DE69701612T2

DE69701612T2 - Verfahren und zusammensetzungen zum analysieren von nukleinsäuremolekulen mittels bemessungstechniken

Info

Publication number: DE69701612T2
Application number: DE69701612T
Authority: DE
Inventors: Jeffry Howbert; T. Mulligan; C. Tabone; Jeffrey Van Ness
Original assignee: Qiagen Genomics Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 2000-08-31
Anticipated expiration: 2017-01-24
Also published as: PL328239A1; GR3033887T3; JP2008200040A; HUP9901856A2; DE69701612D1; DE69739465D1; CN1212020A; ATE434054T1; WO1997027325A2; BR9707016A; NZ331043A; EP0840804A1; CA2243546C; CN1202260C; ATE191515T1; CA2243546A1; KR19990081924A; WO1997027325A3; CZ228598A3; KR100482915B1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Zusammensetzungen zum Analysieren von Nukleinsäuremolekülen und, genauer gesagt, Markierungen, die in einer breiten Vielfalt von Nukleinsäurereaktionen eingesetzt werden können, bei denen die Abtrennung von Nukleinsäuremolekülen auf der Grundlage ihrer Größe erforderlich ist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Nachweis und Analyse von Nukleinsäuremolekülen sind mit die wichtigsten Techniken in der Biologie. Solche Techniken sind wesentlich in der Molekularbiologie und spielen eine sich schnell erweiternde Rolle im Rest der Biologie.
Im allgemeinen umfaßt eine Art von Analyse von Nukleinsäurereaktionen die Abtrennung von Nukleinsäuremolekülen auf der Grundlage ihrer Länge. Zum Beispiel ist eine im breiten Umfang verwendete Technik, die Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe U.S.-Patente Nrn. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159), eine im breiten Umfang eingesetzte Technik geworden, um sowohl in einer Probe vorliegende Sequenzen zu identifizieren als auch DNA-Moleküle für weitere Manipulation zu synthetisieren.
Kurz gesagt werden bei der PCR DNA-Sequenzen durch eine enzymatische Reaktion amplifiziert, die neue DNA-Stränge in entweder einer geometrischen oder linearen Art und Weise synthetisiert. Im Anschluß an die Amplifikation müssen die DNA-Sequenzen nachgewiesen und identifiziert werden. Wegen nicht-spezifischer Amplifikationen, die ansonsten die Analyse durcheinanderbringen würden, oder einer Reinheitsanforderung werden die PCR-Reaktionsprodukte im allgemeinen vor dem Nachweis einer Trennung unterzogen. Die Trennung auf der Grundlage der Größe (d. h. Länge) der Produkte liefert die nützlichste Information. Das Verfahren, das die höchste Auflösung von Nukleinsäuremolekülen ergibt, ist die elektrophoretische Trennung. Bei diesem Verfahren wird jede einzelne PCR-Reaktion auf ein geeignetes Gel aufgebracht und einem Spannungspotential ausgesetzt. Die Anzahl von Proben, die verarbeitet werden können, ist durch die Anzahl von Näpfen im Gel beschränkt. Auf den meisten Gelvorrichtungen können ungefähr 10 bis 64 Proben in einem einzigen Gel getrennt werden. Somit ist die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben sowohl arbeits- als auch materialintensiv.
Elektrophoretische Trennung muß mit irgendeinem Nachweissystem gekoppelt werden, um Daten zu erhalten. Nachweissysteme für Nukleinsäuren verwenden im allgemeinen, und fast ausschließlich, einen Einlagerungsfarbstoff oder eine radioaktive Markierung und weniger häufig eine nicht-radioaktive Markierung. Einlagerungsfarbstoffe, wie etwa Ethidiumbromid, sind einfach zu verwenden. Der Farbstoff wird, während der Elektrophorese in die Gelmatrix einbezogen oder das Gel wird, im Anschluß an die Elektrophorese, in einer farbstoffhaltigen Lösung getränkt. Der Farbstoff kann in einigen Fällen direkt sichtbar gemacht werden, wird aber häufiger, und insbesondere für Ethidiumbromid, mit Licht (z. B. UV) angeregt, um zu fluoreszieren. Trotz dieser offensichtlich einfachen Anwendung haben solche Farbstoffe einige merkbare Nachteile. Erstens sind die Farbstoffe unempfindlich und es muß eine große Menge an Nukleinsäuremolekülen vorliegen, um die Produkte sichtbar zu machen. Zweitens sind die Farbstoffe typischerweise mutagen oder karzinogen.
Eine empfindlichere Nachweistechnik als Farbstoffe verwendet eine radioaktive (oder nicht- radioaktive) Markierung. Typischerweise wird entweder ein radioaktiv markiertes Nukleotid oder ein radioaktiv markierter Primer in die PCR-Reaktion einbezogen. Im Anschluß an die Trennung wird die radioaktive Markierung durch Autoradiographie "sichtbar gemacht". Obgleich empfindlicher leidet der Nachweis an Filmbeschränkungen, wie etwa Abweichung vom Reziprozitätsgesetz und Nicht-Linearität. Diese Beschränkungen können überwunden werden, indem die Markierung durch Phosphorbildanalyse nachgewiesen wird. Radioaktive Markierungen haben jedoch hohe Anforderungen an die Sicherheit, was die Ausnutzung von Resourcen erhöht und spezialisierte Ausrüstung und Personaltraining erfordert. Aus solchen Gründen hat die Verwendung von nicht-radioaktiven Markierungen zunehmend an Popularität gewonnen. In solchen Systemen enthalten Nukleotide eine Markierung, wie etwa ein Fluorphor, Biotin oder Digoxin, die durch einen Antikörper oder ein anderes Molekül (z. B. anderes Teil eines Ligandenpaares) nachgewiesen werden kann, der (das) mit einem Enzym markiert ist, das mit einem chromogenen Substrat reaktiv ist. Diese Systeme haben nicht die Sicherheitsbedenken, wie oben beschrieben, verwenden aber Komponenten, die oft labil sind und nicht-spezifische Reaktionen liefern können, was zu einem hohen Hintergrund führt (d. h. niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis).
WO-A-9504160 offenbart ein Markierungsreagens, das eine Analyteinheit mit zwei Analytresten umfaßt, die mit einer Markierungseinheit mit einer Reportergruppe verknüpft sind. Eine Bibliothek dieser Reagentien wird verwendet, um Nukleinsäure zu sequenzieren.
Jacobson et al. (G. A. T. A., Vol. 8, S. 223-29, 1991) offenbart ein Markierungsreagens, das eine anorganische Markierung umfaßt.
WO-A-9528640 offenbart ein Markierungsreagens und ein Testsystem, bei dem relevante Nukleotidgruppen und entsprechende Reportergruppen auf beiden Seiten eines einzelnen Linkers hinzugefügt werden.
US-A-5 324 231 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von RFLP unter Verwendung spezifischer Primer, die mit nicht-radioaktiven Markierungen, wie etwa Chromophoren, markiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Zusammensetzungen und Verfahren zur Verfügung, die in einer breiten Vielfalt von Nukleinsäurereaktionen eingesetzt werden können und überdies weitere verwandte Vorteile bereitstellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Kurz gesagt stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Verfügung, die in einer breiten Vielfalt von Ligandenpaarreaktionen eingesetzt werden können, bei denen die Trennung von interessierenden Molekülen, wie etwa Nukleinsäuremolekülen, auf der Grundlage ihrer Größe erforderlich ist. Repräsentative Beispiele für Verfahren, die mit dem Hintergrund der hierin zur Verfügung gestellten Offenbarung verbessert werden können, schließen PCR, Differentialdisplay, RNA- Fingerprinting, PCR-SSCP, Oligoligationsassays, Nukleaseverdauungsverfahren (z. B. Assays auf der Basis von Exo- und Endonuklease) und Didesoxy-Fingerprinting ein. Die hierin beschriebenen Verfahren können in einem weiten Bereich von Feldern eingesetzt werden, einschließlich z. B. bei der Entwicklung von Diagnostika für klinische Anwendung oder Forschung, der Bestimmung von Polymorphismen und der Entwicklung genetischer Karten.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem oder mehreren ausgewählten Target- Nukleinsäuremolekülen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Nukleinsäurefragment korrelativ und durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Größe, (c) Abspalten der Markierungen von den markierten Fragmenten und (d) Nachweisen der Markierungen durch Nicht-Fluoreszenz- Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Identität der Nukleinsäuremoleküle daraus.
In einem verwandten Aspekt der Erfindung werden Verfahren zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren markierter Nukleinsäuresonden mit Target-Nukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung einer markierten Nukleinsäuresonde an eine komplementäre ausgewählte Target- Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen, wobei eine markierte Nukleinsäuresonde durch Nicht- Fluoreszenzspektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Verändern der Größe hybridisierter markierter Sonden, nicht-hybridisierter Sonden oder Target-Moleküle oder der Sonden:Target-Hybride, (c) Abtrennen der markierten Sonden nach Größe, (d) Abspalten der Markierungen von den markierten Sonden und (e) Nachweisen der Markierungen durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Nachweisen des ausgewählten Nukleinsäuremoleküls daraus.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem ausgewählten Target-Molekül, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Moleküle nach Sequenzlänge, (c) Abspalten der Markierung vom markierten Molekül und (d) Nachweisen der Markierung durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.
In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren eines markierten Nukleinsäuremoleküls mit einem ausgewählten Target-Molekül unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung des markierten Moleküls an das Target-Molekül zu ermöglichen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge, (c) Abspalten der Markierung vom markierten Fragment und (d) Nachweisen der Markierung durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung sollte "biologische Proben" so verstanden werden, daß diese nicht nur Proben einschließen, die von lebenden Organismen erhalten werden (z. B. Säugern, Fischen, Bakterien, Parasiten, Viren, Pilzen und dergleichen) oder aus der Umwelt (z. B. Luft, Wasser oder Feststoffproben), sondern auch biologische Materialien, die künstlich oder synthetisch hergestellt sein können (z. B. Phagenbibliotheken, Bibliotheken organischer Moleküle, Pools genomischer Klone, cDNA-Klone, RNA-Klone oder dergleichen). Repräsentative Beispiele für biologische Proben schließen biologische Flüssigkeiten (z. B. Blut, Samen, Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Urin), biologische Zellen (z. B. Stammzellen, B- oder T-Zellen, Leberzellen, Fibroblasten oder dergleichen) und biologische Gewebe ein. Schließlich schließen repräsentative Beispiele für Organismen, die genotypisiert werden können, praktisch jeden einzelligen oder mehrzelligen Organismus ein, wie etwa Warmblüter, Säuger oder Wirbeltiere (z. B. Menschen, Schimpansen, Makaken, Pferde, Kühe, Schweine, Schafe, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse sowie Zellen von irgendeinem dieser), Bakterien, Parasiten, Viren, Pilze und Pflanzen.
In verschiedenen Ausführungsformen der oben beschriebenen Verfahren können die Nukleinsäuresonden und/oder -moleküle der vorliegenden Erfindung durch z. B. einen Ligations-, Spaltungs- oder Extensions(z. B. PCR)-Reaktion erzeugt werden. In weiteren verwandten Aspekten können die Nukleinsäuresonden oder -moleküle mit nicht-3'-markierten Oligonukleotid-Primern (z. B. 5'-markierten Oligonukleotid-Primem) oder Didesoxynukleotidterminatoren markiert sein.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450 oder mehr als 500 unterschiedliche und einzigartig markierte Moleküle in einer gegebenen Reaktion gleichzeitig eingesetzt werden, wobei jede Markierung für ein ausgewähltes Nukleinsäuremolekül oder -fragment, oder - sonde, einzigartig ist und separat identifiziert werden kann.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann (können) die Markierung(en) durch Fluorometrie, Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Ultraviolettspektrometrie oder potentiostatische Amperometrie (z. B. Verwendung coulometrischer oder anderer amperometrischer Detektoren) nachgewiesen werden. Repräsentative Beispiele für geeignete spektrometrische Techniken schließen Flugzeit-Massenspektrometrie, Quadrupol- Massenspektrometrie, Magnetsektor-Massenspektrometrie und Elektrosektor- Massenspektrometrie ein. Spezifische Ausführungsformen solcher Techniken schließen Ionenfallen-Massenspektrometrie, Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie, Ionenspray- Massenspektrometrie, Flüssigionisations-Massenspektrometrie, Atmosphärendruckionisations-Massenspektrometrie, Elektronenionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Beschuß mit schnellen Atomen, MALDI-Massenspektrometrie, Photoionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie, Laser-Tröpfchen-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-Massenspektrometrie, APCI-Massenspektrometrie, Nanospray-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation zerstäubten Sprays, Massenspektrometrie mit chemischer Ionisation, Resonanzionisations-Massenspektrometrie, Sekundärionisations- Massenspektrometrie und Thermospray-Massenspektrometrie ein.
In noch weiteren Ausführungsformen der Erfindung können die Target-Moleküle, hybridisierten markierten Sonden, nicht-hybridisierten Sonden oder Target-Moleküle, Sonden:Target-Hybride oder markierten Nukleinsäuresonden oder -moleküle von anderen Molekülen unter Verwendung von Verfahren abgetrennt werden, die zwischen der Größe von Molekülen unterscheiden (entweder tatsächliche lineare Größe oder dreidimensionale Größe). Repräsentative Beispiele solcher Verfahren schließen Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Mikrokanalelektrophorese, HPLC, Ausschlußchromatographie, Filtration, Polyacrylamidgelelektrophorese, Flüssigchromatographie, Umkehrausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenflüssigchromatographie, Pulsfeldelektrophorese, Feldinversionselektrophorese, Dialyse und Fluoreszenz-aktivierte Flüssigtröpfchensortierung. Alternativ können die Target-Moleküle, hybridisierten markierten Sonden, nicht-hybridisierten Sonden oder Target-Moleküle, Sonden:Target-Hybride oder markierten Nukleinsäuresonden oder -moleküle an einen festen Träger (z. B. Hohlfasern (Amicon Corporation, Danvers, Mass.), Perlen (Polysciences, Warrington, Pa.), Magnetperlen (Robbin Scientific, Mountain View, Calif.), Platten, Schalen und Kolben (Corning Glass Works, Corning, N. Y.), Maschengitter (Becton Dickinson, Mountain View, Calif.), Siebe und feste Fasern (siehe Edelman et al., U.S.-Patent Nr. 3,843,324; siehe auch Kuroda et al., U.S.- Patent Nr. 4,416,777), Membranen (Millipore Corp., Bedford, Mass.) und Tauschstäbchen) gebunden sein. Wenn das erste oder zweite Teil oder freiliegende Nukleinsäuren an einen festen Träger sind, können die hierin offenbarten Verfahren in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung außerdem den Schritt umfassen, daß nicht-gebundenes Material vom Träger abgewaschen wird.
In weiteren Ausführungsformen können die markierten Nukleinsäuremoleküle oder -sonden mit solchen Verfahren gespalten werden, wie chemischen, Oxidations-, Reduktions-, säurelabilen, basenlabilen, enzymatischen, elektrochemischen, wärme- und photolabilen Verfahren. In weiteren Ausführungsformen können die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen in einer kontinuierlichen Art und Weise durchgeführt werden, z. B. auf einer einzigen Vorrichtung, die automatisiert sein kann.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die Größe der hybridisierten markierten Sonden, nicht-hybridisierten Sonden oder Targetmoleküle oder Sonden:Target- Hybride mit einem Verfahren verändert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Polymerase-Extension, Ligation, Exonuklease-Verdau, Endonuklease-Verdau, Restriktionsenzym-Verdau, ortsspezifischem Rekombinase-Verdau, Ligation, Mismatch- Verdau mit spezifischer Nuklease, Methylierungs-spezifischer Nuklease-Verdau, kovalente Bindung von Sonde an Target und Hybridisierung besteht.
Die Verfahren und Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, können in einer breiten Vielfalt von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich z. B. Identifizieren von PCR- Amplikons, RNA-Fingerprinting, Differentialdisplay, Einzelstrangkonformationspolymorphismusnachweis, Didesoxy-Fingerprinting, Restriktionskarten- und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen, DNA-Fingerprinting, Genotypisierung, Mutationsnachweis, Oligonukleotidligationsassay; Sequenz-spezifische Amplifikationen, für Diagnose, Forensik, Identifikation, Entwicklungsbiologie, Biologie, Molekularmedizin, Toxikologie, Tierzüchtung.
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden. Zusätzlich werden unten verschiedene Literaturstellen angegeben, die bestimmte Verfahren und Zusammensetzungen (z. B. Plasmide, etc.) detaillierter beschreiben und daher durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit einbezogen werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese von Pentafluorphenylestern chemisch spaltbarer Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäureamid- Endgruppen freizusetzen.
Fig. 2 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese von Pentafluorphenylestern chemisch spaltbarer Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäure- Endgruppen freizusetzen.
Fig. 3-6 und 8 zeigen das Flußdiagramm für die Synthese von Tetrafluorphenylestern eines Satzes von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen.
Fig. 7 zeigt das Flußdiagramm für die Synthese eines Satzes von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen mit Amin-Endgruppen.
Fig. 9 zeigt die Synthese von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierten Oligonukleotiden, hergestellt aus dem entsprechenden Satz von 36 Tetrafluorphenylestern photochemisch spaltbarer Massenspektroskopiemarkierungssäuren.
Fig. 10 zeigt die Synthese von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierten Oligonukleotiden, hergestellt aus dem entsprechenden Satz von 36 photochemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen mit Amin-Endgruppen.
Fig. 11 veranschaulicht den gleichzeitigen Nachweis von mehreren Markierungen durch Massenspektrometrie.
Fig. 12 zeigt das Massenspektrogramm der Alpha-Cyano-Matrix allein.
Fig. 13 zeigt ein modular konstruiertes markiertes Nukleinsäurefragment.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung, bei denen die Trennung von Nukleinsäuremolekülen auf der Grundlage ihrer Größe erforderlich ist. Die vorliegenden Verfahren ermöglichen den gleichzeitigen Nachweis von interessierenden Molekülen, die Nukleinsäuren und Fragmente, Proteine, Peptide, etc. einschließen.
Kurz gesagt stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt Verbindungen zur Verfügung, bei denen ein interessierendes Molekül, oder eine Vorstufe dazu, über eine labile Bindung (oder labile Bindungen) an eine Markierung gebunden ist. So können Verbindungen der Erfindung so angesehen werden, daß sie die allgemeine Formel haben:
T-L-X
in der T die Markierungskomponente ist, L die Linkerkomponente ist, die entweder eine labile Bindung ist oder enthält, und X entweder die Komponente "Interessierendes Molekül" (MOI) oder eine Komponente mit einer funktionellen Gruppe (Lh), durch die das MOI mit T- L verknüpft werden kann, ist. Verbindungen der Erfindung können daher durch die spezifischeren allgemeinen Formeln dargestellt werden:
T-L-MOI und T-L-Lh
Aus unten im Detail beschriebenen Gründen können Sätze von T-L-MOI-Verbindungen gezielt Bedingungen unterworfen werden, die bewirken, daß die labile(n) Bindung(en) bricht (brechen), wodurch eine Markierungseinheit vom Rest der Verbindung freigesetzt wird. Die Markierungseinheit wird dann durch eine oder mehrere analytische Techniken charakterisiert, um dadurch direkte Information über die Struktur der Markierungseinheit zu liefern und (am wichtigsten) indirekte Information über die Identität des entsprechenden MOI.
Als ein einfaches veranschaulichendes Beispiel für eine repräsentative Verbindung der Erfindung, bei der L eine direkte Bindung ist, wird Bezug genommen auf die folgende Struktur (i): Struktur (i)
In Struktur (i) ist T eine stickstoffhaltige polycyclische aromatische Einheit, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist, X ist ein MOI (und spezifisch ein Nukleinsäurefragment, das in einer Amingruppe endet) und L ist die Bindung, die eine Amidgruppe bildet. Die Amidbindung ist relativ zu den Bindungen in T labil, weil eine Amidbindung, wie im Stand der Technik anerkannt, durch saure oder basische Bedingungen chemisch gespalten (gebrochen) werden kann, die die Bindungen in der Markierungskomponente unverändert lassen. So kann eine Markierungseinheit (d. h. das Spaltprodukt, das T enthält) freigesetzt werden, wie unten dargestellt: Struktur (i)
Der Linker L kann jedoch mehr sein als lediglich eine direkte Bindung, wie in dem folgenden veranschaulichenden Beispiel gezeigt, in dem Bezug genommen wird auf eine weitere repräsentative Verbindung der Erfindung der unten dargestellten Struktur (ii): Struktur (ii)
Es ist gut bekannt, daß Verbindungen mit einer ortho-Nitrobenzylamin-Einheit (siehe eingerahmte Atome in Struktur (ii)) photolytisch insofern instabil sind, als die Einwirkung aktinischer Strahlung einer spezifizierten Wellenlänge auf solche Verbindungen eine selektive Spaltung der Benzylamin-Bindung (siehe Bindung, die in Struktur (ii) mit einer dicken Linie bezeichnet ist) bewirkt. So hat Struktur (ii) dieselben T- und MOI-Gruppen wie Struktur (i), die Linker-Gruppe enthält jedoch mehrere Atome und Bindungen, innerhalb derer sich eine besonders labile Bindung befindet. Photoyse von Struktur (ii) setzt somit eine Markierungseinheit (T-enthaltende Einheit) vom Rest der Verbindung frei, wie unten dargestellt: Struktur (ii)
Die Erfindung stellt somit Verbindungen zur Verfügung, die, bei Einwirkung geeigneter Spaltungsbedingungen, eine Spaltungsreaktion durchlaufen, so daß eine Markierungseinheit vom Rest der Verbindung freigesetzt wird. Verbindungen der Erfindung können als die Markierungseinheit, das MOI (oder eine Vorstufe dazu, Lh) und die labile(n) Bindung(en), die die zwei Gruppen miteinander verbindet (verbinden), beschrieben werden. Alternativ können die Verbindungen der Erfindung als die Komponenten beschrieben werden, aus denen sie gebildet sind. So können die Verbindungen wie folgt als das Reaktionsprodukt eines Markierungs-Reaktanten, eines Linker-Reaktanten und eines MOI-Reaktanten beschrieben werden.
Der Markierungs-Reaktant besteht aus einem chemischen Griff (Th) und einer variablen Komponente (Tvc), so daß der Markierungs-Reaktant so betrachtet wird, daß er die allgemeine Struktur hat:
Tvc-Th
Um diese Nomenklatur zu veranschaulichen, kann Bezug genommen werden auf Struktur (iii), die einen Markierungs-Reaktanten zeigt, der verwendet werden kann, um die Verbindung von Struktur (ii) herzustellen. Der Markierungs-Reaktant mit Struktur (iii) enthält eine variable Markierungskomponente und einen Markierungsgriff, wie unten dargestellt: Struktur (iii)
In Struktur (iii) liefert der Markierungsgriff (-C(=O)-A) nur einen Weg für die Reaktion des Markierungs-Reaktanten mit dem Linker-Reaktanten, um eine T-L-Einheit zu bilden. Die Gruppe "A" in Struktur (iii) zeigt, daß die Carboxylgruppe sich in einem chemisch aktiven Zustand befindet, so daß sie für Kopplung mit anderen Griffen bereitsteht. "A" kann z. B. eine Hydroxylgruppe oder Pentafluorphenoxy sein, unter vielen anderen Möglichkeiten. Die Erfindung liefert eine große Anzahl möglicher Markierungsgriffe, die an eine variable Markierungskomponente gebunden werden können, wie im Detail unten diskutiert. Die variable Markierungskomponente ist somit ein Teil von "T" in der Formel T-L-X und wird auch Teil der Markierungseinheit sein, die sich aus der Reaktion bildet, die L spaltet.
Wie ebenfalls unten im Detail diskutiert, wird die variable Markierungskomponente so genannt, weil es bei der Herstellung von Sätzen von Verbindungen gemäß der Erfindung erwünscht ist, daß Mitglieder eines Satzes einzigartige variable Komponenten aufweisen, so daß die einzelnen Mitglieder voneinander mit einer analytischen Technik unterschieden werden können. Als ein Beispiel kann die variable Markierungskomponente von Struktur (iii) Mitglied des folgenden Satzes sein, in dem die Mitglieder des Satzes durch ihre UV- oder Massenspektren unterschieden werden können:
In ähnlicher Weise kann der Linker-Reaktant anhand seiner chemischen Griffe (es gibt notwendigerweise wenigstens zwei, von denen jeder als Lh bezeichnet werden kann), beschrieben werden, die eine labile Linkerkomponente flankieren, wobei die labile Linkerkomponente aus der erforderlichen labilen Einheit (L²) und fakultativen labilen Einheiten (L¹ und L³) besteht, wobei die fakultativen labilen Einheiten effektiv dazu dienen, L² von den Griffen Lh zu trennen, und die erforderliche labile Einheit dazu dient, eine labile Bindung innerhalb der labilen Linkerkomponente bereitzustellen. So kann der Linker- Reaktant so betrachtet werden, daß er die allgemeine Formel hat:
Lh-L¹-L²-L³-Lh
Die Nomenklatur, die verwendet wird, um den Linker-Reaktanten zu beschreiben, kann im Hinblick auf Struktur (iv) veranschaulicht werden, die sich wieder von der Verbindung von Struktur (ii) ableitet: Struktur (iv)
Wie Struktur (iv) veranschaulicht, können Atome in mehr als eine funktionelle Rolle erfüllen. So dient, in Struktur (iv), der Benzylstickstoff als ein chemischer Griff, um zu ermöglichen, daß der Linker-Reaktant sich an den Markierungs-Reaktanten über eine Amidbildungsreaktion bindet, und dient anschließend auch insofern als ein notwendiger Teil der Struktur der labilen Einheit L², als die Benzyl-Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung besonders anfällig ist für photolytische Spaltung. Struktur (iv) veranschaulicht auch, daß ein Linker- Reaktant eine L³-Gruppe aufweisen kann (in diesem Fall eine Methylengruppe), obgleich er keine L¹-Gruppe hat. In ähnlicher Weise können Linker-Reaktanten eine L¹-Gruppe aufweisen, aber keine L³-Gruppe, oder können L¹- und L³-Gruppen aufweisen oder können weder L¹- noch L³-Gruppen aufweisen. In Struktur (iv) zeigt das Vorhandensein der Gruppe "P" neben der Carbonylgruppe, daß die Carbonylgruppe vor der Reaktion geschützt ist. Bei Vorgabe dieser Konfiguration kann die aktivierte Carboxylgruppe des Markierungs- Reaktanten (iii) sauber mit der Amingruppe des Linker-Reaktanten (iv) reagieren, um eine Amidbindung zu bilden und eine Verbindung der Formel T-L-Lh zu ergeben.
Der MOI-Reaktant ist eine in geeigneter Weise reaktive Form eines interessierenden Moleküls. Wenn das interessierende Molekül ein Nukleinsäurefragment ist, ist ein geeigneter MOI- Reaktant ein Nukleinsäurefragment, das durch seine 5'-Hydroxylgruppe an eine Phosphodiestergruppe gebunden ist und anschließend an eine Alkylen-Kette, die in einer Aminogruppe endet. Diese Aminogruppe kann dann mit der Carbonylgruppe von Struktur (iv) reagieren (natürlich nach Entfernen der Schutzgruppe der Carbonylgruppe und vorzugsweise nach anschließender Aktivierung der Carbonylgruppe für die Reaktion mit der Amingruppe), um dadurch das MOI an den Linker zu binden.
Wenn sie in einer chronologischen Reihenfolge betrachtet wird, kann die Erfindung so gesehen werden, daß sie einen Markierungs-Reaktanten (mit einem chemischen Markierungsgriff und einer variablen Markierungskomponente), einen Linker-Reaktanten (mit zwei chemischen Linkergriffen, einer erforderlichen labilen Einheit und 0-2 fakultativen labilen Einheiten) und einen MOI-Reaktanten (mit einer Komponente "Interessierendes Molekül" und einem chemischen Griff des interessierenden Moleküls) nimmt, um T-L-MOI zu bilden. So werden, um T-L-MOI zu bilden, entweder der Markierungs-Reaktant und der Linker-Reaktant zunächst miteinander umgesetzt, um T-L-Lh zu liefern, und anschließend wird der MOI-Reaktant mit T-L-Lh umgesetzt, um T-L-MOI zu liefern, oder (weniger bevorzugt) werden der Linker-Reaktant und der MOI-Reaktant zunächst miteinander umgesetzt, um Lh-L-MOI zu liefern, und anschließend wird Lh-L-MOI mit dem Markierungs- Reaktanten umgesetzt, um T-L-MOI zu liefern. Aus Gründen der Bequemlichkeit werden Verbindungen mit der Formel T-L-MOI als der Markierungs-Reaktant, der Linker-Reaktant und der MOI-Reaktant beschrieben werden, die verwendet werden können, um solche Verbindungen zu bilden. Dieselben Verbindungen von Formel T-L-MOI könnten natürlich mit anderen (typischerweise aufwendigeren) Verfahren hergestellt werden und würden immer noch unter den Schutzumfang der erfinderischen T-L-MOI-Verbindungen fallen.
In jedem Falle sorgt die Erfindung dafür, daß eine T-L-MOI-Verbindung Spaltungsbedingungen unterworfen wird, so daß eine Markierungseinheit vom Rest der Verbindung freigesetzt wird. Die Markierungseinheit wird wenigstens die variable Markierungskomponente umfassen und wird typischerweise zusätzlich einige oder alle Atome vom Markierungsgriff, einige oder alle Atome vom Linkergriff, die verwendet wurden, um das Markierungs-Reaktant an den Linker-Reaktanten zu binden, die fakultative labile Einheit L¹, wenn diese Gruppe in T-L-MOI vorhanden war, umfassen und wird vielleicht einen Teil der erforderlichen labilen Einheit L² enthalten, in Abhängigkeit von der genauen Struktur von L² und der Natur der Spaltungschemie. Aus Gründen der Bequemlichkeit kann die Markierungseinheit als die T-enthaltende Einheit bezeichnet werden, weil T typischerweise den Hauptteil (im Hinblick auf die Masse) der Markierungseinheit ausmachen wird.
Nach dieser Einführung in einen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die verschiedenen Komponenten T, L und X im Detail beschrieben werden. Diese Beschreibung beginnt mit den folgenden Definitionen bestimmter Begriffe, die im weiteren bei der Beschreibung von T, L und X verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Nukleinsäurefragment" ein Molekül, das komplementär zu einem ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekül ist (d. h. komplementär zu dem gesamten Molekül oder einem Teil desselben) und aus der Natur gewonnen oder synthetisch oder rekombinant hergestellt werden kann, einschließlich nicht natürlich vorkommender Moleküle, und kann je nach Eignung in doppel- oder einzelsträngiger Form vorliegen; und schließt ein Oligonukleotid (z. B. DNA oder RNA), einen Primer, eine Sonde, ein Nukleinsäureanalog (z. B. PNA), ein Oligonukleotid, das in einer 5'-nach-3'-Richtung mit einer Polymerase verlängert ist, eine Nukleinsäure, die chemisch oder enzymatisch gespalten ist, eine Nukleinsäure, die mit einem Didesoxyterminator endet oder am 3'- oder 5'-Ende mit einer Verbindung abgedeckt ist, die Polymerisation am 5'- oder 3'-Ende verhindert, oder Kombinationen derselben ein. Die Komplimentarität eines Nukleinsäurefragments zu einem ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekül bedeutet im allgemeinen, daß wenigstens etwa 70% spezifische Basenpaarung über die gesamte Länge des Fragments gezeigt wird. Vorzugsweise zeigt das Nukleinsäurefragment wenigstens etwa 80% spezifische Basenpaarung; und am bevorzugtesten wenigstens etwa 90%. Assays zum Bestimmen des prozentualen Mismatch (und somit der prozentualen spezifischen Basenpaarung) sind im Stand der Technik gut bekannt und beruhen auf dem prozentualen Mismatch als einer Funktion des Tm, wenn bezogen auf eine Kontrolle mit vollständiger Basenpaarung.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Alkyl", allein oder in Kombination, auf einen gesättigten, geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest, der von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 6 und bevorzugter von 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele für solche Reste schließen Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, iso-Amyl, Hexyl, Decyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Alkylen" bezieht sich auf einen gesättigten, geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffdirest, der von 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 6 und bevorzugter von 1 bis 4 Kohlenstoffe enthält. Beispiele für solche einen Direst schließen Methylen, Ethylen (-CH&sub2;-CH&sub2;-), Propylen und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkenyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Reste schließen Ethenyl, E- und Z-Propenyl, Isopropenyl, E- und Z-Butenyl, E- und Z-Isobutenyl, E- und Z-Pentenyl, Decenyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Alkenylen" bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffdirest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Direste schließen Methyliden (=CH&sub2;), Ethyliden (-CH=CH-), Propyliden (-CH&sub2;-CH=CH-) und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkinyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff- Dreifachbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Reste schließen Ethinyl (Acetylenyl), Propinyl (Propargyl), Butinyl, Hexinyl, Decinyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Alkinylen", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffdirest mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung in insgesamt von 2 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 6 und bevorzugter von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Reste schließen Ethinylen (-C=C-), Propinylen (-CH&sub2;-C=C-) und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Cycloalkyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf eine gesättigte cyclische Anordnung von Kohlenstoffatomen, mit einer Anzahl von 3 bis 8 und vorzugsweise von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für solche Cycloalkylreste schließen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Cycloalkylen" bezeichnet eine Direstform eines Cycloalkyls.
Der Begriff "Cycloalkenyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen cyclischen Kohlenstoffring, der von 4 bis 8, vorzugsweise 5 oder 6, Kohlenstoffatome und eine oder mehrere Doppelbindungen enthält. Beispiele für solche Cycloalkenylreste schließen Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cyclopentadienyl und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "Cycloalkenylen" bezieht sich auf eine Direstform eines Cycloalkenyls.
Der Begriff "Aryl" bezieht sich auf eine carbocyclische (vollständig aus Kohlenstoff und Wasserstoff bestehende) aromatische Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Phenyl, Naphthyl, Indenyl, Indanyl, Azulenyl, Fluorenyl und Anthracenyl besteht; oder eine heterocyclische aromatische Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Furyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, 2-Pyrazolinyl, Pyrazolidinyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1,3,5-Triazinyl, 1,3,5-Trithianyl, Indolizinyl, Indolyl, Isoindolyl, 3H-Indolyl, Indolinyl, Benzo[b]furanyl, 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Benzo[b]thiophenyl, 1H-Indazolyl, Benzimidazolyl, Benzthiazolyl, Purinyl, 4H-Chinolizinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, 1,8- Naphthyridinyl, Pteridinyl, Carbazolyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl und Phenoxazinyl besteht.
"Aryl"-Gruppen, wie in dieser Anmeldung definiert, können unabhängig einen bis vier Substituenten enthalten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cyano, Carboxy, Carboalkoxy, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino, Alkinylamino, aliphatischem oder aromatischem Acyl, Alkoxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, Morpholinocarbonylamino, Thiomorpholinocarbonylamino, N-Alkylguanidino, Aralkylaminosulfonyl; Aralkoxyalkyl; N- Aralkoxyharnstoff; N-Hydroxylharnstoff; N-Alkenylharnstoff; N,N-(Alkyl, Hydroxyl)harnstoff; Heterocyclyl; Thioaryloxy-substituiertem Aryl; N,N-(Aryl, Alkyl)hydrazino; Ar'-substituiertem Sulfonylheterocyclyl; Aralkyl-substituiertem Heterocyclyl; Cycloalkyl- und Cycloalkenyl-substituiertem Heterocyclyl; Cycloalkyl- kondensiertem Aryl; Arlyoxy-substituiertem Alkyl; Heterocyclylamino; aliphatischem oder aromatischem Acylaminocarbonyl; aliphatischem oder aromatischem Acyl-substituiertem Alkenyl; Ar'-substituiertem Aminocarbonyloxy; Ar', Ar'-disubstituiertem Aryl; aliphatischem oder aromatischem Acyl-substituiertem Acyl; Cycloalkylcarbonylalkyl; Cycloalkyl- substituiertem Amino; Aryloxycarbonylalkyl; Phosphorodiamidylsäure oder -ester besteht.
"Ar" ist eine carbocyclische oder heterocyclische Arylgruppe, wie oben definiert, mit einem bis drei Substituenten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halogen; Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, 1,2- Dioxymethylen, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Alkylcarbonyloxy, aliphatischem oder aromatischem Acyl, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, N-Alkyl- oder N,N- Dialkylharnstoff besteht.
Der Begriff "Alkoxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf ein Alkyletherrest, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist. Beispiele für geeignete Alkyletherreste schließen Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy, iso-Butoxy, sec.-Butoxy, tert.-Butoxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkenoxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkenyl-O-, wobei der Begriff "Alkenyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Enolether ist. Beispiele für geeignete Alkenoxyreste schließen Allyloxy, E- und Z-3- Methyl-2-propenoxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkinyloxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkinyl-O-, wobei der Begriff "Alkinyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Inolether ist. Beispiele für geeignete Alkinoxyreste schließen Propargyloxy, 2- Butinyloxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Thioalkoxy" bezieht sich auf einen Thioetherrest der Formel Alkyl-S-, wobei Alkyl wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Mono- oder Dialkyl-substituierten Aminorest (d. h. einen Rest der Formel Alkyl-NH- oder (Alkyl)&sub2;-N-), wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist. Beispiele für geeignete Alkylaminoreste schließen Methylamino, Ethylamino, Propylamino, Isopropylamino, tert.-Butylamino, N,N- Diethylamino und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Alkenylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkenyl-NH- oder (Alkenyl)&sub2;N-, wobei der Begriff "Alkenyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Enamin ist. Ein Beispiel für solche Alkenylaminoreste ist der Allylaminorest.
Der Begriff "Alkinylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkinyl-NH- oder (Alkinyl)&sub2;N-, in der der Begriff "Alkinyl" wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Rest kein Inamin ist. Ein Beispiel für solche Alkinylaminoreste ist der Propargylaminorest.
Der Begriff "Amid" bezieht sich entweder auf -N(R¹)-C(=O)- oder -C(=O)-N(R¹)-, wobei R¹ hierin so definiert ist, daß es Wasserstoff sowie andere Gruppen einschließt. Der Begriff "substituiertes Amid" bezieht sich auf die Situation, in der R¹ nicht Wasserstoff ist, während der Begriff "unsubstituiertes Amid" sich auf die Situation bezieht, in der R¹ Wasserstoff ist.
Der Begriff "Aryloxy", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-O-, wobei Aryl wie oben definiert ist. Beispiele für Aryloxyreste schließen Phenoxy, Naphthoxy, Pyridyloxy und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Arylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-NH-, in der Aryl wie oben definiert ist. Beispiele für Arylaminoreste schließen Phenylamino (Anilido), Naphthylamino, 2-, 3- und 4-Pyridylamino und dergleichen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Der Begriff "Aryl-kondensiertes Cycloalkyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Cycloalkylrest, der zwei benachbarte Atome mit einem Arylrest teilt, wobei die Begriffe "Cycloalkyl" und "Aryl" wie oben definiert sind. Ein Beispiel eines Aryl- kondensierten Cycloalkylrestes ist der Benzo-kondensierte Cyclobutylrest.
Der Begriff "Alkylcarbonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-CONH, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkoxycarbonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-OCONH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Alkylsulfonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-SO&sub2;NH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Arylsulfonylamino", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-SO&sub2;NH-, wobei der Begriff "Aryl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "N-Alkylharnstoff", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Alkyl-NH-CO-NH-, wobei der Begriff "Alkyl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "N-Arylharnstoff", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen Rest der Formel Aryl-NH-CO-NH-, wobei der Begriff "Aryl" wie oben definiert ist.
Der Begriff "Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Begriff "Kohlenwasserstoffrest" bezieht sich auf eine Anordnung von Kohlenstoff und Wasserstoffatomen, die nur ein einziges Wasserstoffatom benötigt, um ein unabhängiges stabiles Molekül zu sein. Somit hat ein Kohlenwasserstoffrest eine offene Valenzstelle an einem Kohlenstoffatom, durch die der Kohlenwasserstoffrest an ein anderes Atom (andere Atome) gebunden werden kann. Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, etc. sind Beispiele für Kohlenwasserstoffreste.
Der Begriff "Kohlenwasserstoffdirest" bezieht sich auf eine Anordnung von Kohlenstoff und Wasserstoffatomen, die zwei Wasserstoffatome benötigt, um ein unabhängiges stabiles Molekül zu sein. Somit hat ein Kohlenwasserstoffrest zwei offene Valenzstellen an einem oder zwei Kohlenstoffatomen, durch die der Kohlenwasserstoffrest an ein anderes Atom (andere Atome) gebunden werden kann. Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Cycloalkylen, etc. sind Beispiele für Kohlenwasserstoffdireste.
Der Begriff "Hydrocarbyl" bezieht sich auf jede stabile Anordnung, die vollständig aus Kohlenstoff und Wasserstoff besteht, mit einer einzelnen Valenzstelle, an der sie an eine andere Einheit gebunden ist, und schließt somit Reste ein, die als Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl (ohne Einbeziehung von Heteroatomen in den Arylring), Arylalkyl, Alkylaryl und dergleichen ein. Kohlenwasserstoffrest ist ein anderer Name für Hydrocarbyl.
Der Begriff "Hydrocarbylen" bezieht sich auf jede stabile Anordnung, die vollständig aus Kohlenstoff und Wasserstoff besteht, mit zwei Valenzstellen, an der sie an andere Einheiten gebunden ist, und schließt somit Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Cycloalkylen, Cycloalkenylen, Arylen (ohne Einbeziehung von Heteroatomen in den Arylring), Arylalkylen, Alkylarylen und dergleichen ein. Kohlenwasserstoffdirest ist ein anderer Name für Hydrocarbylen.
Der Begriff "Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen" bezieht sich auf eine Hydrocarbyl-Gruppe, die an ein Sauerstoffatom gebunden ist, wobei das Sauerstoffatom in ähnlicher Weise an eine Hydrocarbylen-Gruppe an einer der zwei Valenzstellen gebunden ist, an der die Hydrocarbylen-Gruppe an andere Einheiten gebunden ist. Die Begriffe "Hydrocarbyl-S- hydrocarbylen", "Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen" und "Hydrocarbyl-Amid-hydrocarbylen" haben äquivalente Bedeutungen, wobei Sauerstoff durch Schwefel, -NH- bzw. eine Amidgruppe ersetzt worden ist.
Der Begriff N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen bezieht sich auf eine Hydrocarbylen-Gruppe, wobei eine der zwei Valenzstellen an ein Stickstoffatom gebunden ist und dieses Stickstoffatom gleichzeitig an einen Wasserstoff und eine Hydrocarbyl-Gruppe gebunden ist. Der Begriff N,N-Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen bezieht sich auf eine Hydrocarbylengruppe, wobei eine der zwei Valenzstellen an ein Stickstoffatom gebunden ist und dieses Stickstoffatom gleichzeitig an zwei Hydrocarbyl-Gruppen gebunden ist.
Der Begriff "Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen" bezieht sich auf eine Hydrocarbyl-Gruppe, die durch eine Acyl(-C(=O)-)-Gruppe an eine der zwei Valenzstellen einer Hydrocarbylen- Gruppe gebunden ist.
Die Begriffe "Heterocyclylhydrocarbyl" und "Heterocyclyl" beziehen sich auf eine stabile cyclische Anordnung von Atomen, die Kohlenstoffatome und bis zu vier Atome (als Heteroatome bezeichnet) einschließt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel. Die cyclische Anordnung kann in der Form eines monocyclischen Ringes mit 3-7 Atomen oder eines bicyclischen Ringes mit 8-11 Atomen vorliegen. Die Ringe können gesättigt oder ungesättigt sein (einschließlich aromatischer Ringe) und können fakultativ Benzo-kondensiert sein. Stickstoff und Schwefelatomen im Ring können in jeder oxidierten Form vorliegen, einschließlich der quaternisierten Form von Stickstoff. Ein Heterocyclylhydrocarbyl kann an irgendeinem endocyclischen Kohlenstoff oder Heteroatom gebunden sein, das zur Schaffung einer stabilen Struktur führt. Bevorzugte Heterocyclylhydrocarbyle schließen 5- bis 7-gliedrige monocyclische Heterocyclen ein, die ein oder zwei Stickstoff-Heteroatome enthalten.
Ein substituiertes Heterocyclylhydrocarbyl bezieht sich auf ein Heterocyclyhydrocarbyl, wie oben definiert, wobei wenigstens ein Ringatom davon an einen angegebenen Substituenten gebunden ist, der sich vom Ring weg erstreckt.
Bei Bezugnahme auf Hydrocarbyl- und Hydrocarbylen-Gruppen bezieht sich der Begriff "Derivate von irgendeinem der vorstehenden, wobei ein oder mehr Wasserstoffe durch eine gleiche Anzahl Fluoride ersetzt ist" auf Moleküle, die Kohlenstoff-, Wasserstoff und Fluoridatome enthalten, aber keine anderen Atome.
Der Begriff "aktivierter Ester" ist ein Ester, der eine "Abgangsgruppe" enthält, die leicht durch ein Nukleophil verdrängbar ist, wie etwa ein Amin und Alkohol oder ein Thiol- Nukleophil. Solche Abgangsgruppen sind gut bekannt und schließen, ohne Beschränkung, N- Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, Halogen (Halogenide), Alkoxy einschließlich Tetrafluorphenolaten, Thioalkoxy und dergleichen ein. Der Begriff "geschützter Ester" bezieht sich auf eine Estergruppe, die maskiert oder in anderer Weise unreaktiv ist. Siehe z. B. Greene, "Protecting Groups In Organic Synthesis".
Angesichts der obigen Definitionen können weitere chemische Begriffe, die in dieser Anmeldung verwendet werden, von den Fachleuten leicht verstanden werden. Begriffe können allein oder in irgendeiner Kombination derselben verwendet werden. Die bevorzugten und bevorzugteren Kettenlängen der Reste gelten für alle solche Kombinationen.

A. ERZEUGUNG MARKIERTER NUKLEINSÄUREFRAGMENTE

Wie oben angegeben, stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein allgemeines Schema zur DNA-Sequenzierung bereit, das die Verwendung von mehr als 16 Markierungen in jeder Spur ermöglicht; bei kontinuierlichem Nachweis können die Markierungen nachgewiesen und die Sequenz gelesen werden, wenn die Trennung nach Größe abläuft, ebenso wie bei herkömmlicher Sequenzierung auf Fluoreszenz-Basis. Dieses Schema ist anwendbar auf alle DNA-Sequenzierungstechniken, die auf Trennung der markierten Moleküle nach Größe beruhen. Geeignete Markierungen und Linker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren sind unten detaillierter diskutiert.

1. Markierungen

"Markierung", wie hierin verwendet, bezieht sich allgemein auf eine chemische Einheit, die verwendet wird, um ein "interessierendes Molekül" in eindeutiger Weise zu identifizieren, und bezieht sich, genauer gesagt, auf die variable Markierungskomponente sowie auf alles, was in dem Markierungs-Reaktanten, der Markierungs-Komponente und/oder der Markierungs-Einheit am dichtesten daran gebunden ist.
Eine Markierung, die in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, besitzt mehrere Eigenschaften:
1) Sie kann von allen anderen Markierungen unterschieden werden. Diese Unterscheidung von anderen chemischen Einheiten kann auf dem chromatographischen Verhalten der Markierung (insbesondere nach der Spaltungsreaktion), ihren spektroskopischen oder potentiometrischen Eigenschaften oder irgendeiner Kombination davon beruhen. Spektroskopische Verfahren, durch die Markierungen brauchbar unterschieden werden, schließen Massenspektroskopie (MS), Infrarot (IR), Ultraviolett (UV) und Fluoreszenz ein, wobei MS, IR und UV bevorzugte spektroskopische Verfahren sind und MS am bevorzugtesten ist. Potentiometrische Ampierometrie ist ein bevorzugtes potentiometrisches Verfahren.
2) Die Markierung kann nachgewiesen werden, wenn sie mit 10&supmin;²² bis 10&supmin;&sup6; Mol vorliegt.
3) Die Markierung besitzt einen chemischen Griff, durch den sie an das MOI gebunden werden kann, welches die Markierung in eindeutiger Weise identifizieren soll. Die Bindung kann direkt an das MOI erfolgen oder indirekt durch eine "Linker"-Gruppe.
4) Die Markierung ist chemisch stabil gegenüber allen Manipulationen, denen sie unterworfen wird, einschließlich Bindung und Spaltung vom MOI, und allen Manipulationen des MOI, während die Markierung daran gebunden ist.
5) Die Markierung beeinflußt die Manipulationen, die am MOI durchgeführt werden, während die Markierung daran gebunden ist, nicht in signifikanter Weise. Wenn die Markierung z. B. an ein Oligonukleotid gebunden ist, darf die Markierung irgendwelche Hybridisierungs- oder enzymatischen Reaktionen (z. B. PCR-Sequenzierungsreaktionen), die am Nukleotid durchgeführt werden, nicht signifikant beeinflussen. In ähnlicher Weise darf, wenn die Markierung an einen Antikörper gebunden ist, sie die Antigen-Erkennung durch den Antikörper nicht signifikant beeinflussen.
Eine Markierungs-Einheit, die mit einem bestimmten spektroskopischen oder potentiometrischen Verfahren nachgewiesen werden soll, sollte Eigenschaften besitzen, die die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises mit diesem Verfahren erhöht. Typischerweise wird die Markierungs-Einheit diese Eigenschaften haben, weil sie in die variable Markierungs-Komponente hineinkonstruiert worden sind, die typischerweise den Hauptteil der Markierungs-Einheit darstellen wird. In der folgenden Diskussion bezieht sich die Verwendung des Wortes "Markierung" typischerweise auf die Markierungs-Einheit (d. h. das Spaltprodukt, das die variable Markierungs-Komponente enthält), kann jedoch auch so betrachtet werden, daß es die variable Markierungs-Komponente selbst bezeichnet, weil diese der Teil der Markierungs-Einheit ist, der typischerweise dafür verantwortlich ist, die eindeutig nachweisbaren Eigenschaften bereitzustellen. In Verbindungen der Formel T-L-X wird der "T"-Teil die variable Markierungs-Komponente enthalten. Wenn die variable Markierungs- Komponente konstruiert worden ist, um mit z. B. Massenspektrometrie charakterisiert zu werden, kann der "T"-Teil von T-L-X als Tms bezeichnet werden. In ähnlicher Weise kann das Spaltprodukt von T-L-X, das T enthält, als die Tms-enthaltende Einheit bezeichnet werden. Die folgenden spektroskopischen und potentiometrischen Verfahren können verwendet werden, um Tms-enthaltende Einheiten zu charakterisieren.

a. Eigenschaften von MS-Markierungen

Wenn eine Markierung durch Massenspektrometrie analysierbar ist (d. h. eine MS-lesbare Markierung ist, hierin auch als eine MS-Markierung oder "Tms-enthaltende Einheit" bezeichnet), ist das wesentliche Merkmal der Markierung, daß sie ionisiert werden kann. Es ist somit ein bevorzugtes Element bei der Konstruktion von MS-lesbaren Markierungen, darin eine chemische Funktionalität einzubauen, die unter Ionisationsbedingungen im MS eine positive oder negative Ladung tragen kann. Dieses Merkmal verleiht verbesserte Effizienz der Ionenbildung und höhere Gesamtempfindlichkeit des Nachweises, insbesondere bei Elektrosprayionisation. Die chemische Funktionalität, die eine ionisierte Ladung unterstützt, kann sich von Tms oder L oder beiden ableiten. Faktoren, die die relative Empfindlichkeit eines durch Massenspektrometrie nachzuweisenden Analyten erhöhen kann, sind in z. B. Sunner, J., et al., Anal. Chem. 60 : 1300-1307 (1988), diskutiert.
Eine bevorzugte Funktionalität, um das Tragen einer negativen Ladung zu erleichtern, ist eine organische Säure, wie etwa phenolisches Hydroxyl, Carbonsäure, Phosphonat, Phosphat, Tetrazol, Sulfonylharnstoff, Perfluoralkohol und Sulfonsäure.
Bevorzugte Funktionalität, um das Tragen einer positiven Ladung unter Ionisationsbedingungen zu erleichtern, sind aliphatische oder aromatische Amine. Beispiele für funktionelle Amingruppen, die erhöhte Nachweisbarkeit von MS-Markierungen ergeben, schließen quartäre Amine (d. h. Amine, die vier Bindungen, jede zu Kohlenstoffatomen, aufweisen, siehe Aebersold, U.S.-Patent Nr. 5,240,859) und tertiäre Amine ein (d. h. Amine, die drei Bindungen, jede zu Kohlenstoffatomen, aufweisen, was C=N-C-Gruppen einschließt, wie sie in Pyridin vorhanden sind, siehe Hess et al., Anal. Biochem. 224 : 373, 1995; Bures et al., Anal. Biochem. 224-364, 1995). Gehinderte tertiäre Amine sind besonders bevorzugt. Tertiäre und quartäre Amine können Alkyl oder Aryl sein. Eine Tms-enthaltende Einheit muß wenigstens eine ionisierbare Spezies tragen, kann aber mehr als eine ionisierbare Spezies besitzen. Der bevorzugte Ladungszustand ist eine einzelne ionisierte Spezies pro Markierung. Demgemäß ist es bevorzugt, daß jede Tms-enthaltende Einheit (und jede variable Markierungs-Komponente) nur ein einziges gehindertes Amin oder eine einzige organische Säuregruppe enthält.
Geeignete Amin-enthaltende Reste, die Teil der Tms-enthaltenden Einheit bilden können, schließen die folgenden ein:
Die Identifizierung einer Markierung durch Massenspektrometrie beruht vorzugsweise auf ihrem Verhältnis Molekülmasse zu Ladung (m/z). Der bevorzugte Molekülmassenbereich für MS-Markierungen ist von etwa 100 bis 2.000 Daltons, und vorzugsweise hat die Tms- enthaltende Einheit eine Masse von wenigstens etwa 250 Daltons, bevorzugter wenigstens etwa 300 Daltons und noch bevorzugter wenigstens etwa 350 Daltons. Es im allgemeinen schwierig für Massenspektrometer, zwischen Einheiten zu unterscheiden, die Molekülionen unter etwa 200-250 Daltons haben (in Abhängigkeit von dem genauen Instrument), und so haben bevorzugte Tmsenthaltende Einheiten der Erfindung Massen oberhalb dieses Bereiches.
Wie oben erklärt, kann die Tms-enthaltende Einheit andere Atome als diejenigen enthalten, die in der variablen Markierungs-Komponente vorhanden sind und tatsächlich andere als in Tms selbst vorhanden sind. Demgemäß kann die Masse von Tms selbst niedriger sein als etwa 250 Daltons, so lange die Tms-enthaltende Einheit eine Masse von wenigstens etwa 250 Daltons hat. So kann die Masse von von 15 (d. h. einem Methylrest) bis etwa 10.000 Daltons reichen und reicht vorzugsweise von etwa 100 bis etwa 5.000 Daltons und reicht bevorzugter von etwa 200 bis etwa 1.000 Daltons.
Es ist relativ schwierig, Markierungen durch Massenspektrometrie zu unterscheiden, wenn diese Markierungen Atome enthalten, die mehr als ein Isotop in signifikanter Menge aufweisen. Demgemäß enthalten T-Gruppen, die für massenspektroskopische Identifizierung (Tms-Gruppen) gedacht sind, Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod. Obgleich weitere Atome im Tms vorhanden sein können, kann ihr Vorhandensein die Analyse der Massenspektrometerdaten etwas schwieriger machen. Vorzugsweise haben die Tms-Gruppen nur Kohlenstoff-, Stickstoff und Sauerstoffatome, zusätzlich zu Wasserstoff und/oder Fluorid.
Fluorid ist ein fakultatives, aber bevorzugtes Atom für die Einbeziehung in eine Tms-Gruppe. Im Vergleich zu Wasserstoff ist Fluorid natürlich viel schwerer. So führt das Vorhandensein von Fluoridatomen statt Wasserstoffatomen zu Tms-Gruppen mit höherer Masse, wodurch ermöglicht wird, daß die Tms-Gruppe eine Masse von mehr als 250 Daltons erreicht und übersteigt, was wünschenswert ist, wie oben erläutert. Zusätzlich verleiht der Ersatz von Wasserstoff durch Fluorid der Tms-enthaltenden Einheit größere Flüchtigkeit, und größere Flüchtigkeit des Analyten erhöht die Empfindlichkeit, wenn Massenspektrometrie als das Nachweisverfahren verwendet wird.
Die Molekülformel von Tms fällt in den Bereich C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;&sub0;N&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;O&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;S&sub0;&submin;&sub1;&sub0;P&sub0;&submin;&sub1;&sub0;HαFβIδ, wobei die Summe von α, β und δ ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen. Die Bezeichnung C&sub1;&submin;&sub5;&sub0;&sub0;N&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;O&sub0;&submin;&sub1;&sub0;&sub0;S&sub0;&submin;&sub1;&sub0;P&sub0;&submin;&sub1;&sub0;HαFβIδ bedeutet, daß Tms wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält und jede Zahl von 1 bis 500 Kohlenstoffatome enthalten kann, zusätzlich dazu, daß es so viel wie 100 Stickstoffatome ("N&sub0;&submin;" bedeutet, daß Tms keinerlei Stickstoffatome enthalten muß), und so viel Wie 100 Sauerstoffatome und so viel wie 10 Schwefelatome und so viel wie 10 Phosphoratome enthält. Die Symbole α, β und δ stellen die Anzahl von Wasserstoff-, Fluorid- und Iodidatomen in Tms dar, wobei jeweils zwei dieser Zahlen Null sein können und wobei die Summe dieser Zahlen der Gesamtheit der sonst ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome entspricht. Vorzugsweise hat Tms eine Molekülformel, die in den Bereich C&sub1;&submin;&sub5;&sub0;N&sub0;&submin; &sub1;&sub0;O&sub0;&submin;&sub1;&sub0;HαFβ fällt, wobei die Summe von α und β der Anzahl von Wasserstoff bzw. Fluoridatomen entspricht, die in der Einheit vorhanden sind.

b. Eigenschaften von IR-Markierungen

Es gibt zwei primäre Formen des IR-Nachweises organischer chemischer Gruppen: Raman- Streuungs-IR und Absorptions-IR. Raman-Streuungs-IR-Spektren und Absorptions-IR- Spektren sind komplementäre spektroskopische Verfahren. Im allgemeinen hängt die Raman- Anregung von Bindungspolarisierbarkeitsveränderungen ab, wohingegen IR-Absorption von Bindungsdipolmomentveränderungen abhängt. Schwache IR-Absorptionslinien werden starke Raman-Linien und umgekehrt. Die Wellenzahl ist die charakteristische Einheit für IR- Spektren. Es gibt drei spektrale Bereiche für IR-Markierungen, die separate Anwendungen haben: Nah-IR bei 12.500 bis 4.000 cm&supmin;¹, Mittel-IR bei 4.000 bis 600 cm&supmin;¹ und Fern-IR bei 600 bis 30 cm&supmin;¹. Für die hierin beschriebenen Verwendungen, bei denen eine Verbindung als eine Markierung dienen soll, um ein MOI, eine Sonde oder einen Primer zu identifizieren, wären die mittleren spektralen Bereiche bevorzugt. Die Carbonyl-Streckschwingung (1.850 bis 1.750 cm&supmin;¹) würde für Carbonsäuren, Carbonsäureester und -amide und Alkyl- und Arylcarbonate, Carbamate und Ketone gemessen werden. N-H-Deformationsschwingungen (1.750 bis 160 cm&supmin;¹) würden verwendet werden, um Amine, Ammonium-Ionen und Amide zu identifizieren. Bei 1.400 bis 1.250 cm&supmin;¹ wird R-OH-Deformationsschwingung nachgewiesen sowie die C-N-Streckschwingung in Amiden. Aromatische Substitutionsmuster werden bei 900 bis 690 cm&supmin;¹ nachgewiesen (C-H-Deformationsschwingung, N-H- Deformationsschwingung für ArNH&sub2;). Gesättigtes C-H, Olefine, aromatische Ringe, Doppel- und Dreifachbindungen, Ester, Acetale, Ketale, Ammoniumsalze, N-O-Verbindungen wie etwa Oxime, Nitro, N-Oxide und Nitrate, Azo, Hydrazone, Chinone, Carbonsäuren, Amide und Lactame besitzen alle Infrarotkorrelationsschwingungsdaten (siehe Pretsch et al., Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, Springer-Verlag, New York, 1989). Bevorzugte Verbindungen würden ein aromatisches Nitril einschließen, das eine sehr starke Nitril-Streckschwingung bei 2.230 bis 2.210 cm&supmin;¹ zeigt. Weitere nützliche Typen von Verbindungen sind aromatische Alkine, die eine starke Streckschwingung aufweisen, die zu einer scharfen Absorptionsbande zwischen 2.140 und 2.100 cm&supmin;¹ führt. Ein dritter Verbindungstyp sind die aromatischen Azide, die eine intensive Absorptionsbande im Bereich 2.160 bis 2.120 cm&supmin;¹ zeigen. Thiocyanate sind beispielhaft für Verbindungen, die eine starke Absorption bei 2.275 bis 2.263 cm&supmin;¹ haben.

c. Eigenschaften von UV-Markierungen

Eine Zusammenstellung von organischen Chromophor-Typen und ihren entsprechenden UV- sichtbaren Eigenschaften ist angegeben in Scott (Interpretation of the UV Spectra of Natural Products, Permagon Press, New York, 1962). Ein Chromophor ist ein Atom oder eine Gruppe von Atomen oder Elektronen, die für die bestimmte Lichtabsorption verantwortlich sind. Empirische Regeln existieren für die π, π*-Maxima in konjugierten Systemen (siehe Pretsch et al., Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, S. B65 und B70, Springer-Verlag, New York, 1989). Bevorzugte Verbindungen (mit konjugierten Systemen) würden π, π*- und π, π*-Übergänge besitzen. Solche Verbindungen werden beispielhaft belegt durch Acid Violet 7, Acridinorange, Acridingelb G, Brillantblau G, Kongorot, Kristallviolett, Malachitgrün-Oxalat, Metanilgelb, Methylenblau, Methylorange, Methylviolett B, Naphtolgrün B, Ölblau N, Ölrot O, 4-Phenylazophenol, Safranin O, Solvent Green 3 und Sudanorange G, die alle kommerziell erhältlich sind (Aldrich, Milwaukee, WI). Andere geeignete Verbindungen sind aufgelistet in z. B. Jane, L, et al., Chrom. 323 : 191-225 (1985).

d. Eigenschaften einer Fluoreszenz-Markierung

Fluoreszierende Sonden werden am direktesten durch ihre Absorptions- und Fluoreszenzemissionswellenlängen und -intensitäten identifiziert und quantifiziert. Emissionsspektren (Fluoreszenz und Phosphoreszenz) sind viel empfindlicher und erlauben spezifischere Messungen als Absorptionsspektren. Andere photophysikalische Eigenschaften, wie etwa Lebensdauer des angeregten Zustandes und Fluoreszenzanisotropie, werden weniger oft verwendet. Die am allgemeinsten brauchbaren Intensitätsparameter sind der molare Extinktionskoeffizient (&epsi;) für die Absorption und die Quantenausbeute (QY) für die Fluoreszenz. Der Wert für &epsi; wird spezifiziert bei einer einzigen Wellenlänge (üblicherweise dem Absorptionsmaximum der Sonde), wohingegen QY ein Maß für die Gesamtphotonenemission über das gesamte Fluoreszenzspektralprofil ist. Eine enge optische Bandbreite (< 20 nm) wird üblicherweise für die Fluoreszenzanregung (über Absorption) verwendet, wohingegen die Fluoreszenznachweisbandbreite viel variabler ist, wobei sie vom vollständigen Spektrum für maximale Empfindlichkeit bis zu einem engen Band (~20 nm) für maximale Auflösung reicht. Fluoreszenzintensität pro Sondenmolekül ist proportional zum Produkt von &epsi; und QY. Der Bereich dieser Parameter unter Fluorophoren mit gegenwärtig praktischer Bedeutung beträgt ungefähr 10.000 bis 100.000 cm&supmin;¹M&supmin;¹ für &epsi; und 0,1 bis 1,0 für QY. Verbindungen, die als Fluoreszenzmarkierungen dienen können, sind wie folgt: Fluorescein, Rhodamin, Lambdablau 470, Lambdagrün, Lambdarot 664, Lambdarot 665, Acridinorange und Propidiumiodid, die kommerziell erhältlich sind von Lambda Fluorescence Co. (Pleasant Gap, PA). Fluoreszierende Verbindungen, wie etwa Nilrot, Texasrot, Lissamine®, BODIPY®s sind von Molecular Probes (Eugene, OR) erhältlich.

e. Eigenschaften potentiometrischer Markierungen

Das Prinzip des elektrochemischen Nachweises (ECD) beruht auf der Oxidation oder Reduktion von Verbindungen, die bei bestimmten angelegten Spannungen Elektronen entweder abgeben oder aufnehmen, wodurch ein Strom erzeugt wird, der gemessen werden kann. Wenn bestimmte Verbindungen einer Potentialdifferenz unterworfen werden, durchlaufen die Moleküle eine Molekülumlagerung an der Oberfläche der Arbeitselektroden mit dem Verlust (Oxidation) oder Gewinn (Reduktion) von Elektronen, von solchen Verbindungen sagt man, daß sie elektronisch sind und elektrochemische Reaktionen durchlaufen. EC-Detektoren legen eine Spannung an eine Elektrodenoberfläche an, über die das HPLC-Elutionsmittel strömt. Elektroaktive Verbindungen, die von der Säule eluieren, geben entweder Elektronen ab (Oxidation) oder nehmen Elektronen auf (Reduktion), wodurch eine Stromspitze in Echtzeit erzeugt wird. Es ist wichtig, daß die erzeugte Strommenge von sowohl der Konzentration des Analyten als auch der angelegten Spannung abhängt, wobei jede Verbindung eine spezifische Spannung besitzt, bei der sie beginnt zu oxidieren oder zu reduzieren. Der gegenwärtig beliebteste elektrochemische Detektor ist der amperometrische Detektor, bei dem das Potential konstant gehalten wird und der erzeugte Strom aus der elektrochemischen Reaktion anschließend gemessen wird. Diese Art von Spektrometrie wird gegenwärtig "potentiostatische Amperometrie" genannt. Kommerzielle Amperometer sind erhältlich von ESA, Inc., Chelmford, MA.
Wenn der Nachweisgrad 100% beträgt, werden die spezialisierten Detektoren "colometrisch" genannt. Colometrische Detektoren sind empfindlich und haben eine Reihe von praktischen Vorteilen im Hinblick auf Selektivität und Empfindlichkeit, die diese Sorte von Detektoren in einer Anordnung nützlich machen. Bei colometrischen Detektoren wird der Signalstrom, für eine gegebene Konzentration an Analyt, als eine Funktion des angelegten Potentials (Spannung) an die Arbeitselektrode aufgezeichnet. Das resultierende sigmoidale Diagramm wird die Strom-Spannungs-Kurve oder hydrodynamisches Voltammagramm (HDV) genannt. Das HDV ermöglicht die beste Auswahl des angelegten Potentials an die Arbeitselektrode, die es einem ermöglicht, das beobachtete Signal zu maximieren. Ein wichtiger Vorteil von ECD ist seine inhärente Empfindlichkeit bei Nachweisstromniveaus im Subfemtomol- Bereich.
Zahlreiche Chemikalien und Verbindungen sind elektrochemisch aktiv, einschließlich vieler Biochemikalien, Pharmazeutika und Pestizide. Chromatographisch zusammen eluierende Verbindungen können wirksam aufgelöst werden, selbst wenn ihre Halbwellenpotentiale (das Potential bei halbem Signalmaximum) sich um nur 30-60 mV unterscheiden.
Kürzlich entwickelte colometrische Sensoren stellen Selektivität, Identifizierung und Auflösung von zusammen eluierenden Verbindungen bereit, wenn sie als Detektoren in Trennungen auf der Grundlage von Flüssigchromatographie verwendet werden. Daher fügen diese angeordneten Detektoren einen weiteren Satz von Trennungen hinzu, die im Detektor selbst ablaufen. Gegenwärtige Instrumente besitzen 16 Kanäle, die im Prinzip nur durch die Geschwindigkeit beschränkt sind, mit denen Daten erhalten werden können. Die Anzahl der Verbindungen, die auf der EC-Anordnung aufgelöst werden können, ist chromatographisch beschränkt (d. h. durch die Bodenzahl beschränkt). Wenn jedoch zwei oder mehr Verbindungen, die chromatographisch zusammen eluieren, einen Unterschied in den Halbwellenpotentialen von 30-60 mV aufweisen, kann die Anordnung die Verbindungen unterscheiden. Die Fähigkeit einer Verbindung, elektrochemisch aktiv zu sein, hängt vom Besitz einer EC-aktiven Gruppe ab (d. h. -OH, -O, -N, -S).
Verbindungen, die unter Verwendung colometrischer Detektoren mit Erfolg nachgewiesen worden sind, schließen 5-Hydroxytryptamin, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglykol, Homogentisinsäure, Dopamin, Metanephrin, 3-Hydroxykynurenin, Acetominophen, 3- Hydroxytryptophol, 5-Hydroxyindolessigsäure, Octansulfonsäure, Phenol, o-Cresol, Pyrogallol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 4,6-Dinitrocresol, 3-Methyl-2- nitrophenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,6-Dichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 4-Chlor-3- methylphenol, 5-Methylphenol, 4-Methyl-2-nitrophenol, 2-Hydroxyanilin, 4-Hydroxyanilin, 1,2-Phenylendiamin, Benzocatechin, Buturon, Chlortholuron, Diuron, Isoproturon, Linuron, Methobromuron, Metuxuron, Monolinuron, Monuron, Methionin, Tryptophan, Tyrosin, 4- Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, 4-Hydroxycumarsäure, 7-Methoxycumarin, Apigenin, Baicalein, Kaffeesäure, Catechin, Centaurein, Chlorogensäure, Daidzein, Datiscetin, Diosmetin, Epicatechingallat, Epigallocatechin, Epigallocatechingallat, Eugenol, Eupatorin, Ferulinsäure, Fisetin, Galangin, Gallsäure, Gardenin, Genistein, Gentisinsäure, Hesperidin, Irigenin, Kämpferol, Leucocyanidin, Luteolin, Mangostin, Morin, Myricetin, Naringin, Narirutin, Pelargondin, Peonidin, Phloretin, Pratensein, Protocatechusäure, Rhamnetin, Quercetin, Sakuranetin, Scutellarein, Scopoletin, Syringaldehyd, Syringasäure, Tangeritin, Troxerutin, Umbelliferon, Vanillinsäure, 1,3-Dimethyltetrahydroisochinolin, 6- Hydroxydopamin, r-Salsolinol, N-Methyl-r-salsolinol, Tetrahydroisochinolin, Amitriptylin, Apomorphin, Capsaicin, Chlordiazepoxid, Chlorpromazin, Daunorubicin, Desipramin, Doxepin, Fluoxetin, Flurazepam, Imipramin, Isoproterenol, Methoxamin, Morphin, Morphin- 3-glucuronid, Nortriptylin, Oxazepam, Phenylephrin, Trimipramin, Ascorbinsäure, N- Acetylserotonin, 3,4-Dihydroxybenzylamin, 3,4-Dihydroxymandelsäure (DOMA), 3,4- Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC), 3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), 3,4- Dihydroxyphenylglykol (DHPG), 3-Hydroxyanthranilsäure, 2-Hydroxyphenylessigsäure (2HPAC), 4-Hydroxybenzoesäure (4HBAC), 4-Hydroxyindol-3-essigsäure (5HIAA), 3- Hydroxykynurenin, 3-Hydroxymandelsäure, 3-Hydroxy-4-methoxyphenylethylamin, 4- Hydroxyphenylessigsäure (4HPAC), 4-Hydroxyphenylmilchsäure (4HPLA), 5- Hydroxytryptophan (5HTP), 5-Hydroxytryptophol (5HTOL), 5-Hydroxytryptamin (5HT), 5- Hydroxytryptaminsulfat, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglykol (MHPG), 5-Methoxytryptamin, 5-Methoxytryptophan, 5-Methoxytryptophol, 5-Methoxytyramin (3MT), 3-Methoxytyrosin (3-OM-DOPA), 5-Methylcystein, 3-Methylguanin, Bufotenin, Dopamin, Dopamin-3- Glucuronid, Dopamin-3-sulfat, Dopamin-4-sulfat, Epinephrin, Epinin, Folsäure, Glutathion (reduziert), Guanin, Guanosin, Homogentinsäure (HGA), Homovanillinsäure (HVA), Homovanillylalkohol (HVOL), Homoveratumsäure, hva-Sulfat, Hypoxanthin, Indol, Indol-3- Essigsäure, Indol-3-milchsäure, Kynurenin, Melatonin, Metanephrin, N-Methyltryptamin, N- Methyltyramin, N,N-Dimethyltryptamin, N,N-Dimethyltyramin, Norepinephrin, Normetanephrin, Octopamin, Pyridoxal, Pyridoxalphosphat, Pyridoxamin, Synephrin, Tryptophol, Tryptamin, Tyramin, Harnsäure, Vanillylmandelsäure (vma), Xanthin und Xanthosin. Andere geeignete Verbindungen sind angegeben in z. B. Jane, L, et al. J. Chrom. 323 : 191-225 (1985) und Musch, G., et al., J. Chrom. 348 : 97-110 (1985). Diese Verbindungen können in Verbindungen der Formel T-L-X mit im Stand der Technik bekannten Verfahren einbezogen werden. Verbindungen mit einer Carbonsäuregruppe können z. B. mit Amin, Hydroxyl, etc. umgesetzt werden, um Amid-, Ester- und andere Bindungen zwischen T und L zu bilden.
Zusätzlich zu den obigen Eigenschaften und ungeachtet des beabsichtigten Nachweisverfahrens ist es bevorzugt, daß die Markierung eine modulare chemische Struktur besitzt. Dies hilft bei der Konstruktion einer großen Anzahl von strukturell verwandten Markierungen unter Verwendung der Techniken der kombinatorischen Chemie. Die Tms- Gruppe hat z. B. wünschenswerterweise mehrere Eigenschaften. Sie enthält wünschenswerterweise eine funktionelle Gruppe, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Tms-enthaltende Einheit Massenspektrometrie unterzogen wird (einfacher als eine "Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärker"-Gruppe oder MSSE bezeichnet). Auch kann sie wünschenswerterweise als ein Mitglied in einer Familie von Tms-enthaltenden Einheiten dienen, in der die Mitglieder der Familie jedes ein unterschiedliches Masse/Ladungs-Verhältnis haben, jedoch ungefähr dieselbe Empfindlichkeit im Massenspektrometer aufweisen. Mitglieder der Familie haben somit wünschenswerterweise denselben MSSE. Um die Schaffung von Familien von Verbindungen zu ermöglichen, hat es sich als geeignet erwiesen, Markierungs-Reaktanten über ein modulares Syntheseschema zu erzeugen, so daß die Markierungs-Komponenten selbst als Module-umfassend angesehen werden können.
In einem bevorzugten modularen Ansatz für die Struktur der Tms-Gruppe hat Tms die Formel
T²-(J-T³-)n-
wobei T² eine organische Einheit ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet wird, mit einem Massebereich von 15 bis 500 Daltons; T³ eine organische Einheit ist, die aus Kohlenstoff und einem oder mehreren von Wasserstoff, Fluorid, Iodid, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor gebildet wird, mit einem Massebereich von 50 bis 1.000 Daltons; J eine direkte Bindung oder eine funktionelle Gruppe ist, wie etwa Amid, Ester, Amin, Sulfid, Ether, Thioester, Disulfid, Thioether, Harnstoff, Thioharnstoff, Carbamat, Thiocarbamat, Schiff'sche Base, reduzierte Schiff'sche Base, Imin, Oxim, Hydrazon, Phosphat, Phosphonat, Phosphoramid, Phosphonamid, Sulfonat, Sulfonamid oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung; und n eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, jedes T³ und J unabhängig ausgewählt wird.
Die modulare Struktur T²-(J-T³)n- liefert einen geeigneten Zugang zu Familien von T-L-X- Verbindungen, in denen jedes Mitglied der Familie eine verschiedene T-Gruppe besitzt. Wenn T z. B. Tms ist und jedes Familienmitglied wünschenswerterweise denselben MSSE besitzt, kann eine der T³-Gruppen diese MSSE-Struktur liefern. Um für Variabilität zwischen Mitgliedern einer Familie im Hinblick auf die Masse von Tms zu sorgen, kann die T²-Gruppe unter den Familienmitgliedern variiert werden. Ein Familienmitglied kann z. B. T² = Methyl haben, während ein anderes T² = Ethyl hat und ein anderes T² = Propyl hat, etc.
Um "grobe" oder große Sprünge in der Masse bereitzustellen, kann eine T³-Gruppe konstruiert werden, die in signifikantem Maße (z. B. eine oder mehrere hundert) Masseeinheiten zu T-L-X hinzufügt. Solch eine T³-Gruppe kann als eine Molekulargewichtsbereicheinstellungsgruppe ("WRA") bezeichnet werden. Eine WRA ist ziemlich nützlich, wenn man mit einem einzigen Satz von T²-Gruppen arbeitet, die Massen haben werden, die sich über einen beschränkten Bereich erstrecken. Ein einzelner Satz von T²-Gruppen kann verwendet werden, um Tms-Gruppen mit einem weiten Massebereich zu schaffen, einfach indem eine oder mehrere WRA-T³-Gruppen in die Tms einbezogen werden. Als ein einfaches Beispiel liefert somit, wenn ein Satz von T²-Gruppen einen Massebereich von 250-340 Daltons für die Tms bereitstellt, das Hinzufügen einer einzigen WRA mit einer beispielhaften Zahl von 100 Daltons, als eine T³-Gruppe Zugang zum Massebereich 350-440 Daltons, während derselbe Satz von T²-Gruppen verwendet wird. In ähnlicher Weise stellt das Hinzufügen von zwei MWA-Gruppen mit 100 Daltons (jede als eine T³-Gruppe) Zugang zum Massebereich von 450-540 Daltons bereit, wobei dieses inkrementale Hinzufügen von WRA- Gruppen fortgesetzt werden kann, um Zugang zu einem sehr großen Massebereich für die Tms-Gruppe zu liefern. Bevorzugte Verbindungen der Formel T²-(J-T³-)n-L-X haben die Formel RVWC-(RWRA)w-RMSSE-L-X, in der VWC eine "T²"-Gruppe ist und jede der WRA- und MSSE-Gruppen "T³"-Gruppen sind. Diese Struktur ist in Fig. 12 veranschaulicht und stellt einen modularen Ansatz für die Herstellung von Tms dar.
In der Formel T²-(J-T³-)n- sind T² und T³ vorzugsweise ausgewählt aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NHhydrocarbylen, Hydrocarbyl-amid-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N- Di(hydrocarbyl)hydrocarbylen, Hydrocarbylacylhydrocarbylen, Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, substituiertem Heterocyclylhydrocarbyl, wobei das (die) Heteroatom(e) ausgewählt ist (sind) aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor und die Substituenten ausgewählt sind aus Hydrocarbyl, Hydrocarbyl-O-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-NH-hydrocarbylen, Hydrocarbyl-S-hydrocarbylen, N-(Hydrocarbyl)hydrocarbylen, N,N-Di(hydrocarbyl)hydro'- carbylen und Hydrocarbylacyl-hydrocarbylen. Zusätzlich kann T² und/oder T³ ein Derivat irgendeiner der zuvor aufgelisteten potentiellen T²/T³-Gruppen sein, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe durch Fluoride ersetzt sind.
Ebenfalls im Hinblick auf die Formel T²-(J-T³-)n- hat ein bevorzugtes T³ die Formel -G(R²)-, in der G eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylenkette mit einem einzelnen R²-Substituenten ist. So kann, wenn G Ethylen (-CH&sub2;-CH&sub2;-) ist, einer der zwei Ethylen-Kohlenstoffe einen R²-Substituenten tragen und R² ist ausgewählt aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl-kondensiertem Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Aryl-substituiertem Alkenyl oder Alkinyl, Cycloalkylsubstituiertem Alkyl, Cycloalkenyl-substituiertem Cycloalkyl, Biaryl, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Aralkoxy, Aryl-substituiertem Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryl-substituiertem Alkylamino, Aryl-substituiertem Alkenylamino oder Alkinylamino, Aryloxy, Arylamino, N-Alkylharnstoff-substituiertem Alkyl, N-Arylharnstoff-substituiertem Alkyl, Alkylcarbylamino-substituiertem Alkyl, Aminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclyl, Heterocyclyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclyl-substituiertem Amino, Carboxyalkyl-substituiertem Aralkyl, Oxocarbocyclylkondensiertem Aryl und Heterocyclylalkyl; Cycloalkenyl, Aryl-substituiertem Alkyl und Aralkyl, Hydroxy-substituiertem Alkyl, Alkoxy-substituiertem Alkyl, Aralkoxy- substituiertem Alkyl, Alkoxy-substituiertem Alkyl, Aralkoxy-substituiertem Alkyl, Amino- substituiertem Alkyl, (Aryl-substituiertem Alkyloxycarbonylamino)-substituiertem Alkyl, Thiol-substituiertem, Alkylsulfonyl-substituiertem Alkyl, (Hydroxy-substituiertem Alkylthio)-substituiertem Alkyl, Thioalkoxy-substituiertem Alkyl, Hydrocarbylacylamino- substituiertem Alkyl, Heterocyclylocylamino-substituiertem Alkyl, Hydrocarbyl- substituiertem-heterocyclylacylamino-substituiertem Alkyl, Alkylsulfonylamino- substituiertem Alkyl, Arylsulfonylamino-substituiertem Alkyl, Morpholinoalkyl, Thiomorpholinoalkyl, Morpholinocarbonyl-substituiertem Alkyl, Thiomorpholinocarbonyl- substituiertem Alkyl, [N-(Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl)- oder N,N-[Dialkyl, Dialkenyl, Dialkinyl oder (Alkyl, Alkenyl)-amino]carbonyl-substituiertem Alkyl, Heterocyclylaminocarbonyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonyl, Heterocyclylaminocarbonyl- substituiertem Alkyl, Heterocyclylalkylenaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, N,N- [Dialkyl]alkylenaminocarbonyl, N,N-[Dialkyl]alkylenaminocarbonyl-substituiertem Alkyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonyl, Alkyl-substituiertem Heterocyclylcarbonylalkyl, Carboxyl-substituiertem Alkyl, Dialkylamino-substituiertem Acylaminoalkyl und Aminosäureseitenketten, ausgewählt aus Arginin, Asparagin, Glutamin, S-Methylcystein, Methionin und entsprechenden Sulfoxid- und Sulfonderivaten davon, Glycin, Leucin, Isoleucin, allo-Isoleucin, tert.-Leucin, Norleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Prolin, Alanin, Ornithin, Histidin, Glutamin, Valin, Threonin, Serin, Asparaginsäure, beta- Cyanoalanin und allo-Threonin; Alinyl und Heterocyclylcarbonyl, Aminocarbonyl, Amido, Mono- oder Dialkylaminocarbonyl, Mono- oder Diarylaminocarbonyl, Alkylarylaminocarbonyl, Diarylaminocarbonyl, Mono- oder Diacylaminocarbonyl, aromatischem oder aliphatischem Acyl, Alkyl, fakultativ substituiert mit Substituenten, die ausgewählt sind aus Amino, Carboxy, Hydroxy, Mercapto, Mono- oder Dialkylamino, Mono- oder Diarylamino, Alkylarylamino, Diarylamino, Mono- oder Diacylamino, Alkoxy, Alkenoxy, Aryloxy, Thioalkoxy, Thioalkenoxy, Thioalkinoxy, Thioaryloxy und Heterocyclyl.
Eine bevorzugte Verbindung der Formel T²-(J-T³-)n-L-X hat die Struktur:
in der G(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub6; ist, so daß ein Sauerstoff an einer und nur einer der CH&sub2;-Gruppen, die durch ein einziges "G" dargestellt werden, ersetzt ist durch -(CH&sub2;)-Amid-T&sup4;; T² und T&sup4; organische Einheiten der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;HαFβ sind, so daß die Summe von α und β ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; Amid
ist; R¹ Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl ist; c eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0 bis 4 ist; und n eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, G, c, Amid, R¹ und T&sup4; unabhängig ausgewählt werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform hat eine Verbindung der Formel T²-(J-T³-)n-L- X die Struktur:
in der T&sup5; eine organische Einheit der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;HαFβ ist, so daß die Summe von α und β ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; und T&sup5; ein tertiäres oder quartäres Amin oder eine organische Säure einschließt;
m eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0-49 ist und T², T&sup4;, R¹, L und X zuvor definiert worden sind.
Eine weitere bevorzugte Verbindung mit der Formel T²-(J-T³-)n-L-X hat die besondere Struktur:
in der T&sup5; eine organische Einheit der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;HαFβ ist, so daß die Summe von α und β ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N- und O-Atome abzusättigen; und T&sup5; ein tertiäres oder quartäres Amin oder eine organische Säure einschließt; m eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0-49 ist und T², T&sup4;, c, R¹, "Amid", L und X zuvor definiert worden sind.
In den obigen Strukturen, die eine T&sup5;-Gruppe besitzen, ist -Amid-T&sup5; vorzugsweise eine der folgenden Gruppen, die geeigneterweise hergestellt werden, indem organische Säuren mit freien Aminogruppen umgesetzt werden, die an "G" gebunden sind:
Wenn die obigen Verbindungen eine T&sup5;-Gruppe besitzen und die "G"-Gruppe eine freie Carboxylgruppe besitzt (oder ein reaktives Äquivalent davon), dann sind die folgenden Gruppen die bevorzugte -Amid-T&sup5;-Gruppen, die geeigneterweise hergestellt werden können, indem das geeignete organische Amin mit einer freien Carboxylgruppe umgesetzt wird, die an eine "G"-Gruppe gebunden ist:
In drei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung hat T-L-MOI die Struktur:
oder die Struktur:
oder die Struktur:
in denen T² und T&sup4; organische Einheiten der Formel C&sub1;&submin;&sub2;&sub5;N&sub0;&submin;&sub9;O&sub0;&submin;&sub9;S&sub0;&submin;&sub3;P&sub0;&submin;&sub3;HαFβIδ sind, so daß die Summe von α, β und δ ausreichend ist, um die sonst ungesättigten Valenzen der C-, N-, O-, S- und P-Atome abzusättigen; G (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub6; ist, wobei ein und nur ein Wasserstoff auf den CH&sub2;-Gruppen, die durch jedes G dargestellt werden, durch -(CH&sub2;)-Amid-T&sup4; ersetzt ist; Amid
ist; R¹ Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl ist; c eine ganze Zahl aus dem Bereich von 0 bis 4 ist; "C&sub2;-C&sub1;&sub0;" eine Hydrocarbylengruppe mit von 2 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt, "ODN-3'- OH" ein Nukleinsäurefragment mit einer endständigen 3'-Hydroxylgruppe darstellt (d. h. ein Nukleinsäurefragment, das an (C&sub1;-C&sub1;&sub0;) am anderen als dem 3'-Ende des Nukleinsäurefragments gebunden ist); und n eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis 50 ist, so daß, wenn n größer als 1 ist, dann G, c, Amid, R¹ und T&sup4; unabhängig ausgewählt werden. Vorzugsweise sind nicht drei Heteroatome an ein einziges Kohlenstoffatom gebunden.
In Strukturen, wie oben angegeben, die eine T²-C(=0)-N(R¹)-Gruppe enthalten, kann diese Gruppe dadurch gebildet werden, daß ein Amin der Formel HN(R¹)- mit einer organischen Säure umgesetzt wird, die aus den folgenden ausgewählt ist, die nur beispielhaft sind und keine erschöpfende Liste möglicher organischer Säuren darstellen: Ameisensäure, Essigsäure, Propiolsäure, Propionsäure, Fluoressigsäure, 2-Butinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Buttersäure, Methoxyessigsäure, Difluoressigsäure, 4-Pentinsäure, Cyclobutancarbonsäure, 3,3-Dimethylacrylsäure, Valeriansäure, N,N-Dimethylglycin, N-Formyl-Gly-OH, Ethoxyessigsäure, (Methylthio)essigsäure, Pyrrol-2-carbonsäure, 3-Furancarbonsäure, Isoxazol-5-carbonsäure, trans-3-Hexensäure, Trifluoressigsäure, Hexansäure, Ac-Gly-OH, 2- Hydroxy-2-methylbuttersäure, Benzoesäure, Nicotinsäure, 2-Pyrazincarbonsäure, 1-Methyl-2- pyrrolcarbonsäure, 2-Cyclopenten-1-essigsäure, Cyclopentylessigsäure, (S)-(-)-2-Pyrrolidon- 5-carbonsäure, N-Methyl-L-prolin, Heptansäure, Ac-b-Ala-OH, 2-Ethyl-2- hydroxybuttersäure, 2-(2-Methoxyethoxy)essigsäure, p-Tolylsäure, 6-Methylnicotinsäure, 5- Methyl-2-pyrazincarbonsäure, 2,5-Dimethylpyrrol-3-carbonsäure, 4-Fluorbenzoesäure, 3,5- Dimethylisoxazol-4-carbonsäure, 3-Cyclopentylpropionsäure, Octansäure, N,N- Dimethylsuccinamidsäure, Phenylpropiolsäure, Zimtsäure, -4-Ethylbenzoesäure, p-Anissäure, 1,2,5-Trimethylpyrrol-3-carbonsäure, 3-Fluor-4-methylbenzoesäure, Ac-DL-Propargylglycin, 3-(Trifluormethyl)buttersäure, 1-Piperidinpropionsäure, N-Acetylprolin, 3,5- Difluorbenzoesäure, Ac-L-Val-OH, Indol-2-carbonsäure, 2-Benzofurancarbonsäure, Benzotriazol-5-carbonsäure, 4-n-Propylbenzoesäure, 3-Dimethylaminobenzoesäure, 4- Ethoxybenzoesäure, 4-(Methylthio)benzoesäure, N-(2-Furoyl)glycin, 2- (Methylthio)nicotinsäure, 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure, Tfa-Gly-OH, 2 Naphthoesäure, Chinaldinsäure, Ac-L-Ile-OH, 3-Methylinden-2-carbonsäure, 2-Chinoxalincarbonsäure, 1- Methylindol-2-carbonsäure, 2,3,6-Trifluorbenzoesäure, N-Formyl-L-Met-OH, 2-[2-(2- Methoxyethoxy)ethoxy]essigsäure, 4-n-Butylbenzoesäure, N-Benzoylglycin, 5-Fluorindol-2- carbonsäure, 4-n-Propoxybenzoesäure, 4-Acetyl-3,5-dimethyl-2-pyrrolcarbonsäure, 3,5- Dimethoxybenzoesäure, 2,6-Dimethoxynicotinsäure, Cyclohexanpentansäure, 2-Naphthylessigsäure, 4-(1H-Pyrrol-1-yl)benzoesäure, Indol-3-propionsäure, m-Trifluormethylbenzoesäure, 5-Methoxyindol-2-carbonsäure, 4-Pentylbenzoesäure, Bz-b-Ala-OH, 4-Diethylaminobenzoesäure, 4-n-Butoxybenzoesäure, 3-Methyl-5-CF3-isoxazol-4-carbonsäure, (3,4- Dimethoxyphenyl)essigsäure, 4-Biphenylcarbonsäure, Pivaloyl-Pro-OH, Octanoyl-Gly-OH, (2-Naphthoxy)essigsäure, Indol-3-buttersäure, 4-(Trifluormethyl)phenylessigsäure, 5- Methoxyindol-3-essigsäure, 4-(Trifluormethoxy)benzoesäure, Ac-L-Phe-OH, 4-Pentyloxybenzoesäure, Z-Gly-OH, 4-Carboxy-N-(fur-2-ylmethyl)pyrrolidin-2-on, 3,4-Diethoxybenzoesäure, 2,4-Dimethyl-5-CO&sub2;Et-pyrrol-3-carbonsäure, N-(2-Fluorphenyl)succinamidsäure, 3,4,5-Trimethoxybenzoesäure, N-Phenylanthranilsäure, 3-Phenoxybenzoesäure, Nonanoyl- Gly-OH, 2-Phenoxypyridin-3-carbonsäure, 2,5-Dimethyl-1-phenylpyrrol-3-carbonsäure, trans-4-(Trifluormethyl)zimtsäure, (5-Methyl-2-phenyloxazol-4-yl)essigsäure, 4-(2-Cyclohexenyloxy)benzoesäure, 5-Methoxy-2-methylindol-3-essigsäure, trans-4-Cotinincarbonsäure, Bz-5-Aminovaleriansäure, 4-Hexyloxybenzoesäure, N-(3-Methoxyphenyl)succinamidsäure, Z-Sar-OH, 4-(3,4-Dimethoxyphenyl)buttersäure, Ac-o-Fluor-DL-Phe-OH, N-(4-Fluorphenyl)glutaminsäure, 4'-Ethyl-4-biphenylcarbonsäure, 1,2,3,4-Tetrahydroacridincarbonsäure, 3-Phenoxyphenylessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)succinamidsäure, N-Decanoyl-Gly-OH, (+)-6-Methoxy-a-methyl-2-naphthalinessigsäure, 3-(Trifluormethoxy)zimtsäure, N-Formyl- DL-Trp-OH, (R)-(+)-a-Methoxy-a-(trifluormethyl)phenylessigsäure, Bz-DL-Leu-OH, 4- (Trifluormethoxy)phenoxyessigsäure, 4-Heptyloxybenzoesäure, 2,3,4-Trimethoxyzimtsäure, 2,6-Dimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propionsäure, 2,3,4,5,6-Pentafluorphenoxyessigsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)glutaminsäure, N-Undecanoyl-Gly-OH, 2-(4- Fluorbenzoyl)benzoesäure, 5-Trifluormethoxyindol-2-carbonsäure, N-(2,4-Difluorphenyl)diglycolamidsäure, Ac-L-Trp-OH, Tfa-L-Phenylglycin-OH, 3-Iodbenzoesäure, 3-(4-n- Pentylbenzoyl)propionsäure, 2-Phenyl-4-chinolincarbonsäure, 4-Octyloxybenzoesäure, Bz-L- Met-OH, 3,4,5-Triethoxybenzoesäure, N-Lauroyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)benzoesäure, Ac-S-Methyl-DL-Trp-OH, 2-Iodphenylessigsäure, 3-Iod-4-methylbenzoesäure, 3-(4-n- Hexylbenzoyl)propionsäure, N-Hexanoyl-L-Phe-OH, 4-Nonyloxybenzoesäure, 4'-(Trifluormethyl)-2-biphenylcarbonsäure, Bz-L-Phe-OH, N-Tridecanoyl-Gly-OH, 3,5-Bis(trifluormethyl)phenylessigsäure, 3-(4-n-Heptylbenzoyl)propionsäure, N-Heptanoyl-L-Phe-OH, 4-Decyloxybenzoesäure, N-(α,α,α-Trifluor-m-tolyl)anthranilsäure, Nifluminsäure, 4-(2- Hydroxyhexafluorisopropyl)benzoesäure, N-Myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-Octylbenzoyl)propionsäure, N-Octanoyl-L-Phe-OH, 4-Undecyloxybenzoesäure, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)- propionyl-Gly-OH, 8-Iodnaphthoesäure, N-Pentadecanoyl-Gly-OH, 4-Dodecyloxybenzoesäure, N-Palmitoyl-Gly-OH und N-Stearoyl-Gly-OH. Diese organischen Säuren sind von einer der folgenden Firmen erhältlich: Advanced ChemTech, Louisville, KY; Bachem Bioscience Inc., Torrance, CA; Calbiochem-Novablochem Corp., San Diego, CA; Farchan Laboratories Inc., Gainesville FL; Lancaster Synthesis, Windham, NH; und MayBridge Chemical Company (c/o Ryan Scientiflc), Columbia, SC. Die Kataloge dieser Firmen verwenden die Abkürzungen, die oben verwendet werden, um die Säuren zu identifizieren.

f. Kombinatorische Chemie als ein Mittel zur Herstellung von Markierungen

Kombinatorische Chemie ist eine Art von Synthesestrategie, die zur Herstellung großer chemischer Bibliotheken führt (siehe z. B. PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 94/08051). Diese kombinatorischen Bibliotheken können als Markierungen zur Identifizierung von interessierenden Molekülen (MOIs) verwendet werden. Kombinatorische Chemie kann definiert werden als die systematische und wiederholte, kovalente Verknüpfung eines Satzes unterschiedlicher "Bausteine" variierender Struktur miteinander, um eine große Anzahl verschiedener Moleküleinheiten zu liefern. Bausteine können viele Formen annehmen, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, wie etwa Nukleophile, Elektrophile, Diene, Alkylierungs- oder Acylierungsmittel, Diamine, Nukleotide, Aminosäuren, Zucker, Lipide, organische Monomere, Synthons und Kombinationen der obigen. Chemische Reaktionen, die verwendet werden, um die Bausteine zu verknüpfen, können Alkylierung, Acylierung, Oxidation, Reduktion, Hydrolyse, Substitution, Elimination, Addition, Zyklisierung, Kondensation und dergleichen einschließen. Dieser Prozeß kann Bibliotheken von Verbindungen erzeugen, die oligomer, nicht-oligomer oder Kombinationen davon sind. Wenn oligomer, können die Verbindungen verzweigt, unverzweigt oder zyklisch sein. Beispiele für oligomere Strukturen, die mit kombinatorischen Verfahren hergestellt werden können, schließen Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Polylipide, Polyester, Polyamide, Polyurethane, Polyharnstoffe, Polyether, Poly(phosphorderivate), z. B. Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide, Phosphite, Phosphinamide, etc., und Poly(schwefelderivate), z. B. Sulfone, Sulfonate, Sulfite, Sulfonamide, Sulfenamide, etc., ein.
Ein üblicher Typ von oligomerer kombinatorischer Bibliothek ist die kombinatorische Peptid- Bibliothek. Kürzliche Innovationen in der Peptidchemie und Molekularbiologie haben Bibliotheken ermöglicht, die aus einigen zehn bis einigen hundert von Millionen verschiedenen Peptidsequenzen bestehen, die hergestellt und verwendet werden. Solche Bibliotheken können in drei große Kategorien unterteilt werden. Eine Kategorie von Bibliotheken umfaßt die chemische Synthese von löslichen, nicht an einen Träger gebundenen Peptidbibliotheken (z. B. Houghten et al., Nature 354 : 84, 1991). Eine zweite Kategorie umfaßt die chemische Synthese von trägergebundenen Peptidbibliotheken, präsentiert auf festen Trägern, wie etwa Kunststoffnadeln, Harzperlen oder Baumwolle (Geysen et al., Mol. Immunol. 23 : 709, 1986; Lam et al., Nature 354 : 82, 1991; Eichler und Houghten, Biochemistry 32 : 11035, 1993). In diesen ersten zwei Kategorien sind die Bausteine typischerweise L-Aminosäuren, D-Aminosäuren, nicht-natürliche Aminosäuren oder irgendeine Mischung oder Kombination davon. Eine dritte Kategorie verwendet molekularbiologische Ansätze, um Peptide oder Proteine auf der Oberfläche filamentöser Phagenteilchen oder Plasmide herzustellen (Scott und Craig, Curr. Opinion Biotech. 5 : 40, 1994). Lösliche, nicht an Träger gebundene Peptidbibliotheken scheinen für eine Reihe von Anwendungen geeignet zu sein, einschließlich Verwendung als Markierungen. Das verfügbare Repertoire von chemischen Diversitäten in Peptidbibliotheken kann durch solche Schritte wie Permethylierung ausgedehnt werden (Ostresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91 : 11138, 1994).
Zahlreiche Varianten von kombinatorischen Peptidbibliotheken sind möglich, in denen die Peptid-Rückgratkette modifiziert wird und/oder die Amidbindungen durch mimetische Gruppen ersetzt worden sind. Amid-mimetische Gruppen, die verwendet werden können, schließen Harnstoffe, Urethane und Carbonylmethylengruppen ein. Die Umstrukturierung der Rückgratkette, so daß Seitenketten von den Amid-Stickstoffen jeder Aminosäure statt von den Alpha-Kohlenstoffatomen ausgehen, ergeben Bibliotheken von Verbindungen, die als Peptoide bekannt sind (Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89 : 9367, 1992).
Ein weiterer üblicher Typ von oligomerer kombinatorischer Bibliothek ist die kombinatorische Oligonukleotidbibliothek, in der die Bausteine irgendeine Form von natürlich vorkommenden oder nicht-natürlichen Nukleotid- oder Polysaccharid-Derivaten sind, einschließlich die Fälle, in denen verschiedene organische und anorganische Gruppen die Phosphatverknüpfung ersetzen können und Stickstoff oder Schwefel Sauerstoff in einer Etherverknüpfung ersetzen können (Schneider et al., Biochem. 34 : 9599, 1995; Freier et al., J. Med. Chem. 38 : 344, 1995; Frank, J. Biotechnology 41 : 259, 1995; Schneider et al., veröffentlichte PCT WO 942052; Ecker et al., Nucleic Acids Res. 21 : 1853, 1993).
Vor kurzem ist die kombinatorische Herstellung von Sammlungen nicht-oligomerer, kleiner Molekülverbindungen beschrieben worden (DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 690, 1993; Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91 : 4708, 1994). Strukturen, die für die Einstellung von Kleinmolekül-Bibliotheken geeignet sind, umfassen eine breite Vielfalt organischer Moleküle, z. B. Heterozyklen, Aromaten, Alizyklen, Aliphaten, Steroide, Antibiotika, Enzyminhibitoren, Liganden, Hormone, pharmazeutische Wirkstoffe, Alkaloide, Opioide, Terpene, Porphyrine, Toxine, Katalysatoren sowie Kombinationen davon.

g. Spezifische Verfahren zur kombinatorischen Synthese von Markierungen

Zwei Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines unterschiedlichen Satzes Amin- enthaltender MS-Markierungen sind unten umrissen. In beiden Verfahren wird Festphasensynthese eingesetzt, um simultane parallele Synthese einer großen Anzahl markierter Linker zu ermöglichen, unter Verwendung der Techniken der kombinatorischen Chemie. Beim ersten Verfahren führt die letztendliche Abspaltung der Markierung vom Oligonukleotid zur Freisetzung eines Carbonsäureamids. Beim zweiten Verfahren erzeugt die Abspaltung der Markierung eine Carbonsäure. Die chemischen Komponenten und Verknüpfungselemente, die in diesen Verfahren verwendet werden, werden wie folgt abgekürzt:
R = Harz
FMOC = Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe
All = Allyl-Schutzgruppe
CO&sub2;H = Carbonsäuregruppe
CONH&sub2; = Carbonsäureamidgruppe
NH&sub2; = Aminogruppe
OH = Hydroxylgruppe
CONH = Amidverknüpfung
COO = Esterverknüpfung
NH&sub2;-Rink-CO&sub2;H = 4-[(α-Amino)-2,4-dimethoxybenzyl)-phenoxybuttersäure (Rink-Linker)
OH-1MeO-CO&sub2;H = (4-Hydroxymethyl)phenoxybuttersäure
OH-2MeO-CO&sub2;H = (4-Hydroxymethyl-3-methoxy)phenoxyessigsäure
NH&sub2;-A-COOH = Aminosäure mit aliphatischer oder aromatischer Aminfunktionalität in der Seitenkette
X1...Xn-COOH = Satz von n verschiedenen Carbonsäuren mit einzigartigen relativen Molekülmassen
Oligo1...Oligo(n) = Satz von n Oligonukleotiden
HBTU = O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat
Die Abfolge der Schritte in Verfahren 1 ist wie folgt:
Die Abfolge der Schritte in Verfahren 2 ist wie folgt:

2. Linker

Eine "Linker"-Komponente (oder L), wie hierin verwendet, bedeutet entweder eine direkte kovalente Bindung oder eine organische chemische Gruppe, die verwendet wird, um eine "Markierung" (oder T) an ein "interessierendes Molekül" (oder MOI) durch kovalente chemische Bindungen zu binden. Zusätzlich ist die direkte Bindung selbst oder eine oder mehrere Bindungen innerhalb der Linker-Komponente unter Bedingungen spaltbar, die ermöglichen, daß T vom Rest der T-L-X-Verbindung (einschließlich der MOI-Komponente) freigesetzt (mit anderen Worten abgespalten) wird. Die variable Markierungskomponente, die innerhalb von T vorhanden ist, sollte gegenüber den Spaltungsbedingungen stabil sein. Vorzugsweise kann die Spaltung schnell durchgeführt werden; innerhalb weniger Minuten und vorzugsweise innerhalb etwa 15 Sekunden oder weniger.
Im allgemeinen wird ein Linker verwendet, um jede aus einem großen Satz von Markierungen mit jedem aus einem ähnlich großen Satz von MOIs zu verknüpfen. Typischerweise wird eine einzige Markierungs-Linker-Kombination mit jedem MOI verknüpft (um verschiedene T-L- MOI zu ergeben), aber in einigen Fällen kann mehr als eine Markierungs-Linker- Kombination mit jedem individuellen MOI verknüpft werden (um verschiedene (T-L)n-MOI zu ergeben). In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwei oder mehr Markierungen an einen einzigen Linker durch mehrere, unabhängige Stellen auf dem Linker gebunden, und diese Mehrfachmarkierungs-Linker-Kombination wird dann an ein einzelnes MOI gebunden (um verschiedene (T)n-L-MOI zu ergeben).
Nach verschiedenen Manipulationen des Satzes markierter MOIs werden spezielle chemische und/oder physikalische Bedingungen verwendet, um eine oder mehrere kovalente Bindungen im Linker zu spalten, was zur Freisetzung der Markierungen von den MOIs führt. Die spaltbare(n) Bindung(en) kann (können) einige derselben Bindungen sein, die gebildet wurden, als die Markierung, der Linker und das MOI miteinander verknüpft wurden, oder nicht. Die Konstruktion des Linkers wird zum großen Teil die Bedingungen bestimmen, unter denen die Spaltung durchgeführt werden kann. Demgemäß können Linker durch die Spaltungsbedingungen identifiziert werden, gegenüber denen sie besonders empfindlich sind. Wenn ein Linker photolabil ist (d. h. zur Spaltung durch Einwirkung von aktinischer Strahlung neigt), kann dem Linker die Bezeichnung Lh gegeben werden. In ähnlicher Weise können die Bezeichnungen LSäure, LBase, L[O], L[R], Lenz, Lelc, LΔ und Lss verwendet werden, um Linker zu bezeichnen, die besonders empfindlich sind gegenüber der Spaltung durch Säure, Base, chemische Oxidation, chemische Reduktion, die katalytische Aktivität eines Enzyms (einfacher "Enzym"), elektrochemische Oxidation oder Reduktion, erhöhte Temperatur ("thermisch") bzw. Thiolaustausch.
Bestimmte Linker-Typen sind gegenüber einem einzigen Typ von Spaltungsbedingung labil, wohingegen andere gegenüber mehreren Typen von Spaltungsbedingungen labil sind. Zusätzlich kann jede der Markierungs-Bindungsstellen in Linkem, die mehrere Markierungen binden können (um (T)n-L-MOI-Strukturen zu ergeben), gegenüber unterschiedlichen Spaltungsbedingungen labil sein. Bei einem Linker mit zwei daran gebundenen Markierungen kann z. B. eine der Markierungen nur gegenüber Base labil sein und die andere nur gegenüber Photolyse.
Ein Linker, der in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, besitzt mehrere Eigenschaften:
1) Der Linker besitzt einen chemischen Griff (Lh), durch den er mit einem MOI verknüpft werden kann.
2) Der Linker besitzt einen zweiten, separaten chemischen Griff (Lh), durch den die Markierung an den Linker gebunden wird. Wenn mehrere Markierungen an einen einzigen Linker gebunden werden ((T)n-L-MOI-Strukturen), dann existiert für jede Markierung ein separater Griff.
3) Der Linker ist gegenüber allen Manipulationen stabil, denen er unterworfen wird, mit Ausnahme der Bedingungen, die eine Spaltung ermöglichen, so daß eine T-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung, einschließlich MOI, freigesetzt wird. Somit ist der Linker während der Bindung der Markierung an den Linker, der Bindung des Linkers an das MOI und allen Manipulationen des MOIs, während die Markierung und der Linker (T-L) daran gebunden sind, stabil.
4) Der Linker beeinflußt die Manipulationen, die am MOI durchgeführt werden, während das T-L daran gebunden ist, nicht signifikant. Wenn das T-L z. B. an ein Oligonukleotid gebunden ist, darf das T-L irgendwelche Hybridisierungs- oder enzymatischen Reaktionen (z. B. PCR), die am Oligonukleotid durchgeführt werden, nicht signifikant beeinflussen. In ähnlicher Weise darf, wenn das T-L an einen Antikörper gebunden ist, es nicht die Antigen-Erkennung durch den Antikörper beeinflussen.
5) Die Abspaltung der Markierung vom Rest der Verbindung tritt in einer in hohem Maße kontrollierten Art und Weise ein, unter Verwendung physikalischer oder chemischer Verfahren, die die Nachweisbarkeit der Markierung nicht nachteilig beeinflussen.
Für jeden gegebenen Linker ist es bevorzugt, daß der Linker mit einer breiten Vielfalt von MOIs verknüpfbar ist und daß eine breite Vielfalt von Markierungen mit dem Linker verknüpfbar ist. Eine solche Flexibilität ist vorteilhaft, weil sie erlaubt, daß eine Bibliothek von T-L-Konjugaten, wenn sie erst einmal hergestellt ist, mit verschiedenen unterschiedlichen Sätzen von MOIs verwendet werden kann.
Wie oben erläutert, hat ein bevorzugter Linker die Formel
Lh-L¹-L²-L³-Lh
in der jedes Lh ein reaktiver Griff ist, der verwendet werden kann, um den Linker mit einem Markierungs-Reaktanten und einem Reaktanten aus einem interessierenden Molekül zu verknüpfen. L² ist ein wesentlicher Teil des Linkers, weil L² dem Linker Labilität verleiht. L¹ und L³ sind fakultative Gruppen, die wirkungsvoll dazu dienen, L² von den Griffen Lh zu trennen.
L¹ (das definitionsgemäß näher an T ist als L³) dient dazu, T von der erforderlichen labilen Einheit L² zu trennen. Diese Trennung kann nützlich sein, wenn die Spaltungsreaktion besonders reaktive Spezies (z. B. freie Radikale) erzeugt, die zufällige Veränderungen in der Struktur der T-enthaltenden Einheit bewirken könnten. Da die Spaltungsstelle weiter von der T-enthaltenden Einheit getrennt wird, besteht eine verringerte Wahrscheinlichkeit, daß reaktive Spezies, die an der Spaltungsstelle gebildet werden, die Struktur der T-enthaltenden Einheit aufbrechen werden. Auch können, da die Atome in L¹ typischerweise in der T- enthaltenden Einheit vorhanden sein werden, diese L¹-Atome der T-enthaltenden Einheit eine wünschenswerte Qualität verleihen. Wenn die T-enthaltende Einheit z. B. eine Tms-enthaltende ist und ein gehindertes Amin wünschenswerterweise als Teil der Struktur der Tms- enthaltenden Einheit vorhanden ist (um z. B. als ein MSSE zu dienen), kann das gehinderte Amin in der labilen L¹-Einheit vorhanden sein.
In anderen Fällen können L¹ und/oder L³ in einer Linkerkomponente vorhanden sein, weil der kommerzielle Lieferant eines Linkers sich entschieden hat, den Linker in einer Form mit solch einer L¹- und/oder L³-Gruppe zu vertreiben. In solch einem Fall besteht kein Nachteil darin, Linker mit L¹ - und/oder L³-Gruppen zu verwenden (so lange diese Gruppen die Spaltungsreaktion nicht hemmen), selbst dann, wenn sie den Verbindungen, die sie umfassen, keine besonderen Leistungsvorteile verleihen. Somit erlaubt die vorliegende Erfindung, daß L¹- und/oder L³-Gruppen in der Linkerkomponente vorhanden sind.
L¹- und/oder L³-Gruppen können eine direkte Bindung sein (wobei in diesem Falle die Gruppe effektiv nicht vorhanden ist), eine Hydrocarbylen-Gruppe (z. B. Alkylen, Arylen, Cycloalkylen, etc.), -O-Hydrocarbylen (z. B. -O-CH&sub2;-, O-CH&sub2;CH(CH&sub3;)-, etc.) oder Hydrocarbylen-(O-hydrocarbylen)w, wobei w eine ganze Zahl aus dem Bereich von 1 bis etwa 10 ist (z. B. -CH&sub2;-O-Ar-, -CH&sub2;-(O-CH&sub2;CH&sub2;)&sub4;-, etc.).
Mit dem Auftauchen der Festphasensynthese ist eine große Menge an Literatur zu Linkem entstanden, die gegenüber spezifischen Reaktionsbedingungen labil sind. Bei der typischen Festphasensynthese wird ein fester Träger durch einen labilen Linker an eine reaktive Stelle gebunden, und ein zu synthetisierendes Molekül wird an der reaktiven Stelle erzeugt. Wenn das Molekül vollständig synthetisiert ist, wird das Konstrukt aus festem Träger, Linker und Molekül Spaltungsbedingungen unterworfen, die das Molekül vom festen Träger freisetzen. Die labilen Linker, die zur Verwendung in diesem Zusammenhang entwickelt worden sind (oder die in diesem Zusammenhang verwendet werden können), können auch ohne weiteres als der Linker-Reaktant in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Lloyd-Williams, P., et al., "Convergent Solid-Phase Peptide Synthesis", Tetrahedron Report Nr. 347, 49(48) : 11065-11133 (1993) liefert eine ausführliche Diskussion von Linkem, die gegenüber aktinischer Strahlung (d. h. Photolyse) sowie sauren, basischen und anderen Spaltungsbedingungen labil sind. Zusätzliche Informationsquellen über labile Linker sind leicht erhältlich.
Wie oben beschrieben, werden unterschiedliche Linkerkonstruktionen unter unterschiedlichen spezifischen physikalischen oder chemischen Bedingungen Spaltbarkeit ("Labilität") verleihen. Beispiele für Bedingungen, die dazu dienen, verschiedene Linkerkonstruktionen zu spalten, schließen saure, basische, Oxidations-, Reduktions-, Fluorid-, Thiolaustausch-, Photolyse- und enzymatische Bedingungen ein.
Beispiele für spaltbare Linker, die die allgemeinen Kriterien für Linker erfüllen, die oben aufgelistet sind, werden den Fachleuten gut bekannt sein und schließen diejenigen ein, die im Katalog zu finden sind, der von Pierce (Rockford, IL) erhältlich ist. Beispiele schließen ein:
- Ethylenglycobis(succinimidylsuccinat) (EGS), ein aminreaktives Vernetzungsreagens, das mit Hydroxylamin spaltbar ist (1 M bei 37ºC für 3-6 Stunden);
- Disuccinimidyltartrat (DST) und Sulfo-DST, die aminreaktive Vernetzungsreagentien sind, spaltbar mit 0,015 M Natriumperiodat;
- Bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES) und Sulfo- BSOCOES, die aminreaktive Vernetzungsmittel sind, spaltbar durch Base (pH 11,6);
- 1,4-Di[3'-(2'-pyridyldithio(propionamido))butan (DPDPB), ein Pyridyldithiol- Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-[4-(p-Azidosalicylamido)-butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid (APDP), ein Pyridyldithiol-Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Bis-[beta-4-(azidosalicylamido)ethyl]-disulfid, ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat (SADP), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'- dithiopropionat (SAED), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAND), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist.
Andere Beispiele für spaltbare Linker und die Spaltungsbedingungen, die verwendet werden können, um Markierungen freizusetzen, sind wie folgt. Eine Silyl-Verknüpfungsgruppe kann durch Fluorid oder unter sauren Bedingungen gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6- substituierte 2-Nitrobenzyloxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4-Nitrobenzyloxy- Verknüpfungsgruppe kann durch eine Photonenquelle (Photolyse) gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Alkoxyphenoxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4- Alkoxyphenoxy-Verknüpfungsgruppe kann durch Ce(NH&sub4;)&sub2;(NO&sub3;)&sub6; (Oxidation) gespalten werden. Ein NCO&sub2;(Urethan)-Linker kann durch Hydroxid (Base), Säure oder LiAlH&sub4; (Reduktion) gespalten werden. Eine 3-Pentenyl-, 2-Butenyl- oder 1-Butenyl- Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub3;, OsO&sub4;/IO&sub4;&supmin; oder KMnO&sub4; (Oxidation) gespalten werden. Eine 2-[3-, 4- oder 5-substituierte Furyl]oxy-Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub2;, Br&sub2;, MeOH oder Säure gespalten werden.
Bedingungen für die Spaltung weiterer labiler Verknüpfungsgruppen schließen ein: tert.- Alkyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure gespalten werden; Methyl(dialkyl)methoxy- oder 4-substituierte 2-Alkyl-1,3-dioxan-2-yl-Verknüpfungsgruppen können durch H&sub3;O&spplus; gespalten werden; 2-Silylethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Fluorid oder durch Säure gespalten werden; 2-(X)-Ethoxy (wobei X = Keto, Esteramid, Cyano, NO&sub2;, Sulfid, Sulfoxid, Sulfon ist)-Verknüpfungsgruppen können unter alkalischen Bedingungen gespalten werden; 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte Benzyloxy- Verknüpfungsgruppen können durch Säure oder unter reduktiven Bedingungen gespalten werden; 2-Butenyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch (Ph&sub3;P)&sub3;RhCl(H) gespalten werden; 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Bromphenoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Li, Mg oder BuLi gespalten werden; Methylthiomethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Hg²&spplus; gespalten werden; 2-(X)-Ethyloxy(wobei X = ein Halogen)-Verknüpfungsgruppen können durch Zn oder Mg gespalten werden; 2-Hydroxyethyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Oxidation (z. B. mit Pb(OAc)&sub4;) gespalten werden.
Bevorzugte Linker sind diejenigen, die durch Säure oder Photolyse gespalten werden. Mehrere der säurelabilen Linker, die für Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden sind, sind zur Verknüpfung von Markierungen mit MOIs nützlich. Einige dieser Linker sind bei einem kürzlich erschienenen Überblick von Lloyd-Williams et al. beschrieben (Tetrahedron 49 : 11065-11133, 1993). Ein nützlicher Linker-Typ beruht auf p-Alkoxybenzylalkoholen, von denen zwei, 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure und 4-(4-Hydroxymethyl-3- methoxyphenoxy)buttersäure, von Advanced ChemTech (Louisville, KY) kommerziell erhältlich sind. Beide Linker können über eine Esterbindung mit dem Benzylalkohol an eine Markierung gebunden werden und über eine Amidbindung mit der Carbonsäure an ein aminhaltiges MOI. Markierungen, die durch diese Moleküle gebunden sind, werden vom MOI mit variierenden Konzentrationen in Trifluoressigsäure freigesetzt. Die Spaltung dieser Linker führt zur Freisetzung einer Carbonsäure auf der Markierung. Säurespaltung von Markierungen, die durch verwandte Linker gebunden sind, wie etwa 2-Dimethoxy-4'- (carboxymethyloxy)-benzhydrylamin (erhältlich von Advanced ChemTech in FMOC- geschützter Form), führt zur Freisetzung eines Carbonsäureamids auf der freigesetzten Markierung.
Die photolabilen Linker, die für diese Anwendung nützlich sind, sind ebenfalls größtenteils für die Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden (siehe Übersicht von Lloyd-Williams). Diese Linker beruhen üblicherweise auf 2-Nitrobenzylestern oder 2-Nitrobenzylamiden. Zwei Beispiele für photolabile Linker, über die vor kurzem in der Literatur berichtet worden ist, sind 4-(4-(1-FMOC-Amino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (Holmes und Jones, J. Org. Chem. 60 : 2318-2319, 1995) und 3-(FMOC-Amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al., Molecular Diversity 1 : 4-12, 1995). Beide Linker können über die Carbonsäure an ein Amin auf dem MOI gebunden werden. Die Bindung der Markierung an den Linker erfolgt durch Bildung eines Amids zwischen einer Carbonsäure auf der Markierung und dem Amin auf dem Linker. Die Spaltung photolabiler Linker erfolgt üblicherweise mit UV-Licht mit 350 nm Wellenlänge bei Intensitäten und Zeiträumen, die den Fachleuten bekannt sind. Die Spaltung der Linker führt zu einer Freisetzung eines primären Amids auf der Markierung. Beispiele für photospaltbare Linker schließen Nitrophenylglycinester, exo- und endo-2- Benzonorborneylchloride und Methansulfonate und 3-Amino-3(2-nitrophenyl)propionsäure ein. Beispiele für enzymatische Spaltung schließen Esterasen, die Esterbindungen spalten werden, Nukleasen, die Phosphodiester spalten werden, Proteasen, die Peptidbindungen spalten werden, etc. ein.
Eine bevorzugte Linkerkomponente besitzt eine ortho-Nitrobenzyl-Struktur, wie unten dargestellt:
in der ein Kohlenstoffatom an den Positionen a, b, c, d oder e mit -L³-X substituiert ist und L¹ (das vorzugsweise eine direkte Bindung ist) links von N(R¹) in der obigen Struktur vorhanden ist. Solch eine Linkerkomponente ist empfindlich gegenüber selektiver photo-induzierter Spaltung der Bindung zwischen dem Kohlenstoff mit der Bezeichnung "a" und N(R¹). Die Identität von R¹ ist typischerweise für die Spaltungsreaktion nicht kritisch, R¹ wird jedoch vorzugsweise ausgewählt aus Wasserstoff und Hydrocarbyl. Die vorliegende Erfindung sorgt dafür, daß in der obigen Struktur -N(R¹)- durch -O- ersetzt werden könnte. Auch können in der obigen Struktur eine oder mehrere der Positionen b, c, d oder e fakultativ mit Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert sein, wobei diese Substituenten bei jedem Auftreten unabhängig ausgewählt werden.
Eine weitere bevorzugte Linkerkomponente mit einem chemischen Griff Lh hat die folgende Struktur:
in der eine oder mehrere der Positionen b, c, d oder e mit Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Fluorid, Chlorid, Hydroxyl, Carboxylat oder Amid substituiert ist, R¹ Wasserstoff oder Hydrocarbyl ist und R² -OH oder eine Gruppe ist, die eine Carbonsäure zur Kopplung mit einer weiteren Einheit entweder schützt oder aktiviert. Fluorkohlenstoff und Fluorkohlenwasserstoffgruppen sind bevorzugte Gruppen, die Carbonsäure zu einer Kopplung mit einer anderen Einheit aktivieren.

3. Interessierendes Molekül (MOI)

Beispiele für MOIs schließen Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloge (z. B. PNA), Fragmente von Nukleinsäuren (d. h. Nukleinsäurefragmente), synthetische Nukleinsäuren oder Fragmente, Oligonukleotide (z. B. DNA oder RNA), Proteine, Peptide, Antikörper oder Antikörperfragmente, Rezeptoren, Rezeptorliganden, Teile eines Ligandenpaares, Cytokine, Hormone, Oligosaccharide, synthetische organische Moleküle, pharmazeutische Wirkstoffe und Kombinationen derselben ein.
Bevorzugte MOIs schließen Nukleinsäurefragmente ein. Bevorzugte Nukleinsäurefragmente sind Primersequenzen, die zu den Vektoren vorhandenen Sequenzen komplementär sind, wobei die Vektoren zur Basensequenzierung verwendet werden. Vorzugsweise ist ein Nukleinsäurefragment direkt oder indirekt an eine Markierung an einem anderen als dem 3'- Ende des Fragments gebunden; am bevorzugtesten am 5'-Ende des Fragmentes. Nukleinsäurefragmente können gekauft oder hergestellt werden auf der Basis genetischer Datenbanken (z. B. Dib et al., Nature 380 : 152-154, 1996 und CEPH Genotype Database, http://www.cephb.fr) und von kommerziellen Anbietern (z. B. Promega, Madison, WI).
Wie hierin verwendet, schließt MOI Derivate eines MOIs ein, die eine Funktionalität enthalten, die nützlich ist bei der Verknüpfung des MOIs mit einer T-L-Lh-Verbindung. Ein Nukleinsäurefragment, das einen Phosphodiester am 5'-Ende aufweist, wobei der Phosphodiester auch an ein Alkylenamin gebunden ist, ist z. B. ein MOI. Solch ein MOI ist in z. B. U.S.-Patent 4,762,779 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme mit einbezogen wird. Ein Nukleinsäurefragment mit einer internen Modifikation ist ebenfalls ein MOI. Eine beispielhafte interne Modifikation eines Nukleinsäurefragmentes ist, daß die Base (z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin, Uracil) modifiziert worden ist, um eine reaktive funktionelle Gruppe hinzuzufügen. Solche intern modifizierten Nukleinsäurefragmente sind kommerziell erhältlich von z. B. Glen Research, Herndon, VA. Eine weitere beispielhafte interne Modifikation eines Nukleinsäurefragments ist, daß ein abasisches Phosphoramidat verwendet wird, um einen modifizierten Phosphodiester zu synthetisieren, der zwischen einem Zucker und einer Phosphatgruppe eines Nukleinsäurefragments angeordnet ist. Das abasische Phosphoramidat enthält eine reaktive Gruppe, die ermöglicht, daß ein Nukleinsäurefragment, das diese Phosphoramidat-abgeleitete Einheit enthält, mit einer weiteren Einheit verknüpft wird z. B. mit einer T-L-Lh-Verbindung. Solche abasischen Phosphoramidate sind kommerziell erhältlich von z. B. Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA.

4. Chemische Griffe (Lh)

Ein chemischer Griff ist eine stabile, aber reaktive Atomanordnung, die als ein Teil eines ersten Moleküls vorhanden ist, wo der Griff eine chemische Reaktion mit einem komplementären chemischen Griff durchlaufen kann, der als Teil eines zweiten Moleküls vorhanden ist, um eine kovalente Bindung zwischen den zwei Molekülen zu bilden. Der chemische Griff kann z. B. eine Hydroxylgruppe sein und der komplementäre chemische Griff kann eine Carbonsäuregruppe (oder ein aktiviertes Derivat, z. B. ein Hydrofluoroarylester) sein, woraufhin eine Reaktion zwischen diesen zwei Griffen eine kovalente Bindung (spezifisch eine Estergruppe) bildet, die die zwei Moleküle miteinander verknüpft.
Chemische Griffe können in einer großen Anzahl von kovalente Bindungen bildenden Reaktionen verwendet werden, die für die Bindung von Markierungen an Linker und Linker in MOIs geeignet sind. Solche Reaktionen schließen Alkylierung (z. B. um Ether, Thioether zu bilden), Acylierung (z. B. um Ester, Amide, Carbamate, Harnstoffe, Thioharnstoffe zu bilden), Phosphorylierung (z. B. um Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide zu bilden), Sulfonylierung (z. B. um Sulfonate, Sulfonamide zu bilden), Kondensation (z. B. um Imine, Oxime, Hydrazone zu bilden), Silylierung, Disulfidbildung und Erzeugung reaktiver Zwischenstufen, wie etwa Nitrene oder Carbene, durch Photolyse ein. Im allgemeinen sind Griffe und bindungsbildende Reaktionen, die zur Bindung von Markierungen an Linker geeignet sind, auch zur Bindung von Linkem an MOIs geeignet und umgekehrt. In einigen Fällen kann das MOI eine vorherige Modifikation oder Derivatisierung durchlaufen, um den für die Bindung des Linkers benötigten Griff bereitzustellen.
Ein Bindungstyp, der besonders nützlich ist zur Bindung von Linkem an MOIs, ist die Disulfidbindung. Ihre Bildung erfordert das Vorhandensein einer Thiolgruppe ("Griff') auf dem Linker und einer weiteren Thiolgruppe auf dem MOI. Milde oxidierende Bedingungen reichen dann aus, um die zwei Thiole als ein Disulfid miteinander zu verbinden. Disulfidbildung kann auch durch Verwendung eines Überschusses an einem geeigneten Disulfidaustauschreagens, z. B. Pyridyldisulfide, induziert werden. Weil Disulfidbildung leicht reversibel ist, kann das Disulfid auch als die spaltbare Bindung zur Freisetzung der Markierung verwendet werden, falls gewünscht. Dies wird typischerweise unter ähnlich milden Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Thiolaustauschreagens, z. B. Dithiothreitol.
Von besonderem Interesse für die Bindung von Markierungen (oder Markierungen mit Linkem) an Oligonukleotide ist die Bildung von Amidbindungen. Griffe aus primärem aliphatischen Amin können leicht mit Phosphoramiditen, wie etwa 6- Monomethoxytritylhexylcyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit (erhältlich von Glen Research, Sterling, VA), in synthetische Oligonukleotide eingeführt werden. Die in natürlichen Nukleotiden anzutreffenden Amine, wie etwa Adenosin und Guanosin, sind praktisch nicht-reaktiv, verglichen mit dem eingeführten primären Amin. Dieser Unterschied in der Reaktivität bildet die Grundlage für die Fähigkeit, selektiv Amide und verwandte Bindungsgruppen (z. B. Harnstoffe, Thioharnstoffe, Sulfonamide) mit dem eingeführten primären Amin und nicht mit den Nukleotid-Aminen zu bilden.
Wie in dem Katalog von Molecular Probes (Eugene, OR) aufgelistet, schließt eine teilweise Aufzählung von aminreaktiven funktionellen Gruppen aktivierte Carbonsäureester, Isocyanate, Isothiocyanate, Sulfonylhalogenide und Dichlortriazene ein. Aktivester sind hervorragende Reagentien zur Aminmodifizierung, da die gebildeten Amidprodukte sehr stabil sind. Diese Reagentien zeigen auch gute Reaktivität mit aliphatischen Aminen und geringe Reaktivität mit den Nukleotid-Aminen von Oligonukleotiden. Beispiele für Aktivester schließen N-Hydroxysuccinimidester, Pentafluorphenylester, Tetrafluorphenylester und p- Nitrophenylester ein. Aktivester sind nützlich, weil sie aus praktisch jedem Molekül hergestellt werden können, das eine Carbonsäure enthält. Verfahren zur Herstellung von Aktivestern sind aufgelistet in Bodansky (Principles of Peptide Chemistry (2. Aufl.), Springer-Verlag, London, 1993).

5. Linker-Bindung

Typischerweise wird ein einziger Linker-Typ verwendet, um einen bestimmten Satz oder eine bestimmte Familie von Markierungen mit einem bestimmten Satz oder einer bestimmten Familie von MOIs zu verbinden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein einziger, gleichförmiger Prozeß befolgt werden, um alle verschiedenen T-L-MOI- Strukturen zu schaffen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn der Satz von T-L-MOI- Strukturen groß ist, weil es ermöglicht, daß der Satz unter Verwendung von Verfahren der kombinatorischen Chemie oder einer anderen Parallelverarbeitungstechnologie hergestellt werden kann. In einer ähnlichen Art und Weise ermöglicht die Verwendung eines einzigen Linker-Typs, das ein einziger, gleichförmiger Prozeß zur Spaltung aller verschiedenen T-L- MOI-Strukturen eingesetzt werden kann. Wieder ist dies für einen großen Satz von T-L-MOI- Strukturen vorteilhaft, weil der Satz auf eine parallele, wiederholte und/oder automatisierte Art und Weise verarbeitet werden kann.
Es gibt jedoch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der zwei oder mehr Linker-Typen verwendet werden, um unterschiedliche Untersätze von Markierungen mit entsprechenden Untersätzen von MOIs zu verbinden. In diesem Fall können selektive Spaltungsbedingungen verwendet werden, um jeden der Linker unabhängig zu spalten, ohne die auf den anderen Untersätzen von MOIs vorhandenen Linker zu spalten.
Eine große Anzahl von kovalente Bindungen bildenden Reaktionen sind für die Bindung von Markierungen an Linker und Linker an MOIs geeignet. Solche Reaktionen schließen Alkylierung (z. B. um Ether, Thioether zu bilden), Acylierung (z. B. um Ester, Amide, Carbamate, Harnstoffe, Thioharnstoffe zu bilden), Phosphorylierung (z. B. um Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide zu bilden), Sulfonylierung (z. B. um Sulfonate, Sulfonamide zu bilden), Kondensation (z. B. um Imine, Oxime, Hydrazone zu bilden), Silylierung, Disulfidbildung und Erzeugung reaktiver Zwischenstufen, wie etwa Nitrene oder Carbene, durch Photolyse ein. Im allgemeinen sind Griffe und bindungsbildende Reaktionen, die zur Bindung von Markierungen an Linker geeignet sind, auch zur Bindung von Linkem an MOIs geeignet und umgekehrt. In einigen Fällen kann das MOI eine vorherige Modifikation oder Derivatisierung durchlaufen, um den zur Bindung des Linkers notwendigen Griff bereitzustellen.
Ein Bindungstyp, der besonders nützlich für die Bindung von Linker an MOIs ist, ist die Disulfidbindung. Ihre Bildung erfordert das Vorhandensein einer Thiolgruppe ("Griff") auf dem Linker und einer weiteren Thiolgruppe auf dem MOI. Milde oxidierende Bedingungen reichen dann aus, um die zwei Thiole miteinander als ein Disulfid zu verbinden. Disulfidbildung kann auch durch die Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Disulfidaustauschreagens, z. B. Pyridyldisulfide, induziert werden. Weil Disulfidbildung leicht reversibel ist, kann das Disulfid auch als die spaltbare Bindung zur Freisetzung der Markierung verwendet werden, falls gewünscht. Dies wird typischerweise unter ähnlich milden Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung eines Überschusses eines geeigneten Thiolaustauschreagens, z. B. Dithiothreitol.
Von besonderem Interesse für die Bindung von Markierungen an Oligonukleotide ist die Bildung von Amidbindungen. Griffe aus primärem aliphatischen Amin können leicht mit Phosphoramiditen, wie etwa 6-Monomethoxytritylhexylcyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit (erhältlich von Glen Research, Sterling, VA), in synthetische Oligonukleotide eingeführt werden. Die in natürlichen Nukleotiden anzutreffenden Amine, wie etwa Adenosin und Guanosin, sind praktisch nicht-reaktiv, verglichen mit dem eingeführten primären Amin. Dieser Unterschied in der Reaktivität bildet die Grundlage für die Fähigkeit, selektiv Amide und verwandte Bindungsgruppen (z. B. Harnstoffe, Thioharnstoffe, Sulfonamide) mit dem eingeführten primären Amin und nicht mit den Nukleotid-Aminen zu bilden.
Wie in dem Katalog von Molecular Probes (Eugene, OR) aufgelistet, schließt eine teilweise Aufzählung von aminreaktiven funktionellen Gruppen aktivierte Carbonsäureester, Isocyanate, Isothiocyanate, Sulfonylhalogenide und Dichlortriazene ein. Aktivester sind hervorragende Reagentien zur Aminmodifizierung, da die gebildeten Amidprodukte sehr stabil sind. Diese Reagentien zeigen auch gute Reaktivität mit aliphatischen Aminen und geringe Reaktivität mit den Nukleotid-Aminen von Oligonukleotiden. Beispiele für Aktivester schließen N-Hydroxysuccinimidester, Pentafluorphenylester, Tetrafluorphenylester und p- Nitrophenylester ein. Aktivester sind nützlich, weil sie aus praktisch jedem Molekül hergestellt werden können, das eine Carbonsäure enthält. Verfahren zur Herstellung von Aktivestern sind aufgelistet in Bodansky (Principles of Peptide Chemistry (2. Aufl.), Springer-Verlag, London, 1993).
Zahlreiche kommerzielle Vernetzungsreagentien existieren, die als Linker dienen können (siehe z. B. Pierce Cross-linkers, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Unter diesen sind homobifunktionelle aminreaktive Vernetzungsreagentien, wie beispielhaft homobifunktionelle Imidoester und N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)-Ester. Es gibt auch heterobifunktionelle Vernetzungsreagentien, die zwei oder mehr unterschiedliche reaktive Gruppen besitzen, die sequentielle Reaktionen ermöglichen. Imidoester reagieren schnell mit Aminen bei alkalischem pH. NHS-Ester ergeben stabile Produkte, wenn sie mit primären oder sekundären Aminen umgesetzt werden. Maleimide, Alkyl- und Arylhalogenide, Alpha- Haloacyle und Pyridyldisulfide sind thiolreaktiv. Maleimide sind spezifisch für Thiol(Sulfhydryl)-Gruppen im pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 und können bei alkalischem pH aminreaktiv werden. Die Thioether-Bindung ist unter physiologischen Bedingungen stabil. Alpha-Haloacetyl-Vernetzungsreagentien enthalten die Iodacetylgruppe und sind gegenüber Sulfhydrylen reaktiv. Die Imidazole können mit der Iodacetyleinheit reagieren, aber die Reaktion ist sehr langsam. Pyridyldisulfide reagieren mit Thiolgruppen, um eine Disulfidbindung zu bilden. Carbodiimide koppeln Carboxyle an primäre Amine von Hydraziden, was zur Bildung einer Acyl-Hydrazin-Bindung führt. Die Arylazide sind Photoaffinitätsreagentien, die chemisch inert sind, bis sie UV- oder sichtbarem Licht ausgesetzt werden. Wenn solche Verbindungen bei 250-460 nm photolysiert werden, wird ein reaktives Arylnitren gebildet. Das reaktive Arylnitren ist relativ unspezifisch. Glyoxale sind reaktiv gegenüber dem Guanidinyl-Teil von Arginin.
In einer typischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Markierung zunächst an einen Linker gebunden, anschließend die Kombination von Markierung und Linker an ein MOI gebunden, um die Struktur T-L-MOI zu schaffen. Alternativ wird dieselbe Struktur gebildet, indem zunächst ein Linker an ein MOI gebunden wird und anschließend die Kombination von Linker und MOI an eine Markierung gebunden wird. Ein Beispiel ist, wenn das MOI ein DNA-Primer oder Oligonukleotid ist. In diesem Falle wird die Markierung typischerweise zunächst an einen Linker gebunden, anschließend das T-L an einen DNA- Primer oder ein Nukleotid gebunden, was dann z. B. in einer Sequenzierungsreaktion verwendet wird.
Eine nützliche Form, in der eine Markierung reversibel an ein MOI (z. B. ein Oligonukleotid oder einen DNA-Sequenzierungsprimer) gebunden werden kann, ist durch einen chemisch labilen Linker. Eine bevorzugte Konstruktion für den Linker ermöglicht, daß der Linker gespalten werden kann, wenn er einer flüchtigen organischen Säure ausgesetzt wird, z. B. Trifluoressigsäure (TFA). TFA ist besonders kompatibel mit den meisten Verfahren zur MS- Ionisierung, einschließlich Elektrospray.
Wie im Detail unten beschrieben, liefert die Erfindung eine Methodik für die Genotypisierung. Eine Zusammensetzung, die beim Genotypisierungsverfahren nützlich ist, umfaßt eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel:
Tms-L-MOI
in der Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben wenigstens zwei Verbindungen dieselbe Tms, aber die MOI-Gruppen dieser Moleküle besitzen nicht-identische Nukleotidlängen.
Eine weitere Zusammensetzung, die beim Genotypisierungsverfahren nützlich ist, umfaßt eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel:
Tms-L-MOI
in der Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Sauerstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben wenigstens zwei Verbindungen dieselbe Tms, aber diese Verbindungen haben nicht-identische Elutionszeiten bei Säulenchromatographie.
Eine weitere Zusammensetzung, die beim Genotypisierungsverfahren verwendet werden kann; umfaßt eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel:
Tms-L-MOI
in der Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Sauerstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben keine zwei Verbindungen, die dieselbe MOI- Nukleotidlänge aufweisen, auch dasselbe Tms.
In der obigen Zusammensetzung ist die Mehrzahl vorzugsweise größer als 2 und vorzugsweise größer als 4. Auch hat das Nukleinsäurefragment im MOI eine zu einem Abschnitt eines Vektors komplementäre Sequenz, wobei das Fragment zum Priming einer Polynukleotidsynthese in der Lage ist. Vorzugsweise unterscheiden sich die Tms-Gruppen von Mitgliedern der Mehrzahl um wenigstens 2 amu und können sich um wenigstens 4 amu unterscheiden.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Mehrzahl von Sätzen von Verbindungen umfaßt, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel besitzt:
Tms-L-MOI
in der Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI auch ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben Mitglieder innerhalb eines ersten Satzes von Verbindungen identische Tms-Gruppen, haben jedoch nicht-identische MOI-Gruppen mit unterschiedlichen Anzahlen von Nukleotiden im MOI, und es gibt wenigstens zehn Mitglieder im ersten Satz, wobei zwischen den Sätzen die Tms-Gruppen sich um wenigstens 2 amu unterscheiden. Die Mehrzahl ist vorzugsweise wenigstens 3 und bevorzugter wenigstens 5.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Mehrzahl von Sätzen von Verbindungen umfaßt, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel hat
Tms-L-MOI
in der Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist. In der Zusammensetzung haben die Verbindungen innerhalb eines Satzes dieselbe Elutionszeit, aber nicht-identische Tms-Gruppen.
Zusätzlich stellt die Erfindung einen Kit zum Genotypisieren zur Verfügung. Der Kit umfaßt eine Mehrzahl von Amplifikationsprimerpaaren, wobei wenigstens einer der Primer die Formel hat:
Tms-L-MOI
in der Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod, umfaßt. In der Formel ist L eine organische Gruppe, die es ermöglicht, daß eine Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abgespalten werden kann, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzelnen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure. In der Formel ist MOI ein Nukleinsäurefragment, wobei L an das MOI an einer anderen Stelle als dem 3'-Ende des MOI konjugiert ist; und jedes Primerpaar assoziiert mit einem unterschiedlichen Locus. Im Kit ist die Mehrzahl vorzugsweise wenigstens 3 und bevorzugter wenigstens 5.
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäurefragmente, die komplementär zu einem ausgewählten Nukleinsäuremolekül (z. B. markierte Fragmente) von einem ersten Ende bis zu einem zweiten Ende eines Nukleinsäuremoleküls) sind, wobei eine Markierung mit einem bestimmten oder ausgewählten Nukleotid korrelativ ist und mit irgendeinem aus einer Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge, (c) Abspalten einer Markierung von einem markierten Fragment und (d) Nachweisen der Markierungen und Bestimmen der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls daraus. Jeder der Aspekte wird unten detaillierter diskutiert werden.

B. DIAGNOSEVERFAHREN

1. Einführung

Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung auch eine breite Vielfalt von Verfahren zur Verfügung, in denen die oben beschriebenen Markierungen und/oder Linker anstelle herkömmlicher Markierungen (z. B. radioaktiv oder enzymatisch) eingesetzt werden können, um die Spezifität, Empfindlichkeit oder Anzahl von Proben, die gleichzeitig analysiert werden können, in einem vorgegebenen Verfahren zu erhöhen. Repräsentative Beispiele für solche Verfahren, die verbessert werden können, schließen z. B. RNA-Amplifikation (siehe Lizardi et al., Bio/Technology 6 : 1197-1202, 1988; Kramer et al., Nature 339 : 401-402, 1989; Lomeli et al., Clinical Chem. 35(9) : 1826-1831, 1989; U.S.-Patent Nr. 4,786,600) und DNA- Amplifikation unter Verwendung von LCR oder Polymerasekettenreaktion ("PCR") (siehe U. S. Patente Nrn. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159) ein.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder -fragments (oder zum Nachweisen des Vorhandenseins eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls oder -fragments) zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem oder mehreren ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekülen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Nukleinsäuremolekül korrelativ und mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Abtrennen der markierten Moleküle nach Größe, (c) Abspalten der Markierungen von den markierten Molekülen und (d) Nachweisen der Markierungen mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen der Identität der Nukleinsäuremoleküle daraus.
In einem verwandten Aspekt der Erfindung werden Verfahren zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren markierter Nukleinsäuresonden mit Target-Nukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung einer markierten Nukleinsäuresonde an eine komplementäre ausgewählte Target- Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen, wobei eine markierte Nukleinsäuresonde mit Nicht- Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist, (b) Verändern der Größe hybridisierter markierter Sonden, nicht-hybridisierter Sonden oder Target-Moleküle oder der Sonden:Target-Hybride, (c) Abtrennender markierten Sonden nach Größe, (d) Abspalten der Markierungen von den markierten Sonden und (e) Nachweisen der Markierungen mit Nicht- Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des ausgewählten Nukleinsäuremoleküls daraus. Diese und andere verwandte Techniken werden detaillierter unten diskutiert.

2. PCR

PCR kann eine gewünschte DNA-Sequenz eines beliebigen Ursprungs (Virus, Bakterium, Pflanze oder Mensch) Hunderte von Millionen mal innerhalb einiger Stunden amplifizieren. PCR ist insbesondere wertvoll, weil die Reaktion hochspezifisch, leicht zu automatisieren und zum Amplifizieren kleiner Probenmengen fähig ist. Aus diesen Gründen hat PCR eine große Bedeutung ihr die klinische Medizin, die Diagnose genetischer Erkrankungen, die forensische Wissenschaft und die Evolutionsbiologie gehabt.
Kurz gesagt ist PCR ein Verfahren, das auf einer spezialisierten Polymerase beruht, die einen komplementären Strang zu einem gegebenen DNA-Strang in einer Mischung synthetisieren kann, die die 4 DNA-Basen und 2 DNA-Fragmente (Primer, jeder etwa 20 Basen lang), die die Target-Sequenz flankieren, enthält. Die Mischung wird erhitzt, um die Stränge aus doppelsträngiger DNA, die die Target-Sequenz enthalten, voneinander, und anschließend abgekühlt, um zu ermöglichen, daß (1) die Primer ihre komplementären Sequenzen auf den voneinander getrennten Strängen finden und sich an sie binden, und (2) daß die Polymerase die Primer zu neuen komplementären Strängen verlängert. Wiederholte Zyklen von Erhitzen und Abkühlen multiplizieren die Target-DNA exponentiell, da jeder neue Doppelstrang sich so auftrennt, daß er zwei Matrizen für eine weitere Synthese wird. In etwa 1 Stunde können 20 PCR-Zyklen das Target um ein Millionenfaches amplifizieren.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen des ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der PCR-Technik zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente oder -moleküle während der PCR und Auftrennen der resultierenden Fragmente nach Größe. Der Größenauftrennschritt kann unter Verwendung irgendeiner der hierin beschriebenen Techniken durchgeführt werden, einschließlich z. B. Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC. Die Markierungen werden anschließend von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten und mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen. Beispiele für solche Technologien sind hierin beschrieben worden und schließen z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie ein.

3. RNA-Fingerprinting und Differential Display

Wenn die Matrize RNA ist, ist der erste Schritt beim Fingerprinting reverse Transkription. Liang und Pardee (Science 257 : 967, 1992) waren die ersten, die ein RNA-Fingerprinting- Protokoll beschrieben haben, das einen Primer für reverse Transkription auf der Basis von Oligo(dT) verwendet, aber mit einem "Anker" aus zwei Basen am 5'-Ende (z. B. Oligo-5'- (dT&sub1;&sub1;)CA-3'). Priming tritt hauptsächlich am 5'-Ende des Poly(rA)-Schwanzes auf und hauptsächlich in Sequenzen, die 5'-UpG-poly(rA)-3' enden, mit einer Selektivität, die sich einer aus 12 polyadenylierten RNAs nähert. Nach reverser Transkription und Denaturierung wird willkürliches Priming auf dem resultierenden ersten Strang aus cDNA durchgeführt. PCR kann jetzt verwendet werden, um einen Fingerprint von Produkten zu erzeugen, die am besten mit den Primern zusammenpassen und die vom 3'-Ende der mRNAs und polyadenylierten heterogenen RNAs abgeleitet werden. Dieses Protokoll ist als "Differential Display" bezeichnet worden.
Alternativ kann ein willkürlicher Primer im ersten Schritt der reversen Transkription verwendet werden, wobei diejenigen für die RNA-internen Regionen ausgewählt werden, die 6-8 Basenmatches mit dem 3'-Ende des Primers haben. Dem folgt willkürliches Priming des resultierenden ersten Stranges aus cDNA mit demselben oder einem unterschiedlichen willkürlichen Primer und anschließend PCR. Dieses besondere Protokoll sampled irgendwo in der RNA, einschließlich offene Leserahmen (Welsh et al., Nuc. Acids. Res. 20 : 4965, 1992). Zusätzlich kann es auf RNAs verwendet werden, die nicht polyadenyliert sind, wie etwa viele bakterielle RNAs. Diese Variante von RNA-Fingerprinting durch PCR mit willkürlichem Primer ist RAP-PCR genannt worden.
Wenn Fingerprinting von RNA durch PCR mit willkürlichem Primer auf Proben durchgeführt wird, die aus Zellen, Geweben oder anderem biologischen Material gewonnen sind, die verschiedenen experimentellen Behandlungen unterzogen worden sind oder verschiedene Entwicklungsgeschichten haben, können Unterschiede in der Genexpression zwischen den Proben nachgewiesen werden. Für jede Reaktion wird angenommen, daß dieselbe Anzahl von effektiven PCR-Verdopplungsereignissen auftritt und alle Unterschiede in den anfänglichen Konzentrationen von cDNA-Produkten als ein Verhältnis von Intensitäten im letztendlichen Fingerprint konserviert werden. Es gibt keine sinnvollen Beziehungen zwischen den Intensitäten von Banden innerhalb einer einzigen Spur auf einem Gel, die eine Funktion von Match und Menge sind. Jedoch wird das Verhältnis zwischen Spuren für jede gesamplete RNA konserviert, was ermöglicht, daß differentiell exprimierte RNAs nachgewiesen werden können. Das Verhältnis von Ausgangsmaterialien zwischen Proben wird aufrechterhalten, selbst wenn die Anzahl von Zyklen ausreichend ist, um zu ermöglichen, daß die PCR- Reaktion absättigt. Dies beruht darauf, daß die Anzahl von Verdopplungen, die benötigt wird, um Sättigung zu erreichen, beinahe vollständig durch die invarianten Produkte gesteuert wird, die den Großteil des Fingerprint ausmachen. In dieser Hinsicht ist PCR-Fingerprinting verschieden von herkömmlicher PCR eines einzelnen Produkts, bei der das Verhältnis von Ausgangsmaterialien zwischen Proben nicht konserviert wird, sofern nicht Produkte in der exponentiellen Phase der Amplifikation gesampled werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der Technik des RNA-Fingerprinting zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente. Die Fragmente, die mit PCR oder ähnlichen Amplifikationsschemen erzeugt werden, werden dann anschließend nach Größe getrennt. Der Schritt der Größentrennung kann z. B. jede der hierin beschriebenen Techniken sein, einschließlich z. B. Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC. Die Markierungen werden dann von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen. Repräsentative Beispiele für geeignete Technologien schließen Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie ein. Die relativen Mengen aller gegebenen Nukleinsäurefragmente sind nicht wichtig, aber die Größe der Bande ist informativ, wenn sie mit einer Kontrollprobe in Beziehung gesetzt wird.

4. PCR-Einzelstrangkonformationspolymorphismus auf Fluoreszenz-Basis (PCR-SSCP)

Eine Reihe von Verfahren, zusätzlich zum RFLP-Ansatz, sind für die Analyse von Basensubstitutionspolymorphismen verfügbar. Orita et al. haben einen Weg zur Analyse dieser Polymorphismen auf der Basis von Konformationsunterschieden denaturierter DNA entwickelt. Kurz gesagt wird Restriktionsenzymverdau oder PCR verwendet, um relativ kleine DNA-Fragmente zu erzeugen, die anschließend denaturiert und durch Elektrophorese auf nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen aufgetrennt werden. Konformationsunterschiede in den einzelsträngigen DNA-Fragmenten, die aus Basensubstitutionen resultieren, werden durch Elektrophoresemobilitätsverschiebung nachgewiesen. Basenpaarung innerhalb des Strangs schafft Einzelstrangkonformationen, die hoch sequenzspezifisch und in der Elektrophoresemobilität unterschiedlich sind. Nachweisraten in verschiedenen Studien unter Verwendung von herkömmlichem SSCP reichen jedoch von 35% bis nahezu 100%, wobei die höchsten Nachweisraten am häufigsten mehrere unterschiedliche Bedingungen erfordern. Im Prinzip könnte das Verfahren auch verwendet werden, um Polymorphismen auf der Basis kurzer Insertionen oder Deletionen zu analysieren. Dieses Verfahren ist eines der leistungsfähigsten Tools zur Identifizierung von Punktmutationen und -deletionen in DNA (SSCP-PCR, Dean et al., Cell 61 : 863, 1990).
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der PCR-SSP-Technik zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente. Die mit PCR erzeugten Fragmente werden dann nach Größe getrennt. Vorzugsweise ist der Größentrennschritt nicht-denaturierend, und die Nukleinsäurefragmente werden vor der Trennmethodik denaturiert. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Markierungen werden anschließend von den abgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie).

5. Didesoxy-Fingerprinting (ddE)

Ein weiteres Verfahren ist beschrieben worden (ddF, Sarkar et al., Genomics 13 : 441, 1992), das 100% von Einzelbasenveränderungen im Gen des Humanfaktors IX nachgewiesen hat, wenn getestet in einer retrospektiven und prospektiven Art und Weise. Insgesamt wurden 84 von 84 unterschiedlichen Sequenzveränderungen nachgewiesen, wenn genomische DNA von Patienten mit Haemophilie B analysiert wurde.
Kurz gesagt ist, bei den Anwendungen von Markierungen zum Genotypisieren oder anderen Zwecken, ein Verfahren, das verwendet werden kann, Didesoxy-Fingerprinting. Dieses Verfahren setzt einen Didesoxyterminator in einer Sanger-Sequenzierungsreaktion ein. Das Prinzip des Verfahrens ist wie folgt: Eine Target-Nukleinsäure, die sequenziert werden soll, wird in eine Reaktion gegeben, die einen Didesoxy-Terminator aufweist, der komplementär zu der Base ist, von der bekannt ist, daß sie in der Target-Nukleinsäure mutiert ist. Wenn die Mutation z. B. zu einer A-> G-Änderung führt, würde die Reaktion in einer C-Didesoxy- Terminator-Reaktion durchgeführt werden. PCR-Primer werden verwendet, um die interessierende Targetsequenz zu lokalisieren und zu amplifizieren. Wenn die hypothetische Targetsequenz die A-> G-Änderung enthält, wird die Größe einer Population von Sequenzen aufgrund des Einbaus eines Didesoxy-Terminators in die amplifizierten Sequenzen verändert. In dieser besonderen Anwendung von Markierungen würde ein Fragment erzeugt werden, das eine vorhersagbare Größe im Fall einer Mutation besäße. Die Markierungen wären an das 5'- Ende der PCR-Primer gebunden und würden eine "Karte" für den Probentyp und den Didesoxy-Terminatortyp liefern. Eine PCR-Amplifikationsreaktion würde stattfinden, die resultierenden Fragmente würden nach Größe mit z. B. HPLC oder PAGE getrennt werden. Am Ende des Trennverfahrens werden die DNA-Fragmente in einem temporären Bezugsrahmen gesammelt, die Markierungen werden abgespalten, und das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Mutation wird durch die Kettenlänge aufgrund frühzeitigen Kettenterminators durch den Einbau eines gegebenen Didesoxy-Terminators bestimmt.
Es ist wichtig anzumerken, daß ddF zu einem Gewinn oder Verlust eines Didesoxy- Terminationssegments und/oder einer Verschiebung der Mobilität wenigstens eines der Terminationssegmente oder -produkte führt. Daher wird bei diesem Verfahren eine Suche nach der Verschiebung von einer Fragmentmobilität vor einem hohen Hintergrund an Fragmenten mit anderer relativer Molekülmasse durchgeführt. Ein Vorteil ist die Vorkenntnis der Länge des Fragmentes, die mit einer gegebenen Mutation assoziiert ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines selektierenden Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der ddE-Technik zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugung einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente, gefolgt von der Trennung auf der Grundlage der Größe. Vorzugsweise ist der Größentrennschritt nicht-denaturierend, und die Nukleinsäurefragmente werden vor der Trennmethodik denaturiert. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Die Markierungen werden anschließend von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie).

6. Restriktionskarten und RFLPs

Restriktionsendonukleasen erkennen kurze DNA-Sequenzen und schneiden DNA-Moleküle an diesen spezifischen Stellen. Einige Restriktionsenzyme (Rare-Cutters) schneiden DNA sehr selten, wodurch eine kleine Anzahl sehr großer Fragmente (mehrere tausend bis eine Million bp) erzeugt werden. Die meisten Enzyme schneiden DNA häufiger, wodurch eine große Anzahl kleiner Fragmente (weniger als einhundert bis mehr als eintausend bp) erzeugt wird. Im Mittel werden Restriktionsenzyme mit 4-Basen-Erkennungsstellen Stücke liefern, die 256 Basen lang sind, 6-Basen-Erkennungsstellen werden Stücke liefern, die 4.000 Basen lang sind, und 8-Basen-Erkennungsstellen werden Stücke liefern, die 64.000 Basen lang sind. Da hunderte von verschiedenen Restriktionsenzymen charakterisiert worden sind, kann DNA in viele verschiedene kleine Fragmente geschnitten werden.
Eine breite Vielfalt von Techniken ist für die Analyse von DNA-Polymorphismen entwickelt worden. Das am weitesten verwendete Verfahren, der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFPL)-Ansatz, kombiniert Restriktionsenzymverdau, Gelelektrophorese, Blotting auf eine Membran und Hybridisierung an eine klonierte DNA-Sonde. Polymorphismen werden als Variationen in den Längen der markierten Fragmente auf den Blots nachgewiesen. Der RFLP-Ansatz kann verwendet werden, um Basensubstitutionen zu analysieren, wenn die Sequenzveränderung in eine Restriktionsenzymstelle fällt, oder um Minisatelliten/(VNTRs) durch Auswahl von Restriktionsenzymen zu analysieren, die außerhalb der Wiederholungseinheiten schneiden. Die Agarosegele liefern üblicherweise nicht die notwendige Auflösung, um Minisatellit/VNTR-Allele zu unterscheiden, die sich um eine einzige Wiederholungseinheit unterscheiden, aber viele der Minisatelliten/VNTRs sind so variabel, daß dennoch hochinformative Marker erhalten werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweisen eines selektierenden Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der Technik der Restriktionskartierung oder RFLPs bereitgestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente, wobei die erzeugten Fragmente mit Restriktionsenzymenen verdaut werden. Die markierten Fragmente werden erzeugt, indem ein Hybridisierungsschritt der markierten Sonden mit der verdauten Target-Nukleinsäure durchgeführt wird. Der Hybridisierungsschritt kann vor oder nach dem Restriktionsnukleaseverdau stattfinden. Die resultierenden verdauten Nukleinsäurefragmente werden dann nach Größe getrennt. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese werden dann nach Größe getrennt. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Die Markierungen werden anschließend von den getrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV-Spektrometrie).

7. DNA-Fingerprinting

DNA-Fingerprinting umfaßt das Display eines Satzes von DNA-Fragmenten von einer spezifischen DNA-Probe. Eine Vielzahl von DNA-Fingerprintingtechniken sind gegenwärtig verfügbar (Jeffties et al., Nature 314 : 67, 1985; Welsh und McClelland, Nuc. Acids. Res. 19 : 861, 1991), von denen die meisten PCR verwenden, um Fragmente zu erzeugen. Die Wahl, welche Fingerprintingtechnik verwendet werden soll, hängt ab von der Anwendung (z. B. DNA-Typisierung, DNA-Marker-Kartierung, und den zu untersuchenden Organismen, z. B. Prokaryonten, Pflanzen, Tiere, Menschen). Eine Reihe von Fingerprintingverfahren, die diese Anforderungen erfüllen, sind über die letzten paar Jahre entwickelt worden, einschließlich statistisch amplifizierter polymorpher DNA (RAPD), DNA- Amplifizierungsfingerprinting (DAF) und willkürlich geprimte PCR (AP-PCR). Diese Verfahren beruhen alle auf der Amplifikation zufälliger genomischer DNA-Fragmente durch willkürlich ausgewählte PCR-Primer. DNA-Fragmentmuster können von jeder DNA ohne vorherige Sequenzkenntnis erzeugt werden. Die erzeugten Muster hängen von der Sequenz der PCR-Primer und der Natur der Matrizen-DNA ab. PCR wird bei niedrigen Annealing- Temperaturen durchgeführt, um zu ermöglichen, daß die Primer an mehrere Loci auf der DNA annealen. DNA-Fragmente werden erzeugt, wenn Primerbindungsstellen innerhalb einer Distanz liegen, die Amplifikation ermöglicht. Im Prinzip ist ein einziger Primer für die Erzeugung von Bandenmustern ausreichend.
Nachweis genomischer Restriktionsfragmente mit PCR-Amplifikation und kann für DNAs jeden Ursprungs und jeder Komplexität verwendet werden. Kurz gesagt werden Fingerprints ohne vorherige Sequenzkenntnis unter Verwendung eines begrenzten Satzes generischer Primer hergestellt. Die Anzahl von Fragmenten, die in einer einzigen Reaktion nachgewiesen werden, können durch Selektion spezifischer Primersets "Tunes" sein. Die AFLP-Technik ist robust und verläßlich, weil stringente Reaktionsbedingungen zum Primerannealing verwendet werden: Die Verläßlichkeit der RFLP-Technik ist kombiniert mit der Leistungsfähigkeit der PCR-Technik.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Bestimmen der Identität eines Nukleinsäuremoleküls oder zum Nachweis eines selektierenden Nukleinsäuremoleküls in z. B. einer biologischen Probe unter Verwendung der Technik des DNA-Fingerprintings bereitgestellt. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren allgemein die Schritte: Erzeugen einer Reihe markierter Nukleinsäurefragmente, gefolgt von Trennung der Fragmente nach Größe. Der Größentrennschritt kann z. B. mit Gelelektrophorese (z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese) oder vorzugsweise HPLC durchgeführt werden. Die Markierungen werden dann von den aufgetrennten Fragmenten abgespalten, und anschließend werden die Markierungen mit der entsprechenden Nachweistechnologie nachgewiesen (z. B. Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, potentiostatische Amperometrie oder UV- Spektrometrie).

8. Anwendung spaltbarer Markierungen auf die Genotypisierung und den Polymorphismusnachweis

a. Einführung

Obgleich einige bekannte Human-DNA-Polymorphismen auf Insertionen, Deletionen oder anderen Umordnungen nicht-wiederholter Sequenzen beruhen, beruht die große Mehrzahl auf entweder Einzelbasensubstitutionen oder auf Variationen in der Anzahl von Tandemwiederholungen. Basensubstitutionen sind im menschlichen Genom reichlich vorhanden, wobei sie im Mittel einmal alle 200-500 bp auftreten. Längenvariationen in Blöcken von Tandemwiederholungen sind ebenfalls im Genom üblich, mit wenigstens einigen 10.000 eingestreuten polymorphen Stellen (Loci genannt). Wiederholungslängen für Tandern-Wiederholungs-Polymorphismen reichen von 1 bp in (dA)n(dT)n-Sequenzen bis wenigstens 170 bp in α-Satelliten-DNA. Tandern-Wiederholungs-Polymorphismen können in zwei große Gruppen unterteilt werden, die aus Minisatelliten/variable Anzahl von Tandem- Wiederholungen (VNTRs), mit typischen Wiederholungslängen von einigen zehn Basenpaaren und mit einigen 10.000 Gesamtwiederholungseinheiten, und Mikrosatelliten, mit Wiederholungslängen von bis zu 6 bp und mit maximalen Gesamtlängen von etwa 70 bp, bestehen. Die meisten Mikrosatelliten-Polymorphismen, die bisher identifiziert worden sind, haben auf (dC-dA)n- oder (dG-dT)n-Dinukleotidwiederholungssequenzen beruht. Die Analyse von Mikrosatelliten-Polymorphismen umfaßt die Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) eines kleinen DNA-Fragments, das einen Block von Wiederholungen enthält, gefolgt von Elektrophorese der amplifizierten DNA auf denaturierendem Polyacrylamidgel. Die PCR-Primer sind komplementär zu einzigartigen Sequenzen, die die Wiederholungsblöcke flankieren. Polyacrylamidgele, anstelle von Agarosegelen, werden traditionellerweise für Mikrosatelliten verwendet, weil die Allele sich in der Größe oft nur um eine einzige Wiederholung unterscheiden.
So werden in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem ausgewählten Targetmolekül, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und mit Nicht-Fluoreszenz- Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Moleküle nach Sequenzlänge, (c) Abspalten der Markierung vom markierten Molekül und (d) Nachweisen der Markierung mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.
In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus zur Verfügung gestellt, die die Schritte umfassen: (a) Kombinieren eines markierten Nukleinsäuremoleküls mit einem ausgewählten Targetmolekül unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung des markierten Moleküls an das Targetmolekül zu ermöglichen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und mit Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann, (b) Abtrennen der markierten Fragmente nach Sequenzlänge, (c) Abspalten der Markierung vom markierte Fragment und (d) Nachweisen der Markierung mit Nicht- Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps des Organismus daraus.

b. Anwendung spaltbarer Markierungen auf die Genotypisierung

Ein PCR-Ansatz, um Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFPL) zu identifizieren, kombiniert Gelelektrophorese und den Nachweis von Markierungen, die mit spezifischen PCR-Primern assoziiert sind. Im allgemeinen wird ein PCR-Primer eine spezifische Markierung aufweisen. Die Markierung wird daher einen Satz von PCR-Primem repräsentieren und daher eine vorbestimmte DNA-Fragmentlänge. Polymorphismen werden als Variationen in der Länge der markierten Fragmente in einem Gel oder aus einem Gel eluierend nachgewiesen. Polyacrylamidgelelektrophorese wird üblicherweise die notwendige Auflösung liefern, um Minisatellit/VNTR-Allele zu unterscheiden, die sich um eine einzige Wiederholungseinheit unterscheiden. Die Analyse von Mikrosatellitenpolymorphismen umfaßt die Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) eines kleinen DNA- Fragments, das einen Wiederholungsblock enthält, gefolgt von der Elektrophorese der amplifizierten DNA auf denaturierendem Polyacrylamidgel oder gefolgt von der Trennung von DNA-Fragmenten mit HPLC. Die amplifizierte DNA wird unter Verwendung von Primern markiert werden, die spaltbare Markierungen am 5'-Ende des Primers aufweisen. Die Primer werden in die neu synthetisierten Stränge durch Kettenverlängerung eingebaut. Die PCR-Primer sind komplementär zu einzigartigen Sequenzen, die die Wiederholungsblöcke flankieren. Minisatelliten/VNTR-Polymorphismen können ebenfalls amplifiziert werden, weitgehend so wie bei den oben beschriebenen Mikrosatelliten.
Beschreibungen vieler Arten von DNA-Sequenzpolymorphismen haben die grundlegende Basis für das Verständnis der Struktur des menschlichen Genoms geliefert (Botstein et al., Am. J. Human Genetics 32: S. 314, 1980; Donis-Keller, Cell 51 : 319, 1987; Weissenbach et al., Nature 359 : 794). Die Konstruktion umfangreicher Kopplungskarten-Systeme ist durch die Verwendung dieser DNA-Polymorphismen erleichtert worden und hat ein praktisches Mittel zur Lokalisierung von Krankheitsgenen durch Kopplung geliefert. Mikrosatelliten- Dinukleotidmarker haben sich als sehr leistungsfähige Tools bei der Identifizierung menschlicher Gene erwiesen, bei denen sich gezeigt hat, daß sie Mutationen enthalten und in einigen Fällen Krankheiten verursachen. Genomische Dinukleotidwiederholungen sind hochpolymorph (Weber, 1990, Genomic Analysis, Vol. 1, S. 159-181, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Weber und Wong, 1993, Hum. Mol. Genetics, 2, S. 1123) und können bis zu 24 Allele besitzen. Mikrosatelliten-Dinukleotidwiederholungen können mit PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert werden, die zu den einzigartigen Regionen komplementär sind, die das Dinukleotid umgeben. Im Anschluß an die Amplifikation können mehrere amplifizierte Loci vor einem Größentrennschritt kombiniert (vervielfältigt) werden. Das Verfahren der Anwendung der amplifizierten Mikrosatellitenfragmente auf einen Größentrennschritt und des anschließenden Identifizierens der Größe und daher des Allels ist als Genotypisierung bekannt. Über chromosomenspezifische Marker, die ein hohes Vervielfältigungsniveau erlauben, ist zum Durchführen vollständiger Genomscans für Kopplungsanalyse berichtet worden (Davies et al., 1994, Nature, 371, S. 130).
Markierungen können mit großer Wirkung beim Genotypisieren mit Mikrosatelliten verwendet werden. Kurz gesagt werden die PCR-Primer konstruiert, um Markierungen zu tragen, und in einer sorgfältig ausgewählten PCR-Reaktion verwendet, um Di-, Tri- oder Tetranukleotid-Wiederholungen zu amplifizieren. Die Amplifikationsprodukte werden anschließend nach Größe mit Verfahren, wie etwa HPLC oder PAGE getrennt. Die DNA- Fragmente werden anschließend in einer temporären Art und Weise gesammelt, die Markierungen von ihren entsprechenden DNA-Fragmenten abgespalten und die Länge aus einem Vergleich mit internen Standards im Größentrennschritt abgeleitet. Allel- Identifizierung wird aus der Bezugnahme zur Größe der amplifizierten Produkte durchgeführt.
Beim Ansatz mit spaltbaren Markierungen für die Genotypisierung ist es möglich, mehrere Proben in einem einzigen Trennschritt zu kombinieren. Es gibt zwei allgemeine Wege, auf denen dies durchgeführt werden kann. Das erste allgemeine Verfahren für ein Screening mit hohem Durchsatz ist der Nachweis eines einzelnen Polymorphismus in einer großen Gruppe von Individuen. In diesem Szenario wird ein einzelner oder eingebauter Satz von PCR- Primern verwendet, und jede Amplifikation wird mit einem DNA-Probentyp pro Reaktion durchgeführt. Die Anzahl von Proben, die im Trennschritt kombiniert werden können, ist proportional zur Anzahl spaltbarer Markierungen, die pro Nachweistechnologie erzeugt werden können (d. h. 400-600 für Massenspektrometrie-Markierungen). Es ist daher möglich, 1 bis mehrere Polymorphismen einer großen Gruppe von Individuen gleichzeitig zu identifizieren. Der zweite Ansatz ist, mehrere Sätze von PCR-Primern zu verwenden, die zahlreiche Polymorphismen auf einer einzigen DNA-Probe identifizieren können (ein Individuum z. B. genotypisieren können). Bei diesem Ansatz werden PCR-Primer in einer einzigen Amplifikationsreaktion kombiniert, die PCR-Produkte unterschiedlicher Länge erzeugt. Jedes Primerpaar oder jeder eingebaute Satz ist durch eine spezifische spaltbare Markierung codiert, was impliziert, daß jedes PCR-Fragment mit einer spezifischen Markierung codiert sein wird. Die Reaktion wird in einem einzigen Trennschritt durchgeführt (siehe unten). Die Anzahl von Proben, die im Trennschritt kombiniert werden können, ist proportional zur Anzahl spaltbarer Markierungen, die pro Nachweistechnologie erzeugt werden können (d. h. 400-600 für Massenspektrometer-Markierungen).

c. Enzymatischer Mutationsnachweis und die Anwendungen von Markierungen.

In dieser besonderen Anwendung oder diesem besonderen Verfahren werden Mismatches in Heteroduplizes durch enzymatische Spaltung von Mismatch-Basenpaaren in einem gegebenen Nukleinsäureduplex nachgewiesen. DNA-Sequenzen, die auf das Vorhandensein von einer Mutation getestet werden sollen, werden mit PCR unter Verwendung eines spezifischen Satzes von Primern amplifiziert, die amplifizierten Produkte werden denaturiert und mit denaturierten Bezugsfragmenten vermischt und hybridisiert, was zur Bildung von Heteroduplizes führt. Die Heteroduplizes werden anschließend mit Enzymen behandelt, die den Duplex erkennen und spalten, wenn ein Mismatch vorhanden ist. Solche Enzyme sind Nuklease S1, Mungobohnen-Nuklease, "Resolvasen", T4-Endonuklease IV; etc.. Im wesentlichen kann jedes Enzym verwendet werden, das Mismatches in vitro erkennt und das resultierende Mismatch spaltet. Nach Behandlung mit dem geeigneten Enzym werden die Duplizes nach Größe mit z. B. HPLC oder PAGE getrennt. Die DNA-Fragmente werden temporär gesammelt. Markierungen werden abgespalten und nachgewiesen. Das Vorhandensein einer Mutation wird durch die Verschiebung der Mobilität des Fragmentes relativ zu einem Wildtyp-Bezugsfragment nachgewiesen.

d. Anwendungen von Markierungen auf dem Oligonukleotidligationsassay (OLA).

Oligonukleotidligationsassay, wie er ursprünglich von Landegren et al. (Landegren et al., Science 241 : 487, 1988) beschrieben ist, ist eine nützliche Technik zur Identifizierung von (bekannten) Sequenzen in sehr großen und komplexen Genomen. Das Prinzip der OLA- Reaktion beruht auf der Fähigkeit von Ligase, zwei diagnostische Oligonukleotide kovalent zu verknüpfen, wenn sie benachbart zueinander auf einem gegebenen DNA-Target hybridisieren. Wenn die Sequenzen an der Sondenverbindungsstelle nicht perfekt basengepaart sind, werden die Sonden nicht von der Ligase verknüpft werden. Die Fähigkeit einer thermostabilen Ligase, potentielle Einzelbasenpaarunterschiede zu unterscheiden, wenn sie am 3'-Ende der "stromaufwärtigen" Sonde angeordnet sind, liefert die Möglichkeit zur Einzelbasenpaarauflösung (Barony, PNAS USA 88 : 189, 1991). Bei der Anwendung von Markierungen würden die Markierungen an die Sonde gebunden werden, die an das amplifizierte Produkt ligiert wird. Nach Abschluß der OLR werden die Fragmente auf der Grundlage ihrer Größe getrennt, die Markierungen abgespalten und mit Massenspektrometrie nachgewiesen.

e. Sequenzspezifische Amplifikation

PCR-Primer mit einem 3'-Ende, das entweder zu einer mutanten oder normalen Oligonukleotidsequenz komplementär ist, können verwendet werden, um das eine oder das andere Allel selektiv zu amplifizieren (Newton et al., Nuc. Acids Res., 17, S. 2503; et al., 1989, Genomics, 5, S. 535; Okayama et al., 1989, J. Lab. Clin. Med., 114, S. 105; Sommer et al., 1989, Mayo Clin. Proc., 64, 1361; Wu et al., PNAS USA, 86, S. 2757). Üblicherweise werden die PCR-Produkte nach der Amplifikation mit PAGE sichtbar gemacht, aber das Prinzip sequenzspezifischer Amplifikation kann auf Festphasenformate angewendet werden.

f. Potentielle Anwendung von Markierungen auf einige Assays auf Amplifikationsbasis.

Genotypisierung von Viren: Eine potentielle Anwendung von Markierungen ist die Genotypisierung oder Identifizierung von Viren durch Hybridisierung mit markierten Sonden. F+-RNA-Coliphagen können z. B. nützliche Kandidaten als Indikatoren für Enteroviruskontamination sein. Genotypisierung mit Nukleinsäurehybridisierungsverfahren ist eine verläßliche, schnelle, einfache und preiswerte Alternative zur Serotypisierung (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7 : 1541, 1979). Amplifikationstechniken und Nukleinsäurehybridisierungstechniken sind mit Erfolg verwendet worden, um eine Vielzahl von Mikroorganismen zu klassifizieren, einschließlich E. coli (Feng, Mol. Cell Probes 7 : 151, 1993), Rotavirus (Sethabutr et al., J. Med. Virol. 37 : 192, 1992), Hepatitis-C-Virus (Stuyver et al., J. Gen Virol. 74 : 1093, 1993) und Herpes-simplex-Virus (Matsumoto et al., J. Virol. Methods 40 : 119, 1992).
Prognostische Anwendungen von Mutationsanalyse bei Krebserkrankungen: Genetische Veränderungen sind in einer Vielzahl experimenteller Säuger- und Human-Neoplasmen beschrieben worden und stellen die morphologische Grundlage für die Abfolge morphologischer Veränderungen dar, die bei Karzinogenese beobachtet wird (Vogelstein et al., NEJM 319 : 525, 1988). In den letzten Jahren, mit dem Aufkommen von Molekularbiologietechniken, sind Allelverluste auf bestimmten Chromosomen oder Mutation von Tumorsuppressorgenen sowie Mutationen in mehreren Oncogenen (z. B., c-myc, c-jun und die ras-Familie) die am häufigsten untersuchten Einheiten gewesen. Frühere Arbeiten (Finkelstein et al., Arch Surg. 128 : 526, 1993) haben eine Korrelation zwischen spezifischen Typen von Punktmutationen im K-ras-Oncogen und dem Stadium bei Diagnose bei kolorektalem Karzinom identifiziert. Die Ergebnisse legen nahe, daß Mutationsanalyse wichtige Informationen über Tumoraggressivität liefern könnte, einschließlich dem Muster und der Verteilung von Metastasen. Prognostische Werte von TP53- und K-ras-2- Mutationsanalyse bei Stufe III-Karzinomen des Colons ist vor kurzem nachgewiesen worden (Pricolo et al., Am. J. Surg. 171 : 41, 1996). Es ist daher offensichtlich, daß die Genotypisierung von Tumoren und präkanzeröser Zellen und spezifischer Mutationsnachweis bei Behandlung von Krebserkrankungen bei Menschen zunehmend wichtig werden wird:

C. TRENNUNG VON NUKLEINSÄUREFRAGMENTEN

Eine Probe, die eine Analyse erfordert, ist oft eine Mischung aus vielen Komponenten in einer komplexen Matrix. Für Proben, die unbekannte Verbindungen enthalten, müssen die Komponenten voneinander getrennt werden, so daß jede einzelne Komponente mit anderen analytischen Verfahren identifiziert werden kann. Die Trenneigenschaften der Komponenten in einer Mischung sind unter konstanten Bedingungen konstant, und wenn sie daher erst einmal bestimmt sind, können sie verwendet werden, um jede der Komponenten zu identifizieren und zu quantifizieren. Solche Verfahren sind typisch bei chromatographischen oder elektrophoretischen analytischen Trennungen.

1. Hochleistungsflüssigkeitschromatrographie (HPLC)

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine chromatographische Trenntechnik, um Verbindungen zu trennen, die in Lösung gelöst sind. HPLC-Instrumente bestehen aus einem Reservoir aus mobiler Phase, einer Pumpe, einem Injektor, einer Trennsäule und einem Detektor. Verbindungen werden durch Injizieren eines aliquoten Teils der Probenmischung auf die Säule getrennt. Die unterschiedlichen Verbindungen gehen aufgrund der Unterschiede in ihrem Verteilungsverhalten zwischen der mobilen flüssigen Phase und der stationären Phase mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule hindurch.
Vor kurzem ist gezeigt worden, daß IP-RO-HPLC auf nicht-porösen PS/DVB-Teilchen mit chemisch gebundenen Alkylketten schnelle Alternativen zu Kapillarelektrophorese bei der Analyse von sowohl einzel- als auch doppelsträngigen Nukleinsäuren ist, die ähnliche Auflösungsgrade liefert (Huber et al., Anal. Biochem. 212 : 351, 1993; Huber et al., 1993, Nuc. Acids Res. 21 : 1061; Huber et al. Biotechniques 16 : 898, 1993). Im Gegensatz zu Ionenaustauschchromatographie, die nicht immer doppelsträngige DNA als eine Funktion der Stranglänge zurückhält (da AT-Basenpaare mit der positiv geladenen stationären Phase stärker als GC-Basenpaare wechselwirken), ermöglicht IP-RP-HPLC eine streng größenabhängige Trennung.
Ein Verfahren unter Verwendung von 100 mM Triethylammoniumacetat als Ionenpaarungsreagens ist entwickelt worden, Phosphodiester-Oligonukleotide konnten mit Erfolg auf alkylierten nicht-porösen 2,3 uM Poly(styrol-divinylbenzol)-Teilchen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie getrennt werden (Oefner et al., Anal. Biochem. 223 : 39, 1994). Die beschriebene Technik ermöglichte die Trennung von PCR-Produkten, die sich nur 4 bis 8 Basenpaare in der Länge unterscheiden, in einem Größenbereich von 50 bis 200 Nukleotiden.

2. Elektrophorese

Elektrophorese ist eine Trenntechnik, die auf der Mobilität von Ionen (oder DNA, wie dies der hierin beschriebene Fall ist) in einem elektrischen Feld beruht. Negativ geladene DNA wandert zu einer positiven Elektrode und positiv geladene Ionen wandern zu einer negativen Elektrode. Aus Sicherheitsgründen ist üblicherweise eine Elektrode geerdet und die andere positiv oder negativ vorgespannt. Geladene Spezies haben unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten in Abhängigkeit von ihrer Gesamtladung, Größe und Gestalt und können daher getrennt werden. Ein Elektrodenapparat besteht aus einer Hochspannungs- Stromquelle, Elektroden, Puffer und einem Träger für den Puffer, wie etwa Polyacrylamidgel, oder eine Kapillarröhre. Offene Kapillarröhren werden für viele Arten von Proben verwendet und die anderen Gelträger werden üblicherweise für biologische Proben verwendet, wie etwa Proteinmischungen oder DNA-Fragmente.

3. Kapillarelektrophorese (CE)

Kapillarelektrophorese (CE) in ihren verschiedenen Manifestationen (freie Lösung, Isotachophorese, isoelektrische Fokussierung, Polyacrylamidgel, mizelläre elektrokinetische "Chromatographie") entwickelt sich als ein Verfahren für schnelle Hochauflösungstrennungen sehr kleiner Probenvolumina komplexer Mischungen. In Kombination mit der inhärenten Empfindlichkeit und Selektivität von MS ist CE-MS eine potentielle leistungsfähige Technik für die Bioanalyse. In der hierin offenbarten neuartigen Anwendung wird das Zusammenspiel dieser zwei Verfahren zu überlegenen DNA-Sequenzierungsverfahren führen, die die Sequenzierungsverfahren mit der augenblicklichen Geschwindigkeit um mehrere Größenordnungen übertreffen.
Die Beziehung zwischen CE und Durchflüssen bei Elektrosprayionisierung (ESI) und die Tatsache, daß beide durch Ionenspezies in Lösung erleichtert werden (und primär dafür verwendet werden), liefert die Grundlage für eine extrem attraktive Kombination. Die Kombination von sowohl Kapillarzonenelektrophorese (CZE) und Kapillarisotachophorese mit Quadrupol-Massenspektrometern auf der Basis von ESI ist beschrieben worden (Olivares et al., Anal. Chem. 59 : 1230, 1987; Smith et al., Anal. Chem. 60 : 436, 1988; Loo et al., Anal. Chem. 179 : 404, 1989; Edmonds et al., J. Chroma. 474 : 21, 1989; Loo et al., J. Microcolumn Sep. 1 : 223, 1989; Lee et al., J. Chromatog. 458 : 313, 1988; Smith et al., J. Chromatog. 480 : 211, 1989; Grese et al., J. Am. Chem. Soc. 111 : 2835, 1989). Kleine Peptide sind einer CZE-Analyse mit guter Empfindlichkeit (im Femtomol-Bereich) leicht zugänglich.
Das leistungsfähigste Trennverfahren für DNA-Fragmente ist Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), im allgemeinen in einem Slabgel-Format. Die wesentliche Beschränkung der gegenwärtigen Technologie ist jedoch die relativ lange Zeit, die erforderlich ist, um die Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten, die in den Sequenzierungsreaktionen hergestellt werden, durchzuführen. Eine Erhöhung der Größenordnung (10-fach) kann mit der Verwendung von Kapillarelektrophorese erreicht werden, die ultradünne Gele einsetzt. In freier Lösung wandert, in einer ersten Annäherung, die gesamte DNA mit derselben Mobilität, da die Zugabe einer Base zur Kompensation von Masse und Ladung führt. In Polyacrylamidgelen sieben und wandern DNA-Fragmente als eine Funktion der Länge, und dieser Ansatz ist nunmehr auf CE angewendet worden. Bemerkenswerte Bodenzahlen pro Meter sind jetzt mit quervernetztem Polyacrylamid erreicht worden (10&spplus;&sup7; Böden pro Meter, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85 : 9660, 1988). Solche CE-Säulen, wie beschrieben, können zur DNA-Sequenzierung eingesetzt werden. Das CE-Verfahren ist im Prinzip 25-mal schneller als Slabgel-Elektrophorese in einem Standard- Sequenzer. Zum Beispiel können etwa 300 Basen pro Stunde gelesen werden. Die Trennungsgeschwindigkeit ist bei Slabgel-Elektrophorese durch die Größenordnung des elektrischen Feldes beschränkt, das ohne übermäßige Wärmeproduktion an das Gel angelegt werden kann. Daher wird die größere Geschwindigkeit von CE durch die Verwendung höherer Feldstärken erreicht (300 V/cm bei CE gegenüber 10 V/cm bei Slabgel- Elektrophorese). Das Kapillarformat verringert den Stromfluß und damit die Leistung und die resultierende Wärmeerzeugung.
Smith und andere (Smith et al., Nuc. Acids Res. 18 : 4417, 1990) haben den Einsatz mehrerer Kapillaren in Parallelschaltung vorgeschlagen, um den Durchsatz zu erhöhen. In ähnlicher Weise haben Mathies und Huang (Mathies und Huang, Nature 359 : 167, 1992) Kapillarelektrophorese eingeführt, bei der Trennungen auf einer Parallelanordnung von Kapillaren durchgeführt werden, und zeigten Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Huang et al., Anal. Chem. 64 : 967, 1992, Huang et al., Anal. Chem. 64 : 2149, 1992). Der wichtigste Nachteil von Kapillarelektrophorese ist die begrenzte Probenmenge, die auf die Kapillare geladen werden kann. Durch Konzentration einer großen Probenmenge am Beginn der Kapillare, vor der Trennung, wird die Beladbarkeit erhöht, und Nachweisgrenzen können um mehrere Größenordnungen gesenkt werden. Das populärste Verfahren zur Vorkonzentration bei CE ist Probenstapelung. Probenstapelung ist vor kurzem in einer Übersicht dargestellt worden (Chien und Burgi, Anal. Chem. 64 : 489A, 1992). Probenstapelung hängt ab von dem Matrixunterschied (pH, Ionenstärke) zwischen dem Probenpuffer und dem Kapillarpuffer, so daß das elektrische Feld über die Probenzone stärker ist als in der Kapillarregion. Bei Probenstapelung wird ein großes Probenvolumen in einem Puffer mit geringer Konzentration zur Vorkonzentrierung am Kopf der Kapillarsäule eingeführt. Die Kapillare wird mit einem Puffer derselben Zusammensetzung gefüllt, aber mit höherer Konzentration. Wenn die Proben-Ionen den Kapillarpuffer und das niedrigere elektrische Feld erreichen, stapeln sie sich in eine konzentrierte Zone hinein. Probenstapelung hat die Nachweisbarkeiten um 1-3 Größenordnungen erhöht.
Ein weiteres Verfahren zur Vorkonzentration ist die Anwendung von Isotachophorese (ITP) vor der Freizonen-CE-Trennung von Analyten. ITP ist eine Elektrophoresetechnik, die es ermöglicht, daß Mikroliter-Probenvolumina auf die Kapillare geladen werden können, im Gegensatz zu den Injektionsvolumina von wenigen nl, die typischerweise mit CE assoziiert sind. Die Technik beruht auf der Einführung der Probe zwischen zwei Puffern (Leading- und Trailing-Elektrolyten) mit höherer bzw. niedrigerer Mobilität als der Analyt. Die Technik ist inhärent eine Konzentrationstechnik, bei der die Analyten sich in reine Zonen hineinkonzentrieren, die mit derselben Geschwindigkeit wandern. Die Technik ist gegenwärtig weniger populär als die Stapelverfahren, die oben beschrieben sind, wegen des Bedarfs mehrerer Wahlmöglichkeiten von Leading- und Trailing-Elektrolyten und der Fähigkeit, nur kationische oder anionische Spezies während eines Trennverfahrens zu trennen.
Das Herz des DNA-Sequenzierungsverfahrens ist die bemerkenswert selektive elektrophoretische Trennung von DNA- oder Oligonukleotid-Fragmenten. Sie ist bemerkenswert, weil jedes Fragment aufgelöst wird und sich nur um Nukleotide unterscheidet. Trennungen von bis zu 1.000 Fragmenten (1.000 bp) sind erzielt worden. Ein weiterer Vorteil der Sequenzierung mit spaltbaren Markierungen ist wie folgt. Es gibt kein Erfordernis, ein Slabgel-Format zu verwenden, wenn DNA-Fragmente mit Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt werden, wenn spaltbare Markierungen eingesetzt werden. Da zahlreiche Proben kombiniert werden (4 bis 2.000), besteht keine Notwendigkeit, Proben parallel laufen zu lassen, wie dies der Fall bei gegenwärtigen Farbstoff-Primer- oder Farbstoff-Terminator-Verfahren ist (d. h. ABI373-Sequenzer). Da es keinen Grund gibt, Parallelspuren laufen zu lassen, gibt es keinen Grund, ein Slabgel zu verwenden. Daher kann man ein Röhrengel-Format für das Elektrophoresetrennverfahren einsetzen. Grossman (Grossman et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9 : 9, 1992) hat gezeigt, daß ein beträchtlicher Vorteil gewonnen wird, wenn ein Röhrengel-Format anstelle eines Slabgel-Formats verwendet wird. Dies beruht auf der größeren Fähigkeit, Joule-Wärme in einem Röhrenformat abzuleiten, verglichen mit einem Slabgel, was zu schnelleren Laufzeiten führt (um 50%) und viel höherer Auflösung von DNA-Fragmenten mit hoher relativer Molekülmasse (mehr als 1.000 nt). Lange Ablesungen sind bei genomischer Sequenzierung entscheidend. Daher hat die Verwendung spaltbarer Markierungen beim Sequenzieren den zusätzlichen Vorteil, daß sie dem Benutzer erlaubt, das effizienteste und empfindlichste DNA-Trennverfahren einzusetzen, das auch die höchste Auflösung besitzt.

4. Mikrosysteme

Kapillarelektrophorese (CE) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur DNA-Sequenzierung, forensischen Analysen, PCR-Produktanalyse und Restriktionsfragmentgrößenbestimmung. CE ist weit schneller als traditionelle Slab-PAGE, da bei Kapillargelen ein weit höheres Spannungsfeld angelegt werden kann. CE hat jedoch den Nachteil, daß es die Verarbeitung von nur einer Probe pro Gel erlaubt. Das Verfahren kombiniert die schnelleren Trennzeiten von CE mit der Fähigkeit, mehrere Proben parallel zu analysieren. Das zugrundeliegende Konzept hinter der Verwendung von Mikrosystemen ist die Fähigkeit, die Informationsdichte in der Elektrophorese durch Miniaturisierung der Spurabmessung auf etwa 100 Mikrometer zu erhöhen. Die Elektronikindustrie verwendet routinemäßig Mikrotechnologie, um Schaltungen mit Merkmalen von weniger als 1 Mikron in der Größe herzustellen. Die gegenwärtige Dichte von Kapillaranordnungen ist beschränkt durch den Außendurchmesser der Kapillarröhre. Mikrotechnologisch hergestellte Kanäle erzeugen eine höhere Dichte von Anordnungen. Mikrotechnologie ermöglicht auch physikalische Baugruppen, die mit Glasfasern nicht möglich sind, und verbindet die Kanäle direkt mit anderen Vorrichtungen auf einem Chip. Mehrere Vorrichtungen sind auf Mikrochips für Trenntechnologien konstruiert worden. Ein Gaschromatograph (Terry et al., IEEE Trans. Electron Device, ED-26 : 1880, 1979) und ein Flüssigkeitschromatograph (Manz et al., Sens. Actuators B1 : 249, 1990) sind auf Siliciumchips hergestellt worden, aber diese Vorrichtungen sind nicht in breitem Umfang eingesetzt worden. Mehrere Gruppen haben über die Trennung von Fluoreszenzfarbstoffen und Aminosäuren auf mikrotechnologisch hergestellten Vorrichtungen berichtet (Manz et al., J. Chromatography 593 : 253, 1992, Effenhauser et al., Anal. Chem. 65 : 2637, 1993). Vor kurzem haben Woolley und Mathies (Woolley und Mathies, Proc. Natl. Acad. Sci. 91 : 11348, 1994) gezeigt, daß Photolithographie und chemisches Ätzen verwendet werden können, um eine große Anzahl von Trennkanälen auf Glassubstraten herzustellen. Die Kanäle werden mit Hydroxyethylcellulose(HEC)trennmatrizes gefüllt. Es wurde gezeigt, daß DNA- Restriktionsfragmente in so wenig wie zwei Minuten getrennt werden konnten.

D. ABSPALTUNG VON MARKIERUNGEN

Wie oben beschrieben, werden unterschiedliche Linkerkonstruktionen Spaltbarkeit ("Labilität") unter unterschiedlichen spezifischen physikalischen oder chemischen Bedingungen verleihen. Beispiele für Bedingungen, die dazu dienen, verschiedene Linkerkonstruktionen zu spalten, schließen saure, basische, Oxidations-, Reduktions-, Fluorid-, Thiolaustausch-, Photolyse- und enzymatische Bedingungen ein.
Beispiele für spaltbare Linker, die die allgemeinen Kriterien für Linker, die oben aufgelistet sind, erfüllen, werden den Fachleuten gut bekannt sein und schließen diejenigen ein, die im von Pierce (Rockford, IL) erhältlichen Katalog zu finden sind. Beispiele schließen ein:
- Ethylenglycobis(succinimidylsuccinat) (EGS), ein aminreaktives Vernetzungsreagens, das mit Hydroxylamin spaltbar ist (1 M bei 37ºC für 3-6 Stunden);
- Disuccinimidyltartrat (DST) und Sulfo-DST, die aminreaktive Vernetzungsreagentien sind, spaltbar mit 0,015 M Natriumperiodat;
- Bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES) und Sulfo- BSOCOES, die aminreaktive Vernetzungsmittel sind, spaltbar durch Base (pH 11,6);
- 1,4-Di[3'-(2'-pyridyldithio(propionamido))butan (DPDPB), ein Pyridyldithiol- Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-[4-(p-Azidosalicylamido)-butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid (APDP), ein Pyridyldithiol-Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Bis-[beta-4-(azidosalicylamido)ethyl]-disulfid, ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat (SADP), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAED), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist;
- Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAND), ein photoreaktiver Vernetzer, der durch Thiolaustausch oder Reduktion spaltbar ist.
Andere Beispiele für spaltbare Linker und die Spaltungsbedingungen, die verwendet werden können, um Markierungen freizusetzen, sind wie folgt. Eine Silyl-Verknüpfungsgruppe kann durch Fluorid oder unter sauren Bedingungen gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6- substituierte 2-Nitrobenzyloxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4-Nitrobenzyloxy- Verknüpfungsgruppe kann durch eine Photonenquelle (Photolyse) gespalten werden. Eine 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Alkoxyphenoxy- oder 2-, 3-, 5- oder 6-substituierte 4- Alkoxyphenoxy-Verknüpfungsgruppe kann durch Ce(NH&sub4;)&sub2;(NO&sub3;)&sub6; (Oxidation) gespalten werden. Ein NCO&sub2;(Urethan)-Linker kann durch Hydroxid (Base), Säure oder LiAlH&sub4; (Reduktion) gespalten werden. Eine 3-Pentenyl-, 2-Butenyl- oder 1-Butenyl- Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub3;, OsO&sub4;/IO&sub4;&supmin; oder KmnO&sub4; (Oxidation) gespalten werden. Eine 2-[3-, 4- oder 5-substituierte Furyl]oxy-Verknüpfungsgruppe kann durch O&sub2;, Br&sub2;, MeOH oder Säure gespalten werden.
Bedingungen für die Spaltung weiterer labiler Verknüpfungsgruppen schließen ein: tert.- Alkyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Säure gespalten werden; Methyl(dialkyl)methoxy- oder 4-substituierte 2-Alkyl-1,3-dioxan-2-yl-Verknüpfungsgruppen können durch H&sub3;O&spplus; gespalten werden; 2-Silylethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Fluorid oder durch Säure gespalten werden; 2-(X)-Ethoxy (wobei X = Keto, Esteramid, Cyano, NO&sub2;, Sulfid, Sulfoxid, Sulfon ist)-Verknüpfungsgruppen können unter alkalischen Bedingungen gespalten werden; 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte Benzyloxy- Verknüpfungsgruppen können durch Säure oder unter reduktiven Bedingungen gespalten werden; 2-Butenyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch (Ph&sub3;P)&sub3;RhCl(H) gespalten werden; 3-, 4-, 5- oder 6-substituierte 2-Bromphenoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Li, Mg oder BuLi gespalten werden; Methylthiomethoxy-Verknüpfungsgruppen können durch Hg²&spplus; gespalten werden; 2-(X)-Ethyloxy(wobei X = ein Halogen)-Verknüpfungsgruppen können durch Zn oder Mg gespalten werden; 2-Hydroxyethyloxy-Verknüpfungsgruppen können durch Oxidation (z. B. mit Pb(OAc)&sub4;) gespalten werden.
Bevorzugte Linker sind diejenigen, die durch Säure oder Photolyse gespalten werden. Mehrere der säurelabilen Linker, die für Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden sind, sind zur Verknüpfung von Markierungen mit MOIs nützlich. Einige dieser Linker sind bei einem kürzlich erschienenen Überblick von Lloyd-Williams et al. beschrieben (Tetrahedron 49 : 11065-11133, 1993). Ein nützlicher Linker-Typ beruht auf p-Alkoxybenzylalkoholen, von denen zwei, 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure und 4-(4-Hydroxymethyl-3- methoxyphenoxy)buttersäure, von Advanced ChemTech (Louisville, KY) kommerziell erhältlich sind. Beide Linker können über eine Esterbindung mit dem Benzylalkohol an eine Markierung gebunden werden und über eine Amidbindung mit der Carbonsäure an ein aminhaltiges MOI. Markierungen, die durch diese Moleküle gebunden sind, werden vom MOI mit variierenden Konzentrationen in Trifluoressigsäure freigesetzt. Die Spaltung dieser Linker führt zur Freisetzung einer Carbonsäure auf der Markierung. Säurespaltung von Markierungen, die durch verwandte Linker gebunden sind, wie etwa 2-Dimethoxy-4'- (carboxymethyloxy)-benzhydrylamin (erhältlich von Advanced ChemTech in FMOC- geschützter Form), führt zur Freisetzung eines Carbonsäureamids auf der freigesetzten Markierung.
Die photolabilen Linker, die für diese Anwendung nützlich sind, sind ebenfalls größtenteils für die Festphasen-Peptidsynthese entwickelt worden (siehe Übersicht von Lloyd-Williams). Diese Linker beruhen üblicherweise auf 2-Nitrobenzylestern oder 2-Nitrobenzylamiden. Zwei Beispiele für photolabile Linker, über die vor kurzem in der Literatur berichtet worden ist, sind 4-(4-(1-FMOC-Amino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (Holmes und Jones, J. Org. Chem. 60 : 2318-2319, 1995) und 3-(FMOC-Amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al., Molecular Diversity 1 : 4-12, 1995). Beide Linker können über die Carbonsäure an ein Amin auf dem MOI gebunden werden. Die Bindung der Markierung an den Linker erfolgt durch Bildung eines Amids zwischen einer Carbonsäure auf der Markierung und dem Amin auf dem Linker. Die Spaltung photolabiler Linker erfolgt üblicherweise mit UV-Licht mit 350 nm Wellenlänge bei Intensitäten und Zeiträumen, die den Fachleuten bekannt sind. Die Spaltung der Linker führt zu einer Freisetzung eines primären Amids auf der Markierung. Beispiele für photospaltbare Linker schließen Nitrophenylglycinester, exo- und endo-2- benzonorborneylchloride und Methansulfonate und 3-Amino-3(2-nitrophenyl)propionsäure ein. Beispiele für enzymatische Spaltung schließen Esterasen, die Esterbindungen spalten werden, Nukleasen, die Phosphodiester spalten werden, Proteasen, die Peptidbindungen spalten werden, etc. ein.

E. NACHWEIS VON MARKIERUNGEN

Nachweisverfahren beruhen typischerweise auf der Absorption und Emission in bestimmten Spektraltypen. Wenn Atome oder Moleküle Licht absorbieren, regt die einstrahlende Energie eine quantisierte Struktur in ein höheres Energieniveau an. Der Anregungstyp hängt von der Wellenlänge des Lichtes ab. Elektronen werden durch ultraviolettes oder sichtbares Licht auf höhere Orbitale angehoben, Molekülvibrationen werden durch Infrarotlicht angeregt und Rotationen werden durch Mikrowellen angeregt. Ein Absorptionsspektrum ist die Lichtabsorption als eine Funktion der Wellenlänge. Das Spektrum eines Atoms oder Moleküls hängt von seiner Energieniveaustruktur ab. Absorptionsspektren sind nützlich für die Identifizierung von Verbindungen. Spezifische absorptionsspektroskopische Verfahren schließen Atomabsorptionsspektroskopie (AA), Infrarotspektroskopie (IR) und UV-vis- Spektroskopie (UV-vis) ein.
Atome oder Moleküle, die auf hohe Energieniveaus angeregt werden, können durch Abgabe von Strahlung auf niedrigere Niveaus absteigen. Diese Lichtemission wird Fluoreszenz genannt, wenn der Übergang zwischen Zuständen mit demselben Spin erfolgt, und Phosphoreszenz, wenn der Übergang zwischen Zuständen mit unterschiedlichem Spin auftritt. Die Emissionsintensität des Analyten ist linear proportional zur Konzentration (bei niedrigen Konzentrationen) und ist nützlich zur Quantifizierung der emittierenden Spezies. Spezifische emissionsspektroskopische Verfahren schließen Atomemissionsspektroskopie (AES), Atomfluoreszenzspektroskopie (AFS), molekulare laserinduzierte Fluoreszenz (LIF) und Röntgenfluoreszenz (XRF) ein.
Wenn elektromagnetische Strahlung durch die Materie hindurchgeht, setzt der größte Teil der Strahlung seinen Weg in seiner ursprünglichen Richtung fort, ein kleinerer Teil wird aber in andere Richtungen gestreut. Licht, das mit derselben Wellenlänge wie das einstrahlende Licht gestreut wird, wird Rayleigh-Streuung genannt. Licht, das in durchsichtigen Feststoffen aufgrund von Vibrationen (Phononen) gestreut wird, wird Brillouin-Streuung genannt. Brillouin-Streuung ist typischerweise um 0,1 bis 1 Wellenzahl vom einstrahlenden Licht verschoben. Licht, das aufgrund von Vibrationen in Molekülen oder optischen Phononen in undurchsichtigen Feststoffen gestreut wird, wird Raman-Streuung genannt. Raman-gestreutes Licht wird um so viel wie 4.000 Wellenzahlen vom einstrahlenden Licht verschoben. Spezifische streuungsspektroskopische Verfahren schließen Raman-Spektroskopie ein.
IR-Spektroskopie ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Licht im mittleren Infrarotbereich durch eine Probe. Licht im mittleren Infrarotbereich (2,5-50 um, 4.000-200 cm&supmin;¹) ist energetisch ausreichend, um Molekülvibrationen auf höhere Energieniveaus anzuregen. Die Wellenlänge der IR-Absorptionsbanden ist charakteristisch für spezifische Typen von chemischen Bindungen und IR-Spektroskopie ist im allgemeinen am nützlichsten zur Identifizierung organischer und metallorganischer Moleküle.
Absorptionsspektroskopie im nahen Infrarotbereich (MR) ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Licht im nahen Infrarotbereich durch eine Probe. Licht im nahen Infrarotbereich überspannt den Bereich 800 nm bis 2,5 um (12.500 bis 4.000 cm&supmin;¹) und ist energetisch ausreichend, um Obertöne und Kombinationen von Molekülvibrationen auf höhere Energieniveaus anzuregen. NIR-Spektroskopie wird typischerweise zur quantitativen Messung organischer funktioneller Gruppen verwendet, insbesondere O-H, N-H und C=O. Die Komponenten und die Konstruktion der NIR-Instrumentierung sind ähnlich zu UV-vis- Absorptionsspektrometern. Die Lichtquelle ist üblicherweise eine Wolframlampe und der Detektor ist üblicherweise ein PbS-Festkörperdetektor. Probenhalter können Quarz oder Glas sein und typische Lösungsmittel sind CCl&sub4; und CS&sub2;. Die bequeme Instrumentierung der NIR- Spektroskopie macht sie für on-line-Überwachung und Prozeßkontrolle geeignet.
Absorptionsspektroskopie im ultravioletten und sichtbaren Bereich (UV-vis) ist die Messung der Wellenlänge und Intensität der Absorption von Licht im nahen ultravioletten und sichtbaren Bereich durch eine Probe. Die Absorption im Vakuum-UV tritt bei 100-200 nm (10&sup5;-50.000 cm&supmin;¹), Quarz-UV bei 200-350 nm (50.000-28.570 cm&supmin;¹) und im Sichtbaren bei 350-800 nm (28.570-12.500 cm&supmin;¹) auf und wird von dem Beer-Lambert-Bouguet-Gesetz beschrieben. Ultraviolettes und sichtbares Licht sind energetisch ausreichend, um äußere Elektronen in höhere Energieniveaus zu heben. UV-vis-Spektroskopie kann üblicherweise auf Moleküle und anorganische Ionen oder Komplexe in Lösung angewendet werden. Die UV- vis-Spektren sind durch die breiten Merkmale der Spektren begrenzt. Die Lichtquelle ist üblicherweise eine Wasserstoff oder Deuteriumlampe für UV-Messungen und eine Wolframlampe für Messungen im Sichtbaren. Die Wellenlängen dieser kontinuierlichen Lichtquellen werden mit einem Wellenlängenseparator ausgewählt, wie etwa einem Prisma oder Gittermonochromator. Spektren werden durch Abtasten des Wellenlängenseparators erhalten und quantitative Messungen können aus einem Spektrum oder bei einer einzigen Wellenlänge durchgeführt werden.
Massenspektrometer nutzen den Unterschied im Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) ionisierter Atome oder Moleküle, um sie voneinander zu trennen. Massenspektrometrie ist daher nützlich zur Quantifizierung von Atomen oder Molekülen und auch zur Bestimmung chemischer und struktureller Informationen über Moleküle. Moleküle haben deutliche Fragmentierungsmuster, die Strukturinformation liefern, um Verbindungen zu identifizieren. Die allgemeinen Betriebsweisen eines Massenspektrometers sind wie folgt. Gasphasen-Ionen werden erzeugt, die Ionen werden in Raum oder Zeit auf der Grundlage ihres Masse/Ladungs- Verhältnisses getrennt und die Menge an Ionen jeden Masse/Ladungs-Verhältnisses wird gemessen. Die Ionentrennkraft eines Massenspektrometers wird durch die Auflösung beschrieben, die definiert ist als R = m / delta m, wobei m die Ionenmasse und delta m der Unterschied in der Masse zwischen zwei auflösbaren Peaks in einem Massenspektrum ist. Ein Massenspektrometer mit einer Auflösung von 1.000 kann z. B. ein Ion mit einem m/z von 100,0 von einem Ion mit einem m/z von 100,1 auflösen.
Im allgemeinen besteht ein Massenspektrometer (MS) aus einer Ionenquelle, einem masseselektiven Analysator und einem Ionendetektor. Die Magnetsektor-, Quadrupol- und Flugzeit-Konstruktionen erfordern auch Extraktions- und Beschleunigungs-Ionenoptiken, um Ionen aus dem Quellenbereich in den Masseanalysatorbereich zu überführen. Die Details mehrerer Masseanalysatorkonstruktionen (für Magnetsektor-MS, Quadrupol-MS oder Flugzeit-MS) sind unten diskutiert. Einzelfokussierungs-Analysatoren für Magnetsektor-MS nutzen einen Teilchenstrahlweg von 180, 90 oder 60 Grad. Die verschiedenen Kräfte, die das Teilchen beeinflussen, trennen Ionen mit unterschiedlichen Masse/Ladungs-Verhältnissen. Bei Doppelfokussierungsanalysatoren wird ein elektrostatischer Analysator in diesem Instrumententyp hinzugefügt, um Teilchen mit Unterschieden in den kinetischen Energien zu trennen.
Ein Quadrupol-Massenfilter für Quadrupol-MS besteht aus vier Metallstäben, die parallel angeordnet sind. Die angelegten Spannungen beeinflussen die Bahn von Ionen, die sich entlang des Flugweges bewegen, der zwischen den vier Stäben zentriert ist. Für gegebene Gleich- und Wechselspannungen gehen nur Ionen eines bestimmten Masse/Ladungs- Verhältnisses durch den Quadrupolfilter hindurch und alle anderen Ionen werden aus ihrem ursprünglichen Weg geworfen. Ein Massenspektrum wird durch Überwachen der Ionen erhalten, die durch den Quadrupolfilter hindurchgehen, wenn die Spannungen an den Stäben variiert werden.
Ein Flugzeit-Massenspektrometer nutzt die Unterschiede in der Durchgangszeit durch eine "Driftregion", um Ionen unterschiedlicher Massen zu trennen. Er arbeitet in einem Pulsmodus, so daß Ionen in Pulsen erzeugt und/oder in Pulsen extrahiert werden müssen. Ein gepulstes elektrisches Feld beschleunigt alle Ionen in einer feldfreien Driftregion mit einer kinetischen Energie qV, wobei q die Ionenladung und V die angelegte Spannung ist. Da die kinetische Ionenenergie 0,5 mV² beträgt, haben leichtere Ionen eine höhere Geschwindigkeit als schwerere Ionen und erreichen den Detektor am Ende der Driftregion früher. Der Ausgang eines Ionendetektors wird auf einem Oszilloskop als eine Funktion der Zeit dargestellt, um das Massenspektrum zu erzeugen.
Der Ionenbildungsprozeß ist der Startpunkt für massenspektrometrische Analysen. Chemische Ionisierung ist ein Verfahren, das ein Reagens-Ion einsetzt, um mit den Analytmolekülen (Markierungen) zu reagieren, um Ionen durch entweder einen Protonen- oder Hydridtransfer zu bilden. Die Reagens-Ionen werden erzeugt durch Einbringen eines großen Überschusses Methan (relativ zur Markierung) in eine Elektronenstoß(EI)-Ionenquelle. Elektronenzusammenstöße erzeugen CH&sub4;&spplus; und CH&sub3;&spplus;, die weiter mit Methan reagieren, um CH&sub5;&spplus; und C&sub2;H&sub5;&spplus; zu bilden. Ein weiteres Verfahren, um Markierungen zu ionisieren, ist durch Plasma und Glühentladung. Plasma ist ein heißes, teilweise ionisiertes Gas, das Atome wirkungsvoll anregt und ionisiert. Eine Glühentladung ist ein Niederdruckplasma, das zwischen zwei Elektroden gehalten wird. Elektronenstoßionisation setzt einen Elektronenstrahl ein, üblicherweise von einem Wolframfaden erzeugt, um Gasphasen-Atome oder -Moleküle zu ionisieren. Ein Elektron aus dem Strahl schlägt ein Elektron aus Analyt- Atomen oder -Molekülen, um Ionen zu erzeugen. Elektrosprayionisierung verwendet eine sehr feine Nadel und eine Reihe von Abstreifern. Eine Probenlösung wird in die Quellenkammer gesprüht, um Tröpfchen zu bilden. Die Tröpfchen tragen Ladung, wenn sie aus der Kapillare austreten, und wenn das Lösungsmittel verdampft, verschwinden die Tröpfchen, wobei sie hochgeladene Analytmoleküle zurücklassen. ESI ist besonders nützlich für große biologische Moleküle, die schwierig zu verdampfen oder zu ionisieren sind. Bombardierung mit schnellen Atomen (FAB) verwendet einen Hochenergiestrahl neutraler Atome, typischerweise Xe oder Ar, der auf eine feste Probe trifft, wodurch Desorption und Ionisierung bewirkt wird. Es wird für große biologische Moleküle verwendet, die schwierig in die Gasphase zu bringen sind. FAB bewirkt geringe Fragmentierung und gibt üblicherweise einen großen Molekülionenpeak, was sie nützlich zur Bestimmung der relativen Molekülmasse macht. Der Atomstrahl wird durch Beschleunigung von Ionen aus einer Ionenquelle durch eine Ladungsaustauschzelle erzeugt. Ionen nehmen in Kollisionen mit neutralen Atomen ein Elektron auf, um einen Strahl aus Hochenergie-Atomen zu bilden. Laserionisierung (LIMS) ist ein Verfahren, bei dem ein Laserpuls Material von der Oberfläche einer Probe ablöst und ein Mikroplasma schafft, das einen Teil der Probenbestandteile ionisiert. Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisation (MALDI) ist ein LIMS-Verfahren zum Verdampfen und Ionisieren großer biologischer Moleküle, wie etwa Proteine oder DNA-Fragmente. Die biologischen Moleküle werden in einer festen Matrix, wie etwa Nicotinsäure, dispergiert. Ein UV-Laserpuls trägt Material von der Matrix ab, was einen Teil der großen Moleküle in einer ionisierten Form in die Gasphase bringt, so daß sie in einen Massenspektrometer extrahiert werden können. Plasmadesorptionsionisation (PD) verwendet den Zerfall von ²&sup5;²Cf, was zwei Fissionsfragmente erzeugt, die sich in entgegengesetzte Richtungen bewegen. Ein Fragment trifft auf die Probe, wodurch 1-10 Analyt-Ionen herausgeschlagen werden. Das andere Fragment trifft auf einen Detektor und triggert den Start der Datenaufnahme. Dieses Ionisationsverfahren ist besonders nützlich für große biologische Moleküle. Resonanzionisation (RIMS) ist ein Verfahren, bei dem ein oder mehrere Laserstrahlen in Resonanz auf Übergänge eines Gasphasen-Atoms oder -Moleküls eingestellt werden, um es schrittweise über sein Ionisationspotential zu heben, um ein Ion zu erzeugen. Sekundärionisation (SIMS) verwendet einen Ionenstrahl, wie etwa ³He&spplus;, ¹&sup6;O&spplus; oder &sup4;&sup0;Ar&spplus;, wird auf die Oberfläche einer Probe fokussiert und zerstäubt Material in die Gasphase hinein. Funkenquelle ist ein Verfahren, das Analyte in feste Proben durch Pulsen eines elektrischen Stroms über zwei Elektroden ionisiert.
Eine Markierung kann vor, während oder nach der Abspaltung vom Molekül, an die sie gebunden ist, mit Ladung versehen werden. Ionisationsverfahren auf der Basis von Ionen- "Desorption", der direkten Bildung oder Emission von Ionen von festen oder flüssigen Oberflächen haben zunehmende Anwendung auf nicht-flüchtige und thermisch labile Verbindungen ermöglicht. Diese Verfahren eliminieren die Notwendigkeit der Verflüchtigung neutraler Moleküle vor der Ionisation und minimieren im allgemeinen die thermische Zersetzung der Molekülspezies. Diese Verfahren schließen Felddesorption (Becky, Principles of Field Ionization and Field Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford; 1977), Plasmadesorption (Sundqvist und MacFarlane, Mass Spectrom. Rev. 4 : 421, 1985), Laserdesorption (Karas und Hillenkamp, Anal. Chem. 60 : 2299, 1988; Karas et al., Angew. Chem. 101 : 805, 1989), Bombardierung mit schnellen Teilchen (z. B. Bombardierung mit schnellen Atomen, FAB, und Sekundärionen-Massenspektrometrie, SIMS, Barber et al., Anal. Chem. 54 : 645A, 1982), und Thermospray(TS)-Ionisation (Vestal, Mass Spectrom. Rev. 2 : 447, 1983) ein. Thermospray wird in breitem Umfang für die on-line-Kombination mit Flüssigkeitschromatographie angewendet. Die FAB-Verfahren mit kontinuierlichem Durchfluß (Caprioli et al., Anal. Chem. 58 : 2949, 1986) haben ebenfalls signifikantes Potential gezeigt. Eine vollständigere Auflistung von Ionisations/Massenspektrometrie-Kombinationen ist Ionenfallen-Massenspektrometrie, Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie, Ionenspray-Massenspektrometrie, Flüssigionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation bei atmosphärischem Druck, Elektronenionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Bombardierung mit metastabilen Atomen, Massenspektrometrie mit Ionisation durch Bombardierung mit schnellen Atomen, MALDI- Massenspektrometrie, Photoionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie, Lasertröpfchen- Massenspektrometrie, MALDI-TOF-Massenspektrometrie, APCI-Massenspektrometrie, Nanospray-Massenspektrometrie, Nebelsprayionisations-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie mit chemischer Ionisation, Resonanzionisations-Massenspektrometrie, Sekundärionisations-Massenspektrometrie, Thermospray-Massenspektrometrie.
Die Ionisationsverfahren, die für nicht-flüchtige biologische Verbindungen geeignet sind, haben überlappende Anwendbarkeitsbereiche. Ionisationswirkungsgrade sind in hohem Maße abhängig von Matrixzusammensetzung und Verbindungstyp. Gegenwärtig verfügbare Ergebnisse weisen darauf hin, daß die obere Molekülmasse für TS etwa 8.000 Daltons beträgt (Jones und Krolik, Rapid Comm. Mass Spektrom. 1 : 67, 1987). Da TS hauptsächlich mit Quadrupol-Massenspektrometern durchgeführt wird, leidet die Empfindlichkeit typischerweise disproportional bei höheren Masse/Ladungs-Verhältnissen (m/z). Flugzeit(TOF)- Massenspektrometer sind kommerziell erhältlich und besitzen den Vorteil, daß der m/z- Bereich nur durch den Detektorwirkungsgrad begrenzt ist. Vor kurzem sind zwei zusätzliche Ionisationsverfahren eingeführt worden. Diese zwei Verfahren werden nun als Matrix- unterstützte Laserdesorption (MALDI, Karas und Hillenkamp, Anal. Chem. 60 : 2299, 1988; Karas et al., Angew. Chem. 101 : 805, 1989) und Elektrosprayionisation (ESI) bezeichnet. Beide Methodiken haben einen sehr hohen Ionisationswirkungsgrad (d. h. sehr hohes [erzeugte Molekülionen]/[verbrauchte Moleküle]). Die Empfindlichkeit, die das letztendliche Potential der Technik definiert, ist abhängig von der Probengröße, der Menge an Ionen, der Durchflußgeschwindigkeit, dem Nachweisgrad und dem tatsächlichen Ionisationswirkungsgrad.
Elektrospray-MS beruht auf einer Idee, die als erstes in den 1960igern vorgeschlagen wurde (Dole et al., J. Chem. Phys. 49 : 2240, 1968). Elektrosprayionisation (ESI) ist ein Mittel, um geladene Moleküle für die Analyse durch Massenspektroskopie zu erzeugen. Kurz gesagt erzeugt Elektrosprayionisation hochgeladene Tröpfchen durch Vernebeln von Flüssigkeiten in einem stark elektrostatischen Feld. Die hochgeladenen Tröpfchen, die im allgemeinen in einem Trockenbadgas bei atmosphärischem Druck gebildet werden, schrumpfen durch Verdampfung von neutralem Lösungsmittel, bis die Ladungsabstoßung die kohäsiven Kräfte überwindet, was zu einer "Coulomb-Explosion" führt. Der genaue Mechanismus der Ionisation wird kontrovers diskutiert und mehrere Gruppen haben Hypothesen vorgelegt (Blades et al., Anal. Chem. 63 : 2109-14, 1991; Kebarle et al., Anal. Chem. 65 : A972-86, 1993; Fenn, J. Am. Soc. Mass. Spektrom. 4 : 524-35, 1993). Ungeachtet des letztendlichen Ionenbildungsprozesses erzeugt ESI geladene Moleküle aus Lösung unter milden Bedingungen.
Die Fähigkeit, nützliche Massenspektrumdaten von geringen Mengen eines organischen Moleküls zu erhalten, beruht auf der effizienten Erzeugung von Ionen. Der Ionisationswirkungsgrad für ESI steht im Zusammenhang mit dem Ausmaß der positiven Ladung, die mit dem Molekül assoziiert ist. Die Verbesserung der Ionisation auf experimentellem Wege hat üblicherweise die Verwendung saurer Bedingungen mit sich gebracht. Ein weiteres Verfahren, um die Ionisation zu verbessern, ist gewesen, quartäre Amine zu verwenden, wenn möglich (siehe Aebersold et al., Protein Science 1 : 494-503, 1992; Smith et al., Anal. Chem. 60 : 436-41, 1988).
Elektrosprayionisation wird detaillierter wie folgt beschrieben. Elektrospray-Ionenerzeugung erfordert zwei Schritte: Dispersion hochgeladener Tröpfchen bei nahezu atmosphärischem Druck, gefolgt von Zuständen, um Verdampfung zu induzieren. Eine Lösung von Analyt- Molekülen wird durch eine Nadel geleitet, die bei hohem elektrischen Potential gehalten wird. Am Ende der Nadel dispergiert die Lösung in einen Nebel von kleinen hochgeladenen Tröpfchen hinein, die die Analyt-Moleküle enthalten. Die kleinen Tröpfchen verdampfen schnell, und mit einem Verfahren der Felddesorption oder Restverdampfung werden protonierte Proteinmoleküle in die Gasphase freigesetzt. Ein Elektrospray wird im allgemeinen durch Anlegen eines hohen elektrischen Feldes an einen geringen Flüssigkeitsstrom (im allgemeinen 1-10 ul/min) aus einer Kapillarröhre erzeugt. Eine Potentialdifferenz von 3-6 kV wird typischerweise zwischen der Kapillare und der Gegenelektrode angelegt, die 0,2 bis 2 cm entfernt angeordnet ist (wo Ionen, geladene Cluster und sogar geladene Tröpfchen, in Abhängigkeit vom Ausmaß der Desolvatisierung, vom MS durch eine kleine Öffnung gesampelt werden können). Das elektrische Feld führt zu einer Ladungsakkumulation auf der Flüssigkeitsoberfläche des Kapillarendes; somit sind die Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeit, der spezifische Widerstand und die Oberflächenspannung wichtige Faktoren bei der Tröpfchenerzeugung. Das hohe elektrische Feld führt zum Aufbrechen der Flüssigkeitsoberfläche und zur Bildung hochgeladener Flüssigkeitströpfchen. Positiv oder negativ geladene Tröpfchen können in Abhängigkeit von der Kapillarvorspannung erzeugt werden. Der negative Ionenmodus erfordert das Vorhandensein eines Elektronenfängers, wie etwa Sauerstoff, um elektrische Entladung zu hemmen.
Ein breiter Bereich von Flüssigkeiten kann elektrostatisch in ein Vakuum gesprüht werden, oder mit Hilfe eines Vernebelungsmittels. Die Verwendung von ausschließlich elektrischen Feldern zur Vernebelung führt zu einigen praktischen Beschränkungen des Bereichs der Flüssigkeitsleitfähigkeit und dielektrischen Konstante. Lösungsleitfähigkeit von weniger als 10&supmin;&sup5; Ohm ist bei Raumtemperatur für ein stabiles Elektrospray bei brauchbaren Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeiten erforderlich, was einer wäßrigen Elektrolytlösung von < 10&supmin;&sup4; M entspricht. Bei dem Modus, der sich für ESI-MS als am nützlichsten erwiesen hat, führt eine geeignete Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeit zu Dispersion der Flüssigkeit als ein feiner Nebel. In kurzer Entfernung von der Kapillare ist der Tröpfchendurchmesser oft ziemlich gleichförmig und in der Größenordnung von 1 um. Von besonderem Interesse ist, daß der Elektrospray-Ionenstrom für höhere Flüssigkeitsdurchflußgeschwindigkeiten nur insgesamt leicht ansteigt. Es gibt Hinweise, daß Erwärmung für die Manipulation des Elektrosprays nützlich ist. Leichte Erwärmung ermöglicht zum Beispiel, daß wäßrige Lösungen leicht in Elektrospray überführt werden können, vermutlich aufgrund der verringerten Viskosität und Oberflächenspannung. Sowohl thermisch unterstützte als auch Gasvernebelungs-unterstützte Elektrosprays ermöglichen, daß höhere Flüssigkeitsdurchflußraten verwendet werden können, senken aber das Ausmaß der Tröpfchenladung. Die Bildung von Molekülionen erfordert Bedingungen, die eine Verdampfung der anfänglichen Tröpfchenpopulation bewirken. Dies kann bei höheren Drücken durch einen Trockengasstrom bei mäßigen Temperaturen (< 60ºC), durch Erhitzen während des Transports durch die Schnittstelle und (insbesondere im Falle von Ioneneinfangverfahren) durch energetische Kollisionen bei relativ niedrigem Druck durchgeführt werden.
Obgleich die detaillierten Prozesse, die ESI zugrundeliegen, unsicher bleiben, scheinen die sehr kleinen Tröpfchen, die durch ESI erzeugt werden, zu ermöglichen, daß nahezu jede Spezies, die in Lösung eine Nettoladung trägt, nach Verdampfung von Restlösungsmittel in die Gasphase überführt werden kann. Massenspektrometrischer Nachweis erfordert dann, daß Ionen nach Desolvatisierung einen verfolgbaren m/z-Bereich haben (< 4.000 Daltons für Quadrupol-Instrumente) sowie mit ausreichendem Wirkungsgrad erzeugt und überführt werden können. Der breite Bereich von gelösten Stoffen, für den bereits festgestellt wurde, daß ESI-MS dafür geeignet ist, und das Fehlen einer substantiellen Abhängigkeit des Ionisationswirkungsgrades von der relativen Molekülmasse weist auf ein in hohem Maße nicht-diskriminierendes und breit anwendbares Ionisationsverfahren hin.
Die Elektrospray-Ionen-"Quelle" arbeitet bei nahezu atmosphärischem Druck. Die Elektrospray-"Quelle" ist typischerweise eine Metall- oder Glaskapillare, die ein Verfahren zur elektrischen Vorspannung der flüssigen Lösung relativ zu einer Gegenelektrode umfaßt. Lösungen, typischerweise Wasser-Methanol-Mischungen, die den Analyten und oft weitere Additive, wie etwa Essigsäure, enthalten, strömen zum Kapillarende. Eine ESI-Quelle ist beschrieben worden (Smith et al., Anal. Chem. 62 : 885, 1990), die im wesentlichen jedes Lösungsmittelsystem aufnehmen kann. Typische Durchflußgeschwindigkeiten für ESI sind 1 bis 10 ul/min. Das prinzipielle Erfordernis einer ESI-MS-Schnittstelle ist, Ionen aus dem Hochdruckbereich so wirkungsvoll wie möglich in das MS zu sampeln und zu transportieren.
Der Wirkungsgrad von ESI kann sehr hoch sein, was die Grundlage für extrem empfindliche Messungen liefert, was für die hierin beschriebene Erfindung nützlich ist. Die augenblickliche Instrumentenleistung kann einen Gesamtionenstrom am Detektor von etwa 2 · 10&supmin;¹² A oder etwa 10&sup7; Zählimpulses für einfach geladene Spezies liefern. Auf der Basis der Instrumentenleistung werden so niedrige Konzentrationen wie 10&supmin;¹&sup0; M oder etwa 10&supmin;¹&sup8; molls einer einfach geladenen Spezies einen nachweisbaren Ionenstrom (etwa 10 Zählimpulses) ergeben, wenn der Analyt vollständig ionisiert ist. Nachweisgrenzen im unteren Attomol- Bereich sind z. B. für quartäre Ammonium-Ionen unter Verwendung einer ESI-Schnittstelle mit Kapillarzonenelektrophorese erhalten worden (Smith et al., Anal. Chem. 59 : 1230, 1988). Für eine Verbindung mit einer relativen Molekülmasse von 1.000 ist die mittlere Zahl von Ladungen 1, die mittlere Zahl von Ladungszuständen 1, die Peakbreite (m/z) 1 und die maximale Intensität (Ionen/s) 1 · 10¹².
Eine bemerkenswert kleine Probe wird beim Erstellen eines ESI-Massenspektrums tatsächlich verbraucht (Smith et al., Anal. Chem. 60 : 1948, 1988). Substantielle Gewinne könnten auch durch die Verwendung von Array-Detektoren mit Sektorinstrumenten erzielt werden, was gleichzeitigen Nachweis von Teilen des Spektrums ermöglicht. Da gegenwärtig nur etwa 10&supmin;&sup5; aller Ionen, die von ESI gebildet werden, nachgewiesen werden, kann eine Fokussierung auf die Faktoren, die die Instrumentenleistung begrenzen, eine Grundlage für verbesserte Empfindlichkeit liefern. Es wird den Fachleuten deutlich sein, daß die vorliegende Erfindung Verbesserungen für Ionisations- und Nachweismethodiken überdenkt und anpaßt.
Vorzugsweise wird zwischen die Trennvorrichtung (z. B. Gel) und den Detektor (z. B. Massenspektrometer) eine Schnittstelle gesetzt. Die Schnittstelle hat vorzugsweise die folgenden Eigenschaften: (1) die Fähigkeit, die DNA-Fragmente in diskreten Zeitintervallen zu sammeln, (2) die DNA-Fragmente zu konzentrieren, (3) die DNA-Fragmente aus den Elektrophoresepuffern und dem Milieu zu entfernen, (4) die Markierung vom DNA-Fragment abzuspalten, (5) die Markierung vom DNA-Fragment zu trennen, (6) das DNA-Fragment zu verwerfen, (7) die Markierung in eine flüchtige Lösung zu geben, (8) die Markierung zu verflüchtigen und zu ionisieren und (9) die Markierung in eine Elektrosprayvorrichtung einzubringen oder dorthin zu transportieren, die die Markierung in das Massenspektrometer einführt.
Die Schnittstelle hat auch die Fähigkeit, DNA-Fragmente zu "sammeln", wenn sie aus dem Boden eines Gels eluieren. Das Gel kann aus einem Slabgel, einem Röhrengel, einer Kapillare, etc. bestehen. Die DNA-Fragmente können mit verschiedenen Verfahren gesammelt werden. Das erste Verfahren ist dasjenige der Verwendung eines elektrischen Feldes, wobei DNA-Fragmente auf oder nahe einer Elektrode gesammelt werden. Ein zweites Verfahren ist dasjenige, bei dem die DNA-Fragmente durch Leiten eines Flüssigkeitsstroms am Boden eines Gels vorbei gesammelt werden. Aspekte beider Verfahren können kombiniert werden, wobei DNA in einen fließenden Strom hinein gesammelt wird, der später unter Verwendung eines elektrischen Feldes konzentriert werden kann. Das Endergebnis ist, daß DNA-Fragmente aus dem Milieu entfernt werden, in dem das Trennverfahren durchgeführt wurde. Das heißt, daß DNA-Fragmente durch Verwendung eines elektrischen Feldes aus einem Lösungstyp in einen anderen "gezogen" werden können.
Wenn die DNA-Fragmente erst einmal in der geeigneten Lösung sind (kompatibel mit Elektrospray und Massenspektrometrie), kann die Markierung vom DNA-Fragment abgespalten werden. Das DNA-Fragment (oder Reste desselben) kann von der Markierung durch das Anlegen eines elektrischen Feldes getrennt werden (vorzugsweise hat die Markierung die entgegengesetzte Ladung zu derjenigen der DNA-Markierung). Die Markierung wird anschließend durch die Verwendung eines elektrischen Feldes oder einer strömenden Flüssigkeit in die Elektrosprayvorrichtung eingebracht.
Fluoreszenz-Markierungen können am direktesten durch ihre Absorptions- und Fluoreszenzemissionswellenlängen und -intensitäten identifiziert und quantifiziert werden.
Während ein herkömmlicher Spektrofluorometer extrem flexibel ist, wobei er kontinuierliche Bereiche für die Anregungs- und Emissionswellenlängen liefert (IEX, IS1, IS2), können spezialisiertere Instrumente, wie etwa Durchflußcytometer und Laserabtastmikroskope, Sonden erfordern, die bei einer einzigen fixierten Wellenlänge anregbar sind. In heutigen Instrumenten ist dies üblicherweise die 488-nm-Linie des Argonlasers.
Fluoreszenzintensität pro Sondenmolekül ist proportional zum Produkt von E und QY. Der Bereich dieser Parameter unter Fluorophoren von gegenwärtiger praktischer Bedeutung ist ungefähr 10.000 bis 100.000 cm&supmin;¹M&supmin;¹ für &epsi; und 0,1 bis 1,0 für QY. Wenn die Absorption durch Hochintensitätsbeleuchtung zur Sättigung getrieben wird, wird die irreversible Zerstörung des angeregten Fluorophors (Photobleichung) der Faktor, der die Fluoreszenznachweisbarkeit begrenzt. Die praktische Auswirkung der Photobleichung hängt von der jeweiligen Fluoreszenznachweistechnik ab.
Es wird einem Fachmann deutlich sein, daß eine Vorrichtung (eine Schnittstelle) zwischen die Trenn- und Nachweisschritte geschaltet werden kann, um den kontinuierlichen Betrieb von Größentrennung und Markierungsnachweis (in Echtzeit) zu ermöglichen. Dies vereinheitlicht die Trennmethodik und -instrumentierung mit der Nachweismethodik und -instrumentierung, unter Bildung einer einzigen Vorrichtung. Eine Schnittstelle ist z. B. zwischen eine Trenntechnik und den Nachweis durch Massenspektrometrie oder potentiostatischer Amperometrie geschaltet.
Die Funktion der Schnittstelle ist primär die Freisetzung der (z. B. Massenspektrometrie)- Markierung vom Analyten. Es gibt mehrere repräsentative Implementierungen der Schnittstelle. Die Konstruktion der Schnittstelle ist abhängig von der Auswahl der spaltbaren Linker. Im Falle von licht- oder photospaltbaren Linkem ist eine Energie- oder Photonenquelle erforderlich. Im Falle eines säurelabilen Linkers, eines baselabilen Linkers oder eines Disulfid-Linkers ist die Zugabe von Reagens in der Schnittstelle erforderlich. Im Falle wärmelabiler Linker ist eine Energiewärmequelle erforderlich. Enzymzugabe ist erforderlich für einen enzymempfindlichen Linker, wie etwa eine spezifische Protease und einen Peptid-Linker, einen Nuklease- und einen DNA- oder RNA-Linker, eine Glycosylase, HRP oder Phosphatase oder einen Linker, der nach Spaltung instabil ist (z. B. ähnlich zu Chemilumineszenzsubstraten). Andere Eigenschaften der Schnittstelle schließen minimale Bandenverbreiterung, Trennung der DNA von Markierungen vor Injektion in einen Massenspektrometer ein. Trenntechniken schließen diejenigen ein, die auf Elektrophoreseverfahren und -techniken, Affinitätstechniken, Größenretention (Dialyse), Filtration und dergleichen beruhen.
Es ist auch möglich, die Markierungen (oder das Nukleinsäure-Linker-Markierungs- Konstrukt) zu konzentrieren, elektrophoretisch einzufangen und dann in einen alternativen Reagensstrom freizusetzen, der mit dem bestimmten ausgewählten Ionisationsverfahrenstyp kompatibel ist. Die Schnittstelle kann auch in der Lage sein, die Markierungen (oder Nukleinsäure-Linker-Markierungs-Konstrukte) auf Mikroperlen einzufangen, die Perle(n) in eine Kammer einzuschließen und anschließend Laserdesorption/Verdampfung durchzuführen. Es ist auch möglich, im Strom in einen alternativen Puffer hinein zu extrahieren (z. B. aus Kapillarelektrophoresepuffer in hydrophoben Puffer durch eine permeable Membran). In einigen Anwendungen kann es auch wünschenswert sein, Markierungen intermittierend in den Massenspektrometer einzuführen, was eine weitere Funktion der Schnittstelle umfassen würde. Eine weitere Funktion der Schnittstelle ist, Markierungen aus mehreren Säulen in einen Massenspektrometer zuzuführen, mit einem rotierenden Zeitslot für jede Säule. Es ist auch möglich, Markierungen aus einer einzigen Säule in mehrere MS-Detektoren einzuführen, getrennt nach Zeit, jeden Satz von Markierungen für ein paar Millisekunden zu sammeln und dann einem Massenspektrometer zuzuführen.
Die folgende ist eine Liste repräsentativer Anbieter für Trenn- und Nachweistechnologien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Hoefer Scientific Instruments (San Francisco, CA) stellt Elektrophoreseausrüstung (Two Step®, Poker Face®II) für Sequenzierungsanwendungen her. Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) stellt Elektrophoreseausrüstung für DNA-Trennungen und -sequenzierung her (PhastSystem für PCR-SSCP-Analyse, MacroPhor System für DNA-Sequenzierung). Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (ABI, Foster City, CA) stellt halbautomatisierte Sequenzer auf der Basis von Fluoreszenzfarbstoffen her (ABI373 und ABI377). Analytical Spectral Devices (Boulder, CO) stellt UV-Spektrometer her. Hitachi Instruments (Tokio, Japan) stellt Atomabsorptionsspektrometer, Fluoreszenzspektrometer, LC- und GC- Massenspektrometer, NMR-Spektrometer und UV-vis-Spektrometer her. PerSeptive Biosystems (Framingham, MA) stellt Massenspektrometer (Voyager® Elite) her. Bruker Instrumens, Inc. (Manning Park, MA) stellt FTIR-Spektrometer (Vector 22), FT-Raman- Spektrometer, Flugzeit-Massenspektrometer (Reflex II®), Ionenfallen-Massenspektrometer (Esquire) und einen Maldi-Massenspektrometer her. Analytical Technology Inc. (ATI, Boston, MA) stellt Kapillargelelektrophoreseeinheiten, UV-Detektoren und Diodenarray- Detektoren her. Teledyne Electronic Technologies (Mountain View, CA) stellt einen Ionenfallen-Massenspektrometer her (3DQ Discovery® und den 3DQ Apogee®). Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (Foster City, CA) stellt einen Sciex-Massenspektrometer (Dreifachquadrupol LC/MS/MS, den API 100/300) her, der mit Elektrospray kompatibel ist. Hewlett-Packard (Santa Clara, CA) stellt massenselektive Detektoren (HP 5972A), MALDITOF-Massenspektrometer (HP G2025A), Diodenarray-Detektoren, CE-Einheiten, HPLC- Einheiten (HP1090) sowie UV-Spektrometer her. Finnigan Corporation (San Jose, CA) stellt Massenspektrometer (Magnetsektor (MAT 95 S®), Quadrupol-Spektrometer (MAT 95 SQ®) und vier weitere verwandte Massenspektrometer) her. Rainin (Ameryville, CA) stellt HPLC- Instrumente her.
Die Verfahren und Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, erlauben die Verwendung von abgespaltenen Markierungen, um als Karten für bestimmte Probentypen und Nukleotididentitäten zu dienen. Zu Beginn jedes Sequenzierungsverfahrens wird ein bestimmter (ausgewählter) Primer einer bestimmten einzigartigen Markierung zugeordnet. Die Markierungen kartieren auf entweder einen Probentyp, einen Didesoxyterminatortyp (im Falle einer Sanger-Sequenzierungsreaktion) oder vorzugsweise beides. Genauer gesagt kartiert die Markierung auf einen Primertyp, der seinerseits auf einen Vektortyp kartiert, der seinerseits auf eine Probenidentität kartiert. Die Markierung kann auch auf einen Didesoxyterminatortyp (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP) durch Bezugnahme, in welche Didesoxynukleotidreaktion der markierte Primer gegeben wird, kartieren. Die Sequenzierungsreaktion wird dann durchgeführt, und die resultierenden Fragmente werden sequentiell über die Zeit nach Größe getrennt.
Die Markierungen werden von den Fragmenten in einem Zeitrahmen abgespalten und in einem Zeitrahmen gemessen und aufgezeichnet. Die Sequenz wird durch Vergleich der Markierungskarte mit dem Zeitrahmen konstruiert. Das heißt, daß alle Markierungsidentitäten über die Zeit nach dem Bemessungsschritt aufgezeichnet und miteinander in einem Zeitrahmen in Beziehung gesetzt werden. Der Bemessungsschritt trennt die Nukleinsäurefragmente nach Inkrementen von einem Nukleotid, und die damit zusammenhängenden Markierungsidentitäten werden daher nach Inkrementen von einem Nukleotid getrennt. Durch Vorkenntnis des Didesoxyterminators, oder der Nukleotidkarte und des Probentyps kann die Sequenz leicht auf lineare Art und Weise abgeleitet werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
Sofern nicht anders angegeben, können Chemikalien, wie sie in den Beispielen verwendet werden, von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI erhalten werden. Die folgenden Abkürzungen, mit den angegebenen Bedeutungen, werden hierin verwendet.
ANP = 3-(Fmoc-Amino)-3-(2-nitrophenyl)propionsäure
NBA = 4-(Fmoc-Aminomethyl)-3-nitrobenzoesäure
HATU = O-7-Azabenzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
DIEA = Diisopropylethylamin
MCT = Monochlortriazin
NMM = 4-Methylmorpholin
NMP = N-Methylpyrrolidon
ACT375 = ACT375-Peptidsynthesizer von Advanced ChemTech, Inc., Louisville, KY
ACT = Advanced ChemTech, Inc., Louisville, KY
NovaBiochem = CalBiochem-NovaBiochem International, San Diego, CA
TFA = Trifluoressigsäure
Tfa = Trifluoracetyl
iNIP = N-Methylisonipecotinsäure
Tfp = Tetrafluorphenyl
DIAEA = 2-(Diisopropylamino)ethylamin
MCT = Monochlortriazen
5'-AH-ODN = Oligodesoxynukleotid mit 5'-Aminohexyl-Schwanz

BEISPIELE

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG VON SÄURELABILEN LINKERN ZUR VERWENDUNG BEI DER SEQUENZIERUNG EINES SPALTBAREN MG-IDENTIFIKATORS

A. Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäureamid-Enden freizusetzen

Fig. 1 zeigt das Reaktionsschema.
Schritt A. TentaGel-S-AC-Harz (Verbindung II; erhältlich von ACT; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357-Peptidsynthesizers (ACT) suspendiert. Verbindung I (3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung III zu ergeben.
Schritt B. Das Harz (Verbindung III) wird mit 25%igem Piperidin in DMF vermischt und fit 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, anschließend mit 25%igem Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt C verwendet.
Schritt C. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt B wird in DMF suspendiert und dazu werden eine Aminosäure mit FMOC-Schutzgruppe, die Aminofunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Verbindung IV, z. B. Alpha-N-FMOC-3-(3-Pyridyl)-alanin (erhältlich von Synthetech, Albany, OR; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Das Gefäß wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von IV an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt D. Das Harz (Verbindung V) wird mit Piperidin behandelt, wie in Schritt B beschrieben, um die FMOC-Gruppe zu entfernen. Das Harz ohne Schutzgruppe wird anschließend gleichmäßig vom ACT357 aus dem Sammelgefäß in 16 Reaktionsgefäße aufgeteilt.
Schritt E. Die 16 Aliquote aus Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt D werden in DMF suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß werden die geeignete Carbonsäure VI&sub1;&submin;&sub1;&sub6;(R&sub1;&submin;&sub1;&sub6;CO&sub2;H; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Harz-Aliquote mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von VI&sub1;&submin;&sub1;&sub6; an die Harz-Aliquote und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindungen VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; zu ergeben.
Schritt F. Die Harz-Aliquote (Verbindungen VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6;) werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (3X) gewaschen. Zu jedem der Reaktionsgefäße wird 1% TFA in CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben und die Gefäße für 30 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhren filtriert. Die Harz-Aliquote werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) und MeOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhren hinein zusammengeführt. Die einzelnen Röhren werden im Vakuum eingedampft, was die Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; liefert.
Schritt G. Jede der freien Carbonsäuren VIII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; wird in DMF gelöst. Zu jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) zugegeben, gefolgt von Pentafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (3X) und 5% wäßrigem NaHCO&sub3; (3X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und in vacuo eingedampft, was die Verbindungen IX&sub1;&submin;&sub1;&sub6; liefert.

B. Synthese von Pentafluorphenylestern von chemisch spaltbaren Massenspektroskopiemarkierungen, um Markierungen mit Carbonsäureenden freizusetzen

Fig. 2 zeigt das Reaktionsschema.
Schritt A. 4-(Hydroxymethyl)phenoxybuttersäure (Verbindung I; 1 Äq.) wird zusammengebracht mit DIEA (2,1 Äq.) und Allylbromid (2,1 Äq.) in CHCl&sub3; und für 2 h unter Rückfluß erhitzt. Die Mischung wird mit EtOAc verdünnt, mit 1 N HCl (2X), pH 9,5 Carbonatpuffer (2X) und Salzlösung (1X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo eingedampft, um den Allylester von Verbindung I zu ergeben.
Schritt B. Der Allylester von Verbindung I aus Schritt A (1,75 Äq.) wird in CH&sub2;Cl&sub2; mit einer Aminosäure mit FMOC-Schutzgruppe, die Aminofunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Verbindung II, z. B. Alpha-N-FMOC-3-(3-Pyridyl)-alanin, erhältlich von Synthetech, Albany, OR; 1 Äq.), N-Methylmorpholin (2,5 Äq.) und HATU (1,1 Äq.) zusammengebracht und bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. Die Mischung wird mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (2X), Wasser (1X) und 5%iger wäßriger NaHCO&sub3; (2X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo eingedampft. Verbindung III wird durch Flashchromatographie (CH&sub2;Cl&sub2;→EtOAc) isoliert.
Schritt C. Verbindung III wird in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, Pd(PPh&sub3;)&sub4; (0,07 Äq.) und N-Methylalanin (2 Äq.) werden hinzugegeben und die Mischung wird bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. Die Mischung wird mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (2X) und Wasser (1X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo eingedampft. Verbindung IV wird durch Flashchromatographie (CH&sub2;Cl&sub2;→EtOAc+HOAc) isoliert.
Schritt D. TentaGel-S-AC-Harz (Verbindung V; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357-Peptidsynthesizers (Advanced ChemTech Inc. (ACT), Louisville, KY) suspendiert. Verbindung IV (3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF werden hinzugefügt und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von IV an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritt E. Das Harz (Verbindung VI) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, dann mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Das Harz ohne Schutzgruppe wird dann gleichmäßig durch den ACT357 aus dem Sammelgefäß in 16 Reaktionsgefäße aufgeteilt.
Schritt F. Die 16 Aliquote aus Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt E werden in DMF suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß werden die geeignete Carbonsäure VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6;(R&sub1;&submin;&sub1;&sub6;CO&sub2;H; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und DIEA (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Harz-Aliquote mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von VII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; an die Harz-Aliquote und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub1;&sub6; zu ergeben.
Schritt G. Die Harz-Aliquote (Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub1;&sub6;) werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (3X) gewaschen. Zu jedem der Reaktionsgefäße wird 1% TFA in CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben und die Gefäße werden für 30 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhren filtriert. Die Harz-Aliquote werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) und MeOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhren hinein zusammengegeben. Die einzelnen Röhren werden im Vakuum verdampft, was die Verbindungen IX&sub1;&submin;&sub1;&sub6; liefert.
Schritt H. Jede der freien Carbonsäuren IX&sub1;&submin;&sub1;&sub6; wird in DMF gelöst. Zu jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) hinzugegeben, gefolgt von Pentafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, mit 1 M wäßriger Zitronensäure (3X) und 5% wäßriger NaHCO&sub3; (3X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und in vacuo eingedampft, was die Verbindungen X&sub1;&submin;&sub1;&sub6; liefert.

BEISPIEL 2

NACHWEIS PHOTOLYTISCHER SPALTUNG VON T-L-X

Eine T-L-X-Verbindung, wie hergestellt in Beispiel 11, wurde mit Licht im nahen UV- Bereich für 7 min bei Raumtemperatur bestrahlt. Eine Rayonett-Fluoreszenz-UV-Lampe (Southern New England Ultraviolet Co., Middletown, CT) mit einem Emissionspeak bei 350 nm wird als eine UV-Lichtquelle verwendet. Die Lampe wird in einem Abstand von 15 cm von den Petrischalen mit Proben gestellt. SDS-Gelelektrophorese zeigt, daß > 85% des Konjugats unter diesen Bedingungen gespalten werden.

BEISPIEL 3

HERSTELLUNG VON FLUORESZENZMARKIERTEN PRIMERN UND NACHWEIS DER SPALTUNG VON FLUOROPHOR

Synthese und Reinigung von Oligonukleotiden

Die Oligonukleotide (ODNs) werden auf automatisierten DNA-Synthesizern unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie, geliefert vom Anbieter, oder der H- Phosphonat-Chemie (Glen Research Sterling, VA) hergestellt. In geeigneter Weise blockierte dA-, dG-, dC- und T-Phosphoramidite sind in diesen Formen kommerziell erhältlich und synthetische Nukleoside können leicht in die geeignete Form überführt werden. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie, geliefert vom Anbieter, oder der H-Phosphonatchemie hergestellt. Oligonukleotide werden durch Adaptionen von Standardverfahren gereinigt. Oligonukleotide mit 5'-Tritylgruppen werden auf HPLC unter Verwendung einer 12 Mikrometer, 300 # Rainin (Emeryville, CA) Dynamax C-8 4,2 · 250 mm Umkehrphasensäule unter Verwendung eines Gradienten von 15% bis 55% MeCN in 0,1 N Et&sub3;NH&spplus;OAc&supmin;, pH 7,0, über 20 min chromatographiert. Wenn die Detritylierung durchgeführt wird, werden die Oligonukleotide durch Gelausschlußchromatographie weitergereinigt. Analytische Überprüfungen der Qualität der Oligonukleotide werden mit einer PRP-Säule (Alltech, Deerfield, IL) bei alkalischem pH und mit PAGE durchgeführt.
Herstellung von 2,4,6-Trichlortriazin-abgeleiteten Oligonukleotiden: 10 bis 1.000 ug 5'- terminal aminverknüpftes Oligonukleotid werden mit einem Überschuß umkristallisierter Cyanurolsäurechloride in 10% N-Methylpyrrolidon in alkalischem Puffer (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) bei 19ºC bis 25ºC für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen bestehen aus 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertem Cyanurolsäurechlorid und 500 ug/ml entsprechendem Oligonukleotid. Das nicht-umgesetzte Cyanurolsäurechlorid wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G- 50-Sephadex-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt.
Das aktivierte gereinigte Oligonukleotid wird dann mit einem 100-fachen molaren Überschuß Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50- Sephadex-Säule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden dann mit aminreaktiven Fluorochromen umgesetzt. Die abgeleitete ODN-Zubereitung wird in 3 Portionen aufgeteilt und jede Portion wird mit entweder (a) einem 20-fachen molaren Überschuß von Texasrot- Sulfonylchlorid (Molecular Probes, Eugene, OR), (b) einem 20-fachen molaren Überschuß von Lissamin-Sulfonylchlorid (Molecular Probes, Eugene, OR), (c) einem 20-fachen molaren Überschuß von Fluoresceinisothiocyanat umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen bestehen aus 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die nicht- umgesetzten Fluorochrome werden durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50- Sephadex-Säule entfernt.
Um das Fluorochrom vom Nukleotid abzuspalten, werden die ODNs auf 1 · 10&supmin;&sup5; molar eingestellt und dann Verdünnungen (12,3-fache Verdünnungen) in TE hergestellt (TE ist 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA). Zu 100 ul-Volumina von ODNs werden 25 ul 0,01 M Dithiothreitol (DTT) zugegeben. Zu einem identischen Satz von Kontrollzusammensetzungen wird kein DTT zugegeben. Die Mischung wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Fluoreszenz wird in einer schwarzen Mikrotiterplatte gemessen. Die Lösung wird aus den Inkubationsröhren (150 ul) entfernt und in eine schwarze Mikrotiterplatte (Dynatek Laboratories, Chantilly, VA) gegeben. Die Platten werden dann direkt unter Verwendung eines Fluoroskan-II-Fluorometers (Flow Laboratories, Molean, VA) unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 495 nm und Überwachung der Emission bei 520 nm für Fluorescein, unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 591 nm und Überwachung der Emission bei 612 nm für Texasrot und unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 570 nm und Überwachung der Emission bei 590 nm für Lissamin abgelesen.
Die Daten zeigen, daß es einen etwa 200-fachen Anstieg der relativen Fluoreszenz gibt, wenn das Fluorochrom vom ODN abgespalten wird.

BEISPIEL 4

HERSTELLUNG VON MARKIERTEN M13-SEQUENZPRIMERN UND NACHWEIS DER ABSPALTUNG VON MARKIERUNGEN

Herstellung von 2,4,6-Trichlortriazin-abgeleiteten Oligonukleotiden: 1.000 ug 5'-terminales aminverknüpftes Oligonukleotid (5'-Hexylamin-TGTAAAACGACGGCCAGT-3") (Seq. ID Nr. 1) werden mit einem Überschuß umkristallisierten Cyanursäurechlorids in 10% N- Methylpyrrolidon in alkalischem Puffer (vorzugsweise pH 8,3 bis 8,5) bei 19 bis 25ºC für 30 bis 120 Minuten umgesetzt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen bestehen aus 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml umkristallisiertem Cyanursäurechlorid und 500 ug/ml entsprechendem Oligonukleotid. Das nicht-umgesetzte Cyanursäurechlorid wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule entfernt.
Das aktivierte gereinigte Oligonukleotid wird anschließend mit einem 100-fachen molaren Überschuß Cystamin in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3 für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Das nicht-umgesetzte Cystamin wird durch Ausschlußchromatographie auf einer G-50-Sephadex-Säule entfernt. Die abgeleiteten ODNs werden anschließend mit einer Vielzahl von Amiden umgesetzt. Die abgeleitete ODN-Zubereitung wird in 12 Portionen aufgeteilt und je Portion wird (25-molarer Überschuß) mit den Pentafluorphenylestern von: (1) 4-Methoxybenzoesäure, (2) 4-Fluorbenzoesäure, (3) Tolylsäure, (4) Benzoesäure, (5) Lndol-3-essigsäure, (6) 2,6-Difluorbenzoesäure, (7) Nicotinsäure-N-oxid, (8) 2- Nitrobenzoesäure, (9) 5-Acetylsalicylsäure, (10) 4-Ethoxybenzoesäure, (11) Zimtsäure oder (12) 3-Aminonicotinsäure umgesetzt. Die Reaktion läuft für 2 Stunden bei 37ºC in 0,2 M NaBorat pH 8,3. Die abgeleiteten ODNs werden mit Gelausschlußchromatographie auf G-50- Sephadex gereinigt.
Um die Markierung vom Oligonukleotid abzuspalten, werden die ODNs auf 1 · 10&supmin;&sup5; molar eingestellt und anschließend werden Verdünnungen (12,3-fache Verdünnungen) in TE hergestellt (TE ist 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA) mit 50% EtOH (v/v). Zu 100 ul- Volumina ODNs werden 25 ul 0,01 M Dithiothreitol (DTT) zugegeben. Zu einem identischen Satz von Kontrollzusammensetzungen wird kein DTT zugegeben. Die Inkubation erfolgt für 30 Minuten bei Raumtemperatur. NaCl wird anschließend auf 0,1 M zugegeben und 2 Volumina EtOH werden zugegeben, um die ODNs auszufällen. Die ODNs werden aus Lösung durch Zentrifugation bei 14.000 · G bei 4ºC für 15 Minuten entfernt. Die Überstände werden aufbewahrt, vollständig getrocknet. Der Pellet wird anschließend in 25 ul MeOH gelöst. Der Pellet wird anschließend mit Massenspektrometrie auf das Vorhandensein von Markierungen getestet.
Der Massenspektrometer, der bei diesen Arbeiten verwendet wurde, ist ein Fouriertransformations-Massenspektrometer (FTMS) mit externer Ionenquelle. Proben, die für MALDI-Analyse hergestellt wurden, werden auf der Spitze einer direkten Sonde abgeschieden und in die Ionenquelle eingeführt. Wenn die Probe mit einem Laserpuls bestrahlt wird, werden Ionen aus der Quelle extrahiert und in eine lange Quadrupol- Ionenführung geleitet, die sie fokussiert und zu einer FTMS-Analysatorzelle transportiert, die innerhalb der Bohrung eines supraleitfähigen Magneten angeordnet ist.
Die Spektren liefern die folgende Information. Peaks die in der Intensität von 25 bis 100 relativen Intensitätseinheiten variieren, bei den folgenden relativen Molekülmassen: (1) 212,1 amu, was 4-Methoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, (2) 200,1, was 4-Fluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, (3) 196,1 amu, was Tolylsäure-Derivat anzeigt, (4) 182,1 amu, was Benzoesäure- Derivat anzeigt, (5) 235,2 amu, was Indol-3-essigsäure-Derivat anzeigt, (6) 218,1 amu, was 2,6-Difluorbenzoesäure-Derivat anzeigt, (7) 199,1 amu, was Nikotinsäure-N-oxid-Derivat anzeigt, (8) 227,1 amu, was 2-Nitrobenzamid anzeigt, (9) 179,18 amu, was 5- Acetylsalylsäure-Derivat anzeigt, (10) 226,1 amu, was 4-Ethoxybenzoesäure-Derivat anzeigt, (11) 209,1 amu, was Zimtsäure-Derivat anzeigt, (12) 198,1 amu, was 3-Aminonicotinsäure- Derivat hinweist.
Die Ergebnisse zeigten, daß die MW-Identifikatoren von den Primern abgespalten werden und mit Massenspektrometrie nachweisbar sind.

BEISPIEL 5

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;&submin; LYS(&epsi;INIP)-ANP-TFP

Fig. 3 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R&sub1;&submin;&sub3;&sub6; mit variabler Masse (wobei die R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über jede der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massensepktrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die &epsi;-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf Fig. 3:
Schritt A. NovaSyn-HMP-Harz (erhältlich von NovaBiochem; 1 Äq.) wird mit DMF im Sammelgefäß des ACT357 suspendiert. Verbindung I (ANP, erhältlich von ACT; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung II zu ergeben.
Schritt B. Das Harz (Verbindung II) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, anschließend mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt C verwendet.
Schritt C. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt B wird in DMF suspendiert und dazu wird eine Aminosäure aus FMOC-Schutzgruppe hinzugegeben, die eine geschützte Aminfunktionalität in ihrer Seitenkette enthält (Fmoc-Lysin(Aloc)-OH, erhältlich von PerSeptive Biosystems; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF. Das Gefäß wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von Fmoc-Lys(Aloc)-OH an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung IV zu ergeben.
Schritt D. Das Harz (Verbindung IV) wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) gewaschen und anschließend in einer Lösung von (PPh&sub3;)&sub4;Pd(0) (0,3 Äq.) und PhSiH&sub3; (10 Äq.) in CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert. Die Mischung wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Der Palladiumschritt wird wiederholt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X), N. N-Diisopropylethylammoniumdiethyldithiocarbamat in DMF (2X), DMF (2X) gewaschen, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt E. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt D wird mit N-Methylisonipecotinsäure gekoppelt, wie in Schritt C beschrieben, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritt F. Das Fmoc-geschützte Harz VI wird gleichmäßig durch den ACT357 aus dem Sammelgefäß in 36 Reaktionsgefäße aufgeteilt, um die Verbindungen VI&sub1;&submin;&sub3;&sub6; zu ergeben.
Schritt G. Das Harz (Verbindungen VI&sub1;&submin;&sub3;&sub6;)wird mit Piperidin behandelt, wie beschrieben in Schritt B, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt H. Die 36 Aliquote des Harzes ohne Schutzgruppe aus Schritt G werden in DMF suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß werden die entsprechende Carbonsäure (R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;CO&sub2;H; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF zugegeben. Die Gefäße werden für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und die Harz-Aliquote mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;CO&sub2;H an die Harz-Aliquote und die Waschschritte werden wiederholt, um die Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; zu ergeben.
Schritt I. Die Harz-Aliquote (Verbindungen VIII&sub1;&submin;&sub3;&sub6;) werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (3X) gewaschen. Zu jedem der Reaktionsgefäße wird TFA : H&sub2;O : CH&sub2;Cl&sub2; im Verhältnis 90 : 5 : 5 zugegeben und die Gefäße für 120 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird aus den Reaktionsgefäßen in einzelne Röhren filtriert. Die Harz-Aliquote werden mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) und MeOH (2X) gewaschen und die Filtrate in die einzelnen Röhren hinein zusammengeführt. Die einzelnen Röhren werden in vacuo eingedampft, was die Verbindungen IX&sub1;&submin;&sub3;&sub6; liefert.
Schritt J. Jede der freien Carbonsäure IX&sub1;&submin;&sub3;&sub6; wird in DMF gelöst. Zu jeder Lösung wird Pyridin (1,05 Äq.) zugegeben, gefolgt von Tetrafluorphenyltrifluoracetat (1,1 Äq.). Die Mischungen werden für 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungen werden mit EtOAc verdünnt, mit 5% wäßrigem NaHCO&sub3; (3X) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und in vacuo eingedampft, was die Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; liefert.

BEISPIEL 6

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;-LYS(&epsi;-iNIP)-NBA-TFP

Fig. 4 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine direkte Bindung zwischen Lh und L² ist, wobei Lh direkt mit dem aromatischen Ring der L²-Gruppe verknüpft ist, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R&sub1;&submin;&sub3;&sub6; mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über jede der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet ist, eingeführt werden können) durch die α- Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrieverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die &epsi;-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf Fig. 4:
Schritt A. NovaSyn-HMP-Harz wird mit Verbindung I (NBA hergestellt gemäß dem Verfahren von Brown et al., Molecular Diversity, 1,4 (1995)) gemäß dem in Schritt A von Beispiel 5 beschriebenen Verfahren gekoppelt, um Verbindung II zu ergeben.
Schritte B-J. Das Harz (Verbindung II) wird behandelt, wie beschrieben in den Schritten B-J von Beispiel 5, um die Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; zu ergeben.

BEISPIEL 7

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL iNIP-LYS(&epsi;-R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;)-ANP-TFP

Fig. 5 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R&sub1;&submin;&sub3;&sub6; mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über jede der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die &epsi;-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N-Methylisonipecotinsäure) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf Fig. 5:
Schritte A-C. Dieselben wie in Beispiel 5.
Schritt D. Das Harz (Verbindung IV) wird mit Piperidin behandelt, wie in Schritt B von Beispiel 5 beschrieben, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt E. Das α-Amin ohne Schutzgruppe auf dem Harz in Schritt D wird mit N- Methylisonipecotinsäure gekoppelt, wie beschrieben in Schritt C von Beispiel 5, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt F. Derselbe wie in Beispiel 5.
Schritt G. Das Harz (Verbindungen VI&sub1;&submin;&sub3;&sub6;) wird behandelt mit Palladium, wie beschrieben in Schritt D von Beispiel 5, um die Aloc-Gruppe zu entfernen.
Schritte H-J. Die Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden auf dieselbe Art und Weise hergestellt wie in Beispiel 5.

BEISPIEL 8

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;-GLU(γ-DIAEA)-ANP-TFP

Fig. 6 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbidnungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die α-Carbonsäuregruppe von Glutaminsäure mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R&sub1;&submin;&sub3;&sub6; mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über eine der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe der Glutaminsäure gebunden ist, während eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über 2-(Diisopropylamino)ethylamin) durch die γ-Carbonsäure der Glutaminsäure gebunden ist.
Bezug nehmend auf Fig. 6:
Schritte A-B. Dieselben wie in Beispiel 5.
Schritt C. Das Harz ohne Schutzgruppe (Verbindung III) wird an Fmoc-Glu-(OAl)-OH unter Verwendung des Kopplungsverfahrens, das in Schritt C von Beispiel 5 beschrieben ist, gekoppelt, um Verbindung IV zu ergeben.
Schritt D. Der Allylester auf dem Harz (Verbindung IV) wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) gewaschen und mit einer Lösung von (PPh&sub3;)&sub4;Pd(0) (0,3 Äq.) und N-Methylanilin (3 Äq.) in CH&sub2;Cl&sub2; vermischt. Die Mischung wird für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X) gewaschen. Der Palladiumschritt wird wiederholt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (2X), N,N- Diisopropylethylammoniumdiethyldithiocarbamat in DMF (2X), DMF (2X) gewaschen, um Verbindung V zu ergeben.
Schritt E. Das Harz ohne Schutzgruppe aus Schritt D wird in DMF suspendiert und durch Vermischen mit HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) aktiviert. Die Gefäße werden für 15 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (1X) gewaschen. Das Harz wird mit 2-(Diisopropylamino)ethylamin (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) vermischt. Die Gefäße werden für 1 Stunde geschüttelt. Die Kopplung von 2-(Diisopropylamino)ethylamin an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung VI zu ergeben.
Schritte F-J. Dieselben wie in Beispiel 5.

BEISPIEL 9

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;-LYS(&epsi;-iNIP)-ANP-LYS(&epsi;-NH&sub2;)-NH&sub2;

Fig. 7 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein Amin ist (genauer die &epsi;-Aminogruppe einer von Lysin abgeleiteten Einheit), L² eine ortho-Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Carboxamido-substituierte Alkylenaminoacylalkylen-Gruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe von Lysin mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, und eine Komponente R&sub1;&submin;&sub3;&sub6; mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über eine der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des Lysins gebunden ist, während eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N- Methylisonipecotinsäure) durch die &epsi;-Aminogruppe des Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf Fig. 7:
Schritt A. Fmoc-Lys(Boc)-SRAM-Harz (erhältlich von ACT; Verbindung I) wird mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 5 min geschüttelt. Das Harz wird filtriert, dann mit 25% Piperidin in DMF vermischt und für 10 min geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt, das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen und direkt in Schritt B verwendet.
Schritt B. Das Harz (Verbindung II), ANP (erhältlich von ACT; 3 Äq.), HATU (3 Äq.) und NMM (7,5 Äq.) in DMF werden zugegeben und das Sammelgefäß für 1 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz mit NMP (2X), MeOH (2X) und DMF (2X) gewaschen. Die Kopplung von I an das Harz und die Waschschritte werden wiederholt, um Verbindung III zu ergeben.
Schritte C-J. Das Harz (Verbindung III) wird behandelt wie in den Schritten B-I in Beispiel 5, um die Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; zu ergeben.

BEISPIEL 10

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;-LYS(&epsi;-TFA)-LYS(&epsi;-INP)-ANP-TFP

Fig. 8 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = Lh), wobei Lh ein aktivierter Ester ist (genauer Tetrafluorphenylester), L² eine ortho- Nitrobenzylamin-Gruppe ist, wobei L³ eine Methylengruppe ist, die Lh und L² verknüpft, T eine modulare Struktur hat, wobei die Carbonsäuregruppe eines ersten Lysins mit dem Stickstoffatom der L²-Benzylamin-Gruppe verknüpft worden ist, um eine Amidbindung zu bilden, eine Massenspektrometrieempfindlichkeitsverstärkergruppe (eingeführt über N- Methylisonipecotinsäure) durch die &epsi;-Aminogruppe des ersten Lysins gebunden ist, ein zweites Lysinmolekül mit dem ersten Lysin über die α-Aminogruppe des ersten Lysins verknüpft worden ist, eine Gruppe zur Einstellung der relativen Molekülmasse (mit einer Trifluoracetylstruktur) durch die &epsi;-Aminogruppe des zweiten Lysins gebunden ist und eine Komponente R&sub1;&submin;&sub3;&sub6; mit variabler Masse (wobei diese R-Gruppen T² entsprechen, wie hierin definiert, und über eine der spezifischen Carbonsäuren, die hierin aufgelistet sind, eingeführt werden können) durch die α-Aminogruppe des zweiten Lysins gebunden ist.
Bezug nehmend auf Fig. 8:
Schritte A-E. Diese Schritte sind identisch mit den Schritten A-E in Beispiel 5.
Schritt F. Das Harz (Verbindung VI) wird mit Piperidin behandelt wie beschrieben in Schritt B in Beispiel 5, um die FMOC-Gruppe zu entfernen.
Schritt G. Das Harz ohne Schutzgruppe (Verbindung VII) wird an Fmoc-Lys(Tfa)-OH unter Verwendung des Kopplungsverfahrens, das in Schritt C von Beispiel 5 beschrieben ist, gekoppelt, um Verbindung VIII zu ergeben.
Schritte H-K. Das Harz (Verbindung VIII) wird behandelt, wie in den Schritten F-J in Beispiel 5, um die Verbindungen XI&sub1;&submin;&sub3;&sub6; zu ergeben.

BEISPIEL 11

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;-LYS(&epsi;-iNIP)-ANP-5'-AH-ODN

Fig. 9 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = MOI, wobei MOI ein Nukleinsäurefragment ist, ODN), abgeleitet von den Estern von Beispiel 5 (dasselbe Verfahren könnte bei anderen T-L-X-Verbindungen verwendet werden, in denen X ein aktivierter Ester ist). Das MOI ist an T-L durch das 5'-Ende des MOIs konjugiert, über eine Phosphodiester-Alkylenamin-Gruppe.
Bezug nehmend auf Fig. 9:
Schritt A. Die Verbindungen XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden hergestellt gemäß einem modifizierten Biotinylierungsverfahren in Van Ness et al., Nuleic Acids Res., 19, 3345 (1991). Zu einer Lösung eines der 5'-Aminohexyl-Oligonukleotide (Verbindungen XI&sub1;&submin;&sub3;&sub6;, 1 mg) in 200 mM Natriumborat (pH 8,3, 250 ml) wird einer der Tetrafluorphenylester zugegeben (Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; aus Beispiel A, 100-facher molarer Überschuß in 250 ml NMP). Die Reaktion wird über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die nicht-umgesetzten und hydrolysierten Tetrafluorphenylester werden von den Verbindungen XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; durch Sephadex- G-50-Chromatographie getrennt.

BEISPIEL 12

HERSTELLUNG EINES SATZES VON VERBINDUNGEN DER FORMEL R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;-LYS(&epsi;-iNIP)-ANP-LYS(&epsi;-(MCT-5'-AH-ODN))-NH&sub2;

Fig. 10 veranschaulicht die parallele Synthese eines Satzes von 36 T-L-X-Verbindungen (X = MOI, wobei MOI ein Nukleinsäurefragment ist, ODN), abgeleitet von den Aminen von Beispiel 11 (dasselbe Verfahren könnte bei anderen T-L-X-Verbindungen verwendet werden, in denen X ein Amin ist). Das MOI ist an T-L durch das 5'-Ende des MOIs konjugiert, über eine Phosphodiester-Alkylenamin-Gruppe.
Bezug nehmend auf Fig. 10:
Schritt A. Die 5'-[6-(4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-2-ylamino)hexyl]-Oligonukleotide XIII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden hergestellt wie beschrieben in Van Ness et al., Nucleic Acids Res., 19, 3345 (1991).
Schritt B. Zu einer Lösung eines der 5'-[6-(4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-2-ylamino)hexyl]- Oligonukleotide (Verbindungen XII&sub1;&submin;&sub3;&sub6;) in einer Konzentration von 1 mg/ml in 100 mM Natriumborat (pH 8,3) wurde ein 100-facher molarer Überschuß eines primäre Amins zugegeben, das ausgewählt ist aus R&sub1;&submin;&sub3;&sub6;-Lys(&epsi;-iNIP)-ANP-Lys(&epsi;-NH&sub2;)-NH&sub2; (Verbindungen X&sub1;&submin;&sub3;&sub6; aus Beispiel 11). Die Lösung wird über Nacht bei Umgebungstemperatur gemischt. Das nicht-umgesetzte Amin wird durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einem 3.000 MG- Schnitt (Amicon, Beverly, MA) unter Verwendung von H&sub2;O als der Waschlösung (3X) entfernt. Die Verbindungen XIII&sub1;&submin;&sub3;&sub6; werden durch Verringerung des Volumens auf 100 ml isoliert.

BEISPIEL 13

DEMONSTRATION DES GLEICHZEITIGEN NACHWEISES MEHRERER MARKIERUNGEN DURCH MASSENSPEKTROMETRIE

Dieses Beispiel liefert eine Beschreibung der Fähigkeit, mehrere Verbindungen (Markierungen) durch Massenspektrometrie gleichzeitig nachzuweisen. In diesem besonderen Beispiel werden 31 Verbindungen mit einer Matrix vermischt, auf einem festen Träger abgeschieden und getrocknet und anschließend mit einem Laser desorbiert. Die resultierenden Ionen werden anschließend in einen Massenspektrometer eingeführt.
Die folgenden Verbindungen (bezogen von Aldrich, Milwaukee, WI) werden auf einer äquimolaren Basis auf eine Endkonzentration von 0,002 M (pro Verbindung) zusammengemischt: Benzamid (121,14), Nicotinamid (122,13), Pyrazinamid (123,12), 3- Amino-4-pyrazolcarbonsäure (127,10), 2-Thiophencarboxamid (127,17), 4-Aminobenzamid (135,15), Tolumid (135,17), 6-Methylnicotinamid (136,15), 3-Aminonicotinamid (137,14), Nicotinamid-N-Oxid (138,12), 3-Hydropicolinamid (138,13), 4-Fluorbenzamid (139,13), Zimtsäureamid (147,18), 4-Methoxybenzamid (151,17), 2,6-Difluorbenzamid (157,12), 4- Amino-5-imidazolcarbonsäureamid (162,58), 3,4-Pyridindicarbonsäureamid (165,16), 4- Ethoxybenzamid (165,19), 2,3-Pyrazindicarboxamid (166,14), 2-Nitrobenzamid (166,14), 3- Fluor-4-methoxybenzoesäure (170,4), Indol-3-acetamid (174,2), 5-Acetylsalicylamid (179,18), 3,5-Dimethoxybenzamid (181,19), 1-Naphthalinacetamid (185,23), 8-Chlor-3,5- diamino-2-pyrazincarboxyamid (187,59), 4-Trifluormethylbenzamid (189,00), 5-Amino-5- phenyl-4-pyrazolcarboxamid (202,22), 1-Methyl-2-benzylmalonamat (207,33), 4-Amino- 2,3,5,6-tetrafluorbenzamid (208,11), 2,3-Naphthalindicarbonsäure (212,22). Die Verbindungen werden in der oben beschriebenen Konzentration in DMSO gegeben. Ein ul des Materials wird dann mit Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix (nach einer 1 : 10.000- Verdünnung) vermischt und auf einem festen Träger aus rostfreiem Stahl abgeschieden.
Das Material wird anschließend mit einem Laser unter Verwendung des Protein-TOF- Massenspektrometers (Bruker, Manning Park, MA) desorbiert und die resultierenden Ionen werden in sowohl dem linearen als auch dem Reflektron-Betriebsmodus gemessen. Die folgenden m/z-Werte werden beobachtet (Fig. 11):
121,1 → Benzamid (121,14)
122,1 → Nicotinamid (122,13)
123,1 → Pyrazinamid (123,12)
124,1
125,2
127,3 → 3-Amino-4-pyrazolcarbonsäure (127,10)
127,2 → 2-Thiophencarboxamid (127,17)
135,1 → 4-Aminobenzamid (135,15)
135,1 → Tolumid (135,17)
136,2 → 6-Methylnicotinamid (136,15)
137,1 → 3-Aminonicotinamid (137,14)
138,2 → Nicotinamid-N-oxid (138,12)
138,2 → 3-Hydropicolinamid (138,13)
139,2 → 4-Fluorbenzamid (139,13)
140,2
147,3 → Zimtsäureamid (147,18)
148,2
149,2
4-Methoxybenzamid (151,17)
152,2
2,6-Difluorbenzamid (157,12)
158,3
4-Amino-5-imidazolcarbonsäureamid (162,58)
163,3
165,2 → 3,4-Pyridindicarbonsäureamid (165,16)
165,2 → 4-Ethoxybenzamid (165,19)
166,2 → 2,3-Pyrazindicarboxamid (166,14)
166,2 → 2-Nitrobenzamid (166,14)
3-Fluor-4-methoxybenzoesäure (170,4)
171,1
172,2
173,4
Indol-3-acetamid (174,2)
178,3
179,3 → 5-Acetylsalicylamid (179,18)
181,2 → 3,5-Dimethoxybenzamid (181,19)
182,2 →
1-Naphthalinacetamid (185,23)
186,2
8-Chlor-3,5-diamino-2-pyrazincarbonsäureamid (187,59)
188,2
189,2 → 4-Trifluormethylbenzamid (189,00)
190,2
191,2
192,3
5-Amino-5-phenyl-4-pyrazolcarboxamid (202,22)
203,2
203,4
1-Methyl-2-benzylmalonamat (207,33)
4-Amino-2,3,5,6-tetrafluorbenzamid (208,11)
212,2 → 2,3-Naphthalindicarbonsäure (212,22).
219,3
221,2
228,2
234,2
237,4
241,4
Daten zeigen, daß 22 von 31 Verbindungen im Spektrum mit der vorhergesagten Masse erschienen, 9 von 31 Verbindungen im Spektrum mit einer n + H-Masse (1 Atommasseneinheit, amu) über der vorhergesagten Masse erschienen. Das letztere Phänomen beruht wahrscheinlich auf der Protonierung eines Amins in den Verbindungen. Daher werden 31 von 31 Verbindungen mit MALDI-Massenspektroskopie nachgewiesen. Noch wichtiger ist, daß das Beispiel zeigt, daß mehrere Markierungen gleichzeitig mit einem spektroskopischen Verfahren nachgewiesen werden können.
Die Alpha-Cyano-Matrix allein (Fig. 11) ergab Peaks bei 146,2, 164,1, 172,1, 173,1, 189,1, 190,1, 191,1, 192,1, 212,1, 224,1, 228,0, 234,3. Weitere identifizierte Massen im Spektrum beruhen auf Verunreinigungen in den gekauften Verbindungen, da keine Anstrengungen unternommen wurden, die Verbindungen weiter zu reinigen.

BEISPIEL 14

MIKROSATELLITEN-MARKER: PCR-AMPLIFIKATIONEN.

Die Mikrosatelliten-Marker werden amplifiziert unter Verwendung der folgenden Standard- PCR-Bedingungen. Kurz gesagt, werden PCR-Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 50 ul durchgeführt, das 40 ng genomische DNA, 50 umol von jedem Primer, 0,125 mM dNTPs und 1 Einheit Taq-Polymerase enthält. 1X-Amplifikationspuffer enthält 10 mM Tris-Base, pH 9,50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Triton X-100 und 0,01% Gelatine. Die Reaktionen werden unter Verwendung eines "Heißstart"-Verfahrens durchgeführt: Taq-Polymerase wird erst nach einem ersten Denaturierungsschritt von 5 Minuten bei 96ºC zugegeben. Amplifikation wird über 35 Zyklen durchgeführt: Denaturierung (94ºC für 40 s) und Annealing (55ºC für 30 s). Ein Verlängerungsschritt (72ºC für 2 Minuten) beendet das Verfahren nach dem letzten Annealing. Da die Amplifikationsprodukte, die erhalten werden sollen, kurz sind (90 bis 350 Basenpaare lang) und das Zeitintervall, um die Temperatur von 55ºC auf 94ºC anzuheben (erhalten mit einer Anstiegsgeschwindigkeit von 1ºC/Sekunde), lang genug ist, kann die Vervollständigung der DNA-Verlängerung ohne einen Schritt bei 72ºC erreicht werden.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Nukleinsäuremoleküls, welches umfaßt:

a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem oder mehreren ausgewählten Target-Nukleinsäuremolekülen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Nukleinsäurefragment korrelativ und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist;

b) Abtrennen besagter markierter Moleküle nach Größe;

c) Abspalten besagter Markierung von besagtem markiertem Molekül; und

d) Nachweisen besagter Markierung durch Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Vorhandenseins besagten Nukleinsäuremoleküls daraus.

2. Verfahren zum Nachweisen eines ausgewählten Nukleinsäuremoleküls, welches umfaßt:

a) Kombinieren eines markierten Nukleinsäuresonde mit Target-Nukleinsäuremolekülen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung besagter markierter Nukleinsäuresonde an eine komplementäre ausgewählte Target-Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen, wobei besagte markierte Nukleinsäuresonde eine Markierung umfaßt, die mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachweisbar ist;

b) Verändern der Größe besagter hybridisierter markierter Sonden, der Größe nicht-hybridisierter Sonden oder Target-Moleküle oder der Größe der Sonden:Target-Hybride;

c) Abtrennen der markierten Sonden nach Größe;

d) Abspalten besagter Markierung von besagter markierter Sonde; und

e) Nachweisen besagter Markierung durch Spektrometrie oder Potentiometrie und Nachweisen besagten ausgewählten Nukleinsäuremoleküls daraus.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Markierung durch Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Ultraviolettspektrometrie oder potentiostatische Amperometrie erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als 4 markierte Nukleinsäurefragmente erzeugt werden und daß jede Markierung einzigartig für ein ausgewähltes Nukleinsäurefragment ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-3, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als 4 markierte Nukleinsonden verwendet werden und daß jede Markierung einzigartig für eine ausgewählte Nukleinsäuresonde ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Target-Nukleinsäuremolekül durch Primer-Extension erzeugt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe besagter hybridisierter markierter Sonden, nicht-hybridisierter Sonden oder Target- Moleküle oder Sonden:Target-Hybride mit einem Verfahren verändert wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Polymerase-Extension, Ligation, Exonuklease- Verdauung und Endonuklease-Verdauung besteht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle mit einem Verfahren abgetrennt werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Mikrokanalelektrophorese, HPLC, Ausschlußchromatographie und Filtration besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle mit einem Verfahren gespalten werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Oxidations-, Reduktions-, säurelabilen, basenlabilen, enzymatischen, elektrochemischen, thermischen und fotolabilen Verfahren besteht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Markierung durch Flugzeit-Massenspektrometrie, Quadrupol-Massenspektrometrie, Magnetsektor-Massenspektrometrie und Elektrosektor-Massenspektrometrie nachgewiesen wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Markierung durch potentiostatische Amperometrie unter Verwendung von Detektoren nachgewiesen wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus coulometrischen Detektoren und amperometrischen Detektoren besteht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen in einer kontinuierlichen Art und Weise durchgeführt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen in einer kontinuierlichen Art und Weise auf einer einzigen Vorrichtung durchgeführt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen automatisiert sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle oder Sonden aus nicht-3'-markierten Oligonukleotidprimern erzeugt werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle oder Sonden aus markierten Didesoxynukleotidterminatoren erzeugt werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, 4-9 und 12-16, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Markierung durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen wird.

18. Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus, welches umfaßt:

a) Erzeugen markierter Nukleinsäuremoleküle aus einem ausgewählten Target- Molekül, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann;

b) Abtrennen besagter markierter Moleküle nach Größe;

c) Abspalten besagter Markierung von besagtem markierten Molekül; und

d) Nachweisen besagter Markierung durch Spektrometrie oder Potentiometrie und Bestimmen des Genotyps besagten Organismus daraus.

19. Verfahren zum Genotypisieren eines ausgewählten Organismus, welches umfaßt:

a) Kombinieren eines markierten Nukleinsäuremoleküls mit einem ausgewählten Target-Molekül unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung besagten markierten Moleküls an besagtes Target- Molekül zu ermöglichen, wobei eine Markierung mit einem bestimmten Fragment korrelativ ist und durch Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen werden kann;

b) Abtrennen besagten markierten Moleküls nach Größe;

c) Abspalten besagter Markierung von besagtem markierten Molekül; und

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle aus einem Pool von Klonen erzeugt werden, ausgewählt aus der Gruppe, die aus genomischen Klonen, cDNA-Klonen und RNA-Klonen besteht.

21. Verfahren nach Ansprüchen 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle durch Polymerasekettenreaktion erzeugt werden.

22. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Target- Nukleinsäuremolekül durch Primer-Extension erzeugt wird.

23. Verfahren nach Ansprüchen 18-22, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Markierung durch Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Ultraviolettspektrometrie oder potentiostatische Amperometrie erfolgt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-23, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als 4 markierte Nukleinsäuremoleküle erzeugt werden und daß jede Markierung einzigartig für ein ausgewähltes Nukleinsäurefragment ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-24, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle mit einem Verfahren abgetrennt werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Mikrokanalelektrophorese, HPLC, Ausschlußchromatographie und Filtration besteht.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-25, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle mit einem Verfahren gespalten werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Oxidations-, Reduktions-, säurelabilen, baselabilen, enzymatischen, elektrochemischen, thermischen und fotolabilen Verfahren besteht.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-26, dadurch gekennzeichnet, daß Markierung durch Flugzeit-Massenspektrometrie, Quadrupol-Massenspektrometrie, Magnetsektor- Massenspektfometrie und Elektrosektor-Massenspektrometrie nachgewiesen wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-26, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Markierung durch potentiostatische Amperometrie unter Verwendung von Detektoren nachgewiesen wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus coulometrischen Detektoren und amperometrischen Detektoren besteht.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-28, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen in einer kontinuierlichen Art und Weise durchgeführt werden.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-29, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen in einer kontinuierlichen Art und Weise auf einer einzigen Vorrichtung durchgeführt werden.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-30, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte Abtrennen, Spalten und Nachweisen automatisiert sind.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-31, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle aus nicht-3'-markierten Oligonukleotidprimern erzeugt werden.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-31, dadurch gekennzeichnet, daß besagte markierte Moleküle aus markierten Didesoxynukleotidterminatoren erzeugt werden.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-33, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Target-Molekül aus einer biologischen Probe erhalten wird.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-34, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Markierung durch Nicht-Fluoreszenz-Spektrometrie oder Potentiometrie nachgewiesen wird.

36. Zusammensetzung, die mehrere Verbindungen der Formel:

Tms-L-MOI

umfaßt, in der

Tms eine durch Massenspektrometrie nachweisbare organische Gruppe ist, die Kohlenstoff, wenigstens eines von Wasserstoff und Fluorid und fakultative Atome umfaßt, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Iod;

L eine organische Gruppe ist, die ermöglicht, eine einzigartige Tms-enthaltende Einheit vom Rest der Verbindung abzuspalten, wobei die Tms-enthaltende Einheit eine funktionelle Gruppe umfaßt, die einen einzigen ionisierten Ladungszustand unterstützt, wenn die Verbindung Massenspektrometrie unterworfen wird, und ausgewählt ist aus tertiärem Amin, quartärem Amin und organischer Säure;

MOL (interessierendes Molekül) ein Nukleinsäurefragment ist; und wobei wenigstens zwei Verbindungen dieselbe Tms aufweisen, aber die MOI-Gruppen dieser Moleküle nicht-identische Nukleotidlängen haben, wobei die MOI-Fragmente nicht mit demselben wie Didesoxynukleotid enden, das ausgewählt ist aus ddAMP, ddCMP, ddGMP und ddTMP.

37. Zusammensetzung, die eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel:

Tms-L-MOI

umfaßt, in der

MOI ein Nukleinsäurefragment ist; und

wobei wenigstens zwei Verbindungen dieselbe Tms aufweisen, aber diese Verbindungen nicht-identische Elutionszeiten haben, gemessen mit HPLC unter Verwendung einer Säule aus nicht-porösen 2,3 um großen Poly(styrol-divinylbenzol)- C&sub1;&sub8;-Teilchen und wäßrigen Puffers, der 100 mM Triethylammoniumacetat umfaßt.

38. Zusammensetzung, die eine Mehrzahl von Verbindungen der Formel:

Tms-L-MOI

umfaßt, in der

MOI ein Nukleinsäurefragment ist; und

wobei nicht zwei Verbindungen, die dieselbe MOI-Nukleotidlänge aufweisen, auch dasselbe Tms aufweisen.

39. Eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36-38, dadurch gekennzeichnet, daß die Mehrzahl mehr als 2 ist.

40. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36-38, dadurch gekennzeichnet, daß die Mehrzahl mehr als 4 ist.

41. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36-40, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurefragment eine zu einem Abschnitt eines Vektors komplementäre Sequenz aufweist, wobei das Fragment zum Priming der Polynukleotidsynthese in der Lage ist.

42. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36-41, dadurch gekennzeichnet, daß die Tms-Gruppen von Mitgliedern der Mehrzahl sich um wenigstens 2 amu unterscheiden.

43. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36-41, dadurch gekennzeichnet, daß die Tms-Gruppen von Mitgliedern der Mehrzahl sich um wenigstens 4 amu unterscheiden.

44. Zusammensetzung, die eine Mehrzahl von Sätzen von Verbindungen umfaßt, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel:

Tms-L-MOI

hat, in der

MOI ein Nukleinsäurefragment ist; und

Mitglieder in einem ersten Satz von Verbindungen identische Tms-Gruppen haben, jedoch nicht-identische MOI-Gruppen mit unterschiedlichen Zahlen von Nukleotiden im MOI haben und es wenigstens zehn Mitglieder im ersten Satz gibt, wobei zwischen Sätzen die Tms-Gruppen sich um wenigstens 2 amu unterscheiden.

45. Zusammensetzung nach Anspruch 44, wobei die Mehrzahl wenigstens 3 ist.

46. Zusammensetzung nach Anspruch 44, wobei die Mehrzahl wenigstens 5 ist.

47. Zusammensetzung, die eine Mehrzahl von Sätzen von Verbindungen umfaßt, wobei jeder Satz von Verbindungen die Formel:

Tms-L-MOI

hat, in der

MOI ein Nukleinsäurefragment ist; und

wobei Verbindungen in einem Satz nicht-identische Tms-Gruppen aufweisen, aber diese dieselben Elutionszeiten haben, gemessen mit HPLC unter Verwendung einer Säule aus nicht-porösen 2,3 um großen Poly(styrol-divinylbenzol)-C&sub1;&sub8;-Teilchen und wäßrigen Puffers, der 100 mM Triethylammoniumacetat umfaßt.

48. Kit zum Genotypisieren, der eine Mehrzahl von Amplifikationsprimerpaaren umfaßt, wobei wenigstens einer der Primer die Formel hat:

Tms-L-MOI

in der

MOI ein Nukleinsäurefragment ist; und

jedes Primerpaar mit einem unterschiedlichen Locus assoziiert.

49. Kit nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß die Mehrzahl wenigstens 3 ist.

50. Kit nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß die Mehrzahl wenigstens 5 ist.