CN115356411B - 一种高效液相色谱法检测l-哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法 - Google Patents

一种高效液相色谱法检测l-哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药制剂技术领域，公开了一种高效液相色谱法检测L‑哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法，同时分析检测L‑哌啶甲酸盐酸盐中6种有关物质：D‑酒石酸、吡啶‑2‑甲酸、吡啶‑4‑甲酸、吡啶‑3‑甲酸、哌啶‑4‑甲酸和哌啶‑3‑甲酸的方法。

Description

一种高效液相色谱法检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法，更具体地说，涉及一种同时分析检测L-哌啶甲酸盐酸盐中6种有关物质：D-酒石酸、吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、哌啶-4-甲酸和哌啶-3-甲酸的方法。
背景技术
有关物质与药品质量、安全性及疗效密切相关，有关物质的存在可能会降低药物的疗效，甚至引起毒副作用，因此，必须通过适当的检测分析方法控制药物中有关物质的种类和含量，确保药品质量。
L-哌啶甲酸盐酸盐可作为酰胺类局麻药合成的起始物料。
L-哌啶甲酸盐酸盐在生产过程中可能产生6种有关物质，分别为D-酒石酸、吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、哌啶-4-甲酸和哌啶-3-甲酸。上述6种有关物质，其含量的多少直接影响了L-哌啶甲酸盐酸盐的质量，目前尚未存在一种方法可同时将以上6种有关物质从L-哌啶甲酸盐酸盐中检测出来。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是构建一种色谱条件，能同时准确地分析检测L-哌啶甲酸盐酸盐中上述6种有关物质，各有关物质结构式分别如下：
本申请的发明人通过对离子对试剂-无机盐混合溶液的组成和溶液pH值等条件进行筛选，兼顾L-哌啶甲酸盐酸盐和6个有关物质分离的需要，最终建立了适当的分析方法，将分析周期控制在25min，主成分与各有关物质之间、各有关物质之间均能达到基线分离，达到本发明的目的。
本发明提供一种高效液相色谱法检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法，包括如下步骤：a.取L-哌啶甲酸盐酸盐，用水、流动相、磷酸溶液或有机溶剂的水溶液，配制成含L-哌啶甲酸盐酸盐溶液；b.取步骤a所得溶液注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，其特征在于步骤b中所述高效液相色谱检测的流动相由离子对试剂-无机盐混合溶液和色谱纯有机溶剂组成，所述流动相的pH值为1.8～2.0。
在一些实施方式中，流动相的pH值为1.9。
在一些实施方式中，步骤b中所述离子对试剂-无机盐混合溶液和色谱纯有机溶剂的体积比例为83:17～87:13，优选85:15，所述色谱纯有机溶剂优选色谱纯乙腈。
其中，所述离子对试剂-无机盐混合溶液可以理解为缓冲溶液。
在一些实施方式中，所述离子对试剂-无机盐混合溶液中含无机盐0.01mol/L；或者所述离子对试剂-无机盐混合溶液中含离子对试剂为0.02～0.05mol/L，优选0.03mol/L；或者所述离子对试剂-无机盐混合溶液中还含有用于调节pH值的无机酸。
在一些实施方式中，所述无机盐优选磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾和/或磷酸氢二铵，优选磷酸二氢铵，或者所述离子对试剂为辛烷磺酸钠，或者所述无机酸为磷酸。
在一些实施方式中，步骤a中L-哌啶甲酸盐酸盐溶液浓度为1～5mg/ml，优选2mg/ml。
在一些实施方式中，步骤a中所述有机溶剂的水溶液选自腈类的水溶液，优选13％～17％乙腈水溶液，最优选15％乙腈水溶液。
在一些实施方式中，步骤a中优选磷酸溶液。
在一些实施方式中，步骤b中所述高效液相色谱仪中的高效液相色谱柱为亲水性的色谱柱，优选以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱。
在一些实施方式中，步骤b中高效液相色谱仪柱温为20～60℃，优选25℃。
在一些实施例中，步骤b中高效液相色谱仪的色谱柱是Shim-pack GIST，4.6×250mm，5μm。
在一些实施方式中，步骤b中所述高效液相色谱检测为紫外检测，检测波长200～400nm，优选210nm。
在一些实施方式中，步骤b中所述高效液相色谱检测的流动相流速为0.5～1.4ml/min，优选0.9～1.1ml/min，最优选1ml/min。
在一些实施方式中，步骤b中所述高效液相色谱检测的色谱条件如下：色谱柱：Shim-pack GIST，4.6×250mm，5μm；检测器：UV检测器，检测波长210nm；流动相流速：0.9～1.1ml/min；柱温：22～30℃；流动相：离子对试剂-无机盐混合溶液(每1000ml离子对试剂-无机盐混合溶液中含磷酸二氢铵0.01mol、含辛烷磺酸钠0.03mol)-乙腈(83:17～87:13)，用磷酸调pH值为1.8～2.0。
在一些实施方式中，所述离子对试剂-无机盐混合溶液的配制方法为：向水中加入磷酸二氢铵0.01mol和辛烷磺酸钠0.03mol，然后加水至溶液体积为1000ml。
在一些实施方式中，供试品溶液的配制方法为：用15％乙腈水溶液制成每1ml含L-哌啶甲酸盐酸盐约2mg的溶液；进样体积是20μl。
本发明提供一种高效液相色谱法检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法，包括如下步骤：a.取L-哌啶甲酸盐酸盐，用水、流动相、磷酸溶液或有机溶剂的水溶液，配制成含L-哌啶甲酸盐酸盐溶液；b.取步骤a所得溶液注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，其中
步骤b的色谱条件为：仪器：岛津高效液相色谱仪LC-20ADXR；色谱柱：Shim-packGIST，4.6×250mm，5μm；检测器：UV检测器，检测波长210nm；流速：1ml/min；柱温：25℃；流动相：离子对试剂-无机盐混合溶液(每1000ml该离子对试剂-无机盐混合溶液中含磷酸二氢铵0.01mol、辛烷磺酸钠0.03mol)-乙腈(离子对试剂-无机盐混合溶液和乙腈体积比为85:15)，用磷酸调pH值为1.9；
试验步骤为：
稀释液(空白溶液)：15％乙腈溶液；
有关物质对照品贮备液：称取D-酒石酸、吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸、L-哌啶甲酸对照品各约200mg，分别置不同的100ml量瓶中，加15％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；
杂质峰鉴别溶液：精密量取对照品贮备液中吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸对照品贮备液各1ml和D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸对照品贮备液各4ml分别置不同的50ml量瓶中，用15％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀；
供试品溶液：称取L-哌啶甲酸盐酸盐约200mg，精密称定，置100ml量瓶中，加15％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
分别精密量取空白溶液、供试品溶液和各杂质峰鉴别溶液各20μl，采用上述色谱条件进样检测，记录色谱图。按有关物质峰面积外标法计算L-哌啶甲酸盐酸盐中有关物质的含量。
本发明所述的用HPLC分离测定L-哌啶甲酸盐酸盐的有关物质的方法，可以采用以有关物质峰面积外标法计算L-哌啶甲酸盐酸盐中的有关物质含量。与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：专属性好、重现性好、准确度高、精密度高。
附图说明
图1是实施例1专属性试验的空白溶液的色谱图；
图2-1是实施例1中专属性试验的“D-酒石酸”杂质峰鉴别溶液的色谱图；
图2-2是实施例1中专属性试验的“吡啶-2-甲酸”杂质峰鉴别溶液的色谱图；
图2-3是实施例1中专属性试验的“吡啶-4-甲酸”杂质峰鉴别溶液的色谱图；
图2-4是实施例1中专属性试验的“吡啶-3-甲酸”杂质峰鉴别溶液的色谱图；
图2-5是实施例1中专属性试验的“哌啶-4-甲酸”杂质峰鉴别溶液的色谱图；
图2-6是实施例1中专属性试验的“哌啶-3-甲酸”杂质峰鉴别溶液的色谱图；
图3是实施例1中专属性试验的供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员理解本发明内容，下面申请人将结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不以任何方式限制本发明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得。其中L-哌啶甲酸盐酸盐来自安徽红杉生物医药科技有限公司，批号为：H4061-191002。本发明所提供的分析方法中用到的试剂均是符合中国药典2020版的分析试剂要求。
实施例1专属性试验
色谱条件：
仪器：岛津高效液相色谱仪LC-20ADXR；
色谱柱：Shim-pack GIST，4.6×250mm，5μm；
检测器：UV检测器，检测波长210nm；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
流动相：离子对试剂-无机盐混合溶液(每1000ml该离子对试剂-无机盐混合溶液中含磷酸二氢铵0.01mol、辛烷磺酸钠0.03mol)-乙腈(离子对试剂-无机盐混合溶液和乙腈体积比为85:15)，用磷酸调pH值为1.9；
试验步骤：
稀释液(空白溶液)：15％乙腈溶液。
有关物质对照品贮备液：称取D-酒石酸、吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸、L-哌啶甲酸对照品各约200mg，分别置不同的100ml量瓶中，加15％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质峰鉴别溶液：精密量取对照品贮备液中吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸对照品贮备液各1ml和D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸对照品贮备液各4ml分别置不同的50ml量瓶中，用15％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：称取L-哌啶甲酸盐酸盐约200mg，精密称定，置100ml量瓶中，加15％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
分别精密量取空白溶液、供试品溶液和各杂质峰鉴别溶液各20μl，采用上述色谱条件进样检测，记录色谱图。空白图谱如图1，杂质峰鉴别溶液图谱如图2，供试品溶液图谱如图3。按有关物质峰面积外标法计算L-哌啶甲酸盐酸盐中有关物质的含量。检测结果如表1所示。
表1和附图1-3表明，本发明提供的方法在检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质，特别是检测吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、D-酒石酸、哌啶-4-甲酸及哌啶-3-甲酸时，空白无干扰，具有很好的专属性。
表1
实施例2耐用性试验
本实施例通过改变部分色谱条件的参数考察色谱方法的耐用性，以如下色谱条件为基础：
色谱条件：
仪器：岛津高效液相色谱仪LC-20ADXR；
色谱柱：Shim-pack GIST，4.6×250mm，5μm；
检测器：UV检测器，检测波长210nm；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
流动相：离子对试剂-无机盐混合溶液(每1000ml该离子对试剂-无机盐混合溶液中含磷酸二氢铵0.01mol、辛烷磺酸钠0.03mol)-乙腈(离子对试剂-无机盐混合溶液和乙腈体积比为85:15)，用磷酸调pH值为1.9；
试验步骤：
以单因素变化的方式考察改变流速、色谱柱温度、或流动相组成的比例等色谱条件对检测系统适用性溶液的影响，主要考察改变色谱条件对系统适用性溶液中各有关物质间的分离度的影响。
稀释液(空白溶液)：15％乙腈溶液。
系统适用性溶液：取L-哌啶甲酸200mg于100ml量瓶中，加15％乙腈溶液溶解，精密量取对照品贮备液中吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸对照品贮备液各100μl和D-酒石酸、哌啶-4-甲酸和哌啶-3-甲酸贮备液各500μl，置上述100ml量瓶中，用15％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
在各考察色谱条件下，分别精密量取系统适用性溶液20μl，记录各色谱图。分离度检测结果如表2所示。
可见，在单因素改变部分色谱条件参数的情况下，本方法依然适用于检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质，其中考察的系统适用性溶液的分离度受影响不大，所述方法具有良好的耐用性，在适当范围内变更色谱条件完全不影响本方法实现分析目的。
表2
实施例3精密度实验
色谱条件为如实施例1所述色谱条件。
稀释液(空白溶液)：15％乙腈溶液。
有关物质对照品贮备液按实施例1中的配制方法配制。
供试品溶液按实施例1中的配制方法配制。
有关物质对照品溶液：精密量取有关物质对照品贮备液杂质吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸对照品贮备液各100μl和D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸及L-哌啶甲酸贮备液各500μl，置同一100ml量瓶中，用15％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取空白溶液、供试品溶液有关物质对照品溶液各20μl，采用实施例1所述色谱条件进样检测，记录色谱图。按有关物质峰面积外标法计算6份重复性试验溶液中有关物质的含量、计算相对标准偏差值(RSD)，检测结果如表3所示。
可见，采用本发明提供的分析方法测定L-哌啶甲酸盐酸盐中的有关物质，重复检测6次，有关物质含量测定结果相对标准偏差为1.24％。
表3
实施例4回收率试验
色谱条件为如实施例1所述色谱条件。
稀释液(空白溶液)：15％乙腈溶液。
有关物质对照品贮备液按实施例1中的配制方法配制。
有关物质对照品溶液按实施例3中的配制方法配制。
供试品溶液按实施例1中的配制方法配制。
有关物质母液的配制：精密量取有关物质对照品贮备液吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸对照品贮备液各1.25ml和D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸及L-哌啶甲酸贮备液各6.25ml，置同一50ml量瓶中，用15％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，作为有关物质母液。
回收率试验溶液：取L-哌啶甲酸盐酸盐50mg，精密称定，置25ml的容量瓶中，平行称取9份，编号为1-9，备用。精密量取有关物质母液0.5ml三份分别置上述1-3号25ml容量瓶中，用15％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为50％-1、50％-2和50％-3回收率溶液；精密量取有关物质母液1ml三份分别置上述4-6号25ml容量瓶中，用15％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为100％-1、100％-2和100％-3回收率溶液；精密量取有关物质母液1.5ml三份分别置上述7-9号容量瓶中，用15％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为150％-1、150％-2和150％-3回收率溶液。
分别精密量取空白溶液、有关物质对照品溶液、供试品溶液、回收率试验溶液各20μl，采用实施例1所述色谱条件进样检测，记录色谱图。按有关物质峰面积外标法计算9份回收率试验溶液中各有关物质的含量，以测得量减去本底量(或测得量)与实际加入量的比值为回收率，检测结果见表4所示。
可见，通过测定中不同浓度水平的吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、D-酒石酸、哌啶-4-甲酸及哌啶-3-甲酸的回收率，考察本发明的分析方法在测定有关物质的准确性。实验结果表明，不同浓度水平的各有关物质平均回收率均在97％以上，各有关物质回收率的相对标准偏差均在3.3％以下。因此所述方法在测定L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质中具有很好的准确性。
表4
实施例5线性试验
色谱条件为如实施例1所述色谱条件。
稀释液(空白溶液)：15％乙腈溶液。
有关物质对照品贮备液按实施例1中的配制方法配制。
线性贮备液：精密量取有关物质对照品贮备液吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸对照品贮备液各1ml和D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸及L-哌啶甲酸贮备液各5ml，置同一100ml量瓶中，用15％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀。
精密量取线性贮备液1.25ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.75ml、5.0ml分别置25ml容量瓶中，用15％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液，分别精密量取线性溶液各20μl，采用实施例1所述色谱条件进样检测，记录色谱图。按峰面积和浓度计算线性方程，并计算相关系数，各有关物质线性结果见表5所示。
可见，各有关物质在约0.02～20μg/mL的范围内线性回归系数R2均大于0.99，证实了良好线性关系。
表5
有关物质名称 浓度范围(ug/ml) 线性方程 相关系数R2
酒石酸 0.29623～19.74876 y＝1768.90x+470.17 0.9999
吡啶-2-甲酸 0.01505～4.01287 y＝44961.42x+736.54 0.9999
吡啶-4-甲酸 0.01943～3.88535 y＝56089.44x+638.25 0.9999
吡啶-3-甲酸 0.01984～3.96713 y＝54668.72x+968.33 0.9999
哌啶-4-甲酸 3.99389～19.96946 y＝435.91x-91.12 0.9999
哌啶-3-甲酸 3.98605～19.93026 y＝446.91x+30.19 0.9997
L-哌啶甲酸 3.93156～19.65782 y＝446.91x+30.19 0.9995
实施例6各有关物质检测限度测定
根据信噪比法，分别取吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸及L-哌啶甲酸对照品各适量，用15％乙腈溶液分别制成不同浓度的供试品溶液；采用实施例1所述色谱条件进样检测，记录色谱图，当有关物质吸收峰信号为仪器噪音信号的3倍时，作为检测限，当有关物质吸收峰信号为仪器噪音信号的10倍时，作为定量限，经试验，确定了各有关物质的检出限的定量限，结果见表6。
可见，本发明提供的分析方法对各有关物质的检测有较高的灵敏度。
表6
有关物质名称 定量限(μg) 检出限(μg)
D-酒石酸 0.2968 0.0890
吡啶-2-甲酸 0.0153 0.0046
吡啶-4-甲酸 0.0212 0.0032
吡啶-3-甲酸 0.0198 0.0059
哌啶-4-甲酸 4.0392 0.6059
哌啶-3-甲酸 5.2871 0.7081
L-哌啶甲酸盐酸盐 7.1358 2.141
综上所述，实施例1的实验结果和附图1-3表明，本发明提供的方法在检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质，特别是检测吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、D-酒石酸、哌啶-4-甲酸及哌啶-3-甲酸时，空白无干扰，具有很好的专属性。
实施例2的实验结果表明在单因素改变部分色谱条件参数的情况下，本方法依然适用于检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质，其中考察的系统适用性溶液的分离度受影响不大，所述方法具有良好的耐用性，在适当范围内变更色谱条件完全不影响本方法实现分析目的。
实施例3的实验结果表明采用本发明提供的分析方法测定L-哌啶甲酸盐酸盐中的有关物质，重复检测6次，有关物质含量测定结果相对标准偏差为1.24％。
实施例4的试验结果通过测定不同浓度水平的吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、及哌啶-3-甲酸的回收率，考察本发明的分析方法在测定有关物质的准确性。实验结果表明，不同浓度水平的各有关物质平均回收率均在97％以上，各有关物质回收率的相对标准偏差均在3.3％以下。因此所述方法在测定L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质中具有很好的准确性。
实施例5的试验结果表明各有关物质在约0.02～20μg/mL的范围内线性回归系数R2均大于0.99，证实了良好线性关系。
实施例6的试验结果表明本发明提供的分析方法对各有关物质的检测有较高的灵敏度。
对比例1
色谱条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪e2695；
色谱柱：大曹三耀CAPCELL PAK CR 1:4 5μm 2.0mmI.D.×150mm；
检测器：UV检测器，检测波长210nm；
流速：0.3ml/min；
柱温：30℃；
流动相A：0.1％磷酸溶液；
流动相B：50mmol磷酸二氢铵(pH＝3.0)：乙腈＝40：60；
流动相A：流动相B＝25：75；
试验步骤：
稀释液(空白溶液)：水。
D-酒石酸溶液：称取D-酒石酸约200mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
L-哌啶甲酸溶液：称取L-哌啶甲酸约200mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
依次进入空白溶液，D-酒石酸溶液和L-哌啶甲酸溶液，发现在L-哌啶甲酸图谱中D-酒石酸出峰处存在干扰峰，出现倒峰。
因此，本发明所提供的分析方法在测定L-哌啶甲酸盐酸盐中有关物质具有专属性好、重现性好、准确度高、精密度高等优点。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说显而易见的，它们都将被视为包括在本发明请求保护的范围内。

Claims (1)

1.一种高效液相色谱法检测L-哌啶甲酸盐酸盐有关物质的方法，包括如下步骤：
a.取L-哌啶甲酸盐酸盐，用水、流动相、磷酸溶液或有机溶剂的水溶液，配制成含L-哌啶甲酸盐酸盐溶液；
b.取步骤a所得溶液注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测；
其中，步骤b的色谱条件为：
仪器：岛津 高效液相色谱仪 LC-20ADXR；
色谱柱：Shim-pack GIST，4.6×250mm，5μm；
检测器：UV检测器，检测波长210nm；
流速：1mL/min；
柱温：25℃；
流动相：离子对试剂-无机盐混合溶液—乙腈，用磷酸调pH值为1.9；每1000mL离子对试剂-无机盐混合溶液中含磷酸二氢铵0.01mol、辛烷磺酸钠0.03mol；所述离子对试剂-无机盐混合溶液和乙腈体积比为85:15；
试验步骤为：
稀释液，即空白溶液：15％乙腈溶液；
有关物质对照品贮备液：称取D-酒石酸、吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸、L-哌啶甲酸对照品各约200mg，分别置不同的100mL量瓶中，加15%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；
杂质峰鉴别溶液：精密量取对照品贮备液中吡啶-2-甲酸、吡啶-4-甲酸、吡啶-3-甲酸对照品贮备液各1mL和D-酒石酸、哌啶-4-甲酸、哌啶-3-甲酸对照品贮备液各4mL分别置不同的50mL量瓶中，用15%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀；
供试品溶液：称取L-哌啶甲酸盐酸盐约200mg，精密称定，置100mL量瓶中，加15%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
分别精密量取空白溶液、供试品溶液和各杂质峰鉴别溶液各20μl，采用上述色谱条件进样检测，记录色谱图，按有关物质峰面积外标法计算L-哌啶甲酸盐酸盐中有关物质的含量。
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