JPH11514227A - シンナモイルＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡ配列及び植物のリグニン含有量の調節の分野におけるその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コーディング領域としてウマゴヤシ属及び／又はトウモロコシの中でシンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードするｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の全部又は一部、又は上述のｍＲＮＡとハイブリダイズすることのできるアンチセンスｍＲＮＡをコードし、前記配列と相補性をもつ配列の全部又は一部を含むあらゆるＤＮＡ配列に関する。本発明は同様に、植物内のリグニン生合成の調節方法を実施するための前記配列の利用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 シンナモイルＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡ配列及び 植物のリグニン含有量の調節の分野におけるその応用 本発明は、植物内のリグニンの割合の調節方法の実施の枠内での、植物内のシ ンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードするＤＮＡ配列、又はこれら の配列のあらゆるフラグメント或いは又これらの配列から誘導されたあらゆる配 列又はその相補的配列の利用を目的とする。 リグニンは、植物の或る種の細胞の壁を不透過性にし補強する複合異種芳香族 重合体である。 リグニンは、パラクマリルアルコール、コニフエリルアルコール及びシナピル アルコールといったモノリグノールから派生する遊離ラジカルの重合によって形 成される(Higuchi，1985，Biosynthesis and degradation of wood components （T．Higuchi編），Academic Press，Orlands，FL，p141〜160)。 リグニンは、種によって及び同一植物内でも異なる組織によって、そのモノリ グノール相対含有量の大幅な変動を示す。 この変動は恐らくは、リグニンの単量体の生合成に必要な酵素の基質の異なる 活性及び特異性に起因するものであり、これによって制御される（ヒグチ、１９ ８５年、前出）。 植物の構造及び発達におけるその役割を超えて、リグニンは、陸上バイオマス の主成分であり、経済的生態学的に大きな重要性をもっている(Brown，1985，J ．Appl．Biochem．7，371〜387; Whetten and Sederoff，1991，Forest Ecology and Management，43，301〜316)。 バイオマスの開発利用という面では、まず第１に、リグニンが飼料植物の消化 率及び栄養効率の制限要因であるということを指摘しておくべきである。実際、 反芻動物による飼料植物の消化率がこれらの植物のリグニン含有量に反比例し、 リグニンの性質もこの現象の決定要因である、ということが明確に実証されてい る(Buxtan and Roussel，1988，Crop．Sci．28，553〜558; Jung and Vogel，19 86，J．Anim，Sci．62，1703〜1712)。 リグニン含有量を減少させるのが有利である主要な飼料植物としては、ウマゴ ヤシ属、ウシノケグサ属、トウモロコシ、エンシレージで利用される飼料などが 挙げられる。 同様に、高いリグニン含有量が、一部、家畜の食糧向けのヒマワリの搾りカス の制限ある品質及び園芸の分野におけるいくつかの種子の発芽能力の低下の原因 となっているということにも留意されたい。 同様に、収穫後の植物器官の保存の際に発生する集中的な木質化が、アスパラ ガス、ヤマノイモ属、ニンジンなどといった生産物を急速に消費不適なものにす る、ということも強調しておきたい。 なお、製紙産業におけるパルプの生産の一環として毎年木質材料から５，００ ０万トン以上のリグニンが抽出されているということも指摘しておきたい。セル ロースを得るのに必要なこの抽出作業は、エネルギー面で高くつき、第２に抽出 のために用いられかつ環境内に再び見い出される化学化合物を通して汚染力をも つものである（Dean and Eriksson，1992，Holzforschung，46，135〜147; Whet ten and Sederoff，1991,前出）。 （種によって乾燥物質の２０〜３０％を占める）リグニンの割合を数パーセン ト（２〜５％）低減することは、効率の増大、実質的節約（化学製品）を意味し 、環境の改善に寄与することになるだろう（汚染の減少）。木質物質の利用の規 模から考えると、これらの効果は、きわめて重要な反響をもたらすだろう。この 場合、関係する種としては、ポプラ、ユーカリ、Acacia mangium、モクマオウ属 そしてパルプの生産に利用される被子植物亜門及び裸子植物全体があると考えら れる。 考慮対象の２つの分野において、細胞壁を強化するリグニンが植物の組み立て られた形態の維持に重要な役割を果たすことから、植物（又は樹木）の剛性特性 及びその正常な構成を保つようにリグニンの割合の減少を加減する必要があるこ とは明白である。 同一の種について自然の中で遵守されているリグニン含有量における自然の変 動（差異は個体間で乾燥質量の６〜８％にまで至る可能性がある）は、上述の減 少を可能にしている。 リグニンの分解に対する耐性並びにその抽出の枠内で遭遇する問題点は、恐ら くは単量体間のエーテル及び炭素−炭素結合から成るこの重合体の複雑な構造、 並びに細胞壁の他の成分とリグニンの間に存在する多数の化学結合に起因するも のである(Sarkanen and Ludurig，1971，「Lignins: Occurrence，Formation，S tructure and Reactions」中(K.V．Sarkanen and C.H．Kudwig編)New York;Wile y Interscience，p1〜18)。 シンナモイル−ＣｏＡから出発して、植物内でのリグニンの生合成は、以下の 要領で行われる。 植物におけるリグニンの割合を低減させようとする遺伝子工学上のアプローチ は、上述のこれらのリグニンの生合成の連鎖の１つの酵素の合成を阻害すること で構成されることになるだろう。 このようなアプローチの一環として特に適切な技術は、これらの酵素をコード するｍＲＮＡとハイブリダイズしその結果少なくとも部分的にその対応するｍＲ ＮＡからのこれらの酵素の産生を妨げることのできるアンチセンスｍＲＮＡの利 用という技術である。 タバコにおけるＣＡＤをコードする遺伝子を用いて実現されるこのようなアン チセンス戦略は、植物内のＣＡＤをコードするｍＲＮＡに対しハイブリダイズす ることによってこれらの植物内のリグニンの産生を阻害することのできるアンチ センスｍＲＮＡの利用について記述する欧州特許出願第５８４１１７号の対象と なっている。 このように形質転換された植物のレベルでの結果は、ＣＡＤの活性の減少を実 証しているが、逆説的にリグニン含有率は進展を示さない。補足的研究は、シン ナミルアルデヒドがリグニン重合体の中に直接取込まれることから、形質転換さ れた植物のリグニンが対照リグニンと異なっていることを示している。 本発明の目的の１つは、正に、植物内のリグニン含有量を植物内の正常な含有 量との関係におけるこれらの含有量の著しい減少の方向か又はこれらの含有量の 増大の方向において効果的に調節できるようにする方法を提供することにある。 本発明のもう１つの目的は、このような方法の利用のための手段、より具体的 には植物の形質転換のために利用可能な構築物を提供することにある。 本発明のもう１つの目的は、形質転換されない樹木の場合よりもそのリグニン 抽出が容易でかつ汚染度が低い、遺伝子的に形質転換された植物、特に形質転換 されない植物よりも消化率が優れている可能性のある飼料植物更にはパルプ生産 のために形質転換された植物又は樹木を提供することにある。 本発明のもう１つの目的は、形質転換されない植物に比べ環境の攻撃特に寄生 虫の攻撃に対し更に耐性をもつ形質転換された植物、又はサイズが（形質転換さ れていない植物よりも）大きいか又は小さい形質転換された植物を提供すること にある。 本発明の目的は、 − それ自体配列番号２で表わされるウマゴヤシ属のシンナモイルＣｏＡレグタ クターゼ（ＣＣＲ）をコードするｍＲＮＡをコードする配列番号１により表わさ れるヌクレオチド配列、 − それ自体配列番号４で表わされるトウモロコシのＣＣＲをコードするｍＲＮ Ａをコードする、配列番号３により表わされるヌクレオチド配列、 − それぞれ配列番号２で表わされるＣＣＲのフラグメント又は配列番号３で表 わされるＣＣＲのフラグメントをコードし、上述の２つのＣＣＲのものと同等の 酵素活性を示す、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列又は配列番号３で表 わされるヌクレオチド配列のフラグメント、 − それぞれ配列番号１及び配列番号３の配列によりコードされるｍＲＮＡとハ イブリダイズすることのできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号１ 又は配列番号３によって表わされる配列との相補性をもつヌクレオチド配列、 − それぞれ配列番号２で表わされるＣＣＲをそれ自体コードするｍＲＮＡ又は 配列番号４で表わされるＣＣＲをそれ自体コードするｍＲＮＡとハイブリダイズ することのできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号１又は配列番号 ３により表わされる配列との相補性をもつヌクレオチド配列のフラグメント、 − それぞれ配列番号２又は４により表わされるＣＣＲをそれ自体コードするｍ ＲＮＡについて、又は植物内で前記ＣＣＲのものと同等の酵素活性を呈するフラ グメント又は前記配列から誘導されたタンパク質をコードする、特に単数又は複 数のヌクレオチドの変異及び／又は付加、及び／又はサプレッション及び／又は 置換により配列番号１又は３で表わされる配列から誘導されたヌクレオチド配列 、 − 前記ｍＲＮＡのうちの１つとハイブリダイズすることのできるアンチセンス ｍＲＮＡをコードする、変異及び／又は付加及び／又はサプレッション及び／又 は置換により、上述の相補的ヌクレオチド配列又は上述のとおりのこの配列のフ ラグメントから誘導されたヌクレオチド配列、 の中から選ばれたヌクレオチド配列で構成されている単数又は複数のコーディン グ領域を含む組換えヌクレオチド配列の、植物内で産生されたリグニンの正常な 含有量との関係における産生されたリグニンの含有量の増加方向又は減少方向で 及び／又は形質転換されていない植物の中で産生されたリグニンとの関係におい てこのトランスジェニック植物により産生されるリグニンの組成を修正する方向 で、特に植物の中のリグニンの量の調節用の以下に記述する方法の１つを利用す ることによりリグニン生合成が内部で調節されているこのトランスジェニック植 物を獲得することを目的とした植物細胞の形質転換のための利用にある。 以上及び以下で用いる「誘導されたヌクレオチド配列」というのは、それを誘 導した配列のものと相同なヌクレオチドを約５０％以上（好ましくは７０％以上 ）有するあらゆる配列のことである。 以上及び以下で用いる「誘導されたタンパク質」というのは、それを誘導した タンパク質のものと相同なアミノ酸を約５０％以上（好ましくは７０％以上）有 する全てのタンパク質のことである。 本発明は、特に、コーディング領域として − それ自体配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡをコードする 、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列、又は − 上述のＣＣＲのものと同等の酵素活性を示す、配列番号２により表わされる ＣＣＲのフラグメントをコードする、上述のヌクレオチド配列のフラグメント、 又は、 − それ自体配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、又は植物内 で前記ＣＣＲのものと同等の酵素活性を呈しこの配列から誘導されたタンパク質 をコードする、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又 はサプレッション及び／又は置換により上述の配列番号１で表わされる配列又は この配列の上述のとおりのフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配 列、 を含むことを特徴とする全てのＤＮＡ配列を目的としている。 本発明は、より具体的に言うと、コーディング領域として、 − それ自体配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡをコードする 、配列番号３で表わされるヌクレオチド配列、又は − 上述のＣＣＲのものと同等の酵素活性を示す、配列番号４により表わされる ＣＣＲのフラグメントをコードする、上述のヌクレオチド配列のフラグメント、 又は、 − それ自体配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、又は植物内 で前記ＣＣＲのものと同等の酵素活性を呈しこの配列から誘導されたタンパク質 をコードする、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又 はサプレッション及び／又は置換により上述の配列番号３で表わされる配列又は この配列の上述のとおりのフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配 列、 を含むことを特徴とする全てのＤＮＡ配列を目的とする。 植物内に存在するＣＣＲ、より具体的には配列番号２及び４により表わされる ＣＣＲのものと同等の酵素活性を有するタンパク質というのは、Eur．J．Bioche m．(1981)，119; 115〜127 の中で発表されたLuderitz及びGrisebach の方法に 従って測定されるようなＣＣＲ活性を有するあらゆるタンパク質のことである。 一例を挙げると、この方法は、３６６nmでのシンナモイルＣｏＡの消滅を追跡 することにより、タンパク質（ＣＣＲ又は誘導体）の還元活性を分光測光するこ とによって実施される。反応は、２〜１０分間３０℃で推移する。反応媒質の組 成は以下の通りである：リン酸緩衝液１００mM、pH６．２５、０．１mMのＮＡＤ ＰＨ、７０μM のFeruloyl ＣｏＡ、５〜１００μl の酵素抽出物、合計体積５ ００μl 中。 本発明は同様に、コーディング領域として、 − それ自体配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、すなわち配 列番号１で表わされる配列によりコードされたか又は上述のとおりのこの配列か ら誘導された配列によってコードされたｍＲＮＡとハイブリダイズすることので きるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号１で表わされるものとの相補 性をもつヌクレオチド配列、又は − それ自体上述の通りの配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ とハイブリダイズすることのできるＣＣＲをコードするｍＲＮＡとハイブリダイ ズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、上述の相補的配列のフラグメント 、又は − 上述のｍＲＮＡとハイブリダイズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする 、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又はサプレッシ ョン及び／又は置換によって上述の相補的配列又は上述の通りのこの相補的配列 のフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配列 を含むことを特徴とするあらゆるＤＮＡ配列をも目的としている。 本発明は、より具体的には、コーディング配列として、 − それ自体配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、すなわち配 列番号３で表わされる配列によりコードされたか又は上述のとおりのこの配列か ら誘導された配列によってコードされたｍＲＮＡとハイブリダイズすることので きるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号３で表わされるものとの相補 性をもつヌクレオチド配列、又は − それ自体上述の通りの配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ とハイブリダイズすることのできるＣＣＲをコードするｍＲＮＡとハイブリダイ ズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、上述の相補的配列のフラグメント 、又は − 上述のｍＲＮＡとハイブリダイズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする 、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又はサプレッシ ョン及び／又は置換によって上述の相補的配列又は上述の通りのこの相補的配列 のフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配列 を含むことを特徴とするあらゆるＤＮＡ配列を目的とする。 当然のことながら、上述の配列番号１及び３で表わされる配列、誘導された配 列及びそのフラグメントは、５′→３′の方向で表わされるものとして考慮され なくてはならない。 このようにして上述のような５′→３′の方向において相補的な配列の最初の ヌクレオチドは、ＣＣＲ（又はＣＣＲのフラグメント又は誘導されたタンパク質 ）をコードする５′→３′の方向での配列の最後のヌクレオチドの相補物であり 、この相補的配列の第２のヌクレオチドは、ＣＣＲをコードする配列の最後か ら２番目のヌクレオチドの相補物であり、この要領でＣＣＲをコードする配列の 最初のヌクレオチドの相補物である前記相補的配列の最後のヌクレオチドまで続 く。 上述の相補的配列によりコードされるｍＲＮＡは、５′→３′の方向でこのｍ ＲＮＡが表わされている場合、この第１のヌクレオチドがＣＣＲをコードする配 列の最後のヌクレオチドに対応し、したがってこれによってコードされるｍＲＮ Ａの最後のヌクレオチドとハイブリダイズし、一方その最後のヌクレオチドはＣ ＣＲをコードする配列の最初のヌクレオチドに対応し、したがってこれによりコ ードされるｍＲＮＡの最初のヌクレオチドとハイブリダイズするようなものであ る。 このようにして、以上及び以下で用いるアンチセンスｍＲＮＡというのは、上 述の相補的配列によってコードされＣＣＲ（又はＣＣＲ又は誘導されたタンパク 質のフラグメント）によりコードされたｍＲＮＡが表わされる方向とは逆方向（ ３′→５′）で表わされる全てのｍＲＮＡのことであり、ここでこの前者のｍＲ ＮＡはなおもセンスｍＲＮＡ（５′→３′）と呼ばれる。 したがって、アンチセンスＲＮＡという語は、メッセンジャーＲＮＡの塩基配 列の相補的ＲＮＡ配列に対して用いられ、ここで相補的という語は、アンチセン ス配列（３′→５′の方向に読まれたもの）の各々の塩基（又は大部分の塩基） がメッセンジャーＲＮＡ（５′→３′）の方向で読まれた配列）の対応する塩基 （ＧとＣ、ＡとＵ）と対合する能力をもつという意味で理解されなくてはならな い。 本発明の枠内では、アンチセンスＲＮＡの戦略は、植物のリグニンの割合の調 整という目的に特に適した分子アプローチである。アンチセンスＲＮＡは、非コ ーディングＤＮＡ鎖（ナンセンス鎖）の転写によって生成されるＲＮＡである。 このアンチセンス戦略は、欧州特許第２４０２０８号に更に具体的に記述され ている。 アンチセンス戦略に従ったタンパク質、ここではＣＣＲの合成の阻害は、タン パク質の産生を妨げる２つの相補的ＲＮＡ（センス及びアンチセンス）の間の ２本鎖の形成の結果である、と思われる。しかしそのメカニズムは今だに明白で ない。ＲＮＡ−ＲＮＡ複合体は、その後の転写、又は成熟、輸送又は翻訳と干渉 するか又はｍＲＮＡの分解を導く可能性がある。 これらの効果の組合せも同様に可能である。 本発明は同様に、本発明に従ったＤＮＡ配列によりコードされるあらゆるｍＲ ＮＡ、より具体的には、 − それ自体配列番号２で表わされるウマゴヤシ属に存在するＣＣＲ、又は上述 の通りのこのＣＣＲのフラグメント又は誘導タンパク質をコードすることのでき る、配列番号１で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるか又は上述の通りの フラグメント又は誘導配列によりコードされるｍＲＮＡ、 − それ自体配列番号４で表わされるようなトウモロコシに存在するＣＣＲ、又 は上述の通りのこのＣＣＲのフラグメント又は誘導タンパク質をコードすること のできる、配列番号３で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるか又は上述の フラグメント又は誘導配列によりコードされるｍＲＮＡ、 にも関する。 本発明は同様に、本発明に従った上述のｍＲＮＡを構成するヌクレオチドの全 て又はその一部のみの相補的ヌクレオチドを含むこと、及びこのｍＲＮＡとハイ ブリダイズ（又は対合）できることを特徴とする、前述の通りのあらゆるアンチ センスｍＲＮＡをも目的とする。 このため、本発明は、より具体的には、本発明の上述のＤＮＡ配列の相補的配 列の１領域のものと相同な５０塩基の領域を少なくとも含む、本発明に従ったＤ ＮＡ配列によりコードされたアンチセンスｍＲＮＡを目的とする。 本発明に従ったアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列についてはサイズ の上限はない。これらは、細胞内で通常産生されるメッセンジャーのものと同じ 位長くてもよく、更には、ＣＣＲのｍＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列と同 じ位長くてもよい。 有利にも、本発明に従ったアンチセンスＲＮＡをコードするこのようなＤＮＡ 配列は、約１００〜約１，０００個の塩基対を含んでいる。 本発明は、より具体的に言うと、上述のような単数又は複数のアンチセンス ｍＲＮＡ又はこのアンチセンスｍＲＮＡのフラグメントを含むあらゆるアンチセ ンス配列、又はリボザイムの単数又は複数の触媒ドメインに対応する単数又は複 数の配列をも目的とする。 このため、本発明は、上述の本発明のｍＲＮＡの１つ（標的ＲＮＡと呼ばれる ）の中に含まれたＧＵＸモチーフ（ＸはＣ、Ｕ又はＡを表わす）を縁どる配列の 相補的な約８個の塩基の腕により両側がフランキングされたリボザイムの触媒ド メインを含む、上述の通りのあらゆるアンチセンス配列を目的とする(Haseloff J.,及びGerlack W.L.，1988，Nature 334; 585〜591)。 本発明は同様に、本発明の単数又は複数のアンチセンスｍＲＮＡ又はアンチセ ンスｍＲＮＡのフラグメント（単数）（有利には上述の通りの約８個の塩基のフ ラグメント）に結びつけられたリボザイムの少なくとも１つの触媒ドメインを含 む上述のようなアンチセンス配列をコードすることのできるあらゆるＤＮＡ配列 にも関する。 本発明はより具体的には、次のものを目的とする： − 配列番号１により表わされるものと相補性をもつヌクレオチド配列によりコ ードされ、配列番号１で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡとハ イブリダイズすることのできるあらゆるアンチセンスｍＲＮＡ； − 配列番号３により表わされるものと相補性をもつヌクレオチド配列によりコ ードされ、配列番号３で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡとハ イブリダイズすることのできるあらゆるアンチセンスｍＲＮＡ。 本発明は同様に、植物内でＣＣＲのものと同等の酵素活性を示す本発明のＤＮ Ａ配列によりコードされる組換えポリペプチド、より具体的には配列番号１及び ３で表わされる配列又は本発明に従ってこれらの配列から誘導された配列によっ てコードされる組換えＣＣＲにも関する。 本発明は、より具体的には、特に以下で記述するようなベクターを用いて、本 発明に従ったＤＮＡ配列を含む以下に定義するような組換えヌクレオチド配列を 、そのゲノムの中に安定した形で組込むことによって、植物細胞の形質転換によ って得られるような組換えポリペプチド、特に組換えＣＣＲを目的とする。 「組換えポリペプチド」という表現は、後にｍＲＮＡに転換される（イントロ ンのサプレッションによる）ＲＮＡを得ることになる対応する遺伝子のＤＮＡの 転写段階を介して遺伝子工学により産生され得るポリペプチド鎖を有するあらゆ る分子を意味し、ここでこのｍＲＮＡはその後タンパク質の形でリボソームによ り翻訳され、これら全てのプロセスは宿主細胞の内部の適切な調節要素の制御下 で実施される。したがって、用いられる「組換えポリペプチド」という表現は、 前記ポリペプチドがグリコシル基といったその他の基を含む可能性を排除するも のではない。 当然のことながら「組換え」という語は、ポリペプチドが遺伝子工学によって 産生されたことを表わす。というのも、このポリペプチドは、適切な宿主細胞を 形質転換するために利用される発現ベクターの中に予め導入された対応するヌク レオチド配列の、この細胞宿主内での発現の結果として得られるからである。た だし、この「組換え」という語は、ポリペプチドが異なるプロセス、例えばタン パク質合成のために利用される既知の方法に従った従来の化学的合成によって、 又はよりサイズの大きい分子のタンパク質分解分割により産生される可能性を排 除するものではない。 本発明はより具体的には、ウマゴヤシ属又はトウモロコシから抽出及び精製に よって実質的に純粋な形で得られるような、ウマゴヤシ属の細胞内に存在し配列 番号２により表わされるＣＣＲ又はトウモロコシの細胞内に存在し配列番号４に より表わされるＣＣＲ、又は特に単数又は複数のアミノ酸の付加及び／又はサプ レッション及び／又は置換によりこれらの配列から誘導されたあらゆるタンパク 質、又は、前述のＣＣＲのものと同等の酵素活性を有する可能性のある、前記Ｃ ＣＲに由来するあらゆるフラグメント又はその誘導配列、にも関する。 本発明は同様に、上述の配列番号２又は４で表わされるＣＣＲ又はこれらの配 列のあらゆる誘導配列及びフラグメントをコードするヌクレオチド配列において 、上述のＣＣＲ又は誘導配列又はそのフラグメントをコードする可能性がありな がら、それぞれ配列番号１又は配列番号３で表わされる配列の全て又は一部分又 は遺伝子コードの縮重によりこれらの配列から誘導されたあらゆる配列に対応す ることを特徴とするヌクレオチド配列をも目的としている。 本発明は同様に、植物内のＣＣＲの全部又は一部をコードすることができる、 本発明に従ったｍＲＮＡと上述の通りのアンチセンスｍＲＮＡの間で形成される 複合体をも目的としている。 本発明は、より具体的には、配列番号１の配列によりコードされるｍＲＮＡと 配列番号１の配列の相補的配列によりコードされたアンチセンスｍＲＮＡとの間 で形成された複合体並びに、配列番号３の配列によりコードされたｍＲＮＡと配 列番号３の配列の相補的配列によってコードされるアンチセンスｍＲＮＡとの間 で形成された複合体を目的とする。 本発明は、より具体的には、上述の細胞の中から選ばれ、非相同配列の中に挿 入される本発明のＤＮＡ配列を少なくとも１つ含むことを特徴とする、あらゆる 組換えヌクレオチド配列（又は組換えＤＮＡ）を目的とする。 本発明は、より具体的には、コーディング領域として、配列番号１又は３で表 わされるヌクレオチド配列又は、上述のようなあらゆるフラグメント又はこれら の配列から誘導されたヌクレオチド配列を含み、かかるヌクレオチド配列又はフ ラグメントが非相同配列中に挿入され、配列番号２又は４でそれぞれ表わされる ＣＣＲ、又はこれらのＣＣＲのフラグメント、又は上述のようなこれらの配列の 誘導タンパク質をコードすることができる、上述の通りのあらゆる組換えヌクレ オチド配列に関する。 本発明は、更に具体的には、コーディング領域として、配列番号１又は３で表 わされるものと相補的なヌクレオチド配列又は上述のようなあらゆるフラグメン ト又はこの相補的配列から誘導されたあらゆるヌクレオチド配列を含み、前記相 補的配列又は前記フラグメントは非相同性配列の中に挿入され、しかも植物内の ＣＣＲをコードするｍＲＮＡの全部又は一部と、より具体的には配列番号２又は ４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡの全部又は一部とハイブリダイズす る能力をもつアンチセンスｍＲＮＡをコードすることができる、あらゆる組換え ヌクレオチド配列にも関する。 本発明に従った組換えＤＮＡは、更に、ＣＣＲをコードするヌクレオチド配列 又は本発明に従ったアンチセンスｍＲＮＡをコードするその相補的配列の発現を 調節するために必要な要素、特にこれらの配列の転写のプロモーター及びターミ ネーターを含むことを特徴とする。 本発明に従った組換えＤＮＡ構築物の中で利用できるさまざまなプロモーター として、以下のものを挙げることができる： − 植物内でＣＣＲの発現を制御する内因性プロモーター、特に配列番号６で表 わされるユーカリ内でＣＣＲをコードする配列番号５で表わされるＤＮＡ配列の 上流にあるプロモーター、又は − 強い発現をもつ構成型のプロモーター。例：³⁵ＳＣＡＭＶ（Benfey et al， (1990)，EMBO J.，9(6)，1677〜1864 に記述されている）、ＥＦ１α（Curie et al，(1991)，Nucl，Acids Res.，19，1305〜1310により記述されたタンパク質 合成における伸長因子の遺伝子のプロモーター）、 − 個々の組織内で特別に発現する特異的プロモーター。例：ＣＡＤプロモータ ー（Feuill et C(1993)トゥールーズ第３大学論文により記述されたもの）、特 定の脈管組織内で発現されるＧＲＰ１−８プロモーター（Keller and Baumgarth er(1991)，Plant Cell，3，1051〜1061 により記述されたもの）。 本発明は同様に、コーディング領域として、植物内でのリグニンの生合成段階 に関与しておりＣＣＲ以外の酵素についてそれ自体コードするｍＲＮＡの全部又 は一部、特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）をコードするｍ ＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むか、又は同じくコ ーディング領域として、上述のｍＲＮＡ特にＣＡＤをコードするｍＲＮＡとハイ ブリダイズすることのできるｍＲＮＡの全部又は一部をコードする少なくとも１ つのヌクレオチド配列を含む、上述の通りのあらゆる組換えヌクレオチド配列に 関する。 本発明の上述の組換えヌクレオチド配列は、有利には、植物内のリグニンの生 合成に必要な酵素をコードするＤＮＡ配列が中に挿入されるベクターから得られ る。 上述のベクターは、そこに挿入されている前記ＤＮＡ配列を回収するべく適切 な制限酵素を用いて消化される。 これらのＤＮＡ配列は、その後本発明に従った組換えＤＮＡの中で、発現の適 切なプロモーターの下流かつ発現の適切なターミネーターの上流に挿入され る。 本発明は、より具体的には、上述のベクターの消化、本発明のＤＮＡ配列の回 収及びその配列の発現のプロモーター及びターミネーターを含む異種ＤＮＡ配列 の中での５′→３′方向での配列の挿入によって得られるような、配列番号１で 表わされる配列又は配列番号３で表わされる配列を含む組換えＤＮＡを目的とす る。 本発明は同様に、より具体的には、上述のベクターの消化、本発明のＤＮＡ配 列の回収及び相補的配列の発現のプロモーター及びターミネーターを含む異種Ｄ ＮＡ配列の中での逆方向つまり３′→５′の方向でのこの配列の挿入によって得 られるような、配列番号１で表わされる配列又は配列番号３で表わされる配列の 相補的配列を含む組換えＤＮＡを目的とする。 このような構築物の中で利用可能なターミネーターの一例としては、Agrobact erium tumefaciens のシンターゼノパリンの遺伝子の３′末端を挙げることがで きる。 このようにして、一般に、ＣＣＲ（又はＣＣＲのフラグメント又は誘導タンパ ク質）及び／又はリグニンの生合成に必要なその他の酵素をコードするＤＮＡ配 列を含む、本発明に従ったヌクレオチド配列は、上述のベクターからの前記ＤＮ Ａ配列の回収、及び異種配列内のこの配列の挿入によって得られ、一方本発明に 従ったアンチセンスｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む組換えヌクレオチド 配列は、上述のＤＮＡ配列の回収及び前記異種配列内へのこの配列の逆方向での 挿入により得られる。 例として、上述の組換えＤＮＡの構築のため、配列番号１又は３で表わされる 相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の全部又は一部、或いは又（上述のｃＤＮＡ＋場合に よってはイントロンに対応する）ＣＣＲに対応するゲノムクローンの全部又は一 部を利用することができる。このゲノムクローンは、それ自体Sam brook，Frits ch and Maniatis，Molecular Cloning Laboratory Manual，Cold Spring Harbou r Laboratory Press，1989により記述されている方法に従って得られるゲノムバ ンクをスクリーニングするためのプローブとしてｃＤＮＡを利用することによっ て得られる。 本発明は同様に、その複製にとっては必須ではないそのゲノムの１つの部位の 中に組込まれた、本発明に従って上述のものの中から選ばれた組換えヌクレオチ ド配列を含むことを特徴とする、植物の形質転換のために利用可能なあらゆる組 換えベクターを目的とする。 植物の形質転換のために利用可能な上述の組換えベクターとしては、ｐＢＩＮ １９から誘導されたバイナリーベクターを挙げることができる(Bevan et al.，( 1984)，Nucl Acids Res.，12(22)，8711〜8721)。 本発明に従った組換えベクターの構築の例は、本発明についての以下の詳細な 説明の中で記述されている。 本発明は同様に、植物内の産生リグニンの正常な量との関係において産生リグ ニン量を減少させるか又は増加させることにより植物内のリグニンを生合成を調 節する方法であって、 − 配列番号１又は３で表わされるヌクレオチド配列又は配列番号２又は４で表 わされるＣＣＲのものと同等の酵素活性を有する植物内のＣＣＲのフラグメント をそれ自体コードするｍＲＮＡをコードする上述のヌクレオチド配列のフラグメ ント、又は上述のＣＣＲのうちの少なくとも１つのものと同等の酵素活性を有す る誘導タンパク質をそれ自体コードするｍＲＮＡをコードする、特に単数又は複 数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又はサプレッション及び／又は置 換により上述のヌクレオチド配列から又は上述のフラグメントから誘導されたヌ クレオチド配列のフラグメント；又は − 上述のｍＲＮＡの１つとハイブリダイズすることのできるアンチセンスｍＲ ＮＡをコードする、ｍＲＮＡをコードする配列番号１又は３で表わされるヌクレ オチド配列の全部又は一部又はこれらの配列のフラグメント又は上述の通りのこ れらの配列からの誘導配列の相補的ヌクレオチド配列 を含むベクターを用いて、これらの植物の細胞を形質転換する工程を包含し、こ の形質転換が特に上述のようなベクターを用いて行なわれる方法をも目的として いる。 本発明は、より具体的には、植物内での生合成により産生されるリグニンの量 を減少させる方法であって、 − 配列番号２又は４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡの全部又は一部 とハイブリダイズすることのできるアンチセンスｍＲＮＡ、又は上述のようなこ れらの配列から誘導されたタンパク質をコードする、上述のような本発明に従っ た少なくとも１つのＤＮＡ配列、 − 及び場合によっては、植物内のリグニンの生合成段階に関与しているＣＣＲ 以外の酵素をコードするｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードするｍＲＮＡとハイブリ ダイズする能力をもつアンチセンスｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮ Ａ配列、を中に取り込むことによってこれらの植物のゲノムを形質転換すること によって行なわれる方法であって、かかる形質転換が、 − ＣＣＲ又は上述のような誘導タンパク質をコードするｍＲＮＡとハイブリダ イズする能力をもつアンチセンスｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、場合 によっては上述のようなＣＣＲ以外の酵素をコードするｍＲＮＡとハイブリダイ ズする能力をもつアンチセンスｍＲＮＡをコードする単数又は複数のＤＮＡ配列 を含む、上述の通りの組換えベクターを用いて、 − 又は、そのうちの少なくとも１つがＣＣＲ又は上述のような誘導タンパク質 をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズする能力をもつアンチセンスｍＲＮＡを コードするＤＮＡ配列を含有し、一方単数又は複数のその他の組換えベクターが 上述のようなＣＣＲ以外の酵素をコードするｍＲＮＡに対してハイブリダイズす る能力をもつアンチセンスｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含有するような、 複数の組換えベクターを用いて行なわれる方法をも目的としている。 植物内での生合成により産生されるリグニン量のもう１つの減少方法は、 − 配列番号１又は３で表わされる本発明に従った少なくとも１つのＤＮＡ配列 又は上述の通りのフラグメント又はこの配列から誘導された配列、 − 及び場合によっては、植物内のリグニンの生合成段階に関与しているＣＣＲ 以外の酵素の全部又は一部をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、特にＣＡ Ｄの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列、 を中に取り込むことによって、これらの植物のゲノムを形質転換することによっ て行なわれる方法であって、かかる形質転換が − 上述の本発明に従ったＤＮＡ配列又は上述の通りのフラグメント又はこの配 列から誘導された配列を含む、及び場合によっては上述のようなＣＣＲ以外の酵 素の全部又は一部をコードする単数又は複数のＤＮＡ配列を含む、上述の通りの 組換えベクターを用いるか − 又は、そのうちの少なくとも１つが上述の本発明に従ったＤＮＡ配列又は上 述の通りのフラグメント又はこの配列から誘導された配列を含み、一方その他の 単数又は複数の組換えベクターが上述のとおりのＣＣＲ以外の酵素の全部又は一 部をコードするＤＮＡ配列を含む、複数の組換えベクターを用いて、 行なわれる方法である。 この最後の方法は、コサプレッションメカニズムを利用している。コサプレッ ションは、内因性遺伝子のコピーがゲノム内に導入された時に観察された。コサ プレッションメカニズムは現在のところ未知であるものの、往々にして取上げら れる仮定の１つは、遺伝子の発現の負の調節が、トランス遺伝子の「不良」鎖の 読取りを通してトランス遺伝子から誘導されるわずかな割合のアンチセンスＲＮ Ａの産生から来るというものである（Griersun et al.，Trends Biotech.，9; 1 22〜123）。 本発明は同様に、植物内での生合成により産生されるリグニンの量の減少方法 において、本発明の単数又は複数のアンチセンスｍＲＮＡ又はアンチセンスｍＲ ＮＡフラグメントに結びつけられたリボザイムの単数又は複数の触媒ドメインを 含むアンチセンス配列をコードする本発明に従った上述の通りのＤＮＡ配列を中 に取り込むことによってこれらの植物のゲノムを形質転換することにより実施さ れる方法であって、ここでこの形式転換が、上述のＤＮＡ配列をそれ自体含む本 発明に従った組換えヌクレオチド配列を含む組換えベクターを用いて実施される 方法をも目的としている。 上述の方法が、（アンチセンスｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の挿入レベル 、ゲノム内に組込まれたこのＤＮＡ配列のコピーの数などに応じて）ＣＣＲ活性 の異なるレベルの減少ひいてはリグニン含有量を示す形質転換された植物に到達 することを可能にするものであるということを指摘しておかなくてはならない。 したがって、形質転換体の選択により、植物の通常の発達と適合性のあるリグ ニン含有量の制御された調整が可能となる。 一般的に、１つの植物のリグニンの正常な平均含有量が乾燥物質重量で約１５ ％〜約３５％の間で変動すると考えると、上述の方法の１つの実施の結果として のリグニン含有量の減少は、有利には、このようにして形質転換された植物が約 １０％〜約３０％更には約１２％〜約３２％の間で変動するリグニン平均含有量 を呈するようなものである。 一例としては、植物のリグニン含有量は、Albert et Boudet(1979)，Physiol ，Veg.，17(1)，67〜74 の中で詳述され、その主要な段階として植物材料のリグ ニンを含有するベンゼンアルコール粉末を得た後、リグニンを臭化アセチルで可 溶化し紫外線中のその吸収に応じて秤量するということが含まれるような、John son et al.，(1961)，T.A.P.P.I，44，793〜798の方法の１変法に従って測定で きる。 本発明は、更に具体的に言うと、植物内のリグニン含有量の上述の減少方法の 、これらの植物内のリグニンの正常な含有量との関係において減少されたリグニ ン含有量を呈し、しかもこのようにしてその消化率が形質転換を受けていないこ れらの同じ植物との関係において改善されているような遺伝子的に形質転換され た飼料植物の獲得への利用を目的としている。 本発明の枠内で形質転換され得る主要な飼料植物としては、ウマゴヤシ属、ウ シノケグサ属、エンシレージ（サイロ）向けトウモロコシなどを挙げることがで きる。 本発明は同様に、植物内のリグニン含有量の上述の減少方法の、これらの植物 内のリグニンの正常な含有量との関係において減少したリグニン含有量を示す遺 伝的に形質転換された植物、より具体的には樹木の獲得に対する利用にも関する ものであり、ここでこれらの植物又は樹木はパルプの生産の枠内で利用するのが 特に有利である。 ＣＣＲの遺伝子の発現の上述の負の調節の方法の第３の可能性のある利用分野 は、形質転換された植物の成長の刺激に関するものである。さまざまな論証の中 で、早尚で急速な木質化が細胞成長ひいては植物の成長にとってブレーキとなる 、ということが強調されている（Sauter and Kende，1992，Plant and Cell Physiology，33(8); 1089）。このようにして上述の方法の使用は、低い木質化 をもつこのような形質転換された植物に対しより優れた成長ひいてはより優れた 収量を可能にすることができる。 本発明は同様に、植物の中の生合成により生成されたリグニンの量の増加方法 において、 − 配列番号１又は３で表わされる本発明に従った少なくとも１つのＤＮＡ配列 又は上述の通りのフラグメント又はこの配列から誘導された配列、 − 及び場合によっては、植物内のリグニンの生合成段階に関与しているＣＣＲ 以外の酵素の全部又は一部をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、特にＣＡ Ｄの全部又は一部をコードするＤＮＡの配列、 を中に取り込むことによってこれらの植物のゲノムを形質転換することによって 行なわれる方法であって、かかる形質転換が − 上述の本発明に従ったＤＮＡ配列又は上述の通りのフラグメント又はこの配 列から誘導された配列を含む、及び場合によっては上述のようなＣＣＲ以外の酵 素の全部又は一部をコードする単数又は複数のＤＮＡ配列を含む、上述の通りの 組換えベクターを用いるか − 又は、そのうちの少なくとも１つが、上述の本発明に従ったＤＮＡ配列又は 上述の通りのフラグメント又はこの配列から誘導された配列を含み、一方その他 の単数又は複数の組換えベクターが上述のとおりのＣＣＲ以外の酵素の全部又は 一部をコードするＤＮＡ配列を含む、複数の組換えベクターを用いて、 行なわれる方法にも関する。 一般的に、同様に１つの植物のリグニンの正常な平均含有量が乾燥物質重量で 約１５％〜約３５％の間で変動すると考えると、上述の方法の１つの実施の結果 としてのリグニン含有量の増加は、有利には、このようにして形質転換された植 物が約２０％〜約４０％更には約１８％〜約３８％の間で変動するリグニン平均 含有量を呈するようなものである。 本発明は、更に具体的に言うと、植物内のリグニン含有量の上述の増加方法（ ＣＣＲの遺伝子の過剰発現方法とも呼ばれる）の、これらの植物内のリグニンの 正常な含有量との関係において増加されたリグニン含有量を呈し、しかもこの ようにして環境の攻撃、特に寄生虫攻撃に対するその耐性が、形質転換を受けて いないこれらの同じ植物との関係において改善されているような遺伝的に形質転 換された植物の獲得に対する利用を目的としている。この最後のケースにおいて 、上述のベクター内でＣＣＲ遺伝子又は誘導配列と関連して、表面組織内で及び ／又は傷に応答して特に発現された特異的プロモーターを利用することが特に有 利である。 なお、本発明は同様に、ＣＣＲの遺伝子の上述の過剰発現方法の、特に寸法が 縮小された植物を得ることが望まれる園芸又は樹木栽培といったいくつかの分野 における、このようにして遺伝的に形質転換された植物の成長の改良に対する利 用にも関する。 最後に、リグニンのベンゼン環は、セルロースのグルコース残基の脂肪族鎖に 比べ更に大きい固有エネルギーを有する。このようにして、本発明の上述の方法 に従って燃料として利用される植物におけるリグニンの割合の増加は、このよう にして形質転換されたこれらの可燃性植物のエネルギーポテンシャルを改善する ことを可能にする。 ＣＣＲの負の調節又は過剰発現という２つのケースにおいて、この活性の変調 が、形質転換された植物のリグニン含有量に影響を及ぼすということは、いかに も考えられることである。実際、植物の中でその活性レベルが非常に低いＣＣＲ は、リグニン合成の調節酵素を構成すると思われる。 本発明の上述の方法の１つの実施のために利用される形質転換技術に関しては 、有利にも以下の技術を活用する： Ａ） Bevan(1984)，Nucleic Acid Research 12; 8711〜8721 により記述され たAgrobacterium tumefaciens のＴｉプラスミドを介した形質転換技術。この技 術は基本的に同時培養方法を用い、形質転換体を見つけることができるように選 択遺伝子との同時形質転換を介入させる。 これは、双子葉植物、例えばタバコ、ウマゴヤシ属、セイヨウアブラナに、特 に利用できる。 Ｂ） （Zumbrum et al.，1989，Technique 1，204〜216; Sarford et al.，1 911，Technique 3．3-16）により詳述されたbiolistique による遺伝子の直接 的トランスファー技術。 この技術には、形質転換すべき組織上に粒子銃を用いて推進される金又はタン グステンの微粒子に、本発明に従った組換えＤＮＡを結びつけることが関与して いる。この技術は特にアグロバクテリウムに対する耐性をもつ種の形質転換に特 に利用される。 上述の２つのケースにおいて、本発明に従った組換えＤＮＡの存在の確認は、 特に配列番号１又は３の配列に由来するオリゴヌクレオチドプライマー及びプロ ーブを用いて、遺伝子増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）及びサザンハイブリダイゼ ーション実験により実施されることになる。 本発明は同様に、特に上述の技術により、本発明に従ったベクターにより形質 転換され、そのゲノムの中に安定した形で組込まれた本発明に従ったＤＮＡ配列 を含む植物の細胞にも関する。 本発明は同様に、上述の形質転換された細胞の培養により得られるような形質 転換された植物にも関する。 したがって、形質転換された植物は次に、インビトロ又はインナチュラ(in na tura)で有性生殖によるか又は無性生殖により繁殖され得る。 本発明は同様に、上述の組換えベクターを用いて本発明に従ってＤＮＡ配列を そのゲノム内に取込むことによって形質転換された植物のフラグメント、特に果 実、粒子、花粉をも目的としている。 本発明は同様に、本発明の組換えポリペプチドに対して誘導された抗体、より 具体的には、上述の組換えＣＣＲに対して導かれた抗体にも関する。 このような抗体は、これらのポリペプチドでの動物の免疫化とそれに続く形成 された抗体の回収によって得ることができる。 当然のことながら、この産生はポリクローナル抗体に限られるものではない。 これは又、一方では本発明の精製されたポリペプチドの１つに対して免疫化さ れた特にマウス又はラットといった動物の脾細胞、そして他方では適切な骨髄腫 細胞から従来の方法によって形成され得、又動物の免疫化のために最初に使用さ れる上述のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生するその能力に よって選択され得るあらゆるハイブリドーマによって産生されたあらゆるモノク ローナル抗体に適用される。 本発明は同様に、本発明の組換えポリペプチドに対して導かれた上述の抗体の 、植物内で採取された標本からのこれらの植物内のＣＣＲの検出又は秤量方法の 実施のための利用をもその目的としている。 本発明のヌクレオチド配列及びその上述の利用からは、それぞれ配列番号６で 表わされるユーカリのＣＣＲをコードする配列番号５、７、９及び１１で表わさ れるヌクレオチド配列、配列番号８で表わされるポプラのＣＣＲ、配列番号１０ で表わされるウシノケグサのＣＣＲ、及び配列番号１２で表わされるタバコのＣ ＣＲ並びに上述のユーカリのＣＣＲから誘導された配列番号１４で表わされるタ ンパク質をコードする配列番号１３で表わされる配列が除外されるということを 明記しておかなくてはならない。 同様にして、本発明のヌクレオチド配列及びその上述の利用から除外されるの は、配列番号５、７、９、１１及び１３のヌクレオチド配列の相補的配列並びに 、配列番号１及び配列番号３で表わされるヌクレオチド配列又はそれらの相補的 配列からの上述のような誘導されたフラグメント及び配列と同一であるかぎりに おいて上述のヌクレオチド配列又はその相補的配列から誘導されたフラグメント 又は配列である。 同様に以下のものは、本発明の枠から除外される。 − 配列番号５、７、９、１１及び１３で表わされたＤＮＡ配列によってコード されるか又は、上述のような配列１及び３で表わされた誘導フラグメント及び配 列と同一であるかぎりにおいて前記ＤＮＡ配列から誘導されたフラグメント又は 配列によってコードされるｍＲＮＡ、 − 上述のｍＲＮＡの相補的ヌクレオチドで構成されるアンチセンスｍＲＮＡ、 − 配列番号６、８、１０、１２及び１４で表わされるポリペプチド、並びに上 述のような配列番号２及び４で表わされるポリペプチド配列から誘導されたフラ グメント及び配列と同一であるかぎりにおいて、上述のポリペプチドから誘導さ れたあらゆるフラグメント又は配列。 本発明は、ユーカリ内での精製された形でのＣＣＲ及びユーカリ、ウマゴヤシ 属及びトウモロコシのＣＣＲをコードするｃＤＮＡの獲得についての以下の記述 の中で更に詳しく説明される： Ａ） 精製されたユーカリのＣＣＲ及びユーカリのＣＣＲをコードするｃＤＮ Ａの獲得 Ｉ．ユーカリのＣＣＲの精製 ＣＣＲは、きわめて制限された数の研究の対象にしかなっていない。これに関 するいくつかの刊行物としては、以下のものを挙げることができる： Wengenmayer H.，Ebel J.，Grisebach H.，1976 - Enzymatic synthesis of l ignin precursors，purification and properties of a cinnamoyl CoA: NaDPH reductase from cell suspension cultures from soybean(Glycine max)，Eur． J，Biochem.，65; 529〜536 。 Luderitz T.，Grisebach H.，1981 - Enzymatic synthesis of lignin precur sors，comparison of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamyl alcohol dehydr ogenase: NADP dehydrogenase from spruce（Picea abies L.）and soybean(Gly cine max L.)，Eur．J．Biochem.，119; 115〜127。 Sarni F.，Grand C.，Boudet A.M.，1984 - Purification and properties of cinnamoyl: CoA reductase and cinnamyl alcohol dehydrogenase from poplar stems(Populus x euramericana)．Eur．J．Biochem.，139; 259〜265 。 以下に記述する研究作業は、ユーカリのＣＣＲの独創的で単純かつ迅速な精製 プロトコルを定義づけするのに貢献した。このプロトコルは同様に、以前に文献 中に記述されているものよりもさらに効果的なものである。実際、これにより初 めて、内部ペプチド配列を得、対応するｃＤＮＡのクローニングを最後まで導く のに充分な量の、均一になるまで精製された酵素を獲得することが可能となった 。 ＣＣＲの精製工程は全て４℃で実施された。 １．ユーカリ木部の粗抽出物の取得 植物材料は、材齢５年のEucalyptus gunnii の枝の木部が富化された組織分画 の「削り取り」によって得た。 予め液体窒素中で凍結させた木部３００ｇを、コーヒーミルを用いて粉末にし た。このようにして得られた粉砕物を１リットルの抽出緩衝液（１００mMのトリ ス−ＨＣｌ pH７．６ ２％ ＰＥＧ６，０００、５mMのＤＴＴ、２％のＰＶＰ Ｐ）の中でホモジナイズし、２倍厚のMiracloth 上でろ過し、硫酸アンモニウム 内で３０％飽和させた。１５，０００×ｇで３０分の遠心分離の後、得られた沈 澱を６０mlの緩衝液Ｉ［２０mMのトリス−ＨＣｌ pH７．５、５mMのＤＴＴ（ジ チオトレイトール）５％のエチレングリコール］の中で再度懸濁状態に置いた。 このようにして得られた抽出物を、１０，０００×ｇで１５分の遠心分離により 「清澄化し」次に緩衝液１中で平衡化されたSephadexＧ２５を通過させて脱塩し た。 ２．Red Sepharose 上でのアフィニティークロマトグラフィー 粗抽出物を、緩衝液１中で平衡化されたアフィニティーカラム「Red Sepharos e 」(１．５×１９cm、Pharmacia)上で沈積させた。５０mlの緩衝液Ｉによりカ ラムを最初に洗浄した後、５mMのＤＴＴ、５％のエチレングリコールを含む２０ mMから１．５M のトリス−ＨＣｌ pH７．５のトリス線形勾配により、タンパク 質を溶離させた。勾配の合計体積は２００mlで流量は３６ml／時であり、ＣＣＲ 活性を示す画分をあわせ、緩衝液１中で平衡化されたSephadexＧ２５カラムを通 過させて脱塩した。 ３．Mono Ｑ上での陰イオン交換クロマトグラフィー このようにしてあわせた脱塩した画分を陰イオン交換カラムMonoＱ(ＨＲ５／ ５、Pharmacia)でクロマトグラフィーに付した。タンパク質の溶離は５％のエチ レングリコール及び５mMのＤＴＴを含むトリス−ＨＣｌ、pH７．５で２０から３ ００mMの線形勾配を適用することによって行なった。勾配の合計体積は５０mlで あり、流量は１ml／分である。前段階と同様、活性ＣＣＲ酵素を含有する画分を あわせて脱塩するが、この場合、SephadesＧ２５カラムの平衡緩衝液は５mMのＤ ＴＴ（緩衝液２）を含むリン酸緩衝液２０mM pH７．６であった。 ４．「Mimetic Red 」上でのアフィニティークロマトグラフィー このようにして得られたＣＣＲ画分グループを、Mimetic Red ２Ａ６×Ｌ（AC L，Cambridge）カラムに沈積させた。カラムは、８mMのＮＡＤを含む３０mlの緩 衝液２で予め洗浄しておく。この洗浄は、前の工程でＣＣＲと同時に精製さ れるリンゴ酸デヒドロゲナーゼといったような、補因子としてＮＡＤと特異的に 機能する酵素を除去することを目的とするものである。ＣＣＲの特異的溶離は、 緩衝液２中でＮＡＤＰ ０〜８mMの勾配（１５ml）を適用することによって得ら れた。純粋で活性なＣＣＲを含む画分は、安定剤（最終濃度５％でのエチレング リコール）を添加した後−８０℃で保存した。 このようにして得られた精製済み酵素は、基質としてフェルロイルＣｏＡを用 いてタンパク質１mgあたり４５１nkatの比活性を呈した。得られた収量(出発植 物材料３００ｇについて純粋タンパク質３６μg)は、インプランタ（植物内）で のＣＣＲの割合を反映しておらず、実際、主に各々の精製段階で最大限の汚染物 質を除去しようとして非常に強いＣＣＲ活性を呈する画分のみが次に続く工程で 処理された。このプロトコルにより得られる精製係数は２８２である。 II．ＣＣＲの特徴づけ ユーカリＣＣＲは、Superose 6(Pharmacia)での排除クロマトグラフィーによ る未変性酵素のサイズについて、及び変性電気泳動ゲル上の単量体サブユニット のサイズについて得られた一致する結果が証明するように、３８kDの単量体であ った。MonoＰ(Pharmacia)でのクロマトグラフィーにより推定された等電点は、 ７に近かった。 最適なpH及び緩衝液の研究から、当初記述された通りのＣＣＲ活性の測定(Lud eritz及びGriseback，1981)がユーカリのＣＣＲ活性の測定に完全に適合してい るということがわかった（リン酸緩衝液１００mM、pH６．２５）。 １次元電気泳動ゲル（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）で単一バンドの状態で存在するＣＣ Ｒの純度は、２次元電気泳動及び銀染色の後に唯一の斑点（「スポット」）が得 られることによって確認された。 III．ユーカリのＣＣＲをコードするｃＤＮＡの獲得 検出不可能な残留汚染という場合によって発生する問題から解放されるべく、 精製酵素を、半変性条件での前処理電気泳動に付し、ゲル内でインサイチュで消 化させた。この消化は、リジン残基の後でタンパク質を特異的に切断し比較的長 いペプチドを得ることを可能にするエンドリジンＣを用いて行なった。消化の結 果得られるペプチドをＨＰＬＣ上で逆相にて分離し、そのうちのいくつかをタン パク質マイクロシーケンサー(Applied Biosystems４７０)を用いて配列決定した 。これらの内部ペプチドの配列は、以下に示されている。 Eucalyptus gunnii の木部から抽出されたメッセンジャーからλファージＺＡ ＰII（市販されているベクター、Strabagere）内で構築されたｃＤＮＡバンクの オリゴヌクレオチドを用いたスクリーニングにより、ＣＣＲをコードするｃＤＮ Ａを得た。トランスフェラーゼ末端を用いてリン３２で３′末端で標識された縮 重オリゴヌクレオチド基を用いて、６００，０００ファージをスクリーニングし た。スクリーニングのために利用されたオリゴヌクレオチドの配列は、上述の内 部ペプチド配列から決定された。これらのペプチドはエンドリジンＣでの切断に より生成されたものであり、縮重度の比較的低いオリゴヌクレオチドの生成を可 能にするため第１の位置でリジンを再度付加した。実際、２つのコドンによって しかコードされ得ないこのアミノ酸は、コードの縮重度が最も低いアミノ酸の一 員であり、従って、ペプチド配列からのオリゴヌクレオチドの生成に完全に適し ている。 下線の付されたアミノ酸から誘導されるユーカリのｃＤＮＡバンクのスクリー ニングのために用いられるオリゴヌクレオチドの配列（Ｉ＝イノシン）は、以下 の通りである。 スクリーニングのために利用されるハイブリダイゼーション条件は以下の通り である：プレハイブリダイゼーションを６〜７時間、５×ＳＳＰＥ、０．２５％ の脱脂粉乳、０．０５％のＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）の中で４２℃で行 なう。ハイブリダイゼーションは４２℃で２４時間、３′でｄｄＡＴＰ２³²Ｐで 標識された４つのオリゴヌクレオチドの存在下で、この同じ溶液中で実施する。 ２４時間のハイブリダイゼーションの終了時点で、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ 内で１５分間フィルタを３回洗浄し、次に−８０℃で２４時間オートラジオグラ フィーフィルムと接触させる。オリゴヌクレトチド基とハイブリダイズするファ ージを、補足的な２回のスクリーニング（「プラーク精製」）によって精製した 。ひとたび精製した時点で、６つの陽性クローンを、独立して取り上げた各々の オリゴヌクレオチドでテストした。１つのファージは４つのオリゴヌクレオチド と陽性反応を示し、これをメーカー（Stratagene）の指示に従って、組換えBlue scriptプラスミドを「切除する」ように処理した。このプラスミドの中に含まれ た（ＣＣＲをコードする）挿入物の制限地図は、図１に概略的に示されている。 IV．ＣＣＲのｃＤＮＡの特徴づけ及び同定 ヌクレオチド配列（配列番号５で表わされるもの）から推定されたアミノ酸配 列（配列番号６で表わされるもの）は、分子量が３６．５kDで等電点が約５．８ である３３５個のアミノ酸から成るタンパク質をコードする。精製されたＣＣＲ から得られた全てのペプチド配列がｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定された ペプチド配列の中に再度見い出されるという点を強調することが重要である。 既存のクローンとの相同性の研究を、利用できる全てのタンパク質及び核酸バ ンク内のＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて行なった。フェノール化 合物のもう１つの代謝レダクターゼ、ジヒドロフラボノールレダクターゼ（ＤＦ Ｒ）との著しい相同性が見い出された。ＣＣＲのｃＤＮＡから推定されたペプチ ド配列とバンク内に列挙されたさまざまなジヒドロフラボノールレダクターゼの 配列の間の同一性は約４０％であり、類似性は２０％近くであり、このことは、 同定されたクローンがＤＦＲをコードするクローンと異なるものであることを確 認している。 Ｖ．E ．Coli 内の活性組換えＣＣＲの産生 ＣＣＲのｃＤＮＡの同定を更に掘り下げるため、E．Coli 内で組換えタンパク 質を産生させ、その酵素活性を研究した。このアプローチの実験上の詳細を以下 で記述する。 １．発現ベクターｐＴ７−７へのｃＤＮＡの導入 Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターの制御下で発現ベクターｐＴ７−７（市販の もの）内でｃＤＮＡをクローニングするために、本発明者らはｃＤＮＡのＡＴＧ にＮｄｅｌ部位を導入しなければならなかった。これは、ｃＤＮＡの３′末端の 下流でBluescript上にある市販のプライマーＴ７と突然変異を受けたオリゴヌク レオチドの間のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により遺伝子増幅反応の際に、 Ｔａｑポリメラーゼを用いて行なわれた。得られた増幅産物はＫｐｎｌにより消 化され、この部位はその後、フラグメントをＮｄｅｌによる消化に付す前にＤＮ ＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて修復され、次に、５′にＮｄ ｅｌ部位を又３′に平滑末端を有する得られたフラグメントは、Ｎｄｅｌ及びＳ ｍａｌによって予め開放されたベクター−ｐＴ７−７内にＤＮＡＴ４リガーゼを 用いて挿入される。 以下に、上述の突然変異を受けたオリゴヌクレオチドの配列を記す。 下線のあるイタリック体の塩基は、Ｎｄｅｌ部位の作成を可能にする初期配列 （ＣＡＴＡＴＧ）に比べ修正されたものである： ２．E．Coli ＢＬ２１内でのＣＣＲの過剰発現 こうして得られた構築物を、ＩＰＴＧにより誘導可能なプロモーターである ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼの遺伝子をその染色体上 に有しているE．Coli 菌株ＢＬ２１（市販のもの）の中に導入する。１〜６００ nmという測定ＯＤが得られるまで３７℃で組換え培養を培養し、その後、培地内 でＩＰＴＧ（最終０．２５％）の添加によりＣＣＲの生成物を導入する。誘発後 異なる時間を経て、採取を行ない、Grima-Pettenati et al.（1993）により記述 されたプロトコルに従って細胞を溶解させる。遠心分離の後、可溶性タンパク質 を含有する上清を利用してＣＣＲ活性を測定し、変性条件での電気泳動の後ＣＣ Ｒの産生を視覚化する。誘発後の経過時間と共に強度が増し、負の対照（挿入物 なしでベクターｐＴ−Ｔのみを含有する菌株ＢＬ２１）の中では存在しない約３ ８kDのポリペプチドの出現が見られる。その上、ＣＣＲクローンの同一性の最終 的証拠は、ｐＴ７−７＋ｃＤＮＡ ＣＣＲのみを含有する菌株ＢＬ２１に由来す るタンパク質抽出物の中でのＣＣＲ活性の測定（３７℃で誘発から３時間後の培 養１mlにつき約７nkat）によりもたらされる。 Bluescriptベクター内でクローニングされた配列番号５で表わされる配列を含 むｐＥＵＣＣＲと呼ばれるベクター（図２に示されている）を、E．Coli ＤＨ５ αの細胞内の培養の形で、Ｉ−１４０５という番号で１９９４年３月１７日、パ リ（フランス）にあるパスツール研究所の国立微生物培養収集機関（ＣＮＣＭ） に寄託した。 図面の説明： 図１：ユーカリのＣＣＲをコードするｃＤＮＡの制限地図。 図２：配列番号５で表わされる（プラスミドｐＥＵＣＣＲ内でＣＣＲにより識 別された）配列を含むプラスミドｐＥＵＣＣＲのスキームを示す。 図３：本発明に従ったユーカリのＣＣＲをコードするＤＮＡ配列を含むベクタ ー（又はセンスＣＣＲベクター）の構築のスキームを示す。 図４：本発明に従ったユーカリのＣＣＲをコードするｍＲＮＡとハイブリダイ ズできるアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター（又はアン チセンスＣＣＲベクター）の構築のスキームを示す。 アンチセンス（又はセンス）ベクターの構築に役立つ「ソース」ＤＮＡに関し て アンチセンスＲＮＡは好ましくは、ｐＥＵＣＣＲクローン内に含有された配列 から誘導される。この配列は、次のようなさまざまな要領で得ることができる： すなわち １） ｐＥＵＣＣＲ内に含まれたＣＣＲのＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を適切な制 限酵素で切断することにより。 ２） 所望のＤＮＡフラグメントを合成するような形で構成されたオリゴヌク レオチドを用いて遺伝子増幅（ＰＣＲ）を実施することにより。 このようにして得られたＤＮＡフラグメントは、プロモーターの下流及びター ミネーターの上流で植物の発現ベクター内でクローニングされる。クローニング は、ＤＮＡフラグメントがプロモーターとの関係において逆方向で挿入されるよ うな形で行なわれる。この新しいベクターの中では、当初鋳型鎖であった鎖がコ ーディング鎖 になり、その逆も見られる。 新しいベクターは、ｐＥＵＣＣＲ内に含まれた配列から推定されたメッセンジ ャーＲＮＡ配列と相補的な配列をもつＲＮＡをコードする。 このようにして２つのＲＮＡは、その配列のみならずその方向（５′−３′） についても相補的である。 アンチセンスＲＮＡの転写のためのＤＮＡソースとしては、ｐＥＵＣＣＲ内に 含まれているもののようなｃＤＮＡのクローンを利用すると便利である。 アンチセンスクローニングの例（図４参照）。 ＣＣＲのｃＤＮＡは、ｐＥＵＣＣＲベクターから２重消化（ＢａｍＨＩ及びＫ ｐｎｌ）によって得られる。このようにして遊離されたＤＮＡフラグメントは、 アガロースゲル電気泳動（Bluescript）によってクローニングベクターから物理 的に分離される。 このＤＮＡフラグメントを閉じ込めているゲル部分は、精製ＤＮＡを得るよう な形で切断され処理される（キットが市販されている上述のSambrook et al，le Gene Clean の中で記述された「低融点アガロース」を含め、複数の方法が利用 可能である）。 ＢａｍＨＩ及びＫｐｎｌ末端を有するフラグメントは、ｃＤＮＡが³⁵Ｓプロモ ーターとの関係において逆向きに挿入されるような形で選ばれたこれら同じ酵 素によって予め消化された植物の発現ベクターと「連結」される。植物の中で転 写されることになる鎖は、この場合、非コーディング配列となる。 センスクローニングの例（図３参照） この場合、発現ベクターの³⁵Ｓプロモーターとの翻訳融合を実現するための「 実際的な」制限部位は存在しない。更に便利な新しい部位を遺伝子増幅（ＰＣＲ ）を用いて挿入した。Ｋｐｎｌ及びＢａｍＨＩにより認識された部位（注：これ らは、上述のアンチセンスクローニングのために利用されたものの５′−３′方 向との関係において異なる形で位置づけされた同じ部位である）の配列が付加さ れたｃＤＮＡの５′及び３′において、２つのオリゴヌクレオチドを規定した。 遺伝子増幅により、２つの制限部位が近接したｃＤＮＡのコーディング配列を 全て含むフラグメントが得られる。その後の手順は、アンチセンス構築物につい て記述したものと同じである。 ただし、この場合、メッセンジャーＲＮＡひいてはＣＣＲタンパク質の過剰発 現を導くはずのＣＣＲのＡＴＧと合わせてプロモーターの融合を行なった。 ユーカリのＣＣＲの場合について上述したセンス及びアンチセンスのクローニ ングの例は、ウマゴヤシ属のＣＣＲやトウモロコシのＣＣＲの場合にもあてはま る。 Ｂ） ウマゴヤシ属(Medicago truncatula)のＣＣＲをコードするｃＤＮＡの 獲得 ｃＤＮＡバンクの特徴 λＺＡＰＨベクター（Stratageneの「ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成」キット）内でMe dicago truncatula の根から抽出された全ＲＮＡから、利用されるバンクを構築 した。 ｃＤＮＡバンクのスクリーニング プローブ： ウマゴヤシ属のバンクのスクリーニングを、ユーカリのＣＣＲをコードするｃ ＤＮＡを用いて実施した。ランダムプライミング技術によって標識したｐＥＵＣ ＣＲの８００bp（Ｘｈｏ−Ｘｈｏ）のフラグメントをプローブとして供 した。 バンクの拡散及びニトロセルロースフィルター上でのフィンガープリント ３００，０００個のクローンを拡散させ、その後ニトロセルロースフィルター 上に移した（Schleicher & Schuell）。そのためフィルターを培養箱の中に５分 間置き、次に以下の溶液の中に連続的に浸漬させた。 １．５M ＭのＮａＣｌ／０．５M のＮａＯＨ ５分 １．５M のＮａＣｌ／０．５M のトリスpH８ ５分 ３×ＳＳＣ ２分 ８０℃で２時間の焼成 プレハイブリダイゼーション−ハイブリダイゼーション： フィルターを１２時間プレハイブリダイズさせ、次に以下の媒質内で３７℃で ２４時間ハイブリダイズさせた。 プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション媒質： ホルムアミド ２０％ デキストラン １０％ ＮａＣｌ １M サケの精子ＤＮＡ（１mg／ml） ０．２％のポリビニル−ピロリドン ０．２％のＢＳＡ ０．２％のフィコール ０．０５M のトリス−ＨＣｌ pH７．５ ０．１％のピロリン酸ナトリウム １％のＳＤＳ ハイブリダイゼーションの後、フィルターを２×ＳＳＣ−１％ＳＤＳ中で室温 で１０分×２回洗浄し、次に同じ溶液中で５５℃で３０分×２回洗浄した。 フィルターのオートラジオグラフィー露光の後、陽性の１５の溶菌斑を同定し た。これらの溶菌斑を、上述のハイブリダイゼーション条件下で、補足的な２回 のスクリーニングサイクルにより精製した。 インビボでの切除： 陽性クローンから、λファージのBluescriptプラスミドを「ＺＡＰ−ｃＤＮＡ 合成キット」のインビボでの切除プロトコルに従って切除した。 ウマゴヤシ属のＣＣＲのｃＤＮＡ： １，４０４pbs のサイズのウマゴヤシ属のＣＣＲをコードするｃＤＮＡをBlue scriptベクターのＥｃｏＲ１（５′側）とＸｈｏ（３′側）の部位の間に挿入し た。これは次の部分で構成されている： − １６７pbs の５′非翻訳転写部分、 − ３４２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする１，０２８pbs の領域 、 − ２０９pbs の３′非翻訳転写部分。 得られたｃＤＮＡは、配列番号１により表わされ、このｃＤＮＡから推定され たアミノ酸配列は配列番号２で表わされる。 Ｃ） トウモロコシのＣＣＲをコードするｃＤＮＡの獲得 ｃＤＮＡバンクの特徴 利用されるバンクは、λＺＡＰベクター（Stratageneの「ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合 成キット）内で、鉄が欠乏したトウモロコシ（ＡＭＯ４０６変換）の根から抽出 された全ＲＮＡから構築された。 ｃＤＮＡバンクのスクリーニング： プローブ： トウモロコシバンクのスクリーニングは、ユーカリのＣＣＲ ｃＤＮＡを用い て行なわれた。ランダムプライミング技術によって標識した８００bp（Ｘｈｏ− Ｘｈｏ）のｐＥＵＣＣＲフラグメントをプローブとして供した。 バンクの拡散及びニトロセルロースフィルター上でのフィンガープリント ５００，０００個のクローンを拡散し、その後ニトロセルロースフィルター上 に移した（Schleicher & Schuell）。そのためフィルターを培養箱の中に５分間 置き、次に以下の溶液の中に連続的に浸漬させた。 １．５M のＮａＣｌ／０．５M のＮａＯＨ ５分 １．５M のＮａＣｌ／０．５M のトリスpH８ ５分 ３×ＳＳＣ ２分 ８０℃で２時間の焼成 プレハイブリダイゼーション−ハイブリダイゼーション： フィルターを１２時間プレハイブリダイズさせ、次に以下の媒質内で５５℃で ２４時間ハイブリダイズさせた。 プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション媒質： ３×ＳＳＣ ０．５％のＳＤＳ ０．１％の粉乳 サケ精子ＤＮＡ（１mg／ml） ハイブリダイゼーションの後、フィルターを３×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳ中で 室温で１０分×２回洗浄し、次に同じ溶液中で６０℃で４５分×２回洗浄した。 フィルターのオートラジオグラフィー露光の後、陽性の２０の溶菌斑を同定し た。これらの溶菌斑を、上述のハイブリダイゼーション条件下で、補足的な３回 のスクリーニングサイクルにより精製した。 インビボでの切除： 陽性クローンから、λファージのBluescriptプラスミドを「ＺＡＰ−ｃＤＮＡ 合成キット」のインビボでの切除プロトコルに従って切除した。 得られたｃＤＮＡは配列番号３で表わされる、このｃＤＮＡから推定されたア ミノ酸配列は配列番号４で表わされている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピション，マガリ フランス国、エフ−31450 フルクヴォ、 アン・ペイルリエ（番地なし) (72)発明者 グリマ−プテナティ，ジャクリーヌ フランス国、エフ−31450 フルクヴォ、 リュ・ドゥ・ラ・アル（番地なし) (72)発明者 ベケール，ミシェル フランス国、エフ−63800 クルノン・ド ヴェルニュ、リュ・デ・バルティゾ、11 (72)発明者 ガマ，パスカル フランス国、エフ−31240 リュニヨン、 リュ・デュ・モン−ヴァリエ、23 (72)発明者 ブリア，ジャン−フランソワ フランス国、エフ−34980 サン−クレマ ン−ドゥ−リヴィエール、リュ・ドゥ・ ラ・グランジュ、116

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．− それ自体配列番号２で表わされるウマゴヤシ属のシンナモイルＣｏＡ レダクターゼ（ＣＣＲ）をコードするｍＲＮＡをコードする、配列番号１により 表わされるヌクレオチド配列、 − それ自体配列番号４で表わされるトウモロコシのＣＣＲをコードするｍＲＮ Ａをコードする、配列番号３により表わされるヌクレオチド配列、 − それぞれ配列番号２で表わされるＣＣＲのフラグメント又は配列番号３で表 わされるＣＣＲのフラグメントをコードし、上述の２つのＣＣＲのものと同等の 酵素活性を示す、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列又は配列番号３で表 わされるヌクレオチド配列のフラグメント、 − それぞれ配列番号１及び配列番号３の配列によりコードされるｍＲＮＡとハ イブリダイズすることのできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号１ 又は配列番号３によって表わされる配列との相補性をもつヌクレオチド配列、 − それぞれ配列番号２で表わされるＣＣＲをそれ自体コードするｍＲＮＡ又は 配列番号４で表わされるＣＣＲをそれ自体コードするｍＲＮＡとハイブリダイズ することのできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号１又は配列番号 ３により表わされる配列との相補性をもつヌクレオチド配列のフラグメント、 − それぞれ配列番号２又は４により表わされるＣＣＲをそれ自体コードするｍ ＲＮＡ、又は、植物内で前記ＣＣＲのものと同等の酵素活性を呈するフラグメン ト又は前記配列から誘導されたタンパク質をコードする、特に単数又は複数のヌ クレオチドの変異及び／又は付加、及び／又はサプレッション及び／又は置換に より配列番号１又は３で表わされる配列から誘導されたヌクレオチド配列、 − 前記ｍＲＮＡのうちの１つとハイブリダイズすることのできるアンチセンス ｍＲＮＡをコードする、変異及び／又は付加及び／又はサプレッション及び／又 は置換により、上述の相補的ヌクレオチド配列又は上述のとおりのこの配列のフ ラグメントから誘導されたヌクレオチド配列、 の中から選ばれたヌクレオチド配列で構成されている単数又は複数のコーディン グ領域を含む組換えヌクレオチド配列の、植物内で産生されたリグニンの正常な 含有量との関係における産生されたリグニンの含有量の増加方向又は減少方向で リグニン生合成が内部で調節されているトランスジェニック植物の獲得を目的と した植物細胞の形質転換のための利用。 ２．コーディング領域として − それ自体配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡをコードする 、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列、又は − 上述のＣＣＲのものと同等の酵素活性を示す、配列番号２により表わされる ＣＣＲのフラグメントをコードする、上述のヌクレオチド配列のフラグメント、 又は、 − それ自体配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、又は植物内 で前記ＣＣＲのものと同等の酵素活性を呈しこの配列から誘導されたタンパク質 をコードする、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又 はサプレッション及び／又は置換により上述の配列番号１で表わされる配列又は この配列の上述のとおりのフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配 列、 を含むことを特徴とするＤＮＡ配列。 ３．コーディング領域として − それ自体配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡをコードする 、配列番号３で表わされるヌクレオチド配列、又は − 上述のＣＣＲのものと同等の酵素活性を示す、配列番号４により表わされる ＣＣＲのフラグメントをコードする、上述のヌクレオチド配列のフラグメント、 又は − それ自体配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、又は植物内 で前記ＣＣＲのものと同等の酵素活性を呈しこの配列から誘導されたタンパク質 をコードする、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又 はサプレッション及び／又は置換により上述の配列番号３で表わされる配列又は この配列の上述のとおりのフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配 列、 を含むことを特徴とするＤＮＡ配列。 ４．コーディング領域として、 − それ自体配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、すなわち配 列番号１で表わされる配列によりコードされたか又は請求項２に記載のとおりの この配列から誘導された配列によってコードされたｍＲＮＡとハイブリダイズす ることのできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号１で表わされるも のとの相補性をもつヌクレオチド配列、又は − それ自体上述の通りの配列番号２で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ とハイブリダイズすることのできるＣＣＲをコードするｍＲＮＡとハイブリダイ ズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、上述の相補的配列のフラグメント 、又は − 上述のｍＲＮＡとハイブリダイズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする 、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又はサプレッシ ョン及び／又は置換によって上述の相補的配列又は上述の通りのこの相補的配列 のフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配列 を含むことを特徴とするＤＮＡ配列。 ５．コーディング領域として、 − それ自体配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ、すなわち配 列番号３で表わされる配列によりコードされたか又は請求項３に記載のとおりの この配列から誘導された配列によってコードされたｍＲＮＡとハイブリダイズす ることのできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、配列番号３で表わされるも のとの相補性をもつヌクレオチド配列、又は − それ自体上述の通りの配列番号４で表わされるＣＣＲをコードするｍＲＮＡ とハイブリダイズすることのできるＣＣＲをコードするｍＲＮＡとハイブリダイ ズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする、上述の相補的配列のフラグメント 、又は − 上述のｍＲＮＡとハイブリダイズできるアンチセンスｍＲＮＡをコードする 、特に単数又は複数のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又はサプレッシ ョン及び／又は置換によって上述の相補的配列又は上述の通りのこの相補的配列 のフラグメントから誘導されたあらゆるヌクレオチド配列 を含むことを特徴とするＤＮＡ配列。 ６．請求項２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列によりコードされるｍＲ ＮＡ、より具体的には、 − それ自体配列番号２で表わされるようなウマゴヤシ属に存在するＣＣＲ、又 は請求項２に記載の通りのこのＣＣＲのフラグメント又は誘導タンパク質をコー ドすることのできる、配列番号１で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるか 又は請求項２に記載のフラグメント又は誘導配列によりコードされるｍＲＮＡ、 − それ自体配列番号４で表わされるようなトウモロコシに存在するＣＣＲ、又 は請求項３に記載の通りのこのＣＣＲのフラグメント又は誘導タンパク質をコー ドすることのできる、配列番号３で表わされるＤＮＡ配列によりコードされるか 又は請求項３に記載のフラグメント又は誘導配列によりコードされるｍＲＮＡ。 ７．請求項６に記載のｍＲＮＡを構成するヌクレオチドの全て又はその一部の みの相補的ヌクレオチドを含むこと、及びこのｍＲＮＡとハイブリダイズできる ことを特徴とするアンチセンスｍＲＮＡ。 ８．それぞれ配列番号２又は４で表わされるウマゴヤシ属又はトウモロコシの 細胞内に存在するようなＣＣＲ、又は特に単数又は複数のアミノ酸の付加及び／ 又はサプレッション及び／又は置換によりこれらの配列から誘導されたあらゆる タンパク質、又は、前述のＣＣＲのものと同等の酵素活性を有する可能性のある 、前記ＣＣＲに由来するあらゆるフラグメント又はその誘導配列。 ９．請求項８に記載の配列番号２又は４で表わされるＣＣＲ又はこれらの配列 のあらゆる誘導配列及びフラグメントをコードするヌクレオチド配列において、 請求項８に記載のＣＣＲ又は誘導配列又はそのフラグメントをコードする可能性 がありながら、それぞれ配列番号１又は配列番号３で表わされる配列の全て又は 一部分又は遺伝子コードの縮重によりこれらの配列から誘導されたあらゆる配列 に対応することを特徴とするヌクレオチド配列。 10．請求項７に記載のアンチセンスｍＲＮＡと請求項６に記載のｍＲＮＡの間 で形成された複合体。 11．それ自体植物内でＣＣＲをコードすることのできるｍＲＮＡをコードする ことができる請求項２及び３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＤＮＡ配 列を含み、請求項２及び３のいずれか１項に記載の前記配列が異種配列内に挿入 されていることを特徴とする、組換えヌクレオチド配列。 12．異種配列内に挿入された請求項４及び５のいずれか１項に記載の相補的Ｄ ＮＡ配列を少なくとも１つ含み、この相補的ＤＮＡ配列は、植物内でＣＣＲをコ ードするｍＲＮＡとハイブリダイズすることのできるアンチセンスｍＲＮＡをコ ードすることを特徴とする、組換えヌクレオチド配列。 13．請求項２及び３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列又は請求項４及 び５のいずれか１項に記載の相補的配列の発現を調節するために必要な要素、特 にこれらの配列の転写のプロモーター及びターミネーター、及び場合によっては 植物内のリグニンの生合成段階に関与しているＣＣＲ以外の酵素の全部又は一部 、特にそれ自体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）をコードする ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、又は上述のｍＲＮＡ、特に ＣＡＤをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズすることのできるアンチセンスｍ ＲＮＡの全部又は一部をコードする少なくとも１つの配列を含むことを特徴とす る、請求項１１又は１２に記載の組換えヌクレオチド配列。 14．その複製にとっては必須ではないそのゲノムの部位の１つに組込まれた、 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組換えヌクレオチド配列を含むことを 特徴とする組換えベクター。 15．植物内の産生リグニンの正常な含有量との関係において産生リグニン含有 量を減少させるか又は増加させることにより植物内のリグニン生合成を調節する 方法であって、請求項１４に記載のベクターを用いてこれらの植物の細胞を形質 転換する段階を含んでなる方法。 16．植物内のリグニンの生合成の減少方法、ひいては植物内の産生リグニンの 正常な含有量との関係における産生リグニン含有量の減少方法であって、 − 請求項４及び５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＤＮＡ配列、 − 場合によっては、植物内のリグニンの生合成段階に関与するＣＣＲ以外の酵 素をコードするｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズす る能力をもつアンチセンスｍＲＮＡの全部又は一部をコードする少なくとも１つ のＤＮＡ配列、 を中に取り込むことによってこれらの植物のゲノムを形質転換させることにより 行なわれ、この形質転換は、 − 請求項１２又は１３に記載の組換えヌクレオチド配列を含む請求項１４に記 載の組換えベクターを用いて、又は − 請求項１２に記載の組換えヌクレオチド配列を含有するものを少なくとも１ つ含み、一方その他のものは上述のようなＣＣＲ以外の酵素をコードするｍＲＮ Ａとハイブリダイズする能力をもつアンチセンスｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配 列を含有している、複数の組換えベクターを用いて、 実施されることを特徴とする方法。 17．植物内のリグニンの生合成の減少方法、ひいては植物内の産生リグニンの 正常な含有量との関係における産生リグニン含有量の減少方法であって、 − 請求項２及び３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＤＮＡ配列、 − 場合によっては、植物内のリグニンの生合成段階に関与するＣＣＲ以外の酵 素の全部又は一部をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、特にＣＡＤの全部 又は一部をコードするＤＮＡ配列、 を中に取り込むことによってこれらの植物のゲノムを形質転換させることにより 行なわれ、この形質転換は、 − 請求項１１又は１３に記載の組換えヌクレオチド配列を含む請求項１４に記 載の組換えベクターを用いて、又は − 請求項１１に記載の組換えヌクレオチド配列を含有するものを少なくとも１ つ含み、一方その他のものは上述のようなＣＣＲ以外の酵素の全部又は一部をコ ードするＤＮＡ配列を含有している複数の組換えベクターを用いて、 実施されることを特徴とする方法。 18．植物内のリグニンの生合成の増加方法、ひいては植物内の産生リグニンの 正常な含有量との関係における産生リグニン含有量の増加方法であって、 − 請求項２及び３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＤＮＡ配列、 − 場合によっては、植物内のリグニンの生合成段階に関与するＣＣＲ以外の酵 素をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、特にＣＡＤをコードするＤＮＡ配 列、 を中に取り込むことによってこれらの植物のゲノムを形質転換させることにより 行なわれ、この形質転換は、 − 請求項１１又は１３に記載の組換えヌクレオチド配列を含む請求項１４に記 載の組換えベクターを用いて、又は − 請求項１１に記載の組換えヌクレオチド配列を含有するものを少なくとも１ つ含み、一方その他のものは上述のようなＣＣＲ以外の酵素の全部又は一部をコ ードするＤＮＡ配列を含有している、複数の組換えベクターを用いて、 実施されることを特徴とする方法。 19．請求項２〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列 をそのゲノム内に取り込むことによって形質転換される植物又は特に細胞、果実 、種子、花粉といった植物の断片。 20．特に請求項１４に記載のベクターを用いて請求項１１〜１３のいずれか１ 項に記載の組換えヌクレオチド配列をそのゲノム内に安定した形で組込むことに より植物細胞を形質転換させることによって得られるような組換えポリペプチド 、特に配列番号２又は４で表わされる組換えＣＣＲ。