JP7270550B2 - 炭水化物産生植物材料 - Google Patents
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Description
本諸実施形態は、全般的には植物材料、具体的には炭水化物産生が制御された植物材料に関する。
連続的炭水化物合成は、植物の個体生育および繁殖過程での生長および生育のためのエネルギー供給を確保することによる植物の生存にとって重要である。デンプンおよびフルクタンは、多数の顕花植物においてもヒトの消費にとっても重要な2つの炭水化物である。協調的なデンプンとフルクタンの合成を理解することは、どのように植物が光合成産物を配分し生存のために様々な炭水化物合成を優先させるかを解明するのに役立つばかりでなく、食糧の安全および品質生産のための農業での穀物の改善に利益をもたらす可能性もある。2つの選択的プロモーター、1つのイントロン/エクソンを用いて、オオムギの単一の遺伝子から、配列は重複しているが、スクロース/グルコース/フルクトースシグナル伝達を介して糖を感知する際の機能が逆である2種類の転写因子を生じさせるシステムを本明細書に報告する。このシステムは、一方のプロモーターで糖制御トランス活性を感知し、他方のプロモーターでの競合的な転写因子結合による協調的なデンプンとフルクタンの合成をシステム全体として調整するのに自己調節機序を用いる。このマルチタスクシステムは、多様な用途に合わせてデンプンとフルクタンの量を調節したイネ科草本の形質の育種に利用できる。異なる機能を有するタンパク質が生じる、ホスト遺伝子中のイントロン/エクソンにまたがるプロモーターの発見が、植物ゲノムの複雑性に寄与する。
デンプンとフルクタンの合成は異なる開始設定点でのスクロースの異所性供給に応答する
シンク葉でのデンプンとフルクタンの合成は、in vivoでスクロース(Suc)の利用可能性が高い場合に、または糖の異所性供給によって誘導される(図4A、4B)。スクロース処理したオオムギ葉でのデンプンとフルクタンの誘導は異なる設定点、すなわち、フルクタンについて50mM Suc、デンプンについて85mM Sucで開始された(図4A、4B)。さらに、デンプンとフルクタンの含有量は供給したスクロースのレベルとよく相関した(図4A、4B)。これらの観察結果から、デンプンとフルクタンの合成の連続的誘導を媒介する糖シグナル伝達経路の性質に関する疑問が浮上する。
多くのSucシグナル伝達経路では、SucそのものではなくGlc、Fruおよび/またはトレハロース6-P(T6P)が一次メッセンジャーとしての役割を果たすことがわかっている。最近、ヘキソースがオオムギ種子でオリゴフルクタン合成およびワタで細胞分化を調節している可能性があることが示唆された。同じモル濃度のSuc、FruおよびGlcをオオムギシンク葉に塗布し、フルクタンおよびデンプンの蓄積に対する効果を検討した(図6Aおよび6B)。図のように、フルクタンおよびデンプンの蓄積の誘導は、それぞれSuc濃度50mM以上および85mM以上で観察された(図4A、4Bも参照されたい)。85mMではGlcもデンプン蓄積を誘導したが、Fruは誘導しなかった。GlcもFruも50mMではフルクタン蓄積を誘導しなかったが、85mMでは誘導した。転写産物およびタンパク質のレベルを検討したところ、Fru処理試料とGlc処理試料がSuc処理試料と同じ傾向、すなわち、SUSIBA1/SUSIBA1のレベル低下と、SUSIBA2/SUSIBA2ならびにフルクタン合成(6-SF/6-SFT)およびデンプン合成(SBEIIb/SBEIIb)のための転写産物/酵素の増大を示すことが明らかになった(図6Cおよび6D)。Suc処理試料中の内因性のFruおよびGlcのレベルはFru処理試料およびGlc処理試料中より高かった(図7Aおよび7B)。内因性のFruおよびGlcのレベルは糖処理試料中のフルクタンおよびデンプンの蓄積と相関した(図6Aおよび6Bならびに図7Aおよび7B)。液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)解析では、T6Pレベルは全般的に低く、いずれの試料でも陽性に検出できなかったのに対し、5ng(119pmol)のT6P標準品は明確なシグナルを与えた。この観察結果は、Suc処理、Fru処理およびGlc処理でTPS様転写産物レベル(図7C)および総トレハロース6-リン酸合成酵素(TPS)活性(図7D)の増大がみられないことによって裏付けられた。
デンプンとフルクタンの合成におけるSUSIBA1 TFとSUSIBA2 TFの機能および相互作用を明らかにするため、SUSIBA1の起源ならびにSUSIBA1pのアイデンティティーおよび配列を最初に検討した。プローブとしてSUSIBA2 cDNAを用いて開花後(daf)10日のオオムギ胚乳cDNAライブラリーをスクリーニングし、SUSIBA2 cDNAの3’末端と同一のクローンを少数得たが、この段階でのSUSIBA1発現は低かった(図1Cおよび1D)。オオムギ葉の全RNAを用いた5’-RACE(cDNA末端の迅速増幅)で、3つのアンプリコンが得られた(図1A)。配列解析から、このアンプリコンがSUSIBA2 cDNAの一部と同一であることがわかった。最も長い1448ntのcDNA(アンプリコン3)は、SUSIBA2のC末端側の281アミノ酸と同一の281アミノ酸ペプチドに対応し、推定分子量は約30kDであった(図1B)。オオムギの葉および胚乳組織のノーザンブロット解析およびウエスタンブロット解析で、1.5kbのSUSIBA1転写産物および30kDのタンパク質産物の存在を確認した(図1Cおよび1D)。SUSIBA1pを単離するため、オオムギゲノムからSUSIBA2のイントロン2およびエクソン3の5’末端の一部をPCR増幅した。増幅した完全長領域、イントロン2またはエクソン3の5’末端の一部を次いで、GFPレポーター遺伝子に融合した。様々な構築物を含むアグロバクテリアを用いてオオムギ葉を浸潤した。完全長領域では35Sプロモーターと同程度の強い活性がみられた(図3C)のに対し、エクソン3の5’末端では弱い活性がみられた(図3C)。イントロン2、陰性対照(GUS:GFP)および構築物を含まないアグロバクテリアではレポーター遺伝子活性が一切みられなかった(図3C)。単離した完全長領域がSUSIBA1の機能的プロモーターであると結論づけられた。
SUSIBA1pを特定した後、SUSIBA1がフルクタン合成に関与している可能性を検討した。SUSIBA1の核内局在をSUSIBA1:GFP融合構築物のアグロバクテリウム浸潤によって確認し、これは、SUSIBA1がGFPを核にうまく標的化し得ることを明らかにした(図8A~8D)。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を用いて、SUSIBA1とオオムギのフルクタン合成の鍵酵素をコードする6-SFTのプロモーターの間のin vitroの相互作用を検討した。大腸菌(E.coli)に過剰発現させて精製したSUSIBA1を用い、既に記載されている[1]通りにEMSAを実施した(図8E~8J)。WRKYタンパク質の特徴と一致して、SUSIBA2 TFがWボックスDNAシスエレメントに結合することが示された。SUSIBA2活性をさらに解析し、SUSIBA2 TFはSUREaにも結合するが、SP8aシスエレメントには結合しないことがわかった。6-SFTプロモーターを検討し、2種類のSUREaエレメント、3種類のWボックスエレメントおよび1種類のSP8aエレメントを同定した(図8E)。制限酵素BstXI、PvullおよびSpelの様々な組合せを用いて、完全長プロモーター(フラグメント1)を4つのフラグメント(フラグメント2~5、図8E)に分割した。EMSAは、SUSIBA1は1つまたは複数のシスエレメントを含むフラグメント1~4に結合できるが、いずれのエレメントも含まないフラグメント5には結合できないことを示した(図8F)。このことは、SUSIBA1がSUREaおよびWボックスおよび/またはSP8aを結合できる可能性があることを示唆した。個々のエレメントに対して構築したオリゴヌクレオチドプローブ(図8G)を用いたEMSAは、SUSIBA1が実際に各エレメントを結合できることを明らかにした(図8H)。結合活性の特異性を確認するために、エレメント配列(図8I)を設計し、SUSIBA1の結合を試験した。EMSAは、エレメント配列をAストレッチで置き換えると、SUSIBA1結合活性が消失することを示し(図8J)、このことは、SUSIBA1がin vitroで、SUREaエレメント、WボックスエレメントおよびSP8aエレメントに結合することによって6-SFTプロモーターと相互作用でき、Wボックスに強く結合することを示している。設計したエレメント配列、すなわち、SP8a M、WボックスMおよびSUREa M4に対するSUSIBA1の結合活性がみられなかったことはまた、アッセイシステムでのEMSAの信頼性を示した(図8J)。
SUSIBA1がフルクタン合成の抑制因子であり、SUSIBA2がデンプン合成の活性化因子であるという見解を、より自然な条件で、すなわち、高い種子フルクタン含有量および低い種子フルクタン含有量を有する様々なオオムギ変種で(図13A、13B)、スクロース誘導実験で(図14A、14B)、およびデンプンおよびフルクタン蓄積の日内変動(図15A、15B)において、SUSIBA1およびSUSIBA2の発現レベルとフルクタンおよびデンプンの含有量の相関を評価することによりさらに検証した。総合的な結果は、SUSIBA1活性とフルクタン含有量の間の負の相関、およびSUSIBA2活性とデンプン含有量の間の正の相関を示した。SUSIBA1とSUSIBA2はこれにより、分子的拮抗システムを構成した。
拮抗システムが確認されたことにより、2つの選択的プロモーターの差次的活性および拮抗システムが実行される仕組みに関して疑問が生じた。この疑問には、プロモーター欠失、asODN阻害、二本鎖デコイオリゴTF捕捉、浸潤による過剰発現、DNAシーケンシングおよびEMSAを含む一連の方法により対処した。様々な長さのSUSIBA2プロモーターをGFPレポーター遺伝子に融合し、オオムギ葉内にアグロインフィルトレーションしたところ、完全長プロモーターは予想通り、スクロース濃度に応答したのに対し、5’末端の25%が欠如した短縮プロモーターには応答が全くまたはほとんどみられなかった(図16A~16C)。この観察結果は、糖応答性配列がSUSIBA2プロモーターの遠位5’末端に位置することを示唆した。完全長型のSUSIBA2p:GFPと35p:SUSIBA1の同時浸潤もまたSUSIBA2プロモーター活性を実質的に消失し(図16Bおよび16C)、SUSIBA1がSUSIBA2プロモーターの遠位の5’領域に結合することによってSUSIBA2活性を抑制することを示唆する。この見解は、40mM SucではSUSIBA1をasODNで阻害してもSUSIBA2発現に変化がみられなかった図11A、11Bに示される結果と一致しないように思われる。40mM Sucでは、SUSIBA1発現が既に低下しており、SUSIBA1力価をさらに低下させることによるSUSIBA2活性の抑制解除は顕著でないという仮説を立てた。しかし、SUSIBA2発現のスクロース誘導閾値(25mM/40mM)の低い側にあたる25mM SucでのasODNによるSUSIBA1の阻害によるSUSIBA2発現の活性化(図17A)およびSUSIBA1の過剰発現がある場合またはない場合に様々なSucレベルでのSUSIBA2発現の活性化(図17B)は、SUSIBA1がSUSIBA2発現の抑制因子としての役割を果たしていることを明白に示唆した。興味深いことに、SUSIBA1が阻害されたとき、SUSIBA2の供給/過剰発現がSUSIBA2発現を促進でき、このことは、SUSIBA1が低いときにSUSIBA2/SUSIBA2は自己促進活性を有し、または自己促進活性がSUSIBA1抑制活性によって阻害されることを示唆している(図17C、19A、19B)。前のEMSA実験(図8E~8J)から、SUSIBA1がWボックスモチーフに効率的に結合できることが示された。SUSIBA2プロモーターの糖応答性遠位5’末端でのWボックスの探索はWボックスを明らかにした。デコイオリゴTF捕捉技術を用いて、SUSIBA2プロモーターから無作為に選択したWボックスをカバーするデコイオリゴおよびWボックスを含まない対照デコイオリゴを設計した(図18A)。デコイオリゴをp35S:SUSIBA1と同時に浸潤させたところ、WボックスデコイオリゴはSUSIBA1による糖応答性SUSIBA2発現の抑制を打ち消し(図18B、20A、20B)、SUSIBA2プロモーター中のWボックスがSUSIBA1抑制因子のコグネイト結合部位であることを示唆した。Wボックスは下流遺伝子のSUSIBA2活性化の標的でもある。SUSIBA1とSUSIBA2がSUSIBA2プロモーター中のWボックスに関して競合するという仮説が立てられる。この仮説を裏付けて、40mM SucでのSUSIBA2過剰発現は、SUSIBA1の阻害時にSUSIBA2発現を増強でき(図17C、19A、19B)、低SUSIBA1発現のバックグラウンドでSUSIBA2を標的とするWボックスデコイオリゴ捕捉は、SUSIBA2発現に対するSUSIBA2の正の作用を大幅に低下させた(図18C、18D、21A、21B)。低SUSIBA1発現は、高Suc濃度(100mM、図18D)またはasODN阻害(図17C、18C、19A、19B、21A、21B)によってもたらされた。内在性SUSIBA2のみをカバーするが構築物配列はカバーしないSUSIBA2 mRNA5’末端に特異的なプライマーによって解析したところ、100mM Sucではp35S:SUSIBA2構築物の浸潤は内因性SUSIBA2発現を有意に増大させないことが観察され、これはおそらく高Suc濃度およびSUSIBA2の外来性導入による活性化の重複性のためである(図18D)。
SUSIBA1が糖依存性の様式でSUSIBA2発現の制御に果たす役割が発見されたことから、SUSIBA1が糖を感知する機序が極めて重要になる。この疑問に対処するため、SUSIBA2に関して上に記載したものと同じ戦略を用いてSUSIBA1プロモーターを詳細に分析した。プロモーター欠失実験は、糖応答性配列はSUSIBA1プロモーターの177bp長の5’末端領域に位置するはずであり、この領域が欠失するとSUSIBA1プロモーターの糖応答活性が完全に消失することを示した(図22A~22C)。さらに、イントロンプロモーター配列全体の欠失は、SUSIBA1のプロモーター活性全体を有意に低下し、このことは、図3A~3Cに示される結果と一致している。177bp長領域内の糖応答性エレメントを絞り込むため、デコイ捕捉戦略を用い、領域を6つのデコイオリゴに分割した(図23Aおよび23B)。オオムギ葉内への浸潤後、デコイ2および3は、解析のためのSUSIBA1発現バックグラウンドに許容される低レベルおよび中レベルの糖でSUSIBA1発現を有意に低下できた(図23C、24A、24B)。SUSIBA1の糖応答活性に関与する対応するトランス因子を解析するため、様々なSuc濃度で処理したオオムギ葉の核タンパク質抽出物をデコイ2および3をカバーするDNAフラグメント、177bp長領域の外側にある対照フラグメント(図23A)ならびにデコイ2および3とともにEMSA実験で使用した(図23D)。EMSAは、フラグメント1およびデコイ2に結合できるが、フラグメント2およびデコイ3には結合できないトランス因子活性を可視化した。この因子は、その活性がSUSIBA1発現と相関したことから、正の調節因子であるように思われた。デコイ2の配列を詳細に検討し、それが特定された糖抑制性エレメント(SRE)に類似したTTATCモチーフを含むことがわかった。
穀類はヒトにとって最も重要な食糧資源であり、穀類収穫高は世界の食糧安全保障の点で最も関心がもたれている問題である。穀類収穫高は穂数、穂の大きさおよび千粒重などの複数の因子に左右される。穂の大きさは穀類収穫高を決める鍵因子の1つである。これまでに、オオムギの抑制因子型転写因子をコードする遺伝子中の変異は二条オオムギから六条オオムギを生じることが報告されている。六条オオムギは理論上、収穫高が二条オオムギの3倍である。しかし、何が穀類の垂直寸法での穂長を決定するのかを明らかにすることは未だ困難である。
植物材料および生長条件
オオムギ(Hordeum vulgare)変種Golden Promise、SLU7(変種155)およびKVL301(変種181)の種子をそれぞれ北欧遺伝子バンク、スウェーデン農業科学大学(SLU)およびデンマーク王立獣医科・農科大学(KVL)から入手した。Golden Promiseを22℃、16時間の明期、18℃、8時間の暗期、相対湿度70%、光強度400μmol/(m2・s)で、SLU7およびKVL301をそれぞれ24℃/16℃および18℃/10℃で栽培した。これ以外の栽培条件は既に記載されている条件[6]と同様であった。オオムギの生育段階をZadoksスケール[18]に従い、または生育中の種子については開花後日数(daf)従ってモニターした。4週齢のオオムギ実生の第二葉を糖誘導、asODN阻害およびその他の実験に用いた。
この研究に使用したオリゴヌクレオチドを表1に挙げる。これらはSigma-Aldrich社(セントルイス、ミズーリ州、米国)から購入した。
GFP、BFPおよびGUSを含むプラスミドを記載されている通り[1、7]に入手した。シロイヌナズナWRI1をGenBankアクセッション番号NM_202701から増幅した。分子クローニングの方法はいずれも記載されている通り[1、2、4、8]であり、5’-RACEをGene Race(登録商標)コアキット(Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)により製造業者のマニュアルに従い実施した。cDNAライブラリースクリーニングを記載されている通り[1、8]に実施した。
スクロース誘導およびasODN阻害に関する実験は既に報告されている通り[1、2、4、5、9]であった。簡潔に述べれば、オオムギ植物体を暗所で24時間置いて糖を枯渇させた後、実験に用いた。4週齢実生の先端部の第二葉を切り離し、ODNを加えて、または加えずに様々な濃度のスクロースでインキュベートした。スクロース誘導には、水およびソルビトールを対照として用いた。asODN阻害には、センスODNを対照に用いた。
アグロインフィルトレーションを、公開されている双子葉植物用のプロトコル[10]をわずかに修正したものに従い実施した。4週齢植物の実生を暗所に24時間置いて糖を枯渇させた。先端部の第二葉を、同じOD濃度へと様々な溶液中に懸濁した構築物含有アグロバクテリウムAGL1に浸潤させて、記載される通り形質転換効率が等しくなるよう[10]アグロインフィルトレーション条件を最適化した。浸潤後、様々な溶液を用いて、または用いずに葉または植物体を暗所でさらに48時間インキュベートした後qPCR解析を実施するか、または72時間インキュベートした後UV光および顕微鏡下で、GFPについては460~500nm、BFPについては340~380nmの波長で観察した。様々な配列をレポーター遺伝子に融合し、アグロバクテリウムに形質転換し、オオムギ葉内に浸潤させた。
オリゴデオキシヌクレオチドデコイを、オリゴヌクレオチドを14mMトリス-HCI、pH8.0および7mM MgCl2中でアニールさせることにより作製した後、オオムギ葉内への浸潤のため作業濃度25μΜに希釈した。
qPCR転写産物の解析のために、浸潤の48時間後に浸潤領域を用いてRNAを単離した。蛍光顕微鏡解析のために、浸潤の72時間後に浸潤領域を用いた。
ノーザンブロット解析およびウエスタンブロット解析を、記載されている通り[1]に実施した。ノーザン解析にはSUSIBA2のcDNAをプローブとして使用し、ウエスタンブロット解析には、Martinez-Carrasco博士の厚意によるオオムギ6-SFTに対する抗体を使用した。同じ負荷量からのブロット上のクーマシーで染色したタンパク質および免疫反応バンドの典型的な全体プロファイルを図6Dに示す。SUSIBA1とSUSIBA2のウエスタンブロット解析は、完全長SUSIBA2ペプチドに対する抗体のSUSIBA1に対する交差反応がSUSIBA2に対するものより弱かったため、同じブロット上で実施する代わりに異なるブロット上で実施した。
定量的リアルタイムPCR(qPCR)を、既に記載されている通り[2、11]に実施した。SUSIBA1の相対発現レベルを、同じハウスキーピング遺伝子(または参照遺伝子)を用いて、SUSIBA1+2のデルタCt値からSUSIBA2のデルタCt値を減じることにより、すなわち、SUSIBA1のデルタCt値=SUSIBA1+2のデルタCt値-SUSIBA2のデルタCt値により算出した。
蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法は記載されている通り[2]であった。ソフトウェアImageJ[19]で相対蛍光強度を測定した。
オオムギ葉を0mM、50mMおよび100mMのSucで2日間処理し、核タンパク質を既に記載されている通り[12]に単離した。変種155および181の9daf種子の核タンパク質を同じプロトコルに従い単離した。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)実験を、既に記載されている通り[1、12]に実施した。簡潔に述べれば、過剰発現したSUSIBA1タンパク質およびSUSIBA2タンパク質を精製するか、またはオオムギ核タンパク質を単離し、EMSAに使用した。PNK(T4ポリヌクレオチドキナーゼ)を用いてDNAフラグメントプローブを[γ32Ρ]で末端標識した。オリゴプローブは、PNKを用いて一方の鎖を[γ32Ρ]で末端標識し、14mMトリス(pH8.0)および7mM MgCl2でオリゴの相補鎖とアニールさせた。大きいDNAフラグメントにはアガロースゲルを使用し、オリゴヌクレオチドフラグメントにはポリアクリルアミドゲルを使用した。競合アッセイには、0.2μgの過剰産生されたSUSIBA2を0.0125μg、0.025μg、0.05μg、0.1μgおよび0.2μgで過剰産生されたSUSIBA1を漸増させて結合反応に加えてインキュベートした。6%のポリアクリルアミドゲルを使用し、160Vの定電圧をかけた。
製造業者のプロトコル(Megazyme社、ブレイ、ウィックロー州、アイルランド)に従い、テクニカルデュプリケートを用いたデンプンとフルクタンの解析を除き、バイオロジカルトリプリケートおよびテクニカルトリプリケートを用いた。解析には一元配置ANOVA[13]およびバイオインフォマティクス[11]の方法を用いた。系統樹をDNASTAR lasergene version 12のプログラムにより作製した。
フルクタン、デンプンならびに内因性のフルクトースおよびグルコースを、記載されている通り[2、11]に、またMegazyme社(ブレイ、ウィックロー州、アイルランド)製のキットに提供されているプロトコルに従い抽出し解析した。内因性トレハロース6-リン酸を、既に記載されているプロトコル[14]に正確に従い単離し、既に記載されている通り[15]に液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)により解析した。LC/MS解析は、Amazon Speed ETDイオントラップ質量分析計(Bruker Daltonics社、ブレーメン、ドイツ)と連動させたAgilent 1100 HPLCで実施した。分離を、Thermo Scientific社(米国)製の2.6μmサイズ粒子のAccucore-150-HILIC-Amideカラム(2.1×150mm)を用い25℃で試みた。標準品および抽出物の両方について流速を200μl/分に維持し、注入体積20μlを用いた。移動相は記載されている通り[15]であった。イオントラップ質量分析計を、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を用いてネガティブモードで操作し、質量スペクトルをm/z50~500のスキャン範囲にわたって取得した。
トレハロース6-リン酸合成酵素アッセイを、最初の反応時間および温度をそれぞれ120分および25℃に設定した以外は既に記載されている通り[16]に実施した。酵素活性は、第二の反応でNADHの340nmでの1分当たりの吸光度減少によって示される。
オオムギ変種
これまでに253種類のオオムギ変種が収集されている。そのうち、12変種が様々な解析で詳細に特徴付けされている[22]。その12変種から4変種(155、199、224および235)をこの高種子フルクタンオオムギに関する試験での交雑用に選択した。
植物の栽培には、SLUにある最新のファイトロトン(phytroton)を本明細書および[22]に既に記載されている通りに使用した。
交雑後の子孫のスクリーニングには、DNAプローブとしてSUSIBA1およびSUSIBA2の配列を用い、タンパク質プローブとしてSUSIBA1およびSUSIBA2、SBEIIbおよび6-SFT[1]に対する抗体を用いた。qPCR、ウエスタンブロット、顕微鏡観察などの他の実験については、本明細書に記載した通りに実施した。
フルクタンおよびβ-グルカンの解析を公開されているプロトコル[11、20、21、22]に従い実施した。
オオムギ変種の間のSUSIBA1発現レベルの遺伝的変異をスクリーニングし、SUSIBA1の発現レベルが異なる系統を多数得た。このうち、変種155および199がSUSIBA1の発現が低い変種であり、SUSIBA1発現が高く、フルクタン加水分解活性が低い変種224および235との交雑に選択した。この変種の交雑は、低SUSIBA1発現および低フルクタン加水分解活性が子孫に遺伝するかどうかを検証するために実施した。変種をファイトトロンで栽培し、既に記載されている交雑技術[23]に従い交雑に用いた。交雑後の子孫系統をスクリーニングの様々な解析に用いた。
オオムギ種子生育期に分子マーカーとして陰陽システムを用いてフルクタン合成活性を追跡し、マーカー遺伝子として2種類の加水分解酵素遺伝子、1-FEHおよび6-FEHを用いてフルクタン加水分解活性をモニターした。初期段階(開花後9日)で合成活性が高いことおよび後期段階(開花後22日)で加水分解活性が低いことに着目した。12種類のオオムギ変種から、初期段階での合成活性が高い2変種(変種155および199)および後期段階での加水分解活性が低い2変種(変種224および235)が特定された。この4変種を交雑に用いて種子フルクタン含有量を増大させた。この考え方は、高い合成活性と低い加水分解活性を組み合わせて種子生育期のフルクタン蓄積を増大させるというものであった。交雑後のF1子孫では、相対的にフルクタン含有量の高い子孫を5個体選択してフルクタン含有量形質の分離を追跡した。その5個体の子孫は♀199×♂155、♀155×♂199、♀224×♂155、♀224×♂199および♀199×♂235であった。選択した子孫は種子生育期に、生育段階を経るに従い、特に後期段階の開花後22日および成熟種子中にますます多くのフルクタンを蓄積し(図33)、このことは、変種224および235の低い加水分解活性が子孫に伝わり、それにより蓄積量が親155および199より高くなることを示唆する。子孫がホモ接合体である場合、♀224×♂155ハダカムギ、♀224×♂199ハダカムギの系統で種子フルクタン含有量が最も高く、個々の植物のフルクタン含有量は乾燥重量(DW)当たり最大13%であり、千粒重(TKW)は影響を受けないことが観察された(図34および35)。スクリーニングでは、子孫に2つのタイプの種子、すなわち、丸い種子と平らな種子が観察された(図36A)。平均種子フルクタン含有量を測定したところ、高いフルクタン含有量は平らな種子の表現型と相関した(図36B、36C)。興味深いのは、平らな種子中の高フルクタン含有量は、高β-グルカン含有量と強く相関したことであり、このことは、陰陽システムがβ-グルカン合成を制御している可能性を示唆している(図36)。
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Claims (9)
- 植物材料であって、前記植物材料がオオムギ植物材料である場合、配列番号104で定義されるオオムギ中糖シグナル伝達2(SUSIBA2)転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列、または前記植物材料がコメ植物材料である場合、配列番号105で定義されるSUSIBA2様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列を含み、
前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子は、前記植物材料中で活性なプロモーターの転写制御下にあり、
前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、(i)前記オオムギ植物材料中の前記SUSIBA2転写因子をコードする野生型の前記ゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在する、配列番号96で定義されるSUSIBA1プロモーター(SUSIBA1 p)の配列番号92で定義される活性化領域、または(ii)前記コメ植物材料中の前記SUSIBA2様転写因子をコードする野生型の前記ゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在する、配列番号97で定義されるSUSIBA1様プロモーター(SUSIBA1様p)の配列番号93で定義される活性化領域を欠く、
植物材料。 - 前記SUSIBA1pまたはSUSIBA1様pの活性化領域が、前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列の前記野生型から欠失されている、請求項1に記載の植物材料。
- 前記SUSIBA1pまたはSUSIBA1様pの活性化領域が、前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列の前記野生型からクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート、(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)を介する欠失により欠失されている、請求項2に記載の植物材料。
- 前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードするゲノム内在性ヌクレオチド配列である、請求項1~3のいずれか1項に記載の植物材料。
- 前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列の前記イントロンに存在する、オオムギについては配列番号94で、コメについては配列番号95で定義される前記SUSIBA1pまたはSUSIBA1様pの糖抑制領域を欠く、請求項1~4のいずれか1項に記載の植物材料。
- 前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記SUSIBA1pまたはSUSIBA1様pのイントロン部分を欠く、請求項1~5のいずれか1項に記載の植物材料。
- 前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記SUSIBA2またはSUSIBA2様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列のイントロン2を欠く、請求項1~6のいずれか1項に記載の植物材料。
- 前記植物材料が、コメ植物体、コメ植物細胞およびコメ種子からなる群より選択され、かつ
前記ゲノムヌクレオチド配列が、SUSIBA2様転写因子をコードしかつ前記SUSIBA2様転写因子をコードする野生型の前記ゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在するSUSIBA1様pの活性化領域を欠く、
請求項1~7のいずれか1項に記載の植物材料。 - 前記植物材料が、オオムギの、植物体、植物細胞または種子からなる群より選択されるオオムギ植物材料である、請求項1~7のいずれか1項に記載の植物材料。
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