CN107208162B - 核酸分子的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种单链核酸分子的构建方法，所述单链核酸分子用于利用纳米孔测序仪进行的核酸序列确定，所述单链核酸分子的构建方法包括：使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物和配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序、以及合成的互补链在分子内形成发夹结构并以自身为模板进行延伸反应的工序，得到的核酸分子序列中包含目标序列及其互补链双方。通过设为单链结构，能够利用纳米孔测序进行解析，此外仅重复对不含互补链信息的目标核酸序列进行解析，因此能够应对测序错误的问题，同时进行精度更高的解析。

Description

核酸分子的构建方法

技术领域

本发明涉及用于核酸序列确定的核酸分子的构建方法。更具体而言，涉及适合于利用纳米孔测序进行解析的单链核酸分子的构建方法。

背景技术

近年来，以遗传性疾病致病基因的检测、药物的有效性、副作用的评价、癌症等相关的基因突变的检测等为目的，核酸碱基序列解析的需求变得非常大。因此，解析结果得到的信息精度必须高。

作为高精度读取核酸分子碱基序列的方法，例如，提出了模板核酸片段中核苷酸的共有序列的确定方法，包括将模板核酸片段的正义链和反义链配置于连续核酸分子的阶段，以及通过利用聚合酶进行的依赖模板的测序方法对正义链和反义链双方进行测序的阶段(专利文献1)。专利文献1中记载了“利用模板的环状构成，能够进行同一分子的多次重复测序。换句话说，测序方法沿着完全连续的序列进行，通过重复对来自互补序列的各片段进行测序，可以重复获得该片段的序列数据和各片段内的序列数据。这样的序列数据的全部或一部分在之后衍生模板与其各种片段的共有序列中是有用的。”(段落编号[0055])。

此外，专利文献2公开了含有双链核酸区域的、可以为了制作用于序列确定目的的核酸单链构建物而使用的接头。专利文献2中记载了“构建物被确定序列时，确保双链核酸中的各个位置并非仅检查1次，实际上是检查2次。这在对核酸的各位置进行检查的基础上实现了较高的可靠性，将通过一次检查来实现，从而对于各位置中的两种碱基，给予分数(Score)更高的综合性识别(Call)。”(段落编号[0038])，进而还记载了“对各位置检查2次的能力对于使用随机感应对甲基胞嘧啶和胸腺嘧啶进行区别也是有用的。这两种碱基在通过跨膜细孔或者与跨膜细孔相互作用时，具有非常类似的电流痕迹。因此，这会使对两者进行区别变得困难。可是，通过对核酸各位置检查2次，将能够进行那样的区别，因为，针对甲基胞嘧啶的互补碱基为鸟嘌呤，而针对胸腺嘧啶的互补碱基为腺嘌呤。毋庸置疑，甲基胞嘧啶与包括癌症的各种疾病有关联。”(段落编号[0042])。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特表2011－515102号公报

专利文献2:日本特表2012－516146号公报

发明内容

发明所要解决的课题

专利文献1中记载的技术是将双链核酸的一个末端用发夹环连接的分子、或将两个末端用发夹环连接的环状分子。一个末端连接的分子使用每次读取互补链(正义链和反义链)各自的序列而得的两个结果来提高碱基的判断精度。然而，关于该方法，在一个核酸链中存在错配碱基对那样的突变的情况下、发生了测序错误的情况下，仅对互补链序列各读取一次则互补链序列间的结果会产生差异。

产生了这样的差异的情况下，无法判断是该位置存在突变还是发生了测序错误，存在仅对互补链的碱基各检查1次则无法进行具有高可靠性的解析的课题。此外，使两个末端用发夹环连接的环状分子中，有可能如现有技术文献那样通过多次反复测序来解决测序错误的问题，但在对单链核酸进行解析的纳米孔测序方法中，存在无法对环状分子进行解析的课题。

专利文献2中也同样存在下述问题：由于其为将双链核酸的一个末端用发夹环连接的分子，仅通过同样地对互补链各检查1次，无法判断是存在突变还是发生了测序错误。进而，为了形成发夹环而进行连接反应等，因而发夹环正确结合而成的核酸分子的构建效率低。虽然为了提高效率可以进行一晚上(例如8小时以上)的反应，但也存在预处理花费时间的课题。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题，本发明人等对构建在单链核酸(单分子)内仅作为目标的单方碱基序列重复的序列结构的核酸分子的方法进行了研究，从而完成了本发明。通过设为单链结构，能够利用纳米孔测序进行解析，此外仅重复对不含互补链信息的目标核酸序列进行解析，因此能够应对测序错误的问题，同时进行精度更高的解析。分子内序列重复的次数越多，则判断精度越高。

即，本发明包括以下方案。

[1]一种单链核酸分子的构建方法，所述单链核酸分子用于利用纳米孔测序仪的核酸序列确定，所述单链核酸分子的构建方法包括：

使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物、以及与该发夹引物配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序，以及

合成的互补链在分子内形成发夹结构并以自身为模板进行延伸反应的工序；

得到的核酸分子序列中包含目标序列及其互补链双方。

[2]根据[1]中记载的方法，上述发夹引物的茎部具有比上述单链部的Tm值高的Tm值。

[3]根据[1]中记载的方法，在发夹引物由于反应的进行而减少的同时，合成的互补链序列以自身为模板进行延伸反应。

[4]根据[1]中记载的方法，进一步包括下述工序：在使用前对发夹引物的5’端进行磷酸化、构建目的核酸分子后使5’末端磷酸化的DNA链分解。

[5]根据[4]中记载的方法，使用λ外切核酸酶进行上述分解。

[6]根据[4]中记载的方法，5’末端磷酸化的DNA链分解后，从其互补链的3’末端介由发夹结构自身退火进行延伸反应。

[7]根据[1]中记载的方法，进一步包括使具有发夹环结构的接头与上述生成物连接，进行链置换反应而使核酸分子延伸的工序。

[8]根据[6]中记载的方法，使具有发夹环结构的接头与上述生成物连接，进行链置换反应而使核酸分子延伸。

[9]根据[1]中记载的方法，将由上述配对的引物形成的末端固定，使互补链DNA解离后，进行延伸反应。

[10]根据[7]或[8]中记载的方法，上述接头的环结构部含有延伸反应抑制分子。

[11]根据[1]中记载的方法，上述配对的引物具有DNA与RNA的嵌合结构，延伸反应后进一步包括使RNA分解的工序。

[12]一种核酸碱基序列确定方法，包括利用纳米孔测序仪对通过[1]中记载的方法得到的核酸分子的碱基序列进行解析。

[13]根据[12]中记载的方法，序列确定工序中，以由核酸分子中所含的已知碱基序列得到的信号为基础进行检测器的校正。

[14]根据[12]中记载的方法，序列确定工序中，以由核酸分子中所含的已知碱基序列得到的信号为基础进行解析。

[15]根据[12]中记载的方法，使用形成了双链的反应物来控制反应物通过纳米孔的速度。

[16]根据[1]中记载的方法，上述发夹引物具有随机序列。

[17]根据[16]中记载的方法，上述发夹引物具有上述目标序列的突变数量以上种类的随机序列。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的国际申请PCT/JP2015/055529号的说明书和/或附图中记载的内容。

发明的效果

本发明的核酸分子构建方法具有下文所示的效果。

通过本发明的方法构建的核酸分子在被确定测序时，目标序列并非仅检查1次，而是利用目标序列与以其序列自身为模板合成的互补链序列连接而成的单链核酸(单分子)检查多次。这使得在检查核酸的目标序列时能够进行高精度分析。更详细而言，通过重复检查单分子内无基因组结构上的互补链序列信息地仅以单链序列为模板合成的序列，能够对是突变导致的碱基不同还是测序错误导致的碱基不同进行识别，能够进行高精度的核酸序列分析。

单分子碱基序列的判断精度高，则能够检测大量的来自正常细胞的基因组DNA中少量含有的来自异常细胞的突变。例如，检测来自血中少量含有的癌细胞的具有突变的DNA的情况下，从一定量的血液提取DNA，使用聚合酶链式反应(PCR)法等，对包含欲检测的碱基序列位置的核酸分子进行扩增，确定其核酸分子碱基序列，从而对是否包含突变进行解析(Couraud S.Clin Cancer Res.2014Sep 1；20(17):4613-24.)。

使用纳米孔测序仪解析单分子DNA碱基序列的情况下，一次读取获得的碱基序列的判断精度为90％时，例如检测来自正常细胞中以1％左右少量含有的癌细胞的具有突变的DNA是困难的。为了检测1％左右的突变而检测通过PCR法仅扩增目标序列而得的1,000个单分子DNA(解读碱基序列)的情况下，各单分子在碱基序列中无突变位置每1碱基检测1,000次。该1,000次内，碱基序列判断精度为90％，因此“约100次”检测到错误的碱基信息(但错误频率有某一定程度偏差)。由于碱基序列中有突变的位置为10％错误的判定、以及1％的突变，因此会判定出“约110次”与1,000次中主要被判定的碱基不同的碱基。该与主要判定不同的“100次”和“110次”之差的出现频率有偏差(分布)，因此以该次数为基础来检测、判断突变的有无是困难的。

然而，本发明的方法中，即使1次检测获得的单分子DNA的碱基序列判断精度为90％，通过仅以单链序列为模板在单分子内重复检查，例如单分子的最终判断精度达到99.9％，从而能够检测少量含有的突变DNA。例如最终判断精度为99.9％时，如果检测1,000个单分子DNA，在无突变位置和有突变位置，与主要判定不同的碱基的出现频率为1次和11次，该出现频率差大有不同，因此具有出现频率之差而容易检测突变有无。这样检测少量含有的突变也与疾病的早期发现相关。

此外，本发明的方法进行使用了发夹引物的聚合酶链式反应，因此，与例如利用连接使发夹结构连接的情况相比，能够以更高的效率构建具有发夹结构的核酸分子。此外，重复扩增工序中的错误几率与测序错误相比大幅降低，因此能够使采用了本发明的方法的解析方法的精度与现有方法相比非常高。

附图说明

图1是本发明的方法中能够使用的纳米孔拉曼(Nanopore Raman)DNA测序装置的构成图例子。

图2是本发明的方法中能够使用的纳米孔拉曼DNA测序装置的检测部和观察容器的截面图的例子。

图3是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图4是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图5是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图6是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图7是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图8A是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图8B是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图8C是显示本发明的方法中的核酸分子构建工序的例子。

图9是对目标序列进行比较的结果。

具体实施方式

以下，使用附图更详细地对本发明的方法进行说明。

本发明涉及用于利用纳米孔测序仪确定核酸序列的核酸分子的构建方法。更具体而言，本发明涉及用于利用纳米孔测序仪确定核酸序列的单链核酸分子的构建方法，其包括：使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物、以及与该发夹引物配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序；以及合成的互补链在分子内形成发夹结构并以自身为模板进行延伸反应的工序，得到的核酸分子序列中包含目标序列及其互补链双方。

需要说明的是，对本发明的方法进行记载时，所谓“目标序列”，贯穿本说明书的记载，在双链核酸分子的情况下意思是仅一条链的序列，对象核酸分子形成了双链的情况下，对于“目标序列”的互补链，不记载为“目标序列”。本发明的构建方法中基于“目标序列”形成了互补链的情况下，对于该互补链，有时表述为“目标序列”或者“目标序列信息”。

纳米孔测序仪是公知的技术，可以适当使用例如WO2013/021815A1中记载的装置。

图1中，对使用了下述装置100的例子的方法进行说明：使核酸进入内径约2nm的纳米孔，利用照射于纳米孔的激发光以及纳米孔附近存在的导电性薄膜使通过纳米孔的生物聚合物(例如DNA)的拉曼散射光增大后检测拉曼光谱。

这里，虽然以检测拉曼光谱的纳米孔测序仪为例进行表示，但能适用于所有的解析单链单分子的方法。例如为能够适用于检测通过纳米孔时的封闭电流或隧道电流的DNA测序仪、检测荧光的纳米孔DNA测序仪的核酸分子构建方法。

图1中，作为显示适用于以正置显微镜为基本构成的拉曼光观察的情况的一例，对装置的构成和动作进行说明。装置构成并不特别限定于正置显微镜的基本构成，也可以是以倒置显微镜为基本构成的显微镜等能够检测照射光产生的试样信号的构成。

光源是照射能够产生荧光或拉曼散射光的波长的外部光(激发光)。可以使用本技术领域公知的光源101。可以使用例如但不限于：半导体激光、氪(Kr)离子激光、钕(Nd)激光、氩(Ar)离子激光、YAG激光、氮激光、蓝宝石激光等。

将来自该光源的外部光照射于多个纳米孔的情况下，使用多重照射机构113。非限定性地，多重照射机构113可以使用微透镜阵列、衍射光栅型分光器或LCOS(Liquidcrystal on silicon，硅基液晶)等。使用它们使多个外部光照射于纳米孔。

为了由光源将外部光照射于显微镜观察容器并使其汇聚，优选将共聚焦透镜和物镜102与光源组合使用。显微镜观察容器103架设于XY平台104上，利用XY平台调整水平面上的位置。对于垂直方向位置，利用Z轴调节机构105，以测定对象试样位于通过物镜聚焦的区域的方式进行调整。根据情况，也可以使XY平台具有Z轴调节机构。作为定位机构，除了这些平台以外，还可以利用θ轴平台、测角仪平台精密地进行调整。这些定位机构以驱动控制部115来控制，使用者通过计算机116进行操作。

此外，作为装置构成，还可以组合针对测定波长区域等测定目标的陷波滤波器、短通滤波器、长通滤波器等滤波器106、分光器107、衍射光栅108等。另外，根据光学部件配置的需要，也可以使用反光镜112、针孔、透镜114、NIR(近红外)反光镜117。这样的用于检测荧光或拉曼散射光的装置构成在本技术领域是公知的，本领域技术人员可以适当选择优选的构成要素。检测器只要是能够检测荧光或拉曼散射光的检测器109，就可以使用任意的分光检测器。此外，根据所使用的显微镜观察容器中试样的数量和配置，可以使用1个或多个一维或二维检测器。作为那样的分光检测器，可列举CCD(电荷耦合元件)或电子倍增(Electron Multiplying)CCD图像传感器、CMOS(互补型金属氧化膜半导体)图像传感器、其他高灵敏度元件(雪崩光电二极管等)图像传感器等。为了防止灵敏度随着检测的高速化而降低，检测器优选具有光电倍增机构、例如图像增强器。此外，优选检测器具备能够直接记录拉曼散射光等图像信息的大容量存储器，由此能够不介由电缆、平板、计算机等而高速进行解析。例如，本发明的解析装置可以进一步具备记录来自检测器的测量值的帧缓冲存储器。此外，本发明的解析装置可以与用于将来自上述检测器的测量值数字化、运算处理、输出的计算机116相连接。

此外，还可以不只是具有拉曼散射光、荧光检测，还具有能够进行明场图像观察的功能。因此，如图1所示，作为明场照射光源，使用LED110；作为明场图像拾取元件，使用二维检测器111。作为二维检测器，可列举CCD或EMCCD图像传感器、CMOS图像传感器等。

图2显示纳米孔基板和配置有纳米孔基板的观察容器的截面构成。观察容器201由隔着具有纳米孔202的基板203(纳米孔基板)的2个封闭空间、即试样导入分区204和试样流出分区205构成。但试样导入分区204与试样流出分区205通过纳米孔202是连通的。在构建了通过后述本发明的方法构建的、重复包含目标序列的核酸分子后，将分子放入观察容器201。或者，也可以直接在观察容器内构建核酸分子。

观察容器具有腔室部和配置于其内部的基板203。基板203具有基材、面向基材形成的薄膜、以及设于薄膜的、使试样(核酸分子)导入分区204与试样流出分区205连通的纳米孔202，配置于腔室的试样导入分区204与试样流出分区205之间。基板203可以具有绝缘层。基板203优选为固体基板。

基板203可以由电绝缘体材料、例如无机材料和有机材料(包括高分子材料)形成。作为构成基板203的电绝缘体材料的例子，可列举硅(silicon)、硅化合物、玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为硅化合物，可列举氮化硅、氧化硅、碳化硅等氮氧化硅。尤其是构成基板203的支撑部的基底(基材)，可以由它们中的任意材料制作，例如可以是硅或硅化合物。

关于基板203的尺寸和厚度，只要能够设置纳米孔202就没有特别限定。基板203可以通过本技术领域公知的方法制作，或者也可以作为市售品获得。例如，基板203可以使用光刻或电子束光刻、以及蚀刻、激光消融、注塑成型、铸造、分子束外延、化学蒸镀(CVD)、介质击穿、电子射线或者会聚粒子束等技术制作。基板203也可以为了避免目标以外的分子向表面吸附而进行涂覆。

基板203至少具有1个纳米孔202。具体而言，纳米孔202设于薄膜，根据情况，也可以同时设于基底(基材)、绝缘体。本发明中“纳米孔”和“孔”是纳米(nm)尺寸(即直径1nm以上、小于1μm)的孔，是贯穿基板203而使试样导入分区204与试样流出分区205连通的孔。

基板203优选具有用于设置纳米孔202的薄膜。即，通过在基板上形成材料和厚度适合形成纳米尺寸的孔的薄膜，可以简便且有效地在基板203上设置纳米孔202。从形成纳米孔方面出发，薄膜的材料优选为例如氧化硅(SiO₂)、氮化硅(SiN)、氮氧化硅(SiON)、金属氧化物、金属硅酸盐等。此外，薄膜(以及根据情况为基板整体)可以是实质上透明的。这里“实质上透明”意思是能够使约50％以上、优选80％以上的外部光透过。此外，薄膜可以是单层也可以是多层。薄膜的厚度为1nm～200nm，优选为1nm～50nm，更优选为1nm～20nm。薄膜可以通过本技术领域公知的技术形成在基板203上，例如减压化学气相生长(LPCVD)。

薄膜上优选设有绝缘层。绝缘层的厚度优选为5nm～50nm。绝缘层可以使用任意绝缘体材料，优选使用例如硅或硅化合物(氮化硅、氧化硅等)。本发明中纳米孔或孔的“开口部”是指纳米孔或孔与试样溶液相接部分的纳米孔或孔的开口圈。分析生物高分子时，试样溶液中的生物高分子、离子等从一个开口部进入纳米孔，从相同或相反侧的开口部出到纳米孔外。

纳米孔202的尺寸可以根据分析对象生物高分子的种类选择适当的尺寸。纳米孔可以具有均匀的直径，也可以根据部位的不同而具有不同直径。纳米孔也可以与具有1μm以上直径的孔相连接。基板203的薄膜中设置的纳米孔中，最小直径部、即该纳米孔所具有的最小直径为直径100nm以下，例如为1nm～100nm，优选为1nm～50nm，例如优选为1nm～10nm，具体而言为1nm以上5nm以下、3nm以上5nm以下等。

ssDNA(单链DNA)的直径约为1.5nm，适合用于分析ssDNA的纳米孔直径范围为1.5nm～10nm程度，优选为1.5nm～2.5nm程度。dsDNA(双链DNA)的直径约为2.6nm，适合用于分析dsDNA的纳米孔直径的范围为3nm～10nm程度，优选为3nm～5nm程度。以其他生物高分子、例如蛋白质、多肽、糖链等为分析对象的情况下，也同样可以选择针对生物高分子外径尺寸的纳米孔直径。

纳米孔202的深度(长度)可以通过调整基板203或基板203的薄膜的厚度来调整。纳米孔202的深度优选设为构成分析对象生物高分子的单体单元。例如选择核酸作为生物高分子的情况下，纳米孔202的深度优选设为1个碱基以下的大小、例如约0.3nm以下。纳米孔202的形状基本为圆形，也可以设为椭圆形、多边形。

可以在基板203上至少设置1个纳米孔202，设置多个纳米孔202的情况下，可以有规律地排列。纳米孔202可以通过本技术领域公知的方法、例如通过照射透射型电子显微镜(TEM)的电子束、通过使用纳米光刻技术或离子束光刻技术等来形成。

腔室部具有试样导入分区204和试样流出分区205、基板203、电压施加机构、以及用于使试样212通过纳米孔202的电极213、214等。在优选的例子中，腔室部具有试样导入分区204和试样流出分区205、设于试样导入分区204的第一电极213、设于试样流出分区205的第二电极214、针对第一、第二电极的电压施加机构等。设于试样导入分区204的第一电极213、设于试样流出分区205的第二电极214之间可以配置有电流计。第一电极213与第二电极214之间的电流从确定试样212通过纳米孔的速度方面考虑适当确定即可，例如，使用不含试样212的离子液体的情况下，如果为DNA，则优选为100mV～300mV程度，但不限于此。

电极213、214可以由金属例如铂、钯、铑、钌等铂族、金、银、铜、铝、镍等；石墨例如石墨烯(单层或多层均可)、钨、钽等制作。

通过施加电压，通过纳米孔202的核酸分子由于激发光而发出拉曼光，可以在纳米孔附近准备导电性薄膜215，产生近场而增强。如从薄膜的定义可知，设于纳米孔附近的导电性薄膜215形成为平面状。导电性薄膜215的厚度根据所采用的材料设为0.1nm～10nm，优选设为0.1nm～7nm。导电性薄膜215的厚度越小，则越能够限制产生的近场，能够进行高分辨率且高灵敏度的解析。此外，导电性薄膜215的大小没有特别限定，可以根据所使用的固体基板203和纳米孔202的大小、所使用的激发光的波长等适当选择。需要说明的是，如果导电性薄膜215不是平面状却是存在弯曲等，则在该弯曲部，激发近场的光能漏出，在目标外位置产生拉曼散射光。即背景光增大，信噪比(S/N)降低。因此，导电性薄膜215优选为平面状，换言之，截面形状优选为无弯曲的直线状。使导电性薄膜215形成平面状不仅对背景光的降低、S/N比的增大有效果，而且从薄膜的均匀性、制作中的再现性等观点出发也是优选的。

试样导入分区204和试样流出分区205中，充满了介由分别连接于两个分区的流入路径206、207导入的液体210、211。液体210、211从连接于试样导入分区204和试样流出分区205的流出路径208、209流出。流入路径206和207可以设于夹着基板相对的位置，但不限于此。流出路径208和209可以设于夹着基板相对的位置，但不限于此。

液体210优选为含有作为分析对象的试样212的试样溶液。液体210优选大量含有作为电荷的承载者的离子(以下称为离子液体)。优选液体210除了含有试样以外仅含有离子液体。作为离子液体，优选为使电离度高的电解质溶解而得的水溶液，可以优选使用盐类溶液、例如氯化钾水溶液等。优选试样212在离子液体中具有电荷。典型地，试样212为核酸分子。

试样导入分区204和试样流出分区205中设有以夹着纳米孔202相对的方式配置的电极213、214。本实施方式中，腔室部还具备针对电极213、214的电压施加机构。通过施加电压，具有电荷的试样212通过纳米孔202从试样导入分区204向试样流出分区205转移。试样212通过以激发光照射的纳米孔202时，对于利用导电性薄膜215增强的拉曼散射光谱，利用浸液介质216有效地使拉曼光聚焦，通过物镜217到达检测器109而被解析。

图2中，将上部设为试样导入分区，将下部设为试样流出分区，也可以将下部设为试样导入分区、将上部设为试样流出分区，检测流出纳米孔的试样。

以下，以实施例的形式具体地对本发明的方法进行说明，但其用意并非是本发明的方法限定于以下的实施例。

实施例1

将本发明的方法的一个实施方式示于图3。本发明的核酸分子的构建方法的特征之一在于，扩增作为对象的核酸的目标序列，目标序列重复的单链(单分子)来构建。

如图3(1)所示，所准备的引物对中，至少一方设为具有发夹结构的引物300。引物300的3'末端侧是具有与包含目标序列的模板DNA的序列互补序列的单链区域的引物序列结构，呈从茎部突出的结构。这种情况下，用于扩增目标序列的引物300是发夹引物，用于扩增目标序列互补链的引物303可以是发夹引物，也可以是不具有发夹结构的引物。或者，还可以：为了扩增目标序列，使用引物303；为了扩增目标序列互补链，使用发夹引物300。以双链核酸中任一方序列为目标序列进行解析的本发明的方法可以根据实施方式使用上述任何方式。任何情况下，在与发夹引物300的对比中，在本说明书中均将引物303记载为“配对的引物”。

模板DNA可以直接使用来自其本身包含目标序列的试样的DNA，也可以以能够更合适地用于本发明的方法的方式，在以包含能够完全与发夹引物形成互补链的序列的方式合成的序列上连接目标序列。

具有包含环部和茎部的发夹结构的引物是已知的，作为其序列例，例如通过I.A.Nazarenko.et al.2516-2521Nucleic Acids Research,1997,Vol.25,No.12，可以给出具有下述表1所示发夹结构的序列例。只要确定了包含目标序列的作为扩增对象的模板DNA，本领域技术人员就能够适当设计、制作用于其扩增的合适的发夹引物。

[表1]

如图3所示，使具有发夹结构的引物300变性并与对象核酸(例如人类基因组)的目标序列退火。

作为一例，在图3的步骤(1)中，准备作为反应溶液混合物的含有对象核酸的溶液、夹有目标序列的引物组(一侧或两侧为上述发夹引物300)、以及聚合酶和对应于聚合酶的盐组合溶液。所使用的DNA聚合酶没有限定，可以使用例如作为Taq DNA聚合酶所代表的从嗜热菌分离的聚合酶的、分类为家族A(PolI型)的酶、作为KOD DNA聚合酶所代表的从超嗜热古细菌分离的聚合酶的、分类为家族B(α型)的酶。此外，作为催化链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶，通常已知Bst DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、Φ29噬菌体DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶(从Vent DNA聚合酶将外切核酸酶活性去除而得)、DeepVentDNA聚合酶、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶(从DeepVentDNA聚合酶将外切核酸酶活性去除而得)、MS-2噬菌体DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(宝生物公司制)等，可以适当使用。

此外，也可以使用具有作为上述DNA聚合酶所需的催化剂活性并且仅将结构等一部分功能去掉的物质、通过氨基酸突变等改变了催化剂活性、稳定性或者耐热性的各种突变体。只要具有序列依赖型的互补链合成活性、链置换活性等，各种DNA聚合酶突变体就能够在本发明中利用，并非限于上述例子。

本发明的方法是多次读取通过合成而制作的序列从而提高测序仪的读取精度的方法，因此优选合成精度高的聚合酶。例如，已知合成精度高的酶PrimeSTAR(注册商标)Max、PrimeSTAR(注册商标)HS等(宝生物公司制)的合成精度为99.995％以上。它们具有为了检测1～0.1％的突变，扩增阶段的合成错误不会对突变检测产生影响程度的充分的精度。

在图3的步骤(2)中，将该(1)的混合物加热至适当的变性温度，使各引物与对象核酸退火，进行延伸反应(步骤(3))。延伸的双链扩增产物在变性条件下解离后，再次与各引物退火、延伸。重复进行该工序。这里，发夹引物的环部也全部形成碱基对包含于延伸的双链扩增产物中(步骤(4))。

如(5b)所示，在这一时刻，延伸的单链核酸的分子内包含发夹引物的序列，因此能够通过其分子内退火而形成具有发夹结构的单链核酸。该反应与通过与未反应的发夹引物300的分子间退火进行形成新的互补链的反应竞争。这里，为了优先获得重复包含(5b)所示那样的目标序列、且具有发夹结构的单链核酸，形成发夹结构的互补链序列部301(茎部)与3’末端的退火比与未反应的发夹引物300的退火优先发生是优选的。因此，通过例如以竞争退火的发夹引物300的发夹引物中的互补链序列部302(单链部)退火所需的温度(Tm值)比形成发夹结构的互补链序列部301(茎部)的Tm值低的方式设计、且以使从变性工序向退火和延伸工序的温度降低的方式设置温度梯度，互补链序列部301(茎部)能够优先退火，能够优先获得具有目标序列重复而得的发夹结构的单链核酸。即，这种情况下，发夹引物的茎部具有比单链部的Tm值高的Tm值。在上下文中，Tm(melting temperature，熔解温度)值记载的是对应于引物内部分序列的值。

例如，进行将发夹引物的单链部的Tm值设为60℃的序列设计的情况下，如果将茎部的Tm值设为70℃，则互补链序列部301能够优先退火，能够优先获得具有目标序列重复而得的发夹结构的单链核酸。

一般而言，双链DNA的状态在Tm值的±5℃内发生变化。只要是具有容差地设置Tm值之差，就可以将单链部与茎部的Tm值之差设定为15℃以上。但是，具有极端差异的Tm值设定还会影响扩增的反应效率，因此可以设为15℃以下、更优选约10℃的温度差。因此，作为本发明方法的一个实施方式，以发夹引物300的茎部具有比发夹引物300单链部的Tm值高5℃以上、10℃以上、或15℃以上的Tm值的方式设定。或者以发夹引物300的茎部具有比发夹引物300单链部的Tm值高约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃的Tm值的方式设定。

此外，如果使用调节DNA的熔解温度的甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸)，则能够使双链DNA的状态在更窄的温度范围内发生变化(William A.Rees等，Biochemistry 1993,32,137-144)，因此可以在反应溶液中添加。

Tm值或各温度下双链DNA的状态根据pH和盐浓度等条件的变动而变动、此外也依赖于碱基序列、长度的值，但在一定条件下的Tm值可以基于碱基序列的长度和GC含有率等来计算。本领域技术人员可以在引物的设计中适当设定各部的Tm值，设计、制作最适的引物，此外也可以适当进行反应温度的设计。

或者，如果不进行上述工序，因为发夹引物300的浓度随着反应循环的进行而减少，因此可以以由于引物300用尽而互补链序列部301优先退火的方式适当调整引物300的浓度。这种情况下，在发夹引物由于反应的进行而减少的同时，合成的互补链序列以自身为模板进行延伸反应。

更具体而言，为了进行上述反应，例如将具有表1所示那样的序列结构的发夹引物与聚合酶和盐组合溶液设为100μl时的组成调制为：

20mM Tris-HCl(pH8.5)

50mM KCl

2mM MgCl₂

200μM各dNTP

5U Pfu^exo-DNA聚合酶(不具有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶)，在以下的温度条件下进行合成反应。

通过在94℃加热5分钟，使发夹与对象核酸(例如人类基因组)的高级结构解开。然后使95℃30秒、60℃45秒、72℃90秒的温度循环重复例如20至40次，然后进行72℃5分钟的延伸反应。温度循环中的时间、温度不限于此处所示的反应条件。温度、时间、循环等可以根据作为目标的序列、引物的序列、得到的产物量等而改变。

通过重复这些步骤的图3的工序，能够获得(5b)所示那样的具有目标序列重复而得的发夹结构的单链核酸，能够迅速构建确定碱基序列前的试样。

此外，图3中，将配对的引物中的一个设为发夹引物300，但也可以是配对的引物双方使用具有发夹结构的引物进行同样的反应工序。用来构建核酸分子的时间依赖于合成反应中的温度、反应时间、循环、热循环仪(thermal-cycler)性能，大体上，图3所示的反应在30分钟至90分钟以内结束。反应溶液中含有未反应的引物等，利用凝胶过滤树脂填充离心柱CHROMA SPIN Column(宝生物公司制)，可以用10分钟左右将未反应的引物除去、仅将合成的目标序列重复的核酸分子取出，进入碱基序列确定工序。

通过本发明的方法得到的生成物具有互补链序列，因此形成双链的(5a)与具有发夹结构的单链核酸分子(5b)混合存在。为了利用使用了使单链DNA通过、每次检测一个碱基的纳米孔(例如直径2nm以下)的测序仪进行序列解析，在序列解析时，双链核酸分子的存在是不优选的。因此，也可以例如在图3所示合成工序中，将使用了两条的引物中的一条设为不具有发夹结构的引物303，使引物303的序列为互补链序列容易解离的富含AT的序列。或者，也可以在生成物通过纳米孔时进行热、碱等导致的互补链序列的解离，形成容易以单链DNA形式通过纳米孔的结构。

或者，可以使引物303在使用以DNA-RNA构成的杂合嵌合引物，将RNA序列设于5’末端之后进行图3所示反应。这种情况下，也可以使用RNaseH酶等将形成了DNA-RNA杂合双链的RNA切断，形成反应生成物的末端为单链DNA的位置，容易地从纳米孔中单链DNA的位置通过。使从形成单链DNA的位置的序列至双链DNA序列的位置通过纳米孔时，带负电荷的DNA经过纳米孔，由于带电而被吸引至阳极侧。双链DNA具有氢键地形成，也可以一边使氢键解离一边吸引。这种情况下，通过纳米孔的速度变慢，可以经过充分的时间通过作为充分的检测场的位置。也就是说，还可以通过热、碱或引力分别调整形成双链的氢键的力，控制DNA通过纳米孔的速度。

本发明的方法是，仅以目标序列(双链的一侧的一条DNA链)为基础合成互补链序列，随后合成该合成序列的互补链序列，构建单链核酸分子，使用其，利用纳米孔测序仪进行检测。这使得仅通过解析目标序列的单链难以解读碱基序列的情况下、例如得到的信号由于碱基间具有类似信号的情况等而不确定的情况下，能够获得来自具有不同序列的互补链序列的信号。也就是说，并非读取包含错配可能性的本来的双链分子双方，而是仅读取相同目标序列的单链序列信息2次，因此表现为，能够在读取到的2次信息的基础上进行高精度的核酸序列分析。即使检测装置(例如检测器、透镜等)并非昂贵且高精度的装置，也能够通过多次读取成为获得充分精度程度的装置，即能够降低装置的负担(例如功能上)，本发明的方法也是能够使用于测序的装置为廉价或小型化的装置的方法。

利用纳米孔测序仪进行的解析在为单链核酸分子的情况下，从5'侧解析、从3'侧解析均可。使用通过上述工序生成的反应产物进行纳米孔测序的情况下，如果从5'侧读取，则图3(5b)所示发夹扩增产物首先分析引物的序列信息，然后按照目标序列、发夹引物序列、目标序列(互补序列)、引物序列(互补序列)的顺序解析。

这里，来自各引物序列的碱基序列信息和碱基序列的信号信息(例如拉曼散射光、封闭电流值)是已知的，因此，以何种信号(波长、频率或电流值)得到峰、对应于各碱基的信号以何种顺序得到峰是已知的，因而能够实时进行检测的校正。例如，检测拉曼散射光的情况下，依次获得已知的利用拉曼散射光得到的光谱信息，因而由光谱峰得到的信息无法在本应得到的元件的位置获得的情况下，例如可以校正检测元件的位置。如果光轴偏移，则在与本来的检测图像元件位置不同的位置获得光谱峰，因此无法正确解析。因此，利用通过碱基序列读取的开始和终止以及目标序列的间隔得到多个已知的拉曼光谱峰，使用由解析初期得到的多个拉曼光谱峰的检测图像元件位置和激发光的检测图像元件位置(不是拉曼光，而是激发光的反射光)组成的多个已知的位置信息、以及本来可检测到的元件位置信息等，可以修正频率和元件的位置信息并进行解析。

由已知序列部得到的多个拉曼光谱峰不仅可以用于上述元件的位置校正，还可以用于污染、延迟的检测。例如，解析多个样品的目标序列的情况下，根据样品的不同，改变解析所用的发夹引物300发夹部分的序列。或在成对的引物303的5’末端设置不具有与目标序列互补的序列的序列，通过根据样品的不同来改变序列，可以由读取的序列信息来识别样品间的污染、解析中前一解析样品的延迟并进行解析。

进行电流检测的情况下，可以使用由已知的各引物序列的各碱基得到的电流值和背景信号值进行校正。例如，在测定中背景信号值发生变动的情况下特别有效。将核酸通过前的信号值作为背景信号值，核酸分子进入时电流值会大幅变化，因此，减去核酸分子进入前的背景信号值而测量电流值。依次测量ACGT并列的已知碱基序列的情况下，可以将在各碱基的信号强度减去背景信号值后，已知序列产生的信号强度比、信号的变化作为对照值，将目标序列部得到的信号值与对照值进行比对而对碱基进行判定。校正的方法不限于此。该方法是以由已知序列得到的已知信号值或信号信息、或由已知序列得到的已知序列产生的实测信号为基础进行校正或解析的方法。基于上述记载，本领域技术人员能够对本发明的方法进行适当改变。

上述是以检测拉曼散射光而确定核酸碱基序列的例子为中心来表示的，但本发明的方法不限于此，例如，可以在下述方法中使用通过本发明的方法得到的核酸分子：检测通过纳米孔时的封闭电流的核酸碱基序列确定方法(US2011/0229877、US2011/0177498等)；检测通过纳米孔时产生的隧道电流的核酸碱基序列确定方法(日本特开2014-20837)；使用液滴的单分子核酸碱基序列确定方法(WO2014111723A、WO2014053854A)；制作聚合酶延伸产物的情况下，进行从核苷酸三磷酸[NTP]放出的荧光标记焦磷酸[PPi]部分的单分子检测的核酸碱基序列确定方法(日本专利第4638043号)等。即使目标序列的读取精度低，由于分子中包含多个目标序列信息，因此也能够通过解析单分子而显示出高精度的解析结果，能够减轻进行检测的装置侧的负担(例如功能上)。

实施例2

实施例1中，仅一方使用发夹引物的情况下构建的核酸分子是按图3的(4)所示分子与(5b)所示分子约各占一半的比例构建的。本实施例中，对下述方法进行说明：能够2次检测图3的(5b)所示目标序列的分子不是以一半的程度构建，而是以构建的分子全部为能够2次检测目标序列的分子的方式构建。图4显示其流程。

本实施例中，在图4所示工序之前，进行与图3类似的工序。与图3所示的工序不同的一点是，将与发夹引物300配对的引物303生物素化而进行图3所示扩增工序。随着引物的生物素化，为了减少由于生物素的立体结构而产生的使用聚合酶进行的合成中的扩增障碍，可以包含约5个碳原子左右的间隔(例如碱基等)。

使用生物素化的引物300，在通过例如图3所示工序扩增的40μl反应产物中，混合带有链霉亲和素的磁珠(例如Dynabeads(注册商标)M-280Streptavidin)，悬浮并在室温下孵育15分钟，使扩增产物与磁珠结合。

之后，在反应容器外侧架设磁铁，在跨反应容器地将磁珠吸引至磁铁侧并固定的状态下，仅将上清除去，进行洗涤溶液的添加和悬浮、利用磁铁进行的吸引和将上清除去的洗涤操作。该洗涤操作时，通过使洗涤溶液为60℃以上或95℃以上来进行，存在于磁珠上结合的DNA链互补链中的DNA链随着双链DNA的解离而被洗去，能够仅分离到磁珠上结合的DNA链、即从生物素化引物延伸的分子。或者，通过利用碱溶液在进行双链DNA的解离的同时进行洗涤，也可获得同样的效果。

作为仅分离到磁珠上结合的DNA链的方法，记载了通过高温下的洗涤和利用碱溶液的洗涤进行处理的方法，但不限于此。只要是使DNA链的互补链序列相结合的状态解离、仅分离到由生物素化的引物延伸的分子的方法即可。

使用该分离到的DNA链，构建分子全部为能够2次检测目标序列的分子。例如，反应溶液设为100μl时，在分离到的DNA链中加入下述组成的溶液：

20mM Tris-HCl(pH8.5)

50mM KCl

2mM MgCl₂

200μM各dNTP

5U Pfu^exo-DNA聚合酶(没有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶)，

在以下的温度条件下进行反应。

通过在94℃加热5分钟使高级结构解开。然后通过95℃30秒、60℃45秒使3’末端具有互补链的序列位置退火，从而构建发夹结构，通过在72℃加热90秒以上进行延伸反应。

结果，如图4所示，能够仅获得具有重复包含目标序列信息的发夹结构的单链核酸。此外，反应条件不限于上述反应条件，可以根据作为目标的序列、引物的序列来改变温度、时间、循环等。此外，关于各工序的反应之间，虽然未记载将盐、酶除去的纯化工序，但根据情况，如有需要也可以实施。

进行纳米孔测序时，由于结合的磁珠而测序效率降低的情况下，可以将磁珠从核酸分子切掉。例如，可以将设于引物与生物素之间的间隔区域切断。作为切断方法，例如可以是间隔区域的碱基序列中预先包含制限酶酶切序列，在测序前切断。由此，可以以将DNA链与磁珠切断而得的混合物作为试样进行纳米孔测序。

实施例3

本实施例中，对使用λ外切核酸酶构建使分子全部作为包含2次目标序列信息的分子的方法的例子进行说明。图5显示其流程。

本实施方式的特征在于，在使用前将发夹引物的5'末端磷酸化，在构建目的核酸分子后使5'末端磷酸化的DNA链分解。分解没有特别限定，使用例如λ外切核酸酶。

在图5所示工序之前进行与图3类似的工序。与图3所示的工序不同的一点是，使发夹引物300的5’末端磷酸化、配对的引物303未磷酸化地进行图3所示扩增工序。反应后，如有需要，将扩增反应液中的盐、引物除去。除去方法无要求，可以使用例如作为通过将扩增产物固定于硅胶膜并离心来纯化的市售试剂盒的NucleoSpin(注册商标)凝胶及PCR纯化(Gel and PCR Clean-up)(宝生物公司制)。

λ外切核酸酶是具有下述特征的酶：从磷酸化的5'末端侧开始消化双链DNA，产生单核苷酸。5'末端磷酸化的双链DNA为良好的底物。利用该性质，在扩增产物中加入λ外切核酸酶(NEB公司制)，按照67mM甘氨酸-KOH(pH9.4)、2.5mM MgCl₂、50μg/ml BSA的缓冲液组成调制反应溶液，在37℃孵育30分钟。通过该反应，经图3的工序生成的扩增产物中不形成发夹结构，因此，无法在一分子中2次读取目标序列信息的双链DNA中具有磷酸基的链被消化，成为单链。进行λ外切核酸酶反应后，再次实施使该DNA链延伸的反应。

这种情况下，将进行了λ外切核酸酶反应的溶液调整为例如下述组成的溶液。

20mM Tris-HCl(pH8.5)

50mM KCl

2mM MgCl₂

200μM各dNTP

5U Pfu^exo-DNA聚合酶(没有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶)

按上述组成在以下的温度条件下进行反应。通过在94℃加热5分钟使高级结构解开。然后通过95℃30秒、60℃45秒使3’末端具有互补链的序列位置退火，从而构建发夹结构，通过在72℃加热90秒以上进行延伸反应。该反应不限于上述所示的反应条件。可以根据作为目标的序列、发夹结构的序列来改变温度、时间、循环等。

结果，如图5所示，作为得到的DNA链，能够仅获得具有目标序列重复的发夹结构的单链核酸。关于各工序的反应之间，虽然未记载将盐、酶除去的纯化工序，但如有需要也可以实施。

本实施例中制成的核酸分子也同样能够在测序时2次检测目标序列，能够进行高精度的碱基测序。

实施例4

本实施例中，对不止2次以上检测目标序列、也可进行4次检测的构建方法进行说明。图6显示其流程。

在图6所示工序之前进行与图3类似的工序。与图3所示工序不同的一点是，将延伸反应中的“72℃90秒”的步骤进行足够长的时间(例如5分钟以上)，从而能够刻意形成反应生成物的3’末端有1碱基腺嘌呤突出的结构。因此，优选使用具有末端转移酶活性的DNA聚合酶(例如TaqDNA聚合酶)实施延伸反应。

对于这里形成的反应产物，进行使3’末端1碱基胸腺嘧啶突出的末端结构与具有发夹结构的接头601连接的TA克隆(TACloning)。如图6所示，该接头601具有下述结构：与前一工序的反应产物结合(连接)的部分(双链DNA)和形成发夹环的部分(例如表1所示那样的序列)之间，仅通过单链连接。这是从发夹环向与反应产物结合的部分3’末端中断的结构。

作为接头的连接例，给出了利用TA克隆与接头601结合，但连接方法不限于此。例如，可以使用作为利用了拓扑异构酶的克隆系统的、例如使用了DNA拓扑异构酶I和来自细菌噬菌体P1的Cre重组酶的StrataClone PCR克隆系统(安捷伦公司)、TOPO(注册商标)Cloning(Life Technologies)等其他克隆技术来连接。

作为连接后的步骤，对于经连接的反应产物，使用链置换型聚合酶进行延伸反应。该反应是在能够从接头601的3'末端对互补碱基序列形成碱基对结合、且可维持发生链置换反应的酶活性的温度(例如60℃)下孵育。孵育时间可以根据延伸反应的碱基长度来调整。这里，各个位置形成碱基对结合的条件一般是例如设定为熔解温度以下，与PCR法、LAMP法中使用的条件是同样的。

该基于链置换反应的延伸可以在提供适合于酶的pH的缓冲剂、维持酶的催化剂活性、为了退火而使用的盐成分、酶的保护剂、以及根据需要的熔解温度调节剂等共存的条件下实施。作为pH缓冲剂的一例，可以使用Tris-HCl等在中性至弱碱性具有缓冲作用的缓冲剂。pH根据所使用的酶(DNA聚合酶)的特性来调整。作为盐成分，可以为了维持酶的活性、调整核酸的熔解温度而适当添加KCl、NaCl或者(NH₄)₂SO₄等。作为酶的保护剂，可以使用糖类、牛血清白蛋白。

熔解温度的调整一般利用的是二甲亚砜(DMSO)、甲酰胺。通过使用它们作为熔解温度调节剂，能够将从3'末端开始的退火调整至限定的温度条件之下。进而，甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸)是天然的渗透性保护剂，可以利用其能够使大量含有G+C碱基序列区域的熔解温度降低至与大量含有A+T碱基序列区域相同的熔解温度的性质。另外，作为熔解温度调节剂，已知脯氨酸、三甲胺N-氧化物等。带来双链DNA的不稳定化，从而能够提高链置换效率。甜菜碱的添加量在反应液中为0.2～3.0M，优选为0.5～1.5M程度，可期待促进本发明的核酸扩增反应的作用。这些熔解温度调节剂向降低熔解温度的方向发挥作用，因此考虑盐浓度、反应温度等其他反应条件，凭经验设定产生适当的反应的条件而实施。

根据链置换反应的特性，只要进行反应，就可以进行延伸反应。例如，存在下述情况：引导延伸反应的3’末端结构自身退火、转移至附近的自身碱基序列而进行反应。

在碱基序列的立体结构上，反应这样进行的情况下，除了作为DNA聚合酶底物的dNTP(脱氧三磷酸核苷酸)以外，还可以以一定浓度含有ddNTP(二脱氧三磷酸核苷酸)。可以通过含有的ddNTP的浓度来限制扩增到的模板的长度。例如，只要经过环结构后延伸反应继续进行，则通过含有高浓度的ddNTP，能够在链置换反应时引进ddNTP而使延伸反应停止。ddNTP浓度低的情况下，聚合酶优先引进dNTP，如果链置换反应进行到一定程度而ddNTP的浓度比变高，则优先引进ddNTP，链置换反应停止。可以根据所需的延伸产物长度调整ddNTP的浓度。通过ddNTP的浓度调整，能够使目标序列信息重复4次以上，但过多的重复结构结果会形成高级结构，能够对通过纳米孔产生影响，因此可以根据序列的构成正确使用重复次数。

链置换反应无限制地进行带来的延伸能够如上所述使用ddNTP来控制，但控制方法不限于此。作为另一例子，如果设为使接头601所具有的发夹环结构的一部分脱碱基的构成，则链置换型聚合酶反应在脱碱基化的位置停止。因此，能够利用脱碱基来控制生成的核酸分子的长度。

此外，也可以在接头601所具有的发夹环结构部分包含抑制利用聚合酶进行的延伸反应的分子。通过准备抑制分子，能够在延伸反应的过程中抑制利用聚合酶进行的延伸反应，防止无限制地延伸。抑制分子的结构只要能够抑制利用聚合酶进行的延伸反应就没有特别限定，优选包含例如核酸衍生物、非核酸衍生物。

作为核酸衍生物，除了上述脱碱基以外，还可列举具有即使在链置换型酶的作用下也不会解离的牢固的高级结构、如假结结构那样立体抑制聚合酶行进的结构的核酸、L型核酸、3-脱氧-2-羟基-dN、修饰碱基核酸、损伤碱基核酸、磷酸结合部位修饰核酸、RNA、2'-OMe-N、BNA(LNA)、以及它们的衍生物。

如图6所示，本实施例所示反应的结果是，能够获得具有目标序列重复4次的发夹结构的单链核酸。关于各工序的反应之间，虽然未记载将盐、酶除去的纯化工序，但如有需要也可以实施。

本实施例中制成的核酸分子能够在测序时对目标序列检测4次，能够实现更高精度的碱基测序。

实施例5

如图6所示，实施例4中构建的核酸分子是目标序列重复2次或4次的核酸分子可以混合存在的混合物。本实施例中，对构建分子全部为目标序列重复4次的核酸分子的方法进行说明。图7显示其流程。

图7的工序中使用通过图5所示反应工序生成的反应物。该生成的反应物是分子全部包含重复2次的目标序列的核酸分子，用其构建目标序列重复4次的核酸分子。

与实施例4中说明的例子同样，图5的反应中，通过延伸反应充分进行，能够刻意形成反应生成物的3’末端1碱基腺嘌呤突出的结构。因此，对图5中生成的反应物，进行赋予具有与实施例4中使用的同样结构的接头601的TA克隆或TOPO(注册商标)克隆(LifeTechnologies)等。但与接头的连接方法没有特别限定。

图5的反应产物与接头601结合后，进行使用了链置换型聚合酶的延伸反应。这里的反应是在能够从3'末端针对互补碱基序列形成碱基对结合、且能够维持发生链置换反应的酶活性的温度下孵育。这里，产生各个位置的碱基对结合的条件一般是例如设为熔解温度以下，与PCR法、LAMP法中所使用的条件同样。关于这里所示链置换反应，也考虑与实施例4所示的链置换反应同样的点而进行反应。

如图7所示，上述所示反应的结果是，能够使得到的DNA链全部为具有目标序列重复4次的发夹结构的单链核酸。关于各工序的反应之间，虽然未记载将盐、酶除去的纯化工序，但如有需要也可以实施。

本实施例中制成的核酸分子能够在测序时检测目标序列4次，能够进行更高精度的碱基测序。

实施例6

上述实施例1～5中，主要以记载构建核酸分子的工序作为主要目的。实施例6中，对考虑了有效地将实施例1～5中构建的核酸分子导入纳米孔的构建方法进行说明。通过实施例1～5的方法构建的核酸分子的末端结构形成双链DNA形状，在确定单链DNA碱基序列的情况下，通过使双链解离为单链，向设为单链DNA直径尺寸的纳米孔的导入效率提高。一般而言，使双链DNA变性为单链DNA的情况下，除了溶剂以外，暴露于高温、pH调节、熔解温度调节剂的使用等也是公知的技术。将增强它们的效果的方法示于本实施例。

通过实施例1～5所示的核酸分子构建方法生成的分子的末端在例如图3所示的反应中，形成具有发夹引物300与配对的引物303序列的双链DNA结构，这种状态下，不容易进入单链DNA直径尺寸的纳米孔。因此，通过设为容易在使该引物303序列变性时形成单链DNA的富含AT(腺嘌呤和胸腺嘧啶)序列的序列701(图7)，容易在碱基测序时简便地将单链DNA导入纳米孔结构。

或者，制成发夹引物300的5’末端具有RNA的、DNA与RNA的嵌合引物，进行图3所示反应，进行各实施例所示反应。之后，使用核糖核酸酶RNaseH使DNA与RNA中嵌合结构末端的RNA分解，从而生成单链DNA突出的核酸分子，从单链DNA的位置导入纳米孔变得容易。

实施例7

本实施例中，对下述方法进行说明：通过发夹引物300中具有随机序列801，利用该随机序列801来识别作为扩增时的来源的核酸分子，提高作为来源的核酸分子的序列判断精度。

实施例1～6所示反应中，发夹引物300中具有随机序列801。例如，如图8A所示，该随机序列801位于发夹引物300的双链形成序列的位置。针对目标序列形成互补序列以外的位置中，双链形成序列中(茎部)形成10碱基对的随机序列的情况下，使用4种碱基能够准备具有4的10次方(1,048,576)种随机序列的发夹引物。结果，图8A(1)～图8C(5)的工序中，如图8C(5)所示，以复制的具有某一随机序列801的核酸分子为模板扩增到的核酸分子以具有同一随机序列801及其互补序列802的分子的形式得到扩增。通过扩增循环的重复，在维持作为扩增来源的序列和随机序列的状态下，得到呈指数级扩增的核酸分子。从具有不同随机序列的发夹引物803～805扩增的核酸分子构成随机序列不同的核酸分子组(图8C)。

序列解析时，通过在识别目标序列的同时识别对应于该发夹引物300的双链形成序列的位置(随机序列801及其互补序列802)，作为扩增时的来源的核酸分子的序列解析结果仅得到扩增到的核酸分子的数量，能够提高相对于数据库等中的参考序列，判定是碱基序列读取错误还是突变的精度。

图9中显示出将具有同一随机序列901的多个核酸分子(01～05)的序列解析结果汇总并与目标序列相比的结果的例子。通过将各核酸分子的解析结果与参考序列同时进行比较，可检测到分子间不同的结果。这种情况下，如果是序列解析时的读取错误，则表示在一部分核酸分子的随机位置存在与参考序列不同的碱基(图中以四边形围成的区域所示的碱基)。例如，在扩增到的核酸分子01中解析到“G”、在另外的核酸分子02～05中解析到“C”的情况下，判定这是读取错误(参考序列中也为“C”)。而在作为扩增来源的核酸分子碱基序列中产生了突变(位置902中的“T”→“C”)的情况下，在具有同一随机序列901的核酸分子01～05的位置902(核酸分子01～05中共用且不同的碱基)显示与参考序列不同的碱基。也就是说，通过识别作为扩增来源的核酸分子，对由该分子扩增到的核酸分子与扩增来源不同的核酸分子进行识别并读取多个，能够进行更高精度的解析。

本方法在前述检测大量存在的来自正常细胞的基因组DNA中少量含有的来自异常细胞的突变的情况下特别有效。

这里将随机序列801的碱基长度设为10碱基，但不限于此。检测对象的含有比例少的情况下，通过使随机序列的碱基长度加长，反应中可以使用种类更多的发夹引物，检测对象(例如来自异常细胞的核酸)和除其以外的核酸(来自正常细胞的核酸)能够不使用具有相同随机序列的发夹引物地扩增。也就是说，优选发夹引物具有上述目标序列的突变数量以上种类的随机序列。

此外，图8中将随机序列801的位置设为双链形成序列的位置，也可以包含发夹的环部分地形成随机序列。此外，虽然没有特别限定，发夹引物的茎部的碱基长度可以设为8～20碱基，例如16～18碱基的范围。

本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接作为参考并入本说明书中。

符号说明

100：纳米孔拉曼DNA测序装置，101：光源，102：物镜，103：显微镜观察容器，104：XY平台，105：Z轴调节机构，106：滤波器，107：分光器，108：衍射光栅，109：检测器，110：LED，111：二维检测器，112：反光镜，113：多重照射机构，114：透镜，115：驱动控制部，116：计算机，117：NIR(近红外)反光镜，201：观察容器，202：纳米孔，203：基板，204：试样导入分区，205：试样流出分区，206：流入路径，207：流入路径，208：流出路径，209：流出路径，210：液体，211：液体，212：试样，213：电极，214：电极，215：导电性薄膜，216：浸液介质，217：物镜，300：发夹引物，300a：发夹引物300的延伸产物，301：形成发夹结构的互补链序列部，302：发夹引物中的互补链序列部，303：引物，303a：引物303的延伸产物，303b：引物303的延伸产物，303c：引物303的延伸产物，303d：引物303的延伸产物，601：发夹接头，701：富含AT(腺嘌呤和胸腺嘧啶)序列的序列，801：随机序列，802：随机序列的互补序列，803：具有不同随机序列的发夹引物，804：具有不同随机序列的发夹引物，805：具有不同随机序列的发夹引物，901：随机序列，902：核酸分子01～05中共用且不同的碱基

Claims (16)

1.一种单链核酸分子的构建方法，所述单链核酸分子用于利用纳米孔测序仪进行的核酸序列确定，所述单链核酸分子的构建方法包括：

使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物和配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序，

将上述工序所得的混合物加热至适当的变性温度，使各引物与对象核酸退火，进行延伸反应的工序，

延伸的双链扩增产物在变性条件下解离后，再次与各引物退火、延伸，重复进行在变性条件下解离后，再次与各引物退火、延伸的操作，得到含有发夹引物的环部的序列的双链扩增产物的工序，

重复上述各工序，即合成互补链的工序、进行延伸反应的工序、得到双链扩增产物的工序，得到具有发夹结构的单链核酸的工序，以及

该单链核酸以自身为模板进行延伸反应的工序；

得到成为生成物的核酸分子序列中包含目标序列及其互补链双方，

所述发夹引物的茎部具有比单链部的Tm值高的Tm值，且以使从变性工序向退火和延伸工序的温度降低的方式设置温度梯度。

2.根据权利要求1所述的方法，在发夹引物由于反应的进行而减少的同时，合成的互补链序列以自身为模板进行延伸反应。

3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用前将发夹引物的5'末端磷酸化，在构建目的核酸分子后使发夹引物5’末端磷酸化的DNA链分解的工序。

4.根据权利要求3所述的方法，使用λ外切核酸酶进行所述分解。

5.根据权利要求3所述的方法，在5’末端磷酸化的DNA链分解后，从其互补链的3’末端介由发夹结构自身退火进行延伸反应。

6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使具有发夹环结构的接头与所述生成物连接，进行链置换反应而使核酸分子延伸的工序。

7.根据权利要求5所述的方法，使具有发夹环结构的接头与所述生成物连接，进行链置换反应而使核酸分子延伸。

8.根据权利要求1所述的方法，将由所述配对的引物形成的末端固定，使互补链DNA解离后，进行延伸反应。

9.根据权利要求6或7所述的方法，所述接头的环结构部含有延伸反应抑制分子。

10.根据权利要求1所述的方法，所述配对的引物具有DNA与RNA的嵌合结构，延伸反应后进一步包括使RNA分解的工序。

11.根据权利要求1所述的方法，所述发夹引物具有随机序列。

12.根据权利要求11所述的方法，所述发夹引物具有所述目标序列的突变数量以上种类的随机序列。

13.一种非诊断和治疗目的的核酸碱基序列确定方法，其包括：

构建在序列中包含目标序列及其互补链双方的单链核酸分子的工序，该构建包括：

使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物和配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序，

将上述工序所得的混合物加热至适当的变性温度，使各引物与对象核酸退火，进行延伸反应的工序，

延伸的双链扩增产物在变性条件下解离后，再次与各引物退火、延伸，重复进行在变性条件下解离后，再次与各引物退火、延伸的操作，得到含有发夹引物的环部的序列的双链扩增产物的工序，

重复上述各工序，即合成互补链的工序、进行延伸反应的工序、得到双链扩增产物的工序，得到具有发夹结构的单链核酸的工序，以及

该单链核酸以自身为模板进行延伸反应的工序；以及

利用纳米孔测序仪对该单链核酸分子的碱基序列进行解析，

所述发夹引物的茎部具有比单链部的Tm值高的Tm值，且以使从变性工序向退火和延伸工序的温度降低的方式设置温度梯度。

14.根据权利要求13所述的方法，序列确定工序中，以由核酸分子中所含的已知碱基序列得到的信号为基础进行检测器的校正。

15.根据权利要求13所述的方法，序列确定工序中，以由核酸分子中所含的已知碱基序列得到的信号为基础进行解析。

16.根据权利要求13所述的方法，使用形成了双链的反应物来控制反应物通过纳米孔的速度。

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