CN102191331A - NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，涉及应用NBS Profiling分子技术领域。该方法（1）提供DNA提取的幼叶的采集与保存；（2）总DNA的分离纯化；（3）进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接；（4）NBS Profiling扩增，两步PCR反应；（5）扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定。该方法可早期快速地鉴定植物育种杂交后代的杂种性，提高育种效率；比较鉴定一些亲本来源不清、性状优良栽培品种的亲本起源，辅助这些品种的性状改良；追溯鉴定一些重要植物资源的亲本起源，促进这些资源的进一步应用。
Description
技术领域
本发明涉及应用NBS Profiling分子技术，调查植物品种或资源与潜在亲本的起源关系。本发明描述了NBS Profiling在植物杂交育种中杂交后代的杂种真实性的早期鉴定、及具有重要经济和研究价值植物品种或材料的亲本起源鉴定中的方法。
背景技术
NBS Profiling是一种基于生物核苷酸结合位点-亮氨酸富集重复序列（nucleotide-binding site-leucine-rich repeat，NBS-LRR）高度保守的特点，设计NBS引物，通过PCR扩增获得特异性分子片段或标记的方法。已知植物抗病基因都具有几个高度保守的NBS-LRR 区域，针对植物抗病基因和抗病基因同源序列NBS-LRR保守序列设计发明的NBS Profiling技术，是一种高度可靠的DNA多位点文库构建、且可以免费使用的技术，具有与AFLP、ISSR分子标记技术相似的显性多位点标记体系的特点。自C. G van der Linden（Theoretical and Applied Genetics (2004) 109: 384–393 “Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS profiling”（利用NBS Profiling有效标定植物病害抗性位点））建立NBS Profiling技术以来，已成功的应用于许多重要作物，如马铃薯、番茄、水稻、大麦、莴苣、葡萄等的抗病基因的分离鉴定和序列分析。
现代植物育种，经常利用野生资源与栽培品种的杂交，将野生资源中的抗逆、抗病等重要性状的基因转移到栽培种中。但由于种间杂交亲缘关系远、且无法完全去雄或隔离授粉，杂交后获得的后代有些不是真正的杂交种。对于像球根花卉水仙、郁金香、百合，木本植物金丝桃、杜鹃花、苹果等生长周期长的植物，如果能在种子苗早期将非杂交后代的自交苗识别去除，可以节省栽培管理这些材料的大量人力、物力，将大大的降低育种成本。此外，了解和弄清一些长期使用，但亲本来源不清、性状优良栽培品种的亲本来源，有助于这些品种的性状改良。
现有鉴定植物杂交后代或品种与亲本遗传关系的方法中，传统的形态学方法存在从种子播种到植株长成、开花结果耗时长，受环境因素影响大等缺点；分子细胞遗传学方法-基因原位杂交（genomic in situ hybridization, GISH ）虽然能够有效的鉴定亲本与杂交后代的遗传关系，但该方法从染色体制片开始到完成鉴定至少需要一周以上，非常耗时耗力，操作人员必须具有丰富的经验和好的操作技能才能应用这项技术，因此实际应用受到了极大的限制。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有鉴定技术周期长、费时费力、或技术要求高等缺点，提供一种新的鉴定杂交后代杂种性、物种起源的方法。
本发明的发明人研究得出通过比较NBS Profiling扩增片段的相似性，可高效准确地分析鉴定植物杂交后代的杂种性或栽培品种与潜在亲本的遗传关系。
本发明所述的一种NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，按以下步骤进行：
（1）供DNA提取的幼叶的采集与保存；
（2）总DNA的分离纯化；
（3）进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接；
（4）NBS Profiling 扩增，包括两步PCR反应；
（5）扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定。
采用本发明方法，可以早期快速地鉴定植物育种杂交后代的杂种性，提高育种效率；可以比较鉴定一些亲本来源不清、性状优良栽培品种的亲本起源，辅助这些品种的性状改良；可以追溯鉴定一些重要植物资源的亲本起源，促进这些资源的进一步应用。NBS Profiling可以鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源，理论推导可能是由于NBS序列高度保守、能够稳定遗传给后代的特点，杂交后代的NBS序列应该和其母本和（或）父本一致。
附图说明
附图1 NBS 特异引物NBS-GLPL 及限制性内切酶RsaI组合的水仙花Narcissus tazetta (cv. ‘Soleil d 'or’) (泳道1,2), ‘Téte-á-Téte’ (泳道3,4), 和Narcissuscyclamineus(泳道5,6) NBS profiling 的带型特征：‘Téte-á-Téte’所有的条带都能追溯到N. tazetta和N. cyclamineus的条带中。
附图2 NBS 特异引物NBS5A 及限制性内切酶MseI组合的金丝桃Hypericum perforatum (HP) 与Elite amber (EA) 及其杂交后代（泳道1、2、3）的NBS profiling 带型特征：杂交后代的带型与其母本Hypericum perforatum (HP) 的带型完全相同。
具体实施方式
本发明提供了一种NBS Profiling鉴定杂交后代杂种性、植物起源的方法，具体的方法如下：
1.供DNA提取的幼叶的采集与保存
采集待鉴定基因型，如杂交亲本及其杂交后代、或品种及其潜在亲本的幼嫩叶片，立即放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到-18℃～-80℃低温下贮存供DNA分离提取；
2.总DNA的分离纯化
DNA的质量是影响NBS Profiling成功最重要的因子之一；
采用常用的Fulton法(Plant Molecular Biology Reportor,1995,13(3): 207-209)或CTAB法（Nucleic Acids Research, 1980, 8(19): 4321-4326）提取幼嫩植物组织的DNA，用0.8%～1.5%琼脂糖电泳和紫外检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度应达到1μl 100 ng 以上，DNA纯度OD260/280值应介于1.8～2.0之间；提取DNA贮藏于-20℃冰箱，于反应前取部分稀释用于NBS Profiing鉴定；
3. DNA的限制性酶消解和末端受体连接
(1)酶切反应
取上述步骤2获得的植物总DNA，用RsaI、MseI等四碱基识别位点的限制性内切酶将其切割为不同大小的DNA片段；以RsaI为例的10 μl酶切反应体系如下：RsaI 1 μl + RsaI 缓冲液 1 μl + 蒸馏水7 μl + DNA 1 μl（100 ng～400 ng）；
酶切反应于37℃恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中10min～20min中止反应；
（2）酶切反应产物检测
采用0.8%-1.5%琼脂糖电泳检测酶切反应产物，选择能够把植物总DNA切割成不同长度、连续分散的DNA片段的内切酶，用于下一步酶切、末端受体连接反应；
（3）DNA限制性酶消解和末端受体连接
这一步是在使用限制性内切酶切割总DNA的同时，将一个末端受体连接到新产生的DNA末端上。末端受体分为平端受体（适用于MseI外的限制性内切酶）和MseI特异的受体两种；
平端受体（blunt adapter）序列为：
5’ A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G T A T A G A T C C C A 3’
3’ NH2 T T C A T A T C T A G G G T 5’-P；
MseI特异的受体序列为：
5’ A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G T A T A G A T C C C A 3’
3’ NH2 T T C A T A T C T A G G G T A T 5’；
酶切和受体连接的反应体系（60 μl体系为例）：5x AFLP 缓冲液12 μl + 末端受体3 μl + 蒸馏水36 μl + ATP（10 mM）6 μl + 限制性酶1 μl + T4连接酶（5 U/μl） 1 μl + DNA（100 ng～400 ng） 1 μl；酶在加完所有试剂后最后一步加入；
酶切和连接反应于37℃恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中10min～20min中止反应；反应产物置于4 oC或 –20 oC冰箱贮藏；
加60 μl蒸馏水到上述酶解-连接反应产物将其稀释一倍后，供下一步的NBS Profiling 扩增反应使用；
4. NBS Profiling 扩增
NBS Profiling扩增包括两步PCR反应：
（1）第一次PCR扩增
第一步PCR扩增反应是线性的，25 μl反应体系为：步骤3稀释的酶解-连接反应产物5 μl + NBS特异引物2 μl + 受体引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 1 μl + 10x PCR 缓冲液2.5μl + DNA Taq 聚合酶 0.08 μl + 蒸馏水12.42 μl；
PCR扩增反应为：95℃ 预变性15 min；95℃ 变性30s, 55℃-60℃退火 100s,72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃延伸20min后10℃保存。其中退火温度NBS1、NBS5、NBS6、NBS GLPL引物为 55°C，NBS2、NBS3引物为60°C；
受体引物序列为：
5’ G T T T A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G 3’；
NBS特异引物序列如下：
NBS GLPL：5' T G Y R R A G G A Y T R C C W Y T A G C 3' ；
NBS 1: 5' G C I A R W G T W G T Y T T I C C Y R A I C C 3' ；
NBS 2: 5' G T W G T Y T T I C C Y R A I C C I S S C A T 3' ；
NBS 3: 5' G T W G T Y T T I CC Y RA I C C I S S C A T I C C 3' ；
NBS 5A: 5' Y Y T K R T H G T M I T K G A T G A T G T I T G G 3' ；
NBS 6: 5' Y Y T K R T H G T M I T K GA T G A T A T I T G G 3' ；
其中Y=C或T；R=A或G；W=A或T；S=C或G；K=G或T；H=A或C或T；M=A或C；A=Adenine（腺嘌呤）；I=Isoleucine(异亮氨酸)；
（2）第二次PCR扩增
第二步PCR扩增反应是指数性扩增，以4（1）中第一次扩增的PCR产物为DNA模板，加入NBS特异引物和标记受体引物进行PCR反应。10 μl反应体系为：4（1）中第一次扩增的PCR产物5μl + IRD 700标记的受体引物（1 pmol/μl）0.6 μl + NBS特异引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 0.4 μl + 10x PCR 缓冲液1μl + DNA Taq 聚合酶 0.04 μl + 蒸馏水2.66 μl，除延伸温度由100s减为40s，PCR循环减为20个循环外，其余与第一次PCR反应条件相同；
5.扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定
将上述4（2）中标记的PCR产物进行聚丙烯酰胺胶电泳分离，以LiCor DNA 分析仪（LI-COR Inc, Lincoln, USA）上的操作为例，操作技术如下：加入0.5~1.5倍体积的溴酚蓝上样缓冲液到4（2）中标记的第二次PCR产物中，混匀样品于94°C条件下变性5 min后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4°C或-20°C冰箱；根据待鉴定材料的不同，在进行植物杂交后代杂种性鉴定时，即鉴定育种中杂交后代是否为真杂种的情况时，上样时按亲本1 - 杂交后代 - 亲本2的顺序排列样品；对于鉴定某个品种或资源的起源亲本的情况，上样时按已知亲本或潜在亲本1 - 待鉴定的品种或资源 – 潜在亲本2的顺序排列样品；每一样品的加样量为0.4 μl~0.5 μl；所述的植物杂交后代杂种性、物种起源的判定是如果杂交后代的扩增条带一部分与父本相同和一部分与母本相同，且所有条带都能追溯到杂交亲本中，说明这一杂交后代为真杂种；如果杂交后代的扩增条带与母本的条带完全相同，说明这一杂交后代为自交种；具有待鉴定的品种或资源的所有条带的潜在亲本组合是该待鉴定的品种或资源的亲本。
针对上述第一种情况，分析亲本1-后代-亲本2样品聚丙烯酰胺胶电泳分离的带型特征，如果杂交后代的扩增条带一部分与父本相同、一部分与母本相同，且所有条带都能追溯到杂交亲本中，说明这一杂交后代为真杂种，应该保留做进一步的分析观察；如果杂交后代的扩增条带与母本的条带完全相同，说明这一杂交后代为自交种，应将其拔出扔掉，节省后期工作相应的人力物力。同理，针对上述第二种情况中那些亲本起源不详的重要栽培品种或资源，将可能的亲本按上述方式一一排列，具有待鉴定的品种或资源所有条带的那一对潜在亲本组合既是该品种或资源的亲本。在第二种情况中，由于该方法只是在最后一步聚丙烯酰胺胶电泳分离NBS Profiling扩增片段时，将不同潜在亲本按不同组合上样，因此可以大量的比较鉴定不同的潜在亲本材料，工作效率高。
实施例：
实施例1 水仙花品种Narcissus‘Tête-à-Tête’未知亲本的鉴定
水仙花品种Narcissus‘Tête-à-Tête’，是一个早春栽培品种，由于其多花、花色亮丽（金黄色）、株型矮化适于盆栽、抗性好、易于栽培管理等优点，自1949年培育至今仍然非常流行，占有当今欧洲早春市场40%的份额。由于‘Tête-à-Tête’是一个完全不育的三倍体，使其难于在进一步的育种中应用。育种家试图根据‘Tête-à-Tête’原来的培育途径，利用其亲本重新合成具有‘Tête-à-Tête’优点的不同花色的新品种。但培育‘Tête-à-Tête’的一个亲本一直是未知的。
根据记载，‘Tête-à-Tête’来自分属于两个不同亚属的水仙花N. cyclamineus (Narcissus subgenus) 和N. tazettaSoleil d 'Or (Hermione subgenus)的杂交后代N. 'Cyclataz'， 从N. 'Cyclataz'开放式授粉后代中选育获得。由于开放式授粉中供给花粉的亲本是随机的，所以培育‘Tête-à-Tête’的一个亲本一直是未知的。因此‘Tête-à-Tête’未知亲本的鉴定对于培育更多具有‘Tête-à-Tête’优良性状的新品种具有重要意义。
根据‘Tête-à-Tête’的性状及染色体数推测：与N. 'Cyclataz'杂交的未知亲本可能为N. cyclamineus（species）、N. papyraceus （species）、Topolino (cultivar)或与它们相关的种或品种。利用NBS Profiling 鉴定其亲本的具体方法如下：
1.植物材料
采集已知亲本N. cyclamineus、N. tazettaSoleil d 'Or 和潜在亲本N. cyclamineus（同前）、N. papyraceus （species）、Topolino (cultivar)的幼嫩叶片，立即放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到-80℃低温下贮存供DNA分离提取；
供试的所有水仙花材料由荷兰瓦赫宁根大学、植物育种组提供；
2.总DNA的分离纯化
采用Fulton法(Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants（Microprep法提取番茄和其它草本植物DNA的操作）, Plant Molecular Biology Reportor, 1995,13(3): 207-209)提取水仙花幼嫩植物组织的DNA，1%琼脂糖电泳和紫外检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度达到1 μl 300 ng -1 μl 200O ng，DNA纯度OD260/280值介于1.85-1.95之间；提取DNA贮藏于-20℃冰箱，于反应前取部分稀释用于NBS Profiing鉴定；
3. DNA的限制性酶消解和末端受体连接
(1)酶切反应
取上述步骤2获得的植物总DNA，用RsaI、MseI限制性内切酶将其切割为不同大小的DNA片段。酶切反应体系为10μl体系，以RsaI为例的反应体系（10 μl体系）如下：RsaI 1 μl + RsaI 缓冲液 1 μl + 蒸馏水7 μl + DNA 1 μl（300 ng）；
酶切反应于37℃恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中15 min中止反应；
（2）酶切反应产物检测
采用1%-1.5%琼脂糖电泳检测酶切反应产物，限制性内切酶RsaI、MseI均能把水仙花幼叶总DNA切割成不同长度、连续分散的DNA片段；
（3）DNA限制性酶消解和末端受体连接
在上述3（2）确定适宜限制性内切酶的基础上，在限制性内切酶切割总DNA的同时，将一个末端受体连接到新产生的DNA末端上；RsaI的酶切-连接反应体系使用平端受体，MseI酶切-连接反应体系使用MseI的特异受体；
酶切-受体连接的反应体系（60 μl体系）为：5x AFLP 缓冲液12 μl + 末端受体3 μl + 蒸馏水36 μl + ATP（10 mM）6 μl + 限制性酶1 μl + T4连接酶（5 U/μl） 1 μl + DNA（300 ng） 1 μl；酶在加完所有试剂后最后一步加入；
酶切和连接反应于37℃恒温条件下反应6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中15 min中止反应。反应产物置于4 oC或 –20 oC冰箱贮藏；
加60 μl蒸馏水到上述酶解-连接反应产物将其稀释一倍后，供下一步的NBS Profiling 扩增反应使用；
4. NBS Profiling 扩增
（1）第一次PCR扩增
第一次PCR扩增反应体系为（25 μl体系）：步骤3稀释的酶解-连接反应产物5 μl + NBS特异引物2 μl + 受体引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 1 μl + 10x PCR 缓冲液2.5μl + DNA Taq 聚合酶 (Hotstart，购于Qiagen公司) 0.08 μl + 蒸馏水12.42 μl；
PCR扩增反应为：95℃ 预变性15 min；95℃ 变性30s, 55℃-60℃退火 100s,72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃延伸20min后10℃保存；其中退火温度NBS1、NBS5、NBS6、NBS GLPL引物为 55°C，NBS2、NBS3引物为60°C；
（2）第二次PCR扩增
以4（1）中第一次扩增的PCR产物为DNA模板，加入相应的NBS特异引物和标记受体引物进行第二次PCR反应；反应体系为（10 μl体系）：4（1）中第一次扩增的PCR产物5μl + IRD 700标记的受体引物（1 pmol/μl）0.6 μl + NBS特异引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 0.4 μl + 10x PCR 缓冲液1μl + DNA Taq 聚合酶 (Dreams，购于BioChain公司) 0.04 μl + 蒸馏水2.66 μl；PCR扩增反应与第一次PCR反应条件相似，但延伸温度由100s减为40s、PCR循环减为20个循环；
5.扩增片段的聚丙烯胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定
上述4（2）中标记的第二次PCR产物于LiCor DNA 分析仪（LI-COR Inc, Lincoln, USA）上进行聚丙烯胺胶电泳分离；加入10 μl溴酚蓝上样缓冲液到第二次PCR产物中，与样品混匀总体积20 μl于94°C条件下变性5 min后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4°C或-20°C冰箱；
聚丙烯胺胶电泳按已知亲本或潜在亲本1 - Tête-à-Tête’- 已知亲本或潜在亲本2的顺序上样，每一样品的加样量为0.5 μl；
用不同的NBS引物与限制性酶组合，NBS Profiling在‘Tête-à-Tête’上获得358条多态性条带，见表表1；如附图1：NBS-GLPL/RsaI组合的例子所示，N. cyclamineus 和N. tazettaSoleil d 'Or具有‘Tête-à-Tête’的所有NBS Profiling条带，‘Tête-à-Tête’的所有条带都能追溯到N. cyclamineus 和N. tazettaSoleil d 'Or中，其它的材料则不具有这一带型特征。因此给N. 'Cyclataz'提供花粉的未知亲本是N. cyclamineus，水仙花育种人利用已知亲本或来自相同组系的其它种或品种重新合成类似‘Tête-à-Tête’特征的新品种成为可能。
表1 不同的限制性酶/NBS引物组合在 ‘Tête-à-Tête’ 上扩增的多态性条代数及其与亲本N. cyclamineus 和 N. tazetta 'Soleil d'Or'的相似性
注：表1中“- ”表示相应的酶/引物组合扩增效果不好
实施例2 金丝桃种间杂交后代杂种性鉴定
金丝桃属（Hypericum）植物含有丰富的抗病毒、抗癌、抗抑制剂等药用成分，早期一直作为一种重要的药用植物使用。但金丝桃的浆果具有红色、黄色、桃色、粉色、绿色等丰富的颜色，浆果挂果期长，且不会像其它浆果一样染色污染衣服或皮肤，可用于花束填充材料或盆栽、园林植物。在过去的十几年里，作为观赏用途的金丝桃发展迅速，如荷兰花卉拍卖市场中金丝桃切枝的数量，自1955年至2000年5年的时间里，从570万增加到1.99亿，金丝桃已成为最流行的浆果类观赏植物。
利用金丝桃野生种与栽培种杂交转移野生种中抗性等性状到栽培种中、改良栽培种是目前观赏金丝桃育种的主要方向。本实施例利用NBS Profiling检测了4个野生种与3个栽培种获得的9个种间杂交组合后代的杂种性。
1. 植物材料
采集供试的4个野生种（Hypericum perforatum、Hypericum calycinum、Hypericum hidcote、Hypericum hidcote）、3个栽培种（Pink attraction、Elite Amber、Red Wave）及获得的9个杂交组合后代（每个杂交组合取3个代表植株）的幼叶，立即放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到-80℃低温下贮存供DNA分离提取；
供试的金丝桃亲本及杂交后代材料由厄瓜多尔的Esmeralda 育种与生物技术公司提供；
2.总DNA的分离纯化
采用改良的CTAB 法（Isolation of plant DNA from fresh tissue （植物新鲜组织的DNA分离）. Focus, 1990, 12:13-15）提取幼嫩植物组织的DNA， DNA浓度和纯度检测同实施例1，提取的DNA自然干燥后溶解于TE-4缓冲液中贮藏于-20℃冰箱，于反应前取部分稀释为400 ng/μl浓度；
3. DNA的限制性酶消解和末端受体连接
取上述步骤2获得的植物总DNA，分别用RsaI、MseI、Alul限制性内切酶将其切割为不同大小的DNA片段，同时将平端受体连接到新产生的DNA末端上；
酶切和受体连接的反应体系（60 μl体系）：5x AFLP 缓冲液12 μl + 末端受体3 μl + 蒸馏水36 μl + ATP（10 mM）6 μl + 限制性酶1 μl + T4连接酶（5 U/μl） 1 μl + DNA（400 ng） 1 μl；酶在加完所有试剂后最后一步加入反应混合物；
酶切和末端受体连接反应、及其产物稀释方法同实施例1；
4. NBS Profiling 扩增
（1）第一次PCR扩增
第一次PCR扩增反应的反应体系为（25 μl体系）：步骤3稀释的酶解-连接反应产物5 μl + NBS特异引物2 μl + 受体引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 1 μl + 10x PCR 缓冲液2.5μl + DNA Taq 聚合酶 (Hotstart, 购于Qiagen公司) 0.08 μl + 蒸馏水12.42 μl；
PCR扩增反应为：95℃ 预变性15 min；95℃ 变性30s, 55℃-60℃退火 100s,72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃延伸20min后10℃保存；其中退火温度NBS1、NBS5、NBS GLPL引物为 55°C，NBS2引物为60°C；
（2）第二次PCR扩增
以4（1）中第一次扩增的PCR产物为DNA模板，加入相应的NBS特异引物和标记受体引物进行PCR反应；反应体系为（10 μl体系）：4（1）中第一次扩增的PCR产物5μl + IRD 700标记的受体引物（1 pmol/μl）0.6 μl + NBS特异引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 0.4 μl + 10x PCR 缓冲液1μl + DNA Taq 聚合酶 (Dreams，购于BioChain公司) 0.04 μl + 蒸馏水2.66 μl；PCR扩增反应与第一次PCR反应条件相似，但延伸温度由100s减为40s、PCR循环减为20个循环；
5.扩增片段的聚丙烯胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定
上述第二次PCR产物于LiCor DNA 分析仪（LI-COR Inc, Lincoln, USA）上进行聚丙烯胺胶电泳分离；加入10 μl溴酚蓝上样缓冲液到第二次PCR产物中，与样品混匀总体积20 μl于94°C条件下变性5 min后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4°C或-20°C冰箱；
不同杂交组合及后代分别按母本- 杂交后代 – 父本的顺序上样，每一样品的加样量为0.5 μl；
6.结果分析
3个限制性内切酶（RsaI、MseI、Alul）、4个NBS特异引物（NBS1、NBS2，NBS5、NBS GLPL）组合的NBS profiling产物，经上述方法的LiCor DNA分析后，结果清楚的显示：所有9个杂交组合的后代都具有与它们的母本同样的NBS Profiling DNA带型。其带型特征如限制性内切酶MseI与NBS 特异引物NBS5A组合在金丝桃Hypericumperforatum (HP) 与Elite amber (EA) 及其杂交后代（1、2、3）例子所示（见附图2）；利用本发明的NBS profiling的鉴定结果证明，金丝桃4个野生种与3个栽培种种间杂交获得的9个杂交后代均为自交种，不是真正的杂交种。要成功实现上述野生种与栽培种间的杂交，需要进一步的努力改进杂交技术或探索新的杂交方法。
Claims (4)
1.NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，按以下步骤进行：
（1）供DNA提取的幼叶的采集与保存；
（2）总DNA的分离纯化；
（3）进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接；
（4）NBS Profiling 扩增，包括两步PCR反应；
（5）扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定。
2.根据权利要求1所述的NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，其特征在于：
所述的（1）供DNA提取的幼叶的采集与保存是采集待鉴定的杂交亲本及其杂交后代、或品种及其潜在亲本的幼嫩叶片，立即放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到-18℃～-80℃低温下贮存供DNA分离提取；
所述的（2）总DNA的分离纯化是采用常用的Fulton法或CTAB法提取幼嫩植物组织的DNA，用0.8%～1.5%琼脂糖电泳和紫外检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度达到100 ng/μl 以上，DNA纯度OD260/280值介于1.8～2.0之间，所提取的DNA贮藏于-20℃冰箱，于反应前取部分稀释用于NBS Profiing鉴定；
所述的（3）进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接是①酶切反应是取步骤（2）获得的植物总DNA，用RsaI或MseI四碱基识别位点的限制性内切酶将其切割为DNA片段，酶切反应于37℃恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中10min～20min中止反应；②酶切反应产物检测是采用0.8%-1.5%琼脂糖电泳检测酶切反应产物，选择能够把植物总DNA切割成不同长度、连续分散的DNA片段的内切酶，用于下一步酶切、末端受体连接反应；③DNA限制性酶消解和末端受体连接是在使用限制性内切酶切割总DNA的同时，将一个末端受体连接到新产生的DNA末端上，末端受体分为平端受体和MseI特异的受体两种；所述的平端受体的碱基序列为：
5’ A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G T A T A G A T C C C A 3’
3’ NH2 T T C A T A T C T A G G G T 5’-P
所述的MseI特异的受体的碱基序列为：
5’ A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G T A T A G A T C C C A 3’
3’ NH2- T T C A T A T C T A G G G T A T 5’
酶切和受体连接的反应体系：60 μl总体系中有5x AFLP 缓冲液12 μl + 末端受体3 μl + 蒸馏水36 μl + ATP（10 mM）6 μl + 限制性酶1 μl + T4连接酶（5 U/μl） 1 μl + DNA（100 ng～400 ng） 1 μl，酶在加完所有试剂后最后一步加入；
酶切和连接反应于37℃恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中10min～20min中止反应，反应产物置于4 oC或 –20 oC冰箱贮藏；加60 μl蒸馏水到所述的酶解-连接反应产物将其稀释一倍后，供下一步的NBS Profiling 扩增反应使用；
所述的（4）NBS Profiling 扩增，包括两步PCR反应是：
①第一次PCR扩增
第一步PCR扩增反应，25 μl反应体系为：步骤（3）稀释的酶解-连接反应产物5 μl + NBS特异引物2 μl + 受体引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 1 μl + 10x PCR 缓冲液2.5μl + DNA Taq 聚合酶 0.08 μl + 蒸馏水12.42 μl；
PCR扩增反应条件为：95℃ 预变性15 min；95℃ 变性30s, 55℃-60℃退火 100s,72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃延伸20min后10℃保存；其中退火温度NBS1、NBS5、NBS6、NBS GLPL引物为 55°C，NBS2、NBS3引物为60°C；
受体引物序列为：
5’ G T T T A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G 3’；
NBS特异引物序列如下：
NBS LPL：5' T G Y R R A G G A Y T R C C W Y T A G C 3'
NBS 1: 5' G C I A R W G T W G T Y T T I C C Y R A I C C 3'
NBS 2: 5' G T W G T Y T T I C C Y R A I C C I S S C A T 3'
NBS 3: 5' G T W G T Y T T I CC Y RA I C C I S S C A T I C C 3'
NBS 5A: 5' Y Y T K R T H G T M I T K G A T G A T G T I T G G 3'
NBS 6: 5' Y Y T K R T H G T M I T K GA T G A T A T I T G G 3' ；
②第二次PCR扩增
第二步PCR扩增反应是以步骤（4）①中第一次扩增的PCR产物为DNA模板，加入NBS特异引物和标记受体引物进行PCR反应，10 μl反应体系为：步骤（4）①中第一次扩增的PCR产物5μl + IRD 700标记的受体引物（1 pmol/μl）0.6 μl + NBS特异引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 0.4 μl + 10x PCR 缓冲液1μl + DNA Taq 聚合酶 0.04 μl + 蒸馏水2.66 μl；PCR扩增反应条件除延伸温度由100s减为40s，PCR循环减为20个循环外，其余与第一次PCR反应条件相同；
所述的（5）扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析是将步骤（4）②中标记的PCR产物进行聚丙烯酰胺胶电泳分离，加入0.5~1.5倍体积的溴酚蓝上样缓冲液到步骤（4）②中标记的第二次PCR产物中，混匀样品于94°C条件下变性5 min后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4°C或-20°C冰箱；当鉴定植物杂交后代杂种性时，上样按亲本1 - 杂交后代 - 亲本2的顺序排列样品；当鉴定物种起源时，上样按已知亲本或潜在亲本1 - 待鉴定的品种或资源 – 潜在亲本2的顺序排列样品；每一样品的加样量为0.4 μl~0.5 μl；所述的植物杂交后代杂种性、物种起源的判定是如果杂交后代的扩增条带一部分与父本相同、一部分与母本相同，且所有条带都能追溯到杂交亲本中，说明这一杂交后代为真杂种；如果杂交后代的扩增条带与母本的条带完全相同，说明这一杂交后代为自交种；具有待鉴定的品种或资源所有条带的潜在亲本组合是该待鉴定的品种或资源的亲本。
3.根据权利要求1或2所述的NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，其特征在于：所述的鉴定物种起源的品种是鉴定水仙花品种Narcissus‘Tête-à-Tête’。
4.根据权利要求1或2所述的NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，其特征在于：所述的鉴定植物杂交后代杂种性的鉴定金丝桃种间杂交后代。
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| CN101760545A (zh) * | 2008-12-19 | 2010-06-30 | 李祥 | 普通小麦背景中外源遗传物质的鉴定 |
| CN101658098A (zh) * | 2009-09-15 | 2010-03-03 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 滇海水仙花匍匐茎扦插繁殖方法 |
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