MXPA99010181A - Pululanasa de maiz - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a fragmentos deácido nucleico aislados que codifican para la totalidad o para una porción sustancial de una pululanasa de maíz. La invención también se relaciona con la construcción de genes quiméricos que codifican para la totalidad o una porción de una pululanasa de maíz, en su orientación directa o antisentido, en donde la expresión del gen quimérico resulta en la producción de concentraciones alteradas de pululanasa de maíz en una célula huésped transformada.

Description

PULULABASA DE MAÍZ CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está en el campo de la biología molecular vegetal. Más específicamente, esta invención pertenece a los fragmentos de ácido nucleico gue codifican para enzimas involucradas en la biosíntesis de almidón en plantas y semillas de maíz .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El almidón de maíz es un componente importante de productos alimenticios, de forraje e industriales. De manera general, consiste de dos tipos de polímeros de glucano: polímeros de cadena relativamente larga con algunas ramas conocidas como amilosa, y una cadena más corta pero altamente ramificada de moléculas denominada amilopectina . Su biosíntesis depende de la interacción compleja de enzimas múltiples (Smith, A. et al., (1995) Plant Physiol . 101.-673 -677 ; Preiss, J. , (1988) Biochemistry of Plants 14:181-253). Las principales entre estas son la ADP-glucosa pirofosforilasa, la cual cataliza la formación de ADP-glucosa, una serie de sintasas de almidón las cuales utilizan ADP glucosa como un sustrato para la formación de polímero utilizando enlaces a-1-4; y varias REF.: 31453 enzimas ramificadoras de almidón las cuales modifican el polímero al transferir segmentos de polímero a otras partes del polímero utilizando enlaces a-1-6, lo gue genera estructuras ramificadas. Sin embargo, en base en los datos de otras plantas gue forman almidón tales como papa, o mutantes de maíz, se vuelve claro gue otras enzimas también juegan un papel en la determinación de la estructura final del almidón. En particular, las enzimas desramificantes tales como isoamilasa y pululanasa, y enzimas desproporcionantes no sólo participan en la degradación de almidón sino también en una modificación de la estructura de almidón durante su biosíntesis. Se han propuesto diferentes modelos para esta acción, pero todos comparten el concepto de gue tales actividades, o la carencia de las mismas, cambian la estructura del almidón producido. Esto es de interés aplicado debido a los cambios en la estructura de almidón, tales como las cantidades relativas de amilosa y amilopectina o el grado y longitud de ramificación de amilopectina, gue alteran su función en el cocinado y en los procesos industriales. Por ejemplo, el almidón derivado de mutantes gue se presentan naturalmente diferentes de maíz se puede demostrar, por una parte, gue difieren en la estructura y gue correspondientemente difieren en los ensayos funcionales tales como análisis visco rápido, el cual mide cambios en la viscosidad conforme se calienta el almidón y después se enfría (Walker, CE., (1988) Cereal Foods World 33 :49l-494). La interrelación de diferentes enzimas para producir estructuras diferentes, y a su vez la manera en gue estas diferentes estructuras se correlacionan con diferentes funcionalidades aún no se ha comprendido por completo. Sin embargo, se entiende gue cambiar la estructura de almidón resultará en una alteración de la función de almidón la cual a su vez lleva a aplicaciones nuevas o a costos reducidos de procesamiento (ciertas funcionalidades de almidón pueden hasta la fecha obtenerse únicamente a través de modificación guímica costosa del almidón. El papel de las enzimas de desramificación en la biosíntesis de almidón, en particular al afectar el grado de ramificación, indica gue la sobreexpresión o una reducción de la expresión de tales genes en el maíz se puede utilizar para alterar la distribución de ramificaciones en la cadena del almidón de maíz . Aungue se han descrito los genes de pululanasa de otras plantas (patente de los E.U. No. 5,514,576; Nakamura, Y. et' al., (1966) Planta 199 (2) : 209-218 ,• Renz, A. et al., (1995) EMBL Acceso No. 1076269) , hasta ahora no se ha descrito un gen de pululanasa para maíz.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con fragmentos de ácido nucleico aislados gue codifican para pululanasa de maíz.

Además, esta invención se relaciona con fragmentos de áci nucleico gue son complementarios a fragmentos de ácido nucleic gue codifican para pululanasa de maíz . En otra modalidad, la presente invención se relacion con genes guiméricos o recombinantes gue codifican para un pululanasa de maíz o fragmentos de ácido nucleico gue so complementarios con fragmentos de ácido nucleico gue codifica para pululanasa de maíz, unidos operablemente a secuencia reguladoras adecuadas, en donde la expresión del gen guiméric resulta en la producción de concentraciones alteradas d pululanasa de maíz en una célula huésped transformada. En una modalidad adicional, la presente invención s relaciona con una célula huésped transformada que comprende e su genoma un gen guimérico gue codifica para pululanasa d maíz, unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas en donde la expresión del gen guimérico resulta en l producción de concentraciones alteradas de pululanasa de maí en una célula huésped transformada. Las células huéspe transformadas pueden ser de origen eucariótico o procariótico e incluyen células derivadas de plantas superiores y d microorganismos. La invención también incluye planta transformadas gue surgen de células huésped transformadas d plantas superiores, y de semillas derivadas de tales planta transformadas .

Una modalidad adicional de la presente invención se relaciona con un método para alterar el nivel de expresión de pululanasa de maíz en una célula huésped transformada, que comprende: a) transformar una célula huésped con el gen quimérico que codifica para una pululanása de maíz, unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas; y b) hacer crecer la célula huésped transformada bajo condiciones gue sean adecuadas para la expresión del gen quimérico, en donde la expresión del gen quimérico resulta en la producción de niveles alterados de pululanasa de maíz en la célula huésped transformada . Además, la modalidad de la presente invención, se relaciona con métodos para obtener un fragmento de ácido nucleico gue codifica para la totalidad o sustancialmente toda la secuencia de aminoácidos gue codifica para pululanasa vegetal .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Y DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS La invención se puede comprender de manera más completa a partir de la siguiente descripción detallada y de los dibujos anexos y las descripciones de las secuencias las cuales forman parte de esta solicitud.

La figura 1 muestra una alineación de lá secuencia de aminoácidos de la presente enzima de pululanasa de maíz gue se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 8 (Sbjct) con la de pululanasa de Oryza sativa gue se establece en GenBank Acceso No. D50602 (Query) . SEC. DE IDENT. NO: 1 es la secuencia de nucleótidos de ADNc clona cen3n.pk0028.d2 gue codifica para una porción de pululanasa de maíz . La SEC. DE IDENT. NO: 2 es una secuencia deducida de aminoácidos obtenida de la traducción de la secuencia de nucleótidos de ADNc clona cen3n.pk0031. d2. La SEC. DE IDENT. NO: 3 es la secuencia nucleótidica de ADNc clona cn3n.pk0031.h.9 gue codifica para una porción de una pululanasa de maíz . La SEC. DE IDENT. NO: 4 es la secuencia deducida de aminoácidos obtenida de la traducción de la secuencia nucleotídica de ADNc de clona cn3n.pk0031.h9. La SEC. DE IDENT. NO: 5 es la secuencia de aminoácidos gue codifica para pululanasa de Oryza sativa gue tiene DDBJ No. de Acceso de D50602. La SEC. DE IDENT . NO: 6 es la secuencia de aminoácidos gue codifica para la pululanasa Spinacia olerácea gue tiene GenBank No. de acceso X83969.

La SEC. DE IDENT. NO: 7 es la secuencia nucleotídica de ADNc de clona gue codifica para una porción de pululanasa de maíz . La SEC. DE IDENT. NO: 8 es la secuencia deducida de aminoácidos obtenida de la traducción de la secuencia nucleotídica de ADNc clona codifica por la SEC. DE IDENT. NO: 7. Las descripciones de secuencia contienen el código de una letra para caracteres de secuencia nucleotídica y códigos de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con los estándares IUPAC-IYUB descritos en Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) y en la Biochemical Journal 219 (No . 2) :345-373 (1984), los cuales se incorporan en la presente como referencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el contexto de esta descripción, se utilizarán numerosos términos. Como se utiliza en la presente, un "fragmento aislado de ácido nucleico" es un ARN o ADN polimérico gue es de cadena sencilla o doble, que opcionalmente contiene bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento aislado de ácido nucleico en forma de un polímero de ADN puede estar constituido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Como se utiliza en la presente, "sustancialmente similar" se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases nucleotídicas resultan en una sustitución de uno o más aminoácidos pero que no afectan las propiedades funcionales de la proteína ' codificada por la secuencia de ADN. "Sustancialmente similar" también se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases nucleotídicas no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la alteración de la expresión de genes por tecnología antisentido o cosupresión. "Sustancialmente similar" también se refiere a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención tales como supresión o inserción de una o más bases nucleotídicas que no afecten sustancialmente las propiedades funcionales del transcrito resultante frente a la capacidad para mediar la alteración de la expresión de genes por tecnología antisentido o con supresión, o alteración de las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante. Por lo tanto, se entiende que la invención abarca más que las secuencias ejemplares específicas. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que la supresión y cosupresión antisentido de la expresión del gen se puede llevar a cabo utilizando fragmentos de ácido nucleico que representen menos de la totalidad de la región codificante de un gen, y mediante fragmentos de ácido nucleico que no comparten 100% de identidad con el gen que se va a suprimir. Además, las alteraciones en un gen las cuales resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado, pero que no llevan a cabo propiedades funcionales de la proteína codificada, son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica para otro residuo menos hidrofóbico, tal como glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como valina, leucina o isoleucina. Similarmente, también se espera gue produzcan un producto funcionalmente eguivalente cambios con los cuales resulten en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico por ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina. Los cambios de nucleótidos los cuales resultan en alteración de las porciones N terminal y C terminal de la molécula de proteína, tampoco se espera gue alteren su actividad de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas se encuentra dentro de la habilidad habitual en la técnica, en base a su determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. Además, las personas familiarizadas en la técnica reconocerán gue las secuencias sustancialmente similares abarcadas por esta invención también están definidas por su capacidad para hibridizar, bajo condiciones de restricción (0.1X SSC, 0.1% SDS, 65°C) , con las secuencias ejemplificadas en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares preferidos de la presente invención son aguéllos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son 80% idénticas a las secuencias de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico más preferidos son 90% idénticos e idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Los más preferidos son fragmentos de ácido nucleico gue son 95% idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente . Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia nucleotídica de un gen para proporcionar una identificación putativa de ese polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por una persona familiarizada en la técnica, o bien por una comparación de secuencia automatizada en computadora e identificación utilizando algoritmos tales como BLAST (Herramienta de búsgueda de alineación local básica,-Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; véase también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) . En general, una secuencia de 10 o más aminoácidos contiguos o 30 o más nucleótidos es necesario con el fin de identificar putativamente un polipéptido o secuencia de ácido nucleico homólogo a una proteína o gen conocido. Además, con respecto a la secuencia de nucleótidos, se pueden utilizar sondas de oligonucleótidos específicas para el gen constituidas de 20-30 nucleótidos contiguos en métodos dependientes de la secuencia de identificación de genes (por ejemplo hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo hibridación in si tu de colonias bacterianas o de placas de bacteriófagos. Además, se pueden utilizar oligonucleótidos cortos de 12-15 bases como cebadores de amplificación en PCR con el fin de obtener un fragmento de ácido nucleico particular gue comprenda a los cebadores. En consecuencia, una "porción sustancial" de una secuencia nucleotídica comprende suficiente de la secuencia para proporcionar identificación y/o aislamiento específicos de un fragmento de ácido nucleico gue comprende la secuencia. La presente especificación describe secuencias de aminoácidos o nucleotídicas parciales o completas gue codifican para una o más proteínas vegetales particulares. Una persona familiarizada en la técnica, gue tenga el beneficio de las secuencias como se presentan en este documento, puede utilizar ahora la totalidad o una porción sustancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos por aguéllos familiarizados en la técnica. En consecuencia, la presente invención comprende la secuencia completa como se presenta en la lista de secuencias anexa, así como porciones sustanciales de agüellas secuencias como se definen antes.

"Degeneración de codón" se refiere a una divergencia en el código genético gue permite la variación de la secuencia nucleotídica sin alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. En consecuencia, la presente invención se relaciona con cualguier fragmento de ácido nucleico gue codifigue para la totalidad o para una porción sustancial de la secuencia de aminoácidos gue codifican para la proteína pululanasa de maíz como se establece en las SEC. DE IDENT. NO: 2, 4 y 8. Una zona familiarizada en la técnica sabrá bien de la "desviación de codón" mostrada por una célula huésped específica cuando se utilicen los codones nucleotídicos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el gen de manera gue su utilización de frecuencia de codones se aproxime a la frecuencia de utilización de codones preferidos de la célula huésped. "Los genes sintéticos" se pueden ensamblar a partir de blogues de construcción oligonucleotídicos gue son sintetizados químicamente durante los procedimientos conocidos por aquéllos familiarizados en la técnica. Estos bloques de construcción se ligan y alinean para formar segmentos de gen los cuales después son ensmblados enzimáticamente para construir un gen completo. El término "sintetizado químicamente", cuando se relaciona con una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos componentes se ensamblan in vitro. La síntesis química manual de ADN se puede llevar a cabo utilizando procedimientos bien establecidos, o síntesis química automatizada la cual se puede realizar utilizando una de numerosas máquinas disponibles comercialmente. En consecuencia, los genes pueden ser adaptados para expresión óptima del gen en base en la optimización de la secuencia nucleotídica para reflejar el desplazamiento de codones de la célula huésped. Las personas familiarizadas en la técnica, aprecian la probabilidad de éxito en la expresión del gen si se hace uso en los codones en la desviación hacia los codones favorecidos del huésped. La determinación de los codones preferidos se puede basar en un análisis de los genes derivados de la célula huésped en donde esté disponible información de las secuencias. El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, que incluye secuencias reguladoras precedentes (secuencias 5' no codificantes) y posteriores (secuencias 3' no codificantes) respecto a la secuencia codificante. El término "gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. El término "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, gue comprende secuencias reguladoras y de codificación gue no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen guimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su posición natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia de genes . Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos o recombinantes. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. El término "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia específica de aminoácidos. "Secuencias reguladoras" se refieren a secuencias nucleotídicas localizadas hacia el extremo 5' (secuencias 51 no codificantes), dentro o hacia el extremo 3' (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante, y las cuales alteran la transcripción, el procesamiento o estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. "Promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante de ARN funcional. En general, una secuencia codificante se localiza 3' respecto a una secuencia promotora. La secuencia promotora consiste de elementos proximales y más distales hacia el extremo 5 ' , estos últimos elementos con frecuencia se denominan como alargadores. En consecuencia, un "alargador" es una secuencia de ADN la cual puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o la especificidad de tejido de un promotor. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o pueden estar constituidos de elementos diferentes derivados de promotores diferentes que se encuentran en la naturaleza, o incluso pueden comprender segmentos sintéticos de ADN. Se entiende por aquéllos familiarizados en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos por tipos de células, o en etapas diferentes de desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales diferentes. Los promotores los cuales provocan que el gen se exprese en la mayor parte de los tipos de células la mayor parte del tiempo se denominan comúnmente como "promotores constitutivos". Los nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales se descubren constantemente; se pueden encontrar numerosos ejemplos en la compilación de Okamuro y Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15 : 1 - 82 . Se reconoce además gue puesto gue la mayor parte de los casos, los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, así gue fragmentos de ADN de longitudes diferentes pueden tener actividad promotora idéntica. La "secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de traducción está presente en el ARNm procesado hacia el extremo 5' de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia líder de traducción puede alterar el procesamiento del transcrito primario a ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficiencia de traducción. Los ejemplos de secuencias líder de traducción se han descrito (Turner, R. y Foster, G.D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225) . La "secuencia 3' no codificante" se refieren a secuencias de ADN localizadas hacia el extremo 3 ' de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican para señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión de genes . La señal de poliadenilación habitualmente está caracterizada porque se altera la adición de los tractos de ácido poliadenílico hacia el extremo 31 del ARNm precursor. El uso de diferentes secuencias 31 no codificantes se ejemplifica por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-680. El término "transcrito de ARN" se refiere al producto que resulta de una transcripción catalizada por ARNm polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina como un transcrito primario, o puede ser una secuencia de ARN derivada de procesamiento postranscripcional del transcrito primario y se denomina como ARN maduro. "ARN mensajero (ARNm) " se refiere al ARN que se encuentra sin intrones y que puede ser traducido en una proteína por la célula. "ADNc" se refiere a un ADN de doble cadena que es complementario y que se deriva de ARNm. ARN "directo" se refiere a un transcrito de ARN que incluye ARNm y que de esta manera puede ser traducido en una proteína por la célula. "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a la totalidad o parte del transcrito primario objetivo de ARNm y que bloquea la expresión del gen objetivo (patente de los Estados Unidos No. 5,107,065). La complementariedad de ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito del gen específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, la secuencia 3' no codificante, intrones o con la secuencia codificante. "ARN funcional" se refiere a ARN antisentido, ARN de ribosima u otro ARN que no ha sido traducido pero que aún tiene un efecto sobre procesos celulares . El término "unido operablemente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico sobre un fragmento de ácido nucleico único de manera que la función de uno es afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante esté bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes se pueden unir operablemente a secuencias reguladoras en orientación directa o antisentido. El término "expresión" como se utiliza en la presente, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN directo (ARNm) o ARN antisentido, derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también se puede referir a la traducción de ARNm en un polipéptido. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcrito de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo. "Sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto de gen en organismos transgénicos que excede las concentraciones de producción en organismos normales o no transformados. "Cosupresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN directos capaces de suprimir la expresión de genes idénticos o sustancialmente similares, extraños o endógenos (patente de los E.U. No. 5,231,020) . "Niveles alterados" se refiere a la producción del producto o productos de genes en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de las normales o de organismos no transformados.

Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado post-traduccionalmente; es decir, uno en el cual los pre- o propéptidos presentes en el producto de traducción primaria se han removido. Proteína "precursora" se refiere al producto primario de traducción de ARNm; es decir, con pre- y propéptidos aún presentes. Los pre- y propétidos pueden ser, pero no se limitan a señales de localización intracelular. Un "péptido de tránsito de cloroplasto" es una secuencia de aminoácido la cual es traducida junto con una proteína y dirige la proteína hacia el cloroplasto u otro tipo de plástido presente en la célula en la cual se elabora la proteína. "Secuencia de tránsito de cloroplasto" se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para un péptido de tránsito de cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos la cual es traducida junto con una proteína y dirige la proteína hacia el sistema secretor (Chrispeels, J. J. , (1991) Ann Rev. Plant Phye . Plant Mol . Biol . 42 :21-53 ) . Si la proteína se va a dirigir a una vacuola, se puede agregar adicionalmente una señal objetivo vacuola (supra) , o si, se dirige al retículo endoplásmico, se puede agregar una señal de retención en el retículo endoplásmico ( supra) . Si la proteína se va a dirigir al núcleo, cualquier señal peptídica presente debe ser removida y en vez de esto se debe incluir una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys . 100 : 1627-1632) .

"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico dentro del genoma de un organismo huésped, lo que resulta en una herencia estable genéticamente.

Los organismos huésped que contiene fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan " como organismos "transgénicos". Los ejemplos de métodos de transformaciones de plantas incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth . Enzymol . 143 : 227) y acelerada por partículas o tecnología de transformación de "cañón de genes" (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327:70-73 ; patente de los E.U. No. 4,945,050). Las técnicas de ADN recombinante estándar y de clonación molecular utilizadas en la presente son bien conocidas en la técnica y se describen más completamente en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Col Spring Harbor, 1989 (a continuación "Maniatis") . Las clonas de ADNc que codifican para el gen de pululanasa de maíz se han aislado e identificado por comparación de secuencias de ADNc de planta aleatorios con la base de datos GenBank utilizando los algoritmos BLAST bien conocidos por aquéllos familiarizados en la técnica. Las secuencias de nucleótido de estas ADNc de pululanasa de maíz se proporcionan en las SEC. DE IDENT. NO: 1 y 3 y las secuencias deducidas de aminoácidos se proporcionan en las SEC.

DE IDENT. NO: 2 y 4. Los genes para pululanasa de otras plantas también se pueden identificar ahora por comparación de las secuencias de ADNc aleatorio con las secuencias de pululanasa de maíz que se proporcionan en este documento. Los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para aislar los ADNc y genes que codifican para pululanasa homólogos para la misma especie o para otras especies vegetales. El aislamiento de genes homólogos utilizando protocolos dependientes de secuencia es bien conocido en la técnica. Los ejemplos de protocolo dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a métodos de hibridación de ácido nucleico, y métodos de amplificación de ADN y ARN como se ejemplifican por los diversos usos de tecnologías de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa, reacción en cadena de ligasa) . Como se describe en la presente, un fragmento de ácido nucleico que codifica para la totalidad o casi la totalidad de pululanasa de maíz (SEC. DE IDENT. NO: 7) se aisla utilizando una porción de la inserción a partir de una clona de ADNc identificada por comparación de secuencias vegetales aleatorias de ADNc con la base de datos GenBank (cen3n.pk0028. d2 ; véase ejemplo 2). Por ejemplo, otros genes de pululanasa, ya sea como los ADNc o los ADN genómicos, se pueden aislar directamente mediante la utilización de la totalidad o una porción del presente gen para pululanasa de maíz como una sonda de hibridación de ADN para analizar bibliotecas de cualquier planta deseada utilizando metodología bien conocida por aquéllos familiarizados en la técnica. Las sondas oligonucleotídicas específicas basadas en la presente secuencia de pululanasa se pueden diseñar y sintetizar por métodos conocidos en la técnica (Maniatis). Además, se puede utilizar la totalidad de las secuencias directamente para sintetizar sondas de ADN por métodos conocidos por aquéllos familiarizados en la técnica tales como etiquetado de cebadores de ADN aleatorios, translación nick, o técnicas de etiquetado de extremo, o sondas de ARN utilizando sistemas de transcripción in vi tro disponibles. Además, se pueden diseñar sebadores específicos y se pueden utilizar para amplificar una parte de, o la longitud completa de la presente secuencia. Los productos de amplificación resultantes se pueden etiquetar directamente durante las reacciones de amplificación o se pueden etiquetar después de las reacciones de amplificación, y se pueden utilizar como sondas para aislar ADNc de longitud completa o fragmentos genómicos bajo condiciones de restricción apropiada. Además, dos segmentos cortos de los presentes fragmentos de ácido nucleico se pueden utilizar en los protocolos de reacción de cadena de polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican para genes de pululanasa homólogos a partir de ADN o ARN. La reacción en cadena de polimerasa también se puede llevar a cabo en una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonados en donde la secuencia de uno o más cebadores se deriva de el fragmento de ácido nucleico actual, y la secuencia de los otros sebadores aprovecha la presencia de los tractos de ácido poliadenílico hacia el extremo 3 ' del precursor de ARNm que codifica para pululanasa vegetal .. Alternativamente, se puede utilizar una segunda secuencia de cebador basada en las secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, una persona familiarizada en la técnica puede seguir el protocolo RACE (Frohman et al., * (1988) PNAS USA 85 : 8998 ) para ADNc mediante la utilización de PCR para amplificar copias de la región entre un sólo punto en el transcrito y el extremo 3 ' ó 5 ' . Se pueden diseñar cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' a partir de las presentes secuencias. Utilizando sistemas disponibles comercialmente 3 ' -RACE o 5 ' -RACE (BRL), específicos para fragmentos de ADNc 3 ' ó 5 ' , se pueden aislar (Ohara et al., (1989) PNAS USA 86;5673; Loh et al., (1989) Science 243 : 217 ) . Los productos generados por los procedimientos 31 y 5' RACE se pueden combinar para generar ADNc de longitud completa (Frohman, M.A. y Martin, G.R., (1989) Techniques 1:165). Finalmente, la disponibilidad de las presentes secuencias nucleotídicas y deducida de aminoácidos facilita el análisis inmunológico de bibliotecas de expresión de ADNc. Se pueden sintetizar péptidos sintéticos que representen porciones de las presentes secuencias de aminoácidos . Estos péptidos se pueden utilizar para inmunizar animales para producir anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad por péptidos o proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos. Estos anticuerpos se pueden utilizar después para analizar las bibliotecas de expresión de ADNc para aislar clonas de ADNc de longitud completa de interés (Lerner, R.A. (1984) Adv. Immunol . 36 : 1 ; Maniatis). Los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para generar plantas transgénicas en las cuales está presente la pululanasa de maíz a concentraciones mayores o menores que las normales o en tipos de células o en etapas de desarrollo en las cuales normalmente no se encuentra. Esto tendrá el efecto de alterar la estructura de almidón en estas células . La sobreexpresión de pululanasa de maíz se puede llevar a cabo al construir primero un gen quimérico en el cual la región que codifica para pululanasa de maíz esté unida operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados en la etapa deseada de desarrollo. Por razones de conveniencia, el gen quimérico puede estar constituido de una secuencia promotora y una secuencia líder de traducción derivada del mismo gen. Las secuencias 3' no codificantes que codifican para las señales de terminación de transcripción también se pueden proporcionar. Los genes quiméricos actuales también pueden estar constituidos de uno o más intrones con el fin de facilitar la expresión del gen. Después se construye un vector plasmídico que comprende el presente gen quimérico. La elección del vector plasmídico depende del método que se utilizará para transformar las plantas huésped. Las personas familiarizadas en la técnica reconocerán los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector plasmídico con el fin de transformar con éxito, seleccionar y propagar células huésped contenidas en el gen quimérico. Las personas familiarizadas en la técnica también reconocerán que eventos de transformación independientes diferentes resultarán en concentraciones y patrones de expresión diferentes (Jones et al., 1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol . Gen . Genetics 218 : 78 - 86 ) , y por lo tanto gue, se deben analizar eventos múltiples con el fin de obtener líneas gue muestren el nivel y patrón de expresión deseados . Tal análisis se puede llevar a cabo mediante análisis Southern del ADN, análisis Northern de la expresión del ARNm, análisis Western de la expresión de proteína, o por análisis fenotípico. Para algunas aplicaciones, puede ser útil dirigir la proteína pululanasa a diferentes compartimientos celulares o para facilitar su secreción de la célula. Por lo tanto se considera que el gen quimérico descrito antes puede ser suplementado adicionalmente al alterar la secuencia codificante para codificar proteína de pululanasa con secuencias dirigidas intracelulares apropiadas tales como secuencias de tránsito (Keegstra, K. (1989) Cell 56.-247-253) , secuencias de señal o secuencias que codifican para localización en el retículo endoplásmico (Chrispeels, J.J., (1991) Ann . Rev. Plant Phys . Plant Mol . Biol . 42:21-53) . o señales de localización nuclear (Raikhel, N. (1992) Plant Phys . 100 : 1627 -1632 ) agregadas y/o con secuencias dirigidas que ya estén removidas en ese momento. Aunque las referencias mencionadas proporcionan ejemplos de cada una de estas, la lista no es exhaustiva y se pueden descubrir en el futuro más señales de dirección de utilidad. También deseable reducir o eliminar la expresión del gen de pululanasa en plantas para algunas aplicaciones. Con el fin de poder llevar a cabo esto, se puede construir un gen quimérico diseñado para la cosupresión de pululanasa al unir el gen de pululanasa o un fragmento del gen a secuencias promotoras vegetales. Alternativamente, se puede construir un gen quimérico jdiseñado para expresar ARN antisentido para la totalidad o parte del gen de pululanasa al unir el gen de pululanasa o el fragmento del gen en orientación inversa o secuencias promotoras vegetales. Ya sea la cosupresión o el gen quimérico antisentido se pueden introducir en plantas por medio de transformación en donde se reduce o elimina la expresión del gen para pululanasa endógena.

La proteín pululanasa de maíz reducida en células huésped heterólogas, particularmente en células de huéspedes microbianos, se puede utilizar para preparar anticuerpos para la proteína por métodos bien conocidos por aquéllos familiarizados en la técnica. Los anticuerpos son útiles para detectar proteína de pululanasa de maíz in si tu en células o bien in vi tro en extractos celulares. Las células huésped heterólogas preferidas para producción de .proteína de pululanasa de maíz son huéspedes microbianos. Los sistemas de expresión microbiana y los vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras que dirigen una expresión de alto nivel para proteínas extrañas son bien conocidos por aquéllos familiarizados en la técnica. Cualquiera de estas se puede utilizar para construir genes quiméricos para la producción de pululanasa de maíz . Estos genes quiméricos después pueden ser introducidos en microorganismos apropiados vía transformación para proporcionar expresión de alto nivel de pululanasa de maíz. Se proporciona un ejemplo de un vector para expresión de alto nivel de pululanasa de maíz en un huésped bacteriano (ejemplo 4) . La totalidad o una porción de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención también se puede utilizar como sondas para mapear genética y físicamente los genes que son una parte de, o como marcadores para rasgos relacionados con la expresión de pululanasa de maíz. Tal información puede ser útil en la elaboración de maíz con el fin de desarrollar líneas con fenotipos de almidón deseados. Por ejemplo, los presentes fragmentos de ácido nucleico se pueden utilizar como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) : Las transferencias Southern (Maniatis) de ADN genómico vegetal digerido por restricción se pueden sondear con los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención. Los patrones de bandeo resultantes después se pueden someter a análisis genético utilizando programas de computadora tales como MapMaker (Lander et al., (1987) Genomics 2:174-181) con el fin de construir un mapa genético. Además, los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para realizar sondeos Southern que contengan los ADN genómicos tratados por endonucleasa de restricción del conjunto de individuos que representen la parte parental de la progenie de un cruce genético definido. La segregación de polimorfismos de ADN se anota y utiliza para calcular la posición de la secuencia de ácido nucleico actual en el mapa genético obtenido previamente, utilizando esta población (Botstein, D. et al., (1980) Am. J. Hum. Genet . 32 314-331) . La producción y uso de ondas derivadas de genes de plantas para uso en mapeo genético se describe en R. Bernatzky, R. y Tanksley, S.D. (1986) Plant Mol . Biol . Repórter 4 (1) -.37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clonas específicas de ADNc utilizando la metodología indicada antes o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones entrecruzadas F2 , poblaciones retrocruzadas, poblaciones apareadas aleatoriamente, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos pueden utilizarse para mapeo. Tales metodologías son bien conocidas para aquéllos familiarizados en la técnica. Las sondas de ácido nucleico derivadas de las secuencias actuales de ácido nucleico también se pueden utilizar para mapeo físico (es decir, colocación de secuencias en mapas físicos; véase Hoeheisel, J. D., et al., In: Nonmammalian Genomic Analysis : A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y referencias mencionadas en ese documento) . En otra modalidad, se pueden utilizar las sondas de ácido nucleico derivadas de las secuencias actuales de ácido nucleico en fluorescencia directa para mapeo por hibridación in si tu (FISH) . Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clonas grandes (de varias hasta varios cientos de KB) , las mejoras en la sensibilidad pueden permitir el funcionamiento del mapeo FISH utilizando sondas más cortas. Se pueden llevar a cabo diversos métodos basados en la amplificación de ácido nucleico del mapeo genético y físico utilizando las presentes secuencias de ácido nucleico. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelo, polimorfismo o fragmentos amplificados por PCR (CAPS) , ligación específica de alelo, reacciones de extensión de nucleótidos, mapeo híbrido por radiación y mapeo Happy. Para estos métodos, la secuencia de un fragmento de ácido nucleico se utiliza para diseñar y producir pares de cebadores para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores es bien conocido por aquéllos f miliarizados en la técnica. En los métodos que utilizan mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar las diferencias en la secuencia de ADN entre los originales o parentales del cruce de mapeo en la región que corresponde a la secuencia actual de ácido nucleico. Sin embargo, esto generalmente no es necesario para métodos de mapeo. Tal información puede ser útil en la producción de maíz con el fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados de almidón.

EJEMPLOS La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos, en los cuales todas las partes y porcentajes están en peso y los grados son Celsius, a menos que se especifique de otra manera. Se debe entender que estos ejemplos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración. A partir de la discusión anterior y estos ejemplos, una persona familiarizada en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención, y sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede realizar diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones .

EJEMPLO 1 Composición de una biblioteca ADNc de maíz ,• aislamiento ? secuenciado de clonas de ADNc Se prepara una biblioteca de ADNc que representa ARNm de tejido de endosperma de maíz obtenido 20 días después de la polinización de plantas de maíz Zea mays LE392. Se prepara una biblioteca de ADNc en un vector Uni-ZAPMR XR, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . La conversión de la biblioteca Uni-ZAPMR XR en una biblioteca plasmídica se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo proporcionado por Stratagene. Cuando se realiza la conversión, las inserciones de ADNc están contenidas en el vector .plasmídico pBluescript. La biblioteca de ADNc se normaliza al seguir esencialmente el protocolo descrito en la patente de los E.U. No. 5,482,845. Las inserciones de ADNc de colonias bacterianas obtenidas aleatoriamente que contienen los plásmidos pBluescript recombinantes se amplifican por medios de reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores específicos para secuencias de vector que flanquean a las secuencias de ADNc de maíz insertadas . Los ADN de inserción amplificados se secuencían en reacciones de secuenciado de colorante-cebador, de acuerdo con el protocolo proporcionado por Perkin-Elmer; los productos resultante se analizan utilizando un secuenciador de ADN Perkin-Elmer ABI PRISMHR 377.

EJEMPLO 2 Identificación y caracterización de clonas de ADNc Se identifican los ADNc que codifican para pululanasa de maíz al llevar a cabo una búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., et al., (1990) *. Mol . Biol . 215 :403-410 ; véase también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para similitud con secuencias contenidas en la base de datos GenBank. Las secuencias de ADNc de maíz obtenidas en el Ejemplo 1, se analizan para determinar la similitud' con todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos GenBank utilizando el algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Las secuencias de ADN se traducen en todos los marcos de lectura y se comparan para determinar la similitud con todas las secuencias de proteína disponibles públicamente contenidas en la base de datos GenBank utilizando el algoritmo BLASTX (Gish, W y States, D.J. (1993) Nature Genetics 3 266-272) proporcionado por la NCBI . La búsqueda BLASTN utilizando la clona cen3n.pk0028.d2 revela similitud de la secuencia nucleotídica actual con una secuencia de nucleótidos reportada en la patente de los E.U. No. 5,514,576 (GenBank Acceso No. 120414; logP = 164.96) para codificar una enzima de pululanasa de Oryza sativa . La búsqueda BLASTX utilizando la clona cen3n.pk0028. d2 revela similitud de la proteína codificada por el ADNc para Oryza sativa (DDJB Acceso No. D50602; logP = 112.55) y Spinacia olerácea (GenBank Acceso No. X83969; logP = 81.36) de enzimas de pululanasa. La SEC. DE IDENT. NO: 1 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de pululanasa. En las SEC. DE IDENT. NO: 2 se muestra la secuencia correspondiente de aminoácidos de la proteína pululanasa. La secuencia de aminoácidos de la presente pululanasa de maíz muestra aproximadamente 83 y 63% de identidad de secuencia con las enzimas de pululanasa de Oriza sativa y Spinacia olerácea, respectivamente . Una clona de ADNc adicional que codifica para una porción distinta de una enzima de pululanasa de maíz se identifica por los métodos descritos antes . Una búsqueda BLASTX utilizando la clona cen3n.pk0031.h9 también revela similitud de la proteína codificada por el ADNc para las enzimas de pululanasa de Oryza sativa (No. de acceso DDJB D50602; logP = 60.74) y Spinacia olerácea (GenBank No. de acceso X83969; logP = 35.17). La SEC. DE IDENT. NO: 3 muestra la secuencia de nucleótidos de este ADNc de pululanasa. En la SEC. DE IDENT. NO: 4 se muestra la secuencia de aminoácidos de la presente pululanasa de maíz . La secuencia de aminoácidos de la presente pululanasa de maíz muestra aproximadamente 77 y 55% de identidad secuencia con las enzimas de pululanása de Oryza sativa y Spinacia olerácea, respectivamente. Se utiliza un fragmento de EcoRI de 1291 pb de la inserción en la clona de ADNc cen3n.pk0028.d2 como una sonda de hibridación para analizar las secuencias de longitud completa para pululanasa de maíz en una biblioteca de ADNc de endosperma de maíz (ARNm que se extrae 20 días después de la polinización) . Se transfieren por duplicado membranas de • nitrocelulosa aproximadamente 2.8 X 10ß ufp. El ADN inmovilizado se hibridiza con el fragmento de EcoRI radiomarcado y los filtros se lavan esencialmente como se describe en Maniatis. Se identifican 18 clonas positivas putativas de este análisis inicial . Una de estas clonas positivas, pDBE6A, se encuentra que contienen la inserción de ADNc más grande. Esta clona se purifica y se somete a caracterización adicional . La secuencia nucleotídica completa de la inserción de ADNc en pDBE6A se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 7. La inserción de 2904 pb consiste de un marco de lectura abierta de 2638 pb gue codifica para un polipéptido de 878 aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 8) , seguido por 245 pb de ADN 31 no traducido y una región poliA de 21 pb. La alineación de la secuencia deducida de aminoácidos con la de pululanasa de arroz muestra gue las dos secuencias son 75% idénticas al nivel de aminoácidos (véase la figura 1) . Las alineaciones de secuencia y los cálculos de por ciento de identidad se realizan utilizando el algoritmo descrito por Altschul et al. ((1990) J*. Mol . Biol . 215:403-410) . Las alineaciones de secuencia y las calificaciones BLAST así como las probabilidades indican gue los presentes fragmentos de ácido nucleico codifican para la totalidad o casi la totalidad de la enzima pululanasa de maíz.

EJEMPLO 3 Expresión de genes quiméricos en células vegetales Se pueden construir un gen guimérico gue comprende un ADNc para pululanasa de maíz en orientación directa con respecto al promotor de zeína de maíz de 27 kD que se localiza hacia el extremo 5 ' respecto al fragmento de pululanasa de maíz, y la zeína de 10 kD hacia el extremo 3' gue se localiza 3 ' respecto al fragmento de pululanasa de maíz . El fragmento de pululanasa de maíz de este gen se puede generar por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de una clona de ADNc gue comprende la pululanasa de maíz utilizando los cebadores oligonucleotídicos apropiados . Se pueden incorporar sitios de clonación (Ncol o Smal) dentro de los oligonucleótidos para proporcionar orientación adecuada del fragmento de ADN cuando se inserte en el vector digerido pML 103 como se describe abajo. La amplificación se realiza posteriormente en 100 µl de volumen en un mezclador PCR estándar que consiste de 0.4 mM de cada oligonucleótido y 0.3 pM de ADN objetivo en Tris-HClo 10 mM, pH 8.3, KC1 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.001% p/v de gelatina, dGTP 200 mM, dATP 200 mM, dTTP 200 mM, dCTP 200 mM y 0.025 unidades de ADN polimerasa AmplitaqM . Las reacciones se llevan a cabo en un aparato Perkin Elmer Cetus ThermocyclerMR durante 30 ciclos que comprende 1 minuto a 95 °C, 2 minutos a 55 °C y 3 minutos a 72 °C, con una extensión final de 7 minutos a 72 °C después del último ciclo. El ADN amplificado después se digiere con enzimas de restricción Ncol y Smal y se fracciona en un gel de agarosa de punto de fusión bajo 0.7% en Tris-acetato 40 mM, pH 8.5, EDTA 1 mM. La banda apropiada se puede cortar del gel, se funde a 68 °C y se combina con un fragmento Ncol-Smal de 4.9 kb del plásmido pML103. El plásmido pML103 se ha depositado bajo los términos del tratado de Budapest en ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852) y tiene el número de acceso ATCC 97366. El fragmento de ADN de pML103 contiene un fragmento promotor Salí-Ncol de 1.05 kb del gen de zeína de maíz de 27 kD y un fragmento Smal-Sall de 0.96 kb desde el extremo 3' del gen de zeína de maíz de 10 kD en el vector pGem9Zf (+) (Promega) . El vector y el ADN de inserción se pueden ligar a 15 °C durante la noche, esencialmente como se describe (Maniatis) . El ADN ligado después se puede utilizar para transformar E. coli XLl-Blue (Epicurian Coli XL-1 BlueMR; Stratagene) . Los transformantes bacteriales se pueden analizar por digestión de enzima de restricción o ADN plasmídico y se limitan al análisis de secuencia nucleotídica utilizando el método de terminación de cadena didesoxi (equipo de secuenciado de ADN SequenaseMR,- U.S. Biochemical) . La construcción plasmídica resultante puede comprender un gen quimérico que codifica en la dirección 5 ' a 31 , el promotor de zeína de maíz de 27 kD, el fragmento de ADNc para pululanasa de maíz y la región 3' de zeína de 10 kD. El gen quimérico descrito antes se puede introducir en células de maíz por el siguiente procedimiento. Se pueden disectar embriones de maíz inmaduros de cariopsis en desarrollo derivadas de cruces de líneas de maíz endogámicas H99 y LH132. Los embriones se aislan 10 a 11 días después de la polinización cuando tienen una longitud de 1.0 a 1.5 mm. Los embriones después se colocan con el lado del eje orientado hacia abajo y en contacto con medio N6 solidificado en agarosa (Chu et al . , (1975) Sci Sin . Peking 18:659-668) . Los embriones se mantienen en la oscuridad a 27 °C. Los callos embriogénicso friables consisten de masas no diferenciadas con células con proembrioides somáticos y embriodes que crecen sobre estructuras suspensoras que proliferan desde el escutelo de estos embriones inmaduros. Los callos embriogénicos aislados de la planta primaria se pueden cultivar en medio N6 y se subcultivan en este medio cada 2 a 3 semanas . Se puede utilizar el plásmido p35S/Ac (obtenido del Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) en experimentos de transformación con el fin de proporcionar un marcador seleccionable . Este plásmido contiene el gen .Pat (véase la publicación de patente europea 0 242 236) el cual codifica para fosfinotrisina acetiltransferasa (PAT) . La enzima PAT confiere resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas tales como fosfinotricina . El gen pat en p35S/Ac está bajo el control de 35S del virus de mosaico de coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:818-812) 'y la región 3' del gen de nopalina sintasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium turne faciens . Se puede utilizar el método de bombardeo de partículas (Klein et al., (1987) Nature 327:70-73) para transferir genes a las células de cultivo de callo. De acuerdo con este método, se recubren partículas de oro (1 µm de diámetro) con ADN utilizando la siguiente técnica. Se agregan 10 µg de ADN plasmídico a 50 µl de una suspensión de partícula de oro (60 mg por ml) . Cloruro de calcio (50 µl de una solución 2.5 M) y base libre de espermidina (20 µl de una solución de 1.0 M) , que se agrega a las partículas. La suspensión se somete a remolino durante la adición de estas soluciones . Después de 10 minutos, los tubos se centrifugan brevemente (5 seg a 15,000 rpm) y se remueven en sobrenadante' Las partículas se resuspenden en 200 µl de etanol absoluto, se centrifugan nuevamente y se remueve el ' sobrenadante. Se realiza un enjuagado con etanol nuevamente y las partículas se resuspenden en un volumen final de 30 µl de etanol. Se puede colocar una alícuota (5 µl) de partículas de oro recubiertas con ADN en el centro de un disco volador KaptonMR (Bio-Rad Labs] Las partículas después se aceleran en el tejido de maíz con el equipo BiolisticMR PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) , utilizando helio de 70.3 kg/cm2 (1000 psi), una distancia de separación de 0.5 cm y una distancia de vuelo de 1.0 cm. Para el bombardeo, el tejido embrlogénico se coloca sobre papel filtro sobre medio N6 solidificado con agarosa. El tejido se dispone en un lecho delgado y se cubre un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La caja de Petri que contiene el tejido se puede colocar en la cámara de PDS-1000/He aproximadamente 8 cm de la pantalla de detención. Después se extrae el aire de la cámara hasta un vacío de 711 mmHg (28 pulgadas de Hg) . El macroportador se acelera con una onda de choque de helio utilizando una membrana de ruptura que se descarga cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 70.3 kg/cm2 (1000 psi). Siete días después del bombardeo, el tejido se puede transferir a medio N6 que contiene glufosinato (2 mg por litro) y que carece de caseína o prolina. El tejido continúa creciendo lentamente en este medio. Después de 2 semanas adicionales, el tejido se puede transferir a medio N6 fresco que contiene glufosinato. Después de 6 semanas, se pueden identificar áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos que crecen activamente, en algunas de las placas que contienen el medio suplementado con glufosinato. Estos callos pueden continuar creciendo cuando se subcultivan en medio selectivo. Las plantas pueden ser regeneradas a partir de los callos transgénicos al primero transferir grupos de tejido a medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2, 4-D. Después de dos semanas, el tejido se puede transferir a medio de regeneración (Fromm et al., (1990) Bio /Technology 8:833-839). El almidón que se extrae de semillas solas obtenido de plantas de maíz transformadas con el gen quimérico se puede analizar posteriormente. Las semillas se pueden colocar en una solución gue contiene ácido láctico 1.0% y metabisulfito de sodio 0.3%, pH 3.8, gue se mantiene a 52 °C durante 22-24 h. Las semillas después se drenan, se enjuagan y homogeneizan individualmente en 8-9 ml de una solución de NaCl 100 mM. Se agregan 5 ml de tolueno a cada tubo y se agita vigorosamente dos veces durante 6 minutos utilizando un mezclador de pintura, y se permite gue sedimente durante 30 minutos. Se rocían 2 ml de NaCl 100 mM en la solución, lo que permite que sedimente durante 30 minutos, y la capa de tolueno y proteína es eliminada por aspirado. Se repite la etapa de lavado con' tolueno. Se agregan 12 ml de agua y se agitan en un agitador de pintura durante 45 segundos . Esta solución se centrifuga durante 10 minutos y se remueve en agua. Se repite el lavado con agua, seguido por un lavado final con 12 ml de acetona. Después de las etapas de agitación y centrifugación, se drena la acetona y se permite que se evapore durante 1 h. Los extractos de almidón se incuban en un horno a 40 °C durante la noche . Los almidones extraídos pueden ser desramificados • enzimáticamente como sigue. Se agregan 7 mg de cada muestra de almidón a un tubo de ensayo con tapa roscada que contiene 1.1 ml de agua. Los tubos se calientan a 120 °C durante 30 minutos y después se colocan en un baño de agua a 45 °C. Se puede preparar una solución de desramificación al diluir 50 µl de isoamilasa (5 x 106 unidades/ml; Sigma) por ml de amortiguador NaOAc 50 mM, pH 4.5. Se agregan 40 µl de solución de desramificación a cada muestra de almidón, y las muestras se incuban en un baño de agua a 45 °C durante 3 h. La reacción de desramificación se detiene por calentamiento de las muestras a 110°C durante 5 minutos. Las muestras de almidón desramificado después se pueden lifilizar y volver a disolver en DMSO. Después se pueden analizar 100 µl de almidón desramificado por cromatografía de permeación en gel - (GPC) . Se inyectan 100 µl de cada almidón desramificado y se someten a cromatografía por pasaje a través de dos columnas GPC (Mixed Bed-C; Polymer Labs) dispuestas en serie. Se realiza la cromatografía a 100 °C y se eluyen las muestras con DMSO a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min. Se recolectan muestras cromatográficas a intervalos de 25 minutos. Se puede utilizar un detector de índice de refracción (Waters) para la detección, y los datos se pueden recolectar y almacenar con la ayuda de un Software (elementos de programación) Chemstation que corre en computadora (versión A.02.05; Hewlett-Packard). Los tiempos de retención de las muestras recolectadas después se pueden comparar con los tiempos de retención de los estándares de pululano (380 K, 100K 23.7K, 5.8K, 728 y 180 de peso molecular) . La proporción del almidón total se determina para veinticuatro intervalos de grado de polimerización (DP) que abarcan las porciones de amilosa y amilopectina del cromatograma. El área de porcentaje en los intervalos de DP apropiados se utiliza para determinar los valores para A & Bl, B2 , B3 y B4+ cadenas de la porción de amilopectina del cromatograma. La proporción del área total por encima de DP 150 se utiliza para determinar el contenido de amilosa.

La amilopectina típicamente se describe por su distribución de cadenas ramificadas en la molécula. La molécula de amilopectina está constituida de regiones alternantes cristalinas y amorfas. La región cristalina en donde se producen muchos de los puntos de ramificación (enlaces a-1,6), mientras que la región amorfa es un área de poca o nula ramificación y algunas cadenas de ramas . El tipo de cadena puede ser designado como A o B. Las cadenas A son no ramificadas y abarcan una sola región cristalina. Las cadenas Bl también abarcan una sola región cristalina, pero están ramificadas. Las cadenas B2 , B3 y B4+ están ramificadas y abarcan 2, 3, y 4 o más regiones cristalinas, respectivamente. El área relativa bajo la porción de amilopectina de los cromatogramas se puede utilizar para determinar el porcentaje de área de las cadenas A & BA, B2 , B3 y B4+. Los almidones derivados de semillas de plantas transformadas con el gen quimérico también se pueden probar para determinar su funcionalidad por técnicas bien conocidos por aquéllos familiarizados en la técnica. Por ejemplo, se puede extraer almidón de semillas maduras secas de plantas transformadas . Se pesan 15 g de semillas en un matraz Erlenmeyer de 50 ml y se colocan en 50 ml de solución de germinación (igual que en lo anterior) durante 18 horas a 52 °C. Las semillas se drenan y se enjuagan con agua. Las semillas después se homogeneizan utilizando una sonda Polytron 20 mm (Kinematica GmbH; Kriens-Luzern, Suiza) en 50 ml de NaCl 50 mM frío. El homogeneizado se filtra a través de un tamiz de malla de 72 micrómetros . El filtrado se lleva a un volumen total de 400 ml con NaCl 50 mM y se agrega un volumen igual de tolueno. La mezcla se agita con una barra de agitación magnética durante 1 h a una velocidad suficiente para emulsificar completamente las dos fases. Se permite que la emulsión se separe durante la noche sobre un vaso de precipitado cubierto . La capa de tolueno superior es aspirada del vaso de precipitado y se desecha. La suspensión de almidón restante en el fondo del vaso de precipitado se resuspende, se vierte en un frasco de centrífuga de 250 ml y se centrifuga 15 minutos a 25,000 RCF. El sobrenadante se desecha y el almidón se lava secuencialmente con agua y acetona por agitación y centrifugación como en lo anterior. Después del lavado de acetona y la centrifugación, la acetona se decanta y se permite gue el almidón segué durante la noche en una campana para humos, a temperatura ambiente. Después se puede utilizar un analizador Rapid Visco Analyzer (Newport Scientific; Sidney, Australia), con la opción de alta sensibilidad y elementos de programación (software) Thermocline para unir las curvas de análisis. Para cada línea, se pesan 1.50 g de almidón en el recipiente de muestra y se agregan 25 ml de amortiguador de fosfato/citrato (pH 6.50) gue contiene NaCl 1%. El análisis de unión de curva se puede realizar utilizando el siguiente perfil de temperatura: temperatura libre 50°C, retención a 50°C durante 0.5. minutos, calentamiento lineal a 95°C durante 2.5 minutos, enfriamiento lineal a 50 °C durante 4 minutos, retención a 50 °C durante 4 minutos . Los resultados del análisis de unión del analizador Rapid Visco pueden demostrar gue el alimidón producido por líneas transformadas con el gen guimérico difieren en sus propiedades de unión del almidón de dientes normales . Este resultado puede demostrar gue la estructura fina del almidón producida al alterar la expresión de una pululanasa de maíz puede crear un almidón de funcionalidad novedosa.

EJEMPLO 4 EXPRESIÓN DE GENES QUIMÉRICOS EN CÉLULAS MICROBIANAS Se puede insertar el ADNc para pululanasa de maíz dentro del vector de expresión de E. coli T7 pET24d (Novagen) . El ADN plasmídico que contiene el ADNc para pululanasa de maíz se puede digerir apropiadamente para liberar un fragmento de ácido nucleico que codifica para la pululanasa de maíz. Este fragmento después se puede purificar en un gel de agarosa con punto de fusión bajo 1% NuSieveMR GTGHR (FMCHR) . El amortiguador y la agarosa contienen 100 µg/ml de bromuro de etilo para visualización del fragmento de ADN. El fragmento después se puede purificar a partir de gel de agarosa por digestión con GELaseHR (Epicentre Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se precipita con etanol, se seca y se resuspende en 20 µl de agua. Los adaptadores oligonucleotídicos apropiados se pueden ligar al fragmento de pululanasa de maíz utilizando ADNc ligasa T4 (NEB) . El fragmento de pululanasa de maíz que contiene los adaptadores ligados se puede purificar del exceso de adaptador utilizando agarosa de punto de fusión bajo como se describe antes. El vector pET24d se digiere, se • desfosforila con fosfatasa alcalina (NEB) y se desproteiniza con fenol/cloroformo como se describe antes . El vector preparado pET24d y el fragmento de pululanasa de maíz después se pueden ligar a 16 °C durante 15 horas seguido por transformación en células electrocompetentes DH5 (GIBCO BRL) . Los transformantes se pueden seleccionar en_placas de agar que contienen medio 2xYT y 50 µg/ml de canamicina. Los transforman es que contienen el gen para pululanasa de maíz después se analizan para determinar su orientación correcta con respecto al promotor pET24d T7 por análisis por enzimas de restricción. Las clonas en la orientación correcta, con respecto al promotor T7 se pueden transformar en células competentes BL21(DE3) (Novagen) y se pueden seleccionar en placas de agar 2xYT que contiene 50 µg/ml de canamicina. Una colonia que surge de esta construcción de tranformación se puede hacer crecer durante la noche a 30 °C en medio 2xYT con 50 µg/ml de canamicina. El cultivo después se diluye de manera doble con medio fresco, se permite que vuelva a crecer durante 1 h y se induce al agregar isopropil-tiogalactopiranósido hasta una concentración final 1 mM. Posteriormente las células se cosechan por centrifugación después de 3 h y se resuspenden en 50 µl de Tris-HCl 50 mM a pH 8.0 que contiene DTT 0.1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0.2 mM. Se puede agregar una cantidad pequeña de esferas de vidrio de 1 mm y la mezcla se sónica 3 veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez con un sonicador de microsonda. La mezcla se centrifuga y se determina la concentración de proteína del' sobrenadante . Se puede separar 1 µg de proteína de la fracción soluble del cultivo por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida . Se pueden observar los geles para determinar las bandas de proteína que emigren en el peso molecular esperado.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE : (A) NOMBRE: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY (BJ CALLE: 1007 MARKET STREET (C) CIUDAD: WILMINGTON (D) ESTADO: DELAWARE (E) PAÍS: E.U.A. (F) Z.P. : 19898 (G) TELÉFONO: 302-992-4926 (H) TELEFAX: 302-773-0164 (I) TÉLEX: 6717325 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PULULANASA DE MAÍZ (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: DISKETTE, 3.50 PULGADAS (B) COMPUTADORA: IBM PC COMPATIBLE (C) SISTEMA OPERANTE: MICROSOFT WINDOW 95 (D) SOFTWARE O PROGRAMA: MICROSOFT WORD PARA WINDOW 95 (7.0) (v) DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 60/045,723 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 DE MAYO DE 1997 (vii) ABOGADO/INFORMACIÓN PARA EL AGENTE: (A) NOMBRE: MAJARÍAN, WILLIAM R. (B) NUMERO DE REGISTRO: 41,173 (C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: BB-1108 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 624 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO: 1 CTCAGAAGGG ACTCTAATGG TCAGACTGAG AACAGCGCGG CTGTGAACAA TACAGCAAGT 60 GAGCATTTCA TGGTTGATAG ATTAATCGTG GATGACCTTC TGAATTGGGC AGTAAATTAC 120 AAAGTTGACG GGTTCAGATT TGATCTAATG GGACATATCA TGAAAAAGAC AATGATTAGA 180 GCAAAATCGG CTCTTCAAAG CCTTACAATT GATGAACATG GAGTAGATGG TTCAAAGATA 240 TACTTGTATG GTGAAGGATG GAACTTCGGT GAAGTTGCGG AAAATCAACG TGGGATAAAT 300 GGATCCCAGC TAAAAATGAG TGGCACTGGG ATTGGTAGTT TCAACGATAG AATCCGTGAT 360 GCTATAAATG GTGGCAGTCC GTTTGGGAAT CCACTGCAAC AAGGTTTCTC TACTGGATTG 420 TTCTTAGAGC CAAATGGATT TTATCAGGGC AATGAAACAG AGACAAGGCT CACGCTTGCT 480 ACATACGCTG ACCATATACA GATTGGATTA GCTGGCAATT TGAAGGACTA TGTAGTTATA 540 TCTCATACTG GAGAAGCTAG AAAANGATCT GAAATTTCGC ACCTTCGATG GCTCACCAGT 600 TNGGCTATGC TTCATCCCCT ATAN 624 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 208 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2: Leu Arg Arg Asp Ser Asn Gly Gln Thr Glu Asn Ser Ala Ala Val Asn Asn Thr Ala Ser Glu His Phe Met Val Asp Arg Leu lie Val Asp Asp 20 25 30 Leu Leu Asn Trp Ala Val Asn Tyr Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp 35 40 45 Leu Met Gly His lie Met Lys Lys Thr Met lie Arg Ala Lys Ser Ala 50 55 60 Leu Gln Ser Leu Thr lie Asp Glu His Gly Val Asp Gly Ser Lys lie 65 70 75 80 Tyr Leu Tyr Gly Glu Gly Trp Asn Phe Gly Glu Val Ala Glu Asn Gln 85 90 95 Arg Gly lie Asn Gly Ser Gln Leu Lys Met Ser Gly Thr Gly lie Gly 100 105 110 Ser Phe Asn Asp Arg lie Arg Asp Ala lie Asn Gly Gly Ser Pro Phe 115 120 125 Gly Asn Pro Leu Gln Gln Gly Phe Ser Thr Gly Leu Phe Leu Glu Pro 130 135 140 Asn Gly Phe Tyr Gln Gly Asn Glu Thr Glu Thr Arg Leu Thr Leu Ala 145 150 155 160 Thr Tyr Ala Asp His lie Gln lie Gly Leu Ala Gly Asn Leu Lys Asp 165 170 175 Tyr Val Val lie Ser His Thr Gly Glu Ala Arg Lys Xaa Ser Glu lie 180 185 190 Ser His Leu Arg Trp Leu Thr Ser Xaa Ala Met Leu His Pro Leu Xaa 195 200 205 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 484 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 3 CCTTAGACAA ATTTATTGAT ATCCTCAAGA TCAGATACTC ATCACCTCTC TTTCGCCTAA 60 CTACAGCAAG TGATATTGTG CAAAGGGTTC ACTTTCACAA CACAGGGCCC TCCTTGGTTC 120 CAGGAGTTAT TGTCATGAGC ATCGAAGATN ANCGAAATGA TAGGCATGAT ATGGCCCAGA 180 TAGATGAAAC ATTCTCTTGT GTCGTTACAG TCTTCAATGT ATGTCCGTAC GAAGTGTCTA 2 4 0 TAGAAATCCC TGATCTTGCA TCACTGCGGC TTCAGTTGCA TCCAGTGCAG GTGAATTCAT 300 CGGATGCGTT AGCCAGGCAG TCTGCGTACG ACACCGCCAC AGGTCGÁTTC ACCGTGCCGA 360 AAAGGACAGC AGCAGTGTTC GTGGAACCCA GGTGCTGATG GATGCCTTTC GCTAGCGAGC 420 AAGTGCATTC GGCATCCAAG TCGAAGCAAA CGAATGANAT AAGAGAAGGC CATCGAATAA 480 AACG 484 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 131 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 4 Leu Asp Lys Phe lie Asp lie Leu Lys lie Arg Tyr Ser Ser Pro Leu 1 - 5 10 15 Phe Arg Leu Thr Thr Ala Ser Asp lie Val Gln Arg Val His Phe His 20 25 30 Asn Thr Gly Pro Ser Leu Val Pro Gly Val lie Val Met Ser lie Glu 35 40 45 Asp Xaa Arg Asn Asp Arg His Asp Met Ala Gln lie Asp Glu Thr Phe 50 55 * 60 Ser Cys Val Val Thr Val Phe Asn Val Cys Pro Tyr Glu Val Ser lie 65 70 75 80 Glu lie Pro Asp Leu Ala Ser Leu Arg Leu Gln Leu His Pro Val Gln 85 90 95 Val Asn Ser Ser Asp Ala Leu Ala Arg Gln Ser Ala Tyr Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Gly Arg Phe Thr Val Pro Lys Arg Thr Ala Ala Val Phe Val Glu 115 120 125 Pro Arg Cys 130 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 986 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 5: Met Gln Met Leu Leu His Ala Asn Ser Leu Leu Leu Leu Ala Pro Thr l 5 10 ' 15 Thr Ser Arg Leu Ser Ala Ser Ala Ser Pro Gly Arg Ser Gly Thr Ala 20 25 30 Arg Pro Leu Pro Pro Pro Gln Gly Thr Arg lie Pro Pro Ala Pro Pro 35 40 45 Leu Ala Gly His Gly Gly Arg Pro Pro Ser Pro Gln Pro Arg Arg Gly 50 55 60 Arg Asp Gly Val Gly Glu Glu Cys Ala Ala Ala Val Ala Ser Gln Gly 65 70 75 80 Phe Val Thr Asp Ala Arg Ala Tyr Trp Val Thr Arg Ser Leu lie Ala 85 90 95 Trp Asn Val Asn Asp Gln Asp Thr Ser Leu Phe Leu Tyr Ala Ser Arg 100 105 ' 110 Asp Ala Thr Met His Val Ser Asp Gly Ala lie His Gly Tyr Asp Ser 115 120 125 Lys lie Glu Leu Glu Pro Glu His Ala Ser Leu Pro Asp Asn Val Ala 130 135 140 Glu Lys Phe Pro Phe lie Arg Ser Tyr Arg Thr Phe Arg Val Pro Ser 145 150 155 160 Ser Val Asp Val Ala Ser Leu Val Lys Cys Gln Leu Ala Val Ala Ser 165 170 175 Tyr Asp Ala His Gly Arg His Gln Asp Val Thr Gly Leu Gln Leu Pro 180 185 190 Gly Val Leu Asp Asp Met Phe Ala Tyr Thr Gly Pro Leu Gly Ala Val 195 200 205 Phe Ser Asp Lys Asp Val Asp Leu Tyr Leu Trp Ala Pro Thr Ala Gln 210 215 220 Asp Val Arg Val Cys Phe Tyr Asp Gly Pro Ala Gly Pro Leu Leu Gln 225 230 235 " 240 Thr Val Gln Leu Lys Glu Leu Asn Gly Val Trp Ser Val Thr Val Pro 245 250 255 Arg Tyr Pro Glu Asn Gln Tyr Tyr Leu Tyr Glu Val Lys Val Tyr His 260 265 270 Pro Ser Thr Ser Gln Val Glu Lys Cys Leu Ala Asp Asp Pro Tyr Ala 275 280 285 Arg Gly Leu Ser Ala Asn Gly Thr Arg Thr Trp Leu Val Asp lie Asn 290 295 300 Ser Glu Thr Leu Lys Pro Ala Ser Trp Asp Glu Leu Ser Asp Glu Glu 305 310 315 320 Pro Asn Leu Glu Ser Phe Ser Asp lie Ser lie Tyr Glu Leu His lie 325 330 335 Arg Asp Phe Ser Ala His Asp Ser Thr Val Asp Cys Asn Ser Arg Gly 340 345 350 Gly Phe Val His Leu His Phe Arg Leu Phe Arg Leu Asn Leu Leu Asn 355 360 365 Asp Phe Cys Ser Pro Pro lie Thr Lys His Pro Gly Arg lie Met Glu 370 375 380 Thr Val Met Gln Asp Ser Ala Gly lie Arg His Leu Arg Lys Leu Ser 385 390 395 400 Ala Ala Gly Leu Thr His Val His Leu Leu Pro Ser Phe His Phe Ala 405 410 415 Ser Val Asp Asp Asn Lys Ser Asn Trp Lys Phe Val Asp Glu Ala Gln 420 425 430 Leu Ala Lys Leu Pro Pro Gly Ser Asp Glu Gln Gln Ala Ala lie Val 435 440 445 Ser lie Gln Gln Glu Asp Pro Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Val Leu 450 455 460 Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Ser Asn Pro Asp Gly Pro Ser 465 470 475 480 Arg lie lie Glu Tyr Arg Gln Met Val Gln Ala Leu Asn Arg lie Gly 485 490 495 Leu Arg Val Val Met Asp Val Val Tyr Asn His Leu Asp Ser Ser Gly 500 505 510 Pro Phe Gly Val Ser Ser Val Leu Asp Lys lie Val Pro Gly Tyr Tyr 515 520 525 Leu Arg Arg Asn Val Asn Gly Gln lie Glu Asn Ser Ala Ala Met Asn 530 535 540 Asn Thr Ala Ser Glu His Phe Met Val Asp Arg Leu Thr Val Asp Asp 545 550 555 560 Leu Leu Asn Trp Ala lie Asn Tyr Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp 565 570 575 Leu Met Gly His lie Met Lys Ser Thr Met lie Arg Ala Lys Ser Ala 580 585 590 lie Arg Ser Leu Thr Arg Asp Val His Gly Val Tyr Gly Ser Lys lie 595 600 605 Tyr Leu Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Phe Gly Glu Val Ala Gln Asn Lys 610 615 620 Arg Gly lie Asn Ala Ser Gln lie Asn Met Ser Gly Thr Gly lie Gly 625 630 635 640 Ser Phe Asn Asp Arg lie Arg Asp Ser Val Asn Gly Gly Asn Pro Phe 645 650 655 Gly Asn Pro Leu Gly Gln Gly Phe Ser Thr Gly Leu Phe Leu Glu Pro 660 665 670 Asn Gly Tyr Tyr Gln Gly Asn Glu Ala Asp Thr Arg Arg Glu Leu Ala 675 680 685 Thr Tyr Ala Asp His lie Gln lie Gly Leu Ala Gly Asn Leu Lys Asp 690 695 700 Tyr Val Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Ala Lys Lys Gly Ser Asp lie 705 710 715 720 Tyr Thr Phe Asp Gly Ser Pro Val Gly Tyr Thr Ser Ser Pro Val Glu 725 730 735 Thr lie Asn Tyr Val Ser Ala His Asp Asn Glu 'Thr Leu Phe Asp lie 740 745 750 Val Ser lie Lys Thr Pro lie Gly Leu Ser lie Asp Gly Glu Cys Arg 755 760 765 lie Asn His Leu Ala Ser Ser Met lie Ala Leu Ser Gln Gly lie Pro 770 775 780 Phe Phe His Ala Gly Asp Glu lie Leu Arg Ser Lys Ser Leu Asp Arg 785 790 795 800 Asp Ser Tyr Asn Ser Gly Asp Trp Phe Lys Lys Leu Asp Leu His Met 805 810 815 Asn Gln Pro lie Gly Cys Arg Leu Leu Gln Glu lie Arg Met Lys Asn 820 825 830 Met His Leu lie Lys Pro Arg Leu Glu Asn Pro Ser Phe Arg Pro Leu 835 840 845 Lys Asn His lie Let Ser Cys Phe Asp Asn Phe Val Asp lie Leu Lys 850 855 860 lie Arg Tyr Ser Ser Pro Leu Phe Arg Leu Ser 'Thr Ala Ser Asp lie 865 870 875 880 Glu Gln Arg Val Arg Phe His Asn Thr Gly Pro Ser Met Val Pro Gly 885 890 895 Val lie Val Met Ser lie Lys Asp Ala Gln Asn Glu Lys Cys Lys Met 900 905 910 Ala Gln Leu Asp Lys Asn Phe Ser Tyr Val Val Thr lie Phe Asn Val 915 920 925 Cys Pro His Glu Val Ser lie Glu lie His Asp Leu Ala Ser Leu Gly 930 935 940 Leu Glu Leu His Pro lie Gln Val Asn Ser Ser Asp Ala Leu Val Arg 960 945 950 955 Gln Ser Ala Tyr Glu Ala Ser Lys Gly Arg Phe Thr Val Pro Arg Arg 965 970 975 Thr Thr Ala Val Phe Val Gln Pro Arg Cys 980 985 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 964 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 6: Met Ser Ser Leu Tyr Asn Pro lie Ala Leu Ala Ser Ser Phe His His 1 5 10 15 His Tyr Pro Asn Leu Arg Phe Leu Pro Phe Asn Phe Asn Phe lie Thr 20 25 30 Lys Leu Pro Val Ser Asn Ser Phe Ala lie Gly Ser Ser Ser Arg Ser 35 40 45 Phe His Ser Ser Pro Leu Lys Lys Asp Ser Ser Cys Phe Cys Cys Ser 50 55 60 Met Ala Val Glu Val Gly Ser Ala Ser Ser Val Ser Gln Ser Glu Leu 65 70 75 ' 80 Gln Gly Ser Leu Asn Ser Cys Arg Ala Tyr Trp Pro Ser Lys Tyr Thr 85 90 95 Phe Ala Trp Asn Val Asp lie Gly Asn Gly Ser Tyr Tyr Leu Phe Ala 100 105 110 Ser Lys Thr Ala Ala Leu Lys Phe Thr Asp Ala Gly lie Glu Gly Tyr 115 120 125 Asp Val Lys lie Lys Leu Asp Lys Asp Gln Gly Gly Leu Pro Ala Asn 130 135 140 Val Thr Glu Lys Phe Pro His lie Arg Gly Tyr Ser Ala Phe Lys Ala 145 150 155 160 Pro Ala Thr Leu Asp Val Asp Ser Leu Leu Lys Cys Gln Leu Ala Val 165 170 175 Ala Ala Phe Ser Ala Asp Gly Ala Cys Arg Asn Ala Thr Gly Leu Gln 180 185 190 Leu Pro Gly Val lie Asp Glu Leu Tyr Ser Tyr Asp Gly Pro Leu Gly 195 200 205 Ala Val Phe Ser Glu Asn Thr lie Ser Leu Tyr Leu Trp Ala Pro Thr 210 215 220 Ala Gln Ala Val Ser Ala Ser lie Phe Lys Asp Pro Ser Gly Gly Glu 225 230 235 240 Pro Leu Gln Thr Val Gln Leu lie Glu Ser Asn Gly Val Trp Ser Ala 245 250 255 Val Gly Pro Arg Thr Trp Glu Gly Cys Tyr Tyr Val Tyr Glu lie Thr 260 265 270 Val Tyr His His Ser Thr Leu Arg lie Glu Lys Ser Phe Ala lie Asp 275 280 285 Pro Tyr Ala Arg Gly lie Ser Ala Asp Val Lys Arg Thr Leu Leu Ala 290 295 300 Asp Leu Ser Ser Glu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Trp Glu Asn Leu Ala 305 310 315 320 Asp Glu Lys Pro His Leu Leu Ser Pro Ser Asp lie Ser Leu Tyr Glu 325 330 335 Leu His lie Arg Asp Phe Ser Ala Tyr Asp Leu Thr Val His Pro Asp 340 345 350 Leu Arg Gly Gly Tyr Leu Ala Phe Thr Ser Gln Asp Ser Ala Gly Val 355 360 365 Asn His Leu Glu Lys Leu Ser Ala Ala Gly Leu Thr His Val His Leu 370 375 380 Leu Pro Ser Phe Gln Phe Ala Glu Val Asp Asp Asp Lys Lys Lys Trp 385 390 395 400 Lys Phe Val Asp Thr Lys Arg Phe Glu Thr Leu Pro Pro Asp Ser Glu 405 410 415 Glu Gln Gln Ala Gln lie Thr Ala lie Arg Asp Glu Asp Gly Tyr Asn 420 425 430 Trp Gly Tyr Asn Pro Val Leu Trp Gly Thr Pro Lys Gly Ser Tyr Ala 435 440 445 Thr Asp Pro Asn Gly Pro Cys Arg lie lie Glu Phe Arg Lys Met Val 450 455 ' 460 Gln Ala Leu Asn Arg lie Gly Leu Arg Val Val Leu Asp Val Val Tyr 465 470 475 480 Asn His Leu Asn Ser Ser Gly Pro Ser Asp Asp Asn Ser Val Leu Asp 485 490 495 Lys lie Val Pro Gly Tyr Tyr Leu Arg Arg Asp Asn Asp Gly Ala lie 500 505 510 Glu Asn Ser Thr Cys Val Asn Asp Thr Ala Ser Glu His Phe Met Val 515 520 525 Glu Arg Leu lie Leu Asp Asp Leu Lys His Trp Ala Val Asn Tyr Lys 530 535 540 Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly His lie Met Lys His Thr 545 550 555 560 Met Val Lys Ala Thr Asn Met Leu Gln Gly Leu Ser Lys Asn lie Asp 565 570 575 Gly Val Glu Gly Ser Ser lie Tyr Leu Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Phe 580 585 * 590 Gly Glu Val Ala Asn Asn Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Gln Leu Asn 595 600 605 Leu Gly Gly Thr Gly lie Gly Ser Phe Asn Asp Arg lie Arg Asp Ala 610 615 620 Val Leu Gly Gly Gly Pro Phe Gly Pro Pro Leu Gln Gln Gly Tyr Val 625 630 630 640 Thr Gly Leu Ser Leu Gln Pro Asn Asp His Asp His Ser Gly Lys Ala 645 650 655 Asn Ala Asp Arg Met Leu Ala Val Ala Lys Asp His lie Gln Val Gly 660 665 670 Met Ala Gly Asn Leu Arg Asp Tyr lie Leu Thr Asn Cys Asp Gly Lys 675 680 685 Gln Val Lys Gly Ser Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Gly Thr Pro Val Gly 690 695 700 Tyr Ala Met Gln Pro lie Glu Thr lie Asn Tyr Val Ser Ala His Asp 705 710 715 720 Asn Glu Thr Leu Phe Asp lie Val Ser Leu Lys Thr Pro Thr Tyr lie 725 730 735 Thr Val Asp Glu Arg Cys Arg Val Asn His Leu Ala Thr Ser lie Leu 740 745 750 Ala Leu Ser Gln Gly lie Pro Phe Phe His Ala Gly Asp Glu Leu Leu 755 760 765 Arg Ser Lys Ser Leu Asp Arg Asp Ser Tyr Asn Ser Gly Asp Trp Phe 770 775 780 Asn Arg Leu Asp Phe Ser Tyr Asn Ser Asn Asn Trp Gly Val Gly Leu 785 790 795 800 Pro Pro Lys Asp His Asn Glu Ser Asn Trp Pro Leu lie Lys Lys Arg 815 805 810 Leu Ala Asn Pro Ser Tyr Lys Pro Asp Lys Asn His lie lie Ala Ala 820 825 830 Val Glu Asn Phe Thr Asn Leu Leu Gln lie Arg Tyr Ser Ser Pro Leu 835 840 845 Phe Arg Leu Arg Ser Ala Lys Asp lie Glu Asp Arg Val Aro Phe His 850 855 860 Asn Asn Val Pro Ser Trp lie Pro Gly Leu lie Ala Met Ser lie Glu 865 870 875 880 Asp Gly His Ala Gly Ala Pro Gly Leu Ser Gln lie Asp Pro Lys Phe 885 890 895 Gln Tyr lie Val Val He He Asn Val Gln Pro Thr Glu Thr Lys Phe 900 905 910 Val Asn Pro Asp Leu Arg Ala Lys Ser Leu Gln Leu His Pro Val Gln 915 920 925 Ser Thr Ser Gly Asp Thr Val Val Lys Glu Ser Lys Tyr Glu Pro Ser 930 935 940 Thr Gly Cys Phe Thr He Pro Pro Lys Ser Thr Ala Val Phe Val Glu 945 950 955 960 Pro Arg His Val (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2904 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 7 GTTGGATGCG AGGGCTTACT GGGTGACAAA ATCCTTGATT GCATGGAATA TCAGTGATCA 60 GAAAACTTCT CTCTTCTTAT ATGCAAGCAG AAATGCTACA ATGTGCATGT CGAGTCAGGA 120 TATGAAAGGT TATGATTCCA AAGTTGAGCT GCAACCAGAA AATGATGGAC TTCCATCCAG 180 TGTGACCCAG AAATTCCCTT TTATCAGCTC TTATAGAGCC TTCAGAATTC CGAGCTCCGT 240 TGATGTTGCC ACCTTGGTGA AATGTCAACT TGCTGTTGCT TCATTTGATG CTCATGGGAA 300 CAGGCAAGAT GTTACTGGGT TGCAACTACC TGGAGTATTG GATGACATGT TCGCCTACAC 360 TGGACCGCTT GGTACTATTT CTAGTGAAGA AGCTGTGAGT ATGTACCTAT GGGCTCCTAC 420 AGCACAGGAT GTAAGTGTGA GCTTCTATGA TGGTCCAGCT GGCCCTTTAC TGGAAACAGT 480 TCAACTCAAC GAGTTAAATG GTGTTTGGAG TGTTACTGGT-CCAAGGAACT GGGAGAACCG 540 GTATTATCTA TATGAAGTCA CAGTATATCA TCAAACTACA GGAAACATTG AGAAATGTTT 600 AGCCGCTGAT CCTTATGCTA GAGGGCTTTC TGAAAATAGC ACACGAACTT GGTTGGTTGA 660 TATTAATAAT GAAAZATTAA AGCCACTTGC CTGGGATGGA TTGGCGGCTG AAAAGCCAAG 720 GCTTGATTCC TTCTCTCACA TAAGCATATA TGAATTGCAC ATTCGTGATT TCAGTGCCCA 780 TGATAGCACA GTGGACTCTC CTTTCCGAGG AGGTTTCTGT GCATTTACAT TTCAGGATTC 840 TGTAGGCATA GAACACCTAA AGAAACTATC TGATGCCGGT TTGACTCATG TCCATTTGTT 900 GCCAAGCTTT CAATTTGGTG GTGTTGATGA CATAAAGAGC AATTGGAAAT GTGTTGATGA 960 GATTGAACTG TCAAAACTCC CTCCAGGGTC AGATTTGCAA CAAGCTGCAA TTGTGGCTAT 1020 TCAGGAAGAG GACCCTTATA ATTGGGGGTA TAACCCTGTG GTTTGGGGCG TTCCAAAAGG 1080 AAGCTATGCA AGTAACCCAG ATGGTCCAAG TCGTATCATT GAGTACCGGC TGATGGTGCA 1140 GGCCTTGAAT CGCTTAGGTC TTCGAGTTGT CATGGATGTT GTATACAATC ATCTATACTC 1200 AAGTGGCCCT TTTGCCATCA CTTCCGTGCT TGACAAGATT GTACCTGGAT ACTACCTCAG 1260 AAGGGACTCT AATGGTCAGA CTGAGAACAG CGCGGCTGTG AACAATACAG CAAGTGAGCA 1320 TTTCATGGTT GATAGATTAA TCGTGGATGA CCTTCTGAAT TGGGCAGTAA ATTACAAAGT 1380 TGACGGGTTC AGATTTGATC TAATGGGACA TATCATGAAA AAGACAATGA TTAGAGCAAA 1440 ATCGGCTCTT CAAAGCCTTA CAATTGATGA ACATGGAGTA GATGGTTCAA AGATATACTT 1500 GTATGGTGAA GGATGGAACT TCGGTGAAGT TGCGGAAAAT CAACGTGGGA TAAATGGATC 1560 CCAGCTAAAA ATGAGTGGCA CTGGGATTGG TAGTTTCAAC GATAGAATCC GTGATGCTAT 1620 AAATGGTGGC AGTCCGTTTG GGAATCCACT GCAACAAGGT TTCTCTACTG GATTGTTCTT 1680 AGAGCCAAAT GGATTTTATC AGGGCAATGA AACAGAGACA AGGCTCACGC TTGCTACATA 1740 CGCTGACCAT ATACAGATTG GATTAGCTGG CAATTTGAAG GACTATGTAG TTATATCTCA 1800 TACTGGAGAA GCTAGAAAAG GATCTGAAAT TCGCACCTTC GATGGCTCAC CAGTTGGCTA 1860 TGCTTCATCC CCTATAGAAA CAATAAACTA CGCCTCTGCT CATGACAATG AAACACTATT 1920 TGATATTATT AGTCTAAAGA CTCCGATGGA CCTCTCAATT GACGAGCGAT GCAGGATAAA 1980 TCATTTGTCC ACAAGCATGA TTGCATTATC CCAGGGAATA CCATTTTTTC ATGCTGGTGA 2040 TGAGATACTA CGATCTAAGT CGCTTGATCG AGATTCATAT GACTCTGGTG ATTGGTTTAA 2100 CAAGATTGAT TTTACCTATG AAACAAACAA TTGGGGTGTT GGGCTTCCAC CAAGAGAAAA 2160 GAACGAAGGG AGCTGGCCTT TGATGAAGCC AAGATTGGAG AACCCGTCGT TCAAACCTGC 2220 AAAACATGAC ATTATTGCTG CCTTAGACAA ATTTATTGAT ATCCTCAAGA TCAGATACTC 2280 - / J - ATCACCTCTC TTTCGCCTAA CTACAGCAAG TGATATTGTG CAAAGGGTTC ACTTTCACAA 2340 CACAGGGCCC TCCTTGGTTC CAGGAGTTAT TGTCATGAGC ATCGAAGATG CACGAAATGA 2400 TAGGCATGAT ATGGCCCAGA TAGATGAAAC ATTCTCTTGT GTCGTTACAG TCTTCAATGT 2460 ATGTCCGTAC GAAGTGTCTA TAGAAATCCC TGATCTTGCA TCACTGCGGC TTCAGTTGCA 2520 TCCAGTGCAG GTGAATTCAT CGGATGCGTT AGCCAGGCAG TCTGCGTACG ACACCGCCAC 2580 AGGTCGATTC ACCGTGCCGA AAAGGACAGC AGCAGTGTTC GTGGAACCCA GGTGCTGATG 2640 GATGCCTTTC GCTAGCGAGC AAGTGCATTC GGCATCCAAG TCGAAGCAAA CGAATGAAAT 2700 AAGAGAAGGC CATCGAATAA AACGAAGTAT ATAAATAGAT TGAATAAGAC GTTGCCCAAG 2760 TTGCCAAGGC ACGCTTTGCC ATATGTATGC GTTGAAAAAT AAATAAATAA ATAAATAAAT 2820 GATGTTATAG AGGTACAAAA GCATTGGAAC ATTTCTTTAT AGAGGTGAAC CACCCTATTT 2880 TCCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 2904 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 8 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 878 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: no relevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 8 Leu Asp Ala Arg Ala Tyr Trp Val Thr Lys Ser Leu He Ala Trp Asn 1 5 10 15 He Ser Asp Gln Lys Thr Ser Leu Phe Leu Tyr Ala Ser Arg Asn Ala 20 25 30 Thr Met Cys Met Ser Ser Gln Asp Met Lys Gly Tyr Asp Ser Lys Val 35 40 45 Glu Leu Gln Pro Glu Asn Asp Gly Leu Pro Ser Ser Val Thr Gln Lys 50 55 60 Phe Pro Phe lie Ser Ser Tyr Arg Ala Phe Arg lie Pro Ser Ser Val 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Leu Val Lys Cys Gln Leu Ala Val Ala Ser Phe Asp 85 90 95 Ala His Gly Asn Arg Gln Aso Val Thr Gly Leu Gln Leu Pro Gly Val 100 105 110 Leu Asp Asp Met Phe Ala Tyr Thr Gly Pro Leu Gly Thr He Ser Ser 115 120 125 Glu Glu Ala Val Ser Met Tyr Leu Trp Ala Pro Thr Ala Gln Asp Val 130 135 140 Ser Val Ser Phe Tyr Asp Gly Pro Ala Gly Pro Leu Leu Glu Thr Val 145 150 155 160 Gln Leu Asn Glu Leu Asn Gly Val Trp Ser Val Thr Gly Pro Arg Asn 165 170 175 Trp Glu Asn Arg Tyr Tyr Leu Tyr Glu Val Thr Val Tyr His Gln Thr 180 185 190 Thr Gly Asn He Glu Lys Cys Leu Ala Ala Asp Pro Tyr Ala Arg Gly 195 200 205 Leu Ser Ala Asn Ser Thr Arg Thr Trp Leu Val Asp He Asn Asn Glu 210 215 220 Thr Leu Lys Pro Leu Ala Trp Asp Glv Leu Ala Ala Glu Lys Pro Arg 225 230 235 240 Leu Asp Ser Phe Ser Asp He Ser He Tyr Glu Leu His He Arg Asp 245 250 255 Phe Ser Ala His Asp Ser Thr Val Asp Cys Pro Phe Arg Gly Gly Phe 260 265 270 Cys Ala Phe Thr Phe Gln Asp Ser Val Gly He Glu His Leu Lys Lys 275 280 285 Leu Ser Asp Ala Gly Leu Thr His Val His Leu Leu Pro Ser Phe Gln 290 295 ' 300 Phe Gly Gly Val Asp Asp He Lys Ser Asn Trp Lys Cys Val Asp Glu 305 310 315 320 He Glu Leu Ser Lys Leu Pro Pro Gly Ser Asp Leu Gln Gln Ala Ala 325 330 335 He Val Ala He Gln Glu Glu Asp Pro Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro 340 345 350 Val Val Trp Gly Val Pro Lys Gly Ser Tyr Ala Ser Asn Pro Asp Gly 355 360 365 Pro Ser Arg He He Glu Tyr Arg Leu Met Val Gln Ala Leu Asn Arg 370 385 380 Leu Gly Leu Arg Val Val Met Asp Val Val Tyr Asn His Leu Tyr Ser 385 390 395 400 Ser Gly Pro Phe Ala He Thr Ser Val Leu Asp Lys He Val Pro Gly 405 410 415 Tyr Tyr Leu Arg Arg Asp Ser Asn Gly Gln Thr Glu Asn Ser Ala Ala 420 425 430 Val Asn Asn Thr Ala Ser Glu His Phe Met Val Asp Arg Leu He Val 435 440 445 Asp Asp Leu Leu Asn Trp Ala Val Asn Tyr Lys Val Asp Gly Phe Arg 450 455 460 Phe Asp Leu Met Gly His He Met Lys Lys Thr Met He Arg Ala Lys 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gln Ser Leu Thr He Asp Glu His Gly Val Asp Gly Ser 485 490 495 Lys He Tyr Leu Tyr Gly Glu Gly Trp Asn Phe Gly Glu Val Ala Glu 500 505 510 sn Gln Arg Gly He Asn Gly Ser Gln Leu Lys Met Ser Gly Thr Gly 515 520 525 He Gly Ser Phe Asn Asp Arg He Arg Asp Ala He Asn Gly Gly Ser 530 535 540 Pro Phe Gly Asn Pro Leu Gln Gln Gly Phe Ser Thr Gly Leu Phe Leu 545 550 555' 560 Glu Pro Asn Gly Phe Tyr Gln Gly Asn Glu Thr Glu Thr Arg Leu Thr 565 570 575 Leu Ala Thr Tyr Ala Asp His He Gln He Gly Leu Ala Gly Asn Leu 580 585 590 Lys Asp Tyr Val Val He Ser His Thr Gly Glu Ala Arg Lys Gly Ser 595 600 605 Glu He Arg Thr Phe Asp Gly Ser Pro Val Gly Tyr Ala Ser Ser Pro 610 615 620 He Glu Thr He Asn Tyr Ala Ser Ala His Asp Asn Glu Thr Leu Phe 625 630 635 640 sp He He Ser Leu Lys Thr Pro Met Asp Leu Ser He Asp Glu Arg 645 650 655 Cys Arg He Asn His Leu Ser Thr Ser Met He Ala Leu Ser Gln Gly 660 665 670 He Pro Phe Phe His Ala Gly Asp Glu He Leu Arg Ser Lys Ser Leu 675 680 685 Asp Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Gly Asp Trp Phe Asn Lys He Asp Phe 690 695 700 Thr Tyr Glu Thr Asn Asn Trp Gly Val Gly Leu Pro Pro Arg Glu Lys 705 710 715 720 Asn Glu Gly Ser Trp Pro Leu Met Lys Pro Arg Leu Glu Asn Pro Ser 725 730 735 Phe Lys Pro Ala Lys His Asp He He Ala Ala Leu Asp Lys Phe He 740 745 750 Asp He Leu Lys He Arg Tyr Ser Ser Pro Leu Phe Arg Leu Thr Thr 755 760 765 Ala Ser Asp He Val Gln Arg Val His Phe His Asn Thr Gly Pro Ser 770 775 780 Leu Val Pro Gly Val He Val Met Ser He Glu Asp Ala Arg Asn Asp 785 790 795 800 Arg His Asp Met Ala Gln He Asp Glu Thr Phe Ser Cys Val Val Thr 805 810 815 Val Phe Asn Val Cys Pro Tyr Glu Val Ser He Glu He Pro Asp Leu 820 825 830 Ala Ser Leu Arg Leu Gln Leu His Pro Val Gln Val Asn Ser Ser Asp 835 840 845 Ala Leu Ala Arg Gln Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Thr Gly Arg Phe Thr 850 855 860 Val Pro Lys Arg Thr Ala Ala Val Phe Val Glu Pro Arg Cys 865 870 875 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un fragmento aislado de ácido nucleico caracterizado porque comprende un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un fragmento aislado de ácido nucleico que codifica para la totalidad o una porción sustancial de la secuencia de aminoácidos que se establece en un miembro que se selecciona del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NO: 2, 4 y 8; (b) un fragmento aislado de ácido nucleico que es sustancialmente similar a un fragmento aislado de ácido nucleico que codifica para la totalidad o para una porción sustancial de la secuencia de aminoácidos que se establece en un miembro que se selecciona del grupo que consiste de las SEC. DE IDEN. NO: 2, 4 y 8; y (c) un fragmento aislado de ácido nucleico que es complementario a (a) o (b) . 2. El fragmento aislado de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del fragmento se establece en un miembro que se selecciona del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NO: 1, 3 y 7.
3. 3. Un gen quimérico o recombinante, caracterizado porque comprende el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas .
4. 4. Una célula huésped transformada, caracterizada porque comprende el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 3.
5. 5. Un método para alterar el nivel de expresión de una pululanasa de maíz en una célula huésped, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula huésped con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 3 ; y (b) hacer crecer la célula huésped transformada producida en la etapa (a) bajo condiciones que son adecuadas para la expresión del gen quimérico en donde la expresión del gen quimérico resulta en la producción de niveles alterados de una pululanasa de maíz en la célula huésped transformada. 6. Un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica para la totalidad o sustancialmente la totalidad de las secuencias de aminoácidos que codifican para una pululanasa vegetal, caracterizado porque comprende: (a) sondear un ADNc o una biblioteca genómica con el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1; (b) identificar una clona de ADN que hibridiza con el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1; y (c) secuenciar el ADNc o el fragmento genómico que comprende la clona identificada en la etapa (c) en donde el fragmento de ácido nucleico secuenciado codifica para la totalidad o sustancialmente la totalidad de la secuencia de aminoácidos que codifica para una pululanasa vegetal . 7. Un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica para una porción de una secuencia de aminoácidos que codifica para una pululanasa vegetal, caracterizado porque comprende : (a) sintetizar un cebador oligonucleotídico que corresponde a una porción de la secuencia que se establece en un miembro que se selecciona del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NO: 1, 3 y 7; y (b) amplificar una inserción de ADNc presente en un vector de clonación utilizando el cebador oligonucleotídico de la etapa (a) y un cebador que representa las secuencias del vector de clonación en donde el fragmento de ácido nucleico amplificado codifica para una porción de una secuencia de. aminoácidos que codifica para una pululanasa vegetal . 8. El producto del método de conformidad con la reivindicación
6. 6. 9. El producto del método de conformidad con la reivindicación
7. 7.