WO2016136952A1 - 核酸分子の構築方法 - Google Patents

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acid molecule
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満 藤岡
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method for constructing a nucleic acid molecule for nucleic acid sequencing. More specifically, the present invention relates to a method for constructing a single-stranded nucleic acid molecule suitable for analysis by nanopore sequencing.
  • Nucleic acid base sequence analysis has become very popular in recent years for the purpose of detecting genes causing genetic diseases, evaluating drug efficacy and side effects, and detecting gene mutations related to cancer diseases, etc. Yes.
  • the information obtained as a result of the analysis must therefore be highly accurate.
  • Patent Document 1 states that “the circular configuration of the template enables multiple repeated sequencing of the same molecule.
  • the sequencing method proceeds along a completely continuous sequence, and each sequence from a complementary sequence is By repeatedly sequencing a segment, the sequence data of this segment and the sequence data within each segment can be repeatedly acquired, all or part of such sequence data is then obtained from the consensus sequence of the template and its various segments. It is useful for inducing "(paragraph number [0055]).
  • Patent Document 2 discloses an adapter that contains a double-stranded nucleic acid region and can be used to create a single-stranded construct of nucleic acid for sequencing purposes.
  • Patent document 2 states that “when constructs are sequenced, it is ensured that each position in the double-stranded nucleic acid is actually examined twice, not just once. This gives greater certainty in examining each position of the nucleic acid, and the overall score with a higher score for both bases at each position than would be possible with a single examination. (Paragraph number [0038]) Further, the ability to examine each position twice is also useful for distinguishing methylcytosine and thymine using probabilistic sensing.
  • Patent Document 1 is a molecule in which one end of a double-stranded nucleic acid is connected by a hairpin loop, or a circular molecule in which both ends are connected by a hairpin loop.
  • the molecule connected at one end improves the base determination accuracy using two results obtained by reading the sequences of the complementary strands (sense strand and antisense strand) once.
  • this method can be used to detect the result between the complementary strand sequences when each nucleic acid strand has a mutation such as a mismatched base pair, or when a sequence error occurs and the complementary strand sequence is read once. Will cause a difference.
  • Patent Document 2 a molecule in which one end of a double-stranded nucleic acid is connected by a hairpin loop. Similarly, by examining each complementary strand once, whether a mutation exists or a sequence error has occurred is determined. There is a problem that cannot be done. Furthermore, since a ligation reaction or the like is performed for hairpin loop formation, the construction efficiency of a nucleic acid molecule to which a hairpin loop is correctly bound is low. Although it is possible to carry out the reaction overnight (for example, 8 hours or more) in order to increase the efficiency, there is also a problem that pretreatment takes time.
  • the present inventors examined a method for constructing a nucleic acid molecule having a sequence structure in which only one target base sequence is repeated in a single-stranded nucleic acid (single molecule), The present invention has been completed.
  • the single-stranded structure enables analysis by nanopore sequencing, and the sequence of only the target nucleic acid that does not contain complementary strand information is repeatedly analyzed, thus addressing the problem of sequence errors and increasing accuracy. High analysis can be performed. The greater the number of times the sequence is repeated in the molecule, the better the determination accuracy.
  • the present invention includes the following.
  • [1] A method for constructing a single-stranded nucleic acid molecule for nucleic acid sequencing by a nanopore sequencer, Synthesizing a complementary strand of a template DNA containing a target sequence using at least one hairpin primer containing a single-stranded region on the 3 ′ side and a primer paired with the hairpin primer; The synthesized complementary strand forms a hairpin structure in the molecule and performs an extension reaction using itself as a template, and the resulting nucleic acid molecule contains both the target sequence and its complementary strand in the sequence.
  • the above method A method for constructing a single-stranded nucleic acid molecule for nucleic acid sequencing by a nanopore sequencer, Synthesizing a complementary strand of a template DNA containing a target sequence using at least one hairpin primer containing a single-stranded region on the 3 ′ side and a primer paired with the hairpin primer; The synthesized complementary strand forms
  • the nucleic acid molecule construction method of the present invention has the following effects.
  • the target sequence is not examined only once, but the target sequence is linked to a complementary strand sequence synthesized using the sequence itself as a template. It is examined multiple times with a single-stranded nucleic acid (single molecule).
  • This enables highly accurate analysis in examining the target sequence of nucleic acid. More specifically, it is possible to recognize whether there is a base difference due to a mutation or a base error due to a sequence error by repeatedly examining a single molecule synthesized using only a single-strand sequence without any complementary strand sequence information in the genome structure. It is possible to perform nucleic acid sequence analysis with high accuracy.
  • the high determination accuracy of the base sequence of a single molecule makes it possible to detect abnormal cell-derived mutations that are slightly contained in a large amount of normal cell-derived genomic DNA. For example, if you want to detect DNA with cancer cell-derived mutations that are slightly contained in blood, the DNA is extracted from a certain amount of blood, and the nucleic acid molecule that contains the base sequence you want to detect is extracted using the polymerase chain reaction (PCR) method. Etc. and determine whether or not the mutation is included by determining the base sequence of the nucleic acid molecule (Couraud S.Clin Cancer Res. 2014 Sep 1; 20 (17): 4613-24. ).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the final determination of a single molecule can be performed, for example, by repeatedly examining within a single molecule using only a single-stranded sequence as a template.
  • the accuracy is 99.9%, it is possible to detect a slightly contained mutant DNA.
  • the final determination accuracy is 99.9%, if 1,000 single molecule DNAs are detected, the frequency of occurrence of bases that differs from the main determination at the site with no mutation and the site with the mutation is 1 and 11, and this frequency difference is Since it is greatly different, it is easy to detect the presence or absence of mutation with the difference in appearance frequency. Detecting such slight mutations also means early detection of disease.
  • the method of the present invention performs a polymerase chain reaction using a hairpin primer, for example, a nucleic acid molecule having a hairpin structure can be constructed with higher efficiency than in the case of linking hairpin structures by ligation. it can. Note that the probability of error in the process of repeating amplification is much lower than that of a sequence error. Therefore, it can be said that the accuracy of the analysis method using the method of the present invention is much higher than that of the conventional method.
  • nucleic acid molecule construction process in the method of this invention. It is an example which shows the nucleic acid molecule construction process in the method of this invention. It is an example which shows the nucleic acid molecule construction process in the method of this invention. It is an example which shows the nucleic acid molecule construction process in the method of this invention. It is the result of comparing target sequences.
  • the present invention relates to a method for constructing a nucleic acid molecule for nucleic acid sequencing by a nanopore sequencer. More specifically, the present invention relates to a method for constructing a single-stranded nucleic acid molecule for nucleic acid sequencing by a nanopore sequencer, comprising at least one hairpin primer containing a single-stranded region on the 3 ′ side, and the hairpin A step of synthesizing a complementary strand of a template DNA containing a target sequence using a primer paired with a primer, and the synthesized complementary strand forms a hairpin structure in the molecule and performs an extension reaction using itself as a template. And the obtained nucleic acid molecule contains both the target sequence and its complementary strand in the sequence.
  • the “target sequence” means only the sequence of one strand in the case of a double-stranded nucleic acid molecule throughout the description of the present specification.
  • the complementary strand of “target sequence” is not described as “target sequence”.
  • the complementary strand may be expressed as “target sequence” or “target sequence information”.
  • the nanopore sequencer is a known technique, and for example, an apparatus described in WO2013 / 02181518A1 can be used preferably.
  • a nanopore sequencer that detects a Raman spectrum is shown as an example, but it can be applied to all techniques for analyzing single-stranded single molecules.
  • it is a nucleic acid molecule construction method applicable to a DNA sequencer that detects a blocking current or a tunnel current when passing through a nanopore or a nanopore DNA sequencer that detects fluorescence.
  • the apparatus configuration is not particularly limited to the basic configuration of an upright microscope, and may be a configuration that enables signal detection of a sample by irradiation light, such as a microscope based on an inverted microscope.
  • the light source emits external light (excitation light) having a wavelength capable of generating fluorescence or Raman scattered light.
  • a light source 101 known in the art can be used.
  • a semiconductor laser a krypton (Kr) ion laser, a neodymium (Nd) laser, an argon (Ar) ion laser, a YAG laser, a nitrogen laser, a sapphire laser, or the like can be used.
  • a multiple irradiation mechanism 113 When irradiating a plurality of nanopores with external light from this light source, a multiple irradiation mechanism 113 is used.
  • the multiple irradiation mechanism 113 is not limited, but a microlens array, a diffraction grating beam splitter, LCOS (Liquid crystal on silicon), or the like may be used. These are used to irradiate the nanopore with a plurality of external lights.
  • a confocal lens and objective lens 102 in combination with a light source in order to irradiate and converge external light from the light source onto the microscope observation container.
  • the microscope observation container 103 is installed on the XY stage 104, and the position on the horizontal plane is adjusted by the XY stage.
  • the vertical position is adjusted by the Z-axis adjustment mechanism 105 so that the sample to be measured is located in the region condensed by the objective lens.
  • the Z-axis adjusting mechanism may be provided on the XY stage.
  • a ⁇ axis stage and a gonio stage may be used for precise adjustment. These positioning means are controlled by the drive control unit 115 and operated by the user by the computer 116.
  • a filter 106 such as a notch filter, a short pass filter, a long pass filter, etc., a beam splitter 107, a diffraction grating 108, and the like corresponding to a measurement target such as a measurement wavelength region may be combined.
  • a mirror 112, a pinhole, a lens 114, and an NIR (near infrared) mirror 117 may be used as required for the arrangement of optical components.
  • an apparatus configuration for detecting fluorescence or Raman scattered light is known in the art, and those skilled in the art can appropriately select preferable components.
  • any spectroscopic detector can be used as long as it is a detector 109 that can detect fluorescence or Raman scattered light.
  • One or more one-dimensional or two-dimensional detectors can be used depending on the number and arrangement of samples in the microscope observation container to be used.
  • spectral detectors include CCD (Charge Coupled Device) or Electron Multiplying CCD image sensors, CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) image sensors, image sensors of other high-sensitivity devices (such as avalanche photodiodes), etc.
  • the detector preferably has a photomultiplier mechanism, for example, an image intensifier, in order to prevent a decrease in sensitivity due to an increase in detection speed.
  • the detector preferably includes a large-capacity memory that can directly record image information such as Raman scattered light, whereby analysis can be performed at high speed without using a cable, a board, a computer, or the like.
  • the analysis apparatus of the present invention may further include a frame buffer memory that records measurement values from the detector.
  • the analysis apparatus of the present invention may be connected to a computer 116 for digitizing, calculating, and outputting the measurement value from the detector.
  • an LED 110 is used as a bright-field illumination light source
  • a two-dimensional detector 111 is used as a bright-field imaging device.
  • the two-dimensional detector include a CCD or EMCCD image sensor and a CMOS image sensor.
  • FIG. 2 shows a cross-sectional configuration of a nanopore substrate and an observation container in which the nanopore substrate is arranged.
  • the observation container 201 is composed of two closed spaces, that is, a sample introduction section 204 and a sample outflow section 205 with a substrate 203 (nanopore substrate) having nanopores 202 therebetween.
  • the sample introduction section 204 and the sample outflow section 205 communicate with each other through the nanopore 202.
  • a molecule is put after constructing a nucleic acid molecule that is constructed by the method of the present invention described later and repeatedly contains a target sequence.
  • the nucleic acid molecule may be constructed directly in the observation container.
  • the observation container has a chamber part and a substrate 203 disposed therein.
  • the substrate 203 includes a base, a thin film formed facing the base, and a nanopore 202 that is provided in the thin film and communicates the sample (nucleic acid molecule) introduction section 204 and the sample outflow section 205. Between the sample introduction section 204 and the sample outflow section 205.
  • the substrate 203 may have an insulating layer.
  • the substrate 203 is preferably a solid substrate.
  • the substrate 203 can be formed of an electrical insulator material such as an inorganic material and an organic material (including a polymer material).
  • the electrical insulator material constituting the substrate 203 include silicon (silicon), silicon compound, glass, quartz, polydimethylsiloxane (PDMS), polytetrafluoroethylene (PTFE), polystyrene, and polypropylene.
  • the silicon compound include silicon oxynitride such as silicon nitride, silicon oxide, and silicon carbide.
  • the base (base material) constituting the support portion of the substrate 203 can be made from any of these materials, but may be, for example, silicon or a silicon compound.
  • the size and thickness of the substrate 203 are not particularly limited as long as the nanopore 202 can be provided.
  • the substrate 203 can be manufactured by a method known in the art, or can be obtained as a commercial product.
  • the substrate 203 may be formed using photolithography or electron beam lithography and techniques such as etching, laser ablation, injection molding, casting, molecular beam epitaxy, chemical vapor deposition (CVD), dielectric breakdown, electron beam or focused ion beam. Can be produced.
  • the substrate 203 may be coated to avoid adsorption of off-target molecules to the surface.
  • the substrate 203 has at least one nanopore 202.
  • the nanopore 202 is specifically provided in the thin film, but may be provided in the base (base material) and the insulator simultaneously.
  • nanopore and pore are pores having a nanometer (nm) size (that is, a diameter of 1 nm or more and less than 1 ⁇ m), penetrate the substrate 203 and have a sample introduction section 204 and a sample outflow section 205. Is a hole communicating with the.
  • the substrate 203 preferably has a thin film for providing the nanopore 202. That is, the nanopore 202 can be provided on the substrate 203 simply and efficiently by forming a thin film having a material and thickness suitable for forming nano-sized holes on the substrate.
  • the material of the thin film is preferably silicon oxide (SiO 2 ), silicon nitride (SiN), silicon oxynitride (SiON), metal oxide, metal silicate, or the like.
  • the thin film (and possibly the entire substrate) may be substantially transparent.
  • substantially transparent means that external light can be transmitted through approximately 50% or more, preferably 80% or more.
  • the thin film may be a single layer or a multilayer.
  • the thickness of the thin film is 1 nm to 200 nm, preferably 1 nm to 50 nm, more preferably 1 nm to 20 nm.
  • the thin film can be formed on the substrate 203 by techniques known in the art, for example, by low pressure chemical vapor deposition (LPCVD).
  • LPCVD low pressure chemical vapor deposition
  • the thickness of the insulating layer is preferably 5 nm to 50 nm.
  • any insulating material can be used for the insulating layer, for example, silicon or a silicon compound (silicon nitride, silicon oxide, etc.) is preferably used.
  • the “opening” of the nanopore or the pore refers to the opening circle of the nanopore or the pore where the nanopore or the pore contacts the sample solution. In the analysis of the biopolymer, biopolymers, ions, and the like in the sample solution enter the nanopore from one opening and go out of the nanopore from the same or opposite opening.
  • the size of the nanopore 202 can be selected according to the type of biopolymer to be analyzed.
  • the nanopore may have a uniform diameter, but may have a different diameter depending on the site.
  • the nanopore may be connected to a pore having a diameter of 1 ⁇ m or more.
  • the nanopore provided in the thin film of the substrate 203 has a minimum diameter portion, that is, the smallest diameter of the nanopore has a diameter of 100 nm or less, for example, 1 nm to 100 nm, preferably 1 nm to 50 nm, for example 1 nm to 10 nm, specifically 1 nm. It is preferably 5 nm or less, 3 nm or more and 5 nm or less.
  • the diameter of ssDNA is about 1.5 nm, and an appropriate range of the nanopore diameter for analyzing ssDNA is about 1.5 to 10 nm, preferably about 1.5 to 2.5 nm.
  • the diameter of dsDNA double-stranded DNA
  • an appropriate range of the nanopore diameter for analyzing dsDNA is about 3 nm to 10 nm, preferably about 3 nm to 5 nm.
  • the nanopore diameter corresponding to the outer diameter of the biopolymer can be selected.
  • the depth (length) of the nanopore 202 can be adjusted by adjusting the thickness of the substrate 203 or the thin film of the substrate 203.
  • the depth of the nanopore 202 is preferably a monomer unit constituting the biopolymer to be analyzed.
  • the depth of the nanopore 202 is preferably a size of one base or less, for example, about 0.3 nm or less.
  • the shape of the nanopore 202 is basically circular, but may be elliptical or polygonal.
  • At least one nanopore 202 can be provided on the substrate 203, and when a plurality of nanopores 202 are provided, they may be regularly arranged.
  • the nanopore 202 can be formed by a method known in the art, for example, by irradiating an electron beam of a transmission electron microscope (TEM) and using a nanolithography technique or an ion beam lithography technique.
  • TEM transmission electron microscope
  • the chamber section includes a sample introduction section 204 and a sample outflow section 205, a substrate 203, a voltage applying means, and electrodes 213 and 214 for allowing the sample 212 to pass through the nanopore 202.
  • the chamber section includes a sample introduction section 204 and a sample outflow section 205, a first electrode 213 provided in the sample introduction section 204, a second electrode 214 provided in the sample outflow section 205, first and second. Voltage application means for the other electrodes.
  • An ammeter may be disposed between the first electrode 213 provided in the sample introduction section 204 and the second electrode 214 provided in the sample outflow section 205.
  • the current between the first electrode 213 and the second electrode 214 may be appropriately determined in terms of determining the nanopore passage speed of the sample 212.
  • an ionic liquid not including the sample 212 is used, If there is, it is preferably about 100 mV to 300 mV, but is not limited thereto.
  • the electrodes 213 and 214 are made of metal, for example, platinum group such as platinum, palladium, rhodium, and ruthenium, gold, silver, copper, aluminum, nickel, etc .; graphite, for example, graphene (which may be either a single layer or multiple layers), tungsten, It can be made from tantalum or the like.
  • a conductive thin film 215 may be prepared near the nanopore to generate a near field and enhance it.
  • the conductive thin film 215 placed in the vicinity of the nanopore is formed in a planar shape as is apparent from the definition of the thin film.
  • the thickness of the conductive thin film 215 is 0.1 nm to 10 nm, preferably 0.1 nm to 7 nm, depending on the material used. As the thickness of the conductive thin film 215 is smaller, the generated near field can be limited, and analysis with high resolution and high sensitivity becomes possible.
  • the size of the conductive thin film 215 is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the size of the solid substrate 203 and nanopore 202 to be used, the wavelength of excitation light to be used, and the like. If the conductive thin film 215 is not flat and has a bend or the like, a near field is induced at the bend and light energy leaks, and Raman scattered light is generated at a location outside the target. That is, background light increases and S / N decreases. Therefore, the conductive thin film 215 is preferably planar, in other words, the cross-sectional shape is preferably linear without bending. Forming the conductive thin film 215 in a planar shape is not only effective in reducing the background light and increasing the S / N ratio, but is also preferable from the viewpoint of uniformity of the thin film and reproducibility in production.
  • the sample introduction section 204 and the sample outflow section 205 are filled with liquids 210 and 211 introduced via inflow paths 206 and 207 connected to both sections, respectively.
  • the liquids 210 and 211 flow out from the outflow paths 208 and 209 connected to the sample introduction section 204 and the sample outflow section 205.
  • the inflow paths 206 and 207 may be provided at positions facing each other with the substrate interposed therebetween, but the present invention is not limited to this.
  • the outflow paths 208 and 209 may be provided at positions facing each other across the substrate, but are not limited thereto.
  • the liquid 210 is preferably a sample solution containing a sample 212 to be analyzed.
  • the liquid 210 preferably contains a large amount of ions that play a charge (hereinafter referred to as ionic liquid).
  • the liquid 210 preferably contains only an ionic liquid other than the sample.
  • an aqueous solution in which an electrolyte having a high degree of ionization is dissolved is preferable, and a salt solution such as an aqueous potassium chloride solution can be suitably used.
  • the sample 212 has a charge in the ionic liquid.
  • Sample 212 is typically a nucleic acid molecule.
  • the sample introduction section 204 and the sample outflow section 205 are provided with electrodes 213 and 214 arranged to face each other with the nanopore 202 in between.
  • the chamber unit also includes voltage applying means for the electrodes 213 and 214. By applying the voltage, the charged sample 212 passes from the sample introduction section 204 through the nanopore 202 and moves to the sample outflow section 205.
  • the Raman scattering spectrum enhanced by the conductive thin film 215 is effectively collected by the immersion medium 216, and the Raman light is collected through the objective lens 217. To be analyzed.
  • the upper part is a sample introduction section and the lower part is a sample outflow section, but the lower part may be a sample introduction section and the upper part may be a sample outflow section, and a sample passing through the nanopore may be detected.
  • FIG. 3 shows an embodiment of the method of the present invention.
  • One feature of the method for constructing a nucleic acid molecule of the present invention is that a target sequence of a target nucleic acid is amplified, and the target sequence is repeated and constructed in a single strand (single molecule).
  • At least one of the prepared primer pairs is a primer 300 having a hairpin structure.
  • the 3 ′ end side of the primer 300 is a primer sequence structure of a single-stranded region having a sequence complementary to the sequence of the template DNA containing the target sequence, and has a structure protruding from the stem portion.
  • the primer 300 for amplification of the target sequence is a hairpin primer
  • the primer 303 for amplification of the complementary strand of the target sequence may be a hairpin primer or may be a primer having no hairpin structure.
  • the primer 303 can be used for amplification of the target sequence
  • the hairpin primer 300 can be used for amplification of the complementary strand of the target sequence.
  • any of the above-described aspects can be used in the method of the present invention for analyzing any one of the double-stranded nucleic acids as a target sequence, depending on the embodiment.
  • the primer 303 in comparison with the hairpin primer 300, is described as a “paired primer” in this specification.
  • DNA derived from a sample containing the target sequence itself can be used as it is, but the template DNA should contain a sequence capable of forming a completely complementary strand with the hairpin primer so that it can be suitably used by the method of the present invention.
  • the target sequence can also be linked to the synthesized sequence.
  • Primers having a hairpin structure having a loop portion and a stem portion are known, and examples of sequences thereof include, for example, IANAzarenko .et al. 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 12 The example of arrangement
  • a person skilled in the art can appropriately design and prepare a hairpin primer suitable for amplification once the template DNA to be amplified including the target sequence is identified.
  • the primer 300 having a hairpin structure is denatured and annealed to the target sequence of the target nucleic acid (for example, human genome).
  • the target nucleic acid for example, human genome
  • a solution containing a target nucleic acid as a mixture of reaction solutions, a primer set sandwiching a target sequence (one or both sides being the above-described hairpin primer 300), polymerase Prepare a salt composition solution according to the polymerase.
  • the DNA polymerase to be used is not limited.
  • a polymerase isolated from a thermophilic bacterium represented by Taq DNA polymerase which is classified into family A (PolI type), or a super-preferred typified by KOD DNA polymerase.
  • Polymerases isolated from heat archaea and those classified as family B ( ⁇ type) can be used.
  • Bst DNA polymerase Bca (exo-) DNA polymerase, Klenow fragment of DNA polymerase I, ⁇ 29 phage DNA polymerase, Vent DNA polymerase, Vent (Exo- ) DNA polymerase (Vent ⁇ DNA polymerase excluding exonuclease activity), DeepVentDNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase (DeepVent DNA polymer excluding exonuclease activity), MS-2 phage DNA polymerase, Z- Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like are generally known and can be suitably used.
  • DNA polymerase mutants While having the catalytic activity required by the above-mentioned DNA polymerase, use only a part of the structure and other functions, or various mutants whose catalytic activity, stability, or heat resistance has been modified by amino acid mutation, etc. May be. As long as various DNA polymerase mutants have sequence-dependent complementary strand synthesis activity, strand displacement activity, and the like, they can be used in the present invention and are not limited to the above examples.
  • the method of the present invention is a technique for increasing the reading accuracy of a sequencer by reading a sequence made by synthesis a plurality of times, a polymerase with high synthesis accuracy is preferable.
  • a polymerase with high synthesis accuracy is preferable.
  • the synthesis accuracy of PrimeSTAR (registered trademark) Max, PrimeSTAR (registered trademark) HS, etc. (manufactured by Takara Bio Inc.) with high synthesis accuracy is 99.995% or more. These have sufficient accuracy to detect 1-0.1% mutations so that a synthesis error at the amplification stage does not affect mutation detection.
  • step (2) of FIG. 3 the mixture of (1) is heated to an appropriate denaturation temperature, each primer is annealed to the target nucleic acid, and an extension reaction is performed (step (3)).
  • the extended double-stranded amplification product is dissociated under denaturing conditions, and then annealed again to each primer to be extended. This process is repeated.
  • the loop part of the hairpin primer is also included in the extended double-stranded amplification product by forming a base pair (step (4)).
  • a single-stranded nucleic acid having a hairpin structure can be formed by intramolecular annealing. This reaction competes with a reaction for forming a new complementary strand by intermolecular annealing with the unreacted hairpin primer 300.
  • a complementary strand sequence portion 301 stem that forms a hairpin structure at the 3 ′ end is used.
  • the annealing of part occurs preferentially over the annealing with the unreacted hairpin primer 300.
  • the complementary strand arrangement part 301 (stem part) is given priority by designing it to be lower than the Tm value of 301 (stem part) and giving a temperature gradient so as to lower the temperature from the denaturation process to the annealing and extension process.
  • the stem part of the hairpin primer has a Tm value higher than that of the single-stranded part.
  • Tm melting temperature
  • the complementary strand sequence part 301 when designing a sequence in which the Tm value of the single-stranded part of the hairpin primer is 60 ° C., if the Tm value of the stem part is set to 70 ° C., the complementary strand sequence part 301 will preferentially anneal and repeat the target sequence. It becomes possible to preferentially obtain a single-stranded nucleic acid having a hairpin structure.
  • the state of double-stranded DNA changes at a Tm value of ⁇ 5 ° C.
  • the difference in Tm value between the single chain portion and the stem portion may be set to 15 ° C. or more.
  • the temperature difference may be 15 ° C. or less, more preferably about 10 ° C. Therefore, as one embodiment of the method of the present invention, the stem part of the hairpin primer 300 has a Tm value that is 5 ° C. or more, 10 ° C. or more, or 15 ° C. or more higher than the Tm value of the single-stranded part of the hairpin primer 300.
  • the stem portion of the hairpin primer 300 is about 5 ° C., about 6 ° C., about 7 ° C., about 8 ° C., about 9 ° C., about 10 ° C., about 11 ° C. than the Tm value of the single-stranded portion of the hairpin primer 300. , About 12 ° C, about 13 ° C, about 14 ° C, about 15 ° C.
  • betaine N, N, N-trimethylglycine
  • betaine N, N, N-trimethylglycine
  • it is possible to change the state of double-stranded DNA in a narrower temperature range (William A. Rees et al. Biochemistry 1993, 32,137-144), may be added to the reaction solution.
  • the Tm value or the state of double-stranded DNA at each temperature varies depending on conditions such as pH and salt concentration, and also depends on the base sequence and length. It can be calculated based on the length of the sequence and the GC content. A person skilled in the art can appropriately set the Tm value of each part in the primer design, design and produce an optimal primer, and design the reaction temperature as appropriate.
  • the concentration of the hairpin primer 300 decreases as the reaction cycle proceeds without performing the above-described steps, the primer 300 is depleted, so that the complementary strand arrangement unit 301 is preferentially annealed.
  • the concentration may be adjusted as appropriate.
  • the synthesized complementary strand sequence performs an extension reaction using itself as a template.
  • the composition when the hairpin primer having the sequence structure shown in Table 1 and the polymerase and salt composition solution 100 ⁇ l is used, for example, 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) 50 mM KCl 2 mM MgCl 2 200 ⁇ M each dNTP 5U Pfu exo -DNA polymerase (polymerase without 3'-5 'exonuclease activity) And the synthesis reaction is carried out under the following temperature conditions.
  • one of the paired primers is a hairpin primer 300, but both of the paired primers may be subjected to the same reaction process using a primer having a hairpin structure.
  • the time for constructing the nucleic acid molecule depends on the temperature in the synthesis reaction, the reaction time, the cycle, and the performance of the thermal-cycler, but the reaction shown in FIG. 3 is completed within approximately 30 to 90 minutes. .
  • the reaction solution contains unreacted primers, etc., but using the gel filtration resin-filled spin column CHROMA SPIN Column (Takara Bio), the unreacted primer was removed in about 10 minutes, and the synthesized target sequence It is possible to take out only the nucleic acid molecule that repeats the above and proceed to the step of determining the base sequence.
  • double-stranded products (5a) are mixed with single-stranded nucleic acid molecules (5b) having a hairpin structure.
  • the presence of double-stranded nucleic acid molecules at the time of sequence analysis is not preferred for sequence analysis using a sequencer using nanopores (for example, 2 nm or less in diameter) that allow single-stranded DNA to pass through and detect each base. Therefore, for example, in the synthesis step shown in FIG. 3, one of the two primers used may be a primer 303 having no hairpin structure, and the sequence of the primer 303 may be an AT-rich sequence in which the complementary strand sequence is easily dissociated. .
  • the structure may be such that when the product passes through the nanopore, the complementary strand sequence is dissociated by heat, alkali, or the like, and the nanopore is easily passed as single-stranded DNA.
  • the reaction shown in FIG. 3 can be performed after preparing the RNA sequence at the 5 ′ end using a hybrid chimeric primer composed of DNA-RNA as the primer 303.
  • the RNA that forms the DNA-RNA hybrid duplex is cleaved using RNaseH enzyme, etc., to create a site where the end of the reaction product becomes single-stranded DNA, and it can be easily integrated into the nanopore. You may let it pass from the location of strand DNA.
  • the negatively charged DNA is electrically drawn to the anode side via the nanopore. Double-stranded DNA is formed with hydrogen bonds and may be drawn in while dissociating the hydrogen bonds.
  • the speed of passing through the nanopore is slow, and it is possible to pass through a portion that becomes a sufficient detection field over a sufficient time. That is, the speed at which DNA passes through the nanopores can be controlled by adjusting the heat, alkali, or pulling force of the hydrogen bonding force that forms a double strand.
  • the method of the present invention synthesizes a complementary strand sequence based only on the target sequence (double-stranded single DNA strand), and subsequently synthesizes the complementary strand sequence of the synthesized sequence to produce a single-stranded nucleic acid.
  • Molecules are constructed and used to detect them with a nanopore sequencer. This is because if it is difficult to decipher the base sequence by analyzing only one strand of the target sequence, for example, if there is a signal that is similar between bases, even if the signal obtained is uncertain, Can be obtained.
  • the sequence information of only one strand of the same target sequence is read twice, so it has high accuracy with the information read twice. It shows that nucleic acid sequence analysis is possible. Even if the device to be detected (for example, a detector or a lens) is not an expensive and high-accuracy object, a device that can obtain sufficient accuracy by reading multiple times, that is, a burden on the device (for example, functional) ) And the method of the present invention is also a method that allows the device for sequencing to be an inexpensive or miniaturized device.
  • Analysis with a nanopore sequencer can be performed from the 5 'side or the 3' side in the case of single-stranded nucleic acid molecules.
  • the hairpin amplification product shown in FIG. 3 (5b) is first analyzed from the sequence information of the primer, and then read from the 5 ′ side.
  • the target sequence, hairpin primer sequence, target sequence (complementary sequence), and primer sequence (complementary sequence) are analyzed in this order.
  • the base sequence information derived from each primer sequence and the signal information of the base sequence are known, a peak is obtained in advance with which signal (wavelength, wave number or current value). Since it is known in which order the peak corresponding to the signal corresponding to each base is obtained, detection calibration can be performed in real time. For example, when detecting Raman scattered light, spectral information based on known Raman scattered light can be obtained sequentially, so if the information obtained from the spectral peak cannot be obtained at the position of the element that is originally obtained, for example, the position of the detecting element is calibrated. May be.
  • a plurality of Raman spectrum peaks obtained from a known array part can be used not only for position calibration of the above-described element but also for detection of contamination and carryover.
  • the sequence of the hairpin portion of the hairpin primer 300 used for analysis is changed for each sample.
  • the sequence of the hairpin portion of the hairpin primer 300 used for analysis is changed for each sample.
  • contamination between samples and the previous time at the time of analysis are analyzed.
  • the analysis sample can be recognized and analyzed.
  • calibration may be performed using a current value obtained from each base of each known primer sequence and a background signal value.
  • a current value obtained from each base of each known primer sequence For example, it is particularly effective when the background signal value fluctuates during measurement.
  • the signal value immediately before the nucleic acid passes is used as the background signal value, and the current value changes greatly when the nucleic acid molecule is incorporated. Therefore, the current value is measured by subtracting the background signal value before the nucleic acid molecule is incorporated.
  • a known base sequence aligned with ACGT is measured in order, after subtracting the background signal value from the signal intensity of each base, the signal intensity ratio or signal change due to the known sequence is used as a reference value, and is obtained at the target sequence part.
  • the base may be determined by comparing the obtained signal value with the reference value.
  • the calibration method is not limited to these. This is a method of calibrating or analyzing based on a known signal value or signal information obtained from a known arrangement, or an actual measurement signal obtained from a known arrangement obtained from a known arrangement. A person skilled in the art can appropriately modify the method of the present invention based on the above description.
  • the example of determining the nucleic acid base sequence by detecting Raman scattered light has been mainly shown.
  • the method of the present invention is not limited to this, for example, a nucleic acid base for detecting a blocking current when passing through a nanopore.
  • Sequencing method (US2011 / 0229877, US2011 / 0177498, etc.), nucleobase sequencing method to detect tunneling current generated when passing through nanopore (JP 2014-20837), single molecule nucleobase sequencing using droplet (WO2014111723A, WO2014053854A), a nucleobase sequencing method that detects a single molecule of a fluorescently labeled pyrophosphate [PPi] moiety released from a nucleotide triphosphate [NTP] when a polymerase extension product is produced ( Patent No. 4638043) can use the nucleic acid molecule obtained by the method of the present invention. Even if the target sequence reading accuracy is low, multiple target sequence information is included in the molecule. Therefore, it is possible to show a highly accurate analysis result by analyzing one molecule, and the burden on the detection device side (for example, functional Can be reduced.
  • Example 1 the nucleic acid molecule constructed when the hairpin primer is used in only one of the molecules shown in (4) and (5b) of FIG. In this example, about half of the molecules capable of detecting the target sequence shown in FIG. 3 (5b) twice are constructed, but the total number of constructed molecules can detect the target sequence twice. How to build a simple molecule.
  • FIG. 4 shows the procedure.
  • a process similar to that shown in FIG. 3 is performed before the process shown in FIG.
  • a difference from the process shown in FIG. 3 is that the amplification process shown in FIG. 3 is performed by biotinylating the primer 303 that forms a pair with the hairpin primer 300.
  • a spacer (for example, a base or the like) of about 5 carbon atoms may be included in order to reduce an amplification obstacle in the synthesis using a polymerase generated by the biotin three-dimensional structure accompanying the biotinylation of the primer.
  • biotinylated primer 300 for example, 40 ⁇ l of the reaction product amplified in the step shown in FIG. 3 is mixed with magnetic beads (eg, Dynabeads® M-280 Streptavidin) provided with streptavidin, and suspended. Incubate for 15 minutes at room temperature to allow amplification product to bind to magnetic beads.
  • magnetic beads eg, Dynabeads® M-280 Streptavidin
  • a magnet is installed outside the reaction vessel, and only the supernatant is removed while the magnetic beads are attracted and fixed to the magnet side across the reaction vessel, and the washing solution is added and suspended, drawn by the magnet, and the supernatant is removed.
  • Perform the washing operation When this washing operation is performed, the washing solution is kept at 60 ° C. or higher or 95 ° C. or higher, so that the DNA strand existing in the complementary strand of the DNA strand bound to the magnetic beads is washed away along with the dissociation of the double-stranded DNA, and magnetic It is possible to isolate only the DNA strand bound to the bead, ie the molecule extended from the biotinylated primer. Alternatively, the same effect can be obtained by washing while dissociating the double-stranded DNA with an alkaline solution.
  • a molecule is constructed in which the total number of molecules can detect the target sequence twice. For example, add a solution of the following composition when the reaction solution is 100 ⁇ l to the isolated DNA strand, 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) 50 mM KCl 2 mM MgCl 2 200 ⁇ M each dNTP 5U Pfu exo -DNA polymerase (polymerase without 3'-5 'exonuclease activity) The reaction is carried out under the following temperature conditions.
  • the hairpin structure is constructed by annealing at 30 ° C. for 30 seconds and at 60 ° C. for 45 seconds to anneal the sequence portion having the complementary strand at the 3 ′ end, and the elongation reaction is carried out by heating at 72 ° C. for 90 seconds or more.
  • reaction conditions are not limited to the above reaction conditions, and the temperature, time, cycle, etc. may be changed depending on the target sequence or primer sequence.
  • purification process which removes a salt and an enzyme between the reaction of each process was not described, you may implement if needed depending on the case.
  • the magnetic beads When performing nanopore sequencing, if the sequencing efficiency is reduced by the bound magnetic beads, the magnetic beads may be separated from the nucleic acid molecule. For example, a spacer region provided between the primer and biotin may be cleaved. As a cleavage method, for example, a restriction enzyme cleavage sequence may be included in advance in the base sequence of the spacer region, and cleavage may be performed before sequencing. Thereby, nanopore sequencing can be performed using a sample obtained by separating a DNA strand and a magnetic bead.
  • FIG. 5 shows the procedure.
  • This embodiment is characterized in that the 5 ′ end of the hairpin primer is phosphorylated before use, and the DNA strand phosphorylated at the 5 ′ end after the construction of the target nucleic acid molecule is degraded.
  • Degradation is not particularly limited, but for example, ⁇ exonuclease is used.
  • the process similar to FIG. 3 is performed before the process shown in FIG.
  • the difference from the process shown in FIG. 3 is that the 5 ′ end of the hairpin primer 300 is phosphorylated, and the amplification process shown in FIG. 3 is performed without phosphorylating the paired primer 303.
  • salts and primers in the amplification reaction solution are removed.
  • the removal method is not limited, but for example, NucleoSpin (registered trademark) Gel and PCR Clean-up (manufactured by Takara Bio Inc.), which is a commercially available kit that is purified by immobilizing an amplification product on a silica membrane and centrifuging it, may be used.
  • Lambda exonuclease is an enzyme that is characterized by digesting from the phosphorylated 5 'end of double-stranded DNA and releasing mononucleotides. Double-stranded DNA phosphorylated at the 5 'end is a good substrate. Using this property, ⁇ exonuclease (manufactured by NEB) was added to the amplification product, and the reaction solution was adjusted with a buffer composition of 67 mM glycine-KOH (pH 9.4), 2.5 mM MgCl 2 , 50 ⁇ g / ml BSA, and 37 Incubate at 30 ° C for 30 minutes.
  • the solution subjected to the ⁇ exonuclease reaction is adjusted to a solution having the following composition, for example. 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) 50 mM KCl 2 mM MgCl 2 200 ⁇ M each dNTP 5U Pfu exo -DNA polymerase (polymerase without 3'-5 'exonuclease activity)
  • the reaction is carried out under the following temperature conditions with the above composition.
  • the higher-order structure is loosened by heating at 94 ° C for 5 minutes.
  • the hairpin structure is constructed by annealing the sequence portion having the complementary strand at the 3 ′ end at 95 ° C. for 30 seconds and at 60 ° C. for 45 seconds.
  • This reaction is not limited to the reaction conditions shown above. The temperature, time, cycle and the like may be changed depending on the target sequence and the sequence of the hairpin structure.
  • the nucleic acid molecule prepared in the present example can detect the target sequence twice during sequencing, and a highly accurate base sequence can be obtained.
  • FIG. 6 shows the procedure.
  • the process similar to FIG. 3 is performed before the process shown in FIG.
  • the difference from the process shown in FIG. 3 is that the 3 ′ end of the reaction product is 1 base of adenine by performing the step of “90 seconds at 72 ° C.” in the extension reaction for a sufficiently long time (for example, 5 minutes or longer).
  • a protruding structure can be intentionally formed.
  • TA cloning is performed on the reaction product thus formed by linking an adapter 601 having a terminal structure with a protruding thymine base at the 3 'end and a hairpin structure.
  • this adapter 601 is formed between a portion (double-stranded DNA) that binds (ligates) with the reaction product in the previous step and a portion that forms a hairpin loop (for example, a sequence as shown in Table 1).
  • a hairpin loop for example, a sequence as shown in Table 1
  • it has a structure that is connected only by a single strand. This has a structure in which the 3 'end from the hairpin loop to the portion binding to the reaction product is interrupted.
  • the connection with the adapter 601 by TA cloning is shown, but the connection method is not limited to this.
  • a cloning system using topoisomerase for example, StrataClone PCR cloning system using Cre recombinase derived from DNA topoisomerase I ⁇ ⁇ and bacteriophage P1 (Agilent) or TOPO (registered trademark) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Cloning (Life Technologies), etc. Ligation may be performed using cloning techniques.
  • the ligated reaction product is subjected to an extension reaction using a strand displacement polymerase.
  • This reaction is incubated at a temperature (for example, 60 ° C.) capable of forming a base pair bond to a complementary base sequence from the 3 ′ end of the adapter 601 and maintaining the enzyme activity at which the strand displacement reaction occurs. .
  • the incubation time may be adjusted depending on the base length for the extension reaction.
  • the conditions that cause base pair binding at various places are generally set to, for example, the melting temperature or lower, and are the same as those used in the PCR method and the LAMP method.
  • the elongation due to this strand displacement reaction may include buffering agents that give a pH suitable for the enzyme, salt components used for maintaining the catalytic activity and annealing of the enzyme, enzyme protecting agents, and melting temperature adjusting agents as necessary. May be carried out under the condition of coexistence.
  • a neutral to weakly alkaline buffering agent such as Tris-HCl may be used. Adjust the pH according to the characteristics of the enzyme (DNA polymerase) used.
  • As the salt component KCl, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4, or the like may be appropriately added in order to maintain the activity of the enzyme and adjust the melting temperature of the nucleic acid.
  • saccharides or bovine serum albumin may be used for protecting the enzyme.
  • Dimethyl sulfoxide (DMSO) and formamide are generally used to adjust the melting temperature.
  • a melting temperature adjusting agent for these, annealing from the 3 ′ end can be adjusted under limited temperature conditions.
  • betaine N, N, N-trimethylglycine
  • proline, trimethylamine N-oxide and the like are known as melting temperature adjusting agents. By causing destabilization of double-stranded DNA, strand displacement efficiency can be improved.
  • the amount of betaine added is preferably about 0.2 to 3.0 M, more preferably about 0.5 to 1.5 M in the reaction solution, and the promotion of the nucleic acid amplification reaction of the present invention can be expected. Since these melting temperature adjusting agents act in the direction of lowering the melting temperature, conditions for giving an appropriate reaction are set empirically in consideration of other reaction conditions such as salt concentration and reaction temperature.
  • the extension reaction may proceed as long as the reaction takes place.
  • the 3 'end structure that leads the extension reaction undergoes self-annealing, or the reaction jumps to its own base sequence in the vicinity.
  • ddNTP (dideoxynucleoside triphosphate) may be included at a certain concentration in addition to dNTP (deoxynucleoside triphosphate) as a substrate for DNA polymerase. good.
  • the length of the template to be amplified can be limited by the concentration of ddNTP contained. For example, if the extension reaction continues via a loop structure, the extension reaction can be stopped by incorporating ddNTP during the strand displacement reaction by containing a high concentration of ddNTP.
  • ddNTP concentration may be adjusted according to the required extension product length. Depending on the concentration adjustment of ddNTP, it is possible to repeat the target sequence information more than 4 times. However, excessive repeat structure results in the formation of higher order structure, which can affect the passage of nanopores. The number of repetitions may be properly used depending on the configuration of the sing.
  • Extension due to the progress of the strand displacement reaction without limitation can be controlled using ddNTP as described above, but the control method is not limited thereto.
  • the strand displacement polymerase reaction stops at the abasic site. Therefore, the length of the nucleic acid molecule produced by abasic control can be controlled.
  • the hairpin loop structure portion of the adapter 601 can contain a molecule that inhibits the elongation reaction by polymerase.
  • a molecule that inhibits the elongation reaction by polymerase By preparing the inhibitor molecule, it is possible to inhibit the elongation reaction by the polymerase during the elongation reaction and to prevent the elongation without restriction.
  • the structure of the inhibitor molecule is not particularly limited as long as it can inhibit the elongation reaction by polymerase, but preferably contains, for example, a nucleic acid derivative or a non-nucleic acid derivative.
  • nucleic acid derivative in addition to the above abasic, a nucleic acid having a structure that sterically inhibits the progress of polymerase, such as a strong higher-order structure that is not dissociated by a strand displacement enzyme or a pseudoknot structure, an L-type nucleic acid, 3- Deoxy-2-hydroxy-dN, modified base nucleic acid, damaged base nucleic acid, phosphate binding site modified nucleic acid, RNA, 2′-OMe-N, BNA (LNA), and derivatives thereof.
  • a nucleic acid having a structure that sterically inhibits the progress of polymerase such as a strong higher-order structure that is not dissociated by a strand displacement enzyme or a pseudoknot structure
  • L-type nucleic acid 3- Deoxy-2-hydroxy-dN, modified base nucleic acid, damaged base nucleic acid, phosphate binding site modified nucleic acid, RNA, 2′-OMe-N, BNA (LNA), and derivatives thereof.
  • the nucleic acid molecule prepared in this example can detect the target sequence four times during sequencing, and can determine the base sequence with higher accuracy.
  • the nucleic acid molecules constructed in Example 4 can be mixed with nucleic acid molecules that repeat the target sequence twice or four times.
  • a method for constructing a nucleic acid molecule in which the total number of molecules repeats the target sequence four times will be described.
  • FIG. 7 shows the procedure.
  • the generated reaction product is a nucleic acid molecule in which the total number of molecules contains the target sequence repeated twice, and using this, a nucleic acid molecule that repeats the target sequence four times is constructed.
  • connection method with the adapter is not particularly limited.
  • an extension reaction using a strand displacement polymerase is performed.
  • incubation is performed at a temperature capable of forming a base pair bond to a complementary base sequence from the 3 ′ end and maintaining an enzyme activity in which a strand displacement reaction occurs.
  • the conditions that cause base pair binding at various places are generally set to, for example, the melting temperature or lower, and are the same as those used in the PCR method and the LAMP method.
  • the strand displacement reaction shown here the reaction is performed in consideration of the same points as the strand displacement reaction shown in Example 4.
  • the nucleic acid molecule prepared in this example can detect the target sequence four times during sequencing, and can determine the base sequence with higher accuracy.
  • Example 6 describes a construction method that also takes into account the efficient introduction of the nucleic acid molecules constructed in Examples 1 to 5 into the nanopore.
  • the terminal structure of the nucleic acid molecule constructed by the methods of Examples 1 to 5 is in the form of double-stranded DNA.
  • the double-stranded single-stranded DNA is used. By dissociating into two, the efficiency of introduction into the nanopore with the diameter size of single-stranded DNA is improved.
  • the ends of the molecules generated by the nucleic acid molecule construction methods shown in Examples 1 to 5 are, for example, double-stranded DNA having the sequence of the primer 303 that makes a pair with the hairpin primer 300 in the reaction shown in FIG. It has a structure, and as it is, it does not easily enter the nanopore which is the diameter size of single-stranded DNA. Therefore, by changing the sequence of the primer 303 to a sequence 701 (FIG. 7) rich in the sequence of AT (adenine and thymine) that tends to become a single-stranded DNA upon denaturation, the single-stranded DNA can be easily converted into a base sequence. It becomes easy to introduce into the nanopore structure.
  • the reaction shown in FIG. 3 is performed as a DNA-RNA chimeric primer having RNA at the 5 'end of the hairpin primer 300, and the reactions shown in the respective examples are performed.
  • RNaseH a ribonuclease
  • RNaseH a ribonuclease
  • the hairpin primer 300 is provided with a random sequence 801, whereby the nucleic acid molecule derived from the amplification is recognized by the random sequence 801, and the determination accuracy of the sequence of the derived nucleic acid molecule is increased. Will be explained.
  • the hairpin primer 300 is given a random sequence 801.
  • this random sequence 801 is used as the location of the double-stranded forming sequence of the hairpin primer 300.
  • a 10-base-pair random sequence is formed in the double-stranded sequence (stem part) at a location other than the sequence that is complementary to the target sequence, it is 4 to the 10th power (1,048,576) with 4 types of bases.
  • a hairpin primer having a random sequence of can be prepared. As a result, in the steps of FIGS.
  • nucleic acid molecule amplified using a nucleic acid molecule replicated with a certain random sequence 801 as a template is as shown in FIG. 8C (5).
  • an exponentially amplified nucleic acid molecule can be obtained while maintaining the sequence from which amplification was derived and the random sequence.
  • the nucleic acid molecules amplified from the hairpin primers 803 to 805 having different random sequences constitute a group of nucleic acid molecules having different random sequences (FIG. 8C).
  • the sequence of the nucleic acid molecule derived from the amplification is recognized by recognizing the corresponding portion (random sequence 801 and its complementary sequence 802) of the double-stranded formation sequence of the hairpin primer 300 together with the target sequence.
  • random sequence 801 and its complementary sequence 802 the corresponding portion of the double-stranded formation sequence of the hairpin primer 300 together with the target sequence.
  • FIG. 9 shows an example of the result of comparing the sequence analysis results of a plurality of nucleic acid molecules (01 to 05) having the same random sequence 901 and comparing the target sequences.
  • results that differ between the molecules can be detected. In that case, if it is a reading error at the time of sequence analysis, the presence of a base different from the reference sequence is indicated at random positions of some of the nucleic acid molecules (bases surrounded by a square in the figure). For example, if the amplified nucleic acid molecule 01 is analyzed as “G” and the other nucleic acid molecules 02 to 05 are analyzed as “C”, this is determined as a reading error (“C” in the reference sequence).
  • This method is particularly effective in detecting the abnormal cell-derived mutations slightly contained in the large amount of normal cell-derived genomic DNA described above.
  • the base length of the random sequence 801 is 10 bases, it is not limited to this.
  • the ratio of detection targets is small, by increasing the base length of the random sequence, more types of hairpin primers can be used in the reaction, and the detection targets (for example, abnormal cell-derived nucleic acids) and others ( It is possible to amplify without using a hairpin primer having the same random sequence in a normal cell-derived nucleic acid. That is, it is preferable that the hairpin primer has a random sequence species equal to or greater than the number of mutations in the target sequence.
  • the position of the random sequence 801 is defined as a double-strand forming sequence, but a random sequence including the loop portion of the hairpin may be formed.
  • the base length of the stem part of the hairpin primer can be in the range of 8 to 20 bases, for example, 16 to 18 bases.

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Abstract

　本発明は、ナノポアシーケンサによる核酸配列決定の為の一本鎖核酸分子の構築方法であって、3'側に一本鎖領域を含む少なくとも一つのヘアピンプライマーと、対をなすプライマーとを用いて標的配列を含む鋳型DNAの相補鎖を合成する工程と、合成された相補鎖が分子内にヘアピン構造を形成して自己を鋳型に伸長反応を行うようにする工程と、を含み、得られた核酸分子が標的配列及びその相補鎖の双方を配列中に含むものである、上記方法を提供する。　一本鎖構造とすることでナノポアシーケンシングによる解析が可能であり、また相補鎖の情報を含まない標的核酸のみの配列を繰り返し解析することとなるため、シーケンスエラーの問題に対処すると共により精度の高い解析を行うことができる。

Description

核酸分子の構築方法
　本発明は、核酸配列決定の為の核酸分子の構築方法に関する。より具体的には、ナノポアシーケンシングによる解析に適した一本鎖核酸分子の構築方法に関する。
　核酸の塩基配列の解析は、遺伝的疾患の原因遺伝子の検出、薬剤の有効性・副作用の評価、ガン疾患等に関連する遺伝子変異の検出等を目的として、近年非常に需要が大きくなってきている。解析の結果得られる情報は、従って、精度の高いものでなければならない。
　核酸分子の塩基配列を高精度に読み取る方法として、例えば、鋳型核酸セグメントのセンス鎖とアンチセンス鎖を連続核酸分子に配置する段階と、ポリメラーゼによる鋳型依存的シーケンシング法でセンス鎖とアンチセンス鎖の両方をシーケンシングする段階とを含む、鋳型核酸セグメントにおけるヌクレオチドのコンセンサス配列の決定方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１には、「鋳型の環状構成により、同一分子の複数回の反復シーケンシングが可能になる。換言するならば、シーケンシング法は完全連続配列に沿って進められ、相補配列からの各セグメントを繰返しシーケンシングすることにより、このセグメントの配列データと各セグメント内の配列データを繰返し獲得することができる。このような配列データの全部又は部分はその後、鋳型とその各種セグメントのコンセンサス配列を誘導するのに有用である。」（段落番号［００５５］）と記載されている。
　また、特許文献２は、二本鎖核酸領域を含み、配列決定の目的のために核酸の一本鎖構築物を作製するために使用し得るアダプターが開示されている。特許文献２には、「構築物が配列決定される際に、二本鎖核酸中のそれぞれの位置が、ただ１回だけ調べられるのではなく、実際には２回調べられることを確実にする。このことは、核酸の各位置を調べる上で、より高い確実性を与え、一回調べることで可能になるであろうものより、各位置における両方の塩基について、より高いスコアでの総合的なコールを与える。」（段落番号［００３８］）さらに「各位置を２回調べる能力は、確率論的センシングを用いてメチルシトシンとチミンを区別するためにも有用である。これらの２つの塩基は、膜貫通細孔を通過したり、膜貫通細孔と相互作用したりする際に、非常に類似する電流トレースをもたらす。従って、そのことは、これら２つの区別を困難にし得る。しかし、核酸の各位置を２回調べることにより、そのような区別が可能になるであろう、なぜなら、メチルシトシンに対する相補的な塩基はグアニンであり、一方、チミンに対する相補的な塩基はアデニンである。メチルシトシンは、言うまでもなく、癌を含む各種の疾患に関連を有する。」（段落番号［００４２］）と記載されている。
特表２０１１－５１５１０２号公報 特表２０１２－５１６１４６号公報
　特許文献１に記載の技術は、二本鎖核酸の片末端をヘアピンループで繋いだ分子か、もしくは両末端をヘアピンループで繋いだ環状分子である。片末端で繋いだ分子は、相補鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）各々の配列を一度ずつ読取った二つの結果を用いて塩基の判定精度を向上させる。しかしながら、この手法は、一方の核酸鎖にミスマッチ塩基対の様な変異が存在する場合や、シーケンスエラーが起きた場合、相補鎖配列を各一回読み取っただけでは、相補鎖の配列間の結果に差異が生じてしまう。
　このような差異が発生した場合、その箇所に変異が存在するのか、あるいはシーケンスエラーが起きたのかを判断することができず、相補鎖の塩基を各々１回調べるだけでは、高い確実性のある解析が出来ないという課題がある。また、両末端をヘアピンループで繋いだ環状分子においては、先行技術文献の様に何度も繰返しシーケンスすることによってシーケンシングエラーの問題を解決することは可能であり得るが、一本鎖核酸を解析するナノポアシーケンシング方法では環状分子を解析することが出来ないという課題がある。
　特許文献２においても同様に、二本鎖核酸の片末端をヘアピンループで繋いだ分子なので、同様に相補鎖各々を１回調べるだけでは、変異が存在するのかシーケンスエラーが起きたのか判断することが出来ないという課題がある。さらに、ヘアピンループ形成のためにライゲーション反応等を行うので、正しくヘアピンループが結合した核酸分子の構築効率が低い。効率を上げるために一晩（例えば8時間以上）の反応を行うことも可能だが、前処理に時間を要するという課題もある。
　上記課題を解決するために、本発明者等は、一本鎖核酸（単分子）内で標的とする片方の塩基配列のみが繰り返されている配列構造の核酸分子を構築する方法を検討し、本発明を完成するに到った。一本鎖構造とすることでナノポアシーケンシングによる解析が可能であり、また相補鎖の情報を含まない標的核酸のみの配列を繰り返し解析することとなるため、シーケンスエラーの問題に対処すると共により精度の高い解析を行うことができる。分子内で配列を繰り返す回数は多いほど判定精度が向上する。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］ナノポアシーケンサによる核酸配列決定の為の一本鎖核酸分子の構築方法であって、
　　3'側に一本鎖領域を含む少なくとも一つのヘアピンプライマーと、該ヘアピンプライマーと対をなすプライマーとを用いて標的配列を含む鋳型DNAの相補鎖を合成する工程と、
　　合成された相補鎖が分子内にヘアピン構造を形成して自己を鋳型に伸長反応を行うようにする工程と
を含み、得られた核酸分子が標的配列及びその相補鎖の双方を配列中に含むものである、上記方法。
［２］前記ヘアピンプライマーのステム部が、前記一本鎖部のTm値より高いTm値を有する、［１］に記載の方法。
［３］反応の進行によるヘアピンプライマーの減少と共に、合成された相補鎖配列が自己を鋳型に伸長反応を行う、［１］に記載の方法。
［４］ヘアピンプライマーの5'末端を使用前にリン酸化し、目的の核酸分子の構築後に5'末端がリン酸化したDNA鎖を分解する工程を更に含む、［１］に記載の方法。
［５］λエキソヌクレアーゼを使用して前記分解を行う、［４］に記載の方法。
［６］5'末端がリン酸化したDNA鎖の分解後、その相補鎖の3'末端からヘアピン構造を介して自己アニールする伸長反応を行う、［４］に記載の方法。
［７］ヘアピンループ構造をもつアダプタを前記生成物と連結し、鎖置換反応を行って核酸分子を伸長させる工程を更に含む、［１］に記載の方法。
［８］ヘアピンループ構造をもつアダプタを前記生成物と連結し、鎖置換反応を行って核酸分子を伸長させる、［６］に記載の方法。
［９］前記対をなすプライマーから形成された末端を固定化し、相補鎖DNAを解離させた後に伸長反応を行う、［１］に記載の方法。
［１０］前記アダプタのループ構造部が、伸長反応阻害分子を含む、［７］又は［８］に記載の方法。
［１１］前記対をなすプライマーがDNAとRNAのキメラ構造を有し、伸長反応後にRNAを分解する工程を更に含む、［１］に記載の方法。
［１２］［１］に記載の方法によって得られた核酸分子の塩基配列をナノポアシーケンサによって解析することを含む、核酸塩基配列決定方法。
［１３］配列決定工程において、核酸分子中に含まれる既知の塩基配列から得られる信号を元に検出器の校正を行う、［１２］に記載の方法。
［１４］配列決定工程において、核酸分子中に含まれる既知の塩基配列から得られる信号を元に解析を行う、［１２］に記載の方法。
［１５］二本鎖形成した反応物を用い、ナノポアを通過する反応物の速度を制御する、［１２］に記載の方法。
［１６］前記ヘアピンプライマーがランダム配列を有する、［１］に記載の方法。
［１７］前記ヘアピンプライマーが前記標的配列の変異の数以上のランダム配列種を有する、［１６］に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である国際出願PCT/JP2015/055529号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明の核酸分子構築方法は、下記に示す効果を有する。
　本発明の方法によって構築された核酸分子が配列決定される際、標的配列は、ただ１回だけ調べられるのではなく、標的配列と、その配列自身を鋳型に合成した相補鎖配列が連なった一本鎖核酸（単分子）によって複数回調べられる。このことは、核酸の標的配列を調べる上での高精度な分析を可能とする。より詳しくは、単分子内でゲノム構造上の相補鎖配列情報無しに片鎖の配列のみを鋳型に合成したものを繰返し調べることで、変異による塩基相違なのかシーケンスエラーによる塩基相違なのかを認識することが可能であり、高精度な核酸配列分析が可能となる。
　単分子の塩基配列の判定精度が高い事は、多量にある正常細胞由来のゲノムDNAの中に僅かに含まれる異常細胞由来の変異の検出を可能とする。例えば、血中に僅かに含まれるガン細胞由来の変異をもつDNAを検出したい場合、ある一定量の血液からDNAを抽出し、検出したい塩基配列箇所を含む核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法等を用いて増幅し、その核酸分子の塩基配列を決定することにより、変異が含まれるか否かを解析する（Couraud S.Clin Cancer Res. 2014 Sep 1;20(17):4613-24.）。
　ナノポアシーケンサを用いて単分子DNAの塩基配列を解析する場合、一回の読取による塩基配列の判定精度が90％の時、例えば正常細胞中に1％程度の僅かに含まれるガン細胞由来の変異をもつDNAを検出するのは難しい。1％程度の変異を検出するのにPCR法によって標的配列のみ増幅された1,000個の単分子DNAを検出（塩基配列を解読）する場合、塩基配列のなかで変異の無い箇所は１塩基辺り1,000回各単分子が検出される。この1,000回の内、塩基配列判定精度が90％である為に「およそ100回」は間違った塩基情報を検出する（但し間違う頻度はある一定程度ばらつく）。塩基配列の中で変異の有る箇所は、10％の間違った判定と1％の変異も含む為に1,000回中主たる判定される塩基と「およそ110回」異なる塩基が判定される。主たる判定と異なるこの「100回」と「110回」の差の出現頻度はバラつき（分布）を持つ為、この回数を持って変異有無の検出と判断するのは困難である。
　しかしながら、本発明の方法では、１回の検出による単分子DNAの塩基配列判定精度が90％だとしても、片鎖配列のみを鋳型に単分子内で繰返し調べることによって、例えば単分子の最終判定精度が99.9％になることにより、僅かに含まれる変異DNAの検出が可能となる。例えば最終判定精度が99.9％のとき、1,000個の単分子DNAを検出すると、変異の無い箇所と有る箇所での主たる判定と異なる塩基の出現頻度は1回と11回となり、この出現頻度差が大きく異なる為、出現頻度の差をもって変異有無の検出が容易になる。このように僅かに含まれる変異を検出するということは、疾患の早期発見につながるということでもある。
　また、本発明の方法は、ヘアピンプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を行っているため、例えばライゲーションによってヘアピン構造を連結する場合と比較してより高い効率でヘアピン構造を有する核酸分子を構築することができる。尚、増幅を繰り返す工程におけるエラーの確率は、シーケンスエラーと比較してはるかに低く、従って本発明の方法を用いた解析方法の精度は従来の方法と比較して非常に高いということができる。
本発明の方法に使用可能なナノポアラマンDNAシーケンサ装置の構成図の例である。 本発明の方法に使用可能なナノポアラマンDNAシーケンサ装置の検出部と観察容器の断面図の例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 本発明の方法における核酸分子構築工程を示す例である。 標的配列を比較した結果である。
　以下、本発明の方法を、図面を用いてより詳細に説明する。
　本発明は、ナノポアシーケンサによる核酸配列決定の為の核酸分子の構築方法に関する。より具体的には、本発明は、ナノポアシーケンサによる核酸配列決定の為の一本鎖核酸分子の構築方法であって、3'側に一本鎖領域を含む少なくとも一つのヘアピンプライマーと、該ヘアピンプライマーと対をなすプライマーとを用いて標的配列を含む鋳型DNAの相補鎖を合成する工程と、合成された相補鎖が分子内にヘアピン構造を形成して自己を鋳型に伸長反応を行うようにする工程と、を含み、得られた核酸分子が標的配列及びその相補鎖の双方を配列中に含むものである、上記方法に関するものである。
　尚、本発明の方法について記載する場合、「標的配列」とは、本明細書の記載を通じて、二本鎖核酸分子の場合には片方の鎖の配列のみを意味し、対象の核酸分子が二本鎖を形成している場合に「標的配列」の相補鎖については「標的配列」とは記載しないこととする。本発明の構築方法において「標的配列」に基づいて相補鎖が形成された場合、その相補鎖については「標的配列」あるいは「標的配列情報」と表現する場合がある。
　ナノポアシーケンサは、公知の技術であり、例えばWO2013/021815 A1に記載された装置を好適に使用することができる。
　図１では、内径約2nmのナノポアに核酸を進入させ、ナノポアに照射する励起光と、ナノポア近傍に存在する導電性薄膜によってナノポアを通過する生体ポリマー（例えばDNA）のラマン散乱光が増大した後、ラマンスペクトルを検出する装置１００の例を用いた方法を説明する。
　ここではラマンスペクトルを検出するナノポアシーケンサを例に示すが、一本鎖の単分子を解析する手法全般に適応可能である。例えば、ナノポアを通過するときの封鎖電流またはトンネル電流を検知するDNAシーケンサや蛍光を検知するナノポアDNAシーケンサにも適応可能な核酸分子構築方法である。
　図１では、正立型顕微鏡を基本構成としたラマン光の観察に適用した場合を示す一例として、装置の構成と動作を説明する。装置構成は、特に正立型顕微鏡の基本構成に限定されるものではなく、倒立型顕微鏡を基本構成とした顕微鏡等、照射光による試料の信号検出を可能とする構成で有れば良い。
　光源は、蛍光もしくはラマン散乱光を発生させることができる波長の外部光（励起光）を照射する。当技術分野で公知の光源１０１を使用することができる。例えば、限定されるものではないが、半導体レーザ、クリプトン（Kr）イオンレーザ、ネオジム（Nd）レーザ、アルゴン（Ar）イオンレーザ、YAGレーザ、窒素レーザ、サファイアレーザ等を使用することができる。
　この光源からの外部光を複数のナノポアに照射する場合は、多重照射機構１１３を用いる。多重照射機構１１３は、限定されるものではないが、マイクロレンズアレイ、回折格子型ビームスプリッターまたはLCOS(Liquid crystal on silicon)等を用いてもよい。これらを用いて複数の外部光をナノポアに照射する。
　光源から外部光を顕微鏡観察容器に照射し収束させるために、光源と組み合わせて、共焦点レンズ及び対物レンズ１０２を使用することが好ましい。顕微鏡観察容器１０３は、XYステージ１０４上に架設し、ＸＹステージによって水平面上の位置を調整する。垂直方向位置に関してはZ軸調整機構１０５により対物レンズで集光した領域に測定対象の試料が位置するように調整する。場合によってZ軸調整機構は、XYステージに持たせてもよい。位置決め手段としてこれらのステージ以外に、θ軸ステージ、ゴニオステージを利用し、精密に調整してもよい。これらの位置決め手段は、駆動制御部１１５によって制御され、コンピュータ１１６によって使用者が操作する。
　また、装置構成として、測定波長領域等の測定標的に応じたノッチフィルタ、ショートパスフィルター、ロングパスフィルター等のフィルタ１０６、ビームスプリッター１０７、回折格子１０８、等を組みあわせてもよい。他、光学部品配置の必要に応じてミラー１１２やピンホール、レンズ１１４、ＮＩＲ（近赤外）ミラー１１７を使用してもよい。このような蛍光もしくは、ラマン散乱光を検出するための装置構成は、当技術分野において公知であり、当業者であれば適宜好ましい構成要素を選択することができる。　検出器は、蛍光もしくはラマン散乱光を検出することができる検出器１０９であれば任意の分光検出器を使用することができる。また使用する顕微鏡観察容器における試料の数及び配置に応じて、1又は複数の1次元又は2次元検出器を使用することができる。そのような分光検出器としては、CCD（電荷結合素子）またはElectron Multiplying CCDイメージセンサ、CMOS（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサ、他の高感度素子（アバランシェフォトダイオード等）のイメージセンサ等が挙げられる。検出器は、検出の高速化に伴う感度低下を防ぐために、光電子増倍機構、例えばイメージインテンシファイアを有することが好ましい。また、検出器は、ラマン散乱光等の画像情報を直接記録することができる大容量メモリを備えることが好ましく、それによりケーブル、ボード、コンピュータ等を介することなく高速に解析を行うことができる。例えば、本発明の解析装置は、検出器からの計測値を記録するフレームバッファメモリをさらに備えてもよい。また、本発明の解析装置は、前記検出器からの計測値をデジタル化や演算処理、出力するためのコンピュータ１１６と接続してもよい。
　また、ラマン散乱光や蛍光検出だけでなく、明視野像の観察が可能な機能を持たせてもよい。そのためには図１に示すように、明視野の照射光源としてLED１１０、明視野撮像素子として２次元検出器１１１を使用する。２次元検出器としては、CCDまたはEMCCDイメージセンサ、CMOSイメージセンサ等が挙げられる。
　図２にナノポア基板、及びナノポア基板を配置した観察容器の断面構成を示す。観察容器２０１は、ナノポア２０２を有する基板２０３（ナノポア基板）を隔てて２つの閉じられた空間、すなわち試料導入区画２０４と試料流出区画２０５で構成されている。但し、試料導入区画２０４と試料流出区画２０５はナノポア２０２で連通している。観察容器２０１には、後述する本発明の方法によって構築された、標的配列を繰り返して含む核酸分子の構築後に分子を入れる。または、観察容器内で核酸分子を直接構築してもよい。
　観察容器は、チャンバ部とその内部に配置されている基板２０３を有する。基板２０３は、基材と、基材に面して形成された薄膜と、薄膜に設けられた、試料（核酸分子）導入区画２０４と試料流出区画２０５とを連通するナノポア２０２を有し、チャンバの試料導入区画２０４と試料流出区画２０５の間に配置される。基板２０３は、絶縁層を有してもよい。基板２０３は、固体基板であることが好ましい。
　基板２０３は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料及び有機材料（高分子材料を含む）から形成することができる。基板２０３を構成する電気的絶縁体材料の例としては、シリコン（ケイ素）、ケイ素化合物、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。ケイ素化合物としては、窒化ケイ素、酸化ケイ素、炭化ケイ素等、酸窒化ケイ素が挙げられる。特に基板２０３の支持部を構成するベース（基材）は、これらの任意の材料から作製することができるが、例えばケイ素又はケイ素化合物であってよい。
　基板２０３のサイズ及び厚さは、ナノポア２０２を設けることができるものであれば特に限定されるものではない。基板２０３は、当技術分野で公知の方法により作製することが可能で、あるいは市販品として入手することも可能である。例えば、基板２０３は、フォトリソグラフィ又は電子線リソグラフィ、及びエッチング、レーザブレーション、射出成形、鋳造、分子線エピタキシー、化学蒸着（CVD）、誘電破壊、電子線若しくは収束イオンビーム等の技術を用いて作製することができる。基板２０３は、表面への標的外の分子の吸着を避けるために、コーティングしてもよい。
　基板２０３は、少なくとも1つのナノポア２０２を有する。ナノポア２０２は、具体的には薄膜に設けられるが、場合により、ベース（基材）、絶縁体に同時に設けてもよい。本発明において「ナノポア」及び「ポア」とは、ナノメートル（nm）サイズ（すなわち、1nm以上、1μm未満の直径）の孔であり、基板２０３を貫通して試料導入区画２０４と試料流出区画２０５とを連通する孔である。
　基板２０３は、ナノポア２０２を設けるための薄膜を有することが好ましい。すなわち、ナノサイズの孔を形成するのに適した材料及び厚さの薄膜を基板上に形成することによって、ナノポア２０２を簡便かつ効率的に基板２０３に設けることができる。ナノポア形成の面から、薄膜の材料は、例えば酸化ケイ素（SiO2）、窒化ケイ素（SiN）、酸窒化ケイ素（SiON）、金属酸化物、金属ケイ酸塩等が好ましい。また薄膜（及び場合によっては基板全体）は、実質的に透明であってもよい。ここで「実質的に透明」とは、外部光をおよそ50％以上、好ましくは80％以上透過できることを意味する。また薄膜は、単層であっても複層であってもよい。薄膜の厚みは、1nm～200nm、好ましくは1nm～50nm、より好ましくは1nm～20nmである。薄膜は、当技術分野で公知の技術により、例えば減圧化学気相成長（LPCVD）により、基板２０３上に形成することができる。
　薄膜上には、絶縁層を設けることも好ましい。絶縁層の厚みは好ましくは5nm～50nmである。絶縁層には任意の絶縁体材料を使用できるが、例えばケイ素又はケイ素化合物（窒化ケイ素、酸化ケイ素等）を使用することが好ましい。本発明においてナノポア又はポアの「開口部」とは、ナノポア又はポアが試料溶液と接する部分のナノポア又はポアの開口円を指す。生体高分子の分析の際には、試料溶液中の生体高分子やイオン等は一方の開口部からナノポアに進入し、同じ又は反対側の開口部からナノポア外に出る。
　ナノポア２０２のサイズは、分析対象の生体高分子の種類によって適切なサイズを選択することができる。ナノポアは、均一な直径を有していてもよいが、部位により異なる直径を有してもよい。ナノポアは、1μm以上の直径を有するポアと連結していてもよい。基板２０３の薄膜に設けるナノポアは、最小直径部、すなわち当該ナノポアの有する最も小さい直径が、直径100nm以下、例えば1nm～100nm、好ましくは1nm～50nm、例えば1nm～10nmであり、具体的には1nm以上5nm以下、3nm以上5nm以下等であることが好ましい。
　ssDNA（1本鎖DNA）の直径は約1.5nmであり、ssDNAを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は1.5nm～10nm程度、好ましくは1.5nm～2.5nm程度である。dsDNA（二本鎖DNA）の直径は約2.6nmであり、dsDNAを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は3nm～10nm程度、好ましくは3nm～5nm程度である。他の生体高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、糖鎖等を分析対象とする場合も同様に、生体高分子の外径寸法に応じたナノポア直径を選択することができる。
　ナノポア２０２の深さ（長さ）は、基板２０３又は基板２０３の薄膜の厚さを調整することにより調整することができる。ナノポア２０２の深さは、分析対象の生体高分子を構成するモノマー単位とすることが好ましい。例えば生体高分子として核酸を選択する場合には、ナノポア２０２の深さは、塩基1個以下の大きさ、例えば約0.3nm以下とすることが好ましい。ナノポア２０２の形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
　ナノポア２０２は、基板２０３に少なくとも1つ設けることができ、複数のナノポア２０２を設ける場合に、規則的に配列してもよい。ナノポア２０２は、当技術分野で公知の方法により、例えば透過型電子顕微鏡（TEM）の電子ビームを照射することにより、ナノリソグラフィー技術又はイオンビームリソグラフィ技術等を使用することにより形成することができる。
　チャンバ部は、試料導入区画２０４及び試料流出区画２０５、基板２０３、電圧印加手段、並びに試料２１２をナノポア２０２に通過させるための電極２１３、２１４等を有する。好適な例では、チャンバ部は、試料導入区画２０４及び試料流出区画２０５、試料導入区画２０４に設けた第１の電極２１３、試料流出区画２０５に設けた第２の電極２１４、第１、第２の電極に対する電圧印加手段等を有する。試料導入区画２０４に設けた第１の電極２１３、試料流出区画２０５に設けた第２の電極２１４の間には、電流計が配置されていてもよい。第１の電極２１３と第２の電極２１４の間の電流は、試料２１２のナノポア通過速度を決定する点で適宜定めればよく、例えば、試料２１２を含まないイオン液体を用いた場合、DNAであれば100mV～300mV程度が好ましいが、これに限定されない。
　電極２１３、２１４は、金属、例えば白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム等の白金族、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル等；グラファイト、例えばグラフェン（単層又は複層のいずれでもよい）、タングステン、タンタル等から作製することができる。
　電圧印加によってナノポア２０２を通過する核酸分子は、励起光によってラマン光を発するが、ナノポア近傍に導電性薄膜２１５を用意し近接場を発生させ増強してもよい。ナノポア近傍に設置する導電性薄膜２１５は、薄膜の定義から明らかな通り、平面状に形成する。導電性薄膜２１５の厚さは、採用する材料に応じて、0.1nm～10nm、好ましくは0.1nm～7nmとする。導電性薄膜２１５の厚さが小さいほど、発生する近接場を限定することができ、高分解能かつ高感度での解析が可能となる。また導電性薄膜２１５の大きさは特に限定されるものではなく、使用する固体基板２０３及びナノポア２０２の大きさ、使用する励起光の波長等に応じて適宜選択することができる。なお導電性薄膜２１５が平面状でなく、屈曲等が存在すると、その屈曲部において近接場が誘起され光エネルギーが漏出し、標的外の場所においてラマン散乱光を発生させる。すなわち背景光が増大し、S/Nが低下する。そのため、導電性薄膜２１５は平面状であることが好ましく、換言すると断面形状は屈曲のない直線状であることが好ましい。導電性薄膜２１５を平面状に形成することは、背景光の低減、S/N比の増大に効果があるだけではなく、薄膜の均一性や作製における再現性等の観点からも好ましい。
　試料導入区画２０４及び試料流出区画２０５は、両区画にそれぞれ連結された流入路２０６、２０７を介して導入される液体２１０、２１１で満たされる。液体２１０、２１１は、試料導入区画２０４及び試料流出区画２０５に連結された流出路２０８、２０９から流出する。流入路２０６と２０７は基板を挟んで対向する位置に設けられてもよいが、これに限定されない。流出路２０８と２０９は基板を挟んで対向する位置に設けられてもよいが、これに限定されない。
　液体２１０は分析対象となる試料２１２を含む試料溶液であることが好ましい。液体２１０は、電荷の担い手となるイオンを好ましくは大量に含む（以下、イオン液体）。液体２１０は、試料以外には、イオン液体のみを含むことが好ましい。イオン液体としては、電離度の高い電解質を溶解した水溶液が好ましく、塩類溶液、例えば塩化カリウム水溶液等を好適に使用できる。試料２１２は、イオン液体中で電荷を有するものであることが好ましい。試料２１２は、典型的には核酸分子である。
　試料導入区画２０４と試料流出区画２０５には、ナノポア２０２を挟んで対向するように配置された電極２１３、２１４が設けられる。本実施形態において、チャンバ部は、電極２１３、２１４に対する電圧印加手段をも備える。電圧印加により、電荷をもつ試料２１２が試料導入区画２０４からナノポア２０２を通過し、試料流出区画２０５へと移る。試料２１２が励起光によって照射されたナノポア２０２を通過するとき、導電性薄膜２１５によって増強されたラマン散乱スペクトルを液浸媒体２１６によって効果的にラマン光を集光し、対物レンズ２１７を通して検出器１０９に達し解析される。
　図２では、上部を試料導入区画、下部を試料流出区画としたが、下部を試料導入区画、上部を試料流出区画とし、ナノポアを抜けてくる試料を検出してもよい。
　以下に、本発明の方法を実施例として具体的に説明するが、本発明の方法が以下の実施例に限定されることを意図するものではない。
　本発明の方法の一実施形態を図３に示す。本発明の核酸分子の構築方法は、対象とする核酸の標的配列を増幅し、標的配列が繰り返され一本鎖（単分子）で構築されることを特徴の一つとする。
　図３（１）に示すように、用意するプライマー対のうち少なくとも一方はヘアピン構造を持ったプライマー３００とする。プライマー３００の3'末端側は標的配列を含む鋳型DNAの配列に相補的な配列を持つ一本鎖領域のプライマー配列構造であり、ステム部から突出した構造となっている。この場合、標的配列の増幅のためのプライマー３００はヘアピンプライマーであり、標的配列の相補鎖の増幅のためのプライマー３０３はヘアピンプライマーであっても良く、ヘアピン構造を持たないプライマーであっても良い。あるいはまた、標的配列の増幅のためにプライマー３０３を使用し、標的配列の相補鎖の増幅のためにヘアピンプライマー３００を使用することもできる。二本鎖核酸のいずれか一方の配列を標的配列として解析する本発明の方法は、実施形態に応じて、上記のいずれの態様を用いることもできる。いずれの場合においても、ヘアピンプライマー３００との対比において、プライマー３０３を本明細書において「対をなすプライマー」と記載するものとする。
　鋳型DNAは、それ自体が標的配列を含む試料由来のDNAをそのまま使用することもできるが、本発明の方法により好適に使用できるように、ヘアピンプライマーと完全に相補鎖形成可能な配列を含むように合成された配列に標的配列を連結することもできる。
　ループ部とステム部を有するヘアピン構造を持ったプライマーは知られており、その配列例として、例えばI.A.Nazarenko .et al. 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 12より下記の表１に示すヘアピン構造を持つ配列例を示す。当業者であれば、標的配列を含む、増幅対象となる鋳型DNAが特定されれば、その増幅のために好適なヘアピンプライマーを適宜設計し、作製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図３に示すように、ヘアピン構造を持ったプライマー３００を変性させ、対象核酸（例えばヒトゲノム）の標的配列にアニールさせる。
　一例として、図３のステップ（１）では反応溶液の混合物として対象核酸を含んだ溶液、標的配列を挟んだプライマーセット（片側または両側が上述したヘアピンプライマー３００となっているもの）、及びポリメラーゼとポリメラーゼに応じた塩組成溶液を用意する。用いるDNAポリメラーゼは限定されず、例えば、Taq DNAポリメラーゼに代表される好熱細菌から分離されたポリメラーゼであり、family A(PolI型）に分類されるものや、KOD DNAポリメラーゼに代表される超好熱古細菌から分離されたポリメラーゼであり、family B(α型）に分類されるものが使用可能である。また、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼとして、Bst DNA ポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Φ29ファージDNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエキソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVentDNAポリメラーゼ、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNA ポリメラーゼからエキソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、MS-2ファージDNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、等が一般的に知られており、好適に使用することができる。
　また、上記のDNAポリメラーゼの必要とする触媒活性を持ちながら、構造等一部機能のみを取り出したものや、アミノ酸の変異等によって触媒活性、安定性、あるいは耐熱性を改変した各種変異体を用いても良い。各種DNAポリメラーゼ変異体が配列依存型の相補鎖合成活性や鎖置換活性等を有する限り、本発明に利用することが可能であり、上記の例に限定されるものではない。
　本発明の方法は、合成によって作られた配列を複数回読み取ることでシーケンサの読取精度を高める手法である為、合成精度が高いポリメラーゼが好ましい。例えば、合成の精度が高い酵素PrimeSTAR（登録商標）MaxやPrimeSTAR（登録商標）HS等（タカラバイオ社製）の合成精度は99.995％以上であることが知られている。これらは、1～0.1％の変異を検出するには増幅段階での合成ミスが変異検出に影響を与えない程度の十分な精度を有している。
　図３のステップ（２）では、これら（１）の混合物を適切な変性温度まで加熱し、各プライマーを対象核酸にアニールさせ、伸長反応を行う（ステップ（３））。伸長した二本鎖の増幅産物は、変性条件下で解離させたのち、各プライマーに再びアニールさせ、伸長させる。この工程を繰り返し行う。ここで、ヘアピンプライマーのループ部も全て伸長した二本鎖の増幅産物中で塩基対を形成して含まれる（ステップ（４））。
　（５ｂ）に示すように、この時点で、伸長した一本鎖核酸は分子内にヘアピンプライマーの配列を含むため、その分子内アニールによってヘアピン構造を持つ一本鎖核酸を形成することができる。この反応と、未反応のヘアピンプライマー３００との分子間アニールによって新たな相補鎖形成を行う反応とが競合する。ここで、（５b）に示すような標的配列を繰り返して含み、かつヘアピン構造を持つ一本鎖核酸を優先的に得るには、3’末端にヘアピン構造を形成させる相補鎖配列部３０１（ステム部）のアニールが、未反応のヘアピンプライマー３００とのアニールよりも優先的に生じる事が好ましい。そのためには、例えば、アニールが競合するヘアピンプライマー３００のヘアピンプライマーにおける相補鎖配列部３０２（一本鎖部）がアニールするのに必要な温度（Tm値)をヘアピン構造を形成させる相補鎖配列部３０１（ステム部）のTm値より低くなるように設計し、かつ変性工程からアニール及び伸長工程へと温度を下げるように温度勾配を与えることにより、相補鎖配列部３０１（ステム部）が優先的にアニールし、標的配列を繰り返したヘアピン構造を持つ一本鎖核酸を優先的に得ることが可能となる。すなわち、この場合、ヘアピンプライマーのステム部は、一本鎖部のTm値より高いTm値を有する。この文脈において、Tm（melting temperature）値は、プライマー内の部分配列に対する値として記載する。
　例えば、ヘアピンプライマーの一本鎖部のTm値を60℃とする配列設計を行う場合、ステム部のTm値を７0℃とすると、相補鎖配列部３０１が優先的にアニールし、標的配列を繰り返したヘアピン構造を持つ一本鎖核酸を優先的に得ることが可能となる。
　一般的に、Tm値の±５℃で二本鎖DNAの様態は変化する。裕度を持ってTm値の差を設けるのであれば、一本鎖部とステム部のTm値の差を１５℃以上に設定してもよい。但し、極端な差を有するようなTm値の設定は増幅の反応効率にも影響を与える為、１５℃以下、より好ましくは約１０℃の温度差としてもよい。従って、本発明の方法の一実施形態として、ヘアピンプライマー３００のステム部が、ヘアピンプライマー３００の一本鎖部のTm値よりも５℃以上、１０℃以上、または１５℃以上高いTm値を有するように設定する。あるいは、ヘアピンプライマー３００のステム部が、ヘアピンプライマー３００の一本鎖部のTm値よりも約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃高いTm値を有するように設定する。
　また、DNAの融解温度を調整するベタイン(N,N,N-トリメチルグリシン)を使用すると、二本鎖DNAの様態をより狭い温度範囲で変化させることが可能である為（William A. Reesら,Biochemistry 1993, 32,137-144）、反応溶液に添加してもよい。
　Tm値または各温度における二本鎖DNAの様態は、pH及び塩濃度等の条件によって変動し、また塩基配列や長さにも依存する値であるが、一定条件下でのTm値は、塩基配列の長さ及びGC含有率等に基づいて計算することができる。当業者であれば、プライマーの設計において各部のTm値を適宜設定し、最適なプライマーを設計・作製することができ、また反応温度の設計も適宜行うことができる。
　もしくは、上述した工程を行わなくとも、ヘアピンプライマー３００の濃度は反応サイクルが進むにつれて減少するため、プライマー３００が枯渇することによって、相補鎖配列部３０１が優先的にアニールされるように、プライマー３００の濃度を適宜調整してもよい。この場合、反応の進行によるヘアピンプライマーの減少と共に、合成された相補鎖配列が自己を鋳型に伸長反応を行う。
　より具体的に上記反応を行うには、表１に示すような配列構造をもつヘアピンプライマーとポリメラーゼおよび塩組成溶液100μlとした時の組成を、例えば、
20mM Tris-HCl (pH8.5)
50mM KCl
2mM MgCl2
200μM 各dNTP
5U Pfuexo-DNAポリメラーゼ (3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼ)
と調製し、以下の温度条件で合成反応を行う。
　94℃で5分の加熱でヘアピンと対象核酸（例えばヒトゲノム）の高次構造をほぐす。その後95℃で30秒、60℃で45秒、72℃で90秒の温度サイクルを、例えば20から40回繰り返した後、72℃で5分の伸長反応を行う。温度サイクルにおける、時間や温度はここで示した反応条件に限定されない。標的とする配列、プライマーの配列、得たい産物量等により温度、時間、サイクル等は変えてもよい。
　これらのステップを繰り返す図３の工程によって、（５ｂ）に示すような標的配列を繰り返したヘアピン構造を持つ一本鎖核酸を得ることが可能であり、迅速に塩基配列決定前の試料の構築が可能となる。
　尚、図３では、対をなすプライマーの内、一つをヘアピンプライマー３００としたが、対をなすプライマーの双方がヘアピン構造をもったプライマーを用いて同様の反応工程を行ってもよい。核酸分子の構築のための時間は、合成反応における温度、反応時間、サイクル、温調器（thermal-cycler）性能に依存するが、概ね30分から90分以内に図３で示した反応が終了する。反応溶液には、未反応のプライマー等が含まれるが、ゲル濾過樹脂充填スピンカラムCHROMA SPIN Column（タカラバイオ社製）を利用し、10分程度で未反応のプライマーを除き、合成された標的配列を繰り返す核酸分子のみを取り出し、塩基配列決定の工程に進めることが可能である。
　本発明の方法によって得られる生成物は相補鎖配列を持つ為、二本鎖を形成したもの（５ａ）がヘアピン構造を有する一本鎖核酸分子（５ｂ）と共に混在する。一本鎖DNAを通過させ、一塩基毎に検出するナノポア（例えば直径2nm以下）を用いたシーケンサによる配列解析のためには、配列解析時点での二本鎖核酸分子の存在は好ましくない。従って、例えば図３に示す合成工程において、二本使用するプライマーのうち一本をヘアピン構造を持たないプライマー３０３とし、プライマー３０３の配列を相補鎖配列が解離しやすいＡＴリッチな配列にしてもよい。または、生成物がナノポアを通過する時に熱やアルカリ等による相補鎖配列の解離を行い、ナノポアを一本鎖DNAとして通過しやすい構造としてもよい。
　または、プライマー３０３を、DNA-RNAで構成されるハイブリッドキメラプライマーを用い、RNA配列を５’末端に用意した上で、図３に示す反応を行うこともできる。その場合、DNA-RNAハイブリッド二本鎖を形成しているRNAを、RNaseH酵素等を使用して切断し、反応生成物の末端が一本鎖DNAとなる箇所を作り、容易にナノポアに一本鎖DNAの箇所から通過させてもよい。一本鎖DNAとなる箇所の配列から二本鎖DNAの配列の箇所をナノポアへ通過させる時、マイナスに電荷を帯びたDNAはナノポアを経由し、電気的に陽極側へ引き込まれる。二本鎖DNAは水素結合をもって形成されており、その水素結合を解離させながら引き込んでもよい。この場合、ナノポアを通過する速度は遅くなり、十分な検出場となる箇所を十分な時間をかけて通過する事も可能である。つまり、二本鎖形成する水素結合の力を熱やアルカリまたは引き込む力各々を調整し、DNAがナノポアを通過する速度を制御することもできる。
　本発明の方法は、標的配列（二本鎖の片側一本のDNA鎖）のみを元に相補鎖配列を合成し、その合成した配列の相補鎖配列も続けて合成して一本鎖の核酸分子を構築し、これを用いてナノポアシーケンサで検出する。これは、標的配列の片鎖のみの解析では塩基配列の解読が難しい場合、例えば塩基間で類似する信号を持つ場合等により、得られる信号が不確かな場合でも、異なる配列を持つ相補鎖配列からの信号を得られることが可能になる。つまり、ミスマッチの可能性を含む本来の二本鎖分子の双方を読取るのではなく、同じ標的配列の片鎖のみの配列情報を２回読取るため、読取った２回の情報を持って高精度な核酸配列分析が可能なことを示す。検出する装置（例えば、検出器やレンズ等）が高価で高精度な物でなくとも、複数回読取ることで十分な精度が得られる程度の装置にすること、つまり装置の負担（例えば機能的な）を軽減することも可能であり、本発明の方法は、シーケンシングのための装置を安価または小型化された装置にすることも可能にする方法でもある。
　ナノポアシーケンサによる解析は、一本鎖核酸分子の場合、5'側からでも3'側からでも解析可能である。上記の工程で生成される反応産物を用いてナノポアシーケンスを行う場合、図３（５ｂ）に示すヘアピン増幅産物は、5'側から読み取られるとすると、初めにプライマーの配列情報から分析され、その後標的配列、ヘアピンプライマー配列、標的配列（相補配列）、プライマー配列（相補配列）の順に解析される。
　ここで、各プライマー配列由来の塩基配列情報および塩基配列の信号情報（例えばラマン散乱光や封鎖電流値）は既知である為、事前にどの信号（波長や波数または電流値）でピークが得られ、各塩基に該当する信号がどの順番でピークが得られるのか既知なので、検出の校正をリアルタイムに行うことができる。例えば、ラマン散乱光を検出する場合、既知のラマン散乱光によるスペクトル情報を順次得られるので、スペクトルピークから得る情報が本来得られる素子の位置で得られない場合、例えば検出素子の位置を校正してもよい。光軸がずれてしまうと、本来と異なる検出画像素子の位置でスペクトルピークを得るため、正しい解析が出来ない。そこで、塩基配列読取の始めと終わり及び標的配列の合間で既知の複数のラマンスペクトルピークが得られることを利用し、解析初期に得られた複数のラマンスペクトルピークの検出画像素子位置と励起光の検出画像素子位置（ラマン光では無く励起光の反射光）からなる複数の既知の位置情報と、本来検出され得る素子位置情報等を用いて、波数と素子の位置情報を補正し、解析することができる。
　既知の配列部から得られる複数のラマンスペクトルピークは、上記の素子の位置校正だけでなく、コンタミネーションやキャリーオーバーの検出のために使うこともできる。例えば、複数のサンプルの標的配列を解析する場合に、サンプルごとに解析に用いるヘアピンプライマー３００のヘアピン部分の配列を変える。または対となるプライマー３０３の5’末端に標的配列と相補的な配列を持たない配列を設け、サンプルごとに配列を変えることにより、読み取った配列情報からサンプル間のコンタミネーションや解析時における前の解析サンプルのキャリーオーバーを認識して解析することができる。
　電流検知を行う場合は、既知の各プライマー配列の各塩基から得られる電流値とバックグランド信号値を用いて校正してもよい。例えば、測定中にバックグランド信号値が変動する場合は、特に効果的である。核酸が通過する直前の信号値をバックグランド信号値とし、核酸分子が取り込まれた時に電流値は大きく変化する為、核酸分子が取り込まれる前のバックグランド信号値を差し引いて電流値を計測する。ACGTと並んだ既知の塩基配列が順に計測される場合、各塩基の信号強度からバックグランド信号値を差し引いた後に、既知配列による信号強度比や信号の変化を参照値とし、標的配列部において得られた信号値を参照値と対比させて塩基を判定してもよい。校正の方法は、これらに限定されるわけではない。既知の配列から得られる既知の信号値または信号情報、または既知の配列から得られる既知の配列による実測の信号を元に、校正または解析する方法である。当業者であれば、上記の記載に基づいて、本発明の方法を適宜改変することができる。
　上記では、ラマン散乱光を検出して核酸塩基配列を決定する例を中心に示したが、本発明の方法はこれに限定されず、例えば、ナノポアを通過させるときの封鎖電流を検出する核酸塩基配列決定法（US2011/0229877やUS2011/0177498等）やナノポアを通過する時に発生するトンネル電流を検知する核酸塩基配列決定法（特開2014-20837)、液滴を用いた一分子核酸塩基配列決定法（WO2014111723A, WO2014053854A)、ポリメラーゼ伸長産物が作製される場合に、ヌクレオチド三リン酸［ＮＴＰ］から放出される蛍光標識ピロリン酸［ＰＰｉ］部分の単一分子の検出を行う核酸塩基配列決定法（特許第4638043号)等に本発明の方法で得られた核酸分子を用いることができる。標的配列の読取精度が低くても、分子中に複数の標的配列情報を含むため、一分子を解析することで高精度な解析結果を示すことができ、検出する装置側の負担（例えば機能的な）を軽減することも可能である。
　実施例１において、１方のみにヘアピンプライマーを用いた場合に構築される核酸分子は、図３の（４）に示す分子と（５ｂ）に示す分子がおよそ半分ずつの割合で構築される。本実施例では、図３の（５ｂ）に示す標的配列を２回検出することが可能な分子が半分程度構築されるのではなく、構築される分子全数が標的配列を２回検出ことが可能な分子となるように構築する方法を説明する。図４にその手順を示す。
　本実施例では、図４に示す工程の前に図３と類似の工程を行う。図３に示した工程と異なる点は、ヘアピンプライマー３００と対をなすプライマー３０３をビオチン化して図３に示す増幅工程を行う点である。プライマーのビオチン化に伴い、ビオチンの立体構造によって生じるポリメラーゼを用いた合成における増幅障害を減らす為、炭素５原子分程度のスペーサー（例えば塩基等）を含むようにしてもよい。
　ビオチン化したプライマー３００を用いて、例えば図３に示す工程で増幅した反応産物40μlにストレプトアビジンが付与された磁性ビーズ（例えばDynabeads(登録商標)M-280 Streptavidin）と混合し、懸濁させながら室温で15分間インキュベーションし、増幅産物と磁性ビーズを結合させる。
　その後、反応容器の外側に磁石を架設し、反応容器を跨いで磁性ビーズを磁石側に引き寄せ固定した状態で上清のみを取り除き、洗浄溶液の添加及び懸濁、磁石による引き寄せ及び上清を取り除く洗浄操作を行う。この洗浄操作の時、洗浄溶液を60℃以上または95℃以上にして行う事により、磁性ビーズに結合したDNA鎖の相補鎖で存在するDNA鎖は、二本鎖DNAの解離と共に洗い流され、磁性ビーズに結合したDNA鎖、すなわちビオチン化プライマーから伸長した分子のみに単離することが可能である。または、アルカリ溶液で二本鎖DNAの解離を行いながら洗浄することによっても同様の効果が得られる。
　磁性ビーズに結合したDNA鎖のみを単離する方法として、高温下での洗浄及びアルカリ溶液での洗浄で処理する方法を記載したが、これに限定されない。DNA鎖の相補鎖配列が結合している状態を解離させ、ビオチン化したプライマーより伸長した分子のみを単離する方法で有ればよい。
　この単離されたDNA鎖を用い、分子全数が標的配列を２回検出することが可能な分子を構築する。例えば、単離したDNA鎖に反応溶液100μlとした時の下記の組成の溶液を加え、
20mM Tris-HCl (pH8.5)
50mM KCl
2mM MgCl2
200μM 各dNTP
5U Pfuexo-DNAポリメラーゼ(3’-5’エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼ)
以下の温度条件で反応を行う。
　94℃で５分の加熱で高次構造をほぐす。その後95℃で30秒、60℃で45秒により3’末端の相補鎖をもつ配列箇所がアニールすることによりヘアピン構造を構築し、72℃で90秒以上の加熱により伸長反応を行う。
　その結果、図４に示すように、標的配列情報を繰り返して含むヘアピン構造を持つ一本鎖核酸のみを得ることが可能となる。尚、反応条件は、上記の反応条件に限定されず、標的とする配列やプライマーの配列により温度、時間、サイクル等は変えてもよい。また、各工程の反応間に関して塩や酵素を取り除く精製工程を記載しなかったが、場合によって必要であれば実施してもよい。
　ナノポアシーケンシングを行う際に、結合した磁性ビーズによってシーケンシング効率が低下する場合は、核酸分子から磁性ビーズを切り離してもよい。例えば、プライマーとビオチンの間に設けたスペーサー領域を切断してもよい。切断方法として、例えばスペーサー領域の塩基配列に予め制限酵素切断配列を含めておき、シーケンシング前に切断することができる。これにより、DNA鎖と磁性ビーズを切り離した物を試料としてナノポアシーケンシングすることができる。
　本実施例では、λエキソヌクレアーゼを用いて分子全数が標的配列情報を２回含む分子として構築する方法の例を説明する。図５にその手順を示す。
　本実施形態は、ヘアピンプライマーの5'末端を使用前にリン酸化しておき、目的の核酸分子の構築後に5'末端がリン酸化したDNA鎖を分解することを特徴とする。分解は、特に限定するものではないが、例えばλエキソヌクレアーゼを使用する。
　図５に示す工程の前に図３と類似の工程を行う。図３に示した工程と異なる点は、ヘアピンプライマー３００の5’末端をリン酸化させ、対をなすプライマー３０３はリン酸化せずに図３に示す増幅工程を行う点である。反応後、必要であれば、増幅反応液中の塩、プライマーを除く。取り除く方法は問わないが、例えばシリカメンブレンに増幅産物を固定化し、遠心することにより精製する市販キットであるNucleoSpin（登録商標） Gel and PCR Clean-up（タカラバイオ社製）を用いてもよい。
　λエキソヌクレアーゼは二本鎖DNAのリン酸化された5'末端側から消化し、モノヌクレオチドを放出する特徴を持った酵素である。5'末端がリン酸化された二本鎖DNAが良い基質となる。この性質を利用し、増幅産物にλエキソヌクレアーゼ（NEB社製）を加え、67 mM グリシン-KOH (pH 9.4)、2.5 mM MgCl2、50μg/ml BSAのバッファー組成で反応溶液を調整し、37℃で30分インキュベーションする。この反応により、図３の工程を経て生成された増幅産物の内、ヘアピン構造を形成せず、従って一分子中で標的配列情報を２回読むことが可能ではない二本鎖DNAのリン酸基を有する鎖が消化されて一本鎖となる。λエキソヌクレアーゼ反応を行った後、このDNA鎖を伸長する反応を再度実施する。
　この場合、λエキソヌクレアーゼ反応を行った溶液を、例えば下記の組成の溶液に調整する。
20mM Tris-HCl (pH8.5)
50mM KCl
2mM MgCl2
200μM 各dNTP
5U Pfuexo-DNAポリメラーゼ(3’-5’エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼ)
　上記の組成で以下の温度条件で反応を行う。94℃で５分の加熱で高次構造をほぐす。その後95℃で30秒、60℃で45秒により3’末端の相補鎖をもつ配列箇所がアニールすることによりヘアピン構造を構築し、72℃で90秒以上の加熱により伸長反応を行う。この反応は、上記に示した反応条件に限定されない。標的とする配列やヘアピン構造の配列により温度、時間、サイクル等は変えてもよい。
　その結果、図５に示すように、得られるDNA鎖として、標的配列を繰り返したヘアピン構造を持つ一本鎖核酸のみを得ることが可能となる。各工程の反応間に関して塩や酵素を取り除く精製工程を記載しなかったが、必要であれば実施してもよい。
　本実施例で作成した核酸分子も同様に、シーケンシング時に標的配列を２回検出することが可能となり、高精度な塩基配列が可能となる。
　本実施例では、標的配列を２回以上検出するだけでなく、４回検出することも行える構築方法を説明する。図６にその手順を示す。
　図６に示す工程の前に図３と類似の工程を行う。図３に示した工程と異なる点は、伸長反応における「72℃で90秒」としたステップを十分に長い時間（例えば５分以上）行う事により、反応生成物の3’末端がアデニン１塩基分突出した構造を意図的に形成させることができる。この為には、ターミナルトランスフェラーゼ活性を持つDNAポリメラーゼ（例えばTaqDNAポリメラーゼ）を使用して伸長反応を実施するのが好ましい。
　ここで形成された反応産物に対して、3’末端にチミン１塩基が突出した末端構造とヘアピン構造とを持つアダプタ６０１とを連結するTAクローニングを行う。このアダプタ６０１は、図６に示すように、前工程での反応産物と結合（ライゲーション）する部分（二本鎖DNA）とヘアピンループを形成する部分（例えば表１に示すような配列）の間に、一本鎖のみでつながる構造を持つ。これは、ヘアピンループから反応産物と結合する部分へと向かう3’末端が途切れた構造となっている。
　アダプタの連結例として、TAクローニングによるアダプタ６０１との結合を示したが、連結方法はこれに限定されない。例えば、トポイソメラーゼを利用したクローニングシステムとして、例えば、DNA トポイソメラーゼ I およびバクテリオファージ P1由来のCre リコンビナーゼを用いたStrataClone PCR クローニング システム（アジレント社）やTOPO（登録商標） Cloning（ライフテクノロジーズ）、等の他のクローニング技術を用いて連結してもよい。
　連結後のステップとして、連結した反応産物に対して鎖置換型ポリメラーゼを用いて伸長反応を行う。この反応は、アダプタ６０１の3'末端から相補的な塩基配列に対して塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換反応が起きる酵素活性を維持しうる温度（例えば６０℃）でインキュベートする。インキュベートする時間は、伸長反応する塩基長により調整してもよい。ここで各所の塩基対結合をもたらす条件は、たとえば融解温度以下に設定することが一般的であり、PCR法やLAMP法で用いられる条件と同様である。
　この鎖置換反応による伸長は、酵素に適したpH を与える緩衝剤や酵素の触媒活性の維持やアニールのために用いる塩成分、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度の調整剤等を共存させた条件下で実施してもよい。pH緩衝剤の一例として、Tris-HCl 等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものを用いても良い。pH は用いる酵素（DNA ポリメラーゼ）の特性に応じて調整する。塩成分としては、酵素の活性維持と核酸の融解温度調整のためにKCl、NaCl、あるいは(NH4)2SO4等を適宜添加しても良い。酵素の保護としては、糖類やウシ血清アルブミンを用いても良い。
　融解温度の調整には、ジメチルスルホキシド(DMSO)やホルムアミドが一般に利用される。これらを融解温度の調整剤を利用することによって、3'末端からのアニールを限られた温度条件の下で調整することが可能になる。更に、ベタイン(N,N,N-トリメチルグリシン)は天然の浸透性保護剤であり、そのG+Cの塩基配列を多く含んだ領域の溶融温度を、A+Tの塩基配列を多く含んだ領域と同じ溶融温度に下げ得る性質を利用しても良い。その他、融解温度調整剤として、プロリン、トリメチルアミンN-オキシド等が知られる。二本鎖DNAの不安定化をもたらすことによって、鎖置換効率を向上させることができる。ベタインの添加量は、反応液中 0.2～3.0Ｍ、好ましくは 0.5～1.5 M 程度が好ましく、本発明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するため、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切な反応を与える条件を経験的に設定し実施する。
　鎖置換反応の特性により、反応する限り伸長反応が進むことも有り得る。例えば、伸長反応を先導する3’末端構造が自己アニールする場合や、近傍の自身の塩基配列に飛び移り、反応が進む場合である。
　塩基配列の立体構造上、そのように反応が進む場合は、DNAポリメラーゼの基質となるdNTP(デオキシヌクレオシド三リン酸)の他にddNTP(ジデオキシヌクレオシド三リン酸）をある一定の濃度で含めても良い。含有するddNTPの濃度によって、増幅される鋳型の長さを制限することができる。例えば、ループ構造を経由して伸長反応が続くようであれば、高濃度のddNTPを含有することにより、鎖置換反応時にddNTPを取り込ませて伸長反応を停止させることが可能である。ddNTPの濃度が薄い場合は、dNTPが優先してポリメラーゼに取り込まれるが、ある程度鎖置換反応が進んでddNTPの濃度比が高くなると、ddNTPの方が優先して取り込まれ、鎖置換反応が停止する。必要な伸長産物長に応じて、ddNTPの濃度を調整してもよい。ddNTPの濃度調整によっては、４回以上の標的配列情報の繰り返しも可能であるが、過度な繰返し構造は結果的に高次構造を形成する為、ナノポアの通過にも影響を与え得る為、シーケンシングの構成によって繰返し回数を使い分けてもよい。
　制限無く鎖置換反応が進行することによる伸長は、上記の通りddNTPを用いて制御することも可能であるが、制御方法はこれに限定されるものではない。別の例として、アダプタ６０１が持つヘアピンループ構造の一部を脱塩基した構成にすると、鎖置換型ポリメラーゼの反応は脱塩基化された箇所で停止する。従って、脱塩基によって生成される核酸分子の長さを制御することができる。
　また、アダプタ６０１が持つヘアピンループ構造部分に、ポリメラーゼによる伸長反応を阻害する分子を含ませることもできる。阻害分子を用意することにより、伸長反応の過程でポリメラーゼによる伸長反応を阻害し、制限なく伸長することを防ぐことができる。阻害分子の構造は、ポリメラーゼによる伸長反応を阻害することができれば特に限定されないが、例えば核酸誘導体や非核酸誘導体を含むことが好ましい。
　核酸誘導体として、上記の脱塩基の他、鎖置換型酵素でも解離されない強固な高次構造やシュードノット構造のようにポリメラーゼの進行を立体的に阻害する構造を有する核酸、Ｌ型核酸、3-デオキシ-2-ヒドロキシ-dN、修飾塩基核酸、損傷塩基核酸、リン酸結合部位修飾核酸、RNA、2'-OMe-N、BNA（LNA）、およびそれらの誘導体が挙げられる。
　本実施例に示す反応の結果、図６に示すように、標的配列を４回繰り返したヘアピン構造を持つ一本鎖核酸を得ることが可能となる。各工程の反応間に関して塩や酵素を取り除く精製工程を記載しなかったが、必要であれば実施してもよい。
　本実施例で作成した核酸分子は、シーケンシング時に標的配列を４回検出することが可能となり、より高精度な塩基配列決定が可能となる。
　実施例４で構築した核酸分子は、図６に示すように、標的配列を２回または４回繰り返す核酸分子が混在し得るものである。本実施例では、分子全数が標的配列を４回繰り返す核酸分子を構築する方法を説明する。図７にその手順を示す。
　図７の工程は、図５に示す反応工程によって生成した反応物を使用する。この生成した反応物は分子全数が標的配列を２回繰り返されして含む核酸分子であり、これを用いて標的配列を４回繰り返す核酸分子を構築する。
　実施例４で説明した例と同様に、図５の反応において、伸長反応を十分に行う事により、反応生成物の3’末端がアデニン１塩基分突出した構造を意図的に形成することができる。従って、図５で生成した反応物に実施例４で使用したものと同様の構造を有するアダプタ６０１を付与するTAクローニングまたはTOPO（登録商標）クローニング（ライフテクノロジーズ）等を行う。しかしながらアダプタとの連結方法は、特に限定されない。
　図５の反応産物とアダプタ６０１が結合したのち、鎖置換型ポリメラーゼを用いた伸長反応を行う。ここでの反応は、3'末端から相補的な塩基配列に対して塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換反応が起きる酵素活性を維持しうる温度でインキュベートする。ここで各所の塩基対結合をもたらす条件は、たとえば融解温度以下に設定することが一般的であり、PCR法やLAMP法で用いられる条件と同様である。ここに示す鎖置換反応に関しても、実施例４に示した鎖置換反応と同様の点を考慮し、反応を行う。
　上記に示す反応の結果、図７に示すように、得られるDNA鎖を全て、標的配列を４回繰り返したヘアピン構造を持つ一本鎖核酸とすることが可能となる。各工程の反応間に関して塩や酵素を取り除く精製工程を記載しなかったが、必要であれば実施してもよい。
　本実施例で作成した核酸分子は、シーケンシング時に標的配列を４回検出することが可能となり、より高精度な塩基配列決定が可能となる。
　上記実施例１～５において、主に核酸分子を構築する工程を主眼に記載した。実施例６では、実施例１～５において構築した核酸分子を効率的にナノポアに導入する事も考慮した構築方法を説明する。実施例１～５までの方法で構築される核酸分子の末端構造は二本鎖DNAの形状を成しており、一本鎖DNAの塩基配列を決定する場合には二本鎖を一本鎖に解離させることにより、一本鎖DNAの直径サイズとしたナノポアへの導入効率も向上する。一般に、二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性する場合は、溶媒と共に高温にさらす、pHの調整、融解温度調整剤の使用等が公知の技術である。これらの効果を補足する方法を、本実施例で示す。
　実施例１～５で示した核酸分子の構築方法で生成される分子の末端は、例えば図３に示した反応において、ヘアピンプライマー３００と対をなすプライマー３０３の配列を持った二本鎖DNAの構造となっており、そのままでは容易には一本鎖DNAの直径サイズであるナノポアへは進入しない。そこで、このプライマー３０３の配列を変性時に一本鎖DNAになりやすいAT（アデニンとチミン）の配列に富んだ配列７０１（図７）にすることにより、塩基配列決定時に簡便に一本鎖DNAをナノポア構造に導入しやすくなる。
　または、ヘアピンプライマー３００の5’末端にRNAを有するDNAとRNAのキメラのプライマーとして図３に示す反応を行い、各実施例に示した反応を行う。その後、リボヌクレアーゼのRNaseHを用い、DNAとRNAでキメラ構造末端のRNAを分解することにより、一本鎖DNAが突出した核酸分子が生成され、一本鎖DNAの箇所からナノポアに導入することが容易になる。
　本実施例では、ヘアピンプライマー３００にランダム配列８０１を持たせることにより、増幅時の由来となった核酸分子をこのランダム配列８０１によって認識し、由来となった核酸分子の配列の判定精度を高める方法を説明する。
　実施例１～６に示す反応において、ヘアピンプライマー３００にランダム配列８０１を持たせる。例えば、図８Ａに示すように、このランダム配列８０１をヘアピンプライマー３００の二本鎖形成配列の箇所とする。標的配列に対して相補的となる配列以外の箇所において、二本鎖形成配列中（ステム部）に10塩基対のランダム配列を形成した場合、４種類の塩基で４の10乗（1,048,576）種類のランダム配列を持つヘアピンプライマーを用意することができる。その結果、図８Ａ（１）～図８Ｃ（５）の工程において、ある一つのランダム配列８０１を持って複製された核酸分子を鋳型として増幅される核酸分子は、図８Ｃ（５）に示すように同じランダム配列８０１及びその相補配列８０２を持つ分子として増幅される。増幅サイクルが繰り返されることにより、増幅の由来となった配列およびランダム配列を維持したまま、指数関数的に増幅した核酸分子が得られる。異なるランダム配列を有するヘアピンプライマー８０３～８０５から増幅される核酸分子は、ランダム配列が異なる核酸分子群を構成する（図８Ｃ）。
　配列解析時には、標的配列と併せてこのヘアピンプライマー３００の二本鎖形成配列該当箇所（ランダム配列８０１及びその相補配列８０２）を認識することにより、増幅時の由来となった核酸分子の配列の解析結果が増幅された核酸分子の数だけ得られ、データベースなどにある参照配列に対して塩基配列読取エラーなのか変異なのかを判定する精度を高めることが可能になる。
　図９に、同じランダム配列９０１を持つ複数の核酸分子（01～05）の配列解析結果をまとめ、標的配列を比較した結果の例を示す。個々の核酸分子の解析結果を参照配列と共に比較することにより、分子間で異なった結果が検出され得る。その場合、配列解析時の読取エラーであれば、一部の核酸分子のランダムな位置に参照配列と異なる塩基の存在が示される（図中に四角で囲んで示す塩基）。例えば、増幅された核酸分子01で「Ｇ」として解析され、他の核酸分子02～05で「Ｃ」として解析される場合、これは読取エラーと判定される（参照配列においても「Ｃ」）。一方、増幅の由来となった核酸分子の塩基配列に変異（位置９０２における「Ｔ」→「Ｃ」）が生じている場合、同じランダム配列９０１を持つ核酸分子01～05の位置９０２（核酸分子01～05で共通して異なる塩基）にて参照配列と異なる塩基を示す。つまり、増幅の由来となった核酸分子を認識し、その分子から増幅された核酸分子を、増幅の由来が異なる核酸分子と識別して数多く読取ることにより、より高精度な解析が可能になる。
　本手法は、前述した、多量にある正常細胞由来のゲノムDNAの中に僅かに含まれる異常細胞由来の変異を検出する場合に特に有効である。
　ここで、ランダム配列８０１の塩基長を10塩基としたが、これに限定されない。検出対象が含まれる割合が少ない場合、ランダム配列の塩基長を長くすることにより、より多くの種類をもつヘアピンプライマーを反応に用いることが出来、検出対象（例えば異常細胞由来核酸）とそれ以外（正常細胞由来の核酸）で同じランダム配列を持つヘアピンプライマーを使用することなく、増幅することが可能になる。つまり、ヘアピンプライマーが前記標的配列の変異の数以上のランダム配列種を有することが好ましい。
　尚、図８ではランダム配列８０１の位置を二本鎖形成配列の箇所としたが、ヘアピンのループ部分を含めてランダム配列を形成してもよい。また、特に限定するものではないが、ヘアピンプライマーのステム部の塩基長は、8～20塩基、例えば16～18塩基の範囲とすることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
１００　ナノポアラマンＤＮＡシーケンサ装置
１０１　光源
１０２　対物レンズ
１０３　顕微鏡観察容器
１０４　ＸＹステージ
１０５　Ｚ軸調整機構
１０６　フィルタ
１０７　ビームスプリッター
１０８　回折格子
１０９　検出器　
１１０　ＬＥＤ
１１１　二次元検出器
１１２　ミラー
１１３　多重照射機構
１１４　レンズ
１１５　駆動制御部
１１６　コンピュータ
１１７　ＮＩＲ（近赤外）ミラー
２０１　観察容器
２０２　ナノポア
２０３　基板
２０４　試料導入区画
２０５　試料流出区画
２０６　流入路
２０７　流入路
２０８　流出路
２０９　流出路
２１０　液体
２１１　液体
２１２　試料
２１３　電極
２１４　電極
２１５　導電性薄膜
２１６　液浸媒体
２１７　対物レンズ
３００　ヘアピンプライマー
３００ａ　ヘアピンプライマー３００の伸長産物
３０１　ヘアピン構造を形成させる相補鎖配列部
３０２　ヘアピンプライマーにおける相補鎖配列部
３０３　プライマー
３０３ａ　プライマー３０３の伸長産物
３０３ｂ　プライマー３０３の伸長産物
３０３ｃ　プライマー３０３の伸長産物
３０３ｄ　プライマー３０３の伸長産物
６０１　ヘアピンアダプタ
７０１　AT（アデニンとチミン）の配列に富んだ配列
８０１　ランダム配列
８０２　ランダム配列の相補配列
８０３　異なるランダム配列を有するヘアピンプライマー
８０４　異なるランダム配列を有するヘアピンプライマー
８０５　異なるランダム配列を有するヘアピンプライマー
９０１　ランダム配列
９０２　核酸分子01～05で共通して異なる塩基

Claims (17)

  1. 　ナノポアシーケンサによる核酸配列決定の為の一本鎖核酸分子の構築方法であって、
    　　3'側に一本鎖領域を含む少なくとも一つのヘアピンプライマーと、対をなすプライマーとを用いて標的配列を含む鋳型DNAの相補鎖を合成する工程と、
    　　合成された相補鎖が分子内にヘアピン構造を形成して自己を鋳型に伸長反応を行うようにする工程と
    を含み、得られた核酸分子が標的配列及びその相補鎖の双方を配列中に含むものである、上記方法。
  2. 前記ヘアピンプライマーのステム部が、前記一本鎖部のTm値より高いTm値を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 反応の進行によるヘアピンプライマーの減少と共に、合成された相補鎖配列が自己を鋳型に伸長反応を行う、請求項１に記載の方法。
  4. ヘアピンプライマーの5'末端を使用前にリン酸化し、目的の核酸分子の構築後にヘアピンプライマー5'末端がリン酸化したDNA鎖を分解する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  5. λエキソヌクレアーゼを使用して前記分解を行う、請求項４に記載の方法。
  6. 5'末端がリン酸化したDNA鎖の分解後、その相補鎖の3'末端からヘアピン構造を介して自己アニールする伸長反応を行う、請求項４に記載の方法。
  7. ヘアピンループ構造をもつアダプタを前記生成物と連結し、鎖置換反応を行って核酸分子を伸長させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  8. ヘアピンループ構造をもつアダプタを前記生成物と連結し、鎖置換反応を行って核酸分子を伸長させる、請求項６に記載の方法。
  9. 前記対をなすプライマーから形成された末端を固定化し、相補鎖DNAを解離させた後に伸長反応を行う、請求項１に記載の方法。
  10. 前記アダプタのループ構造部が、伸長反応阻害分子を含む、請求項７又は８に記載の方法。
  11. 前記対をなすプライマーがDNAとRNAのキメラ構造を有し、伸長反応後にRNAを分解する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  12. 請求項１に記載の方法によって得られた核酸分子の塩基配列をナノポアシーケンサによって解析することを含む、核酸塩基配列決定方法。
  13. 配列決定工程において、核酸分子中に含まれる既知の塩基配列から得られる信号を元に検出器の校正を行う、請求項１２に記載の方法。
  14. 配列決定工程において、核酸分子中に含まれる既知の塩基配列から得られる信号を元に解析を行う、請求項１２に記載の方法。
  15. 二本鎖形成した反応物を用い、ナノポアを通過する反応物の速度を制御する、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記ヘアピンプライマーがランダム配列を有する、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ヘアピンプライマーが前記標的配列の変異の数以上のランダム配列種を有する、請求項１６に記載の方法。
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