CZ228598A3 - Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění - Google Patents

Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění Download PDF

Info

Publication number
CZ228598A3
CZ228598A3 CZ982285A CZ228598A CZ228598A3 CZ 228598 A3 CZ228598 A3 CZ 228598A3 CZ 982285 A CZ982285 A CZ 982285A CZ 228598 A CZ228598 A CZ 228598A CZ 228598 A3 CZ228598 A3 CZ 228598A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
labeled
group
nucleic acid
moi
component
Prior art date
Application number
CZ982285A
Other languages
English (en)
Inventor
Ness Jeffrey Van
John C. Tabone
Jeffry J. Howbert
John T. Mulligan
Original Assignee
Rapigene, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rapigene, Inc. filed Critical Rapigene, Inc.
Publication of CZ228598A3 publication Critical patent/CZ228598A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Description

Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění·
Oblast techniky
Tento vynález se obecně týká způsobů a kompozic pro analyzování molekul nukleových kyselin, přesněji řečeno radioaktivně značených částí, kterých lze využít při velkém poctu různých reakcí nukleových kyselin, kde je požadováno dělení molekul nukleových kyselin na podkladě jejich třídění.
Dosavadní stav techniky
Detekce a analýza molekul nukleových kyselin patří mezi nejdůležitější postupy v biologii. Takové postupy lze označit jako nepostradatelný střed molekulární biologie a hrají prudce se rozšiřující úlohu ve zbývající Části biologie.
Obecně řečeno je jedním typem analyzy reakcí nukleových kyselin dělení molekul nukleových kyselin v závislosti na jejich délce0 Tak například jest jedním z široce používaných technologických postupů polymerasová řetězová reakce (PGR, polymerase chain reaction, viz US pat.spis 4 683 195, 4 683 202 a 4 800 159). Tento postup je velmi zhusta používanou technikou jak k identifikování sekvencí v tom Či onom vzorku, tak i k syntetizování molekul DNA pro dgilší zaobcháze· ni,
Krátce řečeno sekvence PGR a DNA dále produkovány enzymovými reakcemi, jimiž se syntetizují nové řetězce DNA buď geometrickým, nebo lineárním způsobenu Po produkci je třeba zjistit a identifikovat DNA-sekvence. S přihlédnutím k ne-speoifičnosti produkce - což by i nadále komplikovalo analýzu zmatečnými výsledky, nebo se zřetelem na nutnou čistotu se produkty PCR-reakce zpravidla dělí před vlastní analýzou. Nejužitečnější informace se získávají dělením jež je založeno na řazení (tj.délcě produktů. Jako způsob nejspolehlivějšího dělení molekul nukleových kyselin lze označit dělení elektroforezou. Při tomto postupu se každá individuální PCR-reakce ve vhodném gelu vystaví účinku voltového potenciálu Počet vzorků, které lze takto vyhodnotit, je omezen počtem vlnek gélu. Za použití největšího počtu gélových zařízj.ení lze dělit asi 10 až 64 vzorků v jediném gelu. Takže zpracovávání velkého počtu vzorků je velmi svízelné jak z hlediska vynaložené práce, tak i z hlediska použitého materiálu,
Blektroforetické dělení je třeba kombinovat s určitým detekčním systémem, aby se získaly použitelné údaje. Na úseku nukleových kyselin využívají detekční systémy běžně a takřka výlučně vsunutá zbarvení či radioaktivní značení, méně běžněji neradioaktivní značení. Použití vsunutých barviv, jako je ethidiumbromid, je z hlediska použití jednoduché. Barvivo se přidá do gelové matrice během elektroforezy či po ní, gel se vsákne do roztoku, obsahujícího barvivo. Barvivo lze v některých případech přímo vizuálně vyhodnotit, ale častěji -a pro ethidiumbromid to platí obzvláště- se vystaví účinkům světelných paprsků (například ultrafialového záření), aby fluoreskovalo. Navzdory tomuto snadnému využití je spojeno použití s některými závažnými nevýhodami. Za prvé barviva nejsou příliš citlivá a je třeba použít velkého množství (hmotnostně) molekul nukleových kyselin, aby bylo možno sledovat produkt. Za druhé jsou barviva typicky mutagenní nebo karcinogenní.
Citlivější postup detekce - ve srovnání s barvivý -využívá radioaktivního (nebo neradioaktivního) značení. Typicky se buď radioznačený nukleotid nebo radioznačený primér zahrne do PCR-reakce. Po provedeném dělení se radiové značení vyhodnotí autoradiografií. Ačkoliv je tento postup citlivější, je detekce znevýhodněna omezeními ve spojitosti s filmem, jako je opakované selhání nebo nelinearita. Tyto nesnáze lze překonat zjištěním radioaktivního značení pomocí analyzy s fosforových zobrazením. Ale radioznačení má svá omezení z hlediska -3- • · • · • · > · #· ··· · * • ♦ · • · ·♦ požadavků na bezpečnost práce, dojde ke zvýšení využití zdrojů, je třeba speciálního zařízení a vyškolené obsluhy.
Právě z těchto důvodu použití neradioaktivního značení začíná nabývat na popularitě. V takových případech obsahují nukleotidy značení, jako je fluorofor, biotin nebo di-goxin, které lze zjistit použitím antilátky, nebo jako je nějaká jiná molekula (například jiný člen páru ligandů), který je značen enzymovou reakcí s chromogenním substrátem.
Tyto systémy nemají omezení z hlediska bezpečnosti práce, jak to bylo popsáno zde výše, ale použití různých složek je často labilní, může dojít k nespecifickým reakcím, výsledkem čehož je mohutné pozadí (tj. nízký poměr signálu k zvuku).
Tento vynál'ez popisuje nové kompozice a způsoby, jichž lze využít při četných reakcích nukleových kyselin a jsou zde ještě další, s tím spojené výhody.
Podstata vynálezu
Krátce řečeno, popisuje tento vynález kompozice a postupy, kterých lze využít pro nejrozmanitější reakce ligandových párů, kde se jeví být zajímavým dělení molekul, jako jsou molekuly nukleových kyselin a je žádoucí to provézt na základě jejich velikosti. Jako reprezentativní příklady postupů, které lze vylepšit proti popsaným zde, lze uvést PCR, diferenční zobrazení, RNA-otisky prstů, PCR-SSCP, Oligo-litační testy, způsoby nukleázového trávení (např.založené na exo- a endo-neukleázácz) a didesoxy-otisky prstů. Zde popisovaných postupů lze využit na četných úlecích, počítaje v to například vývoj sklinické diagnostiky, jakož i diagnostiky na základě výzkumů, stanovení polyraorfizmu a vývoj genetických map.
Podle jednoho z předmětů tohoto vynálezu se popisují postupy pro stanovení a určení identity molekuly nukleové kyseliny, zahrnující stupně a) připraví se značené molekuly nukleové kyseliny z jedné či více zvolených moelekul předmětných nukleových kyselin, přičemž značení je srovnatelné s tím či oním fragmentem nukleové kyseliny a zjistitelné nefluorescenční spektrometrií nebo poten- -4- «· ···* • · • · -4- «· ···* • · • ·
«··· ··· • · · * • t ·· » Ml I · • · · M ·· ciometrií, b) značené fragmenty se dělí dle jejich velikostí, c) odštěpí se značení ze značeného fragmentu, a d) zjistí se značení nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometrií a tím se zjistí a prokáže identita molekul nukleové kyseliny.
Podlé souběžného aspektu dle tohoto vynálezu se popisují způsoby zjištění zvolené molekuly nukleové kyseliny, zahrnující atupnš a) kombihování vzorků značené nukleové kyseliny s molekulami molekul zvolené nukleové kyseliny za podmínek a po dobu dostačující k hybridizování zvoleného vzorku nukleové kyseliny za vzniku sekvence komplementárně zvolené nukleové kyseliny, kde vzorek zvolené nukleové kyseliby je zjistitelný nefluoresr cenční spektrometrií nebo potenciometricky, b) pozmění se velikost vzorků hybridizovaných značení, něhybridizováných vzorků nebo zvolených molekul, nebo vzorků zvolených hybridů, c) oddělí se značené vzorky dle velikostí, &) odštěpí se značení ze značených vzorků, a e) zjistí se značení nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky a tím se zjistí molekula zvolené nukleocé kyseliny.
Podle dalšího aspektu dle tohoto vynálezu se popisují způsoby genotypování vyvolených organizmů, zahrnující stupně a) připraví se molekuly značené nukleové kyseliny z molekuly zvolené cílové nukleové kyseliny,, kde je značení souměřitelné s tím či oním případným fragmentem a lze je zjistit nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky, b) rozdělí se znavené molekuly dle sekvenční délky, c) odštěpí se znavní ze značené molekuly, a d) zjistí se značení nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky a tím se stanoví genotyp organizmu.
Podle ještě dalšího aspektu se popisují poszupy genotypování zvoleného organizmu, zahrnující stupně -5- ·· ♦ ··· ·· ···· ·· ·♦ • · ♦ ψ • ♦ ♦· • · · · · · • · · ·· ·· a) kombinuje se molekula značené nukleové kyseliby se zvolenou cílovou molekulou za podmínek a po dobu dostačující k průběhu hybridizace značené molekuly na zvolenou cílovou molekulu, kde zna^pení je souměřitelhé s tím či oním případným fragmentem a může být zjištěho nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky, b) rozdělí se značené fragmenty dle sekvenční délky, c) odštěpí se značení ze značeného fragmentu, a d) stanoví se značení nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky a tím se také stanoví genotyp organizmu. V rámci tohoto vynálezu je třeba rozumět, že "biologické vzorky" zahrnují nejen vaorky, získané z živých organizmů (například savců, ryb, bakterií, parazitů, virů, hub a pod.) nebo z bezprostředního okolí (například jako je vzduch, voda nebo pevné vzorky), ale také biologické materiály, které mohou být připraveny uměle nebo syntézami (jako jsou např, fagocytové sledy, sledy organických molekul, soustavy geno-mických klonů, klony cDNA, klony RNA a pod.). Jako názorné příklady biologických vzorků lze uvést biologické kapaliny (například krev, semenotok, cerebrální spinální kapalinu, moč), biologické buňky (například; rodové buňky, buňky B nebo T, jaterní buňky, fibroblasty a pod.), i biologické tkáně.
Posléze jako reprezentativní příklady organizmů, které lze gehotypovat, lze uvést kterýkoli z jednobuněčných nebo ví-cebuněčných organizmů, jako jsou tepltokrevní jedinci, savci nebo obratlovci (například: jako jsou lidé, šimpanzi, opice, koně, krávy, prasata,ovce, psi, kočky, krysy a myši, jakož i buňky kteréhokoli z uvedených tvorů), dále bakterie, parazity, viry, houby a rostliny. V rámci četných provedení výše uvedených postupů lze připravit vzorky nukleových kyselin a/nebo molekuly dle tohoto vynálezu například použitím ligandů, štěpením nebo prodloužením (například pomocí PCR reakce, tj. polymerázové řetězové reakce). Mezi další příbuzné aspekty vhorků nukleových kyselin nebo molekul lze uvést ty, které lze značit priméry oligonukleotidů, nikoli 3 -značených (najko jsou například 5značené oligonuk- -6-
• ·· ···· ·· ·· ·· · · · · · * * • t · t · · ·# • · · · · ♦ ···· · • · · · · · · • · · ·« · ·♦ ·· leotidové prigiéry nebo didesoxyhukleotidové koncovky, ¥ rámci dalších provedení dle tohoto vynálezu lze využít současně pro danou reakci 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200,-250, 300, 350, 400, 450 nebo nad 500 různých či totožných značených molekul, přičemž každé značení je jednotné pro molekulu zvolené nukleove kyseliny nebo její fragment, nebo vzorek, a lze je odděleně identifikovat.
Podle dalšího rysu tohoto vynálezu lze značení (jedno Či více) zjistit fluorometrií, hmotovou spektrometrií, infračervenou spektrometrií, ultrafialovou spektrometrií nebo potenciostatickou amperometrií (například za využití coulo-metrických nebo amperometrických detektorů). Jako reprezentativní příklady vhodných spektrometrických postupů lze uvést hmotovou spektrometrii na základě metody měření průletu, kvadrupolné hmotnostní spektrometrii, hmotnostní spektrometrii na úseku magnetického sektoru i elektrického sektoru. Specifická provedení takových postupů zahrnují iontovou zachycující hmotnostní spektrometrii, hmotnostní spektrometrii s ionizováním elektrosprejem, hmotností spektrometrii s iontovým sprejem, hmotnostní spektrometrii za kapalinového ionizování, spektrometrii za hmotnostního ionizování za atm.tlaku, hmotnostní spektrometrii elektronovou ionizací, hmotnostní spektrometrii za bombardování rychlými atomy, hmotnostní spektrometrii MA3DI, foto-ionizační hmotnostní spektrometrii za měření doby průletu, laser-ovou kapičkovou hmotnostní spektrometrií, hmotnostní spektrometrii MALDI-TOF, hmotnostní spektrometrii APCI, hmotnostní spektrometrii "nano-spray", hmotnostní spektrometrii mlžně rozprašované ionizace, hmotnostní spektrometrii v důsledku chemické ionnizace, rezonanční-ionizační hmotnostní spektrometrii, sekundářně-ionizační hmotnostní spektrometrii a hmotnostní spektrometrii tepelným rozprašováním.
Podle dalšího provedené tohoto vynálezu je možno zvolené cílové molekuly, hybridizované značené vzorky, nehybridizované vuorky nebo cílové molekuly, hybridy vzorků a cílových molekul nebo značené vzorky nukleových kyselin nebo molekul dělit od dalších molekul použitím postupů, jež se vyznačují odlišením velikosti «··♦ «··· «· · · · · ♦ ·· t · · · * ♦· • · ·· ·· · ··· · · • · · ♦ · ··· ···« ·#· ·♦ · ·· ·· -7- v molekul (bhd z hlediska lineárního uspořádání, nebo z hlediska třírozměrné velikosti)*Jako příklady takových postupů lze uvést gelovou elektrofořezu, kapilární elektroforezu, mikro-kanálkovou elektroforezu, vysokotlakovou kapalinovou chromato-grafii, chromátografii, vylučujídí dle velikosti, filtraci, polyakrylamidovou gelovou elektroforezu, kapalinovou chroma-tografii, vylučovací chromátografii na podkladu reverzní velikosti, iontově-výměnnou chromatografii, kapalinovou chromátografii v reverzní fázi, impulzovou elektroforezu, elektroforezu v obráceném poli, dialyzu a kapalinové kapičkové dělení, aktivované fluorescencí,. Jinak mohou být kýžené molekuly, hybridizované značené vzorky, nehybridizované vzorky či očekávané molekuly, dále hybridy vzorků a očekávaných cílených molekul nebo vzorky značených nukleových kyselin nebo molekuly vázány na pevný podklad, například dutá vlákna (Amicon Corporation, Danvers, Mass), kuličky (PólySciences, Warrington, Pa), magnetické kuličky (Robbin Scientific, Mountain View, Calf.) destičky, mističky nebo láhvičky (Corning Glass Works, Corning, N.Y.), sítovinu (Becton Dickin-son, Mountain View, Calf), síta a pevná vlákna (see Edelman a spol., US.pat spis 3 843 324, rovněž Kuroda a spol., U.S.pat.spis 4 416 777), membrány (Millipore Corp., Bedford, Mass) a lepivé tyčinky. Je-li prvý nebo druhý člen, nebo exponovaná Část nukleové kyseliny vázána na pevný podklad, pak za určitých provedení postupu dle tohoto vynálezu mohou zde popisované postupy zahrnovat další stupeň promývání pevného podkladu nevázaného materiálu. Y rámci dalších provedehí mohou molekuly značené nukleové kyseliny nebo vzorky být štěpeny takovými postupy, jako jsou postupy chemické, oxidační, redukční, ye zřetelem na la-bilitu v kyselém či alkalickém prostředí, enzymově, elektrochemicky, tepelně nebo fotolgbilními postupy. Y rámci dalších provedení mohou být stupně dělení, štěpení a detekce prováděny kontinuálně, například jedno jediné zařízeni může být automatizováno. -8- ·· · ·· ··*· ♦· ·» « t ·· · · · t 9 * t ·· · · · #··· • « · · ·· * ·· · · · • · t * ♦ · · · «· + · ·»· ·· * ·* ·♦ V rámci určitých provedení dle tohoto vynálezu může být velikost hybridizovaných značených vzorků, nehybridizo-vaných vzorků či cílených molekul nebo hybridů vzorku a cílené molekuly pozměněna postupem, zvoleným ze skupiny, kterou tvoří polymerázové prodloužení, ligace, exonukleázní digesce, endonukleázní digesce, restrikční enzymová digesce, místně-specifická rekombinázní digesce, ligace, neurčitá specifická nukleázní digesce,, methylačně-specifická nukleázní digesce, kovalentní navázání vzorku na cílovou sloučeninu a hybridizace.
Způsoby kompozic popisovaných zde lze využít na širokém úseku možných aplikací, což zahrnuje například identifikování PCR amplikonů, RNA-otisky prstů, diferenční display, jed noproudovou konformační polymorfní detekci, didesoxy-otisky prstů, restrikční mapování a restrikční fragmentově-délkový polymorfismus,DNA-otisky prstů, genotypování, zjištění mutace, testy oligonukleotidové ligace, specifické sekvenční ampli-fikace, to vše pro diagnostiku, soudní postupy, identifikování, rozvoj biologie, biologii jako takovou, molekulární medicinu, toxikologii, krmení zvířat*
Tyto a ještě další aspekty dle tohoto vynálezu budou jasně zřejmé s odkazem na falší podrobný popis a připojená vyobrazení. Dále pak jsou připojeny četné odkazy, kde se popisují podrobněji určité postupy či kompozice, například plasmidy atd, a jsou sem zahrnuty se zřetelem na úplnost.
Krátký popis vyobrazení.
Yyobr.l je schéma synthesy pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných značených vzorků dle hmotnostní spektroskopie k uvolení značených vzorků s karboxamidovou koncovou skupinou.
Vyobr02 je schéma synthesy pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných značených vzorků dle hmotnostní spektroskupie k uvolnění značených vzorků s koncovou karboxylovou skupinou.
Vyobr.3 až 6 i 8 popisuje schéma synthesy tetrafluorfe-nylesterů serie 36ti fotochemicky štěpitelných vzorků dle -9« 00 0 00 0000 00 00 á I ·· 0 0 · 0 0 0 0 0 « 0·· 0000 0 0000· 00000# φ 0 00· 000 0000 000 0* 0 0 0 0* hmotnostní spektroskopie0
Vyobr.7 popisuje schéma synthesy serie 36 fotochemicky štěpitelných vzorků, dle hmotnostní spektroskopie s koncovou aminoskupinou.
Vyobr,9 popisuje schéma synthesy 36 fotóchemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených oligonukleotidů, připravených z odpovídající serie 36 tetraf^luorfenylesterů fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených kyselin·.
Vyobr«10 popisuje synthesu 36 fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených oligonukleotidů, připravených z odpovídající serie 36 fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených vzorků s koncovou aminoskupinou.
Vyobr.11 znázorňuje současnou detekci většího počtu značených vzorků hmotnostní spektrometrií.
Vyobr.12 znázorňuje hmotnostní spektrogram samotné <NÚ*ky a n-ma tr ic e«
Vyobr.13 uvádí modulárně konstruovaný fragment značené nukleové kyseliny.
Podrobný popis vynálezu
Jak to zde již bylo výše uvedeno popisuje tento vynález kompozice a způsoby analyzování molekul nukleových kyselin, kde je žádoucí dělení molekul nukleových kyselin na základě jejich velikosti. Tento vynález umožňuje současnou detekci molekul, těšících se zájmu, což zahrnuje kyseliny nukleové a jejich fragmenty, proteiny, peptidy atd.
Pro usnadnění sledování souvislosti přihlášky s originálem jsou ponechána písmenná vyjádření, jež na Štěstí nekolidují se značkami prvků, takže v dalším textu
znamená značenou složku (tag component) znamená vazebnou složku (linker component), jíž je labilní vazba, nebo tato složka labilní vazbu obsahuje, a je buď molekula vlastního zájmu (MOI, molecule of inte rest) nebo funkční skupinová složka (L^), pomocí které je MOI navázána na T-L,
Krátce řečeno, jedním předmětem tohoto vynálezu jsou sloučeniny, kde molekula vlastního zájmu, nebo výchozí látka pro ni je vázána labilní vatbou či labilními vazbami na značenou látku. Lze tedy nazírat na sloučeniny dle tohoto vynálezu jako na látky obecného vzorce
vyjádřitelné lépe specifičtějšími vzorci
Z důvodů, které budou ještě detailněji dále probrány, serie sloučenin T—L-MOI mohou být účelově vystaveny podmínkám, jez způsobí rozrušeni labilní vazby nebá labilních vazeb, čímž se uvolní značená část od zbytku molekuly. Značená část se potom charakterizuje jedním- či více analytických postupů, čímž se dospeje přímo k informaci o struktuře značené části a (to je velice důlezite) nepřímo k informaci o identitě odpovídající látky MOI.
Jako jednoduchý názorný příklad reprezentativní molekuly dle tohoto vynalezu, kde L znamená přímou vazbu, lze odkázat ·· ·«·· • · • · • « · Μ ♦ · • ♦ * ♦ · ·# • · · · · • * ♦ · ·· -li na následující strukturu (i)
značená složka molekula interesantní sloučeniny V uvedené struktuře (i) znamená T póly cyklickou aromatickou částici, obsahující dusík a vázanou na karbonylovou skupinu, a X znamená MOI (a přesněji řečeno fragment nukleo-vé kyseliny se zakončením aminoskupinou), L pak znamená vazbu, tvořící amidovou skupinu. Amidová 'ir.agi&R. je labilní v porovnání sevazbami v části T , protože - jak to odborníci znají - lze amidovou skupinu chemicky čtěpit (rozrušit) v kyselém či alkalickém préstředí za podmínek, kdy zůstanou vazby ve složce T nedotčeny. Takže značená část (tj.produkt štěpehí, obsahující T) se může uvolnit takto: 0
značená část
Zbytek sloučeniny
Avšak vazebnou složkou L může být více než jedna přímá vazba, jak je to patrné z dalšího připojeného příkladu, kde je odkaz na jinou sloučeninu vzorce (ii) zde dále:
Je velmi dobře známo, že sloučeniny, obsahující o-nitro-benzylaminovou část (viz zarámovaná skupina atomů ve struktuře (ii) ) jsou fotolyticky nestálé a že je-li taková sloučenina vystavena účinkům aktinického záření specifikované vlnové délky, dojde k selektivnímu odštěpení benzylaminové vazby (viz silná vazba ve struktuře (ii). Takže struktura (ii) má tytéž skupiny či složky T a MOI, jako má struktura (i), ale vazebná skupina obsahuje větší počet atomů a vazeb, mezi nimiž je případná labilní vazba. Fotolyzou struktury (ii) se uvolňuje značená část T (tedy část obsahující T) od zbývající části sloučeniny, jak je to zachyceno zde dále.
značená část zbytek sloučeniny
Jsou tedy dle tohoto vynálezu dostupné sloučeniny, které za podmínek vhodného štěpehí podlehnou tomuto štěpení za uvolnění značené části od zbytku molekuly· Sloučeniny dle tohoto vynálezu lze popisovat výrazy značená část, část MOI (nebo ospovídající výchozí složka L^) a labilní vazba či vazby, čímž jsou spojeny obě skupiny dohromady* Jinak lze sloučeniny dle tohoto vynálezu popisovat citováním složek, ze kterých vznikly. Takže sloučeniny je možno definovat jako reakční produkt značené Části, vazebné složky a reakční složky MOI.
Značená složka z chemické složky (T^, Chemical handle) a variabilní složky (T .), takže reakční značená složka má vc obecný vzorec
Tvc~Th K objasnění tohoto názvosloví je třeba odkázat na strukturu (iii), jež znázorňuje reaktivní značenou složku, kterou lze využít při přípravě sloučenin struktury (ii)· Reaktivní značená složka struktury (iii) obsahuje variabilní značený podíl a manipulační složku, viz dále: ·· ·· ·♦·· ··
variabilní značený manipulační složka podíl
Ve struktuře (iii) představuje manipulační složka -C(=0)-A východisko pro reakci značné složky s vazebnou složkou za vzniku Částice T-L, Skupina "A" ve struktuře (iii) znamená,že karboxylová skupina je v chemicky aktivním stavu, takže je schopná reagovat s dalšími složkami. Skupinou nAů může být například skupina hydroxylová nebo pentafluorfenoxylová mezi četnými dalšími možnostmi. Vynález tedy zahrnuje velký počet značených složek, které lze vázat na variabilní značený podíl, jak to ještě bude zde podrobněji popisováno. Variabilní značený podíl je tedy částí "Tů ve vzorci T-L-X a bude tedy také částí značené složky, jež se vytvoří reakcí Štěpením L.
Jak to zde bude ještě podrobněji popisováno, je variabilní značený podíl takto označován proto, že při přípravě členů určitého seskuúení je žádoucí, aby měly jednotnou variabilní složku, takže lze jednotlivé členy takového seskupení rozlišit vzájemně od sebe analytickými postupy. Jako jeden z příkladů lze uvést, že variabilní značený podíl struktury (iii) může být jedním z členů dále uvedeného seskupení, kde lze členy tohoto seskupení rozlišit jejich ultrafialovými nebo hmotnostními spektryt
-15- • · • · ···· • · ·*·♦ t
·· ♦· I · · · I · ·· ··· · · • · · «t M
Podobně lze vazebnou složku popisovat použitím pojmů odpovídajícího chemického se chování (obvykle jsou nutné nejméně dvě, každá z nich může být označena jako L^), které jsou bočně na vazebné labilní složce, kde vazebná labilní složka sestává z nutné labilní složky (L ) a případně labilních složek (ϊΛ a L3), kde případné labilní podíly slouží účinně od oddělení L od manipulačních složsk a potřebná labilní složka slouží jako labilní vazba uvnitř vazebné labilní složky. Takže vazebná složka může mít obecný vzorec
Lh-L1-L2-L3-Lh
Zde používané názvosloví vazebné složky může být objasněno pohledem na strukturu vzorce (iv), jež je odvozena od struktury (ii): manipulační složka
(iv) manipulační složka
Jak to plyne ze strultury (iv), mohou atomy zastávat více než jednu funkční úlohu. Takže ve struktuře (iv) dusíkatá funkce benzylové skupiny může sloužit jako manipulační složka, umožňující vazebné složce napojení na značenou složku reakční tvorbou amidu, a pak slouží jako nutná část struktury labilní vazebné složky L2 tím, že ·· • t t ···«* · ·· ·· • · · # · ♦ • · · # · · • · · ··· · · • · · · · • t ♦ t* ·· ·» ···· • · -l6- vazba dusíku na uhlík benzylové skupiny je zvláště vhodná k fotolytickému štěpení. Struktura (iv) také ukazuje, že vazebná složka může mít skupinu Ir ( v tomto případě methylenovou skupinu), ačkoliv neobsahuje skupinu L^. Podobně může mít vazebná složka skupinu L , nikoli však L , nebo může 1 3 v obsahovat skupiny L a I, nebo nemít žádnou z nich. Ve struktuře (iv) přítomnost:' skupiny ΗΡ" v blízkosti karbonylové skupiny naznačuje, že karbonylová skupina je před reakcí chráněna. Za této konfigurace může aktivovaná karboxylová skupina značené složky (iii) reagovat čistě s aminoskupinou vazebné složky (iv) za vzniku amidové vazby a tedy látky vzorce T^L-L^o
Reakční složka MOI je vhodnou reaktivní formou předmětné molekuly. Je-li takovou molekulou fragment nukleové kyseliny, je vhodná reakční složka MOI fragmentem nukleové kyseliny, který je vázán 5 ^-hydroxylovou skupinou na fosfodi-esterovou skupinu a potom dále na alkylenový řetězec, končící aminoskupinou. Tato aminoskupina může potom reagovat s kar-bonylovou skupinou struktury (iv), pochopitelně po odstranění chránících funkcí karbonylové skupiny a s výhodou potom ještě aktivovat karbonylovou skupinu při reakci s aminoskupinou, takže se složka MOI naváže na vazebnou složku.
Vezme-li se v úvahu chronologické pořadí, pak z pohledu vynálezu se použije značená složka (obsahující značenou manipulační složku a značenou variabilní složku), vazebná složka (se dvěma chemickými manipulačními složkami, potřebnou labilní částí a s nulou až dvěma případně labilními částmi) a reakční složka MOI, obsahující molekulu předmětné zajímavé složky a chemickou molekulu manipulační složky) ke vzniku látky vzorce TJL-MOI. Takže při vzniku T-L-MOI buď reaguje značená složka nejprve s vazebnou složkou dohromady za vzniku T-L-L^» a potom s tímto seskupením reaguje MOI za vzniku T-LJMOI, nebo - a to je méně výhodné - reagují spolu nejprve vazebná složka a složka MOI za vzniku L^-L-MOI a další reakcí se značenou složkou se připraví T-L „MOI,
Pro pohodlí budouv.zde sloučeniny vzorce T-L-MOI popisovány výrazem značená složka, vazebná složka a reagens MOI, kterých -17- «· ···· • · · • · · I I · t • · · ·· · «· ·· • · t · • · ♦· • ··· · * • · · ♦ · ·· I259 použít pro přípravu takových látBkfochopitelně se může sloučenina či sloučeniny vzorce T-LJflOI připravovat jinými (obvykle pracnějšími) postupy a to vše spadá do rozsahu tohoto vynálezu. V každém případě se vynálezem dají získat sloučeánfcny vzorce T-L-MOI, které lze štěpit tak, že se značená složka uvolní od zbytku sloučeniny. Vazebná složka pak bude obsahovat nejméně značenou variabilní složku a báde typicky dále obsahovat některé nebo všechny atomy ze značené manipulační složky, některé nebo všechny atomy z vazebné manipulační složky, jež byla použita k navázání značené reakční složky na vazebnou složku, případně 1 bilní složku byla-li tato přítomná v T-L-MOI, a bude snad i obsahovat určitou část nutné labilní složky L v závislosti na přesné struktuře if a povaze chemického štěpení. Pro pohodlí značená složka se může označovat jako T-obsahující částice, protože T bude typicky představovat největší podíl (míněno hmotnostně) značené složky.
Po tomto výkladu jednoho aspektu dle tohoto vynálezu budou rlzné složky T, L a X popsány podrobněji. Tento popis začíná definováním určitých termínů, jak zde budou nadále použity při popisech T, L a X.
Jak je zde použij , výraz "fragment nukleové kyse liny” znamená molekulu, jež je doplňkem k vyvolené molekule značené nukleové kyseliny (to znamená doplňkem docela nebo určité její části) a může být odvozena od přírodních nebo synthetických či relcombinantně získaných molekul, čítaje v to i taftové, které se mezi přírodními látkami nevyskytují a může být v dvojitě nebo jednoduše navázané formě, jak se to hodí; zahrnuje tedy oligonukleotid (tedy DM či RM), primér, vzorek, obdobu nukleové kyseliny(třeba PNA), oligonukleotid, který je protažen ve směru poloh 5 ' a 3 ' -polymerasou, nukleovou kyselinu, jež se štěpí chemicky nebo enzymově, nukleovou kyselinu, jež je zakončena didesoxyterminátorem nebo zastřešena na koncovkách 3 nebo 5* sloučeninou, jež předchází polymerování koncovky 5' nebo 3* - a jejich kombinace,,
Doplnění fragmentu nukleové kyseliny na zvolenou cílovou značenou molekulu nukleové kyseliny znamená obvykle zvýšení φφ ♦ φφ φφφφ φφ φφ φ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφφ φφ φ φφ φφ -18- mejméně ο asi 70% specifického základu, čítaje v to zdvojení po délce fragmentu. S výhodou se fragment nukleové kyseliny vyznačuje nejméně o asi 80% specifického zdvojení základu, výhodněji nejméně asi 90%. Testy pro zjištění procenta překřížení (nahodilého a tedy procenta specifického propojení základu) jsou dobře známé a jsou založeny na % překřížení ve funkci Tm, pokud je tím míněn kontrolní vzorek s dokonale prokříženým základem.
Jak je použit zde, výraz "alkyl či alkylová skupina", buď co taková nebo v kombinaci, znamená nasycený, přímý nebo větvený uhlovodíkový řetězový zbytek, obsahující 1 až 10, s výhodou 1 až 6, nejvýhodněji 1 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady lze -L - uvést, ale bezjakéhokoli omezování, skupiny methylovou, ethylo_ vou, n-propylovou, isopropylovou, n-butylovou, isobutylovou, sekT-butylovou, terc.-butylovou, pentylovou, isoamylovou, he-xylovou, decylovou a pod. Výraz "alkylen či alkylenová skupina" znamená nasycenou, přímou nebo větvenou uhlovodíkovou řetězovou skupinu charakteru diradikálu s obsahem 1 až 10, s výhodou 1 až 6 a nejvýhodněji 1 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny methylenovou, ethylenovou, (-CHg.CHg-), propylenovou apod. Výraz "alkenyl či alkenylová skupina", samotný či v kombinaci, znamená uhlovodíkový řetězec přímý nebo větvený s nejméně jednou dvojnou vazbou mezi uhlíkovými atomy a to celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady takových zbytků opět bez jakéhokoli omezování lze jmenovat skupiny ethenylovou, E- a Z-propenylovou, isopropenylovou, E- a Z-Butenylovou, E- a Z-isobňtenylovou, E a Z-pentenylovou, decehylovou apodo Výraz "alkenylen nebo alkenylenová skupina" znamená přímou nebo větvenou uhlovodíkovou biradikálovou skupinu s nejméně jednou dvojnou vazbou mezi atomy uhlíku, celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny methylidenovou (sGHg), ethylidenovou (-CH=CH-) propylidenovou (-CH2-GH=GH)- apod. Výraz"alkinylová skupina", samotný či v kombinaci znamená přímou Či větvenou uhlovodíkovou skupinu s nejméně jednou troj-
·· · · • · · • · 9 · • ♦ ♦ • · · · · ·· ···· • · · · • · · · · t · · · Φ • · · · · · · 4 · · · fe ·· ·· -19- nou vazbou mezi uhlíkovými atomy celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady takových skupin, ale bez jakéhokoli omezování, lze uvést skuliny ethiny-lovou (acGtylenylovou), propinylovou (propargylovou), butinylovou, hexinylovou^i decinylovou apod. Výrazem "alkinylenová skupina” se míní, samotná či v kombinaci, přímá nebo větvená uhlovodíková dvojvazná skupina s nejméně jednou trojnou vazbou mezi uhlíkovými atomy celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny ethinylenovou (C-C-), propinylenovou (-CH^Cí C-) a pod. Výrazem "cykloalkylová skupina”, samotným či v kombinaci, se míní nasycené cyklické uspořádání uhlíkových atomů v počtu 3 až 8, a s výhodou 3 až 6. Jako příklady takových cykloalkylových skupin bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny cyklopropylovou, cyklo-butylovou, cyklopěntylovou, cyklohexylovou apod. Výraz "cyklo-alkylenová skupina” se týká diradikálu cykloalkylové skupiny. Výrazem "-cykloalkenylová skupina", samotným či v kombinaci, se míní cyklocká uhlíkatá skupina se čtyřmi až 8, s výhodou 5 nebo 6 atomy uhlíku a s jednou dvojnou vazbou či více takových. Příklady'.takových skupin zahrnují skupinu - ale bez jakéhokoli omezení _cyklopentenylovou, cyklohexenylovou, cyklopentadieny-lovou apod. Výraz "cykloalkenylenová skupina" se týká odvozených diradikálů. Výraz "aryl či arylová skupina” znamená karbosyklickou aromatickou skupinu (tedy jen z atomů uhlíku a vodíku), jako je skupina fenylová, naftylová, indenylová, anaynylová, azulenylová, fluorenylová a anthracenylová, nebo heterocyklickou aromatickou skupinu, jako je furylová, thienylová, pyridylová, pyrrolylová, oxazolylová, thiazolylová, imidazolylová, pyrazolylová, 2-pyra-zolinylová, pyrazolidinylová, isoxazolyl vá, isotMazolylová, 1,2,3.oxadiazolylová, 1,2,3-triazolylová, l,3,4*»thia.diazol^lová, pyridazinylová, pyrimidinylová, pyrazinylová, 1,3,5-triazinylová, 1,3,5-trithianylová, indolizinylová, andolylová, isoindolylová, 3H-indolylová, indolinylová, benzofb]fůranylová, 2,3-dihydrobenzo-furanylová, benzoQí)thiofenylová, IH-indazolylová, benzimidazo-lylová, benzthiazolylová, purinylová, 4H-chinolizinylová, chino·» linylová, isobinolinylová, cinnolinylová, ftalazinylová, china- -20- • · ·· ♦··· zolinylová, chinoxalinylová, 1,8-naftyridinylová, pteridinylová, karbgzolylová, akridinylová, fenazinylová, fenothiazinylová, a fenoxazinylová. "Arylová skupiny", jak jsou zde definovány, mohou vzájemně nezávisle obsahovat 1 až 4 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z těchto: halogeny, skupina hydroxylová, aminoskupina, nitroskupina, skupina trifluormethylová, trifluormethoxylová, alkylová, alkenylová, alkinylová, kyanová, karboxylová, karbo-alkoxylová, 1,2-oxyethylenová, alkoxylová, alkenoxylová nebo alkinoxylová, alkylaminoskuoina, alkenylamjnoskupina, alki·* nylaminoskupina nebo alifatická či aromatická acylová skupina, alkoxykarbonylaminoskupina, alkyIsulfonylaminoskupina, morfolino-karbonylaminoskupina, thiomorfolinokarbonylaminoskupina, h-alkyl-guanidinová, aralkylaminosulfonylová skupina, dále aralkoxyalkylová, j N-arakjixymočovina, N-hydroxylmočovina, N-alkenylmočovina, lí,N-(alkyl,hydroxyl)-močovina,, dále skupina heterocyklylová, thioaryloxysubstituovaná arylová, N,iT-(aryl,alkyl)hydrazinová,
Ar -substituovaná sulfonylheterocyklylová, aralkylsubstituovaná heterocyklylová, cykloalkyl-· a cykloalkenyl-substituovaná heterocyklylová, cykloalkyl-nakondensobaná arylová, aryloxy-substituovaná alkylová, heterocyklylaminoskupina, alifatická či aromatická acylaminokarbonylová skupina,, alifatická či aromatická acyl-substituovaná alkenylová, Ar^-substituovaná amino-karbonyloxylová, Ar ',Ά£'-disubstituovaná arylová, alifatická či aromatická acyl-substituovaná acylová, cykloalkylkarbonyl-alkylová, cykloalkylsubstituovaná aminoskupina, aryloxykarbonyl-alkylová skupina, fosfordiamidylová kyselina nebo ester. "Ar" je karbocyklická nebo heterocyklická arylová skuúina, jak byla zde výše definována s jedním až třemi substituenty ze skupiny, kterou tvoří halogeny, hydroxylová skupina, aminoskupina, nitroskupina, skupena trifluormethylová, trifluormethoxylová, alkylová, alkenylová, alkinylová, 1,2-dioxymeth^lenová, 1,2-dioxyethylenová, alkoxylová, alkenoxylová, alkinoxylocá, alkylaminoskupina, alkenylamino- nebo alkinylaminoskupina, dále skupina alkylkarbonyloxylová, alifatická či aromatická acylová, • · ·· ···· «t ·*
alkylkarbonylaminoskupina, alkoxykarbonylaminoskupina, alkyl-sulfonylaminoskupina, N-alkyl- anebo U^T-dialkylmočovina. Výrazem "alkoxylová skupina či alkoxy" se míní, samotná či v kombinaci skupina typu alkyletherováho radikálu, kde výraz "alkyl" byl zde již výše definován. Jako příklady vhodných alkyletherových radikálů lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny methoxylovou, ethoxylovou,mn-propoxylovou, isopropo-xylovou, n-butoxylovou, iso-butoxylovou, sek.-butoxylovou, řerc.-butoxylovou apod0 Výrazem "alkenoxylová skupina", samotným či v kombinaci, se míní radikál vzorce alkenyl-O-, kde výraz "alkenyl" byl již výše definován za předpokladu, že radikálem není enol-ether. Příklady vhodných alkenoxylových skupin zahrnují bez jakéhokoli omezování skupiny allyloxylovou, B a Z-3-methyl-2-propenoxylovou apod. Výraz "alkinyloxylová skupina”, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkinyl-O-, kde výraz alkinyl byl již výše definován, ale za omezení, že nejde o inol-ether. Jako vhodné příklady takových skupin lze uvést bez jakéhokoli omezování skupinu propargyloxylovou, 2-butinyloxylovou apod. Výraz "thioalkoxylová skupina" se týká thioetherových zbytků vzorce alkyl-S-, kde alty 1 byl již výše definován. Výraz "alkylamino", samotný či v kombinaci, znamená mono- nebo dialkylaminosubstituovanou aminoskupinu (např, zbytek vzorxe alkyl-HH- nebo (alkyl^-ií-), kde pojem alkyl byl již dříve definován.Jako vhodné příklady možno uvést skupiny, to bez jakéhokoli omezování - methylaminovou, ethylamino-vou, propylaminovou, isopropylaminivou, terc.-butylaminovou, ϊΤ,Ν-diethylaminovou apod. Výraz "alkenylaminová skupina", samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkenyl-NH- nebo (alkenyl)p-H-, kde pojem alkenyl^byl již výše definován, to za omezení, že se nejedná o nějaký enamin. Jako příklad lze uvést allylaminovou skupinu. Výraz "alkinylaminoskupina", samotný či v kombinaci, znamená zbytek alkinyl-NH nebo (alkinyl^-N, kde výraz alkinyl byl již výše definován, to za omezení, že nejde o inamin. Jako příklad ·· * ·· ·♦·· ·♦ ·· • · ·· · · » ♦ · · ♦ • · · t « · · ♦* • » ♦ ♦ · ♦ · ···· ♦ • · · · · ··· ···· «·· ·· · ·· ·· -22-
Ize uvést propargylaminový zbytek. Výraz "amid” se týká buď seskupení -N(R^)-C(=0)- nebo -0(=0)-11-(5^)-, kde ve sítinu zde již dříve uvedené definice znamená vodík, jakož i jiné skupiny. Výraz "substituovaný amid" je vztažen k situaci, kdy R*®* neznamená vodík, zatím co výraz "nesubstituovaný amid" se týká situace, kdy vodík znamená. Výraz "aryloxy", samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-Ο-, kde pojem aryl^byl zde již definován. Jako příklady lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny fenoxylo-vou, neftoxylovou, pyridyloxylovou apod. Výraz "arylamino", samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-NH, kde aryl byl již zde výše definován. Jako příklady opět bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny anilinaminovou (anilidovou), naftylaminovou, 2-, 3- a 4-pyridylaminovou apod. Výraz "arylnavázaná cykloalkylová skupina", samotný či v kombinaci, znamená cykloalkylovou skupinu, jež sdílí dva sousedící uhlíkové atomy s arylovým zbytkem, kde výrazy "cykloalkyl" a "aryl" byly zde již dříve definovány. Jako příklad lze uvést cyklobutylovou skupinu s nakondenzovaným benzenovým jádrem. Výraz "alkylkarbonylaminoskupina", samozný či v kombinaci, znamená zbyt eg: vzorce alkyl-ΝΟ-ΝΗ-, kde výraz "alkyl" byl zde již definován. Výraz "alkoxykarbonylaminoskupina", samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkyl-OCONH-, kde výraz "alkyl byl zde již dříve definován. Výraz "alkylsulfonylaminoskupina", samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkyl-SC^NH-, kde výraz "alkyl" byl zde již definován. Výraz "aryIsulfonylaminoskupina", samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-SC^-HH-, kde pojem "aryl" byl zde již dříve definován. Výraz "N-alkylmočovina", samozný Či v kombinaci, znamená skupinu vzorce alkyl-NH-CO-NH, kde výraz "alkyl" byl zde již dříve definován. -23- ·· ·· > · · Λ t · ·· ·· · · i • · « Výraz "N-arylmočovina", samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-NH-CO-NH, kde poje > "aryl" byl zde již dříve definován. Výrazem Ehalogen" je míněn fluor, chlor, brom či jod. Výrazem "uhlovodíkový zbytek" se míní uspořádání uhlíku a vodíku, kde je třeba pouze jediného'· vodíkového atomu, aby vznikla nezávislá stabilní molekula. Má tedy uhlovodíkový zbytek jedno volné valenční místo na uhlíkovém atomu, kde je uhlovodíkový zbytek navázán na jiný atom či atomx. Jako příklády lze uvést skupiny alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou apod. Výraz "uhlovodíkový diradikál" se týká uspořádání atomů uhlíku a vodíku, kde je třeba dvou vodíkových atomů ke vzniku stálé nezávislé molekuly. Takže má tedy takový diradikál dvě volná valenční místa na jednom či na dvou uhlíkových atomech, kudy je tento zbytek názán na jiný atom či atomy. Jako přík&ady takový skupin možno jmenovat skupinu alkylenovou, alkenylenovou, alkinylenovou, cykloalkylenovou. Výrazem "hydrokarbyl" se míní každé stabilní uspořádání pouze z atomů uhlíku a vodíku s jedním valenčním volným místem, kudy je vázáno na jinou částici a zahrnuje tedy skupiny alkylové, alkenylové, alkinylové, cykloalkylové, cykloalkeny^t^vé, arylové (bez vsunutí^ heteroatomu do arylového cyklu), arylalkylové, alkylarylové a pod. Výrazem "hydrokarbylen" se míní jakékoli stabilní uspořádání jen z atomů uhlíku a vodíku se dvěma volnými valenčními místy, kudy je vázáno na jiné částice, takže sem patří skupiny alkylenové, alkenylenové, alkinylenové, cyklcalkylenové, cykloalfeenylenové, arylenové (bez heteroatomu, vsunutého do aromatického jádra), arylalkylenové, alkylarylenové apod. Výraz "hydrokarbyl-O-hydrokarbylBn" se týká hydrokarbylo-vé skupiny, vázané na atom kyslíku, kde kyslíkový atom je dále vázán na hydrokarbylenovou skupinu na jednom či dvou valenčních místech, kde je hydtokarbylenová skupina vázána na další jiné. Výraz "hydrokarbyl-S-hydrokarbylenM, "hydrokyrbyl-lTH-hydrokar-bylen" a "hydrokarbyl-amido-hydrokarbylen" mají odpovídající ·· ♦ · • · · • 9 9 · • · · 999 ·* ·· ···· 99 ·« 9 · 9 · 9 • · 9 ·· • 9 999 · ♦ • ♦ 9 · 9 ·· 99 -24- významy, kdeže kyslík byl nahrazen sírou, skupinou -NH- nebo amidovou v tom kterém případě. Výraz " N-(hydrokarbyl)-hydrokarbylen se týká hydrokarbylenové skupiny, kde jedno či dvě valenční místa jsou ve vazbě na dusíkový atom a tento dusíkový atom je současně vázán na vodík a hydrokarbylovou skupinu. Výraz Κ,Ν-ά1(hydrokarbyl)-hydrokarbylen se týká hydrokarbylenové skupiny, kde jedno ze dvou valenčních míst je vázáno na atom dusíku a dusíkový atom je současně vázán na dvě hydrokarbylové skupiny. Výraz "hydrokarbylacyl-hydrokarbylen” se vztahuje k hydrokarbylové skupině, vázané pomocí acylové skupiny -C(=0)- na jedno či dvě valenční místa hydrokarbylenové skupiny. Výrazy "heterocyklylhydroearbyl" a "hererocyklyl" se týkají stabilního cyklického uspořádání atomů se zahrnutím atomů uhlíku a až do čtyř atomů (označovaných jako heteroatomy) ze skupiny kyslík, dusík, fosfor a síra. Cyklické uspořádání může mít formu monocyklického zbytku s 3 až 7 atomy, nebo bicyklického s 8 až 11 atomy o Cykly mohou být nasyceně či nenasycené (čítaje v to aromatické kruhy) a mohou případně mít nakondenzované benzo-zbytky. Atomy dusíku a síry mohou zde být v jakémkoli oxidačním stavu, čítaje v to kvarternizovanou formu dusíku. Heterocyklyhydrokarbylový zbytek může být vázán na kterémkoli andocyklickém atomu uhlíku či heteroatomu, čímž vznikne stabilní struktura. Výhodnými takovými zbytky jsou 5~7mičlenné monocyklické heterocykly, ^sáhující jeden nebo dva atomy dusíku ve smyslu heteroatomů.
Substituovaný heterocyklylkydrokarbylový zbytek odpovídá výěejuvedenému, kde nejméně jeden z cyklů je vázán na uvedený substituent, který je navázán na kruhu. S odkazem na hydrokarbylové a hydrokarbylenové skupiny, výraz *' deriváty kteréhokoli z uvedených, kde jeden či více atomů vodíku je nahrazeno totožným množstvím atomů fluoru", se týká molekul, obsahujících uhlík, vodík a fluo r, nikoli však další jiné atomy. 99 99 • 9 9 9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 99 99 ·· m ·· *··· 9 9 99 * 9 9 • · 9 9 9 • · ♦ « · # • 9 ι « · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 -25- Výrazem "aktivovaný ester" se míní tahový ester, který obsahuje odštěpující se skupinu, kterou lze snadno nahradit nukleofilem, jako je amin, alkohol nebo thiolový nukleofil. Takové odštěpující se skupiny jsou dobře známé a zahrnují bez jakéhokoli omezování N-hydroxyimid kyseliny jantarové, I-hydroxybenzotriazol, halogeny (jako helogenidy), alkoxylove skupiny se zahrnutím tetrafluorfenolátů, thioalko-xylové skupiny a pod. Výraz "chráněný ester" se týká esterové skupiny, jež je maskována či jinak převedena do nereaktivní formy. £2 tomu viz Greene "Protecting G®oups in Organic Synthe sis" o S přihlédnutím k výše uvedeným definicém budou další chemické termíny, jak jsou použitelné v textu» snadno pochopitelné obeznámeným v tomto oboru. Termíny mohou být použity samostathě či v kombinaci a je výhodné, případně ještě výhodnější, aby délky řetězců radiMálů vyhovovaly všem uvedeným kombinacím. A· Příprava značených fragmentů nukleových kyselin
Jak to zde již bylo uvedeno, je jedním z předmětů tohoto vynálezu zajištění generálního schématu pro sekvence DIA, kdy by bylo možno použití více než 16 značených vzorků v každé linii; za nepřetržitého detegování lze značené vzorky zjistit a odečtení sekvence v závislosti na míře dělení se provede právě jako při obvyklém sekvencování na podkladu fluorescence. Toto schéma je aplikovatelné na jakýkoli postup sekvencování DIA, založený na míře dělení značených molekul. 0 vhodných značených látkách i vazebných použitých složkách při použití dle tohoto vynálezu, jakož i o postupech sekvencování nukleových kyselin bude podrobnější fiskuse ještě zde dále. 1. Značené vzorky
Značený vzorek ("Tů, tj.tag) je obvykle vztažen k pojetí chemické částice, jež se dá použít k jednoznačnému identifikování "molekuly, těšící se zájmu" a přesněji řečeno se týká obvyk- ·· *· > · · I » · ·· ·· · · 4 • · 4 • · · · • Φ »·*· « « · • t · « f · · • *· · ··· ·· —26— le proměnné složky značené složky, at již je jakkoli těsněji vázána na ni a kterémkoli z dále uvedených činidel: značená reagující látka, značená složka a značená částice.
Značená složka, používaná při postupu dle tohoto vynálezu má několik výhod: 1) Je schopná odlišeni od všech ostatních značených složek. Toto odlišeni od ostatních chemických částí může být založeno na chromátografickém chování se značené složky (zvláště po štěpné reakci), na spektroskopických nebo potencio-metrických vlastnostech, nebo jejich kombinací. Spektroskopické postupy, jimož lze značené složky jednoznačně rozlišit, zahrnují hmotnostní spektroskopii (MS), infračervená spektra (IR), '•ultrafialová spektra (UV) a fluorescenci, přičemž prvé 3 postupy lze označit za výhodnější, prvý za nejvýhodnější. Z potencio-metrických postupů je výhodnou potenciometrická amperometrie. 2) Značenou složku je možno dokázat za přítomnosti 10~22 až 10~6 mol. 3) Značena složka je vybavena shemickou schopností navázat se na MOI, kteroužto složku má značená látka jednoznačně identifikovat. Napojení může proběhnout přímo na MOI, nebo nepřímo prostřednictvím vazebné složky. 4) Značená složka je z chemického hlediska stabilní za všech pochodů, jimž je vystavena, čítaje v to navázání na MOI a odštěpení z MOI, jakož i za všech manipulací, prováděných s MOI, je-li navázána tamže značená složka. 5) Značená složka nijak závažněji nevadí při postupech a manipulacích s MOI, je-li tamže značená složka navázána. Např. je-li značená složka navázána na oligonukleotid, pak značená, složka nesmí podstatněji vadit při jakékoli hybridizaci nebo při enzymových reakcích, prováděných s oligonukleotidem (např. PCR-sek-venčníoh reakcíchuPodobnš je-li značená složka navázána na antilátku, nesmí podstatněji rušit při zjištování antigenu antilátkou0
Značená složka, jež má být zjištována určitými spektroskopickými nebo potenciometrickými postupy se má vyznačovat vlastnost- • · • ♦ · • t • • • • • • • · · · ·· · ♦♦ ···· • · • I * · • t ·· -27- • · · · · • · · ·· • · ··· · · • · · · t · · ·· mi, jez zvyšují citlivost a specifičnost zjištění tímto postu-pemr Typicky bude mít značená složka takového vlastnosti, protože ty byly vneseny do značené variabilní komponenty, a ta bude typicky představovat hlavní část značené složky. V dalším pojednání se výraz značená složka obvykle týká štěpného produktu, obsahujícího variabilní značenou komponentu, ale může být použit i pro variabilní značenou komponentu jako takovou, protože ta je odpovědná za možnost provedení jednoznačeného důkazu a k dosažení nutných vlastností. Ve sloučeninách vzorce T-L-X bude podíl T obdahovat značenou variabilní komponentu.
Zatím co značená variabilní složka byla takto označena za účelem charakterizování, například hmotnostní spektrometrií, může být "Til část celku T-L-X označována jako Tms* Podobně štěpný produkt z T-L-X, obsahující T, může být ozbačován jako Tms-obsahující složka. Následující spektroskopické a potenciometrické postupy se mohou použít k charakterizování podílů, obsahujících Tms0 a Charakterizování značených složek hmotnostní spektrometrií
Pokud se má značená složka analyzovat hmotnostní spektrometrií (např.tedy v příůadš značené složky, sledovatelné hmotnostní chromátografií, kdeže tato část je označována také jako složka-obsahující "T1*18"), pak je základním předpokladeem pro značnou složku, aby byla ionizovatelná. Je tedy výhodným předpokladem pro zjištování značených složek pomocí hmotnostní chromatografie, aby tamže byla vnesena a přítomná chemická funkce ^ nesoucí kladný nebo záporný náboj za podmínek ionizování při hmotnostní spektrometrii. Tento rys přispívá ke zvětšení tvorby iontů a celkově vyšší citlivosti při konstitučním sledování, zvláště elektrosprejovou ionizací. Chemická funkce, jež w ςι podporuje tvorbu ionizovaného stavu, se může odvozovat od T či L, nebo od obou dvou typů. Paktory, které zvašují relativní citlivost analyzované látky, sledované hmotnostní spektrometrií, jsou diskutovány např. v pojednání Sunner-a a spol., Anal.Chem. 60, 1300-1307 (1988).
Výhodnou funkcí k usnadnění vzniku záporného náboje, je některá z organických kyselých funkcí, jako je fenolická hydroxylová skupina, karboxylová skupina, skupina fosfoná-tová, fosfátová, tetrazolové, sulfonylmočovinová, perfluoro-alkoholová a zbytek sulfonové kyseliny. Výhodnou fuhkcí pro usnadnění kladného náboje za podmínek ionnizace jsou alifatické a aromatické aminy. Jako příklady aminových funkčních skupin, kdy dochází ke zvýšení možnosti zjištění pomocí hmotnostní spektroskopie značených složek, lze uvést kvarternizované aminy (tj.aminy, jež mají na dusíku 4 vazby, každou z nich směřující na atom uhlíku) v tomto směru viz Aebersold, US pat.spis 5 240 859, a terč.aminy (tj. dusíkaté látky se třemi vazbami směřujícími vždy na atom uhlíku s tím, že sem patří i látky se skupinou C=N-C, jako je tomu například v pyridinu, viz Hess a spol., Anal.Blochem. 224. 373 )19953, dále Bureš a spol., Anal.Biochem. 224. 364 (1995). Stericky bráněné terč.-aminy jsou zvláště výhodné. Terč.aminy i kvarterní amo-niové soli mohou být povahy alifatické či aromatické. Část, obsahující Tms, musí obsahovat nejméhe jednu ionizovatelnou složku, ale může jich obsahovat a i více. Výhodným nábojem je jediný ionizovaný druh na jednu značenou složku. Ve shodě s tím je výhodné, aby každý podíl s obsahem Tms (a tedy každá značená variabilní komponenta) obsahovala pouze jeden sterický bráněný amin nebo skupinu organické kyseliny.
Jako vhodné skupiny, obsahující aminovou funkci, jež mohou
-(0r°io>
·· ···· ·· Μ • · · · · · · • · · · t ·· • I · · · ···· # • · · · · · • ·· t ·· ·· -29- i Η0ι-0ιο>\3
HV
^(0ι-0ιο)-η(0ι-01ο)2
j-(0l-C10
-N -(Οι-Οχο)- a
Identifikování značené složky pomocí hmotnostní ^spektrometrie se s výhodou provádí na základě odpovídajícího poměru molekulární hmotnosti k náboji (m/z). Výhodné molekulární hmotnostní rozmezí značených složek MS se pohybuje v rozmezí od asi 100 do 2000 daltonů a s výhodou podíl s obsahem Tms má hmotnost nejméně asi 250 daltonů, s výhodou nejméně asi 300 daltonů a ještě výhodněji nejméně asi 350 daltonů. Je zpravidla nesnadné pro hmotnostní spektrometry rozlišit mezi podíly ty, které mají matečné ionty pod asi 200 až 250 daltonů (v závislosti na přesnosti přístroje), takže výhodné podíly s obsahem Tras mají hmotnost nad tímto rozsahem.
Jak to již bylo vysvětleno výše, podíl, obsahující Tms může obsahovat jiné atomy, než jsou ty, které jsou přítomné ve variabilní komponentě značené složky a ve skutečnosti i jiné, než jsou v Tms jako látce co takové. Podle toho hmotnost samotné látky Tms může být pod asi 250 daltonů, a to tak dlouho, pokud podíl Tms má sám hmotnost nejméně asi 250 daltonů. Takže ·· ·· • · · « ··· · I • · · ··. ·♦ ·· · *· ···· • · ·· · · · • · · · · • · · · · · • · ♦ ♦ · «··« ··· f· · -30- hmotnost Tms může kolísat od 15 (tj. nap?.methylový radikál) do asi 10 000 daltonů, s výhodou se pohybuje v rozmezí od 100 do asi 5000 daltonů a nejvýhoSněji od asi 200 do asi 1000 daltonů.
Je poměrně obtížné rozlišit značené složky hmotnostní spektrometrií, pokud takové složky obsahují atomy, obsahující více než jeden izotop v podstatném nadbytku. Dle toho výhodné skupiny T, které jsou určené pro hmotnostní spektrometrii a spektroskopické identifikování (T skupiny) obsahují uhlík, nejméně jeden vodík a fluor a případně další atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, síra, fosfor a jod0 I když mohou být v Tms další jiné atomy, pak jejich přítomnost může poněkud znesnadnit analýzu pomocí údajů hmotnostních spekter. S výhodou Tms skupiny obsahují pouze uhlík, atomy dusíku a kyslíku navíc k vodíku a/nebo fluoru.
Fluor je výhodný a dokonce preferovaný atom ve skupině T , ve srovnání s vodíkem je fluor pochopitelně těžší. Takže přítomnost atomu fluoru místo vodíkových způsobí u skupin Tms, že mají vyšší hmotnost a tím je možno, že skupiny Tms dosahují až i převyšují hmotnost nad 250 daltonů, a to je žádoucí, viz zde dříve. Navíc náhrada vodíku fluorem vede k větší těkavosti podílu, obsahujícího Tms, a větší těkavost analyzovgné látky zvyšuje citlivost použité hmotnostníaspektrometrie, použité jako analytické metody.
Molekulární vzorec T spadá do rozmezí, vyjádřeného vzorcem C1-5001'T0-10000-100S0-10I,0-10H^ F p 1 cT kde s°učet a (Tje dostaču- ύ k uspokojení jinak nenasycených vazností atomů uhlíku, dusíku, kyslíku, síry a fosforu. ,ms
Označení C
nN
sO s,
1-5 00u0-100 6-100 0-10r0-10"dL znamena, ze T“~ obsahuje nejméně jeden, ale může obsahovat jakékoli množství od 1 do 500 atomů uhlíku, navíc až případně 100 atomů dusíku (”^"0 znamená, že Tms neobsahuje žádný atom dusíku) a až 100 atomů kyslíku, až 10 atomů síry a až 10 atomů fosforu. Symboly -Λ, £a á*představují počet atomů vodíku, fl když kterékoli z těchto dvou čísel mohou znamenat nulu a kde
uoru a jodu v T ms ·· φφφφ • · • I ΦΦ φ φ φφ φ φ · φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φφ • · I · · i · ΦΦΦ Φ Φ • · ΦΦΦ ΦΦ· φφφφ ΦΦΦ φφ · φφ φφ -31- a kde součet těchto čísel odpovídá celkovému počtu jinak nenasycených vazeb na uhlíku, dusíku, kyslíku, síře a fosforu. S výhodou má Tms molekulární vzorec, spadající do rozsahu I* ^ , kde-4 «^znamenají dohromady číslo, jež se rovná počtu atomů vodíku a fluoru, přítomných v částici
sS b. Chrakterizování značených složek infračervenými spektry
Jssu dvě zásadní formy infračerveného zjištování organických chemických skupin: Ramanovo rozptylové infračervené spektrum a absorpční infračervené spektrum. Dohromady jsou označována jako spektroskopické postupy. Obecně lze říci, že Ramanova excitace záleží na zrněných polarizavanosti vazeb, zatím co absorpční infračervená spektra jsou závislá na změnách vazebného dipolového momentu. <5éry slabé absorpce infračervených spekter zesílí v Ramenových spektrech a naopak. Pro infračervená spektra jsou charakteristickými jednotkami vlnočty. Jsou zde 3 spektrální oblasti pro infračervená spektra značených složek s možností oddělitelných použití a aplikací: blízká IR v oblasti. -1 12500 až 4000 cm "*, střední IR 4000 až 600 cm"1, a daleká v oblasti 600 až 30 cm \ Pro zde používané použití, kde sloučenina se používá jako značná složka pro identifikaci MOI, vzorku či priméru je výhodná střední spektrální oblast. Tak například karbonylová vazba (1850 až 1750 cm se měří pro karboxylové kyseliny, jejich estery a amidy, alkyl- a arylestery kyseliny uhličité, karbamáty a ketony. Vazba N-H (1750-160 cm se použije při identifikování aminů, amoniových iontů a amidů. Při 1400 až 1250 cm-1 se zjistí vazba R-OH, jakož i 0-1Ί v amidech. Aromatické substituční stavy se zjistí při 900 až 690 cnT1 (vazba C-H, N-H v případě ArNHg). Nasycené vazby uhlíku s vodíkem, olefiny, aromatické cykly, dvojné a trojné vazby, estery, acetaly, ketaly, amoniové soli, sloučenina s vazbou N-0, jako jsou oximy, nitrosloučeniny, N-oxi-dy a nitráty, azosloučeniny, hydrazony, chinony, karboxylové kyseliny, amidy a laktamy, ty všechny obsahují porovnatelné infračervené vibrační údaje, viz Pretsch a spol., Spectral Data for Strugture Determination of Organic Compounds, Springer- • · • ·· ···· ·· ·· • · ·· • · · • · • · • • • · · • · ·· • • • · · · • Ml • « • « • · « • • · MM ··· ♦ · * • · • » -32-
Verlag, New $ork 1989)· Mezi výhodné sloučeniny v tomto směru patří aromatické nitrily s velmi silnou nitrilovou vibrací mezi 22:30 as 2210 cm"^. Dalšími vhodnými typy jsou aromatické alkiny se silnou vibrací s ostrým absorpčním pásem mezi 2140-2100 cm“^. Třetím typem této skupiny jsou aromatické azi-dy s intenzivním absorpčním pásem v rozmezí 2l60 až 2120 cm~^. Thiokyanatany jsou reprezentanty sloučenin §ie silnou absorpcí mezi 227 5 až 2263 cm**·^. c. Charakterizování značených složek ultrafialovými spektry
Souhrn organických chromofornich typů a jejich v ultrafialových spektrech viditelné vlastnosti jsou uvedeny v publikaci Scott "Interpretation of the UV Spectra of Natural Products',' Pergamon Press, New York, 1962 . Ja&o chromofor je označován atom nebo skupina atomů či elektronů, které jsou odpovědné za případnou světelnou absorpci. Jsou zde empirická pravidla pro hodnoty ]L až j] + maksim v konjugovaných systémech, viz Pretsch a spol., "Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, str. B65 až B70, Springer-Verlag, New York, 1989). Výhodné sloučeniny ( s konjugovaným systémem) se budou vyznačovat přechodem n až 31- a Jk až Ji. · Příklady takových sloučenin viz Acid Violet 7, Acridine Orange, Acridine Yellow G, Brilliant Blue G, Congo Red, Crystal Violet, Malachite Green jako oxalát, Metanil Yellow, methylenová modř, methyloranž, methylviolet B, naftolová zeleň B, Oil Blue N, 011 Red 0, 4-fenyl-azofenol, Safranie 0, Solvent Green 3 a Sudan Orange G a ty jsou všechny běžně obchodbě dostupné fAldrich, Milwaukee, TO). Jsou uváděny i další vhodné sloučeninym viz např, Jane 9 spol., J .Chrom. 323., 191-225 (1985). d. Charakterizování značených složek fluorescencí
Fluoreskující vzorky se identifikují a kvantitativně vyhodnotí vlnovými délkami absorpce a fluorescenční emise, jakož i použitím odpovídajících intenzit. Emisní spektra (fluorescence a faáforescence) jsou mnohem citlivější a dovolují speci-cičtější měření ve srovnání s absorpčními spektry. Jin^fotofy- ·· • · · * • · ·♦ • ··· · * • i · ♦ · ·· ·« ♦··· • «· ·· · · • · · · • · · · · • · · · ···« «·· ·· -33- zikální charakterizování, jako je životnost excitovaného stavu a fluorescenční anizotropie se využívají podstatně méně· Obecně nejuživatelnějšími parametry zjišťování intenzity je mo-lární extinkční koeficient či odpovídající koeficienty pro absorpci a kvantové zjištění (quantum yield, QY) fluorescencí. Hodnota £ je specifikována pro iedinou vlnovou délku (zpravidla maximum absorpce vzorkuj zatím co hodnota QY je mírou totální fotonové emise z hlediska celého profilu spektrální fluorescence. Pro fluorescenční excitaci (cestou absorpce) se obvykle používá úzké optické pásové rozmezí (pod 20 nm), zatím co pásová rozmezí pro fluorescenční detekci jsou mnohem variabilnější a zasahují od plného spektra maximální citlivosti až k úzkému pásu ( asi 20 nm) pro nejvyšší rozlišeni. Fluorescenční intenzita vzorku molekuly je úměrná produktu z £ a QY. Rozmezí těchto parametrů mezi chromofory běžné praktické důletitosti činí asi 10 000 až 100 000 cm“^ pro fc a 0,1 až 1,0 pro QY, Sloučeniny, použitelné jako fluoreskující značhé vzorky jsou tyto: rhodarain, v v v modř lambda 470, zelen lambda, červen lambda 664, červen lambda 665, akridinová oranž a propidiniumjodid, vše běžně dostupné od Lambda Fluorescence Co (Pleasant Gap, PA). Jiná fluoreskující činidla, jako je nilská červeň texaská červen, lissamineT^, BODIPY1^ jsou dostupné od Molecular Probes (Eugene, OR). e Potenciometrické charakterizování značených složek Princip elektrochemické detekce (ECD) je založen na oxidaci či redukci sloučenin, které za určité nanesené voltáže, jsou buď donorem či akceptorem elektronů za vzniku proudu, který lze změřit. Pokud jsou některé sloučeniny vystaveny účinkům diferenčních potenciálů, pak molekula poaléhne molekulárnímu přesmyku na povrchu pracovních elektrod za ztráty (oxidace) nebo získání (redukce) elektronů; takovým sloučeninám se říká, že jsou elektronické a podléhají elektrochemické reakci.BC-detektory nanesou voltové napití na povrch elektrory, po kterém teče eluent z vysokotlakové kapalinové chromatografie. Elektroaktivní slouče- • · ··· · Μ · I · ·· * · • · · · < • · · · · · • · · · · »·«· ··· ·· · • · • · • · · · ♦ · ·· • ·· · · · • · · ·· ·» -34- niny, eluované z kolony, jsou bud donory elektronů (oxidující) nebo potřebují elektrony (redukující) za vzniku proudového píku v reálném čase. Podíl vzhiklého proudu je velmi důležitě závislý jak na koncentraci analyzované látky, tak i na naneseném voltovém napětí s tím, že každá sloučenina má své specifické voltové napětí, za kterého se začne oxidovat či redukovat.
Hejběžnějším obecně známým elektrochemickým detektorem je ampérometrioký detektor, na kterém se udržuje potenciál konstantní a měří se potom proud vzniký elektrochemickou reakcí. Tento typ spektrometrie se běžně označuje jako "potensiostac amperomet-fie". Komárně jsou amperometry dostupné od ESA, lne., Chemford-, MA.
Pokud je účinnost detekce 100%ní, pak jsou specializované detektory označovány jako ''coulometrické". Jsou citlivé a mají určité výhody z praktického hlediska se zřetelem na selektivitu a citlivost a proto jsou tyto detektory užitečné na určitém úseku. Při použití coulometrických detektorů se za dané koncentrace analyzované látky nanáší signální proud jsko funkce naneseného potenciálu (voltáže) proti pracující elektrodě. Výsledný sigmonální graf se nazývá křivkou proud/napští nebo hydrodynamickým voltammagramem (HDV)..HDV umožňuje nejlepší volbu potenciálu nanášeného na pracovní elektrodu, jež dovoluje maximalizovat pozorovaný signál. Velkou výhodou ECD je bezprostřední citlivost na hladinu proudu detekce v subfentomolárním rozmezí. v Četné chemikálie a sloučeniny jsou elektrochemicky aktivní, čítaje v to četné biochemické sloučeniny.* farmaceuticky používané látky a pesticidy. Ohromatograficky koeluovatelné slohčeniny lze účinně rozdělit, i když jejich půlvlnový potenciál (potenciál poloviny signálu maxina) se liší v rozmezí pouze 30-60 mV. V současné době vyvinuté coulometrické sensory zajišťují selektivitu, identifikaci a rozdělení koeluovaných sloučenin, použijí-li se jako detektory při děleních, založených na chro-matografii kapalin. -35- ···· ·· ·· • · · · · · • · · · ·· • « # ···· ♦ • · · · · % ·· ·· A proto takové vhodné uspořádané detektory představují další možnost provádění dělení, jež provede detektor sám. Běžné přístroje obsahují l6 kanálků., jejichž výkonnost je omezena v podstatě jen rychlostí, za které lze potřebné údaje získat.
Počet sloučenin, které je možno dělit za BC-uspořádání je z chromátografického hlediska omezen (např.omezením počtu destiček). Avšak jestliže dvě sloučeniny, nebo i více, které jsou chromátograficky koeluovatelné, se vyznačují rozdílem půlvlnového potenciálu 30 až 60 rnV, je zařízení schopno je rozlišit. Schopnost sloučenin k elektroaktivnímu rozlišeni je závislá na tom, zda obsahují BC-aktivní skupinu (například hydroxylovou, kyslík, síru nebo dusík).
Mezi sloučeniny, které byly s úspěchem detegovány použitím coulometrických detektorů, patří 5-hydroxytryptamin, 3-metho-xy-4-hydroxyfenylglykol, kyselina homogentisová, dopamin, meta-nefrin, 3-hydroxykynurenin, acetaminofen, 3-hydroxytryptol, kyselina 5-hydroxyindoloctová, oktansulfonová, fenol, o-kresol, pyrogallol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, 4,6-dinitrokresol, 3-methyl-2-nitrofenol, 2,4-dichlorfenol, 2,β-dichlorfenol, 2,4,5-trichlorfenol, 4-chlor-3-methylfenol, 5-methylfenol, 4-methyl-2-nitrofenol, 2-hydroxyanilin, 4-hydro-xyanilin, 1,2-fenylendiamin, benzokatechin, buturan, chlor-tholuron, diuron, isoproturon, linuron, methobromuron, meto-xuron, monolinuron, monuron, methionin, tryptofan, tyrosin, kyselina 4-aminobenzoová, 4-hydroxyoensoová, 4-hydroxykumari-nová, 7-methoxykumarin, a|>igenin, baikalein, kyselina kávová, katechin, centaurein, kyselina chlorgenova, cřoidzein, cíatis-cenn, diosmetin, epikatechin-galar, epigallo-katechin, epi-gallo-katechin-galat, eugenol, eupatorin, kyselina íerulova, íiseti gaisngm, kyselina galová, gardenin, ganistein, kyselina gen-cisova, hasperidln, irigenin, kemieroi, leukokyanidm , luteolin, rnan-gostin, morin, Myricetin, naringin, narirutin, pelargonidin, peonidin, floretin, pratensin, kyselina protokatechová, rhamne-tin, kvercetin, sakuranetin, skutelarein, skopoletin, aldehyd kyseliny syringové, kyselina syringová, tangeritin, troxerutin, umbeliferon, kyselina vanilová, 1,3-dimethyltetrahydroisochi-nolin, 6-hydroxydopamin, r-salsólinol, W-methyl-r-salsolinol, -36- • · • · · · • · • · tetrahydroisochinolin, amitriptylifa, apomorfin, kapsaicin, chlordiazepoxid, chlor promazin, daunorubicin, desipramin, doxe-pin,fltioxetin, fluorazepan, imipramin, isoproterenol, Hethoxamin, morfin, morfin-3-glukuronid, nortriptylin, oxazepam, fenylefrin, tr imipramin, kyselina askorbová, ft-acetylserobonin, 3,4-dihy&ro-xybenzylamin, kyselina 3#4-dihydroxymandlová (DOMA), 3,4-dihyd-roxyfenyloctová (DOPAC), 3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA), 3,4-dihydroxyfenylglykol (DHPG), kyselina 3~hyároxyanthrani~ lová, 2-hydroxyfenyloctová (2HPAC), 4-hydroxybenzoová (4HBAC), 5-hydroxyindol-3-octová (5KIAA), 3-hydroxykynurenin, kyselina 3- hydroxymandlová, 3-hyd.roxy-4-mathoxyfenylethylamin, kyselina 4- hydroxyfenyloctová (4HPA0), 4-hyd.roxyfenylmléčná (4HPLA), 5- hydroxytryptofan (5HTP), 5-hydroxyÉryptofol (5HT0L), 5-hydro-xytryptamin (5HT), , jeho síran, 3-methoxy-4-hydroxyfenylglykol (MHPG), 5-methoxytryptamin, 5-methoxytryptofan, 5-methoxyprakto-fol, 3-methoxytyramin (3MT), 3-methoxytyrosin (3-0LI-D0PA), 5-methylcystein, 3-methylguanin, bufotenin, dopamin, jeho 3-glu-kuronid, dopamin-3-sulfán a -4-sulfát, epinefrin, epinin, kyselina folová, glutathion (redukovaný), guanin, guanosin, kyselina homogentisová (HGA), homovanilová(HVA), dále homovanilylalko- hol (HVOL), kyselina homoveratrovu, hva-síran, hypoxahthin, indol, kyselina indol-3-octová a indol-3-mléčná, kynurenin, melatonin, metanefrin, IT-methyltryptamin, N-methyltyramin, lT,TT-dimethyJ-tryptamin, Ν,Ν-dimethyltyramin, norepinefrin, normetanefrin, oktopamin, pyridoxal, jeho fosfát, pyridoxamin, synefrin, prypto-fol, tryptamin, kyselina močová, vanilylmandlová (vma), xanthin a xanthosin. Pro další vhodné látky viz např. Jane I, a spol., J,Chrom. 323. 191-225 (1985) a Musch G., a spol., J.Chrom. 348. 97-110 (1985). Tyto sloučeniny lze vtěsnat do látek vzorce T-l-X použitím jinak známých postupů. 'Například sloučenin s karboxylovou skupinou mohou reagovat s aminem, hydroxylovou skupinou atd. za vzniku amidu Či esteru atd a lze vytvořit i jiné vazby mezi T a L. -37- • * ·· ·♦·· • ♦ • ·
Havíc k výše uvedeným vlastnostem a bez zřetele na svolenou detekční metodu je žádoucí, aby značená složka měla.. modulární chemickou strukturu. To napomáhá velmi při konstruování velkého počtu strukturně příbuzných značených složek za použití techniky kombinační chemie. Tak např. jsou žádoucí pro skupinu T některé vlastnosti. Je žádoucí, aby obsahovala funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li složka, obsahující Tras sledována hmotnostní spektrometrií; ( jednodušeji je-li to látka, podporující citlivost hmotnostních spekter, tedy "mass spéct.sensitivity enhancer", jinak MSEE).
Také je žádoucí, aby mohla být použita jako jediný člen ve sku-pinš látek, obsahujících T , kde jednotliví členové této skupiny mají vzájemně lišící se poměr hmotnost/náboj, ale současně mají přibližně tutéž citlivost pro hmotnostní spektrometrii.
Takže členové této skupiny mají totéž MSEE. Se zřetelem na tvorbu a přípravu skupin takových sloučenin bylo nalazeno, že je vhodné generovat značené složky cestou modulární syntetické chemie, takže lze nazírat na sloučeniny, obsahující značené složky jako obsahující moduly.
Je výhodným postupem z hlediska modularity ke struktuře akupiny s Tras, aby Tms měla strukturu T2-(J-T3-)n- kde T^ je organický podíl, vytvořený z uhlíku a jednoho či více vodíků, fluoru, Jodu, kyslíku, nusíku, síry a fosforu s hmotnostním rozsahem 15 až 500 daltonů, dále kde T3 je organický podíl, vytvořený z uhlíku a jednoho či více vodíků, fluoru, jodu, kyslíku, dusíku, síry a fosforu v hmotnostním rozsahu 50 až 1000 daltonů. V takovém případe znamená J přímou vazbu, nebo některou z funkčních skupin, jako je amidová, esterová, aminová, sulfidová, etherová, thioesterová, disulfidická, thioetherová, močo-vinová, karbamátová, thiokarbamátová, některá ze Schiff-ových bází, případně redukovaná, iminová, oximová, hydrazonová, fosfátová, fosfonátová, fosforamidová, fosfonamidová, sulfonátová, sulfon-smidová, nebo vazba uhlíku na uhlík,· n znamená celé kladné číslo od 0 do 50 a to tak, že pokud je & větší než 1, pak T3 a J jsou voleny na sobě nezávisle. • · ·· ·♦·· • · t ♦ ·· ·· « ·· §t -38- 2 3 y
Modulární struktura T -(J-Τ-3)^ podmiňuje vhodné vsunutí do skupiny sloučenin vzorce T-L-X, kde každý člen této skupiny má lišící se skupinu T. Tak například pokud T znamená Tms, a každý z členů této skupiny má nutně shodné MSSE, jedna ze sku-pin T může odpovídat struktuře I.TSSB, S přihlédnutím k seřízení variability mezi cleny skupiny v pojetí hmotnosti Tms, může se skupina T obměňovat mezi člen^ této skupiny. Tak například jeden člen této skupiny má jako T methylovou skupinu, jiný ethylovou a další propylovou atd.
Se zřetelem na zajištění rozdílné hmotnosti nebo velkých skoků v hmotnostech se může skupina T označit jako podstatný ořírůstek (například od 1 do několika set) hmotnostních jednotek do TLX, Takovou skupinu T lze pak označit jako skupinu, jež upravujte či adjustuje rozsah molekulárních hmotností skupiny "¥ÍRA" (v/eight range adjuster). Tato skupina je velice užitečná, 2 pokud se pracuje jen s jedinou sadou skupin T , jež budou mít hmotnosti přesahující omezené rozmezí. Jediná sada skupin T“ se může použít pro seřízení skupin T s velmi širokým rozsahem hmotností a to jednoduše vsunutím jedné či více WRA-T skupin do Tms. Takže za použití jednoduchého příkladu:jestliže sada skupin T se nalézá v hmotnostním rozsahu 250 až 340 daltonů pro skupinu Tms, vsunutí jedné WRA, jež má například 100 dalto-nů, jako skupina T zajistí postup do hmotnostního rozsahu 350 až 440 daltonů při použití téže sady skupin T .Podobně vsunutí dvou MWA skupin s 100 daltony (každá jako skupina Τ'*) umožní vstup do hmotnostního rozmezí 450 až 540 daltonů, a tamže inkrementální přidávání skupin WRA může pokračovat až do velkého hmotnostního rozsahu pro skupiny Tms. Výhodné sloučeniny vzorce T2-(J-T3-)n-L-X mají vzorec Rvwc"^R^ra^“RMSSE“L“X> kde wc ^c) znamená skupinu T2 a každá ze skupin WRA (wra) a MSSE znamená skupinu T^. Struktura je doložena vyobrazením 12 a představuje jeden z modulárních přístupů pro přípravu T . 2 3 2 3
Ve vzorci T -(J-T -) - se T a T s výhodou zvolí ze skupiny kterou tvoří tyto: hydrokarbylová, hydrokarbyl-O-hydrokarbylenová, hy drokar by 1-S-hy drokar bylenová, hydrokarbyl-NH-hydrokarbylenová, hydrokarby1-amido-hydrokarbylenová, N-(hydrokarbyl)-hydrokarbylenová, N,N-di(hydrokarbyl)-hydrokarbylenová, hydrokarbylagyl-hydrokařbylenová heterocyklylhydrokarbylová, kde heteroatom/y mohou být kyslík, dusík, síra a fosfor, dále sem patří substituované heterocyklylkydrokarbylove skupiny, kde heteroatom/s patří do skupiny kyslík, dusík, síra a fosfor a substituenty jsou zvoleny z těchto: hydrokarbylová, hydrokarbyl-O-hydrokarbyle-nové, hydrokarbyΙ-ΚΉ-hydrokarbylenové, hydrokarby1-S-hydrokar-by lenové, II-( hy drokar byl )-hy drokar byle nové, Ν,ϋί-di. (hydro kar byl )-hydrokarbylenové a hydrokarbylacyl-hydrokarbylenové. Dále pak T a/nebo Tr mohou být deriváty kterékoli z dříve uvedených po-tenciálhí skupin T /Qr tak, že jeden či více atomů vodíku se nahradí fluorem. 2 3 Dále se zřetelem na vzorec T -(J-T -) - má výhodná skupina O O i* v v
Tr vzorec -G(R )-, kde G znamená alkylenovou řetězovou skupinu s jedním až šesti atomy uhlíku s jediným substituentem R · Takže znamená-li G ethylenovou skupinu (-CHg-CHg-), pak^jeden nebo oba dna ethylenové uhlíky mohou mít. substituent R , který je zvolen z těchto možných skupin: alkylová, alkenylová, alkinylová, cvkloalkylová, cykloolkylová s nekondenzovaným arylovým cyklem, cykloalkenylová, arylová, aralkylová, aryl-substxtuovaná alkenylová nebo alkinylová, cykloalkyl-substituovaná alkylová, cyklo-alkenylsubstituovaná cykloalkylová, biarylová, alkoxylová, alkenoxylová, alkinoxylová, aralkoxylová, aryl-substituova-ná alkenoxylová nebo alkinoxylová, alkylaminoskupina, alkeqyl-amino- či alkinylaminoskupina, arylaubstituovaná alkylaminoskupina či takto substituovaná alkenylamino či alkinylaminoskupina, aryloxylová, arylaminová, R-alkylmočovinu, substituovanou alkylem, N-arylmočovinu substituovanou ax^cissi alkylem, alkylkarbonylsmino-substituovanou alkylovou skupinu, aminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, skupinu heterocyklylovou, heterocyklysubstituo-vanou alkylovou, heterocyklylsubstituovanou aminoskupinu, karboxy-alkylsubstituovanou aralkylovou skupinu, oxokarbocyklyl-zaakon-denzovanou arylovou skupinu a heterocyklylaikylovou skupinu, dále φφ φφφφ • φ φ φφφφ ··· * · φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φφ φ · φ φ ·· φ · φ φ φ · φ φ φ φφ φ φφ φφ -40- skupinu cykloalkenulovou, aryl-substituovanou alkylovou a aralkylo-vou, hydroxysubstituóvanou, alkoxysubstituovanou, aralkoxysubsti-tuovanou, alkoxysubstituovanou, aralkoxysubstituovanou, amino-substituovanou alkylovou skupinu (arylsubstituovanou alkyloxykar-bonylamino)-substituovanou alkylovou, thiolsubstituovanou alkylovou, alkylsulfonylsubstituovanou alkylovou, (hydroxysubstituo-vanou alkylthip)-substituovanou alkylovou skupinu, thioalkoxv~ substituovanou alkylovou skupinu, hydrokarbykacylaminosubsti-tuovanou alkylovou skupinu, keterocyklylacylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, hydrokarbylsubstituovanou-heterocyklylacyl-amino-substituovanou alkylovou skupinu, alkylsulfonylaminosmbsti-tuovanou alkylovou a arylsulfonylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, morfolinosubstituovanou, thiomorfolinosubstituovanou a morfolinokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, připadne ještě v alkylove části dále substituovanou, |JT-( alkyl, alkenyl nebo alkinyl)- nebo IT,B- dialkyl, dialkenyl, dialkinyl nebo (alkyl, alkenyl)-amino|-karbonylsubstituovanou alkylovou skupinu heterocy&lylaminokarbonylovou skupinu, heterocyklylalkylen- nylovou skupinu, heterocyklylaminokarbonylsubstituovanou skupinu, heterocyklylalkylenaminokarbony1-substituovanou skupinu, N,N-(dialky1)-alkylenaminokarbonylsubstituovanou Laikyl)-alkylenaminokarbonylsubstituovanou alkylovou alkylsubstituovanou heterocyklylkarbonylovou, hetero-bonylalkylovou substituovanou alkylovou skupinu, di^lkyl-ítituovanou acylaminoalkylovou skupinu a aminokyselinové ί řetězce, odvozen® od argininu, asparaginu, glutaminu, systeinu, methioninu a odpovídajícího sulfoxidu a odpo-chsulfonových derivýtá, glycinu, leucinu, isoleucinu, leucinu, terč.-leucinu, norleucinu, fenylalaninu, tyro-•yptofanu, prolinu, alaninu, ornithinu, his^idinu, glutia- alinu, threoninu, šeřinu, kyseliny asparagové, P^-kyan-a allothreoninu, ‘ alynylových a heterocyklylkarbonylových, aminokarbonylových ;ů, látek s amidovou skupinou, mono- nebo dialkýlaminokařboji, mono- nebo diatylamino kar bony lovou, alky larylamino kar bo-u, diarylaminokarbonylovou, mono- n^bo diacylaminokarbonylovou, -41- # · ♦· ·♦♦· • · ·« « · t « · · t • ♦ * · I ♦ ♦ ·· • · · · ♦ ♦ t ··# ♦ · # · ··♦ · · · ···· #·♦ ·· ft ·· #· aromatickou nebo alifatickou skupinou, nebo ze skupiny substituen· tů, případně alkylovou skupinou substituovaných, jako jsou skupiny aminové, karboxylové, hydroxylové, merkaptoskupiny, mono-nebo dialkylarainoskupiny, mono- nebo diarylaminoskupiny, alkyl-arylaminoskupiny, mono- nebo diacylaminoskupiny, alkoxylové, alkenoxylové, aryloxylové, thioalkoxylové, thioalkenoxylové, thioalkinoxylové, thioaryloxylové a heterocyklylové. 2 3 Výhodné sloučeniny vzorce T -(J-T-)n~L-X mají strukturu I4 I am;j.do
9 kde G znamená že vodík na j vyznačen jako kde dále a jednu až šest methylenových skupin (CH^) s tím edné, ale pouze jedné ze skupin CHg, který je "G" je nahrazen seskupením -(GHg)c-amido-T^, jsou organické skupiny vzorce Ο1-25ΪΙ0-900-9ΗΧΪ'Α s tím, že součet «Λ + β dostačuje k uspokojení jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, amido skupina má vzorec 0 0 n ii -N-C- nebo -C-N-R1 Rx kde znamená vodík nebo alkylovou skupinu s jedním až deseti atomů uhlíku, c znamená celé kladné Číslo od 0 do 4 a n znamená celé kladné číslo od 1 až do 50 a to tak, že je-li n větší než 1,,pak se volí G, c, amidoskupina, a vzájemně nezávisle.
Podle dalšího výhodného provedení má sloučenin^ vzorce -L-X strukturu: 99 9 99 9999 • · 99 • · 99 • • 9 9 9 • 9 9 9 • • 9 • 9 9 9 • 9 9 9 • · • ·· 9 • 9 9 9 • 9 · • • 9 ···* ··· • 9 • • 9 9 9 -42
T 1 amid ο
X amido i T 5 kde znamená organickou skupinu vzorce 25^0-9^0-9¾ F A a to tak, že součet (^dostačuje k uspokojení všech jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, dále kde znamená terc._amin nebo kvart.amoniovou skupinu nebo zbytek organické kyseliny, m znamená celé kladné číslo od 0 do 49 a T2, T^, R1, L a X mají významy, jak zde již byly uve d e ny. p _?
Další výhodná skupina sloučenin vzorce T~-(J-T -)n-L-X-má tuto strukturu:
amido 5 -1 kde T znamená organickou skupinu vzorce c^-25'‘o-900-9H-l^ a sou°et je dostačující k uspokojení všech jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, Ir znamená terč.-amin nebo kvart.amoniovou skupinu či zbytek organické kypeliny, m je celé kladné čáslo od 0 do 49, a T^, c, R^, amidoskupina, L a X mají významy, jak zde již byly dříve uvedeny. »· ·· ···· « · · • · · • · * · • · · Μ · ·· ·♦ • · · · t t f* ··· · · • · · ·· *· -43- 5
Ve výše uvedených strukturách se skupinou T má seskupení -amido-T'* s výhodou jednu z dále uvedených struktur, a ty se pohodlně připravují reakcí organických kyselin s volnou aminoskupinou či aminoskupinami, jak jsou na zbytku "G":
-mV(OV0(G2-C10^lí 0 )C. '10- / -liHC-(C, —O-, j-j) —h l( \o o -HHa-(C0-Ci0)
-MHO IIo _ΛΛ \ ^i_vio sr-(0_-Cin) a -NH0.(CrC10)-K o
5 pokud výše uvedené sloučeniny obsahují skupinu T a skupina "Gn má volnou karboxylovou skupinu (nebo odpovídající reaktivní derivát), pak dále uvedené výhodné seskupení -amido-T'* lze běžně připravit reakcí vhodného organického aminu s volnou karboxylovou skupinou na seskupení "G":
-crNH-(c2-c10-íí-(crc10)2 o 0 \juil II. f / \ w
II
-cira-(c2-c10)-K 8 -cuH-(c9-cnn 8 o
10) -44-
10) -44- 99 ···· • · · • · · • ♦ · • · · Μ I ·· ·· • · · · • · ·· 9 999 9 * 9 9 · Μ ·· ί
ÍNH-(Grcio ο
(C^C N
/“Λ -C-H /-(θ!-010) Ο \ a
Ve třech výhodných provedeních dle tohoto vynálezu má seskupení T_L-M0I dále uvedené struktury:
nebo ·· • t ···· • ·· ···· ·· ·· ·· ·· «»··* • · · · · · ·· • · · · · ♦ ··· · # • · # · · · · ··· *» · ·· ·· -45-
10
)-0M-3 '-0H 24 kde T a T znamenají organická seskupení vzorce __ C1-251IO-9°O-9§(0-3)PO-3HpC Tf a to tak> še 8ουδθΐ é ,<p+J 3e dostačující k uspokojení všech jinak nenasycených vazeb atomů uhlíku, dusíku, kyslíku, síry a gosforu, kde dále 0 znamená skupinu (°¾^1-6, kde jeden a pouze jeden vodík methylenová skupiny ve smyslu G je nahrazen seskupením -(CHg )c-amido-T^5> amido-skupina ma vzorec
« V O í> nebo -C-N->1 R* R- RP znamená vodík nebo alkylovou skupinu s jedním až deseti atomy uhlíku, c je celé kladné číslo v rozsahu od O do 4, "C2-0io" znamená hydrokarbyle novou skupinu se dvěma až deseti atomy uhlíku, "ODN-3 *-0H,f znamená fragment nukleová kyseliny s koncovou 3^-hydroxylovou. skupinou (tedy třeba fragment nukleové kyseliny, navázaný na (G^-C^q) na jiném místě, než je 3 ^-koncovka fragmentu nukleové kyseliny, a n znamená celé kladné číslo v rozsahu 1 až 50, a to tak, že^n je větší než 1, ^okuď X 4 pak významy G, c amido, R a T jsou voleny nezávisle. Je výhodné, nejsou-li 3 heteroatomy vázány na jediný atom uhlíku.
Ve výše uvedených strukturách, jež obsahují seskupení Tc..C-(=:0)-lT(R ) se může tato skupina vytvářet reakcí aminu vzorce HN(RP)- s organickou kyselinou, a to některou z déle uvedených, které jsou uvedeny pouze jako příklady a v žádném případě nejsou vyčerpávajícím seznámen potenciálních orggnických kyselin. Tedy kyselina mravenčí, octová, propiolová, propionová, ·· · • # ·· • t • t • · *··· ··· ·· ···· «« ·· • · · · · · · • · · · Φ ·· • · · I ···· 9 9 9 9 9 9 9 99 9 99 99 -46- fluoroctová, 2-butinová, cyklopropankarboxylová, máselná, methoxyoctová, difluoroctová, 4-pantinová, cyklobutan-kar boxylová, 3,3-dimethylakrylová, valerová, Ν,ϊΤ-dimethyl-glycin, ϊϊ-forinyl-Gly-OH, ethoxyoctová, (methylthio)-octová, pyrrol-2-karboxylová, 3-furoová, isoxazol-5-karboxylová, trans-3-hexenová, trifluoroctová, hexanová, Ac-Gly-OH, 2-hydro-xy-2-methylmáselná, benzoová, nikotinová, 2-pyrazinkarboxylová, l-methyl-2-pyrrolkarboxylová, 2~cyklopenten-l-octová, cyklopen-tyloctová, (S)-(-)-2-pyrrolidon-5-karboxylová, ΐϊ-methyl-L-prolin, heptanová, Ac-b-Ala-OH, 2-ethyl-2-hydroxymáselná, 2-(2-methoxy-ethoxy)~octová, p-toluová, 6-methylnikotinová, 5-methyl-2-pyra-zinkarboxylová, 2,5-dimethylpyrrol-3-karboxylová, 4-fTuorbenzoová, 3,5-dimethylisoxazol-4-karboxylová, 2-cyklopěnt^lpropionová, oktanová, Ν,ϊΙ-dimethylsukcinaminová, fenylpropilová, skořicová, 4- ethylbenzoová, p-anisová, 1,2,5-trimethylpyrrol-3-karboxylová, 3- fluor»4~methylbenzoová, Ac-DL-propargylglycin, 3-($rifluormet-hyl)-máselná, 1-piperidinpropionová, H-acetylprolin, 3,5-diflnor-benzoová, Ac-L-Val-OH, indol-2-karboxylová, 2-benzofurankarbo-xylová, benzotriezol-5-karboxylová, 4-n-propylbenzoová, 3-dimet-hylaminobenzoová, 4-ethoxybenzoová, 4-(methylthio)-benzoová, N-(2-furoyl)-glycin, 2-methylthio)-nikotinová, 3-fTuor-4-methoxy-benzoová, Tfa-Gly-OH, 2 naftoová, chinaldová, Ac-L-Ile-OH, 3-methyl-Snden-2-karboxylová, 2-chinoxalinkarboxylová, l-methyl-indol-2-kar-boxylová, 2,3,6-trifluorbenzoová, II formyl-L-Met-OH, 2-(2-(2-metho-x^ethoxy)-ethoxy*|-octová, 4-n-butylbenzoová, N-benzoylglycin, 5- fTuorindol-2-karboxylová, 4-n-propoxybenzoová, 4-acetyl~3,5-dimethyl-2-pyrrolkarboxylová, 3,5-dimethoxybenzoová, 2,6-dimetho-xynikotinová, cyklohexanpentanová, 2-naftyloctová, 4-(lH-pyrrol~ l-yl)-benzoová, indol-3-propionová, 91-trifluormethylbenzoová, 5-methoxyindol-2-ka.rboxylová, 4-pentylbenzoová, Bz-b-Ala-OH, 4- diethylaminobenzoová, 4-n-butoxybenzoová, 3-methyl-5-trifluor-methylisoxazol-4-karboxylová, (3,4-dimethoxyfenyl)-octová, 4-bi-fenylkarboxylová, pivaloyl-Pro-OH, Oktanoyl-Gly-OH,(2-neftoxy)-octová, indol-3-máselná, 4-(trifTuormethyl)-fenyloctová, 5-metho-xyindol-3-octová, 4~(trifluormethoxy)-benzoová, Ac-L-Phe-OH, ·· ···· ·· · > · ·· · « • · · « • · ♦ · « • · · « >··· ··· |f • t ·· • · · · « • I · ·· • · ··· · * • · t < « ·· ·· -47- 4-pentylox^benzoová, Z-Gly-OH, 4-karboxy-N-(fur-2-ylmethyl)-pyrrolidin-2-on, 3,4-diethoxybenzoová, 2,4-dimethyl-5-ethoxy-karbonyl-pyrrol-3-karboxylová, H-(2-fluorfenyl)-sukcinaminová, 3$4,5-trimethoxybenzoová, N-fenylanthranilová, 3-fenoxybenzoová, nonanoyl-Gly-OH, 2-fenoxypyridin-3-karboxylová, 2,5-dimethyl-l-fenylpyrrol-3-karboxylová, trans-4-(trifluormethyl)-skořicová, (5-methy1-2-fenyloxazol-4-y1)-octová, 4-(2-cyklohexenyloxy)-be n-zoová, 5-methoxy-2-methylindol-3-octová, trans-4-kotininkarboxy-lová, Bz-5-aminovalerová, 4-hexyloxybenzoová, Ií-(3-methoxyfenyl)-sukcinaminová, Z-Sar-OH, 4-(3,4~dimethoxyfenyl)-máselná, Ac-o-řluor-DL-Phe-OH, N-(4-fluorfenyl)-glutaramová, 4 *-ethyl-4-bifenvlkarbo-xylová, 1,2,3,4-tetrahydroakridinkarboxylová, 3-fenoxyfenyloctová, kT-(2,4-difluorfenyl)-sukcinamová, H-dekanoyl-Gly-OH, (+)-6-methoxy-^-methyl^-naftalenoctová, 3-(trifluormethoxy)-skořicová, H-formyl-DL-Trp-OH , (R)-(+)- Jv-methoxy- J^-( trifluormethyl)-fenyloctová, Bz-Dl-Leu-OH, 4-(trifluormethoxy)-fenyloctová, 4-heptyloxybenzoová, 2,3,4-trimethoxyskořicová, 2,6-dimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5-trimethoxyfenyl)-propionová, 2,3,4,5,6-pentafluorfenoxyoctová, 1Ί-(2,4-difluorfeny 1)-glutaramová, N-undekanoy 1-Gly-OH, 2- (4-fluor-r benzoyl)-benzoová, 5-trifluormethoxy.indol-2-karboxylová, N-(2,4-difluorfenyl)~diglykolamová, Ac-L-Tro-OH, Tfa-L-fenylglycin-OH, 3-jod benzoová, 3-(4-n-pentylbierjizoyl)-propionová, 2-fenyl-4-chino-linkarboxylová, 4-oktyloxybenzoová, Bz-L-Met-OH, 3,4,5-triethoxy-benzoová, N-lauroyl-Gly-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-benzoová, A®-5-methyl-DL-Trp-0H, 2-jodfenyloctová, 3-jodmethylbenzoová, 3-(4-n-hexylbenzoyl)-propionová, U-hexanoyl-L-Phe-OH, 4-nonyl-oxybenzoová, 4 *~ (trifluorme thy 1)-2-bifenylkar boxy lová, Bz-L-Phe-OH, N-tridekanoyl-Gly-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-fenyloctová, 3-(4-n-heptylbenzoyl)-propionová, lí-heptanoyl-B-Phe-OH, 4-decyl-benzoová, N-( Ji, -trifluor-m-tolyl)-anthranilová, 4-(2~hydro-
M xyhexafluorisopropyl)-benzoová, N-myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-oktyl-be nzoyl)-propio nová, N-oktanoyl-L-Phe-OH, 4-und ecyloxy be n zoová, 3-(3,4,5-trimethoxyfenyl)-propionyl-Gly-OH, 8-jodnaftoová, R-penta-dekanoyl-Gly-OH, 4-dodecyloxybenzoová, N-palmitoyl-Gly-OH, a N-stea-royl-Gly-OH.
Tyto uvedené organické kyseliny jsou dostupné od Advanced Chem,Tech.,,Louisville, KY;$achem Bioscience Unc., Torrance, CA; -48- ·· ···« ·· ♦· • Μ • · » · ♦ ♦ · ·· ··· ·♦·· * · · ♦ · · · ··· · · # · · ♦ · ··· ##*· ··· ·· · ·· ·*
Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, GA; Farchan Laboratories lne., Gainesville, PL; Lancaster Synthesis, Windham NH; a MayBridge Chemical Company /0/0 Ryan Scientific), Columbia, Sc. V katalogách těchto výrobců jsou zkratky, použité výše pro identifikování kyselin. f) Kombinační chemie jako postup pro přípravu značených vzorků.
Kombinační chemie je typ chemické strategie, která vede k produkci velkého množství chemických vzorků (viz například PCT přihláška WO 94/08051. Tyto prokombinované vzorky se dají použít jako značené složky pro identifikování molekul, těšících se zájmu (MOI). Kombinační chemie lze definovat jako systematické a opakující se kovalentní spojení různých "základních bloků” různých struktur vzájemně mezi sebou, to za vzniku velkého množství různých molékulových svazků. Základní bloky mohou být nejrůznějších forem, jak přírodních, tak i syntetických, jako jsou nukleofily, elektrofily, dieny, alkylační nebo acylační činidla, diaminy, nukleotidy, aminokyseliny, cukry, lipidy, organické monomery, syntetické látky i jejich kombinace. Chemické reakce, použitelné k výstavbě zmíněných základních bloků mohou zahrnovat alkylaoe, acylace, oxidace, redukce, hydro-lyzu, substituce, eliminace, adice, cyklizace, kondenzace apod. Tímto postupem se dají připravit molekulové svazky sloučenin, které lze pokládat za oligomery, ne-oligomery nebo jejich kombinace. Pokud se oligomerů týká, pak sloučeniny mohou být větvené, nevětvené nebo cyklické. Jako příklady oligomerních struktur, které lze připravit kombinačními postupy, lze uvést oligopeptidy, oligonukleotidy, oligosacharidy, polylipidy, polyestery, polyamidy, polyurethany, polymočovlnové deriváty, polyethery, póly(fosforové deriváty), například fosfáty, fosfo-náty, fosforamidy, fosfonamidy, fosfity, fosfinamidy atd a poly-deriváty s obsahem síry, jako jsou odpovídající sulfony, sulfonáty, sulfity, sulfonamidy, sulfenamidy atd.
Jednám ze společných typů oligomerní kombinační sbírky je kombinační peptidová sbírka. Poslední čerstvá inovace chemie -49- ♦ · φ φφ φφφφ ·· Φ· φ φ φφ φ φ · φφφφ φ φ ··· φ φ Φ· • φ φ φ φ φ · φφφ · φ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφφ φφ φ φφ φφ peptidů a molekulární biologie umožnily vznik sbírek desítek až stovek milionů různých peptidových sekvencí, které třeba připravit ješte a použít. Takové sbírky je možno rozdělit do tří širokých kategorií. Jedna z nich zahrnuje sbírky chemickou syntézou připravených rozpustných peptidů bez vazby na podklad, viz např. Houghten a spol., Nátuře 354. 84 (1991). Druhá kategorie se týká sbírek chemicky připravených peptidů, vázaných na podklad, vesměs pevný, jako jsou plastové jehly, kuličky z pryskyřic nebo bavlna, viz Geysen a spol., Mol.Immunol. 23. 709 (1986), dále Lam a spol., Nátuře 354. 82 (1991)* Eichler a Houghten, Biochemistry 11 035 (1993). 7 těchto dvou kategoriích jsou stavebními bloky typicky L-aminokyseliny, D-aminokyseliny, nenasycené aminokyseliny nebo směsi či kombinace těchto látek. Třetí kategorie využívá přístupy cestou molekulární biologie k přípravě peptidů nebo proteinů na povrchu vláknitých částeček nebo plasmidů, viz Scott a Craig, Curr.Opinion Biotech. 5., 40 (1994). Smírky rozpustných peptidů bez vazby na podklad jsou vhodné pro celou řadu aplikací, čítaje v to značené složky. Dostupný repertoár chemických růzností a odlišnosti ve sbírkách peptidů se dá rozšiřovat použitím stupňů, jako je napřijlad permethyláce, viz Ostresh a spol., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 91, 11 138 (1994).
Jsou možné četné varianty peptidů v kombinačních sbírkách, kdy se základní peptidová kostra modifikuje a/nebo se amidové vazby nahrazují mimetickými skupinami. Amido-mimetické skupiny, kterých lze využít, zahrnují močovinové deriváty, urethany a karboxymethylenové skupiny. Restruktxírilizace základní kostry tak, že se mění postranní řetězce na dusíkovém atomu amidové skupiny každé z aminokyselin, ponejvíce nikoli jinde, než na ^uhlíkovém atomu, vedou ke sbírkám sloučenin, označovaných jako peptoidy, viz Simon a spol., Proc.Natl.Acad.Sci USA 89, 9367 (1992).
Dalším běžným typem oligomerní kombinační sbírky je kombinační sbírka oligonukleotidů, kde stavební bloky jsou určité ·# • * ···· ·« ··♦· Μ · · • · · • ♦ · · • · · ·»· ♦· ·» *· • « * · ♦ ♦ Μ • ·<« 9 · # · · ·« ·* -50-formy přírodních nebo nenasycených nukleosidů nebo derivátů pólysacharidu, čítaje v to látky, kdy vazby fosforu mohou se nahradit různými organickými nebo anorganickými skupinami a kyslík v etherových vazbách je nahrazen dusíkem nebo sírou, viz Schneider a spol., Blochem.j. 34., 9599 (1995); Preier a spol., J.Med.Chem. 28, 344 (1995); Frank, J.Biotechnol. 41, ?59 (1995); Schneider a spol., publ. POT 942 052; Ecker a spol., Uucleic Acids Res. 21, 1853 (1993).
Dověji byly jeste popsány postupy přípravy kombinačních sbírek neoligomernich sloučenin s malými molekulami,, viz DeWitt a spol., Proč.Kati.Acad.Sci., USA £0, 690 (1993); Proč.
Kati .Acad,Sci., USA 22.» 4708 (1994). Struktury, které jsou vhodné Zapracování do látek ve sbírkách sloučenin s nízkou molekulární hmotností zahrnují velký počet organických molekul, jako jsou napře heterocvklické, alicyklické, alifatické sloučeniny, steroidy, antibiotika, enzymové inhibitory, ligandy, hormony, léky, alkaloidy, opiové látky, terpeny, porfyriny, toxiny, katalyzátory, jakož i jejich kombinace. g) Specifické postupy pro kombinační syntézy značených složek Dále jsou popsány dva postupy přípravy a použití různých sad MS-značených složek s obsahem aminoskupin. V obou případech se používá při syntéze pevná fáze, aby se tím umožnilo současné paralelní syntetizování velkého počtu funkčních skupin značených složek za použití techniky kombinační chemie. Při prvém z postupů případné štěpení značné složky od oligonukleotidu má aa následek uvolnění karboxylamidové skupiny. Při druhém postupu vzhiká štěpením značené složky karboxylová kyselina· Chemické složky, jakož i vazehné podíly, použité při těchto postupech, jsou zkracovány takto: R = pryskyřice (resin) MOC = fluorenylmethoxykarbonylová chránící skupina,
All = allylová chránící skupina, ·· ♦··· • · • 6
• * · ♦ · ··♦ · · • t t · · · ·· * ·· ··
-51-
COOH conh2 NHg OH CONH COO NHg-kruh-OOOH OH-lMeO-COOH OH-2 -Me 0-0 O OH NHg-A-COOH XI,..Xn-COOH oligol...,oligo(b) HBTU = karboxylová skupina = karboxamidová skupina, ss prim, a mi no skupina = hydroxylová skupina, = amidová vazba = esterová vazba = 4 j( ck-amino)-2,4-dimethoxybenzylj-fenoxymáselná kyselina (vazba kruhu) = (4-hydroxymethyl)-fenoxymáselná kyselina = (4-hydroxymethyl-3-methoxy)-fenoxyoctová kyselina = aminokyselina s funkcí alifatického nebo aromatického aminu v postranním řetězci « sada různých karboxylových kyselin ..tedy ..n...s jednotnou molekulární hmotností, = sada n oligonukleotidů = O-benzotriazol-l-yl-Ν,Ν,Ν #,N *- te tramě thyl-uro niumhexafluorfo sfát
Sekvence stupňů při prvém postupu je tato.· OH-2 Me 0-C ONH-R
^ RMOC-NH-kruh-GO OH-2 Me 0-C ONH-R RMOG -TÍH-kr uh-000-2Me 0-C ONH-R piperidin (odstranění HMOG)
NH2-kruh-C 00-2Me0-C ONH-R
FMOC-NH-A-COOH; spojení (např.HBTU) RMOC-NH-A -C ONH-kr uh-C 00-2 Me 0-C ONH-rR piperidin (odstranění RMOC)
NH2-A-C ONH-kruh-C 00-2Me 0-C ONH-R
íéózdělení na n alikvotních částí navázání na n různých kyselin XI...Xn-COOH / ·* ···· ··· · · -52- • · · « • · 2 • ·· · ♦ · ·< ··· · pokr.
XX.. .Xn-C0NH-A-G0NH-kruh-C00-2Me0-C0NH-R odštěpená značených funkčních skupin z
'Yvvv pryskyřice pomocí 1% kyseliny trifluoroctové XI----Xn-C O-NH-A -0 ONH-kruh-C 00H spojení s n podíly oligo (oligo l...oligo (n) vybity např.via Pfp-esterů XI...Xn-CONH-A-CONH-kr u j -0 OIFH-o 1 igo 1 ·..oligo(b) 'vl' shromáždění značených oligo-podíl&j 4^ provedení sekvenční reakce; i oddělení fragmentů, s různými délkami po sekvenční reakci (například vysokotlakovou kapalinovou chromátografií nebo elucí; štěpení značených podílů z vazebných čásťí pomocí 25% až 100% kyseliny trifluroctové
Σ1...,Xn-C0NH-A-C0NH analýza hmotnostní spektrometrií v
Sekvence stupňů při druhém postupu je tato OH-lMe 0-G00-A11 b FMOC-NH-A-COOH, spojení (naúř.HBTU) FMOC-Frí-A-C OO-lMe0-G 00-A11 .]/ palladium (odstranění allylové skupiny)
FMOC-NH-A-C OO-lMe O-GOOH ψ 0H-2Me0-CONH-R, spojení (např.NBTU)
EMOO-im-A -C OO-lMe 0-G 00-2 -MeO-G ONH-R
^ piperidin (odstranění FMOC) lIHg -A -G OO-lMe 0-G 00-2 Me 0-G ONH-R
φ' rpzdělení na n alikvotních částí W jj/l/ navázání na n různých kyselin XI....Xn-COOH
XI«..,Xn-C ONH-A-C OO-lMe0-G 00-2MeO-CONH-R odštěpení značených funkčních skupin z pryskyřice pomocí 1% kyseliny trifluoroctové ·♦ ···♦ «· ·· • ·
9 · · · · · · • 99 · · 9· • · 9 · · 99 · · * 9 9 9 · · ·
XI....Xn-CONH-A-COO-lMeO-COOH
navázání na n podílů oligo (oligo 1...oligo(h) např.via Pfp-esterů XI.··.Xn-CONH-A-COO-lMeO-CONH-oligol*··.oligo(n) 4^ shromáždění značených oligo-podílň; provedení sekvenční reakce; oddělení fragmentů s různými délkami po sekvenční reakci (například vysokotlakovou J/ chromátografií nebo elucí); I štěpení značených podílů z vazebných částí ψ pomocí 25% až 100% kyseliny trifluoroctové
XI.... X n~C ONH-A «0 00H l· analýza hmotnostní spektrometrií 2. Vazebné složky v Výraz "vazebná složka", jak se zde používá, znamená bud přímou kovalentní vazbu nebo organickou chemickou skupinu, jež se použije ke spojení značené složky (T) na zájmovou molekulu (MOI) pomocí kovalentních chemických vazeb .Dále pak, pokud se přímé vazby týká, pak jedna či více vazeb ve vazebné složce je štěpitelná za podmínek, jež dovolují uvolnění T (jinými slovy odštěpení) ze zbývající T-L-X-sloučeniny (čítaje v to složku MOI^, Značená variabilní složka, přítomná v T, má být stálá za podmínek štěpení. S výhodou se má štěpení provést rychle; to znamená za několik málo minut, s výhodou během 15 sekund či ještě méněo
Obecně řečeno: použije se vazebná složka ke spojení každé značené složky z velké sady na kaýdou zájmovou molekulu MOI, sada je v tomto případě podobného rozsahu. Typicky je jediná kombinace zlacená složka-vazebná složka navázána na každou komponentu MOI )vzniknou různé a četné T-L MOI), ale v některých případech více než jedna jediná kombinace značená složka-vazebná složka se může napojit na každou individuální MOI za vzniku různých (T-L) -MOI. Při jiném provedení tohoto -54- • · · · · * « • « · · · · ♦ ··
• · · · t • t·# ··♦ ♦· I • ·· ·· ® · · · · « • * · · · « *» ·# vynálezu se dvě nebo i více značených složek napojí na jedinou vazebnou složku prostřednictvím většího počtu nezávislých míst na vazebné složce a takto vybavená kombinace většího počtu značených složek s vazebnou složkou se pak naváže na individuální MOI za vzniku různých (T)n~L-MOI,
Po Četných manipulacích se sadou značených MOI se použijí specielní chemické a/nebo fyzikální podmínky ke štěpení jedné či více kovalentních vazeb vazebné složky, což vede k uvolnění značených složek z MOI* Štěpitelná vazba či takové vazby mohou, ale také nemusí být některými z týchž vazeb, které vznikly při spojení složek značená, vazebná a MOI dohromady. Ráz vazebné složky z větší míry bude určovat podmínky, za kterých je možno štěpehá uskutečnit. Dle toho jsou vazebné složky dány podmínkami štěpení, aby byly k tomuto úkonu vhodné. Pokud je vazebná složka fotolabilní (například tedy náchylná ke štěpení po vystavení gktinickému záření), pak takovou složku L lze označit jako L^. Podobně další označení I*0"'®, lzás, L(o\ L(r>, Líenz) >Il(elektr)> L a Lss mohou být použita ve spojení s vazebnými složkami, které jsou zvláště vhodné k odštěpení působením kyselin, zásad, oxidací, redukcí, enzymově, elektrochemickou oxidací či redukcí, za zvýšené teploty nebo thiolovou výměnou v tom kterém případě.
Určité typy vazebných složek jsou labilní za jediného typu podmínek Štěpení, jiné jsou labilní za podmínek několika typů štěpení. Dále pak navíc vazebné složky, které jsou schopné vázat vetší počet značených složek za vzniku struktur typu (Ϊ) -L-MOI, mohou být každá v různých místech značené složky labilnější za určitých podmínek štěpení. Tak například v případě vazebné složky s navázanými dvěma značenými složkami může být jedna labilní pouze v alkalickém prostředí, druhá pouze za podmínek fotolyzy.
Vazebná složka, použitelná při postupu dle tohoto vynálezu, má mít několik schopností: 1) Má mít schopnost vázat se chemicky (L^, Chemical handle), čímž se může napojit na MOI, 2) má druhou, oddělenou chemickou možnost (L^), pomocí -55- 6 « «« • · · · · · ·· · · 1
• · I «· ·· kfeeré se naváže značená složka na vazebnou složku. Pokud se větší počet značených složek naváže na jedinou vazebnou složku za vzniku struktury (T) -L-MOI, pak pro každou značenou složku existuje oddělené chemické zacházení, 3) vazebná složka má být stabilní za všech manipulací, jímž je vystavena s výjimkou těch podmínek, které dovolují odštěpení skupiny, obsahující značenou část od zbytku sloučeniny, čítaje v to MOI. Takže vazebná složka je stabilní při navazování značené složky na ni, navázání vazebné složky na MOI a za všech manipulací, kdy MOI obsahuje jak značenou složku, tak i vazebnou složku (T-L), navázané na MOI, 4) vazebná složky memůže podstatněji vadit při manipulacích s MOI, jsou-li na tuto složku navázány složky značená a vazebná (T-L), Tedy, je-li složka T"”L navázána na oligonukleotid, nesmí složka T-L podstatněji vadit při jakýchkoli hybridizacních nebo enzymových reakcích, prováděných s oligonukleotidem. Podobně je_li T-L názána na antilátku, nesmí podstatněji rušit při zjiš-tování antilátký antigenem. 5) Odštěpení značené složky od zbývající části sloučeniny se provádí za vysoce kontrolovaných podmínek, to za použití postupů fyzikálních nebo chemických, které nijak nepříznivě neovlivňují možnost zjištění značené složky.
Po každý druh vazebné složky platí, že je výhodné, aby byl navázatelný na velký rozsah struktur MOI a že velmi různé značené složky mohou být navázány na vazebnou složku. Taková pružnost je výhodná, protože dovoluje použít sbírku konjugátů T-L, jednou již připravených, k použití s dalšími jinými sadami MOI.
Jak to již bylo výše uvedeno, mé výhodná vazebná složka vzorec ^áe znamená reaktivní použitou složku (reqctive handle),kterou lze využít pro navázání vazebné složky na značenou složku a reagu-jící molekulu, těšící se zájmu. L je zásadní částí vazebné slož-ky, protože ovlivňuje labilitu vazebné složky. L^ a I? jsou případné vhodné skupiny, jež účinně slouží k oddělení L2 od 1^. -56- «· Μ » · · t ···· ··· 1 ο L (jež se nalézá blíže k T než Ir) slouží k oddělení T od potřebně labilní části L . Takové oddělení může být užitečné, když se za podmínek štěpení získávají zvláště reaktivní podíly (například volné radikály), které mohou způsobit chaotické a nahodilé změny ve struktuře části, obsahující T, Jelikož místo štěpení je dále odděleno od složky, obsahující T, sníží se nahodilost, že by mohl vzniknotfvreaktivní podíl v místě štěpení a narušil by strukturu podílu, obsahujícího T. Také protože atomy v Lx budou typicky obsaženy v podílu, obsahujícím T, mohou takové atomy L ovlivňovat žádoucí kvalitu podílu, obsahujícího T, Například je-li podílem, obsahujícím T složka, obsahující Tms a stericky bráněný amin je žádoucnš přítomný jako část struktury podílu s obsahem Tms (tedy aby byl použit jako MSSE), může být stericky chráněný amin přítomný v labilní části Ir". V jiných případech mohou být L a/nebo Ir přítomny ve vazebné složce jen proto, že komerční dodavatel vazebné složky poskytuje vazebnou složku pouze ve formě, mající takovou L^·
O a/nebo I> skupinuo V takovém případě není na škodu použít vazebné složky se skupinami L a/nebo L (pokud tyto skupiny nevadí při štěpných reakcích), i když nijak nepřispívají k případným výhodám provedení při použití sloučenin, které je obsahují. Takže tento vynález dovoluje, aby skupiny a/nebó 3 v r L byly přítomny ve vazebné složce.
Skupinami L a/nebo Ir mohou být přímé vazby (v kterémžto případě tam skupina ve skutečnosti není), skupiny hydrokarbyleno vé (např0 alkylen&vé, arylenové, cykloalkylenové atd), -O-hydro-karbylenové (například skupiny vzorců -0-CH2-, -O-CHgVHÍCH^)-atd, nebo hydrokarbylen-|p-hydrokarbylenové^ , kde w je celé kladné číslo v rozsahu od 1 do asi 10, například tedy -Cř^-O-Ar-GHg-CO-CHgCH^- atd. V souvislosti se syntézou na pevné fázi byl zaznamenán velký počet literárních údajů v souvislosti s vazebnými složkami labilními za určitých reakčních podmínek. Při provedení typické syntézy na pevné fázi se takový pevný podklad váže labilním vazným činitelem na reaktivní místo a motekula, jež se má synteticky připravit, se generuje na reaktivním místě. Jakmile byla • · · · · · • * *· · · · • · · · · • · ♦ · · · * · · · * ···· ·«· 9» « <>t • · • • · • • · ··· • « • • * ·· • · « · -57- molekula dokonale syntetizována, pak konstrukce pevného podkladu s vazebnou složkou a molekulou se vystaví podmínkám štěpení, za kterých se molekula uvolní od pevného podkladu. Labilní vazebná činidla, jež byla vyvinuta k použití v této souvislosti (nebo která by mohla být použita) se mohou snadno použít jako vazebná činidla dle tohoto vynálezu.
Llloyd-Williams P. a spol. v článku "Convergent Solid-Phase Peptide Synthesis’,’ Tetrahedron Report č.347, 49(48), 11065-11133 (1993) velmi důkladně diskutují o vazebných složkách, labilních za aktinického záření (např.fotolyzou) jakož i o podmínkách Štěpení kyselinami, zásadami a i jinak. Další zdroje informací o labilních vazebných složkách lze získat snadno.
Jak to již konečně bylo uvedeno zde výše, různé znaky a charaktery vazebných složek budou rozhodujícími ° xaktory za různých a lišících se podmínek štěpehí, at již fyzikálními nebo chemickými postupy. Jako příklady podmínek, za nichž lze štěpit různé typy vazebných složek, lze uvést reakce v kyselém či alkalickém prostředí, oxidace, redukce, fluoridy, thiolovou výměnu, fotolyzu a enzymové reakce. Příklady štěpitelných vazebných složek, jež vyhovují obecným kriteriím pro charakter vazebných složek, jak jsou zde uvedeny výše, jsou obeznámeným dobře známé a zahrnují tyto látky, jak jsou obsaženy v katalogu od Pierce (Rockford II). Patří sem: ethylen-glykobiST(sukcinimidyl-v-jantaran) (SGS), aminové reaktivní zesítující činidlo, štěpitelhé hydroxylaminem (1M, 37 °G, 3 až 6 hodin), disukcinimidyl-vínan (DST), a sulfo-DST, což jsou aminová zesítující reaktivní Činidla, štěpitelná roztokem 0,015'. M jodistanu sodného, namidoij-butan (DPDEB)iť bis-[?-(sukcinimidyloxykarbonyloxy)-ethyl\-sulfon (BSOCOBS) a sulfo-BSOCOBS, což jsou aminová zesítující činidla, štěpitelná působením zásad (pH 11,6), l,4-*di-|3 *~(2 ^-pyridy|:dithio(propio pyridyldithiol, jako zesítovač, který je ětěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí, N-[4-(p-azidosalicylamido)-butylj-3 *-(2 '-pyridyldi-thio)-propionamid APDP), pyridyldithio, jako zesítovač, atěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí, bis-j^-(4-(azidosalicylamido)-ethyl} -disulfid, fotoreaktiv-ní zesítovač, který je šzěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí, N-sukcinimidyl-(4-azidofeny1)-1,3'-dithioprópionát (SADP), v fotoreaktivní zesítovač, který je ětěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí,
Sulfosukcinimidyl-2-(7 -azido-4-methylkumarin-3-acetamido)-ethyl-1,3*-dithiopropionát (SAED), fotoreaktivní zesítovač, který je ětěpitelný thmolovou výměnou nebo redukcí, sulfosukcinimidyl-2T(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-l,3 dithiopropionát (SAHD), fotoreaktivní zesítovač, ětěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí.
Dalšími příklady ětěpitelnýcs vazebných složek a podmínek při štěpení, jak je lze použít při uvolňování značených slovek, jsou tyto: silylovou zesitujxci skupinu lze štěpit fluorem nebo za podmínek kyselého štěpeníp 3-, 4-, 5- nebo 6-substituovsná 2-nitrobenzyloxy- nebo 2-, 3-, 5- nebo β-substituovaná 4-nitro- v benzyloxy-zesítující skupina se může štěpit zdrojem fotonů (fo-tolyzou). Zesítující 3-, 4-, 6- nebo 6-substituovanou~2-atkoxy-fenoxylovou nebo 2-, 3-, 5- nebo 6-substituovanou 4-alkoxyfenoxy-lovou zesítující skupinu lze štěpit oxidačně působením sloučeniny vzorce . Zesítovač typu NC00 (urethan) se dá štěpit působením hydroxidů, kyselin, nebo redukčně hydridem hlinitolith-ným. 3-Pentenýtovou, 2-butenylovou nebo 1-butenylovou zesítující skupinu lze odštěpit ozonem, směsí oxidu osmičelého a Jodistano- v vých aniontů nebo oxidačně manganistanem draselným. Zesítující skupinu 2-(j3-, 4- nebo 5-substituovanou-furyl)-oxylovou lze štěpit kyslíkem, bromem, methanolem nebo kyselinou. • · · « 9 t Μ ··· · 4 ««·· ··· -59-
Podmínky, za michž lze odštěpit další labilní vazebné složky zahrnuji tyto: terč.-alkylo^y-vazebné složky lze štěpit kyselinami, methyl(dialkyl)methoxylové nebo 4-substituované 2-alkyl-l,3-dioxolan-2-ylové vazebné skupiny lze štěpit značenou vodou H^0+, 2-silylethoxylové podobné skupiny lze štěpit fluorem nebo kyselinami, 2-(X)-ethoxylové skupiny, kde X tnamená skupinu ketonickou, esterovou, amidovou, kyanovou, nitroskupinu, dále skupinu sulfidickou, sulfoxidovou a sulfono-vou se dají štěpit v alkalickém prostředí, dále 2-, 3-, 4-, 5-nebo 6-substituované benzyloxylové vazebné skupiny se mohou štěpit kyselinami nebo v redukčním prostředí, 2-butenyloxy-vazebné skupiny se mohou štěpit působením (CgBájO^RhClCH), dále 3-, 4-, 5- nebo β-substituované 2-bromfenoxylové vazebné skupiny je možno štěpit lithiem, hořčíkem nebo bu-tyllithiem, methylthiomethoxylové vazebné skupiny se dají štěpit rtutnatými ionty, 2-(X)-ethyloxyskupiny, kde X znamená halogen, jsou štěpitelné zinkem nebo hořčíkem a 2-hydroxyethyl-oxyskupiny se mohou štěpit oxidačně, například působením octanu olovičitého. Výhodnými vazebnými skupinami jsou ty, které lze štěpit kyselinami nebo fotolyzou. Některé z vazebných skupin, labilních v kyselém prostředí, které byly popsány v souvislosti s peptidovou syntézou na pevné fázi, jsou vhodné pro vázání značených složek na MOI. Některé z nich byly popsány nedávno v přehledné práci LLoyd-Williams-e a spol., letrahedron 49« 11065-11133 (1993). Jedním použitelným typem jsou vazebné složky na podkladu p-alkoxybenzylalkoholových derivátů, z nichž dva jsou dostupné od Advanced Chem.Tech. (Louisville, KY).
Jsou to kyselina 4-hydroxymethylfenyloxyoctová a kyselina 4-(4*-hydroxymethyl~3~methoxyfenoxy)-máselná. Obě tyto vazebné složky se mohou napojit na značenou složku využitím esterové vazby benzylalkoholu a na MOI, obsahuje-li aninoskupinu, pak amidickou vazbou, to s přihlédnutím na karboxylovou kyselinu. Značené složky, vázané těmito molekulami, se mohou uvolnit z MOI použitím kyseliny trifluoroctové v různých koncentracích. Štěpěhí takových vazebných částí se projeví uvolněním karboxylové kyseliny m znagené složce. Výsledkem štěpení -60- « · ♦ ♦ · 99·· *« 99 • · • · • 9 9 • · 9 • • • 9 9 t t • 9 c • • · • 9 « ··· 9 9 • • 9 » 9 9 ·««· ··· 1« ♦ 99 • 9 značených složek, navázaných těmito vazebnými složkami, jako je 2,4-dimethoxy-4*-(kar boxymethyloxy)-benzhydrylamin se projeví uvolněním amidu karboxylové kyseliny na uvoněném značeném podílu; citovaná látka je dostupná od Advanced Chem.Tech. v RMOC-chráněné forměc
Rotolabilní vazebné podíly, použitelné v této souvislosti, byly již také z největší části vyvinuty pro syntézu peptidů na pevné fázi, viz přehled LLoyd-Williams. Obvykle jsou založeny na 2-ni:robenzy5-esterech nebo 2-nitrobenzylanidech. lva příklady fotolabilních vazebných složek, které byly v poslední době uvedeny v literatuře, jsou kyselina 4-\4-(l-Rmoc-amino)-et;_.yl)~2~methoxy~5~nitrofenoxy]-butanová, viz Holmes a Jones J.Org.Chem. 60, 23x8-2319 (1995) a kyselina 3-(Tmoc-amino)-3--(2-nitrofenyl)-propionoví, viz Brov/n a spol., Molscular Di-versity 1, 4-12 (1995). Obě vazebné složky lfce navázat využitím karboxylové kyseliny na aminovou skupinu MOI, Navázání značené složky na vazebnou složku se provede vytvořením amidu mezi karbo-xylovou skupinou značené složky a aminoskupinou na vazebné složce o Štěpení fotolabilních vazebných složek se obvykle provede ultrafialovým světlem (350 nm) za intenzit a dob, které jsou jinak známé. Rozštěpením vazebné složky se uvolní primární 'amidová skupina na značené složce. Jako příklady fotolabilních vazebných složek lze uvést nitrofenylestery glycinu, exo- a endo-2-benzonorborneylchloridy a methansulfonáty, dále kyselinu 3-(amino)-3-(2-nitrofenyl)-propionovou. Jako příklady enzymových štěpehí lze uvést použití esterág štěpících esterové vazby, nukleás, štěpících fosfodiesterové vazby, proteás, štěpících peptidové vazby atd.
Ze výhodnou vazebnou složku lze uvést o-nitrobenzylové deriváty dále uvedeného obecného vhorce
d nebo e kde jeden z uhlíkových atomů v postaveních a, b, c, • * * * #♦ ff··· ·· ·♦ • t I * Ψ · ·♦ » ·#· · * • · * 1« #* -61- 3 1 ^ je substituován skupinou -L ~X,a L (tou je s výhodou přímá vazba) je na levé straně seskupení N(R^) ve výše uvedené stiuiktuře, Taková vazebná složka může podlehnout selektivnímu foto-indukovanému štěpení vazby mezi uhlíkem, označeným "a" a skupinou N(R ). Totožnost R není obvykle rozhodující pro štěpnou reakci, ale s výhodou se R·*· zvolí mezi vodíkem a hydrokarbylovou skupinouo Tento vynález zahrnuje také možnost, že ve výše uvedené struktuře se může nahradit -N(R^)- kyslíkem. Ve výše uvedené struktuře může být jedna či více z poloh b, c, d nebo e případně substituována skupinou alkylovou, alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxyláto-vou nebo amidovou, kdeže tyto substituenty se nezávisle volí od případu k případu.
Další výhodnou vazebnou složkou s chemickou komponentou má tuto dále uvedenou obecnou strukturu a
kde jedna či více z poloh b, c, d nebo e je substituována vodíkem, skupinou alkylovou, alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hyd-roxylovou, karboxylátovou nebo amidickou, R^ znamená vodík nebo hydrokarbylovou skupinu a R^ znamená skupinu hydroxylovou, nebo skupinu, jež buď chrání nebo aktivuje napojení karboxy-lové kyseliny na další jinou část. Výhodnými skupinami, které aktivují karboxylovou skupinu při takovém spojování skupiny fluorkarbonové a hydrofluorkarbonové.
L 3 o Zájmová molekula (MOI, molecule of interest)
Jako příklady zájmových molekul lze uvést nukleové kyseliny nebo jejich obdoby (například PNA), fragmenty nukleových kyselin, syntetické nukleové kyseliny či jejich fragmenty, oli- -62- ·· •9 ··♦· Φ 9 • ·· · 99 • 9 « 9 9 • 9 9 9 • * · 999 9· 9« ♦♦ 9 9 9 9 9 • f · • f 999 9 · • · 9 · 4 99 ·« gonukleotidy (například DNA nebo RNA), proteiny, peptidy, anti-látky či jejich fragmenty# dále receptory, receptorové ligandy, členy ligandových párů, cytokiny, hormony, oligosacharidy, syntetické organické molekuly, léky a jejich kombinace. Výhodné MOI představují fragmenty nukleových kyselin. Z nich pak zvláště primární sekvence, doplňující sekvence, přítomné ve vektorech, kdy se vektor používá pro sekvencování báze. S výhodou je fragment nukleové kyseliny vázán přímo či nepřímo na značenou složku v každém jiném místě, než je 3 ^-koncovka fragmentu, nejvýhodněji v místě 5 ^-koncevky fragmentu. Fragmenty nukleových kyselin lze koupit nebo připravit na podkladě genetických databází, viz Dib. a spol., nátuře 380. 152-154,(1996), jakož i CEPH Genotype Database, http://WWW.cephb.fr, a dále komerčních vektorů, viz ]?romega, Madison, WI. MOI, jak se zde tento výraz používá, zahrnuje deriváty MOI, obsahující funkčnost použitelnou pro spojení MOI s látkou T-L-L^. Tak například fragment nukleové kyseliny má na 5 ^-koncovce fosfodiester,, kdy fosfodiester je rovněž vázán na alky-lenamin. Takový MOI je popsán například v US pat.spise 4 762 779, na který se zde odkazuje, líukleový fragment s vnitřním modifikováním je rovněž MOI. Jako příklady interního modifikování fragmentu nukleové kyseliny lze uvést případy, kdy odpovídající báze, tedy třeba adenin, guanin, cytosin, thymidin, uráčil byla modifikována přidáním reaktivní funkční skupiny. Takové interně modifikované fragmenty nukleových kyselin jsou běžně dostupné od např. Glen Research, Herndon, YA. Jiným příkladem interního modifikování fragmentu nukleové kyseliny je případ, kdy se použije nebázický fosforamidát pro syntézu modifikovaného fosfodiesteru, který je vsunut mezi sacharid a fosfátovou skupinu fragmentu nukleové kyseliny. Nebázický fosforamidát obsahuje reaktivní skupinu, jež umožní, aby se fragment nukleové kyseliny obsahující takový podíl, odvozený od fosforamidátu, vázal na podíly jiné, například některou látku T-L-L^. Takové nebázické fosféramidáty jsou obchodě dostupné od např.Clonetěch Laboratories, lne., Palo Alto, CA. ·· #··♦ ♦ ♦ · ♦ « 0 · · • · Μ «· • · * # · ♦· » ♦· · · • · ♦ · ♦· « -63- 4ο Chemické záchytky (L^, Chemical handles)
Jako chemická záchytka je označováno stabilní, ale reaktivní atomové seskupení na prvé molekule, tedy na její části, kdy je možná chemická reakce takové záchytky s doplňující chemickou záchytkou na části druhé mokekuly za vzniku kovalentní vazby mezi oběma molekulami. Tak například takovou záchytkou může být hydroxylová skupina a opačnou chemickou záchytkou seskupení karboxylové kyseliny, tedy karboxylová skupina nebo odpovídající aktivovaný derivát, třeba hydrofluorarylester, načeš reakcí těchto dvou záchytek dojde ke tvorbě kovalentní vazby, zvláště esterové, jež spojí obě molekuly dohromady.
Chemické záchytky se mohou použít při velmi četných reakcích, kdy vzniká kovalentní vazba, vhodná pro navázání značené složky na vazebnou složku a vazebné složky na MOI.
Takové reakce zahrnují alkylování, tedy tvorbu etherů a thio-etherů, acylování, tedy tvorbu esterů, amidů, karbamátů, derivátů močoviny a thiomočoviny, fosforylace, například za vzniku fosfátů, fosfonátů, fosforamidů, fosfonamidů, sulfonylace, například za vzniku sulfonátů a sulfonamidů, kondenzační reakce, tedy za vzniku iminů, oximů, hydrazonů, silylování, tvorbu di-sulfidů, jakož i přípravu reaktivních meziproduktů, jako jsou nitreny či karbeny a to fotolyzou. Obecně řečeno jsou záchytky a reakce za tvorby vazby vhodné pro navázání značené složky na vazebnou složku a rovněž vhodné pro navázání na MOI, i naopak. V některých případech se může předtím podíl MOI modifikovat nebo upravit do formy derivátu, aby se tak získala záchytka, vhodná pro navázání na vazebnou složku.
Jedním typem vazby, jež se zvláště hodí pro navázání vazebné složky na MOI je disulfidická vazba. Její tvorba vyžaduje přítomnosti thiolové skupiny jako záchytky na vazebné složee a další thiolové skupiny na MOI. Mírne-oxidační podmínky pak dostačují k vzájemné reakci obou thiolů za vzniku disulfidická vazby. Tvorbu disulfidu lze rovněž indukovat použitím nadbytku -64- • · • ·· ··♦· • · ♦ · • · • · 1 t · • · • · • « • · * t # « · » • • « · · • ·· · ♦ # • • • t · • Ψ * • ·* · • · · ·· · • · • · vhodného reagens ze skupiny disulfidůji například pyridyldi-šulfidu. Protože tvorba disulfidů je reverzibilní reakcí, může se disulfid použít rovněž jako štěpitelná vazba při uvolňování značené složky, je-li to třeba. To se typicky provádí v mírně kyselém prostředí za použití vhodného výměnného činidla, jako je třeba dithiothreitol.
Zvláště zajímavá reakce pro navázání značených složek, nebo těchto složek na vazebné složky za vzniku oligonukleotidů je tvorba amidových bloků0 Záchytky typu primárních alifatických aminů lze snadno zavést do syntetických oligonukleotidů působením fosforamiditů, jako je monomethoxytritylhexylkyan-ethyl-NjR-diisopropylfosforamidit, dostupný od Glenn Research, Sterling, VA. Aminy, jak se nacházejí v přírodních nukleotidech, jako je třeba adenosin a guanosin jsou ve skutečnosti nereaktiv-ní ve srovnání s takto zavedenými primárními aminoskupinami. Tento rozdíl v reaktivitě je základem pro možnost selektivní tvorby amidů a podobně vázaných skupin, například močovinových, thiomočovinových, sulfonamidových s zavedenou primární amino-akupinou, nikoli však s aminoskupinámi nukleotidu. Při listování v katalogu Molecular Probes (Bugene, OR) zahrnuje částečné vyjmenování funkčních skupin, reagujících s aminy, aktivované estery karboxylových kyselin, isokyanáty, isothiokyanáty, sulfonylhalogenidy a dichlortriazeny. Aktivované estery jsou vynikajícími reagujícími složkami pro modifikování aminů, protože vzniklý amid jako produkt je velmi stálý. Rovněž se uvedené činidla vyznačují dobrou reaktivitou vůči alifatickým aminům, a nízkou vůči nukleotidovým aminům oligonukleotidů. Jako příklady aktivovaných esterů možno uvést estery N-hydroxyimidu kyseliny jantarové, pentefluorfenyleste-ry, tetrafluorfenylestery a p-nitrofenylestery. Aktivní estery jsou vhodné, protože se dají připravit ve skutečnosti z jakékoli molekuly, pokud obsahuje karboxylovou skupinu. Přípravy aktivních esterů jsou uvedeny v publikaci Bodansky, Principles of Peptide Chemistry, 2,vyd., Springer verlag, London, 1993. 5
Navázání vazebné složky
Typicky se použije jediný druh vazebné složky pro spojení předpokládá né sady značených složek na předpokládanou sadu MOI. Podle výhodného provedení dle tohoto vynálezu může jednoduchý a jediný postup vést ke tvorbě všech různých T-L-MOI struktur. To je zvláště výhodné, je-li sada struktur T-L-MOI velká, protože to dovoluje přípravu sady za použití postupů kombinační chemie nebo jinou odpovídající technologií. Podobně použití vazebné složky jednoho typu dovoluje provedení jedné a jednotné metody pro štěpení věch různých T-L-MOI struktur. A znovu je to výhodné pro velké sady T_L-MOI struktur protože se sada může zpracovávat souběžně, opakovaně a/nebo automatizovaným postupem.
Jsou však další provedení dle tohoto vynálezu, kdy se použijí dva či více typů vazebné složky ke spojení lišících se podskupin znpčHych složek za vzniku odpovídajících podskupin MOI. Y takovém případě se použijí podmínky selektivního štěpení k odštěpení každé z vazebných skupin nezávisle, aniž by fošlo k odštěpení vazebných složek ne jiných podskupinách MOI.
Velký počet reakcí pro tvorbu kovalentních vazeb se hodí pro navázání značené složky na vazebnou složku a vazebné složky na MOI. Patří sem alkyláce, tedy tvorba etherů a thioetherň, acylace, tedy příprava esterů, amidů, karbamátů, močovinových a thiomočovinových derivátů, řosforylace, tedy příprava třeba fosfátů, fosfonátů, fosforamidů, fosfonamidů, sulfonylace, tedy příprava sulfonátů a sulfonamidů, kondenzace, tedy třeba tvorba iminů, oximů, hydrazonů, silylování, tvorba disulfidů, 8 přípravě reaktivních meziproduktů, jako jsou nitreby anebo harbeny za použití fotolyzye Obecně lze říci, že reakce gá-chytek a vznik vazeb, které se hodí pro navázání značených složek na vazebné složky, jsou rovněž vhodné pro navázání vazebných složek na MOI a naopak. V bekterých případech může být podíl MOI předtím modifikován nebo převeden na derivát, aby se tak získala gáchytka, vhodná pro navázání vazebné složky #· ··♦· ·· ·♦ »t • · ·· ·· * · ♦ · * • « ♦ · · · · ♦· * · · · · · · ··# · · • · · t t ♦ · ♦ ··*· ♦·· ♦♦ · *« ·· -66-
Jedním typem vazby, zvlášzě vhodné pro navázání vazebné složky na MOI, je.disulfidická vazba. Jejé tvorba vyžaduje přítomnosti thiolové skupiny jako gáchytky na vazebné složce a další thiolové skupiny na MOI. Mírná oxidace pak dostačuje ke spojení obou dvou thiolů dohromady za vzniku disulfidu. Tvorbu disulfidu lze rovněž uskutečnit použitím nadbytku vhodného výměnného disulfidického činidla, jako jsou pyridyldisulfidyo Peotože tvorba disulfidů je obvykle reversibilní, mlže se disulfid použít jako štěpi-telná vazba pro uvolnění značené složky, je-li to třeba.
To se typicky provede za podobně mírných podmínek použitím nadbytku odpovídajícího thiol-výměnného činidla, jako je třeba dithiothreitol.
Zvláštnímu zájmu pro navázání vazebných složek na oligo-nukleotidy se těší amidové vazby. Primární alifatické aminosku-piny jako záchytky lze snadno zsvést do syntetických oligonukleo-tidů použitím fosforamiditů, jako je 6-monoraethoxytritylhe-xylkyanethyl-K,n-diisopropylfosforamidit, dostupný od Glenn Research, Sterling, VA. Aminy v přírodních nukleotidech, jako jsou adenosin a guanosin,, jsou ve skutečnosti nereaktivní ve srovnání se zavedenou prim.aminoskupinou. Tento rozdíl v reaktivitě je podkladem schopnosti selektivní tvorby amidů a odpovídajících vazných skupin, jako jsou močovinové, thió-močovinové, sulfonamidové vždy za reakce zavedené prim.amino-skupiny, nikoli s aminem nukleotidu·
Jak je to uvedeno v katalogu Molecular Probes, Eugene, OR, částečný výčet funkčních skupin, reaktivních vůči aminům, zahrnuje aktivované estery karboxylových kyselin, isokyanáty, isothiokyanáty, sulfonylhalogenidy a dichlortriazeny· Aktivní estery jsou vynikajícími reakcními složkami pro modifikování aminů, protože amidy, vzniklé jako produkty, jsou velmi stálé.
Rovněž se tato činidla vyznačují dobrou reaktivitou s alifatickými aminy a nízkou reaktivitou vůči nukleotidoÝým aminům oligonukleotidů Jako příklady aktivních esterů lze uvést estery H.hydroxyimidu kyseliny jantarové, pentafluurfenylestery, tetrafluorfenylestery a p-nitrofenylestery. Aktivní estery jsou -67- -67- ·· «··· ·· ··
» * · I » · ·· ·*· · ( • · f ·· ·· vhodné, protože se dají připravit skutečně z jakékoli molekuly, obsahující kar boxylovou skupinu. Způsoby příprav aktivních esterů popisuje Bodansky, viz Principles of Peptide Chemistry, 2.vyd., Springer Verlag, London 1993.
Existují četná zesítující činidla, jichž lze použít jako vazebné složky, viz např. Pierce Cross-linkers, Pierce Chemical Co., Rockford, Il0 Mezi nimi jsou homobifunkční, s aminy reaktivní zesítující činidla, jako příklad lze uvést estery a to homobifunkční imidoestery a N-hydroxysukcinimidylestery (NHS). Existují rovněž heterobifunkční zesítující reakční činidla, obsahující dvě nebo více reaktivních skupin, což umožňuje sekvenční reakce. Imidoestery reagují rychle s aminy v alkalické oblasti pH. Z NHS-esterů se získávají stabilní produkty při re8kci s primárními nebo sekundárními aminy. Jako thiol-reaktivní látky možno jmenovat imidy maleinové kyseliny, alkyl- a arylha-» logenidy, ‘H. -acylované deriváty a pyridyldisulfidy. Imidy maleinové kyyeliny jsou specifické pro thiolové (sulfhydrylové) skupiny v oblasti pH 6,5 až 7,5,V*lkc(J.ické oblasti pH mohou reagovat s aminy. Za fyziologických podmínek je thioetherová vazba stálá. Zesítující látky typu «^-halogenacetylderivátů obsahují jodace-tylovou skupinu a vyznačují se reaktivitou vůči sulfhydrylevým skupinám. Imidazolové látky mohou reagovat s jodacetylderiváty, ale reakce je velmi pomalá. Pyridyldisulfidy reagují s thiolový-mi skupinami za vzniku disulfidické vazby. Karbodiimidy spojují karboxylové skupiny s prim.aminy a hydra židy, což vede k tvorbě acyl-hydrazinové vazby. Arylazidy jsou fotoafinitními činidly, která jsou chemicky inertní při exponování ultrafialovými paprsky mebo viditelným světlem® Potolyzují-li se takové sloučeniny při 250 až 460 nm, vzniká reaktivní arylnitren. Ten je relativně nespecifický. Glyoxalové deriváty reagují z guanidi-nylovou částí argininu. Při jednom typickém provedení postupu dle tohoto vynálezu se značená složka nejprve naváže na vazebnou složku a jejich kombinace se naváže na MOI za vzniku struktury T-L-MOI. Jinak lze dospět k téže struktuře nrjprve navázáním vazebné složky na -68- -68- φφ ·· • · · « φ φ φφ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ • Φ φ φφ ·♦♦· • ♦ φ φ · φ φ φ # φ • φ · φ · · • φ · · · ···· φφφ «» φ ΜΘΙ s následnou vazbou kombinace vazebné složky a MOI na značenou složku. Příkladem je stač, kdy MOI je primírem DUA nebo oligo-nukleotidem. V takovém případě se značená složka typicky nejprve naváže na vazebnou složku a potom se kombinace T-L naváže na. DHA-primár nebo oligonukleotid, který se pak použije například při sekvenční reakci.
Jednou vhodnou vormou k použití, je-li značená složka navázána reverzibilně na MOI (například oligonukleotid nabo DNA-sekvenční primér), je použití chemicky' labilní (/.-.3 vazrbné složky. Jedním z výhodných rysů pro vazebnou složku je to, že ji lze odštěpit těkavou organickou kyselinou, např. kyselinou trifluoroctovou. Ta je zvláště kompatibilní s většinou postupů za hmotnostnš-spektrální ionizace, čítaje v to elektrosprej o
Jak to je popisováno ještě podrobněji dále, vynález za-jiattje metodologii pro genotypování. Kompozice, použitelná při postupu genotypování, zahrnuje větší počet sloučenin vzorce
Tms-L-MOI kde Tms je organická skupina, zjistitelná hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru, a případně další atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, síra, fosfor a jod. Ve výše uvedeném vzorci znamená 1 organickou skupinu, jež dovoluje Tms-části odštěpit se od zbytku molekuly9 kdeže Tm -obsahující část zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina podrobena hmotnostní spektrometrii a je zvolena ze skupiny terč. aminů, kverternizovaných amoniových solí a organických kyselin.
Ve výše uvedeném vzorci odpovídá MOI fragmentu nukleové kyseliny, kde skupina L je konjugována na MOI v jiném místě, než je 3koncovka MOI, V kompozicích nejméně dvě sloučeniny mají totožnou skupinu T , ale skupiny MOI těchto molekul zahrnují nikoli identické nukleotidové délky0
Jinou kompozicí, jež se hodí pro genotypovací postup, je ta, jež obsahuje větší počet sloučenin vzorce
Tms—ϋ—ΜΟΙ kde T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně další atom/y ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod. V uvedeném vzorci znamená L organickou skupinu, jez dovoluje odštěpení části, obsahující Tms od zbytku sloučeniny, kdeže část, obsahující Tms má funkční skupinu, jež podporuje vznik jediného ionizovaného nábojového stavu, je-li sloučenina vystavena hmotnostní spektrometrii a volí se z látek typu terč.-aminů, kvarternizovených amonio-vých zbytků a organických kyselin. V uvedeném vzorci znamená MOI fragment nukleové kyseliny, kde je L-slozka vázána na MOI v každém jiném místě, než je 3 koncovka MOI, V kompozici mají nejméně dvě sloučeniny totožnou skupinu Tms, ale tyto dvě sloučeniny nemají totožné eluční doby při sloupcové chroma-tografii.
Jiné sloučeniny, jichž je možno využít při genotypovém postupu, obsahují větší počet látek vzorce
Tms_L_Moi YY\ g kde T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden vodík či fluor, a případně další atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, síra, fosfor a jod» V tomto vzorci znamená L organickou skupinu, jež umožňuje Části, obsahující Tms odštěpení od zbytku sloučeniny, jestliže Tras-podíl obsahuje funkční skupinu, jež podporuj vznik jediného ionizovaného nábojového stavu, je-li sloučenina vystavena hmotnostní spektrometrii a funkční skupina patří mezi terč.-aminy, kvartérnizované amoniové skupiny a organické kyseliny o V uvedeném vzorci znamená MOI fragment nukleové kyseliny, kde složka 1 je konjugována na MOI v kterékoli jiné poloze, než je 3koncovka MOI. V kompozici nemají dvě slouče- ms niny stejnou MOI-nukleotidovou délku tutéž složku T .
Ve výše uvedené kompozici znamená větší počet více než 2 s výhodou více než 4. Také fragment nukleové kyseliny v MOI má sekvenci, jež je komplementární k části vektoru, přičemž fragment je schopný řídit polynukleotidovou syntézu. S výhodou -70- • ·· »·♦· ·* ·· ·♦ · · · ··«· • · · · · · ·· ♦ # · % · é ··· · · ♦ ♦ · · · t · ··· ·· · #· se skupiny Tms jako části zmíněného většího počtu liší nejméně 2 amu, a mohou se lišit nejméně 4 amu.
Vynález se také týká kompozic, obsahujících větší počet sad sloučenin, když každá sada sloučenin má vzorec ms
Tms-L-M0I kde T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně další atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod o V uvedeném vzorci znamená L skupinu, jež dovo-. luje části, obsahující Tms odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže část, obsahující T1118 obsahuje funkční skupinu, podporující vznik jediného ionizovaného nábojového stavu, je-li sloučenina vystavena hmotnostní spektrometrii a je zvolena ze skupiny terč. aminů, kvarternizovaných amoniových skupin a organických kyselin. Ve vzorci,MOI je fragment nukleové kyseliny, kde složka L je vázána na MOI v jakékoli jiné poloze, než je 3 *-koncovka MOI, V kompozicích mají členové prvé sady sloučenin totožné mí skupiny Φ nikoli však identické skupiny MOI s různými počty nukleotidů v MOI a tamže je nejméně 10 členů v prvé sadě a ve
ΤΠ Q vlastní sadě se skupiny T" liší nejméně o 2 amu. Větší počet znamená s výhodou nejméně 3, výhodněji nejméně 5.
Vynález se také týká kompozice, obsahující větší počet sad sloučenin, přičemž každá sada sloučenin má vzorec
Tms-L-M0I kde Ims znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z vodíku a fluoru, a případně další atomyjze skupiny, kterou tvoří kyslík, síra, dusík, fosfor a jod. V uvedeném vzorce znamená L organic ms odštěpit se kou skupinu, jež umožňuje části s obsahem ,ms zbytku sloučeniny, kde část s obsahem Tzahrnuje funkční skupinu, jež podporuj? jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina vystavena hmotnostní spektrometrii a je zvolena ze skupiny tere.-aminů, kvarternizovaných amoniových solí a organických kyselin. V uvedeném vzorci je MOI fragment nukleové kyseliny, kde složka L je napojena na MOI v každé jiné poloze, než je 3^-koncovka M0Io V kompozici sloučeniny v určité sade mají stejné eluční doby, nikoli však totožné skupiny Tmse Dále pak se vynález týká sestavy(kit) pro genotypování. -71- -71- ····
* ·· ···· ·· ·· ·· ·· · · t · · t · * · · · ·· • · · I · · IM · · • · · · · · · ··· ·· · ·· ··
Sestava obsahuje větší počet amplifikačních párů primerů, kde nejméně jeden z primerů má vzorec
Tms-L-MOI m kde T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spwktrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z vodíku a fluoru a případně další atomy se skupiny, kterou tvoří kyslík, síra, dusík, fosfor a jod, V uvedeném vzorci znamená L orga- ^ TM C! nickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T odštěpit se v v* g od zbytku sloučeniny, kdeže část, obsahující T“ zahrnuje funkční skupinu, podporující jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina vybavena hmotnostní spektrometrii a je zvolena ze skupiny terč.-aminů, £varternizovaných amoniových skupin a organických kyselino V uvedeném vzorci znamená MOI fragment nukleové kyseliny, kde je část L konjugována na MOI jekékoli jiné poloze, než je 3koncovka MOI. S každý primér je asociován s různým postavením. V sestavě znamená větší počet s výhodou nejméně 3, výhodněji nejméně 5.
Jak to bylo uvedeno zde již výše, tento vynález se týká kompozic a posypů zjištování sekvence nukleových kyselin v molekulách. Krátce řečeno zahrnuje takový postup obecně stupně a) přípravu značených, fragmentů nukleové kyseliny, jež jsou komplementární k molekule zvolené nukleové kyseliny (nap?, značené fragmenty) od prvého terminu do druhého terminu molekuly nukleové kyseliny, přičemž značená složka je korelativní s částí nukleotidu nebo se zvoleným nukleotidem a lze ji zjistit kterýmkoli z četných různých způsobů, a b) dělení značených fragmentů dle sekvenční délky, c) odštěpení značené části ze značeného fragmentu, a d) důkaz značené části, čímž se stanoví sekvence molekuly nukleové kyseliny. Každý z těchto aspektů je dále podrobněji probrán a diskutováno B. DIAGNOSTICKÉ POSTUPE 1. tfvod
Jak to bylo zde již uvedeno dříve, vynálezem je zajištěn -72- -72- ·· ···· ·· ··
I · · I » · ·· ··· · i
• · I • · β · velký počet způsobů, kdy se dá výše’ popisovaná značená složka a/nebo vazebná složka využít místo dosud znpmých a tradičních značení (např.radioaktivní nebo enzymové)p to s úmyslem zvýšit specifičnost, citlivost, počet vhorků, které je možno soůčasně analyzovat v rámci námi uvedeného postupu. Jako příklady takových postupů, které lze vylepšit, je možno citovat například RRS-amplifikace, viz Lizardi a spol., Bio/Technology 6, 1197-1202 (1988), Kramer a spol., líature 339. 401-402 (1989), Lomeli a spol., Clinical Chem. 3j> (9), 1826-1831 (1989), Us pat.spis 4 786 600, a dále DNA-amplifikace na použití LCR nebo PGR (polymerase chain reaction), viz US pat.spisy 4 683 195, 4 683 202 a 4 800 159.
Podle jednoho předmětu tohoto vynálezu se popisují postupy k umožnění určení identity molekuly nukleové kyseliny nebo odpovídajícího fragmentu (nebo k důkazu přítomnosti zvolené molekuly nukleové kyseliny či odpovídajícího fragmentu), zahrnující stupně a) přípravu značené molekuly nukleové kyseliny z jednoho ci více zvolených klíčových nukleových kyselin, kde značení je korelativní s příslušnou částí molekuly nukleové kyseliny a zjistitelné nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometrií, b) rozdělení značených molekul dle velikosti, c) odštěpení značených složek ze značených molekul, a d) detekci značené složky nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometričky, čímž se určí identita molekul nukleo-vých kyselin.
Podle dalšího předmětu tohoto vynálezu jsou popisovány způsoby detekce molekuly zvolené nukleové kyseliny, zahrnující stupně a) kombinování značených vzorků nukleové kyseliny s klíčovou molekulou nukleové kyseliny za podmínek a po dobu, dostačujíc k hybridizaci značeného vzorku nukleové kyseliny na komplementárně zvolenou cxlovóu sekvenci nukleové kyseliny, kde značený vzorek nukleové kyseliny je dokazatelný nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometricky, b) změnění velikosti hybridizovaného značeného vzorku, něhy brid i zo váných vzorků nebo klíčových molekul nebo hybridů vfco- rek/klíčová molekula, -73- -73- φφφφ Φ l ΦΦ φφ » Φ · 4 I Φ ΦΦ ΦΦ Φ Φ 4 Φ Φ « ΦΦ φ Φ c) rozdělení značených vzorků dle velikosti, d) odštěpení značených složek ze značených vzorků, e) důkaz značených vzorků nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometrickyp a tím zjištění molekuly zvolené nukleo-vé kyseliny. Tyto a další s tím příbuzné technické postupy jsou podrobněji diskutovány zde dále. 2. PCR (polymerázní řetězová reakce (polymerase chain reaction) PCR může znásobit potřebnou BNA-sekvenci jakéhokoli původu (viry, nakterie, rostliny nebo lidi) stokrát až miliónkrát během několika hodin0 PCR je zvláště výhodnou reakcí, protože je to reakce vysoce specifická, snadno sutomatizovatelný a schopná znásobit minimální množství vzorku. Z těchto důvodů má PCR větší dopad na klinickou medicínu, diagnostiku genetických onemocnění, soudní lékařství a evoluční biologii.
Krátce řečeno PCR je postup založený na specializované ' « v . polymerase, která může syntetizovat komplementární řetězec určené DNA ve směsi, obsahující 4 základní DITA a 2 fragmenty DITA (opriméry, každý o délce asi 20ti základů), které lemují konkrétní sekvenci. Směs se zahřeje, aby se oddělily pro-vazce dvojnásobně lemované DNA, obsahující konkrétní sekvenci, načež se ochladí, čímž se umožní 1) aby priméry nalezly odpovídající komplementární sekvence na oddělených provázcích a navázaly se tamže, a 2) aby polymerasa vnesla priméry do nových komplementárních provazců. Opakované zahřátí a ochlazení znásobí exponentiálně konkrétní DITA, protože každý z nových provazců se oddělí za vzniku dvou šablon pro další syntézu. Během asi hodiny může 20 cyklů POR znásobit konkrétní DNA miliónkrát.
Podle jednoho provedení tohoto vynálezu se popisují postupy, jimiž lze určit identitu molekuly nukleové kyseliny, nebo zjistit zvolenou molekulu nukleové kyseliny například v biologickém vzorku za využití techniky postupu s PCR. irátce řečeno zahrnují tyto postupy stupně generování serie značených ·· · ·· ···· ·· ·· • ♦ · · « · · · · • · ·· · · · · * • · · · φ · * ··· · · • · ··« · · ♦ ·♦♦♦ ♦·· ·« i ·· ·· -74- frsgmentů nukleové kyseliny nebo molekul během PCR s následným dělením vzniklých fragmentů, dle jejich velikosti. Stupeň dělení dle velikosti se může provádět použitím kterékoli ze zde popasované techniky, čítaje v to například gelovou elektrofo-rezu (třeba gélovou elektroforezu na polyakrylamidu) nebo s výhodou vysokotlakovou kapalinovou chromátografii. Značené složky se potom oddělí od fragmentů a zjistí se odpovídající detekční technologií,, Příklady takových technologií jsou zde popisovány a zahrnují například hmotnostní spektrometrii, infrs-červenou spektrometrii, potenciostatickou amperometrii nebo ultrafialovou spektrometrii. 3. -přesný přepis a diferenční displej
Je-li šablonou RNA, pak prvým stupněm přepisu je reverzní přepis. Liang a Pardee, Science 257. 967 (1992) byli urvi podepsaní na protokolu RNA—ořeoisu to za noužití priméru pro reverzní přepis, založený na oligo (dT), ale se zakotvením dvou bází na 5 ‘"-koncovce, tedy např* oligo 5 "-(dT^ )-CA-3 ". Napojení se projeví hlavně na 3 "-koncovce póly CrA)-o času a hlavně sekvencemi, končícími 5" -UpG-póly (rA )-3 ", to se selektivním přiblížením jedné složky z 12 polyadenylova-ných RNAs, Po reverzní transkripci a denaturaci dojde k libovolnému napojení na vzniklý prvý řetězec cDNA, PCR se může nyní znovu použít ke generování otisků produktů, které nejlépe vyhovují primérům a odvozují se od 3 "-koncovky mRNA a polyadeny-lovaných.heterogenních RNA. Tento protokol byl označen jako "diferenční displeje
Jinak se může použít v prvém stupni reverzní transkripce libovolný primér za volby těch vnitřních oblastí ve vztahu k RNA, které mají 6-8 základních svazků na 3"-koncovce priméru.
Toho se docílí nahodilým napojením vzniklého prvého provazce cDNA na týž nebo jiný nahodilý jbrimér a potom použitím PCR.
Tento případný protokol zachytí vzorky kdekoli v RNA se zahrnutím běžně čtených rámů, viz Welsh a spol., Nucl.Acids Res. 20, 4965 (1992). Dále pak se může použít na RNA, které nebyly polyedenylovány, jako je tomu v případě četných bakterielních RNA„ Varianty otisků RNA nahodilými priméry PCR jsou označovány RAP-PCR* ·· ·«·· ·· ·«·· • ♦·
• · · · · · # • « ··· I » «I • t · · ·· · ···· * • · ··· ··· «······ ·· # · β «* -75-
Provádí-li se přesný přepis RNA nahodile napojených PCR za použití vzorků, založených na buňkách, tkáni či dalším biologickém materiálu, který byl vystaven různým pokusným opatřením nebo jde o lišící se historky vývoje, pak lze zjistit rozdíly v genové expresi mezi vzorky. Pro každou z reakcí se předpokládá, že došlo k témuž poctu efektivních PCR-zdvojo-vacách možností a jakékoli rozdíly v počátečních koncentracích cDRA-produktů jsou pokládány za poměr intenzit konečného přesného přepisu. Nejsou zde rozumné vztahy mezi intenzitami pásů v rámci jediného pásu na gelu, což je funkcí přizpůsobivosti a nsdbytkuo Avšak poměr mezi pásy se uchová pro každý vzorek RPTA, což dovoluje zjištění diferenčně exprimovaných RIJA. Poměr výchozích látek mezi vzorky se udržuje, i když počet cyklů je dostačující k nasycení PCR reakce. Je to proto, že počet zdvojení, nutných k dosažení naáycení je takřka dokonale kontrolován invariantními produkty, které doplňují z velké míry přesný popis0 Z tohoto hlediska se liší PCR-přes-ný popia odf běžného PCR jediného produktu, ve kterém není zachován poměr výchozích materiálů mezi vzorky, pokud se produkty vzorkují v exponentiální fázi rozšíření.
Podle jednoho rysu tohoto vynálezu jsou popisovány způsoby pro zjištění totožnosti molekuly nukleové kyseliny nebo pro zjištění molekuly selektivní nukleové kyseliny, např, v biologickém vzorku za použití postupu RNA-přesného přepisu.
Krátce řečeno takové postupy obecně zahrnují stupně generování serie značených fragmentů nukleové kyseliny. Fragmenty generované pomocí PCR nebo podobnými násobnými schématy se potom dělí s ohledem na jejich velikost. Stupeň dělení dle velikosti může být například kterýkoli z technických postupů, jek jsou zde popisovány, to se zahrnutím například gelové elektroforézy (např. polyakrylamidové gélové elektroforezy) nebo s výhodou lze použít vysokotlakovou kapalinovou chromáto-grafii. Značené složky se potom odštěpí z oddělených fragmentů, načež se značené složky detegují odpovídající detekční technologií. Jako příklady použitelných technologií možno uvést hmotnostní spektrometrii, infračervenou spektrometrii, poten-ciostatickou amperometrii nebo ultrafialovou spektrometrii. Relativní množství fragmentů té či oné nukleové kyseliny důle- • · • ♦
• 9 ···· Μ ·· • ·' ♦ · ♦ · · • · I · · ·· t · · · 9 99 · · · 9 9 9 · · · ♦· I 99 9» -76- žitá nejsou, ale velikost pásu je informaticní se zřetelem na kontrolovaný vzorek. 4. PCR jedino-pásový konformační polymorfizmus na základu fluorescence (PCR-SSCP)
Pro analyzování základního substitučního polymorfizmů je k mání určitý počet postupů navíc k postupu RFLP. Orita a spol. poukázali na analýzu takových polymorfizmů na základě konformačních rozdílů denaturovaná DNA. Krátce řečeno: použije se restrikční enzymová digesce nebo PCR pro produkci poměrně malých fragmentů DNA, které se potom denaturují a rozdělí elektroforezou na nedenaturujících polyakrylsmidových gelech, Konformační rozdíly v jedino-pásových fragmentech DNA, vzniklé základními substitucemi, se zjistí elektroforezou, tedy elektro-foretickými posuny mobility.Vnitřne-pásové párování vytvoří jedino-pásové Iconformace, jez jsou vysoce sekvenčně specifické a rozdílné z pohledu elektroforetické mobility. Avšak detekční rychlosti v různých studiích za použití běžného rozsahu SSCP kolísají od 35% do .takřka 100% s tím, že nejvvšší detekční poměry často vyžadují nšfo^íLk lišících se podmínek. V zásadě se postup může použít také k analýze polymorfizmů na základě krátkéKrsunutí či opomenutío Tento postup jest jedním z nejúčinnějších pro identifikování mutačních bodů a vysunutí v DNA (SSCP-PCR, Dean a spol., Cell 6l, 863 (1990).
Podle jednoho provedení tohoto vynálezu se popisuje způsob stanovení totožnosti molekuly nukleové kyseliny, nebo důkazu molekuly selektivní nukleové kyseliny například v biologickém vzorku za použití postupu OCR-SSP. V zkratce: takové postupy obecně zahrnují stupně generování serie značených fragmentů nukleové kyseliny. Fragmenty, generované PCR, se potom dělí dle velikosti. S výhodou je stu-pen delení dle velikosti nedenaturující a fragmenty nukleové kyseliny se denaturují před použitím metodologie dělení. Stupeň dělení dle velikosti se dá uskutečnit například gelovou elektro- ·♦ ♦··· Μ ·· # · ·· ·· · ♦ · · * • · · · · · · ♦♦ • · · · « # # ···· · • · ··« ·«· ···· ··· ·# t ·· ·· -77- fořežou, například na polyakrylamidu nebo s výhodou použitím vysokotlakové kapalinové chromátografie, Značené vzorky se potom odštěpí z rozdělených fragmentů a potom se značené vzorky detegují odpovídajícím detekčním postupem, například hmotnostní spektrometrií, infračervenou spektrometrií, potenciostatickou amperometrií nebo ultrafialovou spektrometrií, 5. Didesoxy-přesný přep±s(ddE, Diceoxy Eingerprinting)
Byl popsán další postup, tedy ddP, Sarkar a spol., Genomics 131 441 (1992), dokazující 100% jednobásových změn v genu lidského fagtoru IX, to přu testování retrospektivním i prospektivním způsobenu Celkově 84 z 84 různých sekvenčních změn bylo detegová-no, byla-li genomická DBA analyzována s použitím pacientů s haemo-filií Bo V krátkosti je jedním z postupů aplikace značených složek při genotypování a dalších postupech didesoxy-přesný přepis. Tento postup využívá didesoxy-terminátoru při Sanger-ovš sekvenční reakci. Postup je v podstatě tento: cílová nukleová kyselina, u níž se má. provádět sekvencování, se vnese do reakce, kde je didesoxy-terminátor, komplementární k základu, který se má mutatovat v cílové nukleové kyselině, Například je-li výsledkem mutace změna A-^ G, pak se reakce provede v C didesoxytermináto-rovém prostředí. Použijí se PCR priméry k lokalizování a znásobení zajímavých sekvencí cílové kyseliny, Jesliže hypotetická cílová sekvence obsahuje změny A-^.G, pak se velikost populace sekvencí změní v dosledku vřazení didesoxy-terminátoru do znásobených sekvencí. Při takovém použití značených složek by vznikl fragment, který by měl předem určenou velikost v případě mutace,Značené složky by se napojily na 5'-koncovku PCR primérů a dosáhlo by se mapování typu vzorku a typu didesoxyterminátoru. Došlo by k PCR ampflifikační reakci, vzniklé fragmenty by se rozdělily dle velikosti například použitím vysokotlakové kapalinové chro-matografie nebo PAGE. Ba konci postupu dělení by se shromáždily • · ♦ · ·♦·· • · ···
·· «· ♦ · · · » • · · ·· • ♦ «·· · · • · · * « ♦· ·· -78- fragmenty DNA v časovém referenčním rámu, značené vzorky by se odštěpily a přítomnost či nepřítomnost mutace by se stanovila dle délky řetězce v důsledku předčasného zásahu terminátoru řetězce vsunutím uvedeného didesoxy-terminátoru.
Je důležité připomenout, že výsledkem ddP je zisk či ztráta didesoxy-terminátorového segmentu a/nebo posun mobility nejméně jednoho segmentu po terminaci nebo jednoho z produktů, Proto při tomto postupu je hledán posun mobility fragmentu za využití mohutného pozadí dalších fragmentů molekulárních hmotností, Jednou z výhod je předběžná znalost délky fragmentu ve spojitosti s danou mutací.
Podle jednoho provedení tohoto vynálezu se popisují postupy pro zjištění totožnosti molekuly nukleové kyseliny, nebo pro důkaz molekuly zvolené nukleové kyseliny, například v biologickém vzorku za použití techniky ddP, Tyto postupy zahrnují stručně stupně generování serie značených fragmentů nukleové kyseliny s jejich následným dělením dle velikosti, S výhodou je stupeň dělení dle velikosti nedenaturační a fragmenty nukleové mkyseliny se denaturují před dělícím pochodem. Stupeň dělení dle velikosti se dá provést například gelovou elektroforezou (například na polyakrylamidu) nebo s výhodou použitím vysokotlakové kapalinové chromátografie. Značené složky se potom odštěpí z oddělených fragmentů a potom se tyto značené složky zjistí odpovídajícím detekčním postupem, například hmotnostní spektrometrií, infračervenou spektrometrií, potenciostatickou amperometrií nebo ultrafialovou spektrometrií.
6. ^esfrikční mapy a RFLP
Restrikční endonukleasy rozpoznají sekvence krátkých DNA a rozřež8u molekuly DNA na specifických místech. Některé z restrikčních enzymů {krátkořezné) dělí DNA nepříliš často, takže vzniká malý počet značně velkých fragmentů (několik tisíc až milion bp). Povětšinou však enzymy dělí DNA častěji, takže tím vzniká velká počet fragmentů malých (pod 100 až nad 1000 bp)o V průměru lze říci, že restrikční enzymy s místy roz- • · • « ·· ···· • · • % • ♦ • * ·· • t ·· • · · * • · ·· • ··· · · • · · ·· Μ -79- poznáním čtyř bází vedou ke kouskům dlouhým 25$ bází, s místy rozpoznáním šesti bází ke kouskům délky 4000 bázi, a s místy rozpoznáním osmi bází ke kouskům délky 64 000 bází. Protože byla charakterizována sta různých restrukčních enzymů, lze nařezat DNA na četné, lišící se malé fragmenty.
Je znám velký počet technických postupů pro analýzu po-lymorfižmu SNA. Nejpoužívajší postup, přístup přes polymorflsmus restrikce fragmentu délky (restriction fragment length póly-morphism, RFPL), kombinuje restrikční enzymovou digesci, gelovou elektrofořezu, nasátí na membránu a hybridizaci na vzorek klonované DNA. Polymorfizmus se zjistí jako variace délek značených fragmentů na místech nasátí. Přístup RFLP se dá použít pro analýzu bázových substitucí, kde sekvenční změna spadá do místa restrikčního anzymu nebo pro analysu minisatelitů/VNTR za volby restrikčního enzymu, který dělí vně opakující se jednotky. Aga-rosové gély se obvykle nevyznačují nutnou schopností dělit,aby bylo možno rozeznat minisatelity/VNTR lišící se jedinou opakující se jednotkou, ale četné minisatelity/VNTR jsou tak variabilní, že se tak dají získat vysoce informativní místa značení.
Podle jednoho rysu tohoto vynálezu je popisován postup prokázání totožnosti molekuly nukleové kyseliny, nebo detekce molekuly zvolené nukleové kyseliny například v biologickém vzorku za použití techniky restrikčního mapování nebo RFLP. V krátkosti tyto postupy obvykle zahrnují atupně generování serie značených fragmentů nukleových kyselin, kdy se generované fragmenty vystaví digesci restrikčními enzymy. Značené fragmenty vznikají provedením hybridizačního stupně značeného vzorku s digestovanou klíčovou nukleovou kyselinou. Hybridizační stupeň lze provést před nebo po digesci restrikční nukleasou. Získané fragmenty nukleové kyseliny po digesci se potom dělí dle velikosti. Stupeň dělení dle velikosti se dá provést například gélovou elektrofo-rezou (například na polyakrylamidovém gélu) nebo s výhodou vy-sokotlakovou kapalinovou chromatografií. Značené složky se potom odštěpí z oddělených fragmentů a provede se jejich detekce odpovídajícím detekčním způsobem, například hmotnostní spektrometrií, infračervenou spektrometrií, potenciostatickou amperometrií nebo ·· ···· «· ·· * I Μ · · · · · · ♦ • « · · ♦ «··· • · · # · · ··#··· • # * * « · · · ···· ·*· «I * Μ ΙΑ -80- ultrafialovou spektrometrií. 7. DNA-přesný přepis DNA-přesný přepis zahrnuje zobrazení sady fragmentů DNA se specifického vzorku DM. Jsou známé četné postupy DNA-přesného přepisu, viz Jeffries a spol., Nátuře 314·. 67 (1985), Welsh a McClelland, Nuc.Acids Res. 19, 861 (1991), nejvíce se používá PCR pro generování fragmentů. Volba, který z technických postupů přesného přepisu se má použít, záleží na aplikaci, například typování DNA, mapování značené DNA, jakož i na organizmu, který se má sledovat, například Prokaryonta, rostliny, zvířata, lidi. Určitý počet postupů přesného přepisu, vyhovujících těmto požadavkům, byl popsán v několika málo předchozích létech, čítaje v to nahodile násobení polymorfní DNA ;(RAPD), násobení DNA přesným přepisem (DAF) a nahodile napájená! PCR (AP-PCR). Tyto metody jsou všechny založeny na amplifikaci genomické DNA, resp.odpovídájících fragmenty nahodile zvolenými priméry PCR. Podklady fragmentů DNA se mohou generovat z jakékoli DNA bez předchozí znalosti sekvence. Vzniklé šablony jsou závislé na sekvenci primérů PCR a na povaze templátu DNA. PCR se provádí za nízkých anelovacích teplot, aby totiž mohly priméry anelováním přilnout na více míst na DNA. Generování fragmentů DNA se provádí, jsou-li vazná místa primérů ve vzdálenosti, jež dovoluje amplifikaci. V podstatě je jediný primér dostačující pro vznik šablon.
Byl popsán nový způsob DNA-přesného popisu, nazvaný AFLP, viz Vos a spol., Nuc.Acids Res. 23., 4407 (1995). Postup APLP je založen na detekci genomických restrikčních fragmentů ampli-fikací PCR a může využít DNA jakéhokoli původu a komplexnosti. V krátkosti: přesné přepisy se získají bez předchozí znalosti sekvence za použití omezené sady generických primérů. Počet fragmentů, detegovaných v jediné reakci může být vyladěn volbou sad specifických primérů. Postup APLP je robustní a spolehlivý, protože se používají přísné reakční omezující podmínky pro ane-lování primérů. Spolehlivost postupu RPLP se kombinuje s výhodami postupu PCR. • « ·· · ♦ • · · ♦ * · ♦ • · * ··· ·♦ «« «« • · · · • · ·· • ·♦·· ♦ • · · ·· ·· -81- V rámci tohoto vynálezu se popisují způsoby prokázání totožnosti molekuly nukleové kyseliny, nebo detekce vyvolení molekuly nukleové kyseliny, například v biologickém vzorku za použití postupu DNA přesného přepisu. V krátkosti takové postupy zahrnují stpně generování serie znamených fragmentů nukleové kyseliny s následným rozdělením těchto fragmentů dle velikosti. Stupeň dělení dle velikosti se dá provést použitím například gélové elektroforézy, například na poly-akrylamidovém gélu nebo,a to s výhodou vysokotlakovou kapalinovou chromátografix. Značené složky se potom odštěpí z oddělených fragmentů a detegují se odpovídajícím detekčním postupem, například hmotnostní spektrometrií, infračervenou spektrometrií, potenciostatickou amperometrií nebo ultrafialovou spektrometrií. 8. Použití štěpitelných značených složek pro geno-typování a detekci polymerfozmu. a) ifvod Ačkoliv je známo několik málojpolymorfizmů lidských DNA na základě vsunutí, opomenutí nebo jiného uspořádání neopakujících se sekvencí, daleko vyšší počet je založen bud na substituci jedné základní složky, nebo na změnách počtu opakujících se tandemů. Substituce základních složek jsou v genomií lidí převažující, dochází k nim jednou vždy za 200 a 500 bp. Měnění délky tandemů základních složek je rovněž obvyklým postupem v genomii, to za nejméně desítek tisíc promíchaných polymorfních míst (označovaných termínem "loci"). Opakující se jednotky pro opakovaný polymorfizmus tandemů kolísají v rozsahu od 1 pb v sekvencích (dA)n(dTn do nejméně 170 bp v oč-satelitních DNA. Polymorfizmus opakujících se tandemů lze rozdělit do dvou větších skupin, tedy minisatelity s měnícím se počtem opakovaných tandemů (VNTRs) s opakovanými délkami desítek párů základních složek a s desítkami až tisíckami celkově se opakujících jednotek, a minisatelity s opakujícími sadélka- • · 4 4 4 ♦ ···· · ♦ · t«#« ·· ♦· • · ♦ · · · « * · · « « ·ι 4 4 · · ··· · · • 44 4 · 4 • 4 4 ·· ·4 -82- mi až do 6 bp a s maximálními celkovými délkami asi 70 bp.
Největší počet mikrosatelitních polymorfizmů, zjištěných k tomuto datu je založen na opakujících se sekvencích (dC-dA)n nebo dG-dT)n dinukleotidů. Analýza mikrosatelitního polymor-fizmu zahrnuje amplifikování polymerázovou řetězovou reakcí (PGR) malých fragmentů DUA, obsahující opakující se základní bloky s následnou elektrofo^eou amplifikované DUA na denaturo-vaném polyakrylamidovém gelu. PCR-priméry jsou doplňkovými složkami jednotlivých sekvencí, jež jsou na stranách opakujících se bloků. Používá se pólyakrylamidové gel, spíše než agarosové gely, a to již tradičně pro mikrosatelity, protože malé shluky se (tzv.allely) často liší jen velikostí jediné opakující se jednotky.
Takže do rozsahu tohoto vynáletu spadají postupy pro geno-typování zvolených organizmů, zahrnující stupně a) generování molekuly značené nukleové kyseliny ze zvolené cílové molekuly, kde značená složka je porovnatelná s tím či oním fragmentem a lze ji zjistit nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometričky, b) dělení značených molekul dle sekvenční délky, c) odštěpení značených složek ze značené molekuly, a d) detekce značené složky nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometričky, a tím se stanoví a zjistí genotyp organizmu.
Podle dalšího aspektu jsou popsány postupy pro genotypování zvolených organizmů, zahrnující stupně a) kombinování moke&uly značené nukleové kyseliny a vybrané cílové molekuly za podmínek a po dobu, dostačující k průběhu hybridizace značené molekuly na vybranou molekulu, přičemž značená složka je korelativní s příslušným fragmentem a může se zjistit nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky, b) rozdělení značených fragmehtů dle sekvenční délky, c) odštěpení značených složek ze značených fragmentů, a d) detekci značené části či složky nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky, čímž se stanoví a určí genotyp organizmu. ·· »9»« Μ · • ♦ ·· · « # · t « • · t · · • · · t ···+ ··· *· *· ·· • · · # ♦ • » · ·· « · ft* · · « * * · -83- b) . Použití odštěpitelných značených složek pro genoty pování.
Použití PCR pro identifikování polymorfizmu restrikční délky fragmentu (RPPL, restriction fragment length polymorphism) kombinuje gelovou elektroforezu a detekci značených složek, asociovaných se specifickými priméry PCR. Obecně budou mít PCR priméry jednu specifickou značenou složku. Značená složka bude tedy reprezentovat jednu sadu PCR-priméru a tudíž také předem stanovenou délku fragmentu DNA.. Polymerfizmus se zjistí dle variací délek značených fragmentů, v gélu nebo eluováním z gélu. Pólyakrylamidová gelová elektroforeza zpravidla dostačí k rozdělení, jež je nutné pro rozlišeni poměrů minisatelitů v a VNTR-allelek, lišících se pouze jedinou opakující se jednotkou. Analýza polymorfizmu mikrosatelitů zahrnuje amplifikaci polymerázníéřetězovou reakcí (PCR) malých fragmentů DUA, obsahujících bloky opakujících se jednotek s následující elektrofo-rezou amplifikované DNA na denaturovaném polyakrylamidovém gélu nebo s následným dělením fragmentů DNA vysokotlakovou kapalinovou chromátografií. Amplifikovaná DNA se opatří značením za použití primérů, které mají odštěpitelnou značenou složku na 5 koncovce priméru. Priméry se vsunou do nově syntetizovaných provazců extBHzzí řetězců. PCR priméry jsou komplementárními složkami jednotlivých sekvencí, jež jsou bočně umístěny na opakujících se blocích. Polymorfizmus minisatelitů versus VNTR se rovněž může amplifikovat, více než s mikrosatelity, jak je to popsáno zde výše.
Popis četných typů polymorfizmu DNA sekvencí poskytl závažný základ pro porozumění struktuře lidských genomů, viz Botstein a spol., Am.J.Human Genetics 32, 314 (1980); Donis-Keller, Cell 51. 319 (1987), Weissenbach a spol., Nátuře 359, 794. Konstrukce extenzivních rámových vazeb a jejich map byla usnadněna použitím polymorfizmů těchto DNA a byl tím dán praktický podklad pro lokalizování nevhodných genů pomocí vazeb. Značené mikrosatelitními dinukleotidy se ukázalo být velmi účinným prostředkem při identifikování lidských genů, kdy se ukázalo, že obsahují mutace a v některých případech příčinu onemocnění. Dpakování se geno- -84- -84- «# · « 4 · I • ♦ · « • · · ··· *· ♦ · ···· tf ·♦ » · · · · * I · Μ • · ♦♦· · ♦ f 4 « t mockých dinukleotidů je vysoce polymorfní, viz Weber, 1990,
Genoraic Aaalysis, sv.l, str.159 181, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, dále Weber a Wong, 1993, Hura. Mol.Genetics £, str-il23 , a může se jednat až do 4 allelek. Opakova mikrosatelitní dinukleotidy lze amplifikovat použitím primérů, komplementárních k jednotlivým oblastem, obklopujícím opakovaný dinukleotid za použití PCR. Další amplifikace^i několik amplifikováných "loci" se může kombinovat (násobně) před stupněm dělení dle velikosti· Postup použití amplifkkovaných 1 v mikrosatelitních fragmentů na stupen dělení dle velikosti a pak zjištění velikosti a tudíž i identifikace allelek je znám jako genotypování. Specifické chromosomní značení, jež dovoluje vysoký multiplexní stupen, bylo uvedeno jako umo žitu jící celý genomní rastr pro vazbcm analýzu, viz Davies a spol., Dature 371« 130 (1994).
Značené složky se Mohou použít ke zvýšení efektu při genotypování použitím mikrosatelitů. V krátkosti se konstruují PCR primery, aby měly značené složky s použitím v pečlivě zvolené oblasti PC reakce k apíifikování opakování di-, tri- nebo tetra-nukleétidu. Amplifikované produkty se potom dělí dle jejich -velikosti použitím postupů, jako je vysokotlaková kapalinová chromato-grafie nebo PAGE. Fragmenty DRA se potom jímají v časových odstupech, značené složky se odštěpí z jejich odpovídajících fragmentů DRA a délka se odvodí ze srovnání s vnitřním standardem ve stupni dělení dle velikosti. Identifikování allelek proběhne s odkazem na velikost amplifikovančh produktů.
Za použití odštěpitelných značených složek při genotypování je možno spojit několik vzorků, dokonce větší počet do jediného stupně dělení. Jsou zde v podstatě dvě možnosti, jak se může toto provádět. Při prvém obecném postupu g přihlédnutím k velmi důkladnému třídění je zjištění jednotného polymorfismu ve velikých skupinách jednotlivých látek důležité. Při tomto scénáři se použije jednotná či složená sada PCR primérů a každá z amplifikací se provede jedním typem DRA vzorku na reakci. Počet vzorků, které se mohou prokombinovat ve stupni dělení je úměrný počtu odštěpitelných značených složek, které lze generovat detekční techno-
99 ·· 9 9 9 9 · 9 9 9 99 9 9999 9 9 9 9 99 ·9 ♦♦ ···· -85- logií (například 400 až 600 při hmotnostní spektrometrii zaače ných složek). Je tedy možno identifikovat jeden až několik polymorfizmů současně ve velké skupině individuálních složek. Druhou možností je použití většího počtu sad PCR primérů, které mohou identifikovat početné polymorfizmy na jediném vzorku DNA (genotypování jednotnosti vzorku). Při tomto postupu se PCR pr-i-mery kombinují při jediné amplifikační reakci, kdy dojde ke generování PCR produktů různých délek. Každý primární pár nebo promíchaná sada se zakóduje specifickou odštšpitelnou značenou složkou, což znamená, že každý PCR fragment bude zakódován Specifickou značenou složkou. Reakce se provede v
značených složek, které lze generovat detekční technologií (např. 400 až 600 pro hmotnostní spektrometrii značených složek). c) Enzymová detekce mutace a použití značených složek Při této konkrétní aplikaci nebo metodě se detegují nahodilé směsi v heteroduplaxech enzymovým štěpením promíchaných základních párů. v duplexu dané nukleové kyseliny. DNA sekvence, které se mají zjistit se zřetelem na přítomnost mutace se amplifikují pomocí PCR za použití specifické sady primérů, amplifikované produkty se denaturují a smíchají s denaturovanými referenčními fragmenty s následnou hybridizací, výsledkem je tvorba heteroduplexů. Na ty se potom působí enzymy, které rozpoznají a štěpí duplex, jde-li o nahodikou směs. Takovými enzymy jsou nukleasa Sl, nukleasa z bobů "Mungo1’, "resolvasy", T 4 endo-nukleasa IV atd. V podstatě se dá použít kterýkoli enzym, který rozefcná nahodilé směsi in vitro a dovede štěpit vzniklou nahodilou směs. Působením vhodného enzymu se duplexy DNA oddělují dle velikostí, například použitím vysokotlakové kapalinové chro-matografie nebo PAGB. Fragmenty DNA se jímají v závislosti na čase. Značené složky se odštěpí a detegují. Přítomnost mutace se zjistí posunem mobility fragmentů relativně proti zvolenému referenčnímu standardu. ·♦ ·♦ • · · « • · ·· ··· · ♦ • t · «· ·· ·· · ·· ···· • ♦ ·· ♦ · · • « « I · • * ♦ · · · • · · · · ···♦ ··· ·· · -86- d) Použitelnost značených složek na test oligonukleotidové ligace (OLA, oligonucleo-tide ligation).
Oligonukleotidový ligační test, jak byl původně popsán, viz Landegren a spol., Science 241, 498 (1988), je užitečným postupem pro identifikování sekvencí (známých) ve velmi velkých a komplexních genomech. Princip reakce OLA je založen na schopnosti 3-igasy kovalentně spojit dva diagnostické oligonukleotidy, protože ty se vzájemně hybridizují jeden na druhého na zvolené DNA. Není-li sekvence, nebo nejsou-li sekvence spojů vzorků dokonale párově propojeny, tak se takové vzorky působením ligesy nespojí. Schopnost termostabilní ligasy diskriminovat potenciálně jednotné párové (základních složek) rozdíly, jsou-li umístěny na 3 koncovce horního vzorku,skýtá možnost štěpení s přihlédnutím k jednotnému páru základních složek, viz Barony, PNAS USA 88, 189 (1991). Při použití značených složek se tyto napojí na vzorek, který se uloží na applifikovaný produkte Po skončení OLR se fragmenty oddělí na podkladu jejich velikosti, značené složky se odštěpí a zjistí hmotnostní spektrometrií. e) Sekvenční specifická amplifikace
Priméry PCN s 3koncovkou, komplementární buď k mutantu nebo normální oligonukleotidové sekvenci se použijí k selektivnímu amplifikovéní jedné či jiné allelky, viz Newton a spol., Nuc.Acids Res. 17, 2503 (1989), Genomics 535 (1989), Okayama a spol., J.Lab.Clin 114, 105 (1989), Sommer a spol., Mayo Clin. Proč. 6£, 1361 (1989), Wu a spol., PNAS USA 86, 2757. Zpravidla se produkty PCR zviditelní po amplifikaci použitím PAGE, ale princip sekvence specifické amplifikace se může použít na formátu pevné fáze. f) Potenciální použitelnost značených složek při některých testech, založených na amplifl kaci.
Potenciální použitelností značených
Genotypování virů: ·· • • · ·· • ♦ • • • • ···· # ♦· ·· ·«·· ·· Μ • · · ♦ ♦ · · · ♦ • · · -87- složek je genotypování nebo identifikování virů hybridizo-váním se vzorky značených složek. Tak například F+RHA koli-fágy mohou být vhodnými látkami jako indikátory vnitřního virového kontaminování. Genotypování postupem hybridizace nukleo-vých kyselin je spolehlivá, rychlá, jednoduchá a nenákladná alternativa pro serotypování, viz Kafatos a spol., Fucl.Acids Res. J, 1541 (1979). Amplifikační postupy a postup hybridizace nukleové kyseliny byly s úspěchem použity při klasifikování různých mikroorganizmů, čítaje v to E.coli, viz Feng, Mol.
Cell Probes J, 151 (1993), rotaviru, viz Sethabur a spol., J. Med.Virol. 2j_, 192 (1992), viru hepatitidy C, viz Stuyver a spol., J.Gen.Virol. 74, 1093 (1993) a viru herpes simplex, viz Matsu-moto a spol., J.Virol.Methods 40. 119 (1992),
Prognostická aplikovatelhost mutační analyzy rakovin: Genetické změny byly popsány u četných pokusných savčích i lidských neoplasmů a představují morfolický podklad pro sekvence morfolfcgáckých změn, pozorovaných v souvislosti s karcinogenesí, viz Vogelstein a spol., HEJM 319. 525 (1988), V posledních le-tch s postupem techniky molekulární biologie byly nejvíce studovanými obory allelické ztráty na četných chromosomech nebo mutace supresorových genů tumorů, jakož i mutace některých onkogenů(např, c-myc, c-jun a rasově-rodinných), Práce Finkel-steina a spol., Arch.Surg. 128, 526 )L993) zjistila porovnání mezi specifickými typy mezi místy mutací H-ras onkogenu a stadiem diagnosy rakoviny kolorektální. Z výsledků plyne, že mutační analýza by mohla poskytnout důležité informace o tumorové agresivitě, čítaje v to šablony a postup metastazy. Prognostická cena TP35 a K-ras-mutační analyzy při rakovině stadia III tlustého střeva byla v poslední době dokázána, viz Pricolo a spol., Am.J.Surg. 171. 41 (1996). Je tedy zřejmé, že genotypování tumorů a prekancerových buněk a specifická mutační xetekce budeu stál vy důležitějšími při léčbě rakoviny lidí. C, Dělení fragmentů nukleových kyselin
Vzorek, který se má analyzovat, bývává často směsí čet -88- ·· ·♦ ♦·♦· ·· • · ·· · ♦ · ···· • · · I · · · ♦· • · · · · · ♦ ··· · · • · ··· ··· ···· ♦♦· ·♦ · ·· ♦· složek v komplexní matrici. Tak například ve vzorcích, obsahujících neznámé sloučeniny, se musí složky nejprve vzájemně od sebe oddělit tak, že každou individuální složku lze identifikovat jinými a dalšími analytickými postupy. Se zřetelem na dělení jsou vlastnosti komponent ve směsi konstantní za konstantních podmínek, a tedy pokud jsou jednou již stanoveny, mohou se použít k identifikování každé ze složek, jakož i k zjištění v množství takové složky. Takové postupy jsou typickými pri postupech dělení chromátograficky či elektroforeticky. 1, Vysokotlaková kapalinová chromátografie (HPLC)
Tento postup jako způsob chromátografického dělení slouží k oddělení látek, které jsou rozpuštěny v roztoku. Příslušný přístroj sestává ze zásobníku mobilní fáze, čerpadla, injektoru, dělící kolony a detektoru. Sloučeniny se dělí injikováním alikvot-ních podílů vzorku směsi na kolonu. Různé složky směsi procházejí kolonou různými rychlostmi v důsledku jejich rozdělení mezi mobilní kapalnou fázi a stacionární fázi. V poslední době bylo zjištěno, že částečky Ip-RO-HPCL a ne-porézní PS/DVB s chemicky navázanými alkylovými řetězci jsou rychlými alternativami pro kapilární elektroforezu při analýze jak jednoprovazcových, tak i dvojitě provazcových nukleových kyselin za podobného stupně štěpení, viz Huber a spol., A hal. Biochem. 212, 351 (1993, Huber a spol., Nucl.Acids Res. 2JL, 106l (1993), Huber a spol., Biotechniques 16, 898 (1993). Na roddíl od iontově výměnné chromatografie, jež často nezadržuje dvojité provazcovité DNA ve funkci délky provazce (protože AT páry základních složek vzájemně reagují s kladně nabitou stacionární fáfeí, a to silněji, než GG páry základních složek) dovoluje IR-RP-HPLC dělení v přísné závislosti na velikosti.
Způsob, který byl popsán, používá lOOmM triethylamoniumacetát jako reagens, spojující ionty a fosfodiestery oligonukleotidů se dají s úspěchem dělit na neporézních Částečkách fM poly(styren~ divinylbenzenu) použitím vysooe výkonné kapalinové chromatografie, ·· · ·· ···· ·· ·· • · · · · · · t · · t ·· · · · ···· • * · · · · · ··· t t • · · · · · t · ···· ··· «· · tt ·# -89- viz Oefner a spol., Anal.Biochem. 223, 39 (1994). Popsaný postup dovoluje oddělení PCPl produktů., lišících se pouze čtyřmi až osmi páry základních složek v délce rozsahu 50 až 200 nukleotidů 2. Elektroforeza
To je postup dělení, založený na pohyblivosti iontů (nebo· DM, jak je to v zde popisovaném případě) v elektrickém poli. Negativně nabité částečky DM se pohybují směrem ke kladné elektrodě a kladně nabité ionty směrem k záporné elektrodě. Z bezpečnostních důvodů je obvykle jedna z elektrod u dna a další v jinde, at již kladná Či záporná. Nabité částečky se vyznačují různými migračními rychlostmi v závislosti na jejich celkovém náboji, velikosti a tvaru a mohou se proto oddělovat. Aparát s elektrodami je spojen se zdrojem napětí o vysoké voltáži, obsahuje elektrody, pufr a podklad pro pufr, jako je polyakrylamidov gel, nebo kapilární trubičku. Otevřené kapilární trubičky se často používají pro četné typy vzorků a další různé gélové podklady se často používají pro biologické vzorky, jako jsou směsi proteinů nebo fragmentů DM, 3. Kapilární elektroforeza (CE)
Je to postup, který při různých řešeních (roztoky, iso-tachoforéza, isoelektrické zaostřování, polyakrylamidový gél, micelární elektrokinetická "chromatografie") se jeví být postupem pro rychlé dělení s vysokou účinností při použití velmi malých objemů vzorku komplikovaných směsí. V souvislosti s neobyčejnou citlivostí a selektivitou molekulární spektroskopie^ může být kombinace CB + MS potenciálně účinnou technikou v bio-ana.JLyze. Při nových možnostech aplikace, jak jsou zde popisovány, propojení obou těchto postupů, povede ke způsobům lepšího sledování sekvencí DM, které vyřadí běžné postupy svou rychroští o několik řádů.
Soulad mezi CB a elektrosprejovou ionizací (ESI) z hlediska průtokových rychlostí a ta skutečnost, že oba postupy jsou uzpůsobeny pro (a hlavně pro) iontové podíly v roztoku je základem • ·· i ·· ♦·· · • · ·· > · · ι > · ·· ·· · « < • · * ·« tt -90- mimořádně přitažlivé kombinace. Byla popsána kombinace jak kapilární zonové elektroforezy (CZE) a kapilární isotachoforezy a quadrupolním hmotnostním spektrometrem na základu ESI, viz Olivares a spol., Anal.Chera. £9, 1230 (1987), Sraith a spol., Anal.Chem. 60, 436 (1988), Loo a spol., Ahal. Chem. 179. 404 (1989), Edmonds a spol., J.Chrom. 474. 21 (1989), Loo a spol., J.taicrocolumn.Sep. 1, 2§'3 (1989), Lee a spol., J.Chromatog. 458, 313 (1988), Smith a spol., J.Chromatog. 480. 2ll (1989), Grese a spol.51 J.Amer.Citem.Soc. 114, 2835 (1989),Malé;paptidy ^sou snadno zjistitelné použitím CZB-analyzy s dohrou citlivostí.
Nejúčinnějším postupem dělení fragmentů DNA je elektrofore-za na polyakrylamidovém gélu (PAGB), obecně za použití destičky gélu. Avšak velkou překážkou současné technologie je poměrně dlouhá doba, které je třeba k provedení gélové chromátografie fragmentů DNA, vzniklých sekvenčními reakcemi. Zvýšení (asi desetinásobného) lze docílit kapilární elektroforezou za použití mimořádně tenkých gelů. Ve volném roztoku se všechny pohybují přibližně stejně fychle, protože jejich a];cce áe projeví kompenzací hmotnosti a náboje. Na polyakrylamidovém gélu se fragmenty prosejí a pohybují se ve funkci své délky a tento přístup byl nyní aplikován na CE. Pozoruhodný počet destiček na metr se dal nyní dosáhnout použitím zesíteného polyakrylamidu (10+^ destiček na metr, viz Cohen a spol., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 85, 9660 (1988). Takové CE kolony, jak to bylo zde popsáno, se mohou použít pro sekvencování DNA. Způsob s použitím CE je v podstatě dvacetpetkrát rychlejší, než gelová chromátografie na destičkách při standartním sekvenčním provedení. Tak například asi 300 podkladu lze přečíst za hodinu. Rychlost dělení je omezena při elektroforeza na gélových destičkách hodnotou elektrického pole, které bylo naneseno na gél bez nadbytečného vzniku tepla. Z toho důvodu se větší rychlost CE dosáhne použitím vysokofrekvenčních polí (300 V/cm při CE proti 10 V/Cm při elektroforeze ha gélových destičkách) .Iíapilárové provedení zredukuje ampéry s tím i mohutnost a vznik následného tepla. · ·· ··♦· ·· ·· ······ · · · · · • · · · · · # Μ • « · « · · · ··· I · • · ··· · · · ··*· *·« ·· · ·· t# -91-
Smith a spol., líuo.Acids Res. 18, 4417 (1990) navrhli použití většího množství kapilái, uspořádaných paralelně, to a mmyslem zvýšit průtok. Podobně Mathies a Hungs, Nátuře 399, 167 (1992) zavedli kapilární elektroforezu, kdy se dělení provádí paralelně v kapilárách takto uspořádaných a dokazují tím rychlé průtokové sekvencování, Huang a spol., Anal.Chem. §±, 967, 1992, Huang a spol., Anal.Chem.64, 2149 (1992).
Největší nevýhodou kapilární elektroforezy je omezení množství vzorku, který se může nanést na kapiláru. Koncentrováním velkého množství vzorku na počátku použití kapiláry před dělením se sice zvýší možnost nanesení vzorku, ale hladina detekce se sníží o několik řádů. Hej známějším postupem předkoncentrování při postupu CB je stahování vzorku, to bylo popsáno nedávno, viz Chien a Burgi, Anal.Chem. 64, 489A (1992). Stahování vzorku je závislé na matričních rozdílech (pH, iontová síla) mezi pufrova-ným vzorkem a kapilárním pufrem, takže elektrické pole napříč pásmem vzorku je větší než v oblasti kapiláry. Při stahování vzorku se velký objem vzorku v nízké koncentraci pufru nanese pro předkoncentrování do zhlaví kapilární kolony, kapilára se naplní pufrem téhož složení, ale s vyšší koncengrací. Když ionty vzorku dosáhnou k pufru kapiláry a k dolnímu elektrickénru poli, stahují se to koncentrovaného pásma. Stahováním vzorku se zvýší možnost zjištění řádově jednou až třikrát.
Jiným způsobem předkoncentrování je použití isotachoforézy (ITP) před CB dělením analyzovaných vzorků ve volném pásmu. ITP je elektroforetický technický postup, dovolující nanesení mikro-litrových objemů vzorku na kapiláru na rozdíl od nízkých nL injekčních objemů, jak to typicky bývává spojeno s CB. Postup záleží ve vnesení vzorku mezi dva pufry (vodící a nosné elektrolyty) o vyšší a nižší mobilitě v tom kterém případě ve srování s analyzovaným vzorkem. Postup je bezprostředně postupem koncentračním, protože koncentráty analyzované látky se dostávají do čistých pásem stejnou rychlostí. Postup je obvykle méně známý než postup stahování, popsaný výše, protože to vyžaduje volbou obou dvou pufrů jako elektrolytů a schopnost dělit pouze druhy kationtů a aniontů během postupu dělení. ·· • · ···· « ·» ♦ *·· • e ···· ♦ · ♦ • · · • · · • · · ·· · • I ·· • % · · • · ·· • ··· · I • · · ·» Λ· -92- Těžištěm sekvenčního postupu DM je pozoruhodné selektivní elektroforetické dělení DUA nebo oligonukleotidových fragmentů.
Je to pozoruhodné proto, že dojde k oddělení každého fragmentu a lisí se pouze jedním nukleotidem. Bylo dosaženo rozdělení až 1000 fragmentů (1000 bp). Další výhoda sekvencování s použitím odštěpitelných značených složek je tato. Keni zde nutnost použít formát tabulkových gelů, dělí-li se fragmenty DM póly a kryla Klidovou gelovou elektroforezou při použití odštěpitelných značených složek. Protože se prokombinují početné vzorky ( 4 až 2000), netřeba vzorky sledovat paralelně, jako je tomu v případě běžných barevných primérů nebo barevných terminátorů, jakož i postupů s nimi (např. ABI373 sekvencování). Hení zde důvod používat paralelní linky, není důvod používat tabulkový gél. Takže je třeba pouze použít gel formátu trubičky při elektroforetickém postupu dělení, viz Grossman a spol., Genet.Anal.Tech.Appl. j), 9 (1992). Ti poukázali no to, že se dosáhne podstatné výhody, použije-li se formát gélové trubičky místo gelových destiček. Je to v důsledku větší schopnosti rozptýlit Joule-ovo teplo ve formátu trubičky než na destičce gelu, čímž se zvýší průtokový rychlost (asi o 50%), a dosáhne se většího rozlišeni fragmentů DM o vysoké molekulární hmotnosti (nad 100 nt). Dlouhé odčítání je rozhodující při genomickém sekvencování. Takže použití štěpitelných značených složek při sekvencování má svou další výhodou v tom, že dovoluje použití účinnějšího a citlivějšího postupu dělení DM s podstatně vyšší rozlíšitelhostí. 4. Mikroprovozní zařízení
Kapilární elektroforéza je účinným postupem sekvencování -v DM, při soudní analýze, analýze produktů PCR a zjistování restrikční velikosti fragmentů. CE je mnohem rychlejší než tradiční destičková PAGE, protože s kapilárními gely se dá nanést mnohem vyšší potenciál. Avšak CE má nevýnodu v tom smyslu, že dovoluje sledování pouze jednoho vzorku na gel. Postup kombinuje rychlejší dělící doby CE se schopností analyzovat paralelně více vzorků. -93- • · • #
Podtextem při použití mikroprovozních zařízení je schopnost zvýšit tím hustotu informací pči elektroforeze miniaturizováním rozměrů dílku asi na 100 mikrometrů. Elektronický průmysl využívá běžně mikroprovozních zařízení pro obvody s velikostí pod 1 mikron. Hustota proudu kalipárních sestav je omezena vnějším průměrem kapilární trubičky. mikrovýroba kanálků je spojena s vyšší hustotou sestav. iVíikrofabrikace rovněž dovoluje fyzikální sestavy, jak to dosud nedovolovalo použití skleněných vláken a napojuje kanálky přímo na další přístrojové Části. Bylo konstruováno několik málo zařízení použitím rnikročásteček pro technologii dělení. Plynový chromatograf, viz Terry a spol., IEEE Trans. Electron Device, ED-26. 1880 (1979) a kapalinový chromatograf, viz Manz a spol., Sens.Actuators 51:249 (1990) byly vyrobeny na silikonových částečkách, ale tato zařízení se nepříliš používají. Několik skupin publikovalo výsledky dělení za použití fluoreskujících barviv a aminokyselin na mikrovyrobených zařízeních, viz Manz a spol., J.Chromatography 593, 253 (1992}, Effenhauser a spol., Anal.Chrm. 6£_, 2637 (1993). V poslední době Woolley a Mathies, Proč .Nati. Acad. .Sci. 91, 11348 (1994) poukázali na to, že lze použít fotolithografie a chemického leptání prii dosažení velkého počtu dělících kanálků na skleněném podkladu. Kanálky se naplní dělícími matricemi z hydroxyethyl-celulosy (HEC). Bylo zjištěno, že restrikční fragmenty DNA lze oddělit v tak krátké době, jako jsou 2 minuty y D. Štěpení značených složek
Jak to již bylo popsáno výše,, různá provedení vaz ebných složek jsou charakterizována štěpitelností ("labilitou”) za různých specifických fyzikálních nebo chemických podmínkách*
Jako příklady podmínek, jichž lze použít pro štěpení různých provedení vazebných složek lze uvést kyseliny, zásady, oxidaci, redukci, fluoridy, záměnu thiolů, fotolyzu a enzymové podmínky. Příklady odštěpitelných vazebných složek, které vyhovují při výše uvedených podmínkách pro vazebné složky, jak jsou definovány zde již dříve, jsou odborníkům dobře známé a zahrnují ty, které lze nalézt v katalogu firmy Pierce (Rockford, IL. Příklady zahrnují: ·· ···· ·· ····
»
A • · ···· • t · « · * · • » ψ ·· » -94- ethylenglykol-bis-(sukcinimidylsukcinát) (EGS), aminické reaktivní zesilující Činidlo, štěpitelné hydroxylaminem, 1 M, 37° C, 3 až 6 hodin, disukcinimidyl-vínan (DST) a sulfo-DST, aminické reaktivní činidlo, zesítující, odštěpitelné půfeobením 0,015 M roztoku jodistanu sodného, bis-[_2-( sukcinimidyloxy kar bony loxy)-ethyl| -sulfon (BSOCOES) a sulfo-BSOCOES, což jsou arainická reaktivní činidla, zesítující, odštěpitelná v alkalickém prostředí, pH 11,6, ‘1,4-di-|3 *-(2 /-pyridyldithiopropionamido)J -butan (DPDPB^i, pyridyldithiolové zesítující činidlo, štěpitelné thiolo-vou výměnou nebo redukčně, K-.^4-(p-azidosalicylamido)-butylJ-3 '-{2 ^-pyridyldithio)- v propionamid (APDP, pyridyldithiolový zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, bis-|^-4-(azidosalicylamido)-ethylJ -disulfid, fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, lí-sukcinimidyl-(4-azidofenyl)-l,3 ^-dithiopropionát (SADP) fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, sulfosukcinimidyl-2-(7-azido~4-methylkumarin-3-acetami-do)-ethyl-l,3^-dithiopropionát (SAED), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, sulfosukcinimidyl-2-(m -azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3 '-dithiopropionát (SAMI)), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně.
Další příklady odštěpitelných vazebných složek a podmínky jejich odštěpení, jak je lze využít k odštěpení značených složek, jsou tyto. Silylovou vazebnou skupinu lze štěpit fluorem nebo v kyselém prostředí. 3-, 4-, 5- nebo 6-Substituovaná 2-nitrobenzyloxylová skupina nebo 2-, 3-, j>- nebo 6-substituova-ná 4-nitrobenzyloxyskupina jako vazebná složka se dá štěpit fotonovým zdrojem (fotolyza). 3-, 4-, 5- nebo 6-Substituovaná 2-akoxyfenoxylová skupina, nebo 2-, 3, 5- či 6-substituovaná 3 .:!.· · ·· ·· > ι ι · » · ·· • · # · ι « » « • « · *> -95- 4-alkoxyfenoxylová skupina se dá jako vazebná odštěpit oxidačně působením dusičnanu eeričitoamonného vzorce Ce(NH*)q(NCU) , v ' o
Urethanová zesítující skupina vzorce -1TC00- se dá štěpit působením zásady, kyseliny nebo hydridem hlinitolithným, tedy redtikčně. Jakákolij^-pentenylová, 2-butehylová nebo 1-butenylová vazebná složka se dá odštěpit ozonem, směsí oxidu osmičelého a jodistanových aniontů nebo manganistanem draselným, tedy oxidačně 2-jh-, 4-, nebo 5-substituovaná~furyl)-oxyskupina se dá jako vazebná štěpit působením kyslíku, bromu, methanolu či kyselinou.
Podmínky odštěpení dalších jiných labilných vazebných skupin zahrnují: t-alkyloxyskupina jako vazebná složka se dá štěpit kyselinou, methyl(dialkyl)methoxylová nebo 4-siibstituovaná 2- alkyl-l,3-dioxolan-2-ylová vazebná skupina se dá šzěpit ionty Η^0+, 2-silyloxy-vazebná skupina je štěpitelná fluorem nebo kyselinou, vazebné skupiny typů, 2-(X)-ethoxy, kde X znamená ketoskupinu, skupinu esterovou, amidovou, kyanovou, nitroskupinu, skupinu sulfidickou, sulfoxidovou nebo sulfonovou se dají odštěpit v alkalickém prostředí,2-, 3-, 4-, 5- nebo 6-substituova-né benzyloxy-vazebné skupiny se mohou štěpit působením kyselin nebo za redukčních podmínek, 2-butenyloxy-vazebné skupiny se dají štěpit působením působením sloučeniny vzorce [ýCgH^)^Pj^RhCl(H) 3- , 4-, 5- nebo 6-substituované 2-bromfenoxy-vazebné skupiny lze štěpit lithiem, hořčíkem nebo butyllithiem, methylthio-methoxylové vazebné skupiny se mohou štěpit kationty dvojmocné rtuti, vazebné skupiny typu 2-(X)-ethoxy-, kde X znamená halogen, lze štěpit zinkem nebo hořčíkem, 2-h^droxyethyloxylové vazebné skupiny se dají štěpit oxidačně, například použitím octanu olovičitého.
Za výhodné vazebné skupiny lze pokládat ty, které se dají štěpit kyselinou nebo fotolyzou. některé vazebné skupiny, labilní v kyselém prostředí, byly připraveny pro peptidové syntézy na pevné fázi a dají se použít pro vazbu značené složky na MOI. Μ 9··· • 9 99 9 9 • 9 9 9 • 9 9 · 9 # • 9 1 9 9 «999 999 9« ě Μ ·· • 9 9 · 9 · Μ 9 99 9 9 * • · . '*» «· *· -96- ITěkteré z vazebných skupin jsou nověji popsány v přehledném článku Llloyd-Williams-e a spol., Tetrahedron £9.» 11065-11133 (1993)* Jeden použitelný tyk je založen na p-alkoxyben-zylalkoholech, z nich dva jsou dostupné od Advanced Chem.Tech. (Louisville, KY), totiž 4-hydroxymethylfenoxyoctová kyselina a 4-(4~hydroxymethyl-2-methoxyfenoxy)-máselná kyselina. Obě vazebné skupiny se napojí na značenou složku použitím esterové vazby na benzylalkohol a na MOI s obsahem aminoskupiny amidovou vazbou kar boxy love kyseliny o Značené složky těchto molekul lze uvolnit z vazby na MOI použitím kyseliny trifluoroctové o různých koncentracích* štěfjení těchto vazebných složek se projeví uvolněním karboxylové skupina na značené složce. Štěpení značených složek, navázaných podobnými vazebnými složkami, jako je 2,4-dimethoxy-4 ""-(karboxymethyloxy)-benzhydrylamin se projeví uvolněním karboxylamidu na takto uvolněné značené složce. Zmíněná látka je dostupná od Advanced Chem.Tech* jako FMOC-chráněná forma·
Botolabilní vazehné složky, použitelné pro toto aplikování, byly z největší míry vyvinuty pro peptidovou syntézu na pevné fázi (viz přehled Lloyd-Williams). Takové vazebné složky jsou obvykle založeny na 2-nitrobenzylesterech nebo 2_nitrobenzylamidech. Dva příklady fotolabilních vazebných slořek, které byly uvedeny v poslední době v literatuře, jsou: 4-[4-(1-Pmoc-amino)-ethylJ^-2-methoxy-5-nitrofenoxybutanová kyselina, Holmes a Jones, J.Org. Ghern. 60, 2318-2319 (1993) a 3-(Pmoc-amino)-3-(2-nitrofenyl)-propionová kyselina, Brown a spol., Molecular Diversity 1, 4-12 (1995). Obě vazebné složky mohou být navázány pomocí karboxylové skupiný^a amin^na molekule MOI. napojení značené části na vazebnou vložku se provede formou amidu mezi kar boxylovou skupinou na značené složce a aminoskupinou na vazebné vložce. v Štěpení fotolabilních vazebných složek se obvykle provede ultrafialovým světlem vlnové délky 350 nm za intensit a dob, které jsou odborníkům jasné. Jako příklady obchodně dostupných přístrojů pro fotochemické štěpení lze uvést Aura Industries lne.(Státem Island, NY) a Agrenetics (Wilmington, MA). Štěpení Μ ·Μ· 4 « » • 4 4 • 4 • · 4 # • 4 · ♦ « • • • 4 «•«1 • 4 · 44 Ů 4· ·· • · * · V · · » V ··· · · *4 · § Β · 0 -97- vazebné složky se projeví uvolněním primární amidoskupiny na značené složce. Jako příklady fotoštěpitelných vazebných složek je možno uvést nitrofenylestery glycinu, exo- a endo-2-benzonorborneylchloridy a methansulfonáty, dále 3-amino-3-(2«rnitrofenyl)-propionovou kyselinu. Příklady enzymového štěpení zahrnují esterasy, štěpící esterovou vazbu, nukleasy, které štěpí fosfodiesterovou vazbu a proteasy, štěpísí peptidové vazby atd. E. Detekce značených složek
Detekční postupy se typicky zakládají na absorpci a emisi v určité oblasti spektra. Pokud atomy nebo molekuly absorbují světlo, pak jejich vstupní energie excituje kvantovanou strukturu na vyšší energetickou hladinu. Typ excitace je závislý na vlnové délce světal. Elektrony jsou posunovány na vyšší orbitaly ultrafialovým nebo viditelným světlem, molekulární vibrace infračerveným soektrem a rotace jsou buzeny mikrovlnami. Absorpční spektrum je absorpcí světla ve funkci vlnové délky. Spektrum atomu nebo molekuly závisí na energetické hladině struktury. Absorpční spektra jsou vhodná pro identifikování sloučenin. Specifické absorpční spektroskopické postupy zahrnují atomovou absorpční spektroskopii (AA), infračervenou spektroskopii (IR) a ultrafialovou spektroskopii (UV-vms).
Atomy nebo molekuly, které byly excitovány na vyšší energetické hladiny, mohou klesnout na nižší hladinu emisní radiací. Tato emise světla je označována jako fluorescence, má-li transipise mezi oběma stavy týž spin, nebo fosforescence, dojde-li k přechodu mezi stavy s různým spinem. Emisní intenzita analyzované látky je lineárně úměrnákoncentraci (za nízkých koncentrací) a dá se použít pro leva ntif i kování emitujícího zdroje. Specifické emisní spektroskopické postupy zahrnují atomovou emisní spektroskopii (AES), atomovou fluorescenční spektroskopii (APS), molekulární, laserem indukovanou fluorescenci (LIP) a fluorescenci paprsky X (XRP).
Pokud elektromagnetické záření prochází nějakou látkou, pak větší podíl z největší míry prochází původním směrem, ale malý podíl se rozptýlí do dalších směrů. Světlo, jež se rozptýlí • » • · 9 V • «»«·
M MM • · • · • · • 9 ·« 9 í ·* ·» • · · * 9 · *· i ··· · ; *· -98- za stejné vlnové délky, jako světlo příchozí se nazývá Rayleigh-ovým rozptylem. Světlo, jež se rozptýlí průhlednou pevnou látkou v důsledku vibrací (fonony) se nazývá Brillouin-ovým rozptylem. Toto je typicky posunuto o 0,1 až 1 vlnových čísel ve srovnání s dopadajícím světlem. Světlo se rozptyluje v důsledku vibrací v molekulách nebo nebo v opakních pevných podíle» optický mi fonony a to je označováno jako Ramanovo světlo. Romanovo rozptýlené světlo je posun až i o 4000 vlnových čísel ve srovnání s dopadajícím světlem. Specifické rozptylové spektroskopické postupy zahrnují tedy Raman-ovu spektroskopii.
Infračervená spektroskopie je měřením vlnové délky a intenzity absorpce středního infračerveného světla vzorkem. Střední infračervené světlo (2,5 až 50 ^m, 4000 - 200cm~^) je energeticky dostačující k tomu, aby excitovalo molekulární vibrace na vyšší energetické hladiny. Vlnové délky infračervených absorpčních pásů jsou charakteristikou specifických typů chemických vazeb a infračervená spektroskopie se obecně nejvíce používá k identifikování organických a organometalických molekul.
Blízká infračervená absorpční spektroskopie (NIR) je měřením vlnové délky a intenzity absorpce blízkého infračerveného světla vzorkem. Spadá do rozsahu 800 nm-2,5 pm (12.500 až 4000 cm"^) a energeticky dostačuje k. excitování vyšších hladin a pro kombinace molekulárních vibrací na vyšší energetické hladiny. IíIR spektroskopie se typicky používá pro kvantitativní zjištování organických funkčních skupin, zvláště hydroxylových, N-H skupin a skupin karbonylových. Složky a označení líIR instrumentsce se podobá UV-vis absorpčním spektrometrům. Zdrojem světla je obvykle wolframová lampa a detektorem obvykle detektor s pevným sirníkem olovnatým. Držáky vzorku mohou být skleněné nebo z křemene, typickými rozpouštědly jsou chlorid uhličitý a sírouhlík. Běžné přístroje pro ÍIIR-spektroskopii umožňují současné monitorování a kontrolu postupu.
Ultrafialovágpeictroskopie a absorpční spektroskopie ve viditelné části spektra (UV-vis) je měřením vlnové délky a inten- ···· 9 * · · ·-99- ·« »* • · · I ψ 9 t« ·«· · I • · 4 mm · ·
žity absorpce vzorkem v blízké ultrafialové oblasti a ve viditelné části světla. K absorpci ve vakuu UV dochází při 100 až 200 nm;(105 - 50 000 cm-1) UV (křemen) při 200 až 35B nm; (50 000 až 28 570 cm"*1) a viditelné světlo při 350 až 800 cm; r — "L * * (28 570 až 12 500 cm , to za označení Beer-Lambert-Bouguet-ův zákon. Ultrafialové a viditelné světlo je energeticky dostačující k tomu. aby posunulo vnější elektrony na vyšší energetické hladiny. UV-vis-spektroskopie se může obvykle použít ve spojitosti s molekulami o anorganickými ionty či komplexy v roztoku. UV-vis spektra jsou omezena širokými rysy spektra. Zdrojem světla je obvykle vodíková nebo deuteriová lampa pro ultrafialové záření a wolframová lampa pro viditelné záření. Vlnové délky těchto kontinuálních zdrojů světla se zvolí seperátorem vlnové délky, jako je hranol nebo stupňový monochromátor. Spektra, tatdj dosažená stupňováním separatorem vlnové délky a kvantitativní měření lze provést ze spektra nebo použitím jediné vlnové délky.
Hmotnostní spektrometry využívají rozdílu v poměru hmot-nost/náboj (m/z) ionizovaných atomů či molekul k jejich vzájemnému oddělení. Hmotnostní spektrometrie je tedy vhodná pro kvantové zjištění atomů či molekul, jakož i pro zjištění chemického a strukturního složení molekul. Moleguly mají rozdílné fragmenteč-ní sklony, což vede k strukturním informacím a k identifikování sloučenin. Obecný postup při práci s hmotnostním spektrometrem je tento: vytvoří se plynná fáze iontů, ionty se oddělí prostorově či časově na základě jejich poměru m/z a změří se množství iontů každého z poměrů m/z. Schopnost dělit ionty hmotnostním spektrometrem je dána rozlišením, definovaným jako R = m/cTm, kde m znamená hmotnost iontu a <fm je rozdíl hmotnosti mezi dvěma rozlišitelnými píky v hmotnostním spektru. Tak například hmotnostní spektrometr s rozlišovací schopností 1000 can rozliší ion s hodnotou m/z 100,0 od iontu s hodnotou m/z 100,1.
Hmotnostní spektrometr (MS) sestává obecně z iontového zdroje, analyzátoru,rozlišujícího hmotnost a detektoru iontů. Magnetický sektor, quadrupol a zařízení pro dobu průletu vyžadují také optickou extrakci a akceleraci iontů, aby se totiž ionty dostaly ze zdroje iontů to hmotnostního analyzátoru. Podrobnosti některých provedení hmotnostních sňalyzátorů(magnetický sektor -ιοοβ- MS, quadrupol IvIS a doba průletu MS) jsou zde uvedeny dále. Jednoduchý zaostřovacá analyzátor pro magnetický sektor MS používá paprskovou dráhu částeček 180, 90 nebo 60 stupňů. Různá zařízení, v * ovlivňující částečky oddělených iontů sjrůznými poměry hmotnost/ná-boj. V double-zaostřovacím analyzátoru je přidán elektrostatický analyzátor k oddělení částeček s různými kinetickými energiemi.
Quadrupolní hmotnostní filtr pro quadrupolní hmotnostní spektrometrii je tvořen čtyřmi kovovými tyčinkami, uspořádanými paralelně. Použité voltové napětí ovlivňuje přenos iontů, pohybujících se dolů paprskem světla mezi čtyřmi tyčinkami. Při určitém voltovém napětí DC a AC pouze ionty s určitým poměrem hmot-nost/náboj projdou quadrupolním filtrem a všechny ostatní vybočí z jejich původního směru. Hmotnostní ppektrum se získá monitorováním iontů, procházejích quadrupolním filtrem, jak se mění voltové napětí na tyčinkách.
Hmotnostní spektrometry typu "doba průletu” využívají rozdílů v době průletu driftovou oblastí k oddělení iontů s líčícími se hmotnostmi. Pracuje pulzujícím· způsobem, takže ionty se $usí tvořit pulsy a/nebo extrahovat v pulsech. Pulsované elektrické pole urychluje všechny ionty do driftové oblasti bez elektrického pole s kinetickou energií qV, kde q znamená náboj iontu a V je použité voltové napětí. Protože kinetická energie iontů a 0,5 mV2, ©ají lehčí ionty vyšší rychlost než těžší ionty a dosahují do pásma detektoru na konci driftového pásma rychleji. Vývod z iontového detektoru se přenese na osciloskop ve funkci času za vzniku hmotnostního spektra.
Způsob tvorby iontů je výchozím bodem pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Chemická ionizace je způsob, který používá reagující ion pro reakci s molekulou analyzované látky (v tomto případě značené složky) za vzniku iontů bud transferem protonu nebo hydridu. Reagující ionty se vytvoří zavedením velkého nadbytku methanu (ve vztahu k značené složce) do elektronového zdroje dopadu na ionty (El). Srážka s elektrony se projeví vznikem CH^+ a CH^", které dále reagují s methanem za vzniku CH^ + a C2H5+. Dalším postupem pro ionizování značených složek piaZma a doutnavý výboj. Plazmou je horký, částečně ionizovaný plyn, 99 99 9 «tl 99
9999 • 9 φ I 9 • 9 ·· • 9 9 Μ • 99 · 9 9 99 *· 9 9 -101- který účinně excituje a ionizuje atom;?. Doutnavý výboj je nízko-tlaková plazma, udržovaná mezi dvěma elektrodami. Elektronová impaktní ionizace používá elektronový paprsek, zpravidla generovaný vláknem wolframu, k ionizování atomů Či molekul doutnavé-ho výboje. Elektron z paprsku narazí na elektron analyzovaných atomů.či molekul za vzniku iontů. Ionizování elektrosprejem využívá velmi jemné jehličky nebo serie stěračů. Roztok vzorku se vstřikuje do komůrky zdroje za vzniku kapiček, ty nesou náboj, když opouštějí kapiláru a jak se rozpouštědlo odpaří, kapičky zmizí, zanechávajíce vysoce nabité molekuly analyzované látky. ESI se zvláště hodí pro velké biologické molekuly, které lze nesnadno změnit na páru nebo ionizovat. Bombardování rychlými atomy (FAB) využívá paprsek neutrálních atomů o vysoké energii, typicky xenonu nebo argonu, který narazí do pevného vzorku za vzniku a průběhu desorpce a ionizování. Postup se používá pro velké biologické molekuly, které lze nesnadno převést do plynné fáze. FAB způsobí malou fragmentaci a obvykle vznikne velký molekulární iontový pík, použielný pro stanovení hmotnosti molekuly. Atomový paprsek vznikne akcelerováním iontů ze zdroje iontů buňkou pro výměnu náboje. Ionty pohltí elektron při srážce s neutrálními atomy za vzniku paprsku atomů o vysoké energii. Laser-ová ionizace (LIMS) je způsob, kdy dopadem laseru se oddělí materiál z povrchu vzorku za vzniku mikroplazmy, jež ioniztije některou z dalších složek. Laserová desorpční ionizace za podpory matrice (MALDIj! je variací laserové ionizace při zplyňování a ionizování velkých biologických molekul, jako jsou proteiny nebo fragmenty DNA. Biologické molekuly se dispergují v pevné matrici, jako je kyselina nikotinová. Ultrafialový lciser odloupne matrici, jež unáší některou z velkých molekul, přenese ji do plynné fáze v ionizovaném stavu, takže se může dostat do hmotnostního spektrometru. Plazma-desorpcní ionizování (PD) využívá rozpad 252Cf, kdy vznikají dva štěpné fragmenty, pohybující se v opačných směrech. Jeden fragment narazí do vzorku a vyrazí odtud 1 až 10 analyzovatelných • ♦ · ♦ ♦ • · • t * ♦ · • · • « · «·· -102- ♦ · ·· • ♦ ♦ · « t Μ *·· * * • * * «* t· 160+ 3 + je některý z líe , iontů. Druhý fragment narazí na detektor a zahájí začátek snímání dat. Tento ionizační postup je zvláště vhodný pro velké biologické molekuly. Resonanční ionizace (RIMS) je pootup^ ge je{jen čí více laser-ových paprsků, vyladí do resonance k transmisi atomů či molekul v plynné fázi, aby ji posunul postupně nad odpovídající ionizační potenciál za vznikli iontu. Sekundární ionizace (SIMS) využívá paprsek iontu, jako I á*0 ' + nebo Ar , ten se zaměří na povrch vzorku a rozpráší materiál do plynné fáze. Jiskřící zdroj je způsob, jímž se ionizuje analyzovaná látka v pevných vzorcích pulsováním elektrického proudu mezi dvěma elektrodami.
Značená složka může být nabita před, během nebo po štěpení od molekuly, na kterou byla připojena. Ionizační postupy založené na iontové •'desorpci", přímá tvorba nebo emise iontů z pevných či kapalných povrchů umožnily zvýšenou aplikovat elnost na netěkavé a tepelně labilní sloučeniny. Tyto postupy eliminují nutnost neutrálních molekul zplynit se před ionizováním a obecně minimalizují tepelnou degradaci těchto molekulárních typů. Do těchto postupů patří desorpce pole, viz Bečky, Principles of J?ield Ionization and Field Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford, 1977, plazmová desorpce, viz Sundqvist a Mac Parlane, Mass Spectrom.Rev. 4, 421 (1985), laserová desorpce, viz Karas a Hillenkamp, Anal.Chem. 60, 2299 (1988), dále Karas a spol·, Angew.Chem. 101. 805,(1989), bombardování rychlými částečkami, bapř. rychlé atomové bombardování, BAB a sekundární iontová hmotnostní spektrometrie, SIMS, viz Barber a spol., Anal.Chem. 5_4., 645A (1982), termosprejová ionizace, viz Vestal, Mass Spectrom.Rev. 2., 447 (1983). Termosprej se často používá při současné kombinaci s kapalinovou chromátografií. Kontinuální průtokové BAB postupy, viz Caprioli a spol., Anal.
Chem. 5j3, 2949 (1986) mají rovněž významnou důležitost. Dokonalejší vyjmenování kombinací ionizování a hmotnostní spektrometrii uvádí: ♦ · ·* ··♦· • · • 9 9 • · · · 9 · · ·· 99 ♦ 9 9 * 9 9 99 *·· # « • 9 * 99 «· -103-
y V hmotnostní spektrometrii se zachycení' iontů, elektronově-sprejo-vou hmotnostní spektrometrii, iontove-sprejovou hmotnostní spektrometrii, kapalinově ionizační hmotnostní spektrometrii, ionizační hmotnostní spektrometrii za norm.tlaku, elektronově-ionizační hmotnostní spektrometrii, metastabilními atomy bombar-dovací ionizační hmotnostní spektrometrii, rychlými atomy bombardi-zační ionizační hmotnostní spektrometrii, MIDI hmotnostní spektrometrii, foto-Ionizační průletovou hmotnostní spektrometrii, laserovou kapičkovou hmotnostní spektrometrii, MALDI-TOP hmotnostní spektrometrii, APCI hmotnostní spektrometrii, na no-· sprejovou hmotnostní spektrometrii, párově-sprejovou ionizační hmotnostní spektrometrii, chemílcy ionizační hmotnostní spektrometrii, resonančně ionizační hmotnostní spektrometrii, sekundárně ionizační hmotnostní spektrometrii, termosprejovou hmotnostní spektrometrii.
Ionizační postupy, pokud se použijí na netěkavé biologické látky, mají omezené rozsahy použitelnosti. Ionizační provedení je vysoce závislé na komposicích matrice a typu látek. Z běžně dostupných výsledků plyne, že horní mezí molekulární hmotnosti pro TS je asi 8000 daltonů, viz Jones a Krolik, Rapid Gomm.líass. Spectrom. i, 67 (1987). Protože TS se prakticky provádí jen s quadrupolnírai hmotnostními spektrometry, citlivost velmi trpí neúměrně za vyšších poměrů m/z, tedy hmotnost k náboji. Průletové hmotnostní spektrometry (TOP) jsou komerčně dostupné a mají výhodu v tom směru, že rozmezí m/z je omezeno jen výkonností detektoru. nověji byly popsány dva nové způsoby ionizačních postupů. Tyto dva způsoby jsou nyní označovány jako laser-ová desorpce za pomoci matrice (MIDI), viz Karas a Hillenkamp, Anal.Chem. 60, 2299 (1988), Karas a spol., Angew.Chem. lOl, 805 (1989) a elektrosprejové ionizování (ESI). Oba postupy se vyznačují velmi vysokou ionizační účinností, tj. velmi vysokým poměrem produkce molekulárních iontů/spotřeba molekul. Citlivost, což je konečný výsledek technického postupu, je závislá na velikosti vzorku, množství iontů, průtokové rychlosti, účinnosti detekce a účinnosti aktuální ionizace. 99 ···· t * ♦ • « ·· i · • 9 9 9 «·«* *·· ·* *1 * 9 9 * 9 9 99 99 9 9 4 9 9 « 99 99 -104-
Blektrosprejová hmotnostní spektrometrie se zakládá na myšlénce, kterou vyslovil v šedesátých letech Dole a spol., J.Chem.Phys. 4.9, 2240 (1968). Elektrosprejová ionizace (ESI) jest jednou možností, pak dospět k nabitým molekulám pro analýzu hmotnostní spektrometrií, V krátkosti: elektrosprejová ionizace Vede ke vzniku vysoce nabitých částeček zmizením kapalin v silném elektrostatickém poli. Vysoce nabité částečky, vytvořené zpravidla v toku suchého plynu za norm.tlaku, se smrsknou odpařením neutrálního rozpouštědla, až náboj odpuzováním překoná kohezivní síly, což vede k "kulombické explozi” « Přesný mechanizmus ionizování (je kontroverzní a hypotézy v tomto směru vyslovilo několik skupin, viz Blades a spol., Anal.Chem. 63., 2109-14 (1991), Kebarle a spol., Anal.Chem. 65, A972-86 (1993), Penn, J.Amer.Soc.t-iass Spectrom. 4, 524-35 (1993). Bez zřetele na vlastní způsob tvorby iontů, Ξ8Ι vede k nabitým mokelulám z roztoku za mírných podmínek.
Možnost získat použitelné údaje hmotností spektrometrií malých množství organických molekul se zakládá na dostatečně účinné produkci iontů. Účinnost ionizování pomocí ESI se vztahuje k míře pozitivních nábojů, spojených s molekulou. Experimentální zvýšení ionizování se obvykle spojuje s použitím podmínek kyselého prostředí. Jinou možností, jak zlepšit ionizování bylo použití kvarternizovaných aminů, je-li to ovsem možno, viz Aebersold a spol., Protein Science 1, 494-503 (1992), Smith a spol., Anal.Chem. 60, 436-41 (1988).
Elektrosprejové ionizování se podrobněji popisuje takto. Vznik iontů elektrosprejováním vyžaduje dva stupně: dispergování vysoce nabitých částeček v blízkosti norm.felaku s následným vytvořením podmínek, indikujících odpaření. Roztok analyzovaných molekul se vede jehlou, udržovanou za velmi vysokého elektr. potenciálu. ITa konci jehly se roztok disperguje jako mlha malých, vysoce nabitých částeček, obsahujících molekuly analyzované látky. Dojde k rychlému odpaření malých kapiček a postupem desorpce pole nebo konečným odpařením se uvolní protonované proteinové molekuly do plynné fáze.Elektrosprej obvykle vyža- duje použití vysokého elektrického pole na malý průtok kapaliny, obecně 1-10 úL/min z kapilární trubičky. Potenciální rozdíl 3-6 kV se obvykle využije mezi kapilárou a protielektro-dou, umístěnou v odstupu 0,2 až 2 cm (kde ionty, nabité shluky a i nabité částečky, v závislosti na míře vymizení rozpouštědla, se mohou testovat jako vzorky hmotnostní spektrometrií malým otvůrkem. Výsledkem elektrického pole je akumulace náboje na povrchu kapaliny na konci kapiláry; takže průtoková rychlost kapaliny, rezistivita a povrchové napětí jsou důležitými faktory při tvorbě kapiček. Výsledkem vysokého elektrického pole je rozrušení povrchu kapaliny a tvorba vysoce nabitých kapiček. Může dojít ke vzniku kladně nebo záporně nabitých kapiček v závislosti na předpČ-tí kapiláry. Vytvoření negativně nabitých iontů vyžaduje přítomnost elektronových skavengerů, jako je kyslík ke znemožnění elektrického vybití.
Elektrostaticky lze sprejovat do vakua velké množství různých kapalin, případně za pomoci zmlžujícího činidla.
Použití pouhého elektrického pole pro zmizení je spojeno s určitými omezeními ve spojitosti s vodivostí kapaliny a di- —5 elektrickou konstantou.Vodivost roztoku pod asi 10 ohmů je nutná za teploty místnosti pro stabilní elektrosprej za použitelných průtokových rychlostí, odpovídajících vodnému roztoku elektrolytu pod 10 M. Při provedení postupu, nejužitečnějšího pro 3S8I-MS se projeví průtoková rychlost kapaliny dispergováním ca pal i ny ve formě jemné mlhy. í\r a.z ká vzdálenost odkapiláry k průměru kapiček je často takřka jednotná a řáddvě kolem 1 pm. Zvláště důležité je to, že celkový elektrosprejový dontový proud se zvýší jen nepatrně při vyšších průtokových rychlostech kapaliny. Jsou zde podklady pro tvrzení, že zahřívání je vhodné pro elektrosprejové manipulování. Tak například mírné zahřátí vodného roztoku vede k snazžímu elektrosprejování, pravděpodobně v důsledku snížení viskozity a povrchového napětí. Pomoc jak z hlediska teploty, tak i zmizení plynem dovoluje elektrosprejování provádět za vyšších průtokových rychlostí, aJLe za poklesu rozsahu nabití částeček. Tvorba molekulárních • 9 ·· ««·· • 9 ·· ««·· ♦ · ·♦ • · · ♦ ♦ ·· ♦ « • « ♦ ·· ΨΦ • ♦ ·♦ « · • t · « ι * t f · · · 9 · » · « ·«·· ·♦· *♦ « -106- iontů vyžaduje podmínky, za nichž dojde k odpaření původní populace kapiček. Toho lze docílit za vyšších tlaků proudem suchého plynu za mírných teplot, řádově pod 60° C, zahříváním během převodu kapaliny stykovou plochou a - zvláště pak v případě postupů, zachycujících ionty - energetickými srážkami za poměrně nízkého tlaku. Λ Skoliv podrobnosti postupů, spadajících do rozsahu ESI zůstávají neurčité, pak velmi malé kapičky, vzniklé při ESI se zdají dovolovat u všech možností přenos čistého náboje v roztoku na plynnou fázi po odpaření zbývajícího rozpouštědla. Hmotnostní spektromstrické detegování potom vyžaduje, aby ionty měly únosné rozmezí m/z (tedy pod 4000 daltónů pro quadrupolní zařízení) po zbavení se rozpouštědla, jakož i aby vznikaly a byly přenášeny s dostatečnou účinností. Velký počet rozpustných látek, u nichž byla zjištěna možnost použití při ESI-MS, postrádání zásadní závislosti účinnosti ionizování na molekulové hmotnosti vede k názoru, že jde o velmi hodnotný a široce aplikovatelný ionizační postup.
Funkce elektrosprejového iontového zdroje v blízkosti norm. tlaku: zdrojem je obvykle kovová nabo skleněná kapilára, zahrnující způsob elektrického předpětí kapalného roztoku vztažmo k proti-elektrodš. Roztoky, obvykle za použití směsi vody a methanolu, obsahující analyzovanou látku a často další přísady, jako je kyselina octová, proudí z koncovky kapiláry. Byl popsánu zdroj ESI, viz Smith a spol., Anal.Qhem. 62, 885 (1990), kterým lze uzpůsobit v podstatě jakýkoli kapalinový systém. Typická průtoková rychlost pro ESI je 1 až 10 ul/min. Zásadním požadavkem stykové plochy BSI-MS je shromáždit a přenést ionty z oblasti vysokého tlaku do oblasti MS tak účinně, jak je to jen možno. Účinnost ESI může být velmi vysoká, což je podkladem pro mimořádně citlivá měření, což je právě vhodné pro zde popisovaný vynález. Přístrojový výkon z hlediska proudu může vyústit v celko-vérn proudu iontů u detektoru asi 2 x 10 A nebo 10 pulsů/s pro jednoduše nabité druhy. Ha podkladě výkonu přístroje vedou koncentrace tak nízké, jako je 10-^¾ nebo asi 10”^® mol/s jed- ·« 9 ♦ 9 99 • 9 é * ♦ 9 4999 99« 99 ·««· ·· 9# • « t 9 9 9 « « 9 9 4 9 99 9 9 9 9 999 9 I 9 9 9 9 9 « 99 9 99 9· -107- notne nabitého druhu ke vzniku dokazatelného toku iontů (asi 10 pulsů/s), je-li analyzovaná látka dokonale ionizovaná.
Například nízké atom-molové detekce byly jako limitní dosaženy u iontů kvarterně-amoniových za použití stykové plochy ESI s ‘elektroforezním kapilárním pásmem, viz Smith a spol., Anal.Chem. 5_9, 1230 (1988). Pro sloučeninu mol.hmotnosti 1000 je průměrným Číslem náboje 1, průměrným číslem stavu náboje je 1, čířka píku (m/z) je 1 a maxikum intenzity 12 iontu či iontů odpovídá 1 x 10 .
Spotřebuje se pozoruhodně malé množství vzorku ve skutečnosti při získávání ESI-hmotnostního spektra, viz Smith a spol., Anal. Chem. 60, 1948 (1988). Podstatního zisku lze rovněž docílit použitím soustavy detektorů se sektorovými vybaveními, což v umožňuje současnou detekci částí spektra. Protože v současnosti pouze asi 10 J všech vzniklých iontů lze zjistit pomoci ESI, pak pozornost, věnovaná faktorům, omezujícím účinnost přístroje by mohla být podkladem pro zlepšení citlivosti. Obeznámeným na tomto úseku je jasné, že tento vynález zahrnuje a přizpůsobuje všechna zlepšení ionizování a postupů detekce.
Mezivrstva je s výhodou umístěna mezi dělící opatření (např. gel) a detektor,(např. hmotnostní spektrometr. Mezivrstva má s výhodou tyto vlastnosti: 1) schopnost shromažďovat fragmenty DNA v určitých časových odstupech, 2) koncentrovat fragmenty DNA, 3) odnímat fragmenty DNA z elektroforežních pufrů a prostředí, 4) odštěpit značenou složku z fragmentu DNA, 5) oddělit značenou složku od fragmentu DNA, 6) odstra^pi'!; fragment DNA, 7) přenést značenou složku do těkavého roztoku, 8) zplynit a ionizovat značenou složku, a 9) umístit značenou složku v elektrosprejovém zařízení, nebo ji tamže přepravit a tak dostat značenou složku do hmotnostního spektrometru. • ♦ · ···♦ ·· 1« « % • t • · • * t • ♦ * · • · »· Ék • ♦ ♦ · · * ♦♦· « * • • » « t » t * ##· ·· « M • · -108-
Mezivrstva má také schopnost shromáždit fragmenty DNA, jak se eluují ode dna gelu· Gelem může být tabulka gelu, trubička gelu, kapilára atd. Fragmenty DITA se mohovi jímat několika způsoby.Prvým je použití elektrického pole, kdy se jímají fragmenty DITA na elektrodě nebo v její blízkosti. Druhou mocností je provedení, kdy se fragmenty DITA jímají tak, že se vede proud plynu u dna gelu. Předpoklady obou dvou postupů lze kombinovat, jíma^í-li se fragmenty DITA proudem plynu, který se potom může zhustit použitím elektrického pole. Konečným výsledkem je to, že se fragmenty DKA vyjmou z prostředí, ve kterém došlo k jejich oddělení. Takže fragmenty DITA mohou být "uneseny" z roztoku jednoho typu do jiného použitím elektrického pole.
Pokud jsou již fragmenty DITA v odpovídajícím roztoku (kompatibilním s elektropprejem a hmotnostní spektrometrií), lze odštěpit z fragmentu DUA značenou složku. Fragment DITA (nebo jeho zbytky) se mohou oddělit od značené složky použitím elektrického pole, s výhodou, má-li značená složka opačný náboj ve srovnání s kombinací DlíA-značená složka. Značená složka se potom dostane do elektrosprejového zařízení použitím elektrického pole nebo proudu kapaliny.
Fluoreskující značené složky lze identifikovat a kvantitativně vyhodnotit ponejvíce přímo dle absorpčních a fluorescenčních emisí vlnových délek a intenzit.
Zatím co běžný spektrofluorometr je mimořádně pružný a poskytuje kontinuální rozsah excitačních a emisních vlnových délek (lex> -^si* ^s2 ), specialisovanější přístroje, jako je průtokový cytometr a stupňové laser-ové mikroskopy vyžadují vzorky, excitovatelné za jediné pevné vlnové délky. U současných přístrojů jde o 488-nm linii argonového laseru.
Fluorescenční intenzita na vzorek molekuly je úměrná produkt z ^ a QY. Rozsah těchto parametrů mezi fluorofory současně praktické důležitosti činí asi 10 000 až 100 000 cm pro ^ a 0,1 až 1,0 pro QY. 99 * * α ♦ *· * 009
-109-
Pokud se absorpce položí proti nasycení použitím iluminací o vysokých intenzitách, pak ireverzibilní destrukce excitovaného fluoroforu (foto-blednutí) se stane faktorem, omezujícím možnost důkazu a stanovení pomocí fluorescence. Praktický dopad foto-blednutí závisí na postupu techniky fluorescenční . detekce.
Je jasné, že určité opatření (mezipovrch) lze vřadit mezi stupně dělení a detekce k umožnění kontinuálních postupů a dělení velikosti a důkazu značené složky (v konkrétní době).
To spojuje métody dělení a instrumentační s metodami detekce a instrumentačními do jediného opaření. Tak například mezivrstva se vloží mezi postup dělení a detekce hmotnostní spektrometrií nebo potenciostatickou amperometrií.
Punkcí mezivrstvy je v prvé řadě uvolnění (např.hmotnostní spektrometrií) značené složky z analyzovaného podílu, Je zde několik příkladných sežizení mezivrstvy. Ráz mezivrstvy je závislý na volbě štěpitelných vazebných slošekY případě vazebných složek, štěpitelných světlem nafo fotoštěpitelných je nurná energie nebo zdroj fotonů. V případě vazebných složek, labilních v kyselém prostředí, v alkalickém prostředí nebo disulfidických je nutné přidání vhodného činidla do mezi. vrstvy. V případě vezebných složek, labilních za tepla, je nutný tepelný zdroj. Přidání enzymů je nutné pro vazebné složky, citli^-vé na enzymy, jako je tomu u specifických proteasových a peptido-vých vazebných složek, nukleasových a DilA- či RHA-vazebných složek, glykosylasy, HRP nebo fosfatasy a vazebných složek, které nejsou stálé po provedeném štěpení (například podobné chemilu-miniscenčním substrátům). Další charakteristiky' mezivrstev zahrnují minimální rozšiřování pásu, oddělení DM of značených složek přéd injikováním do hmotnostního spektrometru. Postupy dělení zahrnují ty, které se zakládají na elektroforetických metodách a technikách, afinitních postupech, retenci dle velikosti (dialyza), filtraci apod.
Také je možné koncentrovat značené složky (nebo sestavy nukleová kyselina-vazebná složka- značená složka), ·« » ♦ · «ι ··*>♦ # ·· ·♦·· ·· ·* • « · · · · · • · * · * ·· • · · « · ··· · · • · # * · ♦ ♦ ·♦ · *· t· -110- elektroforeticky a pak uvolnit do jiného reakčního toku, který je kompatibilní s příslušným typem zvoleného ionizačního postupu. Llezivrstva může být rovněž schopná zachytit značené složky (nebo sestavy nukleová kyselina-rvazefehá složka-značená složka) na mikrokuličkách, s následným vstřelením kuliček do dalšího prostoru, kde dojde k laser-ové desorpci a odpaření, Také je možné extrahovat tok do jiného jbufru (například z pufru pro kapilární elektroforezu do hydrofobnáho pufru pomocí permeabilní membrány). Může být žádoucí v některých případech přepravit značené složky bezprostředně do hmotnostního spektrometru, což zahrnuje další funkci meziwstvy. A další funkcí mezivrstvy je přepravit značené složky z většího počtu kolonek do hmotnostního spektrometru s rotační dobou štěrbiny pro každou kolonku. Také lze přepravit značené složky s jediné kolonky do většího počtu hmotnostně-spektrálních detektorů, oddělit je časově, jímat každou sadu značených složek po několik milisekund s následnou přepravou do hmotnostního spektrometru. Dále je výčet representativních prodejců pro technologie dělení a detekce k použití dle tohoto vynálezu:
Iloefer Scientific Instruments (San Prancisco, CA): elektroforezní zařízení; (Tv/o Step ', Poker Páce ’ II) pro sekvenční aplikace; Pharmacia Biotech (Piseataway, HJ), elektroforetická zařízení pro dělení a sekvencování DNA (PhastSystern pro PCR-SSCP analýzu, MacroPhor Syttem pro sekvencování DUA), Perkin Elraer/Applied Biosystems Division (ABI, Poster City, CA): semiautonatizovaná sekvenční zařízení na základě fluorescenčních barviv (ABI377);
Análytical Spectral Devices (Boulder, CO), UV-spektrometry;
Hitachi Instruments (Tokyo, Japonsko), atomové absorpční spektrometry, fluorescenční spektrometry, LC a GC hmotnostní spektrometry, HMR-spektrometry a UV-VIS spektrometry;. PerSeptive Bio. systems (Pramingham, MA), hmotnostní spektrometry (Voyager " Elitě) Bruker Instruments lne. (Ilanning Park, MA), FTIR-spektrometry (Vector 22), PT-raman spektrometry, průtokové hmotnostní snektro-metry (Reflex II ),Ion Trap Mass Spectrometer (SsquireJ"ljÍ) a Maldi Mass Spectrometer; Analytical Technology lne. (ATI, Boston, MA) kapilárně-gélová elektroforezní zařízení, UV-detektory, detek- ·· ···· »··· • · • « · • · · • · · · I t « • ♦· · ·· ·* • · · « t · ·· • tt · « t · i 99 Ψ· -111- tory é diodovým uspořádáním, Teledyne Electronic Technologies (Llountain View, CA): Ion Trap Mass Spectrometer (3 DO ~ . TM φί.τ
Discovery a 3 DQ Apogee 5, Perkin Elraer/Applied Biosystems Bivision (Poster City, CA), Sciex Mass Spectrometer (tripple quadrupole LCAlS/MS, API 100/300), kompatibilní s elektrospre-jem, Hewlett-Packard (Santa Clara, CA) :hnotnostní selektivní detektory (HP 5972A), MALDI-TOP Mass Spectrometers (HP G 2025A), Diodě Array Detectors , CB unites, IÍPLC units (HP 1090) jako UV-spektrometry; Pinnigan Corporation (San Jose, CA): hmotnostní φΤ„Τ spektrometry (magnetický sektor MAT 95 S itm) 9 quadrupolní spektrometry (MAT 95 SQ '*) a čtyři další podobné hmotnostní spektrometry; Rainin (Emeryville, CA), zařízení $>ro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii.
Postupy a kompozice zde popisované dovolují použití stepi·*· telných značených složek k mapování vzorků spedifikovaného typu a k průkazu nukleotidové identity. Ea počátku každého sekvenčního postupu se zvolený primér oznacé specielním jednotným značením tou kterou složkou. Značené složky zmapují typ vzorku, typ dide-soxy terminátoru (v případě Danger-ovy sekvenční reakce) nebo s výhodou typy oba. Specificky značená složka zmapuje primární typ, jímž je dále zmapován vektorový typ a tím se zmapuje identita vzorku. Značená složka se může rovněž použít k mapování dideso-xy terminátoru typu ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP s odkazem do které didesoxynukleotidové reakce byla značená složka priméru umístěna. Provede se potoiia sekvenční reakce a vzniklé fragmenty se sekvenčně dělí dle velikosti v závislosti na času.
Značené složky se odštěpují z fragmentů v časovém rámci a rovněž v Časovém rámci se měří a zaznamenávají. Sekvence se konstruuje srovnáním mapy značenéňv složky s časovým rámcem. Znamená to, že totožnosti značené složky se zaznamenávají v době po nasazení a vzájemné vztahy k sobě se týkají rovněž časového rámce. Stupeň dělení dle velikosti oddělí fragmenty nukleové kyseliny o jeden nukleotidový přírůstek a proto identity takto odvozených značených částí se liší jedním nukleátidovým inkre-mentem. Z předchozí znalosti didesoxy-terminátoru anebo nukleotidové mapy a téhož tápu se lineárním způsobem snadno dedukuje sekvence. Příklade provedení vynálezu
Další příklady jsou· připojeny pouze se zřetelem na objasnění, v žádném případě nemají charakter omezovači.
Pokud není uvedeno jinak, pak chemická činidla, použitá v příkladech, lze získat od Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI. Použity tyly tyto dále uvedené zkratky: ANP = kyselina 3-(Pmon-amino)-3*-(2-nitrofenylpropionová, KBA = kyselina 4-(Pmoc-aminomethyl-3-nitrobenzoová, HATIJ = 0-7~azabenzotriazol-l“yl-í'T,ií,h ^-tetramethyl- uroniumhexafluorfosfát, DIBA = diisopropylethylamin, MCI’ = monochlortriazin, HMM — 4 -me t hy Imo r f o 1 i n, BMP = H-me thylpyrrolidon ACT357 = syntézní látka ACT-357 peptidu, Advanced Chem.Tech.Inc., Louisville, ΚΪ,
ACT é Advanced Chem.Tech., Inc., Louisville, KY
KovaBiochem = CalBiochem.iTovaBiochem International, San Diego, CA TIA = kyselina trifluoroctová
Tfa = trifluoracetyl iHIP = Tfp = DIAEA = MOT % 5 '-AH-0D1Í kyselina H-methylisonápekotová tetrafluorfenyl 2-(diisopropylamino)-ethylamin monochlortriazen 5 ^-aminohexyl na konci oligodesoxynukleotidu, oba podíly dohromady. Příklady Příklad 1 Příprava vazebných složek, labilních v kyselém prostředí k použití sekvenčních, štěpitelných složek, identifikujících mol.hmotnost Syntéza pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných, hmotnostnš-spektroskopických značených složek, to k uvolnění značených složek s karboxyamidovou koncovkou.
Reakční schéma: viz vyobr.l »· ··♦· • · · • · · • ♦ · ·♦ • é ·· • · · « • · ·* ··· · < • » 4 ·* *· -113-
Stupen A. V dimethylformamidu se suspenduje 1 ekn. -pryskyřice TentaGel S AO (sloučenina II, dostupná od ACT) y nádobce pro peptidový syntetizátor(ACT357); po přidání 3 ekv.sloučeniny I a 7,5 ekv.DIBA v dimethylformamidu se nádobka se směsí látek potřepává hodinu. Po oddestilování rozpouštědla se pryskyřice promyje' 2x pomocí NlIP, 2x mothanolem a 2x dimethylformamidem. Navázání sloučeniny I na pryskyřici a stupně promývání se opakují, čímž se získá látka III.
Stupen B«
Pryskyřice (sloučenina III) se smíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu, a vše se protřepává 5 minut. Pryskyřice se odfiltruje, a po přidání 25% piperidinu v dimethylformamidu se potřepává 10 minut. Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se promyje 2 x použitím ITIvíP, 2 x methanolem a 2 x dimethylformami-dem. Následuje další přímé použití ve stupni C.
Stupen C
Krycích skupin zbavená pryskyřice ze stupně B se suspenduje v dimethylformamidu, a potom se přidá do reakční směsi aminokyselina, chráněná PMOG, obsahující aminovou funkci ve svém postranním řetězci (sloučenina IV, například ;\l-H-PM0C-3-(3-pyridyl)-alanin (dostupný u Synthetech, Albany, OR, 3 ekv), HATU (3 ekv), a DIBA (7,5 ekv) v dimethylformamidu. Obsah nádobky se potřepává po dobu hodiny. Po oddestilování rozpouštědel se pryskyřice promyje použitím NMP (2x), methanolu (2x) a dimethylformamidu (2x). Uavázání IV na pryskyřici a stupně promývání se opakují, až se získá sloučenina V.
Stupeň D
Pryskyřice (sloučenina V) se v reakci s piperidinem, jak je to popsáno ve stupni B, zbaví PMOC-skupin. Pryskyřice, zbavená krysích skupin, se rovnoměrně rozdělí působením ACT357 z původní reakční nádobky do 16 reakčních nádobek.
Stupeň E 16 alikvotních částí pryskyřice, zbavené chránících skupin ze stupně D se suspenduje v dimethylformamidu. Do každé ·« · % · ·· • · • · • · •4·* ··♦ ·· ··♦· • · · « I * • · * • » · ♦ t 0 Μ ·· • · · • Μ ··· · · • · · • t ♦· -114- zi-reakčních nádobek se přidá odpovídající vhodná kar boxy lová kyselina VI-ι (R-« 15COOH , 3 ekv), HáSU (3 ekvivalenty), a DIEA (7,5 efev) v dimethylformamidu, obsah nádobek se pro- třepává hodinu, rozpouštědlo se oddestiluje a alikvotní podíly pryskyřice se pro yjí použitím ITMP (2x), methanolu (2x) a dimethylformamidu (2x), líavázání sloučenin VI1_1g na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují za vzniku sloučenin
Stupeň F
Alikvatní podíly pryskyřice (sloučeniny ) se vždy promyjí třikrát methylenchloridem. Do každé nádobky se přidá l/oní roztok kyseliny trifluoroctové a methylenchloridu, obsah se protřepává 30 minut, rozpouštědlo se potom vydestiluje z jednotlivých reakčních nádobek do individuálních trubiček. Alikvotní podíl pryskyřice se promyje vždy dvakrát methylen-dichlcridem a inethanolem, filtráty se spojí do individuálních trubiček, obsah se vždy zahustí ve vakuu za vzniku sloučenin YIIIX-16·
Stupeň G
Každá z těchto volných kar boxy lových kyselin VlII^^g se odděleně rozpustí v dimethylformamidu, do každého z roztoků se přidá 1,05 ekv.pyridinu a potom 1,1 ekv. pentsfluorfenyl-esteru kyseliny trifluoroctové. Směsi se míchají 45 minut za teploty místnosti, roztoky se zředí přidáním ethylesteru kyseliny octové a po promytí třikrát za použití 1 M vodného roztoku kyseliny citrónové a třikrát 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a po vysušení bezvodým síranem sodným a filtraci se zahuštěním ve vakuu získají sloučeniny IXl-l6
Syntéza pentafluoresterů chemicky štěpitelných značených složek s přihlédnutím k hmotnostní spektroskopii k uvolnění značených složek s koncovkou karboxylové kyseliny
Reakční schéma, viz vyobr.2 99 9 9 · 99 9999 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 999 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 -115-
Stupeň A V prostředí chloroformu se zahřívá 2 hodiny do varu pod zpětným chladičem směs 1 ekv. kyseliny 4-(hydroxymethyl)-fenoxymáselné (sloučenina I) a 2,1 ekv. diisopropyldiethylaminu (DIBA) a 2,1 ekv.allylbromidu. Směs se dále bředí ethylesterem kyseliny octové, rgztok se promyje dvakrát 1 í-í roztokem kyseliny chlorovodíkové, dvakrát uhličitanovým pufrem (pH 9,5) a jednou solankou, načež se vysuší bezvodým síranem sodným. Zahuštěním ve vakuu se takto izoluje allylester sloučeniny I.
Stupen B V prostředí methylendichloridu se smísí 1,75 ekv. allyl-esteru sloučeniny I ze stupně Asi ekv. FMOG-chráněné aminokyseliny s amino-funkcí v postranním řetězci, např. jako je qL.-N-iOMC-3-(3-pyridyl)-alanin (Syntetech, Albany, OR) a po přidání 2,5 ekv. N-methylmorfolinu a 1,1 ekv. 0-7-azabenzo-±riazol-l-yl-N,N,lí 1Γ '-tetramethyluroniumhexafluorfosfátu se reakční směs míchá za teploty místnosti po 4 hodiny. Potom se zředí methylendichloridem, roztok se promyje dvakrát 1 M vodným roztokem kyseliny citrónové, jednou vodou a dvakrát 5?oním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší se bezvodým síranem sodným a po filtraci se filtrát zahustí ve vakuu. Sloučenina III se izoluje bleskovou chromátografií GHgGIg—ý ethylester kyseliny octové.
Stupeň C
Sloučenina III se rozpustí v methylendichloridu, přidá se 0,07 ekv. tetra-(trifenylfosfinyiy-palladia a 1 ekv. íl-met-hylanilinu, reakční směs se míchá 4 hodiny za teploty místnosti, feřed<£ se methylendichloridem, promyje 1 M vodným roztokem kyseliny citrónové a to dvakrát, potom jednou vodou, a po vysušení bezvodým síranem sodným §e filtrát zahustí ve vakuu. Sloučenina IV se izoluje bleskovou chromatografi£ CHgClg—$ ethylester kyseliny octové + kyselina octová
Stupeň D V dimethylformamidu se suspenduje 1 ekv. pryskyřice lentaG-el
AC (sloučenina V) v kolekční nádobce syntetizéru peptidu ACT 357 (Advanced Chem.Tech.Inc., ACT, Louisville, KY). Po přidání 3 ekv. sloučeniny IV, 3 ekv HATU (vis stupeň B) a 7,5 ekv. diisopropylethylaminu se reakční nádoba potřásá po dobu hodiny. Po oddestilování rozpouštědla se získaná pryskyřice promyje dvakrát N-methylpyrrolidonem, dvakrát methanolem a dvakrát dimethylformamidem. Navázání látky vzorce IV na pryskyřici, jakož i stupňa promývání se opakují, získá se tok látka vzorce VI. Stupeň E
Pryskyřičná látka VI se smíchá v dimethylformamidu s obsahem 25% piperidinu, po potřepávání 5 minut se pryskyřice odfiltruje, znovu smíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu a směs se potřepává 10 minut. Rozpouštědlo se oddestiluje, pryskyřice se promyje dvakrát N-methylpyrrolidonem, dvakrát methanolem a dvakrát dimethylformamidem. Pryskyřice, zbavená .chránících skupin se pak rozdělí rovnoměrně dle ACI357 z kolekční nádobky do 16 reakčních nádobek.
Stupeň F Všech 16 alikvotních podílů pryskyřice, zbavené chránících skupin ze stupně E se suspenduje v dimethylformamidu, do každé z reakčních nádobek se přidá odpovídající vhodná karboxylová kyselina VH^^g, tedy obecného vzorce R^^gCOOH, a to 3 ekv, př dají se 3 ekv. HATU (viz stupen B) a 7,5 ekv. diisopropylethy1-aminu v dimethylformamidu, nádoba se protřásává hodinu, rozpouštědla se oddestilují a alikvotní podíly pryskyřice se pro-myjí použitím N-Eiethylpyrrolidonu dvakrát, methanolu a dimethylformamidu rovněž vždy dvakrát. Navázání kyselin vzorce VII^_^g na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují, vzniknou sloučeniny VlII^^g. v
Stupen G
Alikvotní podíly pryskyřice (sloučeniny VlII^^g se pro-myjí třikrát methylenchloridem, do každé z reakčních nádobek se -117- ·· · ·· ···♦ ♦ ♦ ·· • · ·· • • ' · • · • • • · • · • • · ·· • · • · • • • ··· • # • · • • • ♦ • • ···« ··· ·· • ·· přidá methylenchlorid s obsahem 1% kyseliny trifluoroctové, po míchání 10 minut se rozpouštědlo filtruje z reakčních nádobek do jednotlivých trubiček. A}.ikvotní podíly pryskyřice se pro-myjí vždy dvakiát methylendichloridem, a methanolem, filtráty se spojí do individuálních trubiček a zahuštěním těchto ve vakuu se získají sloučeniny .
Stupeň H
Každá z volných kar boxylových kyselin se rozpustí v dimethylformamidu, ke každému z roztoků se přidá 1,05 ekv. pyridinu, dále 1,1 ekv. pentafluorfenylesteru kyseliny trifluoroctové, reakční směsi se míchají za teploty místnosti po 45 minut, roztoky se zředí ethylesterem kyseliny octové s následným promytím vždy třikrát 1 lvi vodným roztokem kyseliny citrónové a 5/-ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, následuje vysušení bezvodým síranem sodným, filtrace a zahuštění ve vakuu. Výsledek: sloučeniny Příklad 2
Důkaz fotolytického štěpení T-L-X
Sloučenina T-L-X, jak byla připravena v příkladu 11, se ozáří blízkým ultrafialovým světlem (7 minut, teplota místnosti). Jako zdroj ultrafialového světla se použijr Rayonett fluorescence UV lamp (Southern New England Ultraviolet Co., Middletown, CT) s emisním pikem 350 nm. Lampa se umístí ve vzdálenosti 15 cm od Petri-ho misek se vzorky. Podle SDS gelové elektroforezy nad 85% konjugátů bylo rozštěpeno za těchto podmínek. Příklad 3 Příprava fluoreskujících značených primérů a důkaz štěpení fluorofóru
Syntéza a čistění oligonukleotidů
Oligonukleotidy (ODN) se připraví na automatizovaných DNA syntetizérech za použití standardní fosforamiditové chemie (dle ♦ · o • · · · ♦ ♦ ·· ♦··· ··· ··« -118- # t ·· i # · · • ·· ·♦♦ · · • · o i « · · výrobce), nebo H-fosfonátoré chemie (Glenn Research Sterling, VA). Vfeodné blokované dA, dG. dG a 2 fosforamidity jsou takto obchodně dostupné a syntetické nukleozidy je možno snadno převést do odpovídající vhodné formy. Oligonukleotidy se připraví použitím standardního fosforamiditu, přímo dodávaného, nebo ÍT-fosfonátovou chemií. Oligonukleotidy se čistí úpravou běžných postupů.Oligonukleotidy s 5 tri tylovou skupinou se chromqto-grafují vysokotlakovou kapalinovou chromátografií za použití reverzní fázové kolony, 12 mikrometrů, 300 44 Rainin (Eme-ryville, CA) Dynamax C-8, 4,2 na 250 mm s ušitím gradientu 15% až 55% acetonitrilu v 0,1 li BtyhH+0Ac“, pH 7,0, 20 minut. Po provedeném detritylování se oligonukleotidy dále čistí gélovou exkluzní chromátografií. Analytická kontrola kvality oligonuk-leotidů se provede na PRP-kolcnš (Alltech, Deerfield, IL) v alkalické oblasti a použitím PAGB. Příprava 2,4,6-trichlortriazinových derivátů oligonukleotidň:
Po dobu 30 až 120 minut a za teploty 19 až 25°C reagují v alkalickém pufru (pH 8,3 až 8,5) spolu 1000 pg vázaného oligonukleotidu s 5 *~amino koncovkou s nadbytkem překrvstalovsného chloridu kyseliny kyanurové. Reakce se dokončí v 0,15 M roztoku bori-r tanu sodného při pH 8,3 za: přidání 3,2 mg/ml překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové a 500 ug/ml odpovídajícího oligo-nukleotidu. Hezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní exkluzní chromatografií dle velikosti na G-50 Sephadexu (Pharmacia, Piscataway, PJ) koloně.
Aktivovaný vyčištěný oligonukleotid potom reaguje s molárně 100-násobným nadbytkem cystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného (pH 8,3) hodinu za teploty místnosti, hezreagovaný cystamin na koloně G-50 Sephadexu (viz výše) a deriváty ODÍT potom reagují s amino-reaktivními fluorofory. Deriváty ODÍT jako přípravky se rozdělí na 3 části a každá z nich reaguje buď a) s dvacetinásobkem molárním Texas Red-sulfonylchloridu (Mole-cular Probes, Bugene, OR), nebo ·· ··· · ·· ·· I · · * > * ·· ·· · · · • · # Μ r!19- b) s dvacetinásobkem molárním Lissamine-sulfonylchloridu (Mo-lecu&ar Probes, Eugene, OR), nebo c) s dvacetinásobkem molárním isothiokyanatanu fluoresceinu. Konečnými reakčními podmínkami je 0,15 M roztok boritanu sodného (pH 8,3), hodina, teplota místnosti. Hezreagované fluorochromy se odstraní na koloně G~50 Sephadex, viz zde výše. , K odštěpení fluorochromu z oligonukleotidy se ODU upraví no koncentraci 1 . 10 molární s následným 12,3-násobným sředě ním v TE (TE je 0,01 K Tris, pH 7,0, 5 mři kyseliny ethylendi-amintetraoctové). Do ohjemů ODE lOOppidá po 25 ;ul 0,01 M dithio threitolu (DTT). Do totožné serie sady kontrolních vzorků se DDT nepřidá. 8mšs se ponechá stát 15 minut za teploty místnosti a fluorescence se změří na černé mikrotitrační destičce. Z inku bačních trubiček se vyjme roztok (150 mikrolitrů) a umístí se na černé nikrotitrační destičce (Dynatek Laboratories, Chan-tilly, VA). Z destiček se přímo provede odečet za použití fluorometru Pluoroskan II (Piovy Laboratories, McLean, VA) za použití excitační vlnové délky 495 nm a monitorováním emise při 520 nm pro fluorescein za použití excitační vlnové délky 591 nm a monitorováním emise při 612 nm pro Texas Red, dále za použití excitační vlnové délky 570 nm a monitorováním při 590 nm pro lissamine.
Moly fluorochromu RFU RPU RPU r* neodštopený odštěpený volný 1,0 . 10° 11 6,4 12 00 1343 3,3 . 106M 2,4 451 456 1,1 . 106M 0,9 135 130 3,7 . 107K *7 0,3 44 48 1.2 o 10'K 0,12 15,3 16,0 4,1 . 107M 0,14 4,9 5,1 1.4 . 108M 0,13 2,5 2,8 4,5 . 109M 0,12 0,8 0,9 Z údajů zde uvedených plyne, že dojde asi k 200-násob-nému zvýšení relativní fluorescence, byl-li fluorochrom odště- • · Μ ···· • · ·· ·· • · · · · · t « » · ·· tý · · ·· · · t • 9 » 9 9 9 «9 « ·· «.· -120- pen z ODN. Příklad 4 Příprava značených M13 sekvenčních primérů a důkaz odštěpení značené složky Příprava 2,4,6-trichlortriazinových derivátů oligonukleotidů: Provede se reakce 1000 pg vázaných oligonukleotidů s 5^-amino koncovkou (5 ^-hexylamin-TGTAAJLACGACGGCCAGT-j/'(. sekvence ID, č.l) s nadbytkem překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové v 10%ním alkalickém lí-methylpyrrolidonovém pufru (pil 8,3-8,5), 30 až 120 minut, 19 až 25°G. Konečné reakční podmínky: 0,15 M roztok boritanu sodného, pH 8,3, 2 mg/ml překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové a 500 pg/ml odpovídajícího oligo-nukleotidu. Kezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní chromatografováním na koloně G-50 Sephsdexu, jak to bylo popsáno zde již výše.
Pak se provede reakce aktivovaného vyčištěného oligonukleotidu ye stonésobkem nadbytku cystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného při pH 8,3. 1 hodinu za teploty místnosti. Hezrea-govaný cystamin se odstraní chromátograficky na koloně G-50 Sephadexu, viz zde výše. Deriváty ODN pak reagují s různými amidy. Deriváty ODN se potom rozdělí na 12 dílů a provede se reakce každé části (25 mol.nadbytek) s pentafluorfenylesterem kyseliny, bud 1) 4-methoxybenzoové, 2) p-fluorbenzoové, 3) toluové, 4) benzoové, 5) indol-3-5ctové, 0) 2,6-difluorbenzoové, 7) H-oxidu nikotinové, 8) 2-nitrobenzoové, 9) 5-acetylsalicylové, 10) 4-ethoxybenzoové, 11) skořicové, 12) 3-ami no ni kot i nové. « • · ·· · • · • * · f * ··· • · · · · · Μ ·· • · · · · · * · · · ·· * · · tM · · • · · · · « · · * β -121-
Reakční doba: 2 hodiny, 37° C v 0,2 M vodného roztoku boritanu sodného, pH 8,3. Deriváty ODN se čistí gelovou exkluzní chroraatografií na G-50 Sephadexu. K odštěpení znaeené složky z oligonukleotidu se koncentrace c ODN upraví na 10“^ molární s následným zředěním 12,3-krát použitím TE (TB je 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM kyseliny ethylendiamin tetra-octové) s 50% ethanolu (objem na objem). K objemům po 100 μΐ ODN se přidá po 25 μΐ 0,01 M roztoku dithiothreitolu (DTT).
Do totožné sady kontrolních DDT se nepřidá. Inkubační doba: 30 minut, teplota místnosti. Dále se přidá roztok chloridu sodného (0,1 M) a dvěma objemy ethanolu se vysráží ODN. Ta se pak izoluje z roztoku odstředěním 14.000 x G, 4° 0, 15 minut. Látka nad sedlinou se uchová a dokonale vysuší, kulička se potom rozpustí v 25 yil methanolu. Kulička se dále testuje hmotnostní spektrometrií se zřetelem na přítomnost značené složky.
Hmotnostním spektrometrem, použitým při této práci, byl esterní iontový zdroj Fohrier-ova transformního hmotnostního spektrometru (FTMS). Vzorky, přípravné analýzou BíALDI se nanesou na hrot sondy a vše se vsune do zdroje iontů. Je-li vzorek ozářen laserovým pulsem, extrahujísse ionty ze zdroje a přecházejí do dlouhého kvadrupolního vodiče iontů, který je zaměří a přepraví do FTMS analytické buňky, umístěné v otvoru supravodivého magnetu.
Ze spektra lze vyčíst tyto informace: Píky, lišící se z hlediska intenzity od 25 do 100 jednotek relativní intenzity s odpovídajícími mol.hmotnostmi: (1) 212,1 amu...odpovídá derivátu kyseliny 4-methoxybenzoové, 2) 200,1 amu (3) 196,1 amu (4) 182,1 amu (5) 235,2 amu (6) 218,1 amu (7) 199,1 amu (8) 227,1 amu derivátu kyseliny 4-fluorbenzoové, derivátu kyseliny toluové, derivátu kyseliny benzoové derivátu kyseliny indol-3-octové, derivátu kyseliny 2,6-difluorbenzoové, derivátu N-oxidu kyseliny nikotinové, 2-nitrobenzamidu, *· • · • ••9 *· « · • · • · • • * • · • • » t • • § • · t · % • • * • · • 199 • • • • • • · * • • • t» ·· 4 *· t* -122- (9) 179,18 amu, odpovídá derivátu kyseliny 5-acetylsalicylové, (10) 22,61 amu derivátu kyseliny 4-ethoxybenzoové, (11) 209,1 amu derivátu kyseliny skořicové, (12) 198,1 amu derivátu kyseliny 3-aminonikotinové. Z výsledků, je jasné, že došlo k odštěpení podílů, identi-fmkujících mol.hmotnost z primérů s tím, že jsou zjistitelné hmotnostní spektrometrií. Příklad 6
Příprava sady sloučenin vzorce R^^-Lysí £-iIHP)-AHP-TPP
Ha vyobr. 3 je doložena paralelní syntéza sady 36 T-L-X- sloučenin (X = L^), kde znamená aktivovaný ester (zvláště pak tetrafluorfenylester), L" je o-nitrobenzylaminovs skupina s tím, že L znamená methylenovou skupinu, spojující a 1?, T má modulární strukturu, kde karboxylová skupina lysinu byla navázána na dusíkový atom IΓ benzylaminové skupiny za vzniku amidové vazby, dále s obsahem složky Rn 0/- s měnící 2 se hmotností (kde R-skupiny odpovídají T dle zde již uvedené definice a lze je zavést použitím kterékoli specifické karbo-xylové kyseliny, jak zce byly uvedeny),a to s tím, že je vázána na οί^-aminoskupinu lysinu, zatím co skupinu, podporující citlivost hmotnostního spektra (zavedená použitím kyseliny H-methyl-nipekotové) je vázána £ -aminoskupinou lysinu. S odvoláním na vyobr.3:
Stupeň A:
Pryskyřice HovaSyn, 1 ekv.(dostupná od ITova Biochem) se suspenduje v dinr-vthylformamidu v jímací nádobce pro ACT357. V prostředí dimethylformamidu se přidá sloučenina I (AHP od ACT, 3 ekv.) a 4-methylmorfolin (7,5 ekv) a vše se protřepává hodinu. Po oddestilování rozpouštědla se pryskyřice promyje vždy dvakrát 4-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem; navázá· ní látky I na pryskyřici a stupně promývání se opakují za vzniku látky II. 00 * • 0 0Φ·· 00 00 0 0 00 • · 0 0 0 0 0 • * 0 0 0 0 0 00 * * • · • 0 • 0 0 0 0 0 • 0 0 • • 0 0 0 ·«·« 0 0 0 • 0 0 00 0 0 -123-
Stupen B
Pryskyřice (látka II) se smíchá s 25% piperidinu v di~ methylformamidu, po pětiminutovém protřepávání se pryskyřice odfiltruje, a po smíchání s 25% piperidinu v dimethylformamidu nové protřepávání po 10 minut. Rozpouštědlo se oddestiluje, pryskyřice se promyje vždy dvatabát 4—methylpyrrolidonem, metha-nolem a' dimethylformamidem, použije se pak přímo ve stupniC.
Stupeň G
Chránících skupin zbavená pryskyřice se stupně B se suspenduje v dimethylformamidu a tamže se přidá FMOC-chráněná aminokyselina, obsahující chránící aminovou funkci v postranním řetězci (Fmoc-lysin(Aloc)-OH, od Perseptive Biosystems, 3 ekv), HATU (3 elcv.) a 4-methylmorfolin (7,5 ekv) v dimethylformamidu.
Po hodinovém protřepávání se rozpouštědla oddestilují a pryskyřice se p omyje vždy dvakrát použitím !T-methylpyrrolidonu, metha-nolu a dimethylformamidu. Navázání Fmoc-Lys(Aloc)-OH na pryskyřici a stupně promývání se opakují za vzniku sloučeniny IV.
Stupeň D
Pryskyřice (sloučenina IV·) se pr omyje dvakrát methylendi-chloridem a suspenduje se s roztokem 0,3 ekv. tetra(trifenyl-fosfin)-palladia a 10 ekv. monofenylsilanu rovněž v prostředí methylendichloridu. Směs se protřepává hodinu, rozpouštědlo se oddestiluje a zbytek se promyje dvakrát methylenchloridem. v
Stupen za použití sloučeniny palladia se opakuje, rozpouštědlo se opět oddestilugg, pryskyřice se promyje dvakrát methylendi-chloridem N,N-diisopropylethylamoniumdiethyldithiokarbamátem, rovněž dvakrát a dvakrát dimethylformamidem. Získá se tím látka V.
Stupeň B
Pryskyřice, zbavená chránících skupin ze stupně D se spojí s kyselinou ΪΙ-methylisonipekotovou, jak je to popsáno ve stupni C;pro sloučeninu VI, která se takto připraví.
Stupen F
Pryskyřice, zbavené Fmoc VI se rovnoměrně rozdělí s přihlédnutím k ACT357 z reakční nádobky do 36 reakčních nádobek
sloučenin Vl-^g Stupeň G jak
Na pryskyřice (sloučeniny VI^^g)se působí pipeÝidinem, se to popisuje ve stupni B s úmyslem odstranit skupinu MOC.
Stupeň H 36 alikvotních podílů pryskyřice bez chránících skupin ze stupně G se suspenduje v dimethylformamidu. Do každé z reakčnícb nádobek se přidá v množství 3 ekv. odpovídající karboxylová kyselina (R^^gCOOH), 3 ekv. HADU a 7,5 ekv. 4-methylmorfolinu v dimethylformamidu. Po protřepávání hodinu se rozpouštědla oddestilují a alikvotní podíly pryskyřice se promyjí vždy dvakrát 4-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem. Stupeň navázání kyselin Pl_3gC00H na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují, získají se tak sloučeniny vzorce VlII^^g ·
Stupeň I
Alikvotní podíly pryskyřice (sloučeniny VlII-^g) se promyjí třikrát methylendichloridem a do každé z nádobek se přidá směs 90 na 5 na 5 kyseliny trifluoroctové, H20 a methylendichloridu, po protřepávání 120 minut se rozpouštědla odfiltrují z jednotlivých reakčních nádobek do individuálních trubiček. Alikvotní podíly pryskyřice se promyjí vždy dvakrát methylendichloridem a methanolem, filtráty se spojí v individuálních trubičkách, jejich obsahy se zahustí ve vakuu a tak se získají sloučeniny IX-^g*
Stupeň J
Každá z volných karboxylových kyselin IX^ ^g se rozpustí v dimethylformamidu, ke každému z těchto roztoků se přidá 1,05 ekv.pyridinu a 1,1 ekv. tetraflurfenylesteru kyseliny trifluor-octové. Za teploty místnosti následuje míchání 45 minut, roztoky se zředí přidáním ethylesteru kyseliny octové a po trojná-sobním promytí použitím 5‘kniho vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, vysušení bezvodým síranem sodným a filtraci se zahuštěním ve izakuu získají sloučeniny ^„^g· #· • ·· ···· #· ·· ♦ » ·· ♦ · t • · • • • • • · · • · ·· » • · · · • ··* • ' · * • * · · • • • ···· ··* ♦ ♦ « ·· -125- Příklad 6
Příprava sady sloučenin vzorce R-^g-Lysí £ - iHIP)-TFP
Ha vyobr. 4 je paralelní íntéza sady-36 sloučenin 1-L-X (X «v. kde znamená aktivovaný ester (zvláště pak tetra-fluorfenylester), L2 znamená skupinu o-nitrobenzylaminovou 3 2 s L znamenající přímou vazbu mezi 1^ a 1 , kde je skupina přímo navázaná na aromatický cyklus skupiny L2, T má modulární strukturu, kde karboxylová skupino lysinu je vázána na dusíkový atom L benzylaminové skupiny za vzniku amidové vazby a složky s různými mol.hmotnostmi( kde R skupiny odpovídají T , definovaným zde dříve a mohou být zavedeny použitím kterékoli ze dne jmenovaných karboxylových kyselin) a jsou vázány o^-ami no skupinou lysinu s tím, že látka, podporující hmotn. spektrum (zavedená působením kyseliny ll-methylisonipekotové) je vázána na £ _aminoskupinu lysinu.
S odvoláním na vyobr.4 Stupeň A
Podle postupu, popsaného ve stupni A příkladu 5 se spojí pryskyřice HovaSyn HMP se sloučeninou I (HBA, viz postup Brown-a a spol., Molecular Diversity 1, 4 (1995), získá se tím sloučenina II.
Stupně B až J
Pryskyřice (sloučenina II) se zpracovává, jak to bylo popsáno ve stupních B až J příkladu 5 za vzniku sloučenin
Xl-36* Příklad 7
Příprava sady sloučenin vzorce iHIP~Lys( £ )-AHP-TPP
Ha vyobr. 5 je zachycena paralelní syntéza 36 sloučenin T-L-X (X = L^), kde znamená aktivovaný ester (zvláště éetra-fluorfenylester), znamená o-nitrobenzylaminovou skupinu s tím, že L znamená methylenovou skupinu, jež spojuje s L , T má modulární strukturu, kde karboxylcvá skupina lysinu byla navázána #♦ · *····· *· ·· « · 4 · » · · · · · ♦ t « · · ♦ # · ·· f · · * · « | ·*« · * • · · # · ··· ·««· «·· ·· * ·» t · -126- 2 na dusíkový atom L -benzylaminové skupiny za vzniku amidové vazby, a znamená složku s variabilní mol.hmotností^ kde skupiny R odpovídají T2 dle dříve již uvedené definice a mokou se zavést použitím jakékoli z jmenovaných karboxylových kyselin) o je vázána £ -aminoskupinou lysinu, zatím co složka, ovlivňující citlivost hmotnostního spektra (zavedená použitím kyseliny N-methylisonipekotové) je vázána na oí-aminoskupinu lysinu, S odvoláním na vyobr.5 Stupně A až C : stejně jako v příkladu 5
Stupeň D
Na pryskyřici (sloučenina IV) se působí piperidinem, jak to bylo popsáno ve stupni B příkladu 5 k odstranění skupiny PMOC.
Stupeň E
Krycích skupin zbavený -amin na prysk řici ze stupně D se váže použitím kyseliny N-methylisonipekotové, jak to bylo popsáno ve stupni C příkladu 5 za vzniku látky V. v
Stupen P: totéž jako v příkladu 5 Stupeň G
Na pryskyřici (sloučeniny Vl-^-g) se působí palladměitou sloučeninou jako ve stupni D příkladu 5 k odstranění skupin Aloe.
Stupně H až J
Sloučeniny se připraví obdohně, jako v příkladu 5. Příklad 8
Příprava sady sloučenin vzorce R^-7g»Gluj? ^-DIAEA)-ANP-IPP
Na yyobr. 6 jsou paralelní syntézy sady 36 sloučenin Ϊ-L-X (X = L^), kde znamená aktivovaný ester (zvláště pak tetrafluorfenylesterj, L2 znamená o-nitrobenzylaminovou skupinu
• ♦ * • ·· ··«· ·· ♦ * • · ♦ · · • · • • • • · « • · ·· - • • · t ♦ 4 ♦♦♦ • • • « ♦ · • • • • · · ··· ·· .« M -127- 2 2 s tím, že li znamená methylenovou skupinu, spojující a I , T má modulární strukturu, kde kar boxy lová skupina glutamové kyseliny je vázána na dusíkový atom L benzylaminové skupiny za vzniku amidové vazby a složka R^^g s variabilní mol.hmotností (kde skupiny R odpovídají 1‘ , jak to konečně zde již bylo uvedeno a mohou se zavést použitím kterékoli specifikované zde již uvedené karboxylové kyseliny) je vázána A-aminoskupinou glutamové kyseliny, zatím co skupina, podporující hmotnostní specitifkou citlivost |T zavedená použitím 2-(diisopropylamino)-ethylaminuj je vázána karboxylovou skupinou glutamové kyse liny . S odvoláním na vyobr.6 Stupně A, B : stejně jako v příkladu 5 v
Stupen 0
Pryskyřice, zbavená chránících skupin (sloučenina III) se naváže na Fmoc-Glu-(OA1)-OH použitím postupu spojování, jak byl popsán ve stupni G příkladu 5, výsledkem je sloučenina vzorce IV Stupeň D
Allylester na pryskyřici (sloučenina IV) se promyje dvakrát methylendichloridem a v prostředí methylendichloridu se smíchá s 0,3 ekv. tetra(trifenylfosfin)-palladia a 3 ekv. N-methylala-ninu, směs se protřepává hodinu, rozpouštědlo se oddestiluje a pryskyřice se promyje dvakrát methylendichloridem. Stupeň za použití sloučeniny palladia se opakuje. Rozpouštědlo se oddestiluje, pryskyřice se promyje dvakrát methylendichloridem, Ν,Ν-diisopropylethylamoniumdiethyldithiokarbamátem v diraethyl-formaraidu a dimethylformamidem, za vzniku sloučeniny V.
Stupen E
Pryskyřice, zbavená chránících skupin ze stupně D, se suspenduje v dimethylformamidu a aktivuje se přidáním 3 ekv.HATU a 75i5 ekv. N-methylpyrrolicionu. Po potřásání nádobkami se rozpouštědlo oddestiluje a pryskyřice se promyje jednou U-methyl-pyirrolidonem, dále se pryskyřice promíchá s 3 ekv. 2-(diisopro-pylarnino)-ethylaminu a 7,5 ekv. 4-methylmorfolinu, nádobky se potřásají hodinu. Navázání 2-(diisopropylaminp)-ethylaminu na pryskyřici a stupně promývání se opakují, to za vzniku 9 9 · * · · · · » c · I t * * • · · Mlt ·«* ·» ···· • · ♦ · # ·· M • · · * 9 · *· ·· * · · ♦ · * 9 9 Ψ * -128- sloučeniny VI.
Stupně P až J; totéž jako v příkladu 5 Příklad 9 Příprava sady sloučenin vzorce R^ _36-Lys( s- -ilíIP ) -A ΪΤP-Lys( £ -11¾ £-1¾
Na vyobr.7 jsou paralelní syntézy sady 36 sloučenin T-L-X (X = Lji), kde znamená aminoskupinu (zvláště -aminoskupinu složky, odvozené od lysinu), L2 znamená o-nitrobenzylaminovou o skupinu s tím, že L je karboxamidově substituovaná alkylen- 2 aminoacylalkylenová skupinu, spojující a L , T má modulární strukturu, kdy karboxylová skupina lysinu byla navázána na dusíko-vý atom 1 -benzylaminové skupiny za vzniku amidové vazby, a složka R^-3g s variabilní mol.hmotností (kde skupiny R odpovídají T , jak to zde bylo již dříve definováno a mohou se zavést použitím kterékoli ze specifických karboxylových kyselin, zde již uvedených) je vázána °C-aminoskupinou lysinu, zatím co skupina, zvyšující citlivost hmotnostní spektrometrie (zavedená použitím kyseliny N-methylisonipekotové) je vázána £-aminoskupinou lysinu.
S odvoláním na vyobr,7 Stupen A
Pryskyřice Pmoc-Lys(Boc)-SRMI (dostupná od AGT, sloučenina I), se smíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu a vše se protře-pává 5 minut. Pryskyřice se odfiltruje, promíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu a po protřepávání směsi 10 minut se rozpouštědlo oddestiluje, a pryskyřice se promývá dvakrát vžd^ lí-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem k přímému použití ve stupni B.
Stupeň B V prostředí dimethylformamidu se smíchá pryskyřice (sloučenina II), AHO (dostupná látka od AGT, 3 ekv.) HA1U (3 ekv) a 4-methylmorfolin (7,5 ekv). Po hodinovém míchání se rozpouštědla oddestilujá a pryskyřice se promývá vždy dvakrát N-methylpyrroli-donem, methanolem a dimethylformamidem. Navázání sloučeniny I na pryskyřici a stupně promývání se opakují, výsledkem je sloučenina III.
Stupně G až J
Pryskyřice (sloučenina III) se dále zpracovává jako ve stupních B až J příkladu 5 za vzniku sloučenin ^-36* Příklad 10
Příprava sady sloučenin vzorce R^^g-LyeK t -T3?A)-lys-( £ -ilITP)--ANP-TFP Z vyobr.8 je patrná paralelní syntéze sady 36 sloučenin T L-X (X = L^), kde znamená aktivovaný ester (zvláště tetra-fluorfenylový ester), znamená methylenovou skupinu, jež spojuje a 1 , T má modulární strukturu, kde karbox^lová skupina prvého lysinu je spojena s dusíkovým atomem L benzylami nové skupiny ta vzniku amidové vazby, skupina, podporující citlivost hmotnostního spektra (zavedená sem použitím kyseliny W-methylisonipekotové) je vázána £ -aminoskupinou prvého lysinu druhá lysinová mokekula je navázána na prvou lysinovou molekulu -aminoskupinou prvého lysinu, látka, upravující mol.hmotnost je vázána £ -aminoskupinou druhého lysinu a složka ^-36 (kde skupiny R odpovídají dle xříve zde již uvedené definice a mohou ge zavést použitím kterékoli ze zde specifikovaných kerboxylových kyselin) je vázána na ^ -aminoskupinu druhého lysinu.
S odvoláním na vyobr.8 Stupně A až E
totožné se stupni A až E příkladu 5 Stupen E la pryskyřici (sloučenina VI) se působí piperidinem, jak je to popsáno ve stupni B příkladu 5 k odstranění FMOC-skupin,
Stupeň G
Pryskyřice, zbavená chránících skupin (sloučenina VII) se naváže na Emoc-Lys(Tfa)-OH za použití postupu, popsaného ve stupni C příkladu 5: výsledkem je sloučenina VIII.
Stupně H až K
Zpracováním pryskyřice (sloučeniny VIII) jako ve stupních • · ♦ 99 ♦♦♦· 99 • · • • · 9 · ♦ • · • 9 9 • • t 1 <1 · 9 9 • • 9 9 9 · 9 ··· 9 9 • • « t « • 9 9 • 9 « • · · 99 9 • 9 99 -130- P až J příkladu 5 se získají sloučeniny χΙχ-36· Příklad 11 Příprava sady sloučenin vzorce R^^g-CiLysC £-iíTIP)-ATTP-5 '-AH-0D!
Ka vyobr.9 je paralelní syntéze sady 36 sloučenin T-L-X, (X = MOI, kde HOI znamená fragment nukleové kyseliny, ODÍT), odvozených od esterů z příkladu 5 (týž postup se může použít v případě dalších sloučenin T-L-X,kde X znamená aktivovaný ester). MOI je komjugována s T«*L- 5'-koncovkou MOI cestou fosfodiester-alkylenaminové skupiny. S odkazem na vyobr.9
Stupeň A
Sloučeniny XII-^-jó se dají připravit modofikovaným bio-tinylovacím postupem, viz Van Hess a spol., Nucleic Acids Res., 19, 3345 (1991). K. roztoku jednoho z 5'-aminohexyloligonukleotidů (sloučeniny ΧΙ^_^^, 1 mg) ve 200 raM 250 ml roztoku boritanu sodného (pH 8,3) se přidá některý z tetrafluorfenylesterů (sloučeniny 2 příkladu A, 100-násobný molární nadbytek v 250 ml H-methylpyrrolidonu^ Reakce se nechá probíhat po dobu noci za teploty místnosti. lezreagované a hydrolyzované tetra-fluorfenylestery se odstraní ze sloučenin Xll^g chromatografo-vánígi na Sephbdex-u G-50. Příklad 12 Příprava sady sloučenin vzorce
Rl-36“L;ys"^ t 'iRI|-AlTP-Ly s-(£(MCT-5 '-AH-0D1)-1¾ la vyobr.10 je paralelní syntéza sady 36 sloučenin T-L X (X = MOI, kde MOI je fragment nukleové kyseliny, ODÍT) odvozených od aminů z příkladu 11 (týž postup by se mohl použít s dalšími T-L-X sloučeninami, kde X znamená amin). MOI se napojí na T-L 5 '-koncovkou LíOI cestou fosfodiester-alkylenaminové skupiny.
S odkazem na vy obr. 10 Stupen A 5 '-[6-(4,6 -Dichlor-l,3,5-triazin-2-ylamino)-hexylj-oligo- ♦ * φ ••t* ··· φφ ·· » · · « I · ·* φφφ φ « • · < ·# ♦· -131- nukleotidy XI 1.^6 se P^iPraví» jak to popsal Van Hess a spol., Hucleic ácids Rqs., 19, 3345 (1991).
Stupen B K roztoku jednoho z 5 ^-6-(4^-dichlor-l^jS-triazin^-ylaminoí-hexyl j-oligonukleotidů (sloučeniny se za koncentrace Img/ml v 100 míá roztoku boritanu sodného (pH 8,3) přidá stomolární nadbytek primárního aminu ze skupiny sloučenin vzorce R-^_^g-Lys( fc -iKIP)-4HP-Lys-(^NH2 )-1^ (sloučeniny ^1-36 2 Příkladu 11); roztok se míchá po dobu noci za teploty místnosti, nezreagovaný amin se odstraní ultrafiltrací membránou, vystřiženou z 3000 MW (Amicon, Beverly, Líh) za použití vody k promývání a to třikrát. Sloučeniny ΧΙΙΙη^ζ se izolují zmenšením objemu na 100 ml. Příklad 13 Důkaz současného detegování většího počtu značených složek hmotnostní spektrometrií. rento přiklad popisuje možnost současného důkazu většího počtu sloučenin (značených složek) hmotnostní spektrometrií. V tomto příkladu bylo smícháno 31 sloučenin s matricí, ne neseno a vysušeno na pevném podkladu s následující desorpcí laserem. Výsledné ionty byly potom přepraveny do hmotnostního spektrometru. Dále uvedené sloučeniny (od Aldrich, Milwaukee, WI) byly vzájemně promíchány na ekvimolárním základu na konečnou koncentraci 0,002 M (na sloučenině): benzamid (121,14), nikotin-amid (122.13), pyrazinamid (123.12), kyselina 3-amino-4-pyra-zolkyjsboxylová (127.10), 2-thiofenkarboxamid (127.17), 4-amino-benzamid (135.15), tolumid (135.17), 6-methylnikotinamid (136.15) 3-arninonikotinamid (138.14), fiikotinemid-H-oxid (138.12), 3-hyd-ropiko1inamid (138.13), 4—Iluorbenzamid (139.13), amid kyseliny skořicové (147.18), 4-methoxybenzamid (151.17), 2,6-difluorbenz-amid (157.12), 4-amino-5-imidazolkarboxamid (162.58), 3,4-pyri-din-dikarboxamid (165.16), 4-ethoxybenzamid (165.19), 2,3-pyra-zindikarboxamid (166.14), 2-nitrobenzamid (166.14), 3-fiuor-4-rnethoxybenzoová kyselina (170.4), indol-3-acetamid (174.2) • · • ♦· ···· ·· ·· • · • · ♦ · * • · • « t • « t 9 • t • t • • • · · · • ··♦ • • • • ♦ # · • • • * *· ♦ *·· ·· · • * -132- 5-acetylsalicylamid (179.18), 3,5-dimethoxy benzamid (181.19), 1-naftalenacetamid (185 .34·), 8-chlor-3,5-dÍ0mino-2-pyrazin-karboxyamid (187.59), 4-trifluormethylbenzamid (189.00), 5-ami-no-5-fenyl-4-pyrazolkarboxamid (202 .22), l-methyl-2~benzyl-ma-lonamát (207.33), 4-amino-2,3,5,6-tetrafluorbenzamid (208.11), 2,3-naftalendikarboxylová kyselina (212.22),. Sloučeniny se umísti do DívíSO ve výše uvedených koncentracích. 1 jih materiálu se potom smíchá s matricí <A -kyan-4-hydroxyskořicové kyseliny (po zředění 1 : 10 000) a nanese se na pevnou podložku z nerezové oceli.
Materiál se dále desorbuje laserem za použití ProteinTOF hmotnostního spektrometru (Bruker, Lianning Park, MA) a vzniklé ionty se změří při postupu jak lineárním, tak reflexním. Byly zjištěny tyto m/z hodnoty (vyobr.ll.): 121.1 .......benzamid (121.14) 122.1 ....... nikotinamid (122.13) 123.1 pyrazinamid (123.12), 124.1 125 .2 127.3.......3-amino-4-pyrazolkarboxylová kyselina (127.iq) 127.2 2-thiofenkarboxamid (127.17) 135.1 4-aminobenzamid (135.15), 135.1 tolumid (135.17) 136.2 6-methylnikotinamid (136.15) 137.1 3-aminonikotinamid (137.14), 138.2 N-oxid nikotinamidu (138.12), 138.2 3-hydropikolinamid (138.13) 139.2 4-fluorbenzamid (139.13), 140.2 147.3 148.2 149.2 152.2 amid kyseliny skořivové (147.18, 4-methoxybenzamid (151.17), 2,6-difluorbenzamid (157,12), 158.3 4-amino-5-imidazolkarboxyamid (162.58), 99 • ·· 9999 99 99 9 9 • · 9 9 9 9 9 • • • · 9 • « • 9 99 9 * 9 • 9 9 9 9 9 #99 • • 9 9 9 9 m • _ ·*«· • 9 9 99 9 9# * 9 99 -133- 163.3 165 .2 165.2166.2 166.2 171.1 172 .2 173.4 17803 179.3· 181.2 182.2 186 «2 188.2 189.2 190.2 191.2 192 .3 203.2 203.4 •3,4-pyridin-dikarboxyamid (165 elg) 4~ethoxybenzamid (165.19), 2,3-pyrazindikarboxamid (166.14) 2- nitrobenzamid (166.14) 3- fluor-4-methoxybenzoová kyselina (170,4) indol-3-acetanid (174.2), 5-acetylsalicylamid (179-18) 3,5-dimethoxybenzamid (181.19) 1-mařtalenacetamid (185.23) 8Achlor-3,5-diamino-2-pyrazinkarboxamid (187.59) 4-trifluormethylbenzamid (189.00) 5-araino-5-f‘enyl-4-pyrazolbarboxamid (202 ,22) 212.2 219.3 221.2 228.2 234. W 237.4 241.4 1-methy 1-2-benzyImalonamát (207.33), 4-amino-2,3,5,6~tetrafluorbenzainid (208.11), 2,3_naftalendikarboxylová kyselina (212.22), Z údajů je jasné, že z 31 sloučenin je 22 ve spektru s předpokládanou hmotností, z 31 sloučenin se jeví být ve spektru 9 s ·· · ·· ···· «I ·· • · ·· · · f ···« ta aat · t ·· a t * # t t · ttt t t •tttt ttt •»tt ·#· tt t tt tt -134- hmotností η + Η (1 atomová hmotnostní jednotka, amu) nad předpokládanou hmotností. Posléze uvedený jev je pravděpodobné důsledkem protonování aminu v sloučenině. A proto z 31 sloučenin bylo 31 dokázáno použitím MALDI hmotnostní spektrometrie. Důležitější, však je, že z příkladu je patrné, že větší počet značených složek lze dokázat současně spektroskopickým způsobem.
Samotná ^ -kyanová matrice (vyobr 11) mela píky při 146,2 164.1, 172,1, 173,1, 189,1, 190,1, 191,1, 192,1, 212,1, 224,1, 228,0, 234,3. Další ve spektru zjištěné hmotnosti jsou dány nečistotami v koupených sloučenin, nebylo totiž vynaloženo žádné úsilí je dále ještě čistit. příklad 14
Mikrosatelitní značení: PCR amplifikace
Mikrosatelitní značení jsou amplifikována použitím těchto standardizovaných podmínek. V krátkosti: provede se reakce PCR v celkovém objemu 50 V·1» obsah 40 ng genomické DRA, 50 pmol každéhp priméru, 0,125 mM dNTPs a 1 jednotka polymerasy značené složky. IX amplifik?ční puřr obsahuje 10 mM Tris-báze, pH 9, 50 mM roztoku chloridu draselného, 1,5 mM roztoku chloridu ho-řečnatého, 0,l?ý Triton-u X-100 a 0,01 % želatiny. Reakce se provedou použitím postupu začátku za horka. Polymerasa značené složky se přidá po prvém denaturování 5 min/96° C. AmplifjLkace se provede pro 35 cyklů: denaturování (94° C, 40 sek.), anelová-n£ (55°C, 30 sek). Stupněm prodloužení (72° C, 2 minuty) končí postup po posledním anelování. Protože amplifikační produkty, které se mají získat, jsou krátké (90 až 350 základních párů co do délky) a časový interval ke zvýšené teplory z 55°C na 94°C (za stupňování teploty čl0C/sek) je dostatečně dlouhý, lze dosáhnout prodloužení DNA bez stupně při 72° C, Z předchozího je patrné, že ačkoliv byla popsána specifická provedení dle tohoto vynálezu jen pro ozřejmění, jsou možné četné modifikgCe, aniž by se vybočilo z rámce a rozsahu vynálezu. ·· ·|Μ • · · • · · • · · • · » ·· · Μ · • ♦ · · • · • · t • · ·♦·· + ·· ·· ·· • · · * • · ·· • ···· · • · · *· ♦· -135-
Vyobrazení I
PMOG
stupeň A V/ FMOC m
o o
stupen B piperidin stupen C FMOC-1ÍH
CO OH
stupen D piperidin /.
R pokr. Vyobr.l 0
A 1-16 ΉΝ- 1 ♦ · · * ···« ·-136,
·« Μ·· ·· Μ * · ♦ · · · * • · · · · ·* » · · · · ·♦·· · • · · · · · ·· t ·· ·♦
stupen D piperidin rozdělit do 16 reaktorů stupeň S R-| ^g-GOOH
stupeň R, zředit kys. trifluor-octovou 0
R
*F
\ FH I 1-16 ''
COOH
R
·· · ·· ·« • ' · • ♦ * • · · t · · ·· ·· • · · * • · · · ··· · · • · I ·♦ ·♦ -137-
Vyobrazení 2
allylbromid, DIEA X = H - > allyl
stupen B
PMOC-ITH\ ^COOH
1 II 9
III PMOC-WH—
I
A v
stupen C
Pd (0)
nJ/ PHOC -UH stupen D « PMOC-NH^X^O A
stupen E piperidin
V
VI R. pokr .Vy obr .2 » · ·· ···« • · · · · « • · · # · » · · · · · • · *
stupen Ξ ·· ·· • ·« · • · ·· ··· · · • · · »· ·· VV/ rozdělit do 16 reaktorů
stupen P VII1-a-g-COOH 0
0 U
IX, stupen G zředěná kys.trifluor-octová 1-16
COOH stupen H pentafluorester kys, trifluoroctové P
R l-l&s b
NH
P ·« ···· ·· · • · ·· • · • · • · MM ··« • ·
• · I • · · • · · ·# · ·· ·· t · · · * I ·♦ ··· · · • · · ·· ·· -139-
Vyobrazení 3 v
stupen A HO·
0 i NOr
NovaSyn HMP prysk. HATU, HMM
stupen B v piperidin
o—
Fmo cHN
stupen E \k
kys.línjnethylisonipekotová HATU, NMM pokr.Vyobr .3 • t · f · ···· ·· ·· ···· · · · · ♦ ♦ · • * · « · ···· • · * · · · · ··· · · • · · · · · · · • ·λλ >0«.. ·· · ·· *· 1
stupeň E
stupen F, rozdělit do 36 reaktorů
piperidin • · pokr ·
Vyobr .3 ···· ··· «· · ·· ·» -141-
stupen G
stupen H R^-COOH ha tu, mm
1-36 Ψ
Stupeň I VTA 4 H20 ; DCM 90
VIII -142- • · • · pokr .Vy obr .3
tupen
I
-143- • · » · » · · · 4 I · · · * · Φ · » · · · · #Φ Φ ΦΦ «4
Vyobrazení 4 NHPmoc
Ho v a Syn HlviP pryskyřice HATU, ΪΤΜΜ
;upen A > HO· HHFmo c
stupen C Imoc-lys~(Aloc)-OH HA TU, IÍMM -
ο~φ
THAloc
V
stupeň D C.(C6H5)3P)4Pd(0> stupen E \ -7 |jys.N-methyl~ isonipekotovTi ha tu mm ^ o
stupen F
V -144- pokr.Vyobr.4
·· ·· • « · · • · · · ·· · · · stupen F, rozdělit do 36 reaktorků. 0
0 H
piperidin
-145-
• · « pokr .Vyobr .4 stupen H R,
1-36-COOH, HATU, MM stupeň I TPA : H20 : DCM 90 V 5 : 5 1-36
stupen J t e tra fluor ester kys.tr ifluoroc t o vé pyridin, dimethylformamid
IX -146-
• «Μ
pokr.Yyobr. 4
stupeň J
IZl-36 -147 - • · · ·
Vyobrazení 5
pipERIDIli stupen B
-148- • · • · · · • · » ·
·· · • · « • ·♦
pokr .Vyobr„5 VI
!tupen F rozdělit do 36 reektorků -Aloemi
stupen G Vl-36 f(e6E5>3p3áPaC0) °<a^yS1H3 0
VIII TFA : ILO £DCM^ 90: 5: 5 ^ '
stupen H R o^COOH i""'50H_ATU, Ηϊ'1/I
' P-36 F u \ ./1
1-36
stupen J I tetrafluorester
0 kys.trifluoroctové ^1-36 il 'pyridin, Dí«F
-149 -149
·· ««·· ·· ·· • · · · · · · • · t · · ·· • · · · ··· · · • · · · · · ·· · ·· ··
Vyobrazení 6 stupeň A__ ΗΟ-φ
Nova Syn-HMP pryskyřice
MU, HMM
Emo clJH
s stupen B piperidin /
0 stunan
Pmoc-Glu(OAi)-OE hatu mm
FmocHN
, JL ΌΑ i
IV &
1 0
EmocHl
stupeň D 1(06Η5)3ΡλΜ (0> IT-methylanilin v
stupen E 2-(diisopropylamino)-ethylamin 0H HATU, NJM
EmoeHN stupen E
J -150pokr. YyobTo 6 stupen
F ro sdělit do 36 reaktorků. ·· ·· • · · · · · • · · · ·· ·· · ·· · ♦ · • · · · · • · · ·· ·· • · · · · · • t
stupeň J
stupen Hr1-36COOH HA TU,
1ÍMM
V
-151- pokr .7yobr.6 • · • · ·« • t ·· » · · « » · Μ ··· · i • · « ·· ·« v
stupen J
Tetrafluorřenylester kyseliny V trifluoroctové
i* P
···· · • · ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • · * · · ···· I • · · I · · • · · * * « * -151- Vyobrazení 7
Y
YI
stupen F ky s .IT-me t hyliso- nipekotová
HATU, mM i' -152 • · ···· * · · · pokr.Vyobr.7
VI
BocHM stupen F Pmo cHIT
VII
BocHN
csJ·' I 1?2 ,ΙτΗ H, * rozdělit do IH 36 zásobníčků
stupen G
Pmo cHW
VII 1-36 stupen H yis piperidin
IX. 1-36/ / stupen J £ TFA : ELO : DCM 90:5:5
-153- ···· ·· • · · · * · • · · t · ···· ··· ·« | ► * ·· • · · · « • · I • « · If
Vyobrazaní 8 l'I0r
Praoc /OHP T
stupen A
HO *
HovaSyn HMP pryskyřice HOg HA TU umí
Pmo o
Prao cH!'í
stupen C IHAloc IV stupen \/piperidin Pmoc-Lys(aloc)-OH ha tu mm υκρ2
III
stupen D 0¾¾¾%3 (0) c6h5sih3
H ¾
VII pokr.Vyobr. 8
VII
V stupen G Fmo c~Lys(T fa)-OH na tu mm
0 vW
0;5^IH a) rozdělit do 36
reservoárků b) piperidin NHTfa VIII
STUPEN I HA TU NIM 0
NHTfa IX
Rl-36“COOH * stupen J TFA:H90:DCM 90:5:5
l1-36 XI1_36 1-36
X, Ll-36 1-36 stupen K tetrafluorester kyseliny trifluoroctové pyridi n, dimethylformamid -155-pokr.Vyobr· 8
HHTfa
XII 1-36 • · ·«·· • · t · • » • • · • • • · • * · • t • · • * ·· · • • • · • • • • • « 1» • · • ♦ -156 • · · • · · · ► · « I * · · * • •I · « • · « * · I#
Vyobrazení 9
H stupen A 100 mM boritan sodný pH 8,3 9*
báze l2-01-36 5 -eminohexyl-snaoené oligonukleotidy 1-36
0 -r-u—i,6 Λ>ο, báze 0 oligonukleotid XIIl-36 1-36 • * · · · · • · • · · * • · · · • 9 ·· ·♦ · · · • * · • · * · -X57-
Cl
Vyobrazení 10
stuoen A oligo nukleotidy 6
Cl
f1,^N JIAs, o v/ i 100 ml Mí boritanu sodného ; chlorid krys.kyanurové oi. Η1ί-(σΗ9)ο-0-Ρ-0· < oligonukleotid 1-36
"1-36 z příkladu E stupeň B 100 mM boritan sodný, pH 8,3 v
WO 97/27325 3>5 8
• « ρςϊ^#01046 i ml -1ΪΪ-iíú
N v. e C5 r-i CN O o-. o o ca rH O ra
WO 97/27325 -160- PCY/US$V01046
Složka s proměnlivou úprava rozsahu hrao t n,, hmotnost
Vyobrazení 13
Fotoodšt· va zebná ;složky oligonukleotid s 5 ^-aminoh ry1o výra. z a ko n o e n í m ^•WRA i NH i
podpora citlivosti hmotn. spektroskop.
JUDrkPetr KALENSKY kdvokát
„ SPOLEČNÁ advokátní KAmeUA VSETEČKA ZELtjTf ČVORČÍK ÁPARTNEŘI 120/00 Praha 2, Málkova 2 Česká republika

Claims (33)

  1. • · ♦ ···« 99 ·♦ • · m 9 • · • · 9 9 ♦ · • · 9 999 ♦ · • · 9 ♦ ♦ • • · • · /{<p4 -P- P A T E Ιί T O Ϊ á H í R O E Ϊ 1. Způsob zjištění totožnosti molekuly nukleové kyseliny, vyznačujíc^ se tím, že obsahuje stupně a) připraví''1 mole kuly značené nukleové kyseliny z jedné Či více molekul zvolené cílové nukleové kyseliny, kdeže je značená složka korelativní s případným fragmentem nukleové kyseliny a dokazatelná nefluoreskující spektrometrií nebo poten-ciometričky, b) rozdělí se uvedené značené molekuly dle velikosti, b) odštěpí se značená složka ze značené molekuly, a d) zjistí se značená složka nefluorescencní spektrometrií nebo potenciometričky a z jboho se stanový totožnost molekuly uvedené nukleové kyseliny.
  2. 2. Způsob zjištění iotožnosti molekuly nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že obsahuje stupně a) kombinuje se vzorek značené nukleové kyseliny s molekulami cílové nukleové kyseliny za podmínek a po dobu dostačující k umožnění hybridizace vzorku značené nukleové kyseliny na komplementární sekvenci cílové nukleové kyseliny, je-li vzorek značené nukleové kyseliny dokazatelný nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometričky, b) pozmění se velikost vzorků uvedených hybridizovaných značených složek, velikost nehybridizovaných vzorků nebo cílových molekul, nebo velikost hybridu vzorek/značená složka, c) rozdělí se značené vzorky dle velikosti, d) odštěpí se značená složka z uvedeného značeného vzorku, a e) zjistí se uvedená značená složka nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometricky a tím se dokáže molekula svolené nukleové kyseliny*
  3. 3. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se důkaz značené složky provede hmotnostní spektrometrií, infračervenou spektrometrií, ultrafialovou spektrometrií nebo potencio- ·· · ·· ···· ♦ ♦ ·♦ • · ·· ♦ • • • · • • • · ♦ • • • « ·· • # t ♦ • * « # • • · • • • • • ♦ · • ·· /KV -li šta tickou amperometrií. 4· Způspb podle nároku 1, vyznačující se tím, že se připraví větší fragmenty nukleové kyseliny než 4 značené s tím, že každá značená složka je jednotná pro zvolený fragment nukleové kyseliny, 5* Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se použije více než 4 vzorky značené nukleové kyseliny s tím, že každá značená složka je jednotná pro vzorek zvolené nukleové kyseliny.
  4. 6. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že molekula cílové nukleové kyseliny se vytvoří prodloužením priméru.
  5. 7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se změní velikost uvedených vzorků hybridizovaných látek, nehybridi-zovaných vzorků nebo cílových molekul, nebo se změní poměr vzorek ku cílovému hybridu postupem zvoleným ze skupiny, zahrnující extenzi polymerasou, ligaci, exonukleasovou digesci a endo-nukleasovou digesci.
  6. 8. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující sejfcím, že se značené molekuly oddělí postupem, zvoleným ze skupiny, kterou tvoří gélová elektroforeza, kapilární elektroforeza, mikrokanálková elektroforeza, vysokotlaková kapalinová chro-matografie, velikostní exkluzní chromatografie a filtrace.
  7. 9. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se uvedené značené molekuly štěpí postupem ze skupiny, kterou tvoří oxidace, redukce, labilita v kyselém či alkalickém prostředí, postupy enzymové, elektrochemické, tepelné a foto-labilní.
  8. 10. Způsob podle nároků 1 nebo 3, vyznačující se tím, že se uvedená značená složka dokáže průletovou hmotnostní spektrometrií, magnetickou sektorovou hmotnostní spektrometrií a elektrickou sektorovou hmotnostní spektrometrií. ·· · • · ·* • · • · • · ···· ··# 9t ···· • · · ♦ · · • · · » · · ·· · #· 4 · ··♦ · • · ·· ·· t -III 11· Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se uvedená značená složka dokáže potensiostatickou amperomet-rií za použití detektorů ze skupiny, kterou tvoří coulometrické a amperometrické detektory.
  9. 12. Způsob že se stupně dělení, ním postupem. podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, štěpení a dokazování provádějí kontinua!-
  10. 13. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, Se se stupně dělení, štěpení a dokazování provádějí kontinuálním postupem v jediném zařízení.
  11. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se stupně dělení, štěpení a dokazování provádějí postupem. se tím, Se automatizovaným
  12. 15. Způsob podle nároků 1 nebo 2 že uvedené značené molekuly Či vzorky se ných oligonukleotidových primářů. , vyznačující se tím, připravují z 5snače- lé. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačujíc: že se uvedené značené molekuly či vaorky připravují ze značených didesoxynukleotidových terminátorů. 17. Způsob genotypování zvoleného organizmu, vyznačují cí se tím, že se a! ky: fragmentem a lze ji dokázat nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky, b) dělí se značené molekuly dle sekvenční délky, c) odštěpí se značená složka z uvedené značené molekuly, a d) zjistí se značená složka nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky a tím se stanoví genotyp uvedeného organizmu. cí se tím, že se a) připraví molekuly značené nukleové kyseliny se svolené kyseliny, kdeže značená složka je korelativní s příslušným sea)
  13. 16. Způsob tím, že zahrnuje kombinovaní genotypování zvoleného organizmu, vyznačující stupně molekuly značené nukleové kyseliny s cílovou -IV- -IV- ♦· ···· t« ·· I · · · » · ·· *·· · · • · ♦ ·· ♦ · molekulou za podmínek a po dobu, dostačující k průběhu hybri-dizace značené molekuly na uvedenou cílovou molekulu, kdeže značená složka je korelativní s odpovídajícím případným fragment-tem a lze ji dokázat nefluoreskující spektrometrií nebo poten-ciometričky, b) dělí se značené molekuly dle sekvenční délky, c) odštěpí se značená složka ze značené molekuly, a d) dokáže se uvedená značená složka nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometričky a tím se stanoví genotyp uvedeného organizmu.
  14. 19. Způsob polle nároků 17 či 18, vyznačující se tím, že se značené molekuly připraví ze soustavy klonů, svolených ze skupiny, kterou tvoří genomické kleny, cDNA-klony a RHA-klo.ny.
  15. 20. Způsob podle nároků 17 či 18, vyznačující se tím, že se připravují uvedené značené molekuly polymerázovou řetězovou reakcí. 21. « Způsob podle nároků 17 či 18, vyznačující se tím, že se důkaz značené složky provádí hmotnostní spektrometrií, infračervenou spektrometrií, ultrafialovou spektrometrií, nebo potenciostatickou amperometrií·
  16. 22. Způsob podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se připraví více než 4 značené molekuly nukleové kyseliny a každ^á značená složka je jednotná pro zvolený fragment nukleové kyseliny.
  17. 23. Způspb podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se molekula cílové nukleové kyseliny připravuje prodloužením priméru.
  18. 24. Způsob podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se uvedené značené molekuly dělí postupem, zvoleným ze skupiny, kterou tvoří gélová elektroforeza, kapilární elektro-foréza, mikrokanálková elektroforeza, vysokotlaková kapalinová chromatografie exkluzní chromatografie dle velikosti a filtrace.
  19. 25. Způsob podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se značené molekuly štěpí postupem, zvoleným ze skupiny, kterou tvoří oxidace, redukce, labil£ta v kyselém či zásaditém prostředí, dále postupy enzymové, elektrochemické, • ♦ •t ···» #♦ ·« • · »··· ·· · · • · · • » » I • » « ··· #· ♦ • · • ·· ·« · · • · ·· ·« -γ~ tepelné a založené ne fotolabilitš*
  20. 26. Způsob podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se značená složka dokazuje průletovou hmotnostní spektrometrií, quadrupolní hmotnostní spektrometrií, magnetickou sektorovou hmotnostní spektrometrií a elektrickou sektorovou hmotnostní spektrometrií,
  21. 27, Způsob podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se značená složka dokazuje potenciometrickou ampero-metrií za použití detektorů ze skupiny, kterou tvoří coulo-metrické detektory a amperometrické detektory.
  22. 28. Způsob podle nároků tím, že se stupně dělení, štěpení postupem. 17 nebo 18, vyznačující se a důkazu provádějí kontinuálním , vyznačující se provádějí kontinuálním
  23. 29. Způsob podle nároků 17 nebo 18 tím, že se stupně dělení, štěpení a důkazu postupem v jediném zařízení.
  24. 30. Způsob podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se stupně děleními štěpení a důkazu provádějí automatizovaným postupem.
  25. 31. Způsob podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se značená molekula připraví z nikoli 3^-značeného oligonukleotidového priméru.
  26. 32. Způsob podle nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se uvedená značené molekuly připravují ze značených didesoxynukleotidových terminátorů.
  27. 33. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 17, vyznačující se tím, že se cílová molekula získává z biologického vzorku.
  28. 34. Kompozice, obsahující větší počet látek obecného vzorce Tms-L-M0I kde Tms znamená organickou skupinu, dokazatelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru, -VI- -VI- • #·· ·· • · ···· i « • · ·
    ·# «· • · · • · ·· ··· · • · ·· ·# Q připadne atomy se skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod, 1 znamená vazebnou složku, jež umožňuje odštěpení TmS-obsahu-jící části od zbytku molekuly, přičemž Tms-obsahující část zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a touto skupinou je terč.amin, kvarternizovaná amoniová skupina a organická kyselina, lví01 je fragment nukleové kyseliny, kde L je napojeno na í.IOI v jiné poloze, než je 3 ""-koncovka MOI, a nejméně dvě sloučeniny mají totožnou skupinu T , ale skupiny hOI těchto molekul mají netotožné délky nukleotidu. 35. vzorce kd e TR1S znamená organickou skupinu, dokázatelnou hmotnostní spektrometrií,, ob ahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku či fluoru, a případně atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, umožňující části, obsahující T Kompozice, obsahující větší počet látek obecného Tms-L~M0I ras odštěpení od zbytku moke|uly, přičemž Tms obsahující část zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a tato skupina je zvolena z terč.-aminů, levarternizováných amoniových solí a organických kyselin, í.iOI je fragment nukleové kyseliny, kde L je napojeno na MOI v poloze jiné, než je 3 ""-koncovka na MOI, a nejméně dvě sloučeniny mají totožnou skupinu Tms, sle nemají totožné eluČní doby při sloupcové chromatografii, Kompozice, obsahující větší počet látek obecného 36. vzorce Tms-L-M0I kde ,rns T“~ znamená organickou skupinu dokazatelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodík a fluor, a -VII- -VII- • · Μ ♦ * · · • · Μ. • ·♦· · · • · · ·· ·· ·» · ·· ·· • · ·· · · • · · · • · · · · · • · ♦ * · ··· · ··· ·· · případně atomy, zvolené ze skupiny kyslík,dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, jež dovoluje části, obsahující Tras odštěpení od zbytku molekuly, přičemž část, obsahující T zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový steV, je-li sloučenina sledována hmotnostní chromsto-grafií a je zvolena z terč.-aminů, kvarternizovaných amonioyých skupin a organických kyselin, I.10I je fragment nukleové kyseliny, kde L je napojeno na MOI v každém jiném postavení kromě 3 koncovky MOI, a kde dvě sloučeniny 'Línají tutéž MOI-nukleotidovou délku, mají 'ktere PIS rovněž stejnou skupinu 1 ‘ . 37· Kompozice podle kteréhokoli z nároků 34 až 36, vyznačující se tím, že údaj větší počet znamená více než 2.
  29. 38. Kompozice podle nároků 34 až 36, vyznačující se tím, že výréz větší počet znamená více než 4. 39· Kompozice podle kteréhokoli z nároků 34 až 36, vyznačující j-se tím, že fragment nukleové kyseliny má sekvenci, jež je komplementární k části vektoru, kdy fragment je schopný iniciovat pólynukleotidovou syntézu.
  30. 40. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 34 až 36, vyznačující se tím, že skupiny Tms uvedeného většího počtu se liší nejméně 2 amu. 41. K0mp02ice podle kteréhokoli z nároků 34 až 36, vyznačující se tím, že skupiny Tms uvedeného většího počtu se liší nejméně 4 amu.
  31. 42. Kompozice, obsahující větší počet sad sloučenin, kdy každá sada sloučenin odpovídá obecnému vzorci Tms-L-M0I kde Tms znamená organickou skupinu dokazatelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodík a fluor, případně další atomy ze skupiny kyslík dusík, síra, fosfor a jod, -VIII- L znamená organickou skupinu, umožňující části, obsahující Tms odštěpit se od zbytku molekuly, přičeml část, obsahující T zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena z terč.aminů, kvarternizováných amoniových skupin a organických kyselin, KOI je fragment nukleové kyseliny, kde L je napojeno na MOI v jakémkoli jiném postavení, než je 3 "'-koncovka MOI, a členové prvé sady sloučenin mají totožné skupiny Tm , nikoli však totožné skupiny MOI s různými počty nukleotidů v MOI a v prvé sadě je nejméně 10 členů, kde uvnitř sady se skupiny Tm<^ liší nejméně 2 amu. 43· Kompozice podle nároku 42, kde větším počtem se míní nejméně 3. 44· Kompozice podle nároku 42, kde větším počtem se míní nejméně 5. 45· Kompozice, obsahující větší počet sad sloučenin, přičemž každá sada sloučenin má obecný vzorec Tras-L_M0I, kde Tms je organická skupina, dokazatelná hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodík a fluor, případně další atomy ze skupiny kyslík,dusík, síra, fosfor a jod, L je organická skupina, umožňující části, obsahující TmS odštěpit se od zbytku molekuly, přičemž I1 obsahující část zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a skupina je zvoleno z terč.aminů, kvarternizovaných amoniových skupin a organických kyselin MOI je fragment nukleogé kyseliny, kde L je napojeno na MOI v každé jiné poleze, než je 3 koncovka na MOI, a kde sloučeniny v jedné sadě mají tytéž eluční doby, nikoli ^ rns vsak totožné skupiny T . -IX- ·· ···« ·· ·· ···» • · · · · · · • · · · · ·· t 9 t · 9 9999 9 9 9 9 9 9 9 99 · 99 99
  32. 46. Sestava (kit) pro genotypování, obsahující větší počet amplifikačních primérních párů, přičemž alespoň jeden z primérů odpovídá obecnému vzorci Tms_0-MOI kde mS T znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlí';:, nejméně jeden z atomů vodík a fluor, a případně další atomy ze skupiny kyslík dusík, síra, fosfor a jod, L znamená organickou skupinu, umožňující časti, obsahující ms v v T odštěpit se od zbytku molekuly, přičemž část, obsahující ms T zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena z terč.-aminů, kvartérnizovaných amoniových skupin a organických kyselin, a MOI je fragment nukleové kyseliny, kde L je navázáno na MOI a $ekékoli jiné poloze, než je 3koncovka MOI, a každý pár primérů je asociován s různými leči. 47. ^estava (kit) podle nároku 46, kde větší počet snemaná nejméně 3.
  33. 48. Sestava (kit) podle nároku 46, kde větší počet znamená nejméně 5. JUDr. Petr KALEt' V advokát SPOLEČNÁ ADVOKÁTNÍ ŘANCELÁŘ VŠETEČKA ZElfcNÝ ŠVORČÍ* KALENSKÝ 'k PARTNEŘI 1/Q 00 Praha 2, Hálkova 2 ’ Česká republika
CZ982285A 1996-01-23 1997-01-23 Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění CZ228598A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1453696P 1996-01-23 1996-01-23
US2048796P 1996-06-04 1996-06-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ228598A3 true CZ228598A3 (cs) 1998-12-16

Family

ID=26686209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ982285A CZ228598A3 (cs) 1996-01-23 1997-01-23 Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP0962537B1 (cs)
JP (2) JP2000503845A (cs)
KR (1) KR100482915B1 (cs)
CN (1) CN1202260C (cs)
AT (2) ATE191515T1 (cs)
AU (1) AU717945B2 (cs)
BR (1) BR9707016A (cs)
CA (1) CA2243546C (cs)
CZ (1) CZ228598A3 (cs)
DE (2) DE69701612T2 (cs)
DK (1) DK0840804T3 (cs)
ES (1) ES2145580T3 (cs)
GR (1) GR3033887T3 (cs)
HU (1) HUP9901856A3 (cs)
NZ (1) NZ331043A (cs)
PL (1) PL328239A1 (cs)
PT (1) PT840804E (cs)
WO (1) WO1997027325A2 (cs)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6401267B1 (en) 1993-09-27 2002-06-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
DE69700902T2 (de) * 1996-01-23 2000-07-20 Rapigene Inc Verfahren zur erkennung von ligandenpaar bindung mit erhöter empfindlichkeit
IL130885A (en) * 1997-01-15 2005-05-17 Xzillion Gmbh & Co Kg Hybridisation probes comprising a base sequence cleavably linked to a mass label and uses thereof
US6699668B1 (en) 1997-01-15 2004-03-02 Xzillion Gmbh & Co. Mass label linked hybridisation probes
WO1998037242A1 (en) * 1997-02-24 1998-08-27 Tm Technologies, Inc. Process for selecting anti-sense oligonucleotides
CN1270598A (zh) * 1997-07-22 2000-10-18 拉普吉恩公司 用于质谱分析核酸的方法和组合物
US6090558A (en) * 1997-09-19 2000-07-18 Genetrace Systems, Inc. DNA typing by mass spectrometry with polymorphic DNA repeat markers
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
BR0013024A (pt) * 1999-08-31 2002-06-18 Qiagen Genomics Inc Comtostos enantiomiericamente enriquecidos tendo ligação( ões ) fotoclivável( is ) e métodos relacionados aos mesmos
US6379889B1 (en) 1999-11-04 2002-04-30 Agilent Technologies, Inc. Multiplexing methods for identifying nucleic acids using denaturing liquid chromatography
DE10021204A1 (de) * 2000-04-25 2001-11-08 Epigenomics Ag Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen
US7771929B2 (en) 2000-04-28 2010-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Tag library compounds, compositions, kits and methods of use
US7160735B2 (en) 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
US6716634B1 (en) 2000-05-31 2004-04-06 Agilent Technologies, Inc. Increasing ionization efficiency in mass spectrometry
DE10027040A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Basf Lynx Bioscience Ag Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays
EP1170379A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-09 Centre National de Genotypage Sample generation for genotyping by mass spectrometry
FI115139B (fi) 2001-01-10 2005-03-15 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testipakkaus solu- tai kudosnäytteissä olevien polynukleotidien määrässä tapahtuvien vaihteluiden kvantitatiiviseen ja/tai vertailevaan arvioimiseen
DE10108453B4 (de) * 2001-02-22 2005-10-20 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Mutationsanalyse mit photolytisch spaltbaren Primern
DE10112387B4 (de) * 2001-03-15 2004-03-25 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Genotypisierung
AU2002305658A1 (en) 2001-05-21 2002-12-03 Aclara Biosciences, Inc. Analyzing phosphorylated proteins
AU2002310012A1 (en) 2001-05-21 2002-12-03 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
WO2002097112A2 (en) 2001-05-26 2002-12-05 Aclara Biosciences, Inc. Catalytic amplification of multiplexed assay signals
EP1448800A4 (en) * 2001-11-21 2007-05-16 Applera Corp DIGITAL ASSAY
US7347976B2 (en) 2001-12-20 2008-03-25 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using a hydrophilic solid support in a hydrophobic matrix
US7192560B2 (en) 2001-12-20 2007-03-20 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using anion exchange
EP1978108A3 (en) 2002-01-08 2009-01-07 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease and medication efficacy
DE60219132T2 (de) * 2002-02-01 2007-12-13 Bruker Daltonik Gmbh Mutationsanalyse mittels PCR und Massenspektrometrie
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
US20040229294A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US7402397B2 (en) 2002-05-21 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
FI20021325A0 (fi) * 2002-07-05 2002-07-05 Valtion Teknillinen Menetelmä ja reagenssipakkaus yksittäisten polynukleotidien määrän määrittämiseksi
US7981600B2 (en) 2003-04-17 2011-07-19 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using an anion exchange material that includes a polyoxyalkylene
US7939249B2 (en) 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
GB0515323D0 (en) 2005-07-26 2005-08-31 Electrophoretics Ltd Mass labels
GB0518585D0 (en) 2005-09-12 2005-10-19 Electrophoretics Ltd Mass labels
EP1936369A1 (en) * 2006-12-20 2008-06-25 Agilent Technologies, Inc. Selective excitation of OH-containing solvents
GB0704764D0 (en) 2007-03-12 2007-04-18 Electrophoretics Ltd Isobarically labelled reagents and methods of their use
US7888127B2 (en) 2008-01-15 2011-02-15 Sequenom, Inc. Methods for reducing adduct formation for mass spectrometry analysis
GB0809488D0 (en) 2008-05-23 2008-07-02 Electrophoretics Ltd Mass spectrometric analysis
GB0811574D0 (en) * 2008-06-24 2008-07-30 Trillion Genomics Ltd Characterising planar samples by mass spectrometry
EP2180065A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method of reducing the molecular weight of at least one PCR product for its detection while maintaining its identity
JP5283178B2 (ja) * 2009-03-05 2013-09-04 株式会社島津製作所 マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用マトリックス
GB0921665D0 (en) 2009-12-10 2010-01-27 Trillion Genomics Ltd Phobes
DK2588144T3 (en) 2010-07-02 2018-07-23 Ventana Med Syst Inc Detection of targets using mass markers and mass spectrometry
US9305756B2 (en) 2013-03-13 2016-04-05 Agena Bioscience, Inc. Preparation enhancements and methods of use for MALDI mass spectrometry
GB201322567D0 (en) 2013-12-19 2014-02-05 Electrophoretics Ltd Mass labels
CN110687191A (zh) * 2019-10-22 2020-01-14 宁波大学 基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与ftir光谱联用的微生物鉴定和分型方法
CN113607829B (zh) * 2021-06-11 2023-05-30 南京品生医学检验实验室有限公司 一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的方法
CN115337665B (zh) * 2022-09-14 2023-05-30 洛阳理工学院 微通道萃取装置辅助从黄岑根中高效分离黄芩苷的方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4709016A (en) * 1982-02-01 1987-11-24 Northeastern University Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis
US5516931A (en) * 1982-02-01 1996-05-14 Northeastern University Release tag compounds producing ketone signal groups
US5118605A (en) * 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5346670A (en) * 1986-12-24 1994-09-13 British Technology Group U.S.A. Inc. Phthalocyanine and tetrabenztriazaporphyrin reagents
FI80476C (fi) * 1987-10-09 1990-06-11 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning.
EP0317239A3 (en) * 1987-11-13 1990-01-17 Native Plants Incorporated Method and device for improved restriction fragment length polymorphism analysis
US5003059A (en) * 1988-06-20 1991-03-26 Genomyx, Inc. Determining DNA sequences by mass spectrometry
DK220890D0 (da) * 1990-09-14 1990-09-14 Ole Buchardt Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider
WO1993005183A1 (en) * 1991-09-09 1993-03-18 Baylor College Of Medicine Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme
AU3919293A (en) * 1992-03-27 1993-11-08 University Of Maryland At Baltimore Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes
IL107166A (en) * 1992-10-01 2000-10-31 Univ Columbia Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5565324A (en) * 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5547835A (en) * 1993-01-07 1996-08-20 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
DE69700902T2 (de) * 1996-01-23 2000-07-20 Rapigene Inc Verfahren zur erkennung von ligandenpaar bindung mit erhöter empfindlichkeit
PT868535E (pt) * 1996-01-23 2000-12-29 Qiagen Genomics Inc Metodos e composicoes para a determinacao de sequencias de moleculas de acido nucleico

Also Published As

Publication number Publication date
CA2243546C (en) 2008-04-15
DE69701612T2 (de) 2000-08-31
DK0840804T3 (da) 2000-07-17
PT840804E (pt) 2000-10-31
JP2008200040A (ja) 2008-09-04
EP0962537A2 (en) 1999-12-08
HUP9901856A2 (hu) 1999-09-28
WO1997027325A2 (en) 1997-07-31
WO1997027325A3 (en) 1998-04-02
PL328239A1 (en) 1999-01-18
ES2145580T3 (es) 2000-07-01
CA2243546A1 (en) 1997-07-31
CN1212020A (zh) 1999-03-24
EP0962537A3 (en) 2004-02-11
JP2000503845A (ja) 2000-04-04
BR9707016A (pt) 2000-01-04
ATE434054T1 (de) 2009-07-15
AU717945B2 (en) 2000-04-06
DE69739465D1 (de) 2009-07-30
KR100482915B1 (ko) 2005-09-12
AU2244897A (en) 1997-08-20
EP0840804A1 (en) 1998-05-13
HUP9901856A3 (en) 2001-10-29
DE69701612D1 (de) 2000-05-11
GR3033887T3 (en) 2000-11-30
EP0962537B1 (en) 2009-06-17
EP0840804B1 (en) 2000-04-05
KR19990081924A (ko) 1999-11-15
CN1202260C (zh) 2005-05-18
ATE191515T1 (de) 2000-04-15
NZ331043A (en) 1999-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ228598A3 (cs) Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění
EP0850320B1 (en) Methods for detecting binding of ligand pair with enhanced sensitivity
US7052846B2 (en) Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
JP4870791B2 (ja) 質量分析によって核酸を分析するための方法および化合物
KR100482917B1 (ko) 핵산분자의서열을결정하는방법및이를위한조성물
US6815212B2 (en) Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US6623928B2 (en) Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
WO1997027331A9 (en) Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
EP0992511B1 (en) Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
EP0962464A2 (en) Methods and compositions for detecting binding of ligand pair using non-fluorescent label
MXPA98005955A (en) Methods and compositions to analyze nucleic acid molecules by using classification techniques

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic