das Benzoesäure-Derivat anzeigt, 235,2 amu das Indol-3-essigsäure-Derivat anzeigt, 218,1 amu das 2,6-Difluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, 199,1 amu das Nicotinsäure-N- oxid-Derivat anzeigt, 227,1 amu das 2-Nitrobenzamid anzeigt, 179,18 amu das 5- Acetylsalicylsäure-Derivat anzeigt, 226,1 amu das 4-Ethoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, 209,1 amu das Zimtsäure-Derivat anzeigt, und 198,1 amu das 3-Aminonicotinsäure-Derivat anzeigt, kann die erste Sequenz als -5'-TATGCA-3'- deduziert werden, und die zweite Sequenz kann als -S'-CGTACC-3'- deduziert werden. Damit ist es möglich, mehr als eine DNA-Probe pro Trennungsschritt zu sequenzieren.

BEISPIEL 7

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R¹&submin;&sub3;&sub6;-LYS(&epsi;-INIP)-ANP-TFP

Fig. 3 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (insbesondere Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamingruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamingruppe verbunden worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und ein Bestandteil R¹&submin;&sub3;&sub6; variablen Gewichts (wobei diese R-Gruppen T², wie hierin definiert, entsprechen und über jede der besonderen hierin aufgelisteten Carbonsäuren eingefiilrt werden können) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrie-Empfindlichkeitsverstärker-Gruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die E-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezugnehmend auf Fig. 3:
Schritt A. NovaSyn HMP-Harz (erhältlich von Novaßiochem; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357 suspendiert. Verbindung I (ANP, erhältlich von ACT; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben, und das Sammelgefäß für eine Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMT (2X) gewaschen. Das Koppeln von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung 11 zu ergeben.
Schritt B. Das Harz (Verbindung 11) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 Min. geschüttelt. Das Harz wird gefiltert, dann mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 10 Min. geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt C verwendet.
Schritt C. Das von Schutzgruppen befreite Harz aus Schritt B wird in DMF suspendiert, und dazu wird eine FMOC-geschützte Aminosäure zugegeben, die eine geschützte Amin- Funktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Fmoc-Lysin(Aloc)-OH, erhältlich von PerSeptive Biosystems; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF. Das Gefäß wird für 1 Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Das Koppeln von Fmoc-Lys(Aloc)-OH an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung IV zu ergeben.
Schritt D. Das Harz (Verbindung IV) wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) gewaschen und dann in einer Lösung aus (PPh&sub3;)&sub4;Pd (0) (0,3 Äq.) und PhSiH&sub3; (10 Äq.) in CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert. Die Mischung wird für eine Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) gewaschen. Der Palladiumschritt wird wiederholt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und das Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X), N,N-Diisopropylethylammoniumdiethyldithiocarbamat in DMF (2X), DMF (2X) gewaschen, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt E. Das von Schutzgruppen befreite Harz aus Schritt D wird an N- Methylisonipecotinsäure, wie in Schritt C beschrieben, gekoppelt, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritt F. Das Fmoc-geschützte Harz VI wird von dem ACT357 aus dem Sammelgefäß in 36 Reaktionsgefäße gleichmäßig aufgeteilt, um Verbindungen VI1146 zu ergeben.
Schritt G. Das Harz (Verbindungen V1136) wird mit Piperidin, wie in Schritt B beschrieben, behandelt, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt H. Die 36 Aliquots des von Schutzgruppen befreiten Harzes aus Schritt G werden in DMF suspendiert. Jedem Reaktionsgefäß wird die passende Carbonsäure (R¹&submin;&sub3;&sub6;CO&sub2;H; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für 1 Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Aliquots Harz werden mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Das Koppeln von R¹&submin;&sub3;&sub6;CO&sub2;H an die Aliquots Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; zu ergeben.
Schritt I. Die Aliquots Harz (Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub3;&sub6;)werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (3X) gewaschen. Jedem der Reaktionsgefäße wird 90 : 5 : 5 TFA:H&sub2;O:CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben, und die Gefäße werden für 120 Min. geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhrchen abgefiltert. Die Aliquots Harz werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) und MeOH (2X) gewaschen, und die Filtrate in die einzelnen Röhrchen kombiniert. Die einzelnen Röhrchen werden in vacuo eingedampft, was Verbindungen IX&sub1;&submin;&sub3;&sub6; bereitstellt.
Schritt J. Jede der freien Carbonsäuren IX&sub1;&submin;&sub3;&sub6; wird in DMF aufgelöst. Jeder Lösung wird Pyridin zugegeben (1,05 Äq.), gefolgt von Tetrafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 Min. bei Zimmertemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, mit 5% aq. NaHCO&sub3; (3x) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, gefiltert und in vacuo eingedampft, was Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; bereitstellt.

BEISPIEL 8

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R¹&submin;&sub3;&sub6;-LYS(&epsi;-INIP)-NBA-TFP

Fig. 4 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (insbesondere Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamingruppe ist, wobei L³ eine direkte Bindung zwischen Lh und L² ist, wobei Lh direkt an den aromatischen Ring der L²-Gruppe geknüpft ist, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin an das Stickstoffatom der L²-Benzylamingruppe geknüpft ist, um eine Amidbindung zu bilden, und ein Bestandteil R¹&submin;&sub3;&sub6; variablen Gewichts (wobei diese R-Gruppen T², wie hierin definiert, entsprechen und über irgendeine der hierin aufgelisteten spezifischen Carbonsäuren eingeführt werden können) durch die α- Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrie-Verstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die s-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezugnehmend auf Fig. 4:
Schritt A: NovaSyn HMP-Harz wird mit Verbindung I gekoppelt (NBA, hergestellt gemäß der Prozedur von Brown et al., Molecular Diversity, 1, 4 (1995)), gemäß der in Schritt A aus Beispiel 7 beschriebenen Prozedur, um Verbindung 11 zu ergeben.
Schritte B-J: Das Harz (Verbindung 11) wird wie in den Schritten B-J aus Beispiel 7 behandelt, um Verbindungen X136 zu ergeben.

BEISPIEL 9

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL INIP-LYS (&epsi;-R¹&submin;&sub3;&sub6;)-ANP-TFP

Fig. 5 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = L¹,), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (insbesondere Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamingruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe des Lysins an das Stickstoffatom der L²-Benzylamingruppe gebunden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und ein Bestandteil R¹&submin;&sub3;&sub6; variablen Gewichts, (wobei diese R-Gruppen T², wie hierin definiert, entsprechen und über irgendeine der spezifischen, hierin aufgelisteten Carbonsäuren angeführt werden können), durch die &epsi;-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrie- Empfindlichkeitsverstärker-Gruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die α- Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezugnehmend auf Fig. 5:
Schritte A-C. Dieselben wie in Beispiel 7.
- Schritt D. Das Harz (Verbindung IV) wird mit Piperidin, wie in Schritt B aus Beispiel 7 beschrieben, behandelt, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt E. Das von Schutzgruppen befreite α-Amin an dem Harz in Schritt D wird an N- Methylisonipecotinsäure, wie in Schritt C aus Beispiel 7 beschrieben, gekoppelt, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt F. Derselbe wie in Beispiel 7.
Schritt G. Das Harz (Verbindungen VI&sub1;&submin;&sub3;&sub6;) werden mit Palladium, wie in Schritt D aus Beispiel 7 beschrieben, behandelt, um die Aloc-Gruppe zu entfernen.
Schritte H-J. Die Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7 hergestellt.

BEISPIEL 10

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R¹&submin;&sub3;&sub6;- GLU(γ-DIAEA)-ANP-TFP

Fig. 6 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (spezifisch Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamingruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die α-Carbonsäuregruppe der Glutaminsäure an das Stickstoffatom der L²-Benzylamingruppe gebunden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und ein Bestandteil R¹&submin;&sub3;&sub6; variablen Gewichts (wobei diese R-Gruppen T², wie hierin definiert, entsprechen und über irgendeine der spezifischen, hierin aufgelisteten Carbonsäuren eingeführt werden können) durch die aα-Aminogruppe der Glutaminsäure gebunden ist, während eine Massenspektrometrie-Empfindlichkeitsverstärker-Gruppe (eingeführt über 2- (Diisopropylamino)ethylamin) durch die γ-Carbonsäure der Glutaminsäure gebunden ist.
Bezugnehmend auf Fig. 6:
Schritte A-B. Dieselben wie in Beispiel 7.
Schritt C. Das von Schutzgruppen befreite Harz (Verbindung III) wird an Fmoc-Glu-(OAl)- OH gekoppelt, unter Verwendung des in Schritt C aus Beispiel 7 beschriebenen Kopplungsverfahrens, um Verbindung IV zu ergeben.
Schritt D. Der Allylester auf dem Harz (Verbindung IV) wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) gewaschen und mit einer Lösung aus (PPh&sub3;)&sub4;Pd (0) (0,3 Äq.) und N-Methylanilin (3 Äq.) in CH&sub2;Cl&sub2; vermischt. Die Mischung wird für 1 Stunde geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und das Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) gewaschen. Der Palladiumschritt wird wiederholt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und das Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X), N,N- Diisopropylethylammoniumdiethyldithiocarbamat in DMF (2X), DMF (2X) gewaschen, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt E. Das von Schutzgruppen befreite Harz aus Schritt D wird in DMF suspendiert und durch Vermischen mit HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) aktiviert. Die Gefäße werden für 15 Minuten geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und das Harz wird mit NMP (1X) gewaschen. Das Harz wird mit 2-(Diisopropylamino)ethylamin (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) vermischt. Die Gefäße werden für 1 Stunde geschüttelt. Das Koppeln von 2- (Diisopropylamino)ethylamin an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritte F-J. Dieselben wie in Beispiel 7.

BEISPIEL 11

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R¹&submin;&sub3;&sub6;- LYS(&epsi;-INIP)-ANP-LYS(s-NH&sub2;)-NH&sub2;

Fig. 7 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein Amin ist (insbesondere die s-Aminogruppe einer Lysin-abgeleiteten Einheit), L² eine ortho-Nitrobenzylamingruppe ist, wobei L³ eine Carboxamido-substituierte Alkylenaminoacylalkylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin an das Stickstoffatom der L²-Benzylamingruppe gebunden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und ein Bestandteil R¹&submin;&sub3;&sub6; variabelen Gewichts (wobei diese R-Gruppen T², wie hierin definiert, entsprechen und über irgendeine der hierin aufgelisteten spezifischen Carbonsäuren eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrie-Empfindlichkeitsverstärker-Gruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die &epsi;-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezugnehmend auf Fig. 7:
Schritt A. Fmoc-Lys(Boc)-SRAM-Harz (erhältlich von ACT; Verbindung I) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 Min. geschüttelt. Das Harz wird gefiltert, dann mit 25 % Piperidin in DMF vermischt und für 10 Min. geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt B verwendet.
Schritt B. Das Harz (Verbindung II), ANP (erhältlich von ACT; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben, und das Sammelgefäß wird für 1 Stunde ge schüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, und das Harz wird mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Das Koppeln von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung III zu ergeben.
Schritte C-J. Das Harz (Verbindung III) wird wie in Schritten B-I in Beispiel 7 behandelt, um Verbindungen X136 zu ergeben.

BEISPIEL 12

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R¹&submin;&sub3;&sub6;- LYS(&epsi;-TFA)-LYS(s-IINP)-ANP-TFP

Fig. 8 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (spezifisch Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamingruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe eines ersten Lysins an das Stickstoffatom der L²-Benzylamingruppe gebunden ist, um eine Amidbindung zu bilden, eine Massenspektrometrie-Empfindlichkeitsverstärker-Gruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die &epsi;-Aminogruppe des ersten Lysins gebunden ist, ein zweites Lysinmolekül an das erste Lysin durch die α-Aminogruppe des ersten Lysins gebunden ist, eine Molekulargewichts-Einstellungs-Gruppe (mit einer Trifluoracetylstruktur) durch die &epsi;- Aminogruppe des zweiten Lysins gebunden ist und ein Bestandteil R¹&submin;&sub3;&sub6; (wobei diese R- Gruppen T², wie hierin definiert, entsprechen und über irgendeine der hierin aufgelisteten spezifischen Carbonsäuren eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des zweiten Lysins gebunden ist.
Bezugnehmend auf Fig. 8:
Schritte A-E. Diese Schritte sind identisch mit den Schritten A-E in Beispiel 7.
Schritt F. Das Harz (Verbindung VI) wird mit Piperidin, wie in Schritt B in Beispiel 7 beschrieben, behandelt, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt G. Das von Schutzgruppen befreite Harz (Verbindung VII) wird an Fmoc-Lys(Tfa)- OH gekoppelt unter Verwendung des in Schritt C aus Beispiel 7 beschriebenen Kopplungsverfahrens, um Verbindung VIII zu ergeben.
Schritte H-K. Das Harz (Verbindung VIII) wird wie in Schritten F-J in Beispiel 7 behandelt, um Verbindungen XI&sub1;&submin;&sub3;&sub6; zu ergeben.

BEISPIEL 13

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R¹&submin;&sub3;&sub6;- LYS(&epsi;-JNIP)-ANP-5'-AH-ODN

Fig. 9 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = MOI, wobei MOI ein Nukleinsäurefragment, ODN, ist) abgeleitet aus den Estern von Beispiel 7 (dieselbe Prozedur könnte mit anderen T-L-X-Verbindungen verwendet werden, wobei X ein aktivierter Ester ist). Das MOI ist an T-L durch das 5'-Ende des MOI über eine Phosphodiester-Alkylenamin-Gruppe konjugiert.
Bezugnehmend auf Fig. 9:
Schritt A. Verbindungen XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden gemäß einer modifizierten Biotinylierungsprozedur in Van Ness et al., Nucleic Acids Res., 19, 3345 (1991) hergestellt. Einer Lösung eines der 5'- Aminohexyl-Oligonukleotide (Verbindungen XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6;, 1 mg) in 200 mM Natriumborat (pH 8,3, 250 ml) wird einer der Tetrafluorphenylester zugegeben (Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; aus Beispiel A, 100-facher molarer Überschuß in 250 ml NMP). Die Reaktion wird über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die nicht-umgesetzten und hydrolysierten Tetrafluorphenylester werden von den Verbindungen XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; durch Sephadex G-50-Chromatographie entfernt.

BEISPIEL 14

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R¹&submin;&sub3;&sub6;- LYS(&epsi;-INIP)-ANP-LYS(2e-(MCT-5'-AH-ODN))-NHZ

Fig. 10 illustriert die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = MOI, wobei MOI ein Nukleinsäurefragment ist, ODN) abgeleitet aus den Aminen von Beispiel 11 (dieselbe Prozedur könnte mit anderen T-L-X-Verbindungen verwendet werden, wobei X ein Amin ist). Das MOI ist an T-L durch das 5'-Ende des MOI konjugiert, über eine Phosphodiester-Alkylenamin-Gruppe.
Bezugnehmend auf Fig. 10:
Schritt A. Die 5'-[6-(4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-2-ylamino)hexyl]oligonukleotide XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden hergestellt wie beschrieben in Van Ness et al., Nucleic Acids Res., 19, 3345 (1991).
Schritt B. Einer Lösung eines der 5'-[6-(4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-2-ylamino)hexyl]oligonukleotide (Verbindungen XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6;) in einer Konzentration von 1 mg/ml in 100 mM Natriumborat (pH 8,3) wurde ein 100-facher molarer Überschuß eines primären Amins zugegeben, ausgewählt aus R¹&submin;&sub3;&sub6;-LYs(e-iNIP)-ANP-Lys(e-NH&sub2;)-NH&sub2; (Verbindungen X136 aus Beispiel 11). Die Lösung wird über Nacht bei Umgebungstemperatur gemischt. Das nicht-umgesetzte Amin wird durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einem Schnitt von 3000 MW entfernt (Amicon, Beverly, MA), unter Verwendung von H&sub2;O als die Waschlösung (3 X). Die Verbindungen XIII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden durch Reduktion des Volumens auf 100 ml isoliert.

BEISPIEL 15

DEMONSTRATION DES SEQUENZIERENS UNTER VERWENDUNG EINES CE- TRENNUNGSVERFAHRENS, DER SAMMLUNG VON FRAKTIONEN, DER ABSPALTUNG DER MARKIERUNG, DER BESTIMMUNG DER MASSE (UND DAMIT DER IDENTITÄT) DER MARKIERUNG UND DANN DER ABLEITUNG DER SEQUENZ.

In diesem Beispiel werden zwei DNA-Proben in einem einzelnen Trennungsverfahren sequenziert.
CE-Instrumentierung
Das CE-Instrument ist eine Eigenbauversion des Instruments, das kommerziell erhältlich ist von Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). Es umfaßt Plexiglas-Kästen, die zwei Pufferkammern einschließen, die auf konstanter Temperatur mit einer Wärmekontrolleinheit gehalten werden können. Die Spannung, die zur Elektrophorese notwendig ist, wird durch eine Hochspannungsstromquelle (Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, FL) mit einer magnetischen Sicherheitssperre und einer Kontrolleinheit zum Variieren des angelegten Potentials bereitgestellt. Probeninjektionen für offene Röhrenkapillaren werden unter Verwendung einer Handvakuumpumpe durchgeführt, um ein Druckdifferential über die Kapillare zu erzeugen (Vakuuminjektion). Für Gel-gefüllte Kapillaren werden die Proben mittels Elektrophorese in die Röhre durch Anlegen eines elektrischen Felds bewegt (elektrokinetische Injektion).

Herstellung Gel-gefühlter Kapillaren

Fünfzig Zentimeter lange, verschmolzene Silica-Kapillaren (375 mm o. d., 50 mm i. d., Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) mit Detektorfenstern (wobei die Polyimid-Beschichtung von der Kapillare entfernt worden ist) bei 25 cm werden bei den Trennungen verwendet. Die innere Oberfläche der Kapillaren werden mit (Methylacryloxypropyl)trimethoxysilan (MAPS) (Sigma, St. Louis, MO) derivatisiert, um kovalentes Anhängen des Gels an die Kapillarwand zu ermöglichen (Nashabeh et al., Anal Chem 63: 2148, 1994). Kurz gesagt, werden die Kapillaren durch aufeinanderfolgendes Fließenlassen von Trifluoressigsäure, entionisiertem Wasser und Aceton durch die Säule gesäubert. Nach der Acetonwaschung wird eine 0,2 % Lösung von MAPS in 50/50 Wasser/Ethanol-Lösung durch die Kapillare geleitet und bei Zimmertemperatur für 30 Minuten gelassen. Die Lösung wird durch Ansaugen entfernt, und die Röhrchen werden für 30 Minuten unter einer Infrarot-Wärmelampe getrocknet.
Gel-gefüllte Kapillaren werden unter hohem Druck durch eine Modifikation der von Huang et al. (J. Chromatography 600 : 289, 1992) beschriebenen Prozedur hergestellt. Vier Prozent Poly(acrylamid)gele mit 5% Quervernetzer und 8,3 Harnstoff werden für alle hier berichteten Studien verwendet. Eine Stammlösung wird gemacht durch Auflösen von 3,8 g Acrylamid, 0,20 g N,N'-Methylenbis(acrylamid) und 50 g Harnstoff in 100 ml TBE-Puffer (90 mM Tris- Borat, pH 8,3, 0,2 mM EDTA). Quervernetzung wird mit 10 ml N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 250 ml 10% Ammoniumpersulfat-Lösung initiiert.
Die polymerisierende Lösung wird schnell in die derivatisierte Säule geleitet. Gefüllfe-Kapillaren werden dann in ein Stahlrohr 1 · m · 1/8 in. i. d. · ¹/&sub4; in. o. d. gebracht, das mit Wasser gefüllt ist, und der Druck wird auf 400 bar unter Verwendung einer HPLC-Pumpe erhöht und bei diesem Druck über Nacht gehalten. Der Druck wird allmählich abgelassen, und die Kapillaren werden entfernt. Ein kurzer Abschnitt der Kapillare von jedem Ende der Säule wird vor der Verwendung entfernt.

Trennung und Nachweis von DNA-Fragmenten

Analyse von DNA-Sequenzierungsreaktionen, die durch herkömmliche Elektrophorese getrennt werden, wird auf einem ABI 370A DNA-Sequenzierer durchgeführt. Dieses Instrument verwendet ein denaturierendes Harnstoff-Poly(acrylamid)-Slabgel, das 0,4 mm dick ist, mit einer Distanz von 26 cm von der Probentasche zur Nachweisregion, hergestellt gemäß den Anweisungen der Hersteller. DNA-Sequenzierungsreaktionen werden hergestellt, wie vom Hersteller beschrieben, unter Verwendung von Taq-Polymerase (Promega Corp., Madison, WI) und werden an einer M13mp 19 einzelsträngigen DNA-Matrize durchgeführt, die mit Standardprozeduren hergestellt worden ist. Sequenzierungsreaktionen werden bei -20ºC im Dunkeln aufbewahrt und auf 90ºC für 3 Minuten in Formamid kurz vor dem Laden der Probe erhitzt. Sie werden auf den 370A mit einem Pipetman gemäß den Herstelleranweisungen und auf die CE durch elektrokinetische Injektion bei 10.000 V für 10 Sekunden geladen. 10 ul- Fraktionen werden während des Laufs durch Entfernen der gesamten Flüssigkeit an der Bodenelektrode und Ersetzen mit neuem Elektrolyten gesammelt.
Um die Markierung von dem Oligonukleotid abzuspalten, wird 100 ul 0,05 M Dithiothreitol (DTT) jeder Fraktion zugegeben. Inkubation dauert für 30 Minuten bei Zimmertemperatur. NaCl wird dann auf 0,1 M zugegeben, und 2 Volumina EtOH werden zugegeben, um die ODNs zu fällen. Die ODNs werden aus der Lösung durch Zentrifugation bei 14.000 · G bei 4ºC für 15 Minuten entfernt. Die Überstände werden aufbewahrt, vollständig getrocknet unter einem Vakuum mit Zentrifugation. Die Pellets werden dann in 25 ul MeOH aufgelöst. Das Pellet wird dann mit Massenspektrometrie auf die Anwesenheit von Markierungen getestet. Dieselbe MALDI-Technik wird verwendet, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die folgenden MWs (Markierungen) werden in den Massenspektren als eine Funktion der Zeit beobachtet:
Das zeitliche Erscheinen der Markierungen für Satz #1 ist 212,1, 200,1, 196,1, 182,1, 235,2, 218,1, 199,1, 227,1, und das zeitliche Erscheinen der Markierungen für Satz #2 ist 199,1, 227,1, 179,1, 226,1, 209,1, 198,1. Da 212,1 amu das 4-Methoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, 200,1 das 4-Fluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, 196,1 amu das Toluylsäure-Derivat anzeigt, 182,1 amu das Benzoesäure-Derivat anzeigt, 235,2 amu das Indol-3-essigsäure-Derivat anzeigt, 218,1 amu das 2,6-Difluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, 199,1 amu das Nicotinsäure-N- Oxidderivat anzeigt, 227,1 amu das 2-Nitrobenzamid anzeigt, 179,18 amu das 5- Acetylsalicylsäure-Derivat anzeigt, 226,1 amu das 4-Ethoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, 209,1 amu das Zimtsäure-Derivat anzeigt und 198,1 amu die 3-Aminonicotinsäure anzeigt, kann die erste Sequenz als -5'-TATGCA-3'- abgeleitet werden, und die zweite Sequenz kann abgeleitet werden als -5'-CGTACC-3'-. Damit ist es möglich, mehr als eine DNA-Probe pro Auftrennungsschritt zu sequenzieren.

BEISPIEL 16

DEMONSTRATION DES GLEICHZEITIGEN NACHWEISES VIELFACHER MARKIERUNGEN MIT MASSENSPEKTROMETRIE

Dieses Beispiel stellt eine Beschreibung der Fähigkeit bereit, simultan vielfache Verbindungen (Markierungen) mit Massenspektrometrie nachzuweisen. In diesem besonderen Beispiel werden 31 Verbindungen mit einer Matrix vermischt, abgelegt und auf einem festen Träger getrocknet und dann mit einem Laser desorbiert. Die resultierenden Ionen werden dann in einen Massenspektrometer eingeführt.
Die folgenden Verbindungen (käuflich erworben von Aldrich, Milwaukee, WI) werden zusammengemischt auf einer gleichmolaren Basis auf eine endgültige Konzentration von 0,002 M (auf einer pro-Verbindung-Basis): Benzamid (121,14), Nicotinamid (122,13), Pyrazinamid (123,12), 3-Amino-4-pyrazolcarbonsäure (127,10), 2-Thiophencarboxamid (127,17), 4- Aminobenzamid (135,15), Tolumid (135,17), 6-Methylnicotinamid (136,15), 3- Aminonicotinamid (137,14), Nicotinamid-N-oxid (13 8,12), 3-Hydropicolinamid (138,13), 4- Fluorbenzamid (139,13), Zimtsäureamid (147,18), 4-Methoxybenzamid (151,17), 2,6- Difluorbenzamid (157,12), 4-Amino-5-imidazolcarboxyamid (162,58), 3,4-Pyridindicarboxyamid (165,16), 4-Ethoxybenzamid (165,19), 2,3-Pyrazindicarboxamid (166,14), 2- Nitrobenzamid (166,14), 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure (170,4), Indol-3-acetamid (174,2), 5-Acetylsalicylamid (179,18), 3,5-Dimethoxybenzamid (181,19), 1-Naphthalinacetamid (185,23), 8-Chlor-3,5-diamino-2-pyrazincarboxyamid (187,59), 4-Trifluormethylbenzamid (189,00), 5-Amino-5-phenyl-4-pyrazolcarboxamid (202,22), 1-Methyl-2-benzylmalonamat (207,33), 4-Amino-2,3,5,6-tetrafluorbenzamid (208,11), 2,3-Naphthalindicarbonsäure (212,22). Die Verbindungen werden in DMSO in der oben beschriebenen Konzentration eingebracht. Ein ul des Materials wird dann mit alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix (nach einer 1 : 10.000-Verdünnung) gemischt und auf einen festen rostfreien Stahlträger abgelegt.
Das Material wird dann durch einen Laser desorbiert, unter Verwendung des Protein-TOF- Massenspektrometers (Bruker, Manning Park, MA), und die resultierenden Ionen werden sowohl im linearen als auch Reflektron-Betriebsmodus gemessen. Die folgenden m/z-Werte werden beobachtet (Fig. 11):
121,1---> Benzamid (121,14)
122,1---> Nicotinamid (122,13)
123,1---> Pyrazinamid (123,12)
124,1
125,2
127,3---> 3-Amino-4-pyrazolcarbonsäure (127,10)
127,2---> 2-Thiophencarboxamid (127,17)
135,1---> 4-Aminobenzamid (135,15)
135,1---> Tolumid (135,17)
136,2---> 6-Methylnicotinamid (136,15)
137,1---> 3-Aminonicotinamid (137,14)
138,2---> Nicotinamid-N-oxid (138,12)
138,2---> 3-Hydropicolinamid (138,13)
139,2---> 4-Fluorbenzamid (139,13)
140,2
147,3---> Zimtsäureamid (147,18)
148,2
149,2
4-Methoxybenzamid (151,17)
152,2
2,6-Difluorbenzamid (157,12)
158,3
4-Amino-5-imidazolcarboxyamid (162,58)
163,3
165,2---> 3,4-Pyridindicarboxyamid (165,16)
165,2---> 4-Ethoxybenzamid (165,19)
166,2---> 2,3-Pyrazindicarboxamid (166,14)
166,2---> 2-Nitrobenzamid (166,14)
3-Fluor-4-methoxybenzoesäure (170,4)
171,1
172,2
173,4
Indol-3-acetamid (174,2)
178,3
179,3---> 5-Acetylsalicylamid (179,18)
181,2---> 3,5-Dimethoxybenzamid (181,19)
182,2--->
1-Naphthalinacetamid (185,23)
186,2
8-Chlor-3,5-diamino-2-pyrazincarboxyamid (187,59)
188,2
189,2---> 4-Trifluormethylbenzamid (189,00)
190,2
191,2
192,3
5-Amino-5-phenyl-4-pyrazolcarboxamid (202,22)
203,2
203,4
1-Methyl-2-benzylmalonamat (207,33)
4-Amino-2,3,5,6-tetrafluorbenzamid (208,11)
212,2---> 2,3-Naphthalindicarbonsäure (212,22).
219,3
221,2
228,2
234,2
23 7,4
241,4
Die Daten zeigen an, daß 22 von 31 Verbindungen im Spektrum mit der erwarteten Masse erschienen, 9 aus 31 Verbindungen im Spektrum mit einer n + H-Masse (1 atomare Masseneinheit, amu) über der erwarteten Masse erschienen. Letzteres Phänomen beruht wahrscheinlich auf der Protonierung eines Amins innerhalb der Verbindungen. Deshalb werden 31 aus 31 Verbindungen mit MALDI-Massenspektroskopie nachgewiesen. Wichtiger noch, zeigt das Beispiel, daß vielfache Markierungen mit einem spektroskopischen Verfahren gleichzeitig nachgewiesen werden können.
Die alpha-Cyano-Matrix allein (Fig. 12) ergab Peaks bei 146,2, 164,1, 172,1, 173,1, 189,1, 190,1, 191,1, 192,1, 212,1, 224,1, 228,0, 234,3. Andere im Spektrum identifizierte Massen beruhen auf Verunreinigungen in den gekauften Verbindungen, da keine Anstrengung unternommen wurde, die Verbindungen weiter aufzureinigen.

BEISPIEL 17

EINE PROZEDUR ZUM SEQUENZIEREN MIT MW-IDENTIFIKATOR-MARKIERTEN PRIMERN, RADIOAKTIV MARKIERTEN PRIMERN, MW-IDENTIFIKATOR-MARKIERTEN- DIDESOXYTERMINATOREN, FLUORESZENZ-PRIMERN UND FLUORESZENZ- DIDESOXYTERMINATOREN

A. Herstellung von Sequenziergelen und Elektrophorese

Das Protokoll ist wie folgt. Stelle 8 M Harnstoff, Polyacrylamid-Gele gemäß den folgenden Rezepten (100 ml) für 4%, 6% oder 8% Polyacrylamid her.
Harnstoff (5505UA) wird von Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) erworben. Alle anderen Materialien werden von Fisher (Fair Lawn, NJ) erworben. Kurz gesagt, werden Harnstoff, MTBE- Puffer und Wasser kombiniert, für 5 Minuten bei 55ºC inkubiert und gerührt, um den Harnstoff aufzulösen. Die Mischung wird kurz gekühlt, AcrylamidJBisacrylamid-Lösung wird zugegeben und vermischt, und das gesamte Gemisch wird unter Vakuum für 5 Minuten entgast. APS und TEMED-Polymerisations-Mittel werden unter Rühren zugegeben. Die vollständige Gelmischung wird sofort zwischen die mit Band versiegelten Glasplatten mit 0,15 mm Abstandshaltern gegossen. Die Platten werden präpariert, indem sie zuerst mit ALCONOXTM (New York, NY)-Detergens und heißem Wasser gesäubert werden, werden mit doppelt destilliertem Wasser gespült und getrocknet. Typischerweise wird die Glasplatte mit Einschnitt mit einem Silanisier-Reagens behandelt und dann mit doppelt destilliertem Wasser gespült. Nach dem Gießen wird das Gel sofort horizontal gelegt, der Taschenbildende Kamm wird eingeführt, in Position festgeklammert, und man läßt das Gel für wenigstens 30 Minuten polymerisieren. Vor dem Laden werden das Band um den Boden des Gels und der Taschenbildende Kamm entfernt. Ein vertikaler Elektrophoreseapparat wird dann zusammengebaut, indem man die obere und untere Pufferkammer an die Gelplatten klammert, und indem 1X MTBE-Elektrophoresepuffer den Kammern zugegeben wird. Die Probentaschen werden mit einer Spritze gespült, die Laufpuffer enthält, und unmittelbar vor dem Laden jeder Probe wird die Tasche mit Laufpuffer unter Verwendung von Gel-Lade-Spitzen gespült, um Harnstoff zu entfernen. Ein bis zwei Mikroliter Probe werden in jede Tasche unter Verwendung eines Pipetteman (Rainin, Emeryville, CA) mit Gel-Lade-Spitzen geladen und dann einer Elektrophorese unterzogen gemäß den folgenden Richtlinien (während der Elektrophorese wird das Gel mit einem Ventilator gekühlt):
Jede basenspezifisch terminierte Sequenzierungsreaktionsmischung (mit der kurzen Termination) wird auf ein 0,15 mm · 50 cm · 20 cm denaturierendes 5% Polyacrylamidgel geladen; Reaktionen, die mit der langen Terminationsmischung terminiert worden sind, werden typischerweise in die Hälfte geteilt und auf zwei 0,15 mm · 70 cm · 20 cm denaturierende 4% Polyacrylamidgele geladen.
Nach der Elektrophorese wird der Puffer aus den Taschen entfernt, das Band wird entfernt, und die Gelplatten werden getrennt. Das Gel wird auf ein 40 cm · 20 cm-Blatt 3 mm Whatman-Papier übertragen, mit Plastikfolie abgedeckt und auf einem Hoefer (San Francisco, CA)-Geltrockner für 25 Minuten bei 80ºC getrocknet. Das getrocknete Gel wird einem Kodak (New Haven, CT) XRP-1 Film exponiert. Abhängig von der Intensität des Signals, und ob die radioaktive Markierung ³²P oder ³&sup5;S ist, können die Exponierzeiten von 4 Stunden bis mehrere Tage variieren. Nach dem Exponieren werden die Filme durch Verarbeitung im Entwickler und Fixierlösungen entwickelt, mit Wasser gespült und luftgetrocknet. Das Autoradiogramm wird dann auf einen Leuchtkasten gebracht, die Sequenz wird manuell gelesen und die Daten in einen Computer eingegeben.
Taq-Polymerase-katalysiertes Zyklus-Sequenzieren unter Verwendung von markierten Primern. Jede basenspezifische Zyklus-Sequenzierungsreaktion schloß routinemäßig näherungsweise 100 oder 200 ng isolierte einzelsträngige DNA für A- und C- bzw. G- und T- Reaktionen ein. Doppelsträngige Zyklus-Sequenzierungsreaktionen enthielten auf ähnliche Weise näherungsweise 200 oder 400 ng Plasmid-DNA, die isoliert worden ist unter Verwendung von alkalischen Lyse- oder Diatomeenerde-modifizierten-alkalischen Lyse- Standardprozeduren. Alle Reagentien außer der Matrizen-DNA werden in einem Pipettierschritt aus einer Vormischung von zuvor aliquotisierten Stammlösungen, die bei -20ºC gelagert worden waren, zusammengegeben. Reaktions-Vormischungen werden hergestellt, indem Reaktionspuffer mit den basenspezifischen Nukleotidmischungen kombiniert wird. Vor der Verwendung werden die basenspezifischen Reaktions-Vormischungen aufgetaut und mit verdünnter Taq-DNA-Polymerase und den einzelnen endmarkierten Universal-Primern kombiniert, um die endgültigen Reaktionsmischungen zu ergeben. Wenn die obigen Mischungen hergestellt sind, werden 4 Aliquots einzeln- oder doppelsträngiger DNA in den Boden eines jeden 0,2 ml dünnwandigen Reaktionsröhrchen pipettiert, entsprechend den A-, C-, G- und T- Reaktionen, und dann wird ein Aliquot der jeweiligen Reaktionsmischungen an der Seite eines jeden Röhrchens zugegeben. Diese Röhrchen sind Teil eines 96-Röhrchen/Behälter-Satz- Tabletts in einem Mikrotiter-Plattenformat, das in einen Perkin Elmer Cetus Cycler 9600 (Foster City, CA) paßt. Streifkappen werden auf den Röhrchen/Behälter-Satz gesiegelt, und die Platte wird kurz zentrifugiert. Die Platte wird dann in den Cycler gebracht, dessen Hitzeblock auf 95ºC vorerhitzt worden war, und das Zyklusprogramm wird sofort gestartet. Das Zyklusprotokoll umfaßt 15-30 Zyklen von: 95ºC Denaturierung; 55ºC Annealing; 72ºC Extension; 95ºC Denaturierung; 72ºC Extension; 95ºC Denaturierung und 72ºC Extension, geknüpft an eine Abschluß-Datei, zum Durchweichen bei 4ºC.
In diesem Stadium können die Reaktionen eingefroren und bei -20ºC für bis zu mehrere Tage gelagert werden. Vor Vereinigen und Ausfällen wird die Platte kurz zentrifugiert, um Kondensiertes wiederzugewinnen. Die primer- und basenspezifischen Reaktionen werden in Ethanol vereinigt, und die gefällte DNA wird durch Zentrifugation gesammelt und getrocknet. Diese Sequenzierungsreaktionen könnten für mehrere Tage bei -20ºC gelagert werden.
Das Protokoll für die Sequenzierungsreaktionen ist wie folgt. Für A- und C-Reaktionen werden 1 ul und für G- und T-Reaktionen 2 ul jeder DNA-Probe (100 ng/ul für M13-Matrizen und 200 ng/ul für pUC-Matrizen) auf den Boden der 0,2 ml dünnwandigen Reaktionsröhrchen pipettiert. AmpliTaq-Polymeräse (N801-0060) ist von Perkin-Elmer Cetus (Foster City, CA).
Eine Mischung von 30 ul AmpliTaq (5U/ul), 30 ul 5X Taq-Reaktionspuffer, 130 ul ddH&sub2;O, und 190 ul verdünnte Taq für 24 Stunden wird hergestellt.
A-, C-, G- und T-basenspezifische Mischungen werden hergestellt durch Zugeben von basenspezifischem Primer und verdünnter Taq zu jeder der basenspezifischen Nukleotid/Puffer- Vormischungen:
A,C/G,T
60/120 ul 5X Taq-Zyklus-Sequenziermischung
30/60 ul verdünnte Taq-Polymerase
30/60 ul entsprechender Fluoreszenz-endmarkierter Primer
120/240 ul

B. Taq-Polymerase katalysiertes Zyklus-Sequenzieren unter Verwendung von MW- Identifikator-markierten Terminator-Reaktionen

Ein Problem beim DNA-Zyklus-Sequenzieren ist, daß, wenn Primer verwendet werden, die Reaktionsbedingungen so sind, daß die eingenistete Fragmentsatz-Verteilung stark von der Matrizen-Konzentration in der Reaktionsmischung abhängig ist. Es ist vor kurzem beobachtet worden, daß die eingenistete Fragmentsatz-Verteilung für die DNA-Zyklus- Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung der markierten Terminatoren viel weniger empfindlich gegenüber DNA-Konzentration ist, als diejenige, die erhalten wird mit den wie oben beschriebenen markierten Primerreaktionen. Zusätzlich erfordern die Terminatorreaktionen nur ein Reaktionsröhrchen pro Matrize, während die markierten Primerreaktionen ein Reaktionsröhrchen für jeden der vier Terminatoren erfordern. Das unten beschriebene Protokoll wird auf leichte Weise an die 96-Napf-Matrizenisolierung und 96-Napf-Reaktions- Säuberungsprozeduren angekoppelt, die ebenso hierin beschrieben sind.
Bringe 0,5 ug einzelsträngiger oder 1 ug doppelsträngiger DNA in 0,2 ml PCR-Röhrchen. Füge 1 ul (für einzelsträngige Matrizen) oder 4 ul (für doppelsträngige Matrizen) 0,8 uM Primer und 9,5 ul Vormischung, die von ABI geliefert wird, jedem Röhrchen zu, und bringe das endgültige Volumen auf 20 ul mit ddH&sub2;O. Zentrifugiere kurz und führe einen Zyklus wie gewöhnlich aus, unter Verwendung des Terminator-Programms, wie vom Hersteller beschrieben (d. h. erhitze auf 96ºC vor, gefolgt von 25 Zyklen 96ºC für 15 Sekunden, 50ºC für 1 Sekunde, 60ºC für 4 Minuten und verknüpfe dann mit einem 4ºC-Halteschritt). Fahre fort mit der Spin-Säulenaufreinigung unter Verwendung von entweder Centri-Sep-Säulen (Amicon, Beverly, MA) oder G-50 Mikrotiter-Plattenprozeduren, die unten angegeben sind.

C. Terminatorreaktions-Säuberung mit Centri-Sep-Säulen

Eine Säule wird vorbereitet, indem man die Säule sanft anschnippt, um zu bewirken, daß das Gelmaterial sich an den Boden der Säule setzt. Der Säulenstopper wird entfernt, und 0,75 ml dH&sub2;O wird zugegeben. Verschließe die Säule und kehre sie mehrere Male zum Mischen um. Lasse das Gel für wenigstens 30 Minuten bei Zimmertemperatur hydrieren. Säulen können für ein paar Tage bei 4ºC gelagert werden. Lasse die Säulen, die bei 4ºC gelagert worden sind, sich auf Zimmertemperatur vor ihrer Verwendung erwärmen. Entferne alle Luftblasen durch Umkehren der Säule und Setzenlassen des Gels. Entferne die Kappe am oberen Ende zuerst, und entferne dann die Kappe am unteren Ende. Lasse die Säule mit der Schwerkraft vollständig ablaufen. (Beachte: Wenn der Fluß nicht sofort beginnt, wende leichten Druck auf die Säule mit einem Pipettenball an.) Führe die Säule in das bereitgestellte Waschröhrchen ein. Drehe sie in einer Mikrozentrifuge mit varüerbarer Geschwindigkeitseinstellung bei 1300 xg für 2 Minuten, um die Flüssigkeit zu entfernen. Entferne die Säule aus dem Waschröhrchen und führe sie in ein Probensammelröhrchen ein. Entferne sorgfältig die Reaktionsmischung (20 ul) und lade sie oben auf das Gelmaterial. Wenn die Proben in einem Zyklus-Instrument inkubiert waren, das eine Überschichtung mit Öl erforderte, entferne sorgfältig die Reaktion unterhalb des Öls. Vermeide das Aufnehmen von Öl mit der Probe, obwohl geringere Mengen von Öl (< 1 ul) in der Probe die Resultate nicht stören werden. Öl am Ende der Pipettenspitze, die die Probe enthält, kann durch Berührung der Spitze sorgfältig auf einer sauberen Oberfläche (z. B. dem Reaktionsröhrchen) entfernt werden. Verwende jede Säule nur einmal. Drehe sie in einer Mikrozentrifuge mit varüerbarer Geschwindigkeitseinstellung mit einem Festwinkel-Rotor, wobei die Säule in dieselbe Orientierung gebracht wird, in der sie für das erste Zentrifugieren war. Trockne die Probe in einer Vakuum-Zentrifuge. Wende keine Hitze an oder trockne zu stark. Wenn erwünscht, können Reaktionen mit Ethanol gefällt werden.

D. Terminatorreaktions-Säuberung über Sephadex G-50-gefüllte Mikrotiter-Format- Filterplatten

Sephadex (Pharmacia, Piscataway, NJ) sedimentiert; deshalb muß man vor Zugabe zur Platte und ebenso nach Befüllen von jeweils acht bis zehn Näpfen resuspendieren. Gib 400 ul gemischtes Sephadex G-50 jedem Napfeiner Mikrotiter-Filterplatte zu. Bringe Mikrotiter- Filterplatte auf eine Mikrotiter-Platte, um Wasser zu sammeln, und befestige die Seiten mit Band so, daß sie nicht während des Zentrifugierens auseinanderfliegen. Drehe bei 1500 upm für 2 Minuten. Verwerfe das Wasser, das in der Mikrotiter-Platte gesammelt worden ist. Bringe die Mikrotiter-Filterplatte auf eine Mikrotiter-Platte, um Wasser zu sammeln, und befestige die Seiten mit einem Band so, daß sie nicht während des Zentrifugierens auseinanderfliegen. Gib zusätzliche 100-200 ul Sephadex G-50 zu, um die Mikrotiter-Platten-Näpfe zu füllen. Drehe bei 1500 upm für 2 Minuten. Verwerfe das Wasser, das in der Mikrotiter-Platte gesammelt worden ist. Bringe die Mikrotiter-Filterplatte auf eine Mikrotiter-Platte mit Röhrchen, um Wasser zu sammeln, und befestige die Seiten mit einem Band so, daß sie nicht während des Zentrifugierens auseinanderfliegen. Gib 20 ul Terminatorreaktion jedem Sephadex G-50-enthaltendem Napfzu. Drehe bei 1500 upm für 2 Minuten. Bringe den gesammelten Ausfluß in einen Speed-Vac für näherungsweise 1-2 Stunden.
SequenaseTM (UBS; CLEVELAND OH)-katalysiertes Sequenzieren mit markierten Terminatoren. Einzelsträngige Terminatorreaktionen erfordern näherungsweise 2 ug Phenolextrahierte Matrizen-DNA auf M 13-Basis. Die DNA wird denaturiert, und der Primer annealed durch Inkubieren von DNA, Primer und Puffer bei 65ºC. Nachdem die Reaktion auf Zimmertemperatur abgekühlt ist, werden alpha-Thiodesoxynukleotide, markierte Terminatoren und verdünnte SequenaseTM-DNA-Polymerase zugegeben, und die Mischung wird bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von Ammoniumacetat und Ethanol gestoppt, und die DNA-Fragmente werden gefällt und getrocknet. Um bei dem Entfernen von nichteingebauten Terminatoren zu helfen, wird das DNA-Pellet zweimal mit Ethanol gespült. Die getrockneten Sequenzierungsreaktionen könnten bis zu mehreren Tagen bei -20ºC gelagert werden.
Doppelsträngige Terminatorreaktionen erforderten näherungsweise 5 ug Plasmid-DNA, die in einer Diatomeenerde-modifizierten-alkalischen-Lyse-midi-Prep aufgereinigt worden war. Die doppelsträngige DNA wird durch Inkubieren der DNA in Natriumhydroxid bei 65ºC denaturiert, und nach Inkubation wird Primer zugegeben, und die Reaktion wird durch Zugabe eines sauren Puffers neutralisiert. Reaktionspuffer, alpha-Thiodesoxynukleotide, markierte Farbstoff-Terminatoren und verdünnte SequenaseTM-DNA-Polymerase werden dann zugegeben, und die Reaktion wird bei 37ºC inkubiert. Ammoniumacetat wird zugegeben, um die Reaktion abzustoppen, und die DNA-Fragmente werden gefällt, gespült, getrocknet und gelagert. Für einzelsträngige Reaktionen:
Gib folgendes einem 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu:
4 ul ss DNA (2 ug)
4 ul 0,8 uM Primer
2 ul 10x MOPS-Puffer
2 ul 10x Mn²&spplus;/Isocitrat-Puffer
12 ul
Um die DNA zu denaturieren und den Primer zu annealen, inkubiere die Reaktion bei 65ºC- 70ºC für 5 Minuten. Lasse die Reaktion auf Zimmertemperatur für 15 Minuten abkühlen, und zentrifugiere kurz, um Kondensiertes wiederzugewinnen. Gib jeder Reaktion die folgenden Reagentien hinzu und inkubiere für 10 Minuten bei 37ºC.
7 ul ABI Terminator-Mischung (Katalog Nr. 401489)
2 ul verdünnte Sequenase TM (3,25 U/ ul)
1 ul 2 mM α-S dNTPs
22 ul
Die unverdünnte Sequenase TM (Katalog Nr. 70775, United States Biochemicals, Cleveland, OH) ist 13 U/ul und wird 1 : 4 mit USB-Verdünnungspuffer vor der Verwendung verdünnt. Füge 20 ul 9,5 M Ammoniumacetat und 100 ul 95% Ethanol hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und mische.
Fälle die DNA in einem Eiswasserbad für 10 Minuten. Zentrifugiere für 15 Minuten bei 10.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4ºC. Dekantiere sorgfältig den Überstand und spüle das Pellet durch Zugabe von 300 ul 70-80% Ethanol. Mische und Zentrifugiere wieder für 15 Minuten und dekantiere sorgfältig den Überstand.
Wiederhole den Spülschritt, um ein wirksames Entfernen der nicht-eingebauten Terminatoren sicherzustellen. Trockne die DNA für 5-10 Minuten (oder bis sie trocken ist) in dem Speed- Vac, und lagere die getrockneten Reaktionen bei -20ºC.
Für doppelsträngige Reaktionen:
Gib die folgenden einem 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu:
5 ul ds DNA (5 ug)
4 ul 1 N NaOH
3 ul ddH&sub2;O
Inkubiere die Reaktion bei 65ºC-70ºC für 5 Minuten, und zentrifugiere dann kurz, um Kondensiertes wiederzugewinnen. Gib die folgenden Reagentien jeder Reaktion zu, vortexe und zentrifugiere kurz:
3 ul 8 uM Primer
9 ul ddH&sub2;O
4 ul MOPS-saurer Puffer
Zu jeder Reaktion gib die folgenden Reagentien hinzu und inkubiere für 10 Minuten bei 37ºC.
4 ul 10x Mn²&spplus;/Isocitrat-Puffer
6 ul ABI Terminator-Mischung
2 ul verdünnte Sequenase TM (3,25 U/ul)
1 ul 2 mM [alpha]-S-dNTPs
22 ul
Die unverdünnte SEQUENASETM von United States Biochemicals ist 13 U/ul und sollte 1 : 4 mit USB-Verdünnungspuffer vor ihrer Verwendung verdünnt werden. Gib 60 ul 8 M Ammoniumacetat und 300 ul 95% Ethanol hinzu, um die Reaktion abzustoppen, und vortexe. Fälle die DNA in einem Eiswasserbad für 10 Minuten. Zentrifugiere für 15 Minuten bei 10.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4ºC. Dekantiere sorgfältig den Überstand, und spüle das Pellet durch Zugabe von 300 ul 80% Ethanol. Mische die Probe und zentrifugiere wieder für 15 Minuten und dekantiere sorgfältig den Überstand. Wiederhole den Spülschritt, um ein wirksames Entfernen der nicht-eingebauten Terminatoren sicherzustellen. Trockne die DNA für 5 -10 Minuten (oder bis zur Trockenheit) in dem Speed-Vac.

E. Sequenzgel-Herstellung Prä-Elektrophorese Probenladen Elektrophorese Datensammlung und Analyse auf dem ABI 373 DNA-Seguenzierer

Polyacrylamidgele zum DNA-Sequenzieren werden wie oben beschrieben hergestellt, außer daß die Gelmischung vor der Polymerisation gefiltert wird. Glasplatten werden sorgfältig mit heißem Wasser, destilliertem Wasser und Ethanol gesäubert, um potentielle fluoreszierende Verunreinigung vor dem Versiegeln mit Band zu entfernen. Denaturierende 6% Polyacrylamidgele werden in 0,3 mm · 89 cm · 52 cm mit Band versehene Platten gegossen und mit einem 36-Taschen-Kamm versehen. Nach der Polymerisation werden das Band und der Kamm aus dem Gel entfernt, und die äußeren Oberflächen der Glasplatten werden mit heißem Wasser gesäubert und mit destilliertem Wasser und Ethanol gespült. Das Gel wird in einen ABI-Sequenzierer eingebaut und dann durch Laser-Scanning überprüft. Wenn Grundlinienveränderungen auf dem ABI-assoziierten Macintosh-Computerschirm beobachtet werden, werden die Platten erneut gesäubert. Darauffolgend werden die Pufferkammern angehängt, Elektrophoresepuffer wird zugegeben, und das Gel wird einer Vor-Elektrophorese für 10-30 Minuten bei 30 W unterzogen. Vor dem Probenladen werden die vereinigten und getrockneten Reaktionsprodukte in Formamid/EDTA-Ladepuffer durch Vortexen resuspendiert und dann auf 90ºC erhitzt. Ein Probenblatt wird innerhalb der ABI-Datensammlungs-Software auf dem Macintosh-Computer erzeugt, das die Anzahl an geladenen Proben und die zur Sequenzdatenverarbeitung zu verwendende Fluoreszenzmarkierungs-Mobilitäts-Datei anzeigt. Nach Säubern der Probentaschen mit einer Spritze werden die Sequenzierungsreaktionen mit ungeraden Zahlen in die jeweiligen Taschen geladen unter Verwendung eines Mikropipettors, der mit einer flach-spitzigen Gel-Ladespitze ausgestattet ist. Das Gel wird dann für 5 Minuten einer Elektrophorese unterzogen, bevor die Taschen wieder gesäubert werden und die Proben mit geraden Zahlen geladen werden. Das Filterrad, das für Dye-Primer und Dye-Terminatoren verwendet wird, ist auf dem ABI 373A CPU spezifiziert. Typischerweise dauern Elektrophorese und Datensammlung 10 Stunden bei 30 W auf dem ABI 373A, der mit einer hitzeverteilenden Aluminiumplatte ausgestattet ist. Nach der Datensammlung wird eine Bild-Datei durch die ABI-Software erzeugt, die das nachgewiesene Fluoreszenzsignal mit der entsprechenden Scan-Zahl in Beziehung setzt. Die Software bestimmt dann die Proben-Spur- Positionen, auf der Grundlage der Signalintensitäten. Nachdem die Spuren aufgesucht worden sind, wird der Querschnitt an Daten für jede Spur extrahiert und durch Grundliniensubtraktion, Mobilitätsberechnung, spektrale Dekonvolution und Zeitkorrektur verarbeitet. Nach dem Verarbeiten werden die Sequenzdaten-Dateien auf eine SPARCstation 2 unter Verwendung von NFS Share übertragen.
Protokoll: Stelle 8 M Harnstoff, 4,75% Polyacrylamidgele wie oben beschrieben her, unter Verwendung eines 36-Taschen-Kamms. Vor dem Laden säubere die äußere Oberfläche der Gelplatten. Baue die Gelplatten in einen ABI 373A DNA-Sequenzierer ein (Foster City, CA), so daß die untere Scan(gewöhnlicherweise die blaue)Linie einem Intensitätswert von 800 - 1000 entspricht, wenn auf einem Computer-Datensammlungsfenster angezeigt. Wenn die Grundlinie von Vier-Farb-Scan-Linien nicht eben ist, säubere die Glasplatten wieder. Befestige die Aluminium-Hitzeverteilungsplatte. Unterwirfdas Gel für 10-30 Minuten einer Vor- Elektrophorese. Bereite die Proben zum Laden vor. Füge 3 ul FE dem Boden eines jeden Röhrchens zu, vortexe, erhitze für 3 Minuten auf 90ºC und zentrifugiere, um Kondensiertes wiederzugewinnen. Spüle die Probentaschen mit Elektrophoresepuffer unter Verwendung einer Spritze. Unter Verwendung von Gel-Ladepipettierspitzen mit flacher Spitze lade jede Probe mit ungerader Zahl. Unterwirfdas Gel für wenigstens 5 Minuten einer Vor- Elektrophorese; spüle die Taschen wieder und lade dann jede Probe mit gerader Zahl. Beginne die Elektrophorese (30 W für 10 Stunden). Nach der Datensammlung wird die ABI- Software automatisch die Datenanalyse-Software öffnen, die die Gel-Bild-Datei erzeugen, die Daten für jede Probenspur extrahieren und die Daten verarbeiten wird.

F. Doppelsträngiges Sequenzieren von cDNA-Klonen, die lange Poly(A)-Schwänze enthalten, unter Verwendung von verankerten Poly(dT)-Primern

Doppelsträngige Matrizen von cDNAs, die lange Poly(A)-Abschnitte enthalten, sind schwierig mit Vektorprimern zu sequenzieren, die stromab von dem Poly(A)-Schwanz annealen. Sequenzieren mit diesen Primern führt zu einer langen Poly(T)-Leiter, gefolgt von einer Sequenz, die schwierig zu lesen sein kann. Um dieses Problem zu umgehen, wurden drei Primer, die (dT)17 und entweder (dA) oder (dC) oder (dG) am 3'-Ende enthalten, konstruiert, um die Primer zu "verankern" und das Sequenzieren der Region unmittelbar stromauf von der Poly(A)-Region zu ermöglichen. Unter Verwendung dieses Protokolls konnten über 300 bp lesbare Sequenz erhalten werden. Die Sequenz des gegenüberliegenden Stranges dieser cDNAs wurde unter Verwendung von Insert-spezifischen Primern stromauf von der Poly(A)-Region bestimmt. Die Fähigkeit, direkt Sequenz unmittelbar stromauf vom Poly(A)-Schwanz von cDNAs zu erhalten, sollte von besonderer Wichtigkeit für Versuche auf großem Maßstab sein, sequenzmarkierte Stellen (STSs) aus cDNAs zu erzeugen.
Das Protokoll ist wie folgt. Synthetisiere verankertes Poly(dT)17 mit Ankern von (dA) oder (dC) oder (dG) am 3'-Ende auf einem DNA-Synthesizer und verwende es nach der Aufreinigung auf Oligonucleotide Purification Cartridges (Amicon, Beverly, MA). Zum Sequenzieren mit verankerten Primern denaturiere 5-10 ug Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 50 ul, das 0,2 M Natriumhydroxid und 0,16 mM EDTA enthält, durch Inkubation bei 65ºC für 10 Minuten. Gib die drei Poly(dT)-verankerten Primer (2 umol von jedem) hinzu und bringe die Mischung sofort auf Eis. Neutralisiere die Lösung durch Zugabe von 5 ml 5 M Ammoniumacetat, pH 7,0.
Fälle die DNA durch Zugabe von 150 ul kaltem 95% Ethanol und wasche das Pellet zweimal mit kaltem 70% Ethanol. Trockne das Pellet für 5 Minuten und resuspendiere dann in MOPS- Puffer. Anneale die Primer durch Erhitzen der Lösung für 2 Minuten bei 65ºC, gefolgt von langsamem Abkühlen auf Zimmertemperatur für 15-30 Minuten. Führe Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung von modifzierter T7-DNA-Polymerase und α-[³²P]dATP (> 1000 Ci/mmol) durch, unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls.

6. cDNA-Sequenzieren auf Grundlage von PCR- und Zufalls-Shotgun-Klonieren

Das Folgende ist ein Verfahren zum Sequenzieren von klonierten cDNAs, auf der Grundlage von PCR-Amplifizierung, Zufalls-Shotgun-Klonieren und automatisiertem Fluoreszenz- Sequenzieren. Dieser Ansatz auf PCR-Basis verwendet ein Primerpaar zwischen den gewöhnlichen "universellen" Vorwärts- und Rückwärts-Priming-Stellen und den vielfachen Klonierstellen des Stratagene Bluescript Vektors. Diese zwei PCR-Primer mit der Sequenz 5'- TCGAGGTCGACGGTATCG-3' (Seq. ID No. 15) für den Vorwärts- oder -16bs-Primer und 5'-GCCGCTCTAGAACTAG TG-3' (Seq. ID No. 16) für den Rückwärts- oder +19bs- Primer, können verwendet werden, um ausreichende Quantitäten an cDNA-Inserts im 1,2- bis 3,4 kb-Größenbereich zu amplifizieren, so daß der unten beschriebene Zufalls-Shotgun- Sequenzieransatz implementiert werden könnte.
Das Folgende ist das Protokoll. Inkubiere vier 100 ul PCR-Reaktionen, von denen jede näherungsweise 100 ng Plasmid-DNA, 100 umol jedes Primers, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,5, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM jedes dNTP und 5 Einheiten PE-Cetus-Amplitaq in 0,5 ml Schnapp-Kappen-Röhrchen enthält, für 25 Zyklen von 95ºC für 1 Minute, 55ºC für 1 Minute und 72ºC für 2 Minuten in einem PE-Cetus-48-Röhrchen-DNA-Thermal Cycler. Nach Vereinigen der vier Reaktionen wird die wässrige Lösung, die das PCR-Produkt enthält, in einen Zerstäuber gebracht, auf 2,0 ml durch Zugabe von näherungsweise 0,5 bis 1,0 ml Glycerin gebracht und bei -20ºC equilibriert, indem sie entweder in ein Isopropylalkohol/Trockeneis- oder gesättigtes wässriges NaCi/Trockeisbad für 10 Minuten gebracht wurde. Die Probe wird bei -20ºC zerstäubt, indem 25-30 psi Stickstoffdruck für 2,5 min angewendet werden. Nach einer Ethanolfällung zum Konzentrieren des PCR-Produktes, das einer Scherung unterworfen worden war, wurden die Fragmente stumpfendig gemacht und durch Inkubation mit dem Klenow-Fragment aus E. coli DNA-Polymerase und T&sup4;-Polynukleotidkinase, wie zuvor be schrieben, phosphoryliert. Fragmente in dem 0,4 bis 0,7 kb-Bereich wurden durch Elution aus einem niedrig schmelzenden Agarosegel erhalten.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Van Ness, Jeffrey
Tabone, John C.
Howbert, J. Jeffry
Mulligan, John T.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: VERFAHREN UND ZUSAMMENSETZUNGEN ZUM BESTIMMEN DER SEQUENZ VON NUKLEINSÄUREMOLEKÜLEN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 16
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: SEED and BERRY
(B) STRASSE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
(C) ORT: Seattle
(D) STAAT: Washington
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 98104-7092
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release 1.0, Version 1.30
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG: 22. Januar 1997
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:
(A) NAME: McMasters, David D.
(B) REGISTRIERNUMMER: 33,963
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 240052.416
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (206) 622-4900
(B) TELEFAX: (206) 682-6031
(2) ANGABEN ZU SEQ ID No: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5.
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

Claims

1. Ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, das umfaßt:

(a) Erzeugen markierter Nukleinsäurefragmente, die zu einem ausgewählten Target- Nukleinsäuremolekül komplementär sind, wobei eine Markierung eine organische Einheit ist, die mit einem bestimmten Nukleotid korrelativ und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist;

(b) Auftrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge;

(c) Abspalten der Markierungen von den markierten Fragmenten; und

(d) Nachweisen der Markierungen mit Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls daraus.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der Markierungen durch Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Ultraviolettspektrometrie oder potentiostatische Amperometrie erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei die markierten Fragmente in Schritt (b) durch ein Verfahren aufgetrennt werden, das ausgewählt ist aus Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Mikrokanal-Elektrophorese und HPLC.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die markierten Fragmente in Schritt (c) abgespalten werden durch ein Verfahren, das ausgewählt ist aus Oxidations-, Reduktions-, säurelabilen, baselabilen, enzymatischen, elektrochemischen, thermischen, Thiolaustauschs- und photolabilen Verfahren.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Markierungen durch Flugzeit- Massenspektrometrie, Quadrupol-Massenspektrometrie, Magnetsektor-Massenspektrometrie oder Elektrosektor-Massenspektrometrie nachgewiesen werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Markierungen mit coulometrischen Detektoren oder amperometrischen Detektoren nachgewiesen werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die markierten Nukleinsäurefragmente in Schritt (a) von einem 5'-Terminus zu einem 3'-Terminus erzeugt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei Schritt (a) mehr als vier der markierten Nukleinsäurefragmente erzeugt und jede Markierung für ein Nukleinsäurefragment einzigartig ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei Schritte (b), (c) und (d) in einer kontinuierlichen Weise durchgeführt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei Schritte (b), (c) und (d) in einer kontinuierlichen Weise auf einem System durchgeführt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei einer oder mehrere der Schritte automatisiert sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11, wobei die markierten Fragmente aus Oligonukleotidprimern erzeugt werden, die an eine Markierung an einem Ende des Primers, das nicht das 3'-Ende ist, konjugiert sind.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, wobei die markierten Fragmente aus markierten Didesoxynukleotidterminatoren erzeugt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, wobei wenigstens ein markiertes Nukleinsäurefragment eine Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 34 ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3-4 und 7-14, wobei der Nachweis der Markierungen durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie erfolgt.

16. Eine Verbindung der Formel:

Tms-L-X

wobei,

Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod;

L eine organische Gruppe ist, die ermöglicht, eine einzigartige Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abzuspalten, wobei die TrnS-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzigen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und tertiäres Amin, quartäres Amin oder organische Säure ist; und

X ein Nukleinsäurefragment ist;

unter den Bedingungen, daß die Verbindung nicht an einen festen Träger durch X gebunden ist noch eine Masse von weniger als 250 Dalton hat.

17. Verbindung nach Anspruch 16, wobei Tms eine Masse von 15-10.000 Dalton und eine molekulare Formel von C&sub1;&submin;&sub5;&sub0;&sub0;N&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;O&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;S&sub0;&submin;&sub1;&sub0;P&sub0;&submin;&sub1;&sub0;HαFβIδ hat, wobei die Summe von α, β und δ ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, P- und S-Atome abzusättigen.

18. Verbindung nach einem der Ansprüche 16-17, wobei Tms und L durch eine funktionelle Gruppe aneinander gebunden sind, die ausgewählt ist aus Amid, Ester, Ether, Amin, Sulfid, Thioester, Disulfid, Thioether, Harnstoff, Thioharnstoff, Carbamat, Thiocarbamat, Schiff sche Base, reduzierte Schiff sche Base, Imin, Oxim, Hydrazon, Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Sulfonat, Sulfonamid oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung.

19. Verbindung nach einem der Ansprüche 16-18, wobei die funktionelle Gruppe, durch die Tms und L aneinander gebunden sind, aus Amid, Ester, Amin, Harnstoff und Carbamat ausgewählt ist.

20. Verbindung nach einem der Ansprüche 16-19, wobei L ausgewählt ist aus Lhν, LSäure, LBase, L[O], L[R], Lenz, Lenc, LΔ und LSS, wobei aktinische Strahlung, Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Enzym, elektrochemischer, thermischer bzw. Thiolaustausch bewirken, daß die Tm5-enthaltende Einheit von dem Rest des Moleküls abgespalten wird.

21. Verbindung nach einem der Ansprüche 16-20, wobei L Lhν ist und die Formel L¹-L²-L³ hat, wobei L² ein molekulares Fragment ist, das aktinische Strahlung absorbiert, um die Abspaltung von Tms von X zu fördern, und L¹ und L³ unabhängig eine direkte Bindung oder eine organische Einheit sind, wobei L¹L² von T trennt und L³ L² von X trennt und weder L¹ noch L³ Bindungsspaltung durchlaufen, wenn L² die aktinische Strahlung absorbiert. 22. Verbindung nach einem der Ansprüche 16-21, wobei L Lhν ist, Lhν die Formel L¹-L²-L³ hat und -L²-L³ die Formel hat:

wobei ein Kohlentstoffatom an Positionen a, b, c, d oder e mit -L³-X substituiert ist und fakultativ eine oder mehrere Positionen b, c, d oder e mit Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert sind; und R¹ Wasserstoff oder Hydrocarbyl ist.

23. Verbindung nach Anspruch 22, wobei sich -L³-X an Position a befindet.

24. Verbindung nach Anspruch 21, wobei L³ ausgewählt ist aus einer direkten Bindung, einem Hydrocarbylen, -O-Hydrocarbylen und Hydrocarbylen-(O-hydrocarbylen)n-H und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 10 ist.

25. Verbindung nach einem der Ansprüche 16-24, wobei -L-X die Formel hat:

wobei eine oder mehrere Positionen b, c, d oder e mit Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert sind; R¹ Wasserstoff oder Hydrocarbyl ist und R² ein Nukleinsäurefragment ist.

26. Verbindung nach einem der Ansprüche 16-25, wobei Tms die Formel hat:

T²-(J-T³-)n-

T² eine organische Einheit ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet ist, mit einer Masse von 15 bis 500 Dalton;

T³ eine organische Einheit ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet ist, mit einer Masse von 50 bis 1.000 Dalton;

J eine direkte Bindung oder eine funktionelle Gruppe ist, die ausgewählt ist aus Amid, Ester, Amin, Sulfid, Ether, Thioester, Disulfid, Thioether, Harnstoff, Thioharnstoff, Carbamat, Thiocarbamat, Schiff sche Base, reduzierte Schiff sche Base, Imin, Oxim, Hydrazon, Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Sulfonat, Sulfonamid oder Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindung; und

n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 50 ist, und, wenn n größer als 1 ist, jedes T³ und J unabhängig ausgewählt ist.

27. Verbindung nach Anspruch 26, wobei T² ausgewählt ist aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-Ohydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbylamid-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen, Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen, Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, substituiertem Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor und die Substituenten ausgewählt sind aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S- hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen und Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen, sowie Derivaten eines der vorhergehenden, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe mit einer gleichen Anzahl von Fluoriden ersetzt ist.

28. Verbindung nach einem der Ansprüche 26-27, wobei T³ die Formel -G(R²)- hat, G C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylen ist mit einem einzelnen R²-Substituenten und R² ausgewählt ist aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl-kondensiertem Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Arylsubstituiertem Alkenyl oder Alkinyl, Cycloalkyl-substituiertem Alkyl, Cycloalkenylsubstitiertem Cycloalkyl, Biaryl, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Aralkoxy, Aryl-substituiertem Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryl-substituiertem Alkylamino, Aryl-substituiertem Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryloxy, Arylamino, N- Alkylharnstoff-substituiertem Alkyl, N-Arylharnstoff-substituiertem Alkyl, Alkylcarbonylamino-substituiertem Alkyl, Aminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylsubstituiertem Alkyl, Heterocyclylsubstituiertem Amino, Carboxyalkyi-substituiertem Aralkyl, Oxocarbocyclyl-kondensiertem Aryl und Heterocyclylalkyl; Cycloalkenyl, Arylsubstituiertem Alkyl und Aralkyl, Hydroxy-substituiertem Alkyl, Alkoxy-substituiertem Alkyl, Aralkoxy-substituiertem Alkyl, Alkoxy-substituiertem Alkyl, Aralkoxy-substituiertem Alkyl, Amino-substituiertem Alkyl, (Aryl-substituiertem Alkyloxycarbonylamino)- substituiertem Alkyl, Thiol-substituiertem Alkyl, Alkylsulfonyl-substituiertem Alkyl, (Hydroxy-substituiertem Alkylthio)-substituiertem Alkyl, Thioalkoxy-substituiertem Alkyl, Hydrocarbylacylamino-substituiertem Alkyl, Heterocyclylacylamino-substituiertem Alkyl, Hydrocarbyl-substituiertem-Heterocyclylacylamino-substituiertem Alkyl, Alkylsulfonylaminosubstituiertem Alkyl, Arylsulfonylamino-substituiertem Alkyl, Morpholinoalkyl, Thiomorpholinoalkyl, Morpholinocarbonyl-substituiertem Alkyl, Thiomorpholinocarbonylsubstituiertem Alkyl, [N-(Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl)- oder N,N-[Dialkyl, Dialkenyl, Dialkinyl oder (Alkyl, Alkenyl)-amino]carbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclylaminocar bonyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonyl, Heterocyclylaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonyl-substituiertem AIkyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbonyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbony1-substituiertem Alkyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonylalkyl, Carboxylsubstituiertem Alkyl, Dialkylamino-substituiertem Acylaminoalkyl und Aminosäureseitenketten, ausgewählt aus Arginin, Asparagin, Glutamin, S-Methylcystein, Methionin und entsprechenden Sulfoxid- und Sulfonderivaten davon, Glycin, Leucin, Isoleucin, allo-Isoleucin, tert.-Leucin, Norleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Prolin, Alanin, Ornithin, Histidin, Glutamin, Valin, Threonin, Serin, Asparaginsäure, beta-Cyanoalanin und allo-Threonin; Alinyl und Heterocyclylcarbonyl, Aminocarbonyl, Amido, Mono- oder Dialkylaminocarbonyl, Mono- oder Diarylaminocarbonyl, Alkylarylaminocarbonyl, Diarylaminocarbonyl, Mono- oder Diacylaminocarbonyl, aromatischem oder aliphatischem Acyl, Alkyl, das fakultativ mit Substituenten substituiert ist, die ausgewählt sind aus Amino, Carboxy, Hydroxy, Mercapto, Mono- oder Dialkylamino, Mono- oder Diarylamino, Alkylarylamino, Diarylamino, Mono- oder Diacylamino, Alkoxy, Alkenoxy, Aryloxy, Thioalkoxy, Thioalkenoxy, Thioalkinoxy, Thioaryloxy und Heterocyclyl.

29. Verbindung nach einem der Ansprüche 26-28 mit der Formel:

wobei

G (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub6; ist, wobei ein Wasserstoff an einer und nur einer der CH&sub2;-Gruppen eines jeden G durch -(CH&sub2;)c-Amid-T&sup4; ersetzt ist;

T² und T&sup4; organische Einheiten der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;S&sub0;&submin;&sub3;P&sub0;&submin;&sub3;HαFβIδ sind, wobei die Summe von α, β und δ ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen;

R¹ Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl ist;

c eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 4 ist;

X nach Anspruch 1 definiert ist; und

n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, G, c, Amid, R¹ und T&sup4; unabhängig ausgewählt werden.

30. Verbindung nach einem der Ansprüche 26-29 mit der Formel:

wobei T&sup5; eine organische Einheit der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;S&sub0;&submin;&sub3;P&sub0;&submin;&sub3;HαFβIδ ist, wobei die Summe von α, β und δ ausreicht, um die ansonsten ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen; und T&sup5; ein tertiäres oder quartäres Amin oder eine organische Säure einschließt; und m eine ganze Zahl im Bereich von 0-49 ist.

31. Verbindung nach einem der Ansprüche 26-29 mit der Formel:

32. Verbindung nach einem der Ansprüche 30-31, wobei -Amid-T&sup5; ausgewählt ist aus:

33. Verbindung nach einem der Ansprüche 30-31, wobei -Amid-T&sup5; ausgewählt ist aus:

34. Verbindung nach einem der Ansprüche 26-33, wobei T² die Struktur hat, die resultiert, wenn eine der folgenden organischen Säuren mit einer Amingruppe kondensiert wird, um T²- C(=O)-N(R¹)- zu bilden: Ameisensäure, Essigsäure, Propiolsäure, Priopionsäure, Fluoressigsäure, 2-Butinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Buttersäure, Methoxyessigsäure, Difluoressigsäure, 4-Pentinsäure, Cyclobutancarbonsäure, 3,3-Dimethyiacrylsäure, Valeriansäure, N,N- Dimethylglycin, N-Formyl-Gly-OH, Ethoxyessigsäure, (Methylthio)essigsäure, Pyrrol-2- carbonsäure, 3-Furancarbonsäure, Isoxazol-5-carbonsäure, trans-3-Hexensäure, Trifluoressigsäure, Hexansäure, Ac-Gly-OH, 2-Hydroxy-2-methylbuttersäure, Benzoesäure, Nicotinsäure, 2-Pyrazincarbonsäure, 1-Methyl-2-pyrrolcarbonsäure, 2-Cyclopenten-1-essigsäure, Cyclopentylessigsäure, (S)-(-)-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure, N-Methyl-L-prolin, Heptansäure, Ac-b- Ala-OH, 2-Ethyl-2-hydroxybuttersäure, 2-(2-Methoxyethoxy)essigsäure, p-Toluylsäure, 6- Methylnicotinsäure, 5-Methyl-2-pyrazincarbonsäure, 2,5-Dimethylpyrrol-3-carbonsäure, 4- Fluorbenzoesäure, 3,5-Dimethylisoxazol-4-carbonsäure, 3-Cyclopentylpropionsäure, Octansäure, N,N-Dimethylsuccinamidsäure, Phenylpropiolsäure, Zimtsäure, 4-Ethylbenzoesäure, p- Anissäure, 1,2,5-Trimethylpyrrol-3-carbonsäure, 3-Fluor-4-methylbenzoesäure, Ac-DL- Propargylglycin, 3-(Trifluormethyl)buttersäure, 1-Piperidinpropionsäure, N-Acetylprolin, 3,5- Difluorbenzoesäure, Ac-L-Val-OH, Indol-2-carbonsäure, 2-Benzofurancarbonsäure, Benzotriazol-5-carbonsäure, 4-n-Propylbenzoesäure, 3-Dimethylaminobenzoesäure, 4- Ethoxybenzoesäure, 4-(Methylthio)benzoesäure, N-(2-Furoyl)glycin, 2- (Methylthio)nicotinsäure, 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure, Tfa-Gly-OH, 2-Naphthoesäure, Chinaldinsäure, Ac-L-Ile-OH, 3-Methylinden-2-carbonsäure, 2-Chinoxalincarbonsäure, 1- Methylindol-2-carbonsäure, 2,3,6-Trifluorbenzoesäure, N-Formyl-L-Met-OH, 2-[2-(2- Methoxyethoxy)ethoxy]essigsäure, 4-n-Butylbenzoesäure, N-Benzoylglycin, S-Fluorindol-2- carbonsäure, 4-n-Propoxybenzoesäure, 4-Acetyl-3,5-dimethyl-2-pyrrolcarbonsäure, 3,5- Dimethoxybenzoesäure, 2,6-Dimethoxynicotinsäure, Cyclohexanpentansäure, 2- Naphthylessigsäure, 4-(1H-Pyrrol-1-yl)benzoesäure, Indol-3-propionsäure, m- Trifluormethylbenzoesäure, 5-Methoxyindol-2-carbonsäure, 4-Pentylbenzoesäure, Bz-b-Ala- OH, 4-Diethylaminobenzoesäure, 4-n-Butoxybenzoesäure, 3-Methyl-5-CF3-isoxazol-4- carbonsäure, (3,4-Dimethyoxyphenyl)essigsäure, 4-Biphenylcarbonsäure, Pivaloyl-Pro-OH, Octanoyl-Gly-OH, (2-Naphthoxy)essigsäure, Indol-3-buttersäure, 4- (Trifluormethyl)phenylessigsäure, 5-Methoxyindol-3-essigsäure, 4- (Trifluormethoxy)benzoesäure, Ac-L-Phe-OH, 4-Pentyloxybenzoesäure, Z-Gly-OH, 4- Carboxy-N-(fur-2-ylmethyl)pyrrolidin-2-on, 3,4-Diethoxybenzoesäure, 2,4-Dimethyl-5 - CO&sub2;Et-pyrrol-3-carbonsäure, N-(2-Fluorphenyl)süccinamidsäure, 3,4,5 - Trimethoxybenzoesäure, N-Phenylanthranilsäure, 3-Phenoxybenzoesäure, Nonanoyl-Gly-OH, 2-Phenoxypyridin-3-carbonsäure, 2,5-Dimethyl-1-phenylpyrrol-3-carbonsäure, trans-4- (Trifluormethyl)zimtsäure, (5-Methyl-2-phenyloxazol-4-yl)essigsäure, 4-(2- Cyclohexenyloxy)benzoesäure, 5-Methoxy-2-methylindol-3-essigsäure, trans-4- Cotinincarbonsäure, Bz-5-Aminovaleriansäure, 4-Hexyloxybenzoesäure, N-(3- Methoxyphenyl)succinamidsäure, Z-Sar-OH, 4-(3,4-Dimethoxyphenyl)buttersäure, Ac-o- Fluor-DL-Phe-OH, N-(4-Fluorphenyl)glutaminsäure, 4'-Ethyl-4-biphenylcarbonsäure, 1,2,3,4-Tetrahydroacridincarbonsäure, 3-Phenoxyphenylessigsäure, N-(2,4- Difluorphenyl)succinamidsäure, N-Decanoyl-Gly-OH, (+)-6-Methoxy-a-methyl-2- naphthalinessigsäure, 3-(Trifluormethoxy)zimtsäure, N-Formyl-DL-Trp-OH, (R)-(+)-α- Methoxy-α-(trifluormethyl)phenylessigsäure, Bz-DL-Leu-OH, 4- (Trifluormethoxy)phenoxyessigsäure, 4-Heptyloxybenzoesäure, 2,3,4-Trimethoxyzimtsäure, 2,6-Dimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionsäure, 2,3,4,5,6- Pentafluorphenoxyessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)giutaminsäure, N-Undecanoyl-Gly-OH, 2-(4-Fluorbenzoyl)benzoesäure, 5-Trifluormethoxyindol-2-carbonsäure, N-(2,4- Difluorphenyl)diglycolamidsäure, Ac-L-Trp-OH, Tfa-L-Phenylglycin-OH, 3-Iodbenzoesäure, 3-(4-n-Pentylbenzoyl)propionsäure, 2-Phenyl-4-chinolincarbonsäure, 4-Octyloxybenzoesäure, Bz-L-Met-OH, 3,4,5-Triethoxybenzoesäure, N-Lauroyl-Gly-OH, 3,5- Bis(trifluormethyl)benzoesäure, Ac-5-Methyl-DL-Trp-OH, 2-Iodphenylessigsäure, 3-Iod-4- methylbenzoesäure, 3-(4-n-Hexylbenzoyl)propionsäure, N-Hexanoyl-L-Phe-OH, 4- Nonyloxybenzoesäure, 4'-(Trifluormethyl)-2-biphenylcarbonsäure, Bz-L-Phe-OH, N- Tridecanoyl-Gly-OH, 3,S-Bis(trifluormethyl)phenylessigsäure, 3-(4-n- Heptylbenzoyl)propionsäure, N-Heptanoyl-L-Phe-OH, 4-Decyloxybenzoesäure, N-(α,α,αtrifluor-m-tolyl)anthranilsäure, Nifluminsäure, 4-(2-Hydroxyhexafluorisopropyl)benzoesäure, N-Myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-Octylbenzoyl)propionsäure, N-Octanoyl-L-Phe-OH, 4- Undecyloxybenzoesäure, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionyl-Gly-OH, 8- Iodnaphthoesäure, N-Pentadecanoyl-Gly-OH, 4-Dodecyloxybenzoesäure, N-Palmitoyl-Gly- OH und N-Stearoyl-Gly-OH.

35. Eine Zusammensetzung, die eine Mehrzahl von Verbindungen nach einem der Ansprüche 16-34 umfaßt, wobei keine zwei Verbindungen entweder dasselbe Tms oder dasselbe X haben, und wobei sich, wenn die Zusammensetzung ein Paar von besagten Verbindungen umfaßt, die X-Einheiten um mehr als eine nicht-identische Base unterscheiden.

36. Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei die Mehrzahl größer als 2 ist.

37. Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei die Mehrzahl größer als 4 ist.

38. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35-37, wobei das Nukleinsäurefragment eine zu einem Teil eines Vektors komplementäre Sequenz hat, wobei das Fragment in der Lage ist, Nukleotidsynthese zu primen.

39. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35-38, wobei sich die Tms-Gruppen von Mitgliedern der Mehrzahl um wenigstens 2 amu unterscheiden.

40. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35-38, wobei sich die Tms-Gruppen von Mitgliedern der Mehrzahl um wenigstens 4 amu unterscheiden.

41. Zusammensetzung, die Wasser und eine Verbindung nach einem der Ansprüche 16-34 umfaßt.

42. Zusammensetzung nach Anspruch 41, die weiterhin Puffer umfaßt, der einen pH von ungefähr 5 bis ungefähr 9 hat.

43. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 41-42, die weiterhin ein Enzym und eines von dATP, dGTP, dCTP und dTTP umfaßt.

44. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 41-42, die weiterhin ein Enzym und eines von ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP umfaßt.

45. Zusammensetzung, die eine Mehrzahl an Sätzen von Verbindungen nach einem der Ansprüche 16-34 umfaßt;

wobei innerhalb eines Satzes alle Mitglieder dieselbe Tms-Gruppe haben und die Nukleinsäurefragmente variable Längen haben, die mit demselben Didesoxynukleotid enden, das ausgewählt ist aus ddAMP, ddGMP, ddCMP und ddTMP; und

wobei, zwischen den Sätzen, sich die Tms-Gruppen um wenigstens 2 amu unterscheiden.

46. Zusammensetzung nach Anspruch 45, wobei die Mehrzahl wenigstens 3 ist.

47. Zusammensetzung nach Anspruch 45, wobei die Mehrzahl wenigstens 5 ist.

48. Eine Zusammensetzung, die eine erste Mehrzahl an Sätzen von Verbindungen nach Anspruch 45 und eine zweite Mehrzahl an Sätzen von Verbindungen nach einem der Ansprüche 16-34 umfaßt;

wobei alle Mitglieder innerhalb der zweiten Mehrzahl eine Nukleinsäuresequenz haben, die mit demselben Didesoxynukleotid endet, das ausgewählt ist aus ddAMP, ddGMP, ddCMP und ddTMP; unter der Bedingung, daß das bei den Verbindungen der ersten Mehrzahl vorhandene Didesoxynukleotid nicht dasselbe Didesoxynukleotid ist, das bei den Verbindungen der zweiten Mehrzahl vorliegt.

49. Ein Kit zur DNA-Sequenzanalyse, der eine Mehrzahl an Behälter-Sätzen umfaßt, wobei jeder Behälter-Satz wenigstens fünf Behälter umfaßt, wobei ein erster Behälter einen Vektor enthält, ein zweiter, dritter, vierter und fünfterBehälter Verbindungen nach einem der Ansprüche 16-34 enthalten; und

das Nukleinsäurefragment in dem zweiten, dritten, vierten und fünften Behälter identisch und zu einem Teil des Vektors innerhalb des Satzes an Behältern komplementär ist, und die Tms- Gruppe innerhalb eines jeden Behälters von den anderen Tms-Gruppen im Kit verschieden ist.

50. Kit nach Anspruch 49, wobei die Mehrzahl wenigstens 3 ist.

51. Kit nach Anspruch 49, wobei die Mehrzahl wenigstens 5 ist.

52. Ein System, das sich zur Verwendung bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1- 15 eignet, das eine Trennungsapparatur, die markierte Nukleinsäurefragmente trennt, eine Apparatur, die von einem markierten Nukleinsäurefragment eine Markierung abspaltet, die mit einem bestimmten Nukleotid korrelativ und durch elektrochemischen Nachweis nachweisbar ist, und eine Apparatur für potentiostatische Amperometrie umfaßt.