KR20180089518A - 형질전환 유전자를 효율적으로 표적화하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

형질전환 유전자를 효율적으로 표적화하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20180089518A
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크리스틴 엠. 엘리스
마이클 이. 골리
클레이톤 티. 라루
쉐리 엘. 레클레어
췬강 치
아이후아 샤오
콴 와이. 타이
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몬산토 테크놀로지 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 형질전환 식물에서 단백질의 효율적인 형질전환 유전자 하위-세포 국재화를 제공하는데 유용한 재조합 DNA 분자 및 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 제초제 내성 또는 식물에 대한 내성을 부여하는 재조합 DNA 분자 및 작제물, 뿐만 아니라 제초제 내성을 나타내는 식물 및 상기 식물의 생산 또는 이용는 방법을 추가로 제공한다.

Description

형질전환 유전자를 효율적으로 표적화하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/270,180호(2015년 12월 21일자로 출원됨), 및 미국 가출원 제62/364,715호(2016년 7월 20일자로 출원됨) (이상의 것은 그 전문이 참고로 편입되어 있음)의 이익을 청구한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 농업, 식물 생명공학, 및 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 제초제 내성 또는 저항을 나타내는 형질전환 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
서열 목록의 도입
컴퓨터 판독가능한 형태의 서열 목록이 전자 제출에 의해서 본 출원과 함께 제출되고, 그의 전체가 참고로 본 출원에 포함된다. 서열목록은 MONS389WO_ST25.txt로 명명된 파일에 포함되어 있으며, 이는 크기가 122 킬로바이트(운영 체제 MS 윈도우에서 측정됨)이고 2016년 12월 19일자로 생성되었다.
관련 기술의 설명
신규한 형질전환 식물의 생산은 유익한 특성, 예컨대 개선된 제초제 내성을 나타내어 향상된 잡초 방제 전략을 허용하는 상당히 개선된 농작물에 대한 잠재능을 제공한다.
그러나, 수확물에서 유익한 특성을 생산하는데 유용한 단백질이 공지되어 있지만, 형질 전환 식물 세포 내에서 이들 재조합 단백질의 효과적인 하위-세포 국재화(표적화로도 알려짐) 및 가공은 상당한 장애물을 남긴다. 따라서, 식물 세포내에서 재조합 단백질을 효과적으로 국재화할 수 있는 신규한 수송(transit) 펩타이드에 대한 요구가 존재한다.
요약
본 발명의 일 측면은 디캄바 모노옥시게나제 (dicamba monooxygenase, DMO) 또는 프로토포르피리노겐 옥시다제(protoporphyrinogen oxidase, PPO)를 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 엽록체 수송 펩타이드(CTP)를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이며, 여기서 상기 CTP는 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CTP를 인코딩하는 DNA 서열은 서열번호 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 구현예에서, DMO 또는 PPO는 서열번호 18-27 및 40-59로 이루어진 군으로부터 선택된 선택된 폴리펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, DMO 또는 PPO의 DNA 서열은 서열번호 28-37 및 61-102로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, DMO 또는 PPO는 식물 세포내에서 발현된 경우 제초제 내성을 부여할 수 있는 제초제 내성 단백질로서 정의된다. 특정 구현예에서, 제초제 내성 단백질은 DMO 단백질이고, CTP는 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 제초제 내성 단백질은 PPO 단백질이고, CTP는 서열번호 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된식물 세포내에서 이종 프로모터 기능성에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 작제물을 제공한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자로 형질 전환된 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 일부, 또는 종자를 제공한다. 특정 구현예에서, 식물은 외떡잎식물이다. 본 발명으로 사용될 수 있는 외떡잎식물은 비제한적으로, 옥수수 또는 밀 식물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 식물은 쌍떡잎식물이다. 본 발명으로 사용될 수 있는 쌍떡잎식물은 비제한적으로, 대두, 목화, 또는 브라씨카 (Brassica) 식물을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 살아있지 않은 식물 물질 내에 존재하는 본 발명의 재조합 DNA 분자가 제공된다. 일 예에서, 식물 세포는 이들이 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 경우 본 발명의 범위 내에 있다. 일 구현예에서, 이러한 식물 세포는 재생가능 식물 세포일 수 있거나, 식물로 재생될 수 없는 비-재생가능 식물 세포일 수 있다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 이로써 생산된 생성물을 포함하는, 검출가능한 양의 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 상품을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 상품은 비생존가능한 종자(seed) 또는 이의 부분, 탈수된 식물 조직, 냉동된 식물 조직, 가공된 식물 조직, 식사, 가루, 플레이크(flake), 겨, 및 섬유를 포함한다. 상품은 생존가능하거나 비생존가능할 수 있다. 비생존가능한 상품은 비제한적으로 비생존가능한 종자 및 알갱이; 가공된 종자, 종자 부분, 및 식물 부분; 탈수된 식물 조직, 냉동된 식물 조직, 및 가공된 식물 조직을 포함한다. 본 발명의 상품은 본 명세서에서 기재된검출가능한 양의 재조합 DNA 분자를 포함한다. 본 발명의 재조합 DNA 분자를 검출하는 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 a) 식물 세포를 본 발명의 DNA 작제물로 형질 전환하는 단계, 및 b) 식물을 상기 DNA 작제물을 포함하는 형질 전환된 식물 세포로부터 재생하는 단계의 단계들을 포함하는 제초제 내성 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 방법의 일 구현예에서, 재생된 식물은 디캄바(dicamba) 및 PPO 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 제초제에 대해 내성이다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는 제초제 내성 식물을 생산하는 방법을 제공한다: a) 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 모체 식물을 자가 교배하거나 또는 제2 식물과 이종 교배시켜 하나 이상의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 b) 상기 DNA 분자를 포함하는 자손 식물을 선별하는 단계. 상기 방법의 일 구현예에서, 자손 식물은 디캄바 및 PPO 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 제초제에 대해 내성이다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 식물 세포내로 도입시키는 단계를 포함하는, 식물 세포 내에서 PPO 또는 DMO를 발현시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 재조합 DNA 분자의 도입 단계는 식물 세포를 형질 전환시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는, 작물 생장 환경에서 잡초 생장을 방제하는 방법을 제공한다: a) 본 발명의 식물 또는 종자를 작물 생장 환경 속에서 식재하는 단계; 및 b) 작물 생장 환경에 잡초 생장을 방제하는데 효과적인 양의 디캄바 또는 PPO 저해제를 적용시키는 단계. 특정 구현예에서, 제초제 적용은 발아-전 또는 -후에 이루어진다. 일 구현예에서, 제초제의 양은 식물 또는 종자를 손상시키지 않는다. 방법의 특정 구현예에서, 식물 또는 종자는 외떡잎식물 또는 종자, 예컨대, 옥수수 또는 밀 식물 또는 종자이다. 다른 구현예에서, 식물 또는 종자는 쌍떡잎식물 또는 종자, 예컨대 대두, 목화, 또는 브라씨카 식물이다. 추가 구현예에서, 제초제는 디캄바 또는 PPO 저해제이다.
도 1은 V2, 그 후 V4, 그 후 V8에 0.036 lbs ai/acre S-3100의 제초제를 적용 처리한 후의, APG6 (서열번호 1) 또는 12G088600TP (서열번호 38)에 작동가능하게 연결된 H_N10 (서열번호 43)을 발현하는 형질 전환 F1 옥수수 식물을 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 아라비돕시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana ) 알비노 및 연녹색 (APG6) CTP의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 서열번호 1의 APG6 CTP의 아미노-말단 최적화된 변이체의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 아라비돕시스 탈리아나 90 kDa 열충격 단백질 (CR88) CTP의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 Ph.ShkG-CTP4 CTP의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 Ps.RbcS-3C CTP의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 Os.Waxy CTP의 아미노산 서열이다.
서열번호 7-11은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 발현을 위해 최적화된 서열번호 1의 APG6 CTP를 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 12는 서열번호 2의 APG6 CTP를 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 13 및 14는 각각 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 발현을 위해 최적화된 At.CR88 CTP를 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 15-17은 각각 서열번호 4-6을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 18-27은 디캄바 모노옥시게나제 (DMO) 변이체를 인코딩하는 아미노산 서열이다.
서열번호 28-37은 각각 서열번호 18-27의 DMO 변이체를 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 38은 쌍떡잎식물 발현을 위해 최적화된, 목화 12G088600TP 엽록체 수송 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열번호 39는 서열번호 38을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 40은 H_N90의 아미노산 서열이다.
서열번호 41는 H_N20의 아미노산 서열이다.
서열번호 42은 H_N60의 아미노산 서열이다.
서열번호 43은 H_N10의 아미노산 서열이다.
서열번호 44는 H_N30의 아미노산 서열이다.
서열번호 45은 H_N40의 아미노산 서열이다.
서열번호 46은 H_N50의 아미노산 서열이다.
서열번호 47은 H_N70의 아미노산 서열이다.
서열번호 48는 H_N100의 아미노산 서열이다.
서열번호 49은 H_N110의 아미노산 서열이다.
서열번호 50-56은 각각 서열번호 40, 41, 43, 44, 45, 46 및 48에 상응하는 개시 메티오닌을 결여하는 아미노산 서열이다.
서열번호 57-58은 서열번호 50의 아미노산 변이체이다.
서열번호 59는 서열번호 56의 아미노산 변이체이다.
서열번호 60은 아마란써스 투베르쿨라투스(Amaranthus tuberculatus) (waterhemp)(WH_PPO) 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다제의 아미노산 서열이다.
서열번호 61-70은 각각 대장균(E. coli) 발현을 위해 코돈 최적화된, 서열번호 40-49을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 71-80은 각각 쌍떡잎식물 발현을 위해 코돈 최적화된, 서열번호 40-4을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 81-87은 각각 쌍떡잎식물 발현을 위해 코돈 최적화된, 서열번호 50-5을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 88 및 91은 각각 서열번호 50 및 51의 핵산 변이체이다.
서열번호 89, 90, 및 92는 각각 서열번호 57-59을 인코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 93-102는 각각 외떡잎식물 발현을 위해 코돈 최적화된, 서열번호 40-49을 인코딩하는 핵산 서열이다.
세포내에 제초제 내성 단백질을 국재화하기 위한 엽록체 수송 펩타이드(CTP)는 당해 기술 분야에 공지되어 있으나, 효과적인 하위-세포 국재화 정도 및 임의의 CTP 및 제초제 내성 단백질 조합에 대한 가공은 예측하기 어렵다. 국재화 및 가공은 제초제 내성 단백질의 발현 수준 및 기능을 결정하므로, 단백질을 포함하는 형질 전환 세포, 식물, 또는 종자의 제초제 내성 표현형에 영향을 준다. 다양한 CTP가 형질전환 식물에서 디캄바 모노옥시게나제 (DMO) 및 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 포함하는 유용한 제초제 내성 단백질로 시험되어 왔다. 그러나, 단백질의 불량한 또는 불완전한 가공 및 국재화가 흔히 관찰된다.
본 발명은 개선된 엽록체 국재화 및 가공을 제공할 수 있는 신규한 재조합 DNA 분자, 뿐만 아니라 이들을 사용하기 위한 조성물 및 방법도 제공함으로써, 이들 장애물을 극복한다. 본 발명의 재조합 DNA 분자는 DMO 또는 PPO에 작동가능하게 연결된 CTP를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 본 발명의 재조합 DNA 분자는 DMO 또는 PPO의 엽록체 국재화 및 재조합 DNA 분자를 포함하는 식물에서 디캄바 또는 PPO 제초제에 대해 개선된 내성을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 제초제 내성 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CTP를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 CTP, 예컨대, DMO 단백질, 예를 들어 서열번호 18-27 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 DMO 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CTP를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 CTP, 예컨대, PPO 단백질, 예컨대, 서열번호 40-60으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 PPO 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CTP를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.
재조합 DNA 분자
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 유전공학의 결과인 비-천연 DNA, 폴리펩타이드, 단백질, 세포, 종자, 또는 식물을 지칭하며, 이들은 천연에서 통상 발견될 수 없고 인간 개입에 의해 생성되었다. "재조합 DNA 분자"는 천연적으로 발생하지 않고 인간 개입의 결과인 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자, 예컨대, 서로에 대해서 이종인 적어도 2종의 DNA 분자의 조합으로 구성된 DNA 분자이다. 재조합 DNA 분자의 예는 서열번호 18-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DMO 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CTP를 인코딩하는 DNA 분자이다. DMO 단백질의 예는 하기 표 1에서 제공된다.
Figure pct00001
재조합 DNA 분자의 또 다른 예는 서열번호 40-60으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 PPO 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CTP를 인코딩하는 DNA 분자이다. 재조합 세포, 종자, 또는 식물은 형질 전환 DNA를 포함하는 세포, 종자, 또는 식물, 예를 들어, 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질 전환 세포, 종자, 식물, 또는 식물 일부이다. PPO 단백질의 예는 하기 표 2에 제공된다.
Figure pct00002
본 발명에 따라 사용될 수 있는 CTP 서열의 예는 하기 표 3에 제공된다.
Figure pct00003
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 DNA 분자"는 DNA 분자가 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 존재하지만, 그것의 천연 환경 내에 있지 않음을 의미한다. 예를 들어, 단백질-코딩 서열 및 이종 CTP 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자는 형질전환 식물, 세포, 또는 종자의 게놈 속에 존재하는 경우 단리된 DNA 분자인데, 이는 이러한 재조합 DNA 분자의 성분이 그것의 천연 환경(즉, 각각의 성분이 처음에 관측된 유기체의 게놈) 속에 존재하지 않기 때문이다. 형질전환 식물 게놈 속에 존재하는 재조합 DNA 분자는, 재조합 DNA 분자가 이러한 식물 게놈 속에서 천연적으로 발견되지 않아서 그것의 천연 환경으로부터 단리되는 한 단리된 DNA 분자이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "유전공학"은 천연에서 통상 발견될 수 없는 DNA, 단백질, 또는 유기체의 인간 개입에 의한 창출을 지칭한다. 유전공학은 생명공학, 예컨대 분자 생물학, 단백질 생화학, 박테리아 형질 전환, 및 식물 형질 전환의 기술 중 하나 이상을 사용하여 실험실 내에서 고안되고 생성된 DNA, 폴리펩타이드, 단백질, 세포, 종자, 또는 식물을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전공학은 서열번호 18-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DMO 단백질에 작동가능하게 연결된 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CTP를 인코딩하는 DNA 분자를 포함하는 키메라 유전자를 생성하는데 사용될 수 있으며, 선택적으로 식물 세포 내에서 기능성인 이종 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 유전공학을 사용하여 서열번호 40-60로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 PPO 단백질에 작동가능하게 연결된 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 CTP를 인코딩하는 DNA 분자를 포함하는 키메라 유전자를 생성할 수 있으며, 선택적으로 식물 세포내에서 기능성인 이종 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 그와 같은 키메라 유전자는 분자 생물학, 예컨대 유전자 클로닝, DNA 라이게이션(ligation), 및 DNA 합성의 기술 중 하나 이상을 사용하여 생산될 수 있다.
용어 "형질전환 유전자(transgene)"는 인간 개입, 예컨대 식물 형질 전환 방법에 의한 결과로서 유기체의 게놈내로 인공적으로 편입된 DNA 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환(transgenic)"은 형질전환 유전자를 포함하는 것을 의미하며, 예를 들어, "형질전환 식물"은 이의 게놈에 형질전환 유전자를 포함하는 식물을 지칭하며, "형질전환 특성(transgenic trait)"은 식물 게놈에 도입된 형질전환 유전자의 존재에 의해 전달되거나 부여되는 특징 또는 표현형을 지칭한다. 이러한 게놈 변형의 결과로서, 형질전환 식물은 관련 야생형 식물과는 뚜렷이 다르며, 형질전환 특성은 야생형 식물에서 천연에서 발현되지 않는 특성이다. 본 발명의 형질전환 식물은 본 발명에 의해 제공된 재조합 DNA 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "이종"은 상이한 공급원으로부터 유래된 2종 이상의 물질 사이의 관계를 지칭하며, 따라서 천연에서는 통상 관련되지 않는다. 예를 들어, DMO 단백질은 이러한 조합이 천연에서 통상 발견되지 않는 경우 작동가능하게 연결된 CTP에 관해서는 이종이다. 또 다른 예에서, DMO 단백질에 작동가능하게 연결된 재조합 CTP를 인코딩하는 DNA 분자는, 이러한 조합이 천연에서 통상 발견되지 않는 경우, 식물 세포내에서 기능성인 작동가능하게 연결된 프로모터와 관련하여 이종이다. 특정한 재조합 DNA 분자는 또한 이것이 특정한 세포, 종자, 또는 유기체 내에서 천연적으로 발생하지 않는 경우 이것이 삽입된 세포, 종자, 또는 유기체와 관련하여 이종일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "단백질-인코딩 DNA 분자" 또는 "폴리펩타이드-인코딩 DNA 분자"는 단백질 또는 폴리펩타이드, 예컨대 제초제 내성 또는 곤충 방제를 부여하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 지칭한다. "단백질-인코딩 서열" 또는 "폴리펩티드-인코딩 서열"은 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 의미한다. "서열"은 핵산 또는 아미노산의 순차적 배열을 의미한다. 단백질-인코딩 서열 또는 폴리펩티드-인코딩 서열의 경계는 통상적으로 5'-말단의 번역 개시 코돈, 및 3'-말단의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 단백질-인코딩 분자 또는 폴리펩티드-인코딩 분자는 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "형질전환 유전자 발현", "형질전환 유전자를 발현하는", "단백질 발현", "폴리펩타이드 발현", "단백질을 발현하는", 및 "폴리펩타이드를 발현하는"은, DNA 분자의 메신저 RNA(mRNA)로의 전사, 및 mRNA가 단백질로 궁극적으로 접혀질 수 있는 폴리펩타이드 사슬 내로 번역되는 과정을 통한 단백질 또는 폴리펩타이드의 생산을 의미한다. 단백질-인코딩 DNA 분자 또는 폴리펩티드-인코딩 DNA 분자는, 재조합 DNA 분자로 형질전환된 세포에서 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는데 사용하기 위한 DNA 작제물에서 이종 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은, 하나가 다른 하나의 기능에 영향을 미칠 수 있게 하는 방식으로 연결된 두 개의 DNA 분자를 의미한다. 작동 가능하게 연결된 DNA 분자는 단일 인접 분자의 일부일 수 있고, 인접할 수 있거나 인접하지 않을 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 두 개의 DNA 분자가 프로모터가 형질전환 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있도록 정렬되어 있는 DNA 작제물에서 단백질-인코딩 DNA 분자 또는 폴리펩티드-인코딩 DNA 분자와 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 재조합 DNA 분자는 CTP 서열에 작동가능하게 연결된 DMO를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용된, "디캄바 모노옥시게나제" 또는 "DMO"는 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산)의 3,6-디클로로살리실 산 (3,6-DCSA)로의 열화를 효소적으로 촉매할 수 있는 옥시게나제, 예컨대 스테노트로포모나스 말 토필리아(Stenotrophomonas maltophilia )로부터 탈메틸효소 (dmo) 유전자에 의해 인코딩된 디캄바 모노옥시게나제를 의미한다. 디캄바 모노옥시게나제는 당업계에 공지되어 있고, 서열번호 18-27로서 제공되고, 표 1에 확인된 단백질 서열을 포함한다.
본 발명의 재조합 DNA 분자는 CTP 서열에 작동가능하게 연결된 PPO를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용된, "프로토포르피리노겐 옥시다제" 또는 "PPO"는 프로토포르피리노겐 IX를 프로토포르피린 IX로 효소적으로 전환시킬 수 있는 옥시다제를 의미한다. 프로토포르피리노겐 옥시다제는 당업계에 공지되어 있고, 서열번호 40-60으로서 제공되고, 표 2에 확인된 단백질 서열을 포함한다.
본 발명의 재조합 DNA 분자는 본 발명에 의해 제공된 단백질-인코딩 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 CTP 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함함으로써, CTP가 세포내에서 재조합 단백질 분자를 국재화시키는 것을 용이하게 한다. CTP는 또한 당해 분야에서 신호 서열, 표적화 서열, 표적화 펩타이드, 및 국재화 서열로 공지되어 있다. 엽록체는 또한 당해 분야에서 색소체(plastid)로서 알려져 있다. 세포내에서 단백질 국재화를 촉진시킴으로써, CTP는 최적의 효소 활성을 위해 단백질의 엽록체로의 국재화를 보증하고, 재조합 단백질의 축적을 증가시키고 단백질 분해성 열화로부터 단백질을 보호할 수 있다. 엽록체내로의 이동(translocatopn)시, CTP는 단백질로부터 통상 절단되는데, 또한 소위 가공(processing)으로도 지칭된다. CTP 가공은 완전하거나(완전한 CTP는 단백질의 아미노-말단으로부터 절단됨을 의미한다), 불완전할 수 있거나(CTP의 하나 이상의 아미노산이 단백질의 아미노-말단에 남아있음을 의미한다), 또는 단백질의 아미노-말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 제거를 초래할 수 있다. DMO 단백질로부터 CTP의 완전한 가공은 단백질 축적의 수준을 증가시킴으로서, 디캄바 내성을 증가시키고, 제초제 적용 후 형질 전환 세포, 종자, 또는 유기체내에서의 손상 수준을 감소시킨다. CTP는 서열번호 1-6 및 38로서 제공되며, 표 3에서 확인된다. 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물에서의 발현을 위해 최적화된, 각각의 CTP를 인코딩하는 DNA 서열은 서열번호 7-17 및 39로서 제공된다.
본 개시내용의 재조합 DNA 분자는 특히 이것이 DNA 조작에 유용한 서열(예컨대, 제한 효소 인식 부위 또는 재조합-기반의 클로닝 부위), 식물-바람직한 서열(예컨대 식물-코돈 사용 또는 코작(Kozak) 공통 서열), 또는 DNA 작제물 디자인에 유용한 서열(예컨대, 스페이서 또는 링커 서열)을 제공하는데 바람직한 경우, 당해 분야에서 공지된 방법에 의해, 완전히 또는 부분적으로 합성되고 변형될 수 있다. 본 개시내용의 재조합 DNA 분자는 본원에 제공된 DNA 서열과 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 변성된(degenerated) DNA 서열을 포함한다. 변성된 DNA 서열은 당해 분야에서 공지된 방법 및 DNA 코돈 표를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명은 본원에 제공된 임의의 재조합 DNA 분자 또는 폴리펩타이드 서열에 대해, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 및 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 재조합 DNA 분자 및 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 서열번호 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 28-37 및 61-102로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 DNA 분자는 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열; 또는 서열번호 18-27 및 40-59로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질 서열을 인코딩할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "%의 서열 동일성"은, 두 개의 서열이 최적으로 정렬될 때(적절한 핵산 또는 아미노산 삽입, 결실, 또는 비교 윈도우에 대해 참조 서열의 총 20% 미만의 갭(갭)을 가짐), 시험("대상") 서열 (또는 이의 상보적인 가닥)과 비교하여, 참조["조회(query)"] 서열(또는 이의 상보적인 쇄)의 선형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열에서의 동일한 핵산 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 당업계의 숙련가들에게 널리 알려져 있으며 다음과 같은도구로 수행될 수 있다: 스미스 및 워터먼(Smith 및 Waterman)의 국소 상동성 알고리즘, 니들먼 및 번치(Needleman 및 Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘과 같은 도구, 피어슨 및 리프만(Pearson 및 Lipman)의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 및 디폴트 파라미터를 갖는 GCG® Wisconsin 패키지® (Accelrys Inc.,San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc.,1228 S.Park St.,Madison, WI 53715), 및 MUSCLE(버전 3.6) (Edgar, Nucleic Acids Research 32(5): 1792-7, 2004)의 서열 분석 소프트웨어 패키지의 일부로서 입수가능한 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA. 시험 서열 및 참조 서열의 정렬된 세그먼트에 대한 "동일성 분율"은, 두 개의 정렬된 서열에 의해 공유된 동일 성분의 수를, 참조 서열 세그먼트의 성분, 즉, 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 보다 작은 정의된 부분의 총 수로 나눈 것이다. 서열 동일성 퍼센트는 동일성 분율에 100을 곱한 것으로 나타낸다. 하나 이상의 서열의 비교는 전장 서열 또는 이의 일부에 대해, 또는 더 긴 서열에 대한 비교일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "DNA 작제물"은 둘 이상의 이종 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자이다. DNA 작제물은 형질전환 유전자 발현을 위해 유용하고, 벡터 및 플라스미드에 포함될 수 있다. DNA 작제물은 형질전환 목적으로, 즉 형질전환 식물 및 세포를 생산하기 위해 이종 DNA를 숙주 세포로 도입하기 위해 벡터에서 사용될 수 있으며, 이로서 또한 형질전환 식물, 종자, 세포, 또는 식물 부분의 색소체 DNA 또는 게놈 DNA에 함유될 수 있다. 본원에서 사용된, "벡터"는 식물 형질전환의 목적으로 사용될 수 있는 임의의 재조합 DNA 분자를 의미한다. 서열목록에서 제시된 바와 같은 재조합 DNA 분자는 예를 들어, 재조합 DNA 분자에 의해 인코딩된 단백질의 발현에 영향을 주기 위해 식물내에서 기능하는 유전자 발현 요소에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 분자를 갖는 작제물의 일부로서 벡터내로 삽입될 수 있다. DNA 작제물 및 벡터를 작제하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. DNA 작제물, 또는 DNA 작제물을 포함하는 벡터를 위한 성분은, 일반적으로 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 유전자 발현 요소를 포함하며, 예컨대 다음과 같다: 작동가능하게 연결된 DNA의 발현을 위한 프로모터, 작동가능하게 연결된 단백질-인코딩 DNA 분자, 및 3' 미번역된 영역.본 발명을 실시하는데 유용한 유전자 발현 요소는 다음과 같은 유형의 요소 중 하나 이상을 비제한적으로 포함한다: 프로모터, 5' 미번역 영역, 인핸서, 리더, 시스-작용 요소, 인트론, 3' 미번역된 영역, 및 하나 이상의 선별 마커 형질전환 유전자.
본 발명의 DNA 작제물은 본 발명에 의해 제공된 단백질-코딩 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있으며, 이에 의해, 프로모터는 재조합 단백질 분자의 발현을 유도한다. 본 발명을 실행하는데 유용한 프로모터는 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 세포에서 기능하는 것, 예를 들어, 박테리아 또는 식물 프로모터를 포함한다. 식물 프로모터는 다양하며, 당해 분야에서 잘 알려져 있고 유도성, 바이러스성, 합성, 구성적, 일시적으로 조절된, 공간적으로 조절된, 및/또는 시공간적으로(spatio-temporally) 조절된 것들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, "음성 대조군" 및 "양성 대조군"은 비교 목적으로 설계된 실험적 대조군을 의미한다. 예를 들어, 형질전환 식물 분석에서 음성 대조군 또는 양성 대조군은, 실험 식물(즉, 시험될 식물)과 동일한 유형의 식물일 수 있으나, 실험적 식물의 형질 전환 삽입물, 재조합 DNA 분자, 또는 DNA 작제물을 포함하지 않는다. 형질 전환 옥수수 식물과의 비교를 위해 유용한 식물의 예는: 비-형질 전환 LH244 옥수수 (U.S. 특허 제6,252,148호), 또는 비-형질 전환 01DKD2 옥수수 (U.S.특허 제7,166,779호)이고, 형질 전환 대두 식물과의 비교를 위해서는 비-형질 전환 A3555 대두 (U.S.특허 제7,700,846호), 또는 비-형질 전환 A3244 대두 (U.S.특허 제5,659,114호, PVP 9600246)이며, 형질 전환 카놀라 또는 브라씨카 나푸스 식물과의 비교를 위해서는 비-형질 전환 브라씨카 나푸스 품종65037 Restorer line이고, 형질 전환 밀 식물과의 비교를 위해서는 비-형질 전환 밀 품종 Samson 생식질(germplasm) (PVP 1994)이며, 형질 전환 목화 식물과의 비교를 위해서는 비 -형질 전환 DP393 (U.S.특허 제6,930,228호 PVP 200400266).
형질전환 식물
본 발명의 측면은 본 발명에 의해 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질 전환 식물 세포, 형질전환 식물 조직, 형질전환 식물, 및 형질전환 종자를 포함한다. 재조합 DNA 분자를 포함하는 이들 세포, 조직, 식물, 및 종자는 제초제에 대해 내성을 나타낸다.
형질 전환 DNA("형질전환 유전자"로서 공지됨)의 식물의 게놈내로의 삽입은, 식물 형질 전환의 작용으로 달성될 수 있으며, "사건(event)"으로 알려진 신규한 형질 전환 게놈 분자 서열의 창출을 초래한다. 각각의 사건은 특이적이며, 사건의 DNA 서열은 사건에 대해 특이적이다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 숙주 식물 세포의 변형을 위한 적합한 방법은, DNA를 세포에 도입할 수 있는 거의 모든 방법(예를 들어, 여기서, 재조합 DNA 작제물은 식물 염색체에 안정적으로 통합된다)을 포함하며 당업계에 널리 공지되어 있다. 재조합 DNA 작제물을 식물내로 도입하기 위한 예시적인 방법으로는, 삽입된 재조합 DNA 작제물은 아그로박테리움 형질 전환 시스템 및 DNA 입자-폭격(bombardment)이 있으며, 이 둘 모두는 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 식물에 재조합 DNA 작제물을 도입하기 위한 다른 예시적인 방법은, 부위-지향 통합(Site-directed integration)의 방법에 의해 이미 결정된 부위의 식물 게놈에 재조합 DNA 작제물의 삽입되는 것이다. 부위-지향 통합은 예를 들어, 아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease), 조작된 또는 천연의 메가뉴클레아제(meganucleases), TALE-엔도뉴클레아제, 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템)에 의해, 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 형질전환 식물은 식물 세포 배양의 방법에 의해 변형된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 형질전환 유전자에 대해 동형접합성인(즉, 형질전환 유전자의 두 개의 대립형질 카피) 형질전환 식물은, 단일 형질전환 유전자 대립형질을 함유하는 형질전환 식물, 예를 들어 R0 식물을 자가 수분(자가 수정)시켜 R1 종자를 생산함으로써 수득될 수 있다. 생산된 R1 종자의 4분의 1은 형질전환 유전자에 대해 동형접합성일 것이다. R1 종자를 발아시키는 것으로부터 생장된 식물은, 통상 SNP 검정, DNA 시퀀싱, 또는 접합성 검정(zygosity assay)이라고 하는 이종접합체와 동형접합체 간의 구별을 가능케 하는 열 증폭 검정을 사용하여, 접합성에 대해 시험할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 식물, 종자, 식물 부분, 식물 조직, 및 세포는 디캄바에 대해 제초제 내성을 나타낼 수 있다. 디캄바는 잡초 생장을 방지하는 것을 포함하는 잡초 방제 방법으로서, 본 발명에 의해 제공된 식물 및 종자를 포함하는 식물 생장 지역에 적용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 식물 및 종자는 제초제 내성 특성을 포함하며, 자체로서 디캄바의 적용에 대해 내성이다. 제초제 적용은 권장되는 상업적 비율(1X) 또는 이의 일부 또는 배수, 예를 들어, 권장되는 상업적 비율의 두 배(2X)일 수 있다. 디캄바 적용 비율(rate)은 에이커당 파운드당 산 당량 (lb ae/acre), 또는 헥타르당 그램당 산 당량 (g ae/ha)으로 나타낼 수 있다. 식물 생장 구역은 제초제 적용 시 잡초 식물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 잡초를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 제초 유효량의 디캄바는, 생장하는 계절에 걸쳐 약 0.1X 내지 약 30X 표지 비율(label rate))의 범위로 이루어져야 한다. 디캄바에 대한 1X 표지 비율은 0.5 lb ae/acre이다. 제초제 비율은 영국식과 미터법 사이에서 다음과 같이 전환될 수 있다:(lb ai/ac)*1.12 = (kg ai/ha) 및 (kg ai/ha)*0.89 = (lb ai/ac).
식물, 종자, 식물 부분, 식물 조직, 및 세포는 PPO 제초제라고 하는, 하나 이상의 PPO 저해제에 대해 내성을 나타낼 수 있다. 하나 이상의 PPO 제초제는 잡초 생장을 방제하는 것을 포함하는, 잡초 방제용 방법으로서 본 발명에 의해 제공된 식물 및 종자를 포함하는 식물 생장 지역에 적용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 식물 및 종자는 제초제 내성 형질을 포함하며, 그 자체는 하나 이상의 PPO 제초제의 적용에 대해 내성이 있다. 제초제 적용은 권장되는 상업적 비율(1X) 또는 이의 일부 또는 배수, 예를 들어, 권장되는 상업적 비율의 두 배(2X)일 수 있다. 식물 생장 구역은 제초제 적용 시 잡초 식물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 잡초 방제 지역에서 사용하기 위한 제초 유효량의 PPO 제초제는, 생장하는 계절에 걸쳐 약 0.1X 내지 약 30X 표지 비율(들)의 범위로 이루어져야 한다. PPO 제초제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 상업적으로 입수 가능하다. PPO 제초제의 예는, 비제한적으로, 디페닐에테르(예컨대 아시플우로르펜, 그것의 염 및 에스테르, 아클로니펜, 비페녹스, 그것의 염 및 에스테르, 에톡시펜, 그것의 염 및 에스테르, 플루오로니트로펜, 푸릴옥시펜, 할로사펜, 클로메톡시펜, 플루오로글리코펜, 그것의 염 및 에스테르, 락토펜, 그것의 염 및 에스테르, 옥시플루오르펜, 및 포메사펜, 그것의 염 및 에스테르); 티아디아졸 (예컨대 플루티아세트-메틸 및 티디아지민); 피리미딘디온 또는 페닐우라실(예컨대 벤즈펜디존, 부타페나실, 에틸 [3-2-클로로-4-플루오로-5-(1-메틸-6-트리플루오로메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리미딘-3-일)페녹시]-2-피리딜옥시]아세테이트 (CAS 등록번호 353292-31-6 및 본 명세서에서 일명 S-3100), 플루프로파실, 사플루페나실, 및 티아페나실); 페닐피라졸(예컨대 플루아졸레이트, 피라플루펜 및 피라플루펜-에틸); 옥사디아졸 (예컨대 옥사디아르길 및 옥사디아존); 트리아졸리논(예컨대 아자페니딘, 벤카바존, 카르펜트라존, 그것의 염 및 에스테르, 및 설페트라존); 옥사졸리딘디온 (예컨대 펜톡사존); N-페닐프탈이미드(예컨대 시니돈-에틸, 플루미클로락, 플루미클로락 -펜틸, 및 플루미옥사진); 벤족사지논 유도체(예컨대 1,5-디메틸-6-티옥소-3-(2,2,7-트리플루로로 -3,4-디하이드로-3-옥소-4-프로프-2-이닐-2H-1,4-벤족사진-6-일)-1,3,5-트리아지난-2,4-디온); 플루펜피르 및 플루펜피르-에틸; 피라클로닐; 및 프로플루아졸을 포함한다.
제초제 적용은 순차적으로 또는 몇몇 제초제 또는 임의의 다른 양립가능한 제초제중 1개, 2개 또는 조합물과 혼합된 탱크일 수 있다. 하나의 제초제 또는 둘 이상의 제초제의 조합 또는 단독의 다중 적용, 예를 들어, 2회 적용(예를 들어, 파종전 적용 및 발아후 적용; 또는 발아전 적용 및 발아후 적용) 또는 3회 적용(예를 들어, 파종전 적용, 발아전 적용, 및 발아후 적용; 또는 발아전 적용과 2회의 발아후 적용)가 광범위한 스펙트럼의 쌍떡잎 식물 잡초, 외떡잎 식물 잡초, 또는 이들 둘 다의 방제를 위해 본 발명의 형질전환 식물을 포함하는 구역에 생장 시기에 걸쳐 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "내성" 또는 "제초제 내성"은 적용되는 경우 제초제의 독성 효과에 대해 내성인 식물, 종자, 또는 세포의 능력을 의미한다. 식물, 종자, 식물 조직, 식물 일부, 또는 세포의 제초제 내성은 식물, 종자, 식물 조직, 식물 일부, 또는 세포를, 적합한 실험적 대조군과 비교함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 제초제 내성은 제초제 내성을 부여할 수 있는 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 식물(시험 식물) 및 제초제 내성을 부여할 수 있는 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 포함하지 않는 동일한 종의 식물(음성 대조군 식물)에 제초제를 적용한 다음, 2개 식물의 식물 손상을 비교함으로써 측정되거나 평가될 수 있으며, 여기서 시험 식물의 제초제 내성은 음성 대조군 식물의 손상율과 비교하여 감소된 손상율에 의해 나타낸다. 제초제 내성 식물, 종자, 식물 조직, 식물 일부, 또는 세포는, 음성 대조군의 식물, 종자, 식물 조직, 식물 일부, 또는 세포와 비교하는 경우, 제초제가 독성 효과에 대해 감소된 반응을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된, "제초제 내성 특성"은 음성 대조군 식물과 비교하여 개선된 제초제 내성을 식물에 부여하는 형질 전환 특성이다.
본 발명의 형질전환 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물 부분은, 또한 하나 이상의 추가의 형질전환 특성을 함유할 수 있다. 추가의 형질전환 특성은 본 발명에 의해 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 유전자를 함유하는 식물을, 추가의 형질전환 특성(들)을 함유하는 다른 식물과 교배함으로써 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "교배"는 두 개의 개별 식물을 재배하여 자손 식물을 생산함을 의미한다. 따라서, 두 개의 형질전환 식물을 교배하여 형질전환 특성을 함유하는 자손을 생산할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "자손(progeny)"은 임의의 세대의 모 식물의 자손(offspring)를 의미하며, 형질전환 자손은 본 발명에 의해 제공되고 적어도 하나의 모 식물로부터 유전된 DNA 작제물을 포함한다. 대안적으로, 추가의 형질전환 특성(들)은 그 추가의 형질전환 특성(들)을 위한 DNA 작제물을, 본 발명에 의해 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 작제물(예를 들면, 식물 형질전환에 사용된 동일한 벡터의 일부로서 존재하는 모든 DNA 작제물)과 공동-형질전환시킴으로써, 또는 추가의 형질(들)을 본 발명에 의해 제공된 DNA 작제물을 포함하는 형질전환 식물에 도입하거나, 또는 그 반대로 함으로써(예를 들면, 형질전환 식물 또는 식물 세포에 대한 식물 형질전환의 방법 중의 어느 하나를 사용함으로써) 도입될 수 있다. 이러한 추가의 형질 전환 특성은, 비제한적으로, 증가된 곤충 저항, 증가된 물 사용 효율, 증가된 수율 성능, 증가된 가뭄 저항, 증가된 종자 품질, 개선된 영양 품질, 하이브리드 종자 생산, 및 제초제 내성을 포함하며, 여기서 상기 특성은 야생형 식물과 관련하여 측정된다. 이러한 추가의 형질 전환 특성은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며; 예를 들어, 이러한 특성의 목록은 미국 농무부(USDA)의 동물 및 식물 건강 점검 서비스(APHIS)에 제공되어 있다.
본 발명에 의해 제공된 형질전환 특성을 함유하는 형질전환 식물 및 자손은, 당업계에 통상적으로 공지된 임의의 재배 방법에 사용될 수 있다. 둘 이상의 형질전환 특성을 포함하는 식물주에서, 형질전환 특성은 셋 이상의 형질전환 특성을 포함하는 식물주에서 독립적으로 분리되거나, 연결되거나, 둘 다 될 수 있다. 영양 번식과 같이, 모 식물에의 역교배 및 비-형질전환 식물과의 이종교배가 또한 고려된다. 상이한 형질 및 작물에 통상적으로 사용되는 육종 방법의 설명은 당업계의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 특정 식물 또는 종자에서 형질전환 유전자(들)의 존재를 확인하기 위해, 각종 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들면, 분자 생물학 검정, 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅, PCR, 및 DNA 시퀀싱; 생화학 검정, 예를 들면, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯), 또는 효소 작용에 의한 단백질 산물의 존재 검출; 식물 부분 검정, 예를 들면, 잎 또는 뿌리 검정; 및 또한, 전체 식물의 표현형 분석을 포함한다. 특정한 형질전환 식물 또는 종자내에서 CTP 가공을 확인하기 위하여, 검정, 예컨대 Edman 열화 서열분석 또는 질량 분광분석법 분석을 형질 전환 세포, 식물, 또는 종자로부터 수득된 재조합 DMO 또는 PPO 단백질에서 수행하고, 수득한 서열 데이터를 DMO 또는 PPO 단백질 각각의 데이터와 비교하였다.
식물 유전자형에 형질전환 특성의 유전자이입(introgression)은 역교배 형질 전환의 과정의 결과로서 달성된다. 형질전환 특성이 유전자 도입되는 식물 유전자형을 역교배 형질 전환된 유전자형, 라인, 근친교배, 또는 혼성이라고 할 수 있다. 유사하게, 원하는 형질전환 특성이 결핍된 식물 유전자형은 비전환 유전자형, 라인, 근친교배, 또는 혼성이라고 할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 본 개시내용에 비추어, 많은 변화가 본 발명의 범위 및 개념 범위를 벗어나지 않고 제공되어 동일하거나 유사한 결과를 여전히 수득하는 특정 구현예에서 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 수 있다. 더 구체적으로, 화학적으로 또는 생리학적으로 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과가 달성된 본원에 기재된 제제로 치환될 수 있음이 분명할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체물 및 변형은 본 발명의 범위 및 개념내에 있는 것으로 간주된다.
실시예 1: 대두 원형질에서 CTP - DMO 발현 및 국재화
대두 원형질 검정을 사용하여 DMO 서열(서열번호 27)에 작동가능하게 연결된 5개의 CTP 중 하나를 포함하는 재조합 단백질의 상대적인 엽록체 표적 효율을 평가하였다. 재조합 단백질의 세포질 및 엽록체 분포를 모니터하기 위해, 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 서열을 재조합 CTP 및 DMO 조합(본 명세서에서 일명 CTP-DMO)을 인코딩하는 카셋트에 첨가함으로써, 녹색 형광 단백질이 DMO의 카복시-말단에 융합되도록 하였다.
원형질을 대두 자엽 (생식질 A3244)으로부터 준비하였다. 미성숙한 대두 종자 포드(pod)를 수확하고, 종자 (4-6 mm 길이)를 멸균 기술을 사용하여 제거하였다. 각각의 종자로부터의 자엽을 수작업으로 제거하여, 1 mm 조각으로 횡으로 슬라이스하고, 0.7M 만니톨을 갖는 CPW 완충액(pH 5.8) 속에서 1시간 동안 24-26℃에서 암실 속에서 40 RPM에서 진탕하면서 배양하였다. 이후에, 완충액을 제거하고 효소 완충액(CPW 완충액(pH 5.8; 0.49 M 만니톨 포함) 중의 4% 셀룰라아제 '오노주카(onozuka)' R-10; 2% 헤미셀룰라아제; 0.3% 마세로자임 R-10)으로 교체하였다. 자엽 조직을 회전식 진탕기에서 50 rpm으로 24-26℃에서 2시간 동안 배양하였다. 대두 원형질을 플레이트를 수작업으로 휘젖고, 현탁액을 60 um 나일론 메쉬의 이중 층을 통해 50 mL 원뿔형 튜브내로 여과함으로서 당해 배양 말기에 자엽 조직으로부터 방출시켰다. 원형질을 재현탁 및 원심분리로 1회 온화하게 세척하였다. 당해 최종 펠렛을 완충액 (4 mM MES, pH 5.7; 150 mM NaCl; 5 mM CaCl2; 0.5 M 만니톨)에 재현탁시키고, 1시간 동안 얼음 위에 두었다. 이후에 원형질을 원심분리하고 펠렛을 형질 전환 완충액 (0.4 M 만니톨; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5.7) 에서 재현탁시켰다. 용적을 1 x 10,000,000 원형질/ml이 되도록 조정하였다. 형질 전환은 각각의 작제물에 대해 12.5 ㎍ DNA를 혼합하여 달성하였다. DNA를 1.5 x 1,000,000 원형질과 조합시키고, 이어서 동등 용적의 PEG 완충액을 첨가하였다. 이를 5분 동안 배양한 후, 300 ㎕의 W5 완충액 (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7)으로 서서히 희석하였다. 이를 5-10분 배양한 후, 900 ㎕의 W5 완충액을 천천히 첨가했다. 원형질을 펠렛화하고 WI 완충액 (0.5 M 만니톨; 4 mM MES (pH 5.7); 20 mM KCl)에서 재현탁시키고 24-26 ℃에서 암실 속에서 배양하였다. 현미경검사 분석은 크립톤-아르곤 이온 (458, 488 nm) 레이저, 녹색 (543 nm) 헬륨-네온 레이저, 및 FITC 및 텍사스 레드 필터 세트가 장착된, Zeiss LSM510 메타 레이저 스캐닝 현미경 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY)를 사용하여 수행하였다. 이미지 취득 및 분석은 ZEN 2012 v.8.1 (Carl Zeiss MicroImagiNg, Inc.,Thornwood, NY) 및 40X 물 1.2 수치의 구경 대물렌즈를 사용하여 수행하였다. 사용된 여기 파장은 488 nm (GFP) 및 543 nm (엽록체 자동-형광)이고, 방출 필터는 500-530 nm (GFP) 및 630-700 nm (엽록체 자동-형광)이었다. 각각의 작제물에 대해, 적어도 50개의 개별 세포를 작제물의 국재화에 대해 채점하였다. 세포질, 색소체, 또는 둘 모두 세포질 및 색소체.결과는 분석된 세포의 총 수 중 세포질 또는 색소체 (또는 둘 다)내에 국재화된 단백질을 지닌 세포의 백분율로 기록되었으며 표 4에 제공된다.
Figure pct00004
분석된 5개의 CTP-DMO 조합 중, APG6 CTP (서열번호1) 만이 색소체에 대해 단독으로 단백질의 국재화를 나타내는 세포의 100%를 생성하였다. At.CR88 CTP(서열번호 3)는 색소체에 대해 단독으로 단백질의 국재화를 나타내는 세포의 94%를 수득하였고, 세포질 및 색소체에 대해 단백질의 국제화를 나타내는 세포의 6%를 수득하였다. 'A' CTP는 색소체에 대해 단독으로 단백질의 국재화를 나타내는 세포의 79% 및 세포질 및 색소체에 대해 국재화를 나타내는 세포의 21%를 수득하였다. 'B' CTP는 색소체에 대해 단독으로 단백질의 국재화를 나타내는 세포의 9%, 및 색소체 및 세포질에 대해 국재화를 나타내는 세포의 91%를 수득하였다. 'C' CTP는 색소체에 대해 단독으로 단백질의 국재화를 나타내는 세포의 18%, 및 색소체 및 세포질에 대해 국재화를 나타내는 세포의 82%를 수득하였다. CTP의 부재하에서, 단백질은 세포질에만 존재하였다. 이들 결과는 APG6 CTP가 CTP-DMO를 색소체에 대해 표적화하는데 100% 효율적이었고 At.CR88 CTP가 CTP-DMO를 색소체에 대해 표적화하는데 94% 효율적이었음을 나타낸다.
실시예 2: 형질 전환 밀에서의 CTP - DMO 가공
DMO에 작동가능하게 연결된 4개의 별개의 CTP중 하나를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 작제물로 형질 전환된 형질 전환 밀 식물을 사용하여 단백질 발현을 평가하고 CTP 가공을 측정하였다.
형질 전환 밀 식물을 DMO에 작동가능하게 연결된 4개의 상이한 CTP중 하나를 포함하는 DNA 작제물을 포함하는 4개의 상이한 식물 형질 전환 벡터 각각을 사용하여 생산하였다. Samson 생식질 (PVP 1994)의 밀로부터 예비-배양된 미성숙한 배아를 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 형질 전환시켜 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 형질전환 식물체를 생산하였다. 잎 샘플을 분자 분석을 위해 취하여 각각의 특유의 사건의 게놈에서 형질전환 유전자 복제 수를 확인하고 형질전환 유전자의 1개 카피를 지닌 R0 식물을 자가생산하여 R1 종자를 수집하였다.
종자(50g)를 분말로 분쇄하고, 이것을 이후에 250 ml의 추출 완충액 (1xTBE (89 mM 트리스-보레이트, 2 mM EDTA, pH 8.4), 200 mM NaCl, 10% 글리세린, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), 5 mM 벤자미딘, 2 mM 디티오트레이톨 (DTT), cOmpleteTM 프로테아제 저해제 (Roche Diagnostics Corporation, Indianopolis, IN))에 가하고, Polytron® (VWR, Radnor, PA)으로 약 20 초간 균질화한 후, 4℃에서 1 내지 2 시간 동안 배양하였다. 혼합물을 4℃에서 25분 동안 9,000 rpm으로 원심분리하고. 상청액을 10% 및 55%의 포화 황산암모늄 (AS)으로 순차적으로 침전시키며, 각각의 침전 단계는 18,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 10% AS 침전물로부터의 펠렛을 폐기하였다.
10-55% 분획으로부터의 펠렛을 cOmpleteTM 프로테아제 저해제의 1개 정제가 들어있는 30 mL의 PBS (0.1 M 인산나트륨, 0.15 M NaCl) 속에 용해하였다. 용해된 펠렛을 원심분리하고, 상청액을 0.22 um 막을 통해 여과하였다. DMO에 대한 염소 다클론성 항체 혈청을 PierceTM 단백질 A/G 아가로스 수지 (ThermoFischer Acientific, Grand Island, NY)의 1:1 현탁액과 혼합하고, 1.5 시간 후 항-DMO Ab 장입된 단백질 A/G 아가로스 수지를 PBS로 3회 세척하고, 약 30 mL의 10% - 55% AS 여과된 분획에 가하였다. 배양 후, 수지를 회전시키고 PBS로 3회 세척한 후, 1 ml의 PBS 에서 재현탁시키고, 마이크로원심분리관에 전달하여 다시 펠렛화하였다.
최종 펠렛을 2X Laemmli 완충액 속에서 재현탁시키고, 5 분 동안 비등시키고, 샘플을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 트리스-글리신 완충액 중에서 185 V (일정한)으로 수행하였다. SDS-PAGE 겔 속의 단백질을 CAPS 전달 완충액을 사용하여, 30분 동안 4℃ 및 100V에서 PVDF 막으로 전달하였다. PDVF 막 결합된 단백질을 쿠마씨 블루(coomassie blue)로 대략 30초 동안 염색하고, 10% - 55% AS 분획 속의 각각의 DMO 단백질에 상응하는 밴드를 PVDF 블랏(blot)에서 절단하여 아미노-말단 단백질 서열 분석에 사용하였다. 아미노-말단 단백질 서열분석을 자동화 Edman 열화 화학으로 수행하였으며, 각각의 분석은 15회 사이클로 자동화 Edman 열화 화학을 사용하여 수행하였다. 140C 마이크로구배 펌프 및 Perkin Elmer 시리즈 200 UV/Vis 검출기가 장착된 Applied Biosystems 494 Procise® 서열분석 시스템을, Procise 대조군 (버전 2.1) 소프트웨어 (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY)로 조절된 분석을 위해 사용하였다. 크로마토그래피 데이터를 SequencePro® (버전 2.1) 단백질 서열분석 분석 소프트웨어를 사용하여 수집하였다. 기대된 단백질의 예상된 서열과 일치하는 적어도 8개의 아미노산이 관측되는 경우 각각의 단백질에 대해 동일성을 확립하였다. 아미노-말단 서열분석의 결과는 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
DMO, DMO+1, DMO+10, 및 DMO+12의 지정을 사용하여, 단백질 서열분석이 가공 후 DMO의 아미노-말단 각각에 남아있는 CTP의 0, 1, 10, 또는 12개의 아미노산이 존재함을 나타내었다. DMO-1의 지정을 사용하여, DMO의 제1 메티오닌이 가공 후 제거되었음을 나타내었다. 2개의 특유의 사건을 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP (서열번호 1)에 대해 시험하였다. 샘플 둘 다는 가공(DMO+1) 후 DMO의 아미노-말단에 남아있는 CTP의 하나의 아미노산을 나타내었다. 3개의 특유의 사건을 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 At.CR88 CTP (서열번호3)에 대해 시험하였다. 모든 3개의 샘플은 가공(DMO 및 DMO+1)후 DMO의 아미노-말단에 남아있는 CTP의 아미노산이 0개 또는 1개임을 나타내었다. DMO (서열번호 19)에 작동가능하게 연결된 CTP4 (서열번호 4)로부터 시험한 사건은, 가공 (DMO+12) 후 DMO의 아미노-말단에 남아있는 CTP의 12개 아미노산을 나타내었다. 2개의 특유의 사건을 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 Os.Waxy CTP (서열번호 6)에 대해 시험하였다. 1개의 샘플은 가공(DMO+10) 후 DMO의 아미노-말단에 남아있는 CTP의 10개의 아미노산을 나타내었으며 하나는 DMO의 제1 메티오닌이 가공(DMO-1) 후 제거되었음을 나타내었다. 이들 결과는 APG6 CTP 및 At.CR88 CTP가 형질전환 식물에서 발현되는 경우 DMO로부터 효율적으로 가공됨을 나타낸다.
실시예 3: 형질 전환 브라씨카 나푸스 에서 CTP - DMO 발현
DMO에 작동가능하게 연결된 3개의 별개의 CTP 중 하나를 인코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 작제물의 디캄바 내성을 제공하는 능력을, 형질 전환 브라씨카 나푸스 식물을 사용하여 평가하였다.
형질 전환 브라씨카 나푸스 식물을, 프로모터에 작동가능하게 연결된 DMO에 작동가능하게 연결된 3개의 상이한 CTP중 하나를 각각 포함하는 DNA 작제물을 포함하는 3개의 상이한 식물 형질 전환 벡터를 사용하여 생산하였다. 브라씨카 나푸스 품종65037 Restorer line을 아그로박테리움-매개된 형질 전환을 위해 사용하였고, R0 식물을 온실에서 생장시켰다. 특유의 사건을 형질전환 유전자의 복제 수에 대해 선별하였다. 형질전환 유전자의 1개 카피를 지닌 R0 식물을 자가생산하고, R1 종자를 수집하였다.
디캄바 내성을 벡터 골격을 지닌 형질전환 유전자의 1개 카피 또는 형질전환 유전자의 2개 카피를 지닌 R0 식물을 사용하여 평가하였다. 디캄바 내성을 온실 조건하에서 20% 이하의 디캄바 손상으로서 지정하였다. 포트에서 R0 사건을 3개 그룹으로 분할하고, 디캄바 (Clarity®)를 3개 비율 중 하나로 적용하였다; (1) 디캄바 적용 안함, (2) 1 lb ae/acre의 디캄바 (2X 비율), 또는 (3) 2 lb ae/acre 디캄바 (4X 비율). 형질전환 식물에 분무하였고, 손상 등급은 21일 후에 기록하였다. DMO (서열번호 21)에 작동가능하게 연결된 "A" CTP를 포함하는 식물은 디캄바에 대해 내성인 사건을 나타내지 않았다. DMO (서열번호 21)에 작동가능하게 연결된 RbcS CTP (서열번호 5)를 포함하는 식물은, 9개 사건 중 8개가 2X 비율의 디캄바에 대해 내성을 가지며, 7개의 사건 중 7개가 4X 비율의 디캄바에 대해 내성을 가짐을 나타내었다. DMO (서열번호 20)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP (서열번호 1)를 포함하는 식물은, 14개의 사건 중 7개가 2X 비율의 디캄바에 대해 내성을 가지며, 18개의 사건 중 6개가 4X 비율의 디캄바에 대해 내성을 가짐을 나타내었다. 결과들이 표 6에 제공된다.
Figure pct00006
디캄바 내성을 형질전환 유전자 1개 카피를 지닌 R0 식물에서 평가하였다. 식물에게 온실 속에서 디캄바 (Clarity)를 사용하여 1 lb ae/acre (2X 비율)로 분무하고, 디캄바 내성을 14 내지 21 일 후 측정하였다. DMO (서열번호 20)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP를 포함하는 식물은, 31개 중 13개의 사건이 디캄바에 대해 내성을 가짐을 나타내었다. DMO(서열번호 21)에 작동가능하게 연결된 RbcS CTP를 포함하는 식물은 17개 중 13개의 사건이 디캄바에 대해 내성을 가짐을 나타내었다. DMO (서열번호 21)에 작동가능하게 연결된 "A" CTP를 포함하는 식물은, 18개의 사건 중 7개의 사건이 디캄바에 대해 내성을 가짐을 나타내었다. 결과들이 표 7에 제공된다.
Figure pct00007
DMO (서열번호 20)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP(APG6+DMO)를 포함하는 각각의 28 R1 식물로부터의 10개의 종자, 및 DMO (서열번호 21)에 작동가능하게 연결된 RbcS CTP (RbcS+DMO)를 포함하는 각각의 17 R1 식물로부터의 10개의 종자를, 온실속에서 생장시켰다. 식물에게 2 lb ae/acre의 디캄바 (4X)를 식재 일에 분무한 후, 1 lb ae/acre의 디캄바 (2X) 디캄바를 V3 단계에서, 및 1 lb ae/acre의 디캄바 (2X) 디캄바를 먼저 꽃(식물의 >90%가 오므리고, 약 25%가 적어도 하나의 개화된 꽃을 지닌 것으로 정의됨)에 분무하였다. 손상 등급을 각각의 분무 후 7일째에 취하여 분무된 대조군과 비교하여 손상 퍼센트로 표현하였다. APG6+DMO를 포함하는 식물의 경우, 각각의 3개의 등급 기간에서 ≤ 20%의 디캄바 손상 등급을 지닌 2개의 사건으로부터 총 9개의 자손이 존재하였다. RbcS+DMO를 포함하는 식물의 경우, 3회의 등급 기간 각각에서 20% 미만의 디캄바 내성을 갖는 16개의 사건에 걸쳐 77개의 식물이 존재하였다.
단백질 특성규명을 R0 사건으로부터 수확된 잎을 사용하여 수행하였다. 잎 조직을 액체 질소 속에서 분쇄하고 10% 2-메르캅토에탄올 및 5 mM DTT를 포함하는 2개 용적의 2X 램믈리(Laemmli) 완충액(BioRad, Hercules, CA)을 사용하여 추출하였다. 샘플을 비등시키고, 10 ㎕를 4-20% CriterionTM 예비-캐스트 겔(BioRad, Hercules, CA) 내로 장입시켜 트리스/글리신/SDS 완충액 속에서 250V에서 45 분 동안 수행하였다. 겔 속의 단백질을 400 mA에서 30분 동안 20% 메탄올을 포함하는 트리스/글리신 완충액 속에서 PVDF 막으로 이전시켰다. DMO 단백질을 다클론성 토끼 항-DMO 항혈청 및 HRP-접합된 항-토끼 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 신호를 SuperSignalTM West Pico 화학발광 키트 (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY)를 사용하여 검출하였다. 대략 38 kDa의 단일밴드가 존재하였으며, 이는 APG6-DMO를 포함하는 각각 3개의 사건에 대해, 완전히 가공된 DMO 단백질에 대해 기대된 크기이다. RbcS-DMO를 포함하는 각각의 6개의 사건에 대해, 대략 38 kDa 및 대략 41 kDa의 2개 밴드가 존재하였다. 41 kDa 밴드는 DMO+27과 일치하며, 이전에 RbcS-DMO를 포함하는 대두에서 보고되었다(U.S. 특허 제7,838,729호). "A" CTP-DMO를 포함하는 모든 사건에서 DMO 단백질의 매우 낮은 발현이 존재하였으며, 긴 노출 후 검출된 신호는 대략 50 kDa의 밴드 및 대략 39 kDa의 밴드였다. 50 kDa 밴드는 비-가공된 "A" CTP-DMO의 예측된 크기의 근사치이다. 이들 결과는 APG6-DMO가 완전히 가공된 DMO와 일치하는 기대된 크기의 단일 밴드를 생산하였음을 나타낸다.
재조합 단백질을 APG6-DMO 또는 RbcS-DMO를 포함하는 R0 식물의 잎 조직으로부터 분리하였다. 아미노-말단 서열 분석을 기재된 바와 같이 Edman 열화 화학을 사용하여 수행하였다. 아미노-말단 서열 분석은 웨스턴 블랏에서 관찰된 DMO 밴드의 크기와 일치하는, RbcS-DMO를 포함하는 식물에 존재하는 DMO+27 및 DMO-1의 현존 DMO 아미노-말단 서열의 존재를 확인하였다. 아미노-말단 서열 분석은 웨스턴 블랏에서 관찰된 DMO 밴드의 크기와 일치하는, APG6-DMO를 포함하는 식물 내의 DMO 아미노-말단 서열 DMO+1만의 존재를 확인하였다. 당해 결과는, APG6 CTP의 사용이 식물 속에서 작동가능하게 연결된 DMO의 완전한 가공을 초래함을 확인해 준다.
실시예 4: 형질 전환 옥수수에서의 CTP - DMO 발현
DMO에 작동가능하게 연결된 2개의 별개의 CTP 중 하나를 인코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 작제물의 발현을, 형질 전환 옥수수 세포 및 식물에서 분석하였다.
옥수수 메소필 원형질 일시적 형질 전환을 사용하여, 2개의 CTP-DMO 조합의 상대적인 DMO 발현을 평가하였다. DNA 작제물은, DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 CTP가 APG6 (서열번호 1) 또는 CTP4 (서열번호 4)인 점을 제외하고는 동일하였다. 원형질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 본질적으로 제조하였다. 형질 전환 후 세포를 수확하고, DMO 단백질 수준을 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 측정하였다. 4개의 형질 전환된 원형질 샘플로부터의 단백질을, 각각의 CTP-DMO 조합에 대해 총 단백질(mg) 당 DMO(ng)으로 측정하였다. APG6-DMO로 형질 전환된 원형질은 CTP4-DMO로 형질 전환된 원형질과 비교하여, 대략 4-배 더 높은 수준의 DMO를 가졌다. 데이터는 표 8에 제공된다.
형질 전환 옥수수 식물을 DNA 작제물을 사용하여 생성시키고, R0 식물을 생장시켰다. 잎 샘플을 8개의 특유의 단일 카피 사건을 나타내는 R0 식물로부터 수집하고 정량적 ELISA를 위해 사용하여 DMO 수준을 측정하였다. R0 잎 조직에서의 DMO 발현은 CTP4-DMO를 포함하는 사건과 비교하여, APG6-DMO를 포함하는 사건에 대하여 대략 4-배 더 높았다. 데이터는 표 8에 제공된다.
아미노-말단 서열분석을 형질 전환 옥수수 식물에서 발현된 DMO에 대해 수행하였다. 단백질을 CTP4-DMO 또는 APG6-DMO를 발현하는 형질 전환 옥수수 식물로부터 정제하고, 실시에 2에 기재된 바와 같이 본질적으로 Edman 열화 서열분석을 위해 제조하였다. 아미노-말단 서열 분석은 DMO+6, DMO+7, 및 DMO+12의 DMO 아미노-말단 서열이 CTP4-DMO를 포함하는 식물 속에 존재함을 확인하였다. 아미노-말단 서열 분석은 APG6-DMO를 포함하는 식물 속에서 DMO 및 DMO+1의 DMO 아미노-말단 서열을 확인하였다. 이들 결과는 CTP의 가공이 DMO의 아미노-말단에 남아있는 보다 적은 CTP 아미노산에 의해 입증된 바와 같이, CTP4에 비해 APG6를 사용하는 경우기 보다 완전함을 나타낸다. 데이터는 표 8에 제공된다.
Figure pct00008
형질 전환 옥수수를 APG6-DMO 또는 CTP4-DMO를 인코딩하는 재조합 DAN 분자를 포함하는 DNA 작제물을 사용하여, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 아그로박테리움 매개된 형질 전환에 의해 생성시켰다. 디캄바 내성을 형질 전환 F1 하이브리드 식물에 대한 필드 시험으로 평가하였다. 필드 시험은 2개의 복제 각각을 사용하여 2개의 지역에서 4회 처리를 포함하였다. 4회 처리는 다음과 같았다: (1) 디캄바 (Clarity®)를 V2, 이후 V4, 이후 V8에서 2 lbs ae/acre (4X)에서 적용하였고; (2) 디캄바를 V2, 이후 V4, 이후 V8에서 4 lbs at/acre (8X)에서 적용하였으며; (3) 디캄바를 V2, 이후 V4, 이후 V8에서 8 lbs at/acre (16X)에서 적용하였고; 및 (4) 디캄바를 V2, 이후 V4, 이후 V8에서 16 lbs at/acre (32X)에서 적용하였다. 작물 손상은 처리 후 10일째에 평가하였으며, V-단계(CIPV2, CIPV4, 또는 CIPV8)당 작물 손상 퍼센트로 측정하였다. 계절이 끝난 후, 그레인(grain)을 수확하여 수율을 bushels/acre로서 측정하였다. CIPV 등급 및 수율 둘다의 경우, 5% (p=0.05)의 가능성(probability)에서 최소한의 유의차(LSD)를 계산하였다. APG6-DMO를 포함하는 F1 하이브리드 식물에 적용된 최고 디캄바 비율(16X 및 32X)은, 영양 손상이 거의 없고, CTP4-DMO를 포함하는 식물보다 더 높은 그레인 수율을 나타내었다. 데이터는 표 9에 제공되어 있다.
Figure pct00009
실시예 5: 형질 전환 목화 및 대두에서의 CTP - DMO 발현
APG6 CTP를 최적화하여 단백질 번역 효능(단백질 합성)을 향상시키고, 단백질 축적을 증가시켰다. 최적화된 APG6 CTP(서열번호 2)는 APG6 CTP (서열번호1)의 3번 및 4번 위치에서, 트레오닌(T)으로부터 세린(S)으로의 아미노산 변화를 갖는다. DNA 작제물을 제조하여 대두에서 DMO에 각각 작동 가능하게 연결된 2개의 CTP와 비교하였다.
형질 전환 대두 식물을 APG6 CTP를 제외하고는 동일한 2개의 DNA 작제물을 사용하여 생성시켰다. 제1 DNA 작제물은 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)를 가졌다. 제2 DNA 작제물은 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 최적화된 APG6(서열번호 2)를 가졌다. 각각의 DNA 작제물을 사용하여 아그로박테리움 매개된 형질 전환 방법에 의해 A3555 대두를 형질 전환시켰다. 형질 전환 후, 형질전환 유전자의 단일 카피를 포함하는 R0 형질전환 식물을 PCR 검정으로 확인하였다. 단일 카피 R0 식물을 온실 속에서 생장시키고, R1 종자를 수확하였다. 각각의 2개의 DNA 작제물 및 AG3555 종자를 사용하여 생성된 4개의 사건에 대한 사건당 10개의 R1 종자를, 표준 온실 생장 조건 하에서 발아 후 디캄바 처리에 대한 작물 내성의 평가를 위해 식재하였다. 디캄바 (Clarity)를 V4 단계에서 1120 g ai/ha에서 적용하였다. 작물 손상 등급을 처리 후 10일째에 취하였다. 디캄바 내성 대두 식물로부터의 잎 샘플을 재조합 단백질 수준 측정 및 아미노-말단 서열 분석을 위해 취하였다. DMO 단백질 수준은 ELISA에 의해, DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP (서열번호 1)을 지닌 단일 카피 디캄바 내성 R1 형질 전환 대두 식물의 경우 13.35 ± 2.7 ng/mg인 것으로 검출되었다. DMO 단백질 수준은 ELISA에 의해, 최적화된 APG6 CTP (서열번호 2)를 지닌 단일 카피 디캄바 내성 R1 형질 전환 대두 식물의 경우 18.55 ± 3.1 ng/mg인 것으로 확인되었다. DMO 단백질은 음성 대조군 A3555 대두 잎 조직에서 검출되지 않았다. DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP (서열번호 1)를 지닌 단일 카피 R1 형질 전환 대두 식물에 대한 디캄바 손상 등급은 3.6%이었다. DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 최적화된 APG6 CTP (서열번호 2)를 지닌 단일 카피 R1 형질 전환 대두 식물에 대한 디캄바 손상 등급은 2.7%이었다. 음성 대조군 A3555 대두는 디캄바 손상 등급이 99.8%이었다. 단일 카피 디캄바 내성 R1 형질 전환 대두 식물로부터의 잎 샘플을, (실시예 2 및 4에 기재된 바와 같이) 아미노-말단 서열분석에 사용하였다. 아미노-말단 서열 분석은 APG6-DMO의 가공 및 최적화된 APG6-DMO가 DMO 단백질의 아미노-말단으로부터 CTP의 전체 가공에서 수득되었음을 확인하였다. DMO 수준, 디캄바 손상 및 APG6-DMO 가공은, APG6 및 최적화된 APG6 둘 다가 DMO에 작동가능하게 연결된 경우, 디캄바에 대한 내성을 제공하며 CTP 둘 다는 식물 내에서 완전히 가공됨을 나타내었다. 데이터는 표 10에 제공된다.
Figure pct00010
형질 전환 목화 식물을 APG6 CTP를 제외하고는 동일한 2개의 DNA 작제물을 사용하여 생성하였다. 제1 DNA 작제물은 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)를 가졌다. 제2 DNA 작제물은 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 최적화된 APG6 CTP (서열번호 2)를 가졌다. 각각의 DNA 작제물을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 아그로박테리움 매개된 형질 전환에 의해 목화으로 형질 전환시켰다. 형질 전환 후, 단일 카피의 형질전환 유전자를 포함하는 R0 목화 형질전환 식물을 PCR 검정으로 확인하고, 온실 속에서 생장시켜, R1 종자를 수확하였다. 각각의 작제물에 대한 10개의 사건으로부터 사건당 10개의 R1 종자 및 DP393 목화으로부터의 종자를 식재하여 디캄바의 출현 후 적용에 대한 내성을 평가하였다. 디캄바 (Clarity)를 V4 단계에서 1120 g ai/ha에서 적용하였다. 작물 손상 퍼센트 등급을 처리 후 9일째에 취하였다. 내성 목화 식물로부터의 잎 샘플을 단백질 수준 측정 및 APG6-DMO 또는 최적화된 APG6-DMO 아미노-말단 서열 분석에 사용하였다. ELISA에 의해 검출된 DMO 단백질 수준은 DMO (서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP (서열번호 1)을 지닌 단일 카피 디캄바 내성 R1 형질 전환 목화 식물의 경우 176.2 ± 103 ng/mg이었다. ELISA에 의해 검출된 DMO 단백질 수준은 최적화된 APG6 CTP (서열번호 2)를 지닌 단일 카피 디캄바 내성 R1 형질 전환 목화 식물의 경우 136.5 ± 58.6 ng/mg이었다. DMO 단백질은 음성 대조군 DP393 목화 잎 조직에서 검출되지 않았다. DMO(서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 APG6 CTP (서열번호 1)를 갖는 단일 카피 R1 형질 전환 목화 식물에 대한 디캄바 손상은 2.6%이었다. DMO(서열번호 18)에 작동가능하게 연결된 최적화된 APG6 CTP (서열번호 2)를 지닌 단일 카피 R1 형질전환 식물에 대한 디캄바 손상은 2.2%이었다. 음성 대조군 DP393 목화 손상은 85%이었다. 단일 카피 디캄바 내성 R1 식물로부터의 잎 샘플울 아미노-말단 서열분석(실시예 2 및 4에 기재된 바와 같음)에 사용하였다. 아미노-말단 서열 분석은 APG6-DMO의 가공 및 최적화된 APG6-DMO가 DMO 단백질의 아미노-말단로부터 CTP의 전체 가공에서 수득되었음을 확인하였다. DMO 단백질 발현 수준, 디캄바 손상, 및 APG6-DMO 및 최적화된 APG6-DMO 아미노-말단 가공은 APG6 및 최적화된 APG6 둘 다가 DMO에 작동가능하게 연결된 경우 디캄바에 대해 내성을 제공하며 CTP 둘 다는 식물 속에서 완전히 가공됨을 나타내었다. 데이터는 표 11에 제공된다.
Figure pct00011
실시예 6: 형질 전환 옥수수에서 CTP - PPO 발현
PPO 제초제에 대해 내성인 신규한 PPO를 제초제 박테리아 스크리닝 시스템을 사용하여 확인하였다. 당해 스크리닝 시스템을 PPO 제초제가 들어있는 LB 액체 배지 속에서 녹아웃 대장균 균주의 생장 검정에 사용하여, PPO 제초제에 대해 비감수성인 PPO를 확인하였다.
녹아웃 대장균 균주를 확인된 PPO 활성을 포함하는 박테리아 발현 벡터로 형질 전환시키고, LB 액체 배지 속에서 배양하였다. 3개의 상이한 PPO 화학 서브클래스를 나타내는, 5개의 상이한 PPO 제초제(악시플루오르펜(1 mM), 플루미옥사진(0.5 mM), 락토펜(0.5 mM), 포메사펜(1 mM), 및 S-3100(100 μM) 중 하나의 정제된 결정형을 배지에 첨가하였다. 재조합 단백질을 발현시키고, 이 콜라이 생장률을 측정하였다. 생장 곡선(OD600)을 0 내지 24시간까지의 선택된 시점에서 PPO 제초제의 존재 및 부재 하에서 상이한 변이체에 대해 측정하였다. PPO 제초제의 존재하에서 LB 배지 속에서 형질 전환된 녹아웃 대장균 균주의 생장은, 대장균을 형질 전환하는데 사용된 유전자가 제초제-비감수성 프로토포르피리노겐 옥시다제 (iPPO)를 인코딩하였음을 나타내었다.
서열번호 40-49로서 제공된 10개의 PPO는, PPO 제초제가 존재하는 LB 배지 속에서 녹아웃 대장균 균주에서 모두 정상의 생장률을 부여하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이들 단백질이 제초제-비감수성 프로토포르피리노겐 옥시다제 (iPPO)임을 나타낸다. WH_PPO (서열번호 60)를 발현하는 녹아웃 대장균 균주는 모두 5개의 PPO 제초제에 대해 감수성이었으며, 당해 검정이 각각의 제초제에 대해 감수성과 비감수성인 PPO를 구별할 수 있음을 확인하였다.
4개의 식물 형질 전환 벡터를 식물속에서 PPO H_N10 (서열번호 43)을 발현하기 위해 생성시켰다. 형질 전환 작제물 1 및 11은 동일한 프로모터 플러스 리더 플러스 인트론 조합, 동일한 3'UTR 서열, 동일한 PPO H_N10 (서열번호 43)을 가졌으나, CTP 서열에서 상이하였고, 대두의 형질 전환시 사용되었다. 형질 전환 작제물 6 및 16은 동일한 프로모터 플러스 리더 플러스 인트론 조합, 동일한 3'UTR 서열, 동일한 PPO H_N10 (서열번호 43)을 가졌으나, CTP 서열에서 상이하였고, 옥수수의 형질 전환에 사용되었다. 표 12는 PPO H_N10 식물 형질 전환 작제물에서 구조를 제공한다.
Figure pct00012
PPO 효소를 형질 전환 옥수수 식물에서 발현시키고, 형질전환 식물을 PPO 제초제 내성에 대해 분석하였다. 서열번호 40-59로서 제공된 PPO 효소 중 하나를 인코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 식물 형질 전환 벡터를 작제하였다. PPO 효소를 인코딩하는 DNA 서열은 5' 말단에서, 시작 코돈으로서 통상적으로 공지된 메티오닌에 대한 코돈을 포함할 수 있거나, 또는 당해 코돈을 제거하여 엽록체 수송 펩타이드 서열의 코딩 서열의 5' 말단로의 작동가능한 연결을 용이하게 할 수 있다. 아미노-말단에서 메티오닌을 포함하는 PPO 효소 단백질 서열의 예는, 서열번호 40-49로서 제공된다. 아미노-말단에서 메티오닌이 없는 PPO 효소 단백질 서열의 예는 서열번호 50-59로서 제공된다. 식물 형질 전환을 위하여, 추정된 PPO 효소를 엔코딩하는 핵산 서열은 쌍떡잎식물 또는 외떡잎식물 발현 중 어느 하나를 위해 최적화된 코돈이다. 표 2는 형질 전환 벡터 내에서 PPO 효소의 단백질 및 핵산 서열에 상응하는 서열번호를 제공한다.
식물 시험에서 옥수수의 경우, 옥수수(LH244)를 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 표준 당해 분야에서 공지된 방법으로 형질 전환시켰다. 두 개의 작제물 구성들 중 하나에서 H_N10(서열번호 43)을 발현시키는 단일 카피 R0 식물을 이종 교배시키는 것으로부터 생산된 형질전환 F1 식물을, 제초제 내성에 대해 온실에서 시험하였다. 식물을 V3 생장 단계에서 40 그램/ha S-3100으로 처리하고, 처리한 지 7일 후에 손상 등급을 받았다. PPO H_N10 (서열번호43))에 작동가능하게 연결된 작제물 6 구조 (APG6 (서열번호 1)에서 H_N10 (서열번호 43)을 발현하는 형질 전환 옥수수 식물은, 18개 사건 중 13개에서 고도로 내성인 식물 (10% 이하 손상)을 생산하였으나, PPO H_N10 (서열번호 43))에 작동가능하게 연결된 작제물 16 구조 (12G088600TP (서열번호 38)는 고도로 내성인 식물을 생산하는 사건이 없었다.
두 개의 작제물 구성(작제물 6 및 16) 중 하나에서 H_N10(서열번호 43)을 발현시키는 단일 카피체 R0 식물을 이종 교배하는 것으로부터 생산된 형질전환 F1 식물을, 제초제 내성에 대한 분야에서 시험하였다. 이러한 F1 집단을 분리하였고(50% 반접합체 및 50% 무형질(null)), 손상 등급화 이전에는 형질전환 식물을 위한 선택을 수행하지 않았다. 이러한 집단에 대한 전체 평균 손상 등급화를 균일 형질전환 집단 보다 더욱 높은 것으로 예상되는데, 왜냐하면, 형질전환 식물로부터 비-형질전환 식물을 식별하기가 어렵기 때문이다. 시험을 2회의 반복 및 작제물당 3회 처리로 2개의 위치에서 수행하였다. 비-형질전환 옥수수 식물을 음성 대조군으로서 사용하였다. 제초제 적용 처리는 하기와 같다: 처리 1은 V2 이후 (fb) V4 fb V8에서 적용된 0.036 lb ai/acre S-3100이었고; 처리 2는: V2 fb V4 fb V8에서 적용된 0.072 lb ai/acre S-3100이었으며; 처리 3은: V2 fb V4 fb V8에서 적용된 0.144 lb ai/acre S-3100이었다. 작물 손상 백분율 등급을 처리한 지 5 내지 7일 후에 V2 생장 단계(CIPV2) 및 V4 생장 단계(CIPV4)에서 평가하였다 [오류(error) V2 및 오류 V4는 최소 유의성 차이]의 절반이다. 작물 손상 등급은 두 위치 모두에 대해 합산되었다. 모든 비-형질전환 식물 및 작제물 16 (PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 12G088600TP (서열번호 38))을 사용하여 생성된 사건을 지닌 식물은, 각각 3회 처리의 경우, V2 및 V4 제초제 둘 다의 적용 후 94.6- 99.5% 손상을 나타내었다. 작제물 6 (PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1))을 사용하여 생성된 사건을 지닌 식물은, V2 제초제 적용 후 단지 30% 내지 50% 손상을 나타내었으며, V4 제초제 적용 후에는 손상이 없었다. 데이터는 표 13에 제공된다.
Figure pct00013
F1 형질 전환 옥수수 온실 및 필드 데이터는, PPO H_N10(서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)가 PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 12G088600TP (서열번호 38)가 형질전환 식물에서 발현되는 경우의 손상율과 비교하여, 형질전환 식물에서 발현된 경우 감소된 손상율을 얻었음을 입증하였다. 도 1을 참조한다.
식물 형질 전환 벡터를 식물 속에서 APG6 (서열번호 1), CTP D, 또는 CTP E에 작동가능하게 연결된 PPO H_N40 (서열번호 54) 또는 PPO H_N90 (서열번호 50)을 발현시키기 위해 생성하였다. 옥수수 (01DKD2)를 아그로박테리움 투메파시엔스 및 당해 분야에서 공지된 표준 방법을 사용하여 형질 전환시켰다. 수득된 R0 식물로부터 취한 잎 샘플을 PCR로 분석하여 형질전환 유전자 삽입물의 복제수를 측정하였다. 특유의 형질 전환 사건을 각각 포함하는 R0 식물에, 40 g ai/ha 또는 80 g ai/ha의 S-3100를 대략 V5 생장 단계에서 분무하고, 처리 4-7일 후 손상 등급을 취하였다. 분무된 식물의 총 수의 ≤ 10% 손상(고도로 내성) 또는 ≤ 20% 손상(내성)인 식물의 수를 기록하였다. ≤ 20% 손상에서 분무를 통과한 단일 카피 사건인 것으로 결정된 식물을, 자가수정 및 이중교배에 진전시켰다. 데이터는 표 14에 나타낸다.
Figure pct00014
결과는 APG6(서열번호 1)가 H_N40 (서열번호 54) 또는 H_N90 (서열번호 50)에 작동가능하게 연결되는 경우 CTP D 또는 CTP E로 형질 전환된 식물과 비교하여 더 높은 제초제 내성을 일관되게 생산함을 나타낸다. APG6는 H_N40에 작동가능하게 연결되는 경우 80 g ai/ha에서 S-3100에 대해, 고도로 내성인 21.4% 내지 40.2%의 형질전환 식물, 및 내성인 41.1% 내지 58.9%의 형질전환 식물을 수득하였다. APG6는 H_N90에 작동가능하게 연결된 경우 40 g ai/ha에서 S-3100에 대해, 고도로 내성인 49.1%의 형질전환 식물, 및 내성인 56.3%의 형질전환 식물을 수득하였다. CTP D는 H_N40에 작동가능하게 연결된 경우 80 g ai/ha에서 S-3100에 대해, 고도로 내성인 0%의 형질전환 식물, 및 내성인 2.2%의 형질전환 식물을 수득하였다. CTP E는 H_N40에 작동가능하게 연결된 경우 40 g ai/ha에서 S-3100에 대해, 고도로 내성인 0% 내지 8%의 형질전환 식물, 및 내성인 12.9% 내지 32.1%의 형질전환 식물을 수득하였다.
PPO H_N10에 작동가능하게 연결된 APG6를 발현하는 형질 전환 F1 하이브리드 옥수수를 상이한 7개의 상이한 PPO 제초제에 대한 내성을 평가하였다: S-3100, 포메사펜, 악시플루오르펜, 락토펜, 플루미옥사진, 설펜트라존, 및 사플루페나실.5개의 특유의 사건을 나타내는 풀링된 종자를 음성 대조군으로서 하이브리드 옥수수 종자와 함께 온실 속에서 화분에 식재하였다.
발아전 제초제 내성을 시험하기 위해, PPO 제초제를 아래와 같이 처리 당 6회의 반복물을 사용하여 2개 비율 중 1개에 개별적으로 적용하였다: S-3100 (80 또는 160 g ai/ha), 포메사펜 (Reflex®, 840 또는 1680 g ai/ha), 플루미옥사진 (Valor® SX, 210 또는 420 g ai/ha), 설펜트라존(스파르탄® 4L, 840 또는 1680 g ai/ha), 및 사플루페나실(Sharpen®, 200 또는 400 g ai/ha). 식물을 처리 후 20일째에 작물 손상의 백분율에 대해 평가하고, 옥수수 종자를 음성 대조군으로서 포함시켰다. PPO H_N10에 작동가능하게 연결된 APG6을 지닌 형질전환 식물은 발아전 적용된 상이한 PPO 제초제에 대해 0% 내지 5.8% 범위의 손상 등급을 가졌으며, 이는 PPO H_N10에 작동가능하게 연결된 APG6가 모든 5개의 PPO 제초제에 대한 제초제 비율 둘 다에서 옥수수에게 탁월한 발아전 내성을 제공하였음을 나타낸다. 음성 대조군 옥수수 식물은 17.5% 내지 94.2% 범위의 손상 등급을 가졌으며, 사플루페나실은 예외인데, 이는 당해 제초제가 종래의 옥수수 식물에서 사용되기 위해 시판된 것이기 때문인 것으로 예측된다. 데이터는 표 15에 +/-로 나타낸 표준 오차와 함께 나타낸다.
Figure pct00015
발아 후(V3 내지 V4) 제초제 내성에 대해 시험하기 위해, PPO 제초제를 아래와 같이 처리당 6개의 반복물을 사용하여 3개 비율 중 하나에서 개별적으로 적용하였다: S-3100(40, 80, 또는 160 g ai/ha), 포메사펜(Reflex®, 420, 840, 또는 1680 g ai/ha), 악시플루오르펜(Ultra Blazer®, 420, 840, 또는 1680 g ai/ha), 락토펜(Cobra®, 220, 440, 또는 880 g ai/ha), 플루미옥사진(Valor® SX, 105, 210, 또는 420 g ai/ha), 설펜트라존(스파르탄® 4L, 420, 840, 또는 1680 g ai/ha), 및 사플루페나실(Sharpen®, 100, 200, 또는 400 g ai/ha). 식물을 처리 후 14일째에 작물 손상의 백분율에 대해 평가하고, 종래의 하이브리드 옥수수 종자를 음성 대조군으로 포함시켰다. PPO H_N10에 작동가능하게 연결된 APG6을 지닌 형질전환 식물은, 발아 후 적용된 상이한 PPO 제초제에 대해 0.5% 내지 5.8% 범위의 손상 등급을 가졌으며, 예외로 포메사펜은 1680 g ai/ha에서 손상 등급이 13.8%이었고, 이는 PPO H_N10에 작동가능하게 연결된 APG6이 모든 7개의 PPO 제초제에 대해 모든 제초제 비율에서 옥수수에 대해 탁월한 발아 후 내성을 제공하였음을 나타낸다. 음성 대조군 옥수수 식물은 36.7% 내지 100% 범위의 손상 등급을 가졌다. 데이터는 표 16에 +/-로 나타낸 표준 오차와 함께 나타낸다.
Figure pct00016
실시예 7: 형질 전환 대두에서의 CTP - PPO 발현
상이한 CTP에 작동가능하게 연결된 PPO 효소를 형질 전환 대두 식물에서 발현시키고, 형질전환 식물을 PPO 제초제 내성에 대해 분석하였다.
식물 형질 전환 벡터를 식물 속에서 PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 12G088600TP (서열번호 38) 또는 PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)을 발현시키기 위해 생성시켰다. 대두 A3555를 이들 식물 형질 전환 벡터 및 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 당해 분야에서 공지된 표준 방법으로 형질 전환시켰다. 재생된 R0 형질전환 식물체를 온실 속에서 생장시키고, 자가수분하고, R1 종자를 수집하였다. 형질 전환 R1 식물에 온실 속에서 V4 및 R1에서 적용된 3개의 제초제 처리 중 하나로 분무하였다: (1) 5 그램의 ai/ha S-3100, (2) 10 그램의 ai/ha S-3100, 또는 (3) 30 그램의 ai/ha S-3100.작물 손상 등급을 처리 후 10일째에 평가하였다. PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)을 발현하는 형질전환 식물은, 5, 10, 및 30 g ai/ha 비율 각각에서, V4 단계에서 4.2%, 7.8%, 및 9.4%의 손상 등급 및 R1 단계에서 3%, 6.5%, 내지 15.7%의 손상 등급을 가졌다. PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 12G088600TP (서열번호 38)를 발현하는 형질전환 식물은, 5, 10, 및 30 g ai/ha 비율에서 각각 82.7%, 92.7%, 내지 98.2%의 평균 손상 등급을 가졌으며, R1 단계에서의 등급에서 생존하지 않았다. 음성 대조군 식물은 5, 10, 및 30 g ai/ha 등급 각각에서 89%, 98%, 및 100%의 유사한 평균 손상 등급을 가졌으며, R1 단계에서의 등급에서 생존하지 않았다. 데이터는 표 17에 제공된다.
Figure pct00017
식물 형질 전환 벡터를 식물 속에서 3개의 상이한 CTP, APG6 (서열번호 1) CTP F, 및 CTP H 중 하나에 작동가능하게 연결된 PPO H_N90 (서열번호 47)을 발현시키기 위해 생성시켰다. 대두 A3555를 이들 식물 형질 전환 벡터 및 아그로박테리움 투메파시엔 스를 사용하여 당해 분야에서 공지된 표준 방법으로 형질 전환시켰다. 재생된 R0 형질전환 식물체를 온실 속에서 생장시키고, 수득한 R0 식물로부터 취한 잎 샘플을 PCR로 분석하여 사건의 단일 카피를 포함하는 식물을 확인하였다. 특유의 사건을 각각 나타내는 형질 전환 단일 카피 R0 식물에 온실 속에서 대략 V3 단계에서 적용된 제초제 처리를 사용하여 20 g ai/ha S-3100을 분무하였다. 손상 등급을 처리 후 14 일째에 고도로 내성(≤ 10% 손상) 또는 내성(≤ 20% 손상)으로 고려되는 수치로 취하였다. PPO H_N90 (서열번호 47)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)을 발현하는 형질전환 식물은, 고도로 내성인 21.4%의 특유의 사건, 및 내성인 57.1%의 사건을 수득하였다. PPO H_N90 (서열번호 47)에 작동가능하게 연결된 CTP F를 발현하는 형질전환 식물은, 고도로 내성인 11.7%의 특유의 사건, 및 내성인 41.1%의 특유의 사건을 수득하였다. PPO H_N90 PPO H_N90 (서열번호 47)에 작동가능하게 연결된 CTP H를 발현하는 형질전환 식물은, 고도로 내성이거나 내성인 특유의 사건이 없었다. 데이터는 표 18에 나타낸다.
Figure pct00018
당해 데이터는 PPO 효소에 작동가능하게 연결된 특이적인 CTP가 제초제 내성을 달성하는데 중요하며, 따라서 CTP 선택 및 제초제 내성 형질전환 식물을 생산하는데 사용하기 위한 다른 CTP와 비교한 APG6 CTP의 예기치 못한 우월성의 중요성을 나타냄을 입증하였다.
실시예 8: 형질 전환 목화에서의 CTP - PPO 발현
식물 형질 전환 벡터를 형질 전환 목화 식물에서 PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)을 발현하기 위해 생성시키고, 형질전환 식물을 PPO 제초제 내성에 대해 분석하였다. 목화 DP393을 식물 형질 전환 벡터 및 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 당해 분야에서 공지된 표준 방법으로 형질 전환시켰다. 재생된 R0 형질전환 식물체를 온실 속에서 생장시키고, 수득한 R0 식물로부터 취한 잎 샘플을 PCR로 분석하여 사건의 단일 카피를 포함하는 식물을 확인하였다. 특유의 사건을 각각 나타내는 형질 전환 단일 카피 R0 식물에 온실 속에서 V2 단계에서 적용된 S-3100의 제초제 처리 20 g ai/ha를 분무하였다. 추가로, 형질 전환 멀티-카피 (≥ 2개 복사/식물)에 온실 속에서 V2 단계에서 적용된 S-3100의 제초제 처리 20 g ai/ha를 분무하였다. 손상 등급을 처리 후 3일째에 취하였다.
음성 대조군, 목화 DP393은 20 g ai/ha의 S-3100을 사용한 제초제 처리 후 3일째에 100% 손상을 가졌다. 그에 반해서, 21개의 단일 카피 R0 식물은 26.7%의 평균 손상을 가졌다. 21개의 단일 카피 R0 식물에 대한 손상 분포는 다음과 같았다: 손상이 없는 3개의 식물; 10% 손상된 3개의 식물; 15% 손상된 3개의 식물; 20% 손상된 2개의 식물; 30% 손상된 7개의 식물; 및 40% 손상된 3개의 식물. 멀티-카피 R0 식물의 경우, 14개의 식물에게 제초제 처리를 제공하였으며 평균 손상은 10.4%이었다. 14개의 멀티-카피 식물의 손상 분포는 다음과 같았다; 손상이 없는 5개의 식물; 5% 손상된 3개의 식물; 10% 손상된 1개의 식물; 15% 손상된 2개의 식물; 20% 손상된 1개의 식물; 30% 손상된 1개의 식물; 및 40% 손상된 1개의 식물. 당해 데이터는 PPO H_N10 (서열번호 43)에 작동가능하게 연결된 APG6 (서열번호 1)을 발현하는 R0 형질 전환 목화가 V2 단계에서 적용된 20 g ai/ha에서 제초제 S-3100에 대해 내성을 가졌음을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR EFFICIENT TARGETING OF TRANSGENES <130> MONS:389wo <150> US 62/270,180 <151> 2015-12-21 <150> US 62/364,715 <151> 2016-07-20 <160> 102 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 68 <212> PRT <213> Arabidopsis thalinana <400> 1 Met Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Ser Gly Val Val 1 5 10 15 Ser Val Gly Thr Glu Thr Arg Arg Ile Tyr Ser Phe Ser His Leu Gln 20 25 30 Pro Ser Ala Ala Phe Pro Ala Lys Pro Ser Ser Phe Lys Ser Leu Lys 35 40 45 Leu Lys Gln Ser Ala Arg Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Arg Pro Phe 50 55 60 Val Val Arg Cys 65 <210> 2 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 2 Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Ser Gly Val Val 1 5 10 15 Ser Val Gly Thr Glu Thr Arg Arg Ile Tyr Ser Phe Ser His Leu Gln 20 25 30 Pro Ser Ala Ala Phe Pro Ala Lys Pro Ser Ser Phe Lys Ser Leu Lys 35 40 45 Leu Lys Gln Ser Ala Arg Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Arg Pro Phe 50 55 60 Val Val Arg Cys 65 <210> 3 <211> 61 <212> PRT <213> Arabidopsis thalinana <400> 3 Met Ala Pro Ala Leu Ser Arg Ser Leu Tyr Thr Ser Pro Leu Thr Ser 1 5 10 15 Val Pro Ile Thr Pro Val Ser Ser Arg Leu Ser His Leu Arg Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Arg Thr Gly Val Ser Cys Ser Trp 35 40 45 Asn Leu Glu Lys Arg Cys Asn Arg Phe Ala Val Lys Cys 50 55 60 <210> 4 <211> 72 <212> PRT <213> Petunia hybrida <400> 4 Met Ala Gln Ile Asn Asn Met Ala Gln Gly Ile Gln Thr Leu Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gln Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu 20 25 30 Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val 35 40 45 Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gln Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile 50 55 60 Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Cys 65 70 <210> 5 <211> 57 <212> PRT <213> Pisum sativum <400> 5 Met Ala Ser Met Ile Ser Ser Ser Ala Val Thr Thr Val Ser Arg Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Ser Ala Ala Met Ala Pro Phe Gly Gly Leu Lys Ser 20 25 30 Met Thr Gly Phe Pro Val Arg Lys Val Asn Thr Asp Ile Thr Ser Ile 35 40 45 Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys 50 55 <210> 6 <211> 77 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 6 Met Ala Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe 1 5 10 15 Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe 20 25 30 Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu 35 40 45 Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val 50 55 60 Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Cys 65 70 75 <210> 7 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 7 atggccaccg ccaccactac cgccaccgct gcgttctccg gcgtggtgag cgtcggcact 60 gagacgcgca ggatctactc cttcagccac ctccagcctt ctgctgcgtt ccccgctaag 120 ccgtcttcgt tcaagagcct gaagctgaaa cagtccgcac gccttacccg gcgcctggac 180 cataggccat tcgttgtcag gtgc 204 <210> 8 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 8 atggcgacgg ctacgacgac tgctacggcg gcgtttagtg gtgtagtcag tgtaggaacg 60 gagactcgaa ggatttattc gttttctcat cttcaacctt ctgcggcttt tccggcgaag 120 cctagttcct tcaaatctct caaattaaag cagagcgcga ggctcacacg gcggcttgat 180 catcggccgt tcgttgtccg atgt 204 <210> 9 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 9 atggctactg ctactaccac agctaccgct gcattctctg gtgttgtgag tgttggaacc 60 gagacacgta gaatttactc tttctcacac ttgcaaccta gcgcagcctt ccctgccaag 120 ccatcatcct ttaagtcctt gaagctgaaa cagtcggcga ggcttacgag gcgcctcgat 180 catagaccct ttgtggtccg atgc 204 <210> 10 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 10 atggcaaccg cgactaccac cgcaacggca gctttctccg gggtagtttc agtcgggacg 60 gaaacccgca ggatctattc gttcagccat ttgcaacctt ccgcggcctt tcccgccaaa 120 ccctcgtctt ttaaatcgct gaaactcaaa cagtcagcac ggttgacccg aagattggac 180 caccgcccat ttgtagtgag gtgc 204 <210> 11 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 11 atggccacgg ccacgaccac ggcaacagcg gccttttcgg gcgttgtatc cgtcgggaca 60 gaaaccagac gcatatatag cttctcacac ctgcaaccta gtgccgcttt 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ctggaacctg gagaagcgct gcaaccgctt cgccgtgaag 180 tgc 183 <210> 15 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 15 atggcccaga tcaacaacat ggcccagggc atccagaccc tgaaccctaa ctctaacttc 60 cacaagccgc aagtgcccaa gtctagctcc ttcctcgtgt tcggctccaa gaagctcaag 120 aatagcgcca attccatgct ggtcctgaag aaagactcga tcttcatgca gaagttctgc 180 tcctttcgca tcagtgcttc ggttgcgact gcctgc 216 <210> 16 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 16 atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc tagggggcaa 60 tccgccgcaa tggctccatt cggcggcctc aaatccatga ctggattccc agtgaggaag 120 gtcaacactg acattacttc cattacaagc aatggtggaa gagtaaagtg c 171 <210> 17 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 17 atggcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60 aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120 gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180 cagcggtcgg 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720 aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780 tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840 gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900 atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960 gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020 tga 1023 <210> 29 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 29 atgaccttcg tccgcaatgc ctggtatgtg gcggcgctgc ccgaggaact gtccgaaaag 60 ccgctcggcc ggacgattct cgacacaccg ctcgcgctct accgccagcc cgacggtgtg 120 gtcgcggcgc tgctcgacat ctgtccgcac cgcttcgcgc cgctgagcga cggcatcctc 180 gtcaacggcc atctccaatg cccctatcac gggctggaat tcgatggcgg cgggcagtgc 240 gtccataacc cgcacggcaa tggcgcccgc ccggcttcgc tcaacgtccg ctccttcccg 300 gtggtggagc gcgacgcgct gatctggatc tggcccggcg atccggcgct ggccgatcct 360 ggggcgatcc ccgacttcgg ctgccgcgtc gatcccgcct atcggaccgt cggcggctat 420 gggcatgtcg actgcaacta caagctgctg gtcgacaacc tgatggacct 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gcagcgcgtg 240 agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300 aacgcgtata ccgtgaaatt tctggcgcag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360 tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagttt 420 attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat gcgagcaaag aagtggaata taccgattgg 480 cagcaggtgc agcgctttgc gcgcgatttt gcgcagctgc cgggcaaaag ctat 534 <210> 63 <211> 531 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 63 atgaaagcgc tgattctgta tagcacccgc gatggccaga cccgcaaaat tgcgagcagc 60 attgcggatg tgattcgcca gcagcagcag tgcgatgtgc tgaacattaa agatgcgagc 120 ctgccggatt gggcgcagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180 tttcagccgg tggtggataa atttgtgaaa cagcatctgc atgaactgca gcagcgcacc 240 agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300 aacgcgtata cccagaaatt tctggcgcat agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360 tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg 420 attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcaccaaag aagtggaata 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<400> 68 atgaaagcgc tgattctgtt tagcagccgc gatggccaga cccagctgat tgcgagcagc 60 attgcgaaag aactggaagg caaacaggcg tgcgatgtgc tgaacattct ggataccacc 120 aacgtggaat ggacccagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180 tttcatccgg cggtggcgga atttgtgaaa cgccatcagc gcgaactgca gcagcgcagc 240 agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300 aacgcgtata ccgcgaaatt tctgaaccag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360 tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggtttg atcgcattat gattcagctg 420 attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcagcaaag aagtggaata taccgattgg 480 cagcaggtga cccgctttgc gcaggaattt gcgcgcctgc cgggcaaaac cagc 534 <210> 69 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 69 atgaaaaccc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccgcgaaat tgcggcgttt 60 ctggcgagcg aactgaaaga acagggcatt tatgcggatg tgattaacct gaaccgcacc 120 gaagaaattg cgtggcagga atatgatcgc gtggtgattg gcgcgagcat tcgctatggc 180 cattttcatc cggcggtgga tcgctttgtg aaaaaacata ccgaaaccct gaacagcctg 240 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537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 89 aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc 60 gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac 120 gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga atattcgtta cggccacttc 180 aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc 240 gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac 300 ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc 360 gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata 420 atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag 480 caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatcgt acaagaaggc cctctag 537 <210> 90 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 90 aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc 60 gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac 120 gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga gtattcgtta cggccacttc 180 aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc 240 gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac 300 ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc 360 gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata 420 atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag 480 caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatagt acaagaaggc cctctag 537 <210> 91 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 91 aaggccttga tcctgttctc tacacgcgac ggacagacac agaagatcgc atctgccatc 60 gctgatgaga taaaggggca gcaatcgtgc gacgtgatta acatacagga tgccaaaacc 120 ctcgactggc agcagtacga ccgggtactc atcggcgcct ccattcgtta cgggcatttc 180 cagcccgttg tgaatgagtt tgtcaagcac aacctcttgg ccctacagca gagagtttcc 240 ggattcttct ccgtgaactt gacagcccga aagccagaga agcggagccc cgagactaac 300 gcttatacag tcaaattctt ggcgcagtca ccctggcaac cggactgctg cgctgttttt 360 gcgggggccc tgtactaccc acggtaccgg tggttcgata gggtgatgat acagttcata 420 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cgcctcttac 60 atcgcgtcct gtatgaagga gaaggccgag tgcgacgtca tcgatctcac gcacggggag 120 cacgtgaatc ttacgcagta cgaccaagtg ctgataggcg cctctatccg ttacggccat 180 tttaacgccg tcctcgacaa attcatcaag cgcaatgtag accagctgaa caacatgccc 240 tccgcgttct tttgcgtgaa cctgacggct cggaagcctg agaagcgaac acctcagacc 300 aacccatacg tgcggaaatt cctactcgca acgccatggc agcccgccct gtgcggggtt 360 ttcgcagggg cgctacgcta tccgcgttac cgctggatcg ataaggtgat gatccagcta 420 ataatgcgca tgaccggcgg cgagacagac acatcgaagg aagtcgaata cacagactgg 480 gaacaggtga agaagtttgc agaggatttc gccaagctct catacaaaaa ggcattgtga 540 <210> 94 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 94 atgaaggcgc ttatactgtt ctcgacacgc gacggtcaga cgcagaaaat cgcctcagcc 60 atcgccgacg agatcaaggg ccagcagagc tgcgatgtga tcaatattca ggacgccaaa 120 actctcgact ggcagcagta tgaccgcgtg ctcattggcg catcaatccg ctacgggcat 180 ttccagccag tcgtcaatga gtttgtgaaa cataacctct tggcattgca gcagcgggtg 240 tctggcttct tctccgtgaa ccttacagct agaaaaccag agaagcggtc gcccgagact 300 aacgcctaca ccgttaagtt ccttgcgcag tcaccgtggc agcctgattg ctgcgcggtc 360 ttcgccgggg cactgtacta ccctcgatac cggtggtttg atagggtaat gatccagttc 420 ataatgcgca tgaccggtgg ggagaccgac gcaagtaaag aagttgagta cacggattgg 480 cagcaggtgc aaaggttcgc acgcgacttc gcgcagctcc cgggcaagtc ttactga 537 <210> 95 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 95 atgaaagccc tgatcctcta ttccaccagg gacggccaga cccgcaagat agcctcctcc 60 atcgctgatg tcatccgcca gcagcagcag tgcgacgttt taaacattaa ggacgcttca 120 ctgcctgatt gggcccagta tgaccgcgtc ctgatcggcg cgtcgattcg gtacggccac 180 ttccagcctg tggttgacaa gttcgtcaag cagcacctgc atgagctgca gcagcgaact 240 agcgggttct tcagtgtgaa cctgacagct agaaagcccg aaaagagatc cccagaaacc 300 aacgcctata cgcagaaatt ccttgctcac tcaccctggc agcctgactg ttgtgccgtc 360 ttcgcgggcg ccttgtacta tccccgctac cgctggttcg atagggtgat gatccagctg 420 attatgagaa tgacgggagg ggagaccgat tcgaccaagg aggtagagta cactgactgg 480 caacaggtgt caactttcgc aaacgacttc gcacaactac ccggtaagtc ttga 534 <210> 96 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 96 atgaaaaccc taatactgtt ctcgacccgc gacggccaga cgcgtgagat tgcgagctac 60 ctggcctccg agctcaagga gctggggatc caagccgatg tcgcgaacgt gcaccgcatt 120 gaggagccgc agtgggagaa ttacgatcgc gttgtgatag gggccagcat ccgctatggc 180 cactaccact cggcctttca ggagtttgta aagaaacacg ccacaagatt aaactccatg 240 cctagcgcct tctactccgt caaccttgtc gcgcgcaagc cggagaagcg gacacctcag 300 acgaactcct acgcgcggaa gttcctgatg aacagccagt ggcggccgga cagatgtgct 360 gttattgcgg gagccctgag atacccgagg taccggtggt acgataggtt tatgattaaa 420 cttattatga agatgtctgg tggggagact gacaccagga aggaggtggt atatacagac 480 tgggagcagg tcgccaattt cgctcgggaa atcgcgcatc tgacagacaa gcctacactg 540 aagtag 546 <210> 97 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 97 atgaaggccc tgatcctctt tagctctagg gagggccaga cccgcgagat cgcgtcatat 60 atcgcgaatt ccataaagga ggagatggag tgcgatgtgt ttaacatcct tagggtggag 120 caaatagact ggtctcagta tgaccgtgtg ctcatagggg ggagcatcca ctacggccac 180 tttcacccgg ccgtggcgaa attcgtcaag cgacacctcc acgagcttca gcagcgctcc 240 tcagggttct tctgcgtcaa cctgacagca agaaaggcag ataaacgcac cccgcagacg 300 aacgcctaca tgaggaagtt ccttctgcag tctccttggc agcccgattg ctgcgcggtg 360 ttcgccggtg cactgcgcta tacgcgctat agatggtttg atagagtcat gattcagctc 420 atcatgcgga tgaccggcgg ggaaacggat actagtaagg aggtggagta cacggactgg 480 acccaggtgg cacgtttcgc ccaggagttt gcacatcttc ctgggaagac ccaatga 537 <210> 98 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 98 atgaaggcgc taattgtgtt cagctccagg gatggccaga cgagggctat agcatcctat 60 atcgccaata ccttgaaagg aacgctcgag tgtgacgtgg tcaacgtctt gaacgccaat 120 gacattgacc tttcccagta cgaccgagtt gccataggcg cgtcgatccg ctacgggcga 180 tttcaccctg cagtcaacca gtttatacgg aagcatttga cctcgctgca gcagctcccg 240 tcagccttct tctctgtgaa tttaaccgcg cggaagcctg agaaacggac gatccaaaca 300 aacgcctata cccgaaagtt cctcctgaac agcccatggc agccagacct gtgctgtgtc 360 ttcgccggcg cgttgcggta tccccgctac aggtggttcg atagagtgat gatccagctc 420 atcatgagga tcaccggggg agagaccgat agtaccaagg agatcgagta cacggactgg 480 cagcaggtgg ctcgcttcgc ccaggacttc gctcagttgg ccgcaaagaa tccagcataa 540 <210> 99 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 99 atgaagacac tgatcctgtt ctcgactcga gatggccaga ctcataaaat tgcgcgccac 60 attgcggggg tcctggagga gcagggcaaa gcgtgcgagc tcgtggactt actccagccc 120 ggggagccgg actggagcac ggtggagtgc gtcgttctgg gcgcttccat acgttacggg 180 catttccaca aaagtttcat ccggttcgtc aacacccacg ctcaacggct gaacaacatg 240 cctggcgcgc tattcactgt taacttagtg gctcgtaagc ccgagaagca gtctccgcag 300 actaactcct acacaaggaa atttctagca gcaagcccat ggcaaccgca gcggtgccag 360 gtgttcgctg gagctctgcg ctatcctagg tacagttggt acgacagaat gatgatacgg 420 ttgattatga agatggcagg cggggagacg gacaccagga aagaggtcga atacactgac 480 tggcaatcag tcactcggtt tgctagagag atcgcgcaat taccaggtga gacgcggtaa 540 <210> 100 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 100 atgaaggctc tcatactgtt cagctcgaga gacgggcaga cccagctgat cgcctcctcc 60 atagcaaagg agctagaggg caagcaagcc tgcgacgtgc tcaatattct cgacacaacc 120 aacgtggagt ggactcagta cgacagagtc ctaatcggcg cgtccatcag atacggccac 180 ttccatcccg ccgtcgctga attcgtgaaa cgccaccagc gtgagctcca gcagcgcagc 240 agcggcttct tcagcgtgaa tcttactgcg agaaagccgg aaaagcggag tcccgagact 300 aacgcttata cggcaaagtt cctcaaccaa tctccctggc aaccagactg ctgtgccgtg 360 ttcgctgggg cactgaggta tccgcgctat cggtggttcg atagaatcat gatacagctg 420 ataatgcgta tgactggtgg ggagacggat tccagtaaag aggtagagta tactgattgg 480 cagcaggtca ctaggttcgc gcaggagttt gctaggctgc cgggcaagac atcctga 537 <210> 101 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 101 atgaaaacct taatcttgtt cagcacccgc gacggccaga cgcgtgaaat cgcagcgttc 60 ctcgcttcgg agctcaagga acagggaatt tacgccgacg tcattaacct aaaccgtacc 120 gaagagattg cgtggcagga gtatgaccgc gtggtgattg gcgcttctat ccgctatggc 180 cacttccacc cggctgttga ccggttcgtg aagaagcaca cggagacctt gaactcactg 240 ccgggggcat tctttagcgt aaatctggtg gcgcgcaagg ccgagaagcg caccccccag 300 acgaacagct acacccgcaa atttttactt aactccccat ggaaacctgc ggcctgcgca 360 gtgttcgcag gagctctccg ctatcctcgc tatcgatggt acgatcggtt catgattcgg 420 ctgattatga aaatgacggg cggcgagacg gatacgcgaa aggaagttgt ctacactgac 480 tggtcccagg tggcctcgtt tgcaagggag atcgtacagc tcactcgatc tagtaggctc 540 tga 543 <210> 102 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 102 atgaagattc tcatcttatt ttccacccga gacggccaaa cccgcgagat tgcggcgtcc 60 ctcgcctccg agttgaagga gcaggcgttt gatgtggatg tggtcaacct ccaccgcgca 120 gaaaacatag cgtgggagga gtacgatggg gtcgtcatcg gagcgtcaat ccgctacgga 180 catttccact caacgctgaa ttcatttgtg aagaagcacc aacaagcgct caagaagctg 240 cccggagcat tctacagcgt caacctcgtg gctcggaagc cggaaaagcg caccccgcaa 300 acaaacagct acacacgcaa gtttctgctc gactcgccct ggcaacccga cctgagtgcc 360 gttttcgccg gggcactgcg ctatccccgt tacaactggt acgatcgcat aatgattcga 420 ctgatcatga agattacagg cggggaaacc gatactcgga aggaggtggt gtatacagac 480 tggcagcagg ttacccactt cgcccacgag atcgtccagc tcgttcgtaa gtga 534

Claims (27)

  1. 디캄바 모노옥시게나제 (DMO) 또는 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 엽록체 수송 펩타이드(CTP)를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하고, 상기 CTP는 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CTP를 인코딩하는 상기 DNA 서열이 서열번호 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 DMO 또는 PPO가 서열번호 18-27 및 40-59로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  4. 제3항에 있어서,
    DMO 또는 PPO를 인코딩하는 상기 DNA 서열이 서열번호 28-37 및 61-102로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CTP가 DMO 단백질에 작동가능하게 연결되고, 상기 CTP가 서열번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CTP가 PPO 단백질에 작동가능하게 연결되고, 상기 CTP가 서열번호 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  7. 식물 세포 내에서 기능성인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 제1항의 DNA 분자를 포함하는 DNA 작제물.
  8. 제1항의 DNA 분자를 포함하는, 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 일부, 또는 종자.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 식물이 외떡잎식물인, 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 일부, 또는 종자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 식물이 옥수수 또는 밀 식물인, 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 일부, 또는 종자.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 식물이 쌍떡잎식물인, 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 일부, 또는 종자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 식물이 대두, 목화, 또는 브라씨카 식물인, 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 일부, 또는 종자.
  13. 이하의 단계를 포함하는, 제초제 내성 식물의 생산 방법:
    a) 식물 세포를 제7항의 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계; 및
    b)상기 DNA 작제물을 포함하는 형질전환 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 재생된 식물이 디캄바 및 PPO 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 제초제에 대해 내성인, 방법.
  15. 이하의 단계를 포함하는, 제초제 내성 식물의 생산 방법:
    a) 제1항의 DNA 분자를 포함하는 모체 식물을 자가 교배하거나 또는 제2 식물과 이종교배하여 하나 이상의 자손 식물을 생산하는 단계; 및
    b) 상기 DNA 분자를 포함하는 자손 식물을 선별하는 단계.
  16. 제15항에 있어서,
    여기서 상기 자손 식물이 디캄바 및 PPO 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 제초제에 대해 내성인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 자손 식물이 S-3100, 포메사펜, 악시플루오르펜, 락토펜, 플루미옥사진, 설펜트라존 및 사플루페나실로 이루어진 군으로부터 선택된 PPO 저해제 제초제에 대해 내성인, 방법.
  18. 제1항의 DNA 분자를 식물 세포내로 도입시키는 단계를 포함하는, 디캄바 모노옥시게나제 (DMO) 또는 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)의 발현 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 도입시키는 단계가 상기 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 이하의 단계를 포함하는, 작물 생장 환경에서 잡초 생장을 방제하는 방법:
    a) 제8항의 식물 또는 종자를 작물 생장 환경에서 식재하는 단계; 및
    b) 상기 작물 생장 환경에, 잡초 생장을 방제하는데 효과적인 양의 디캄바 또는 PPO 저해제 제초제를 적용시키는 단계.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제초제가 상기 식물 또는 종자를 손상시키지 않는, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 식물 또는 종자가 외떡잎식물 또는 종자인, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    여기서 상기 식물이 옥수수 또는 밀 식물인, 방법.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 식물 또는 종자가 쌍떡잎식물 또는 종자인, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 식물이 대두, 목화, 또는 브라씨카 식물인 방법.
  26. 제20항에 있어서,
    상기 제초제가 디캄바인 방법.
  27. 제20항에 있어서,
    상기 제초제가 PPO 저해제인 방법.
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