CN104789671B - 基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物鉴别技术领域，具体为一种基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法。本发明利用粳稻品种日本晴与籼稻品种93‑11的全基因组DNA序列的比对而获得插入/缺失差异片段所设计的14对特异DNA引物。对交源优69及其亲本交源5A和JP69进行DNA提取、DNA片段扩增和电泳分离以及电泳图谱的分析来鉴定交源优69。具体而言，利用14对InDel引物组合，对基于聚合酶链式反应和凝胶垂直板电泳获得的指纹图谱进行分析，根据14个InDel位点的电泳带型，进而确定是否是杂交稻品种交源优69。本发明需用检测样品量少，方法简便快捷，鉴定结果准确，可以应用到市场上的交源优69的品种鉴定中。
Description
技术领域
本发明属于生物鉴别技术领域，涉及一种基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法，即一种利用水稻DNA插入或缺失分子标记鉴定杂交稻品种交源优69的方法。
背景技术
交源优69属大穗型籼粳杂交超高产品种，由上海交通大学生命科学技术学院选育，具有重要的农业价值和商业价值。该品种特点为穗型大，着粒密，灌浆结实好，株高约129cm，株型紧凑，耐肥，抗性强，剑叶较长，熟期适宜，米质优质，每穗总粒数约291.4粒，实粒数约258.2粒，结实率约88.6％，千粒重约25克，全生育期在170天左右。
栽培稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，具有丰富的遗传多样性。水稻品种鉴定对于水稻遗传研究和品种培育具有重要意义。已经报道的鉴定水稻品种的方法多为粳稻和籼稻亚种的鉴定，如以形态鉴定为基础的“程氏指数法”(包括六个性状：稃毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比)和基于分子标记的粳稻-籼稻鉴定方法等。对某一具体品种是否为特定的水稻品种进行鉴定的方法则限于SNP芯片的一种方法，但SNP芯片价格昂贵，分析周期较长，后续的数据处理繁琐，不能当天得到检测结果。
InDel标记(insertion-deletion length polymorphism)，也叫插入缺失长度多态性，是由于碱基序列的相对插入或者缺失造成的，在基因组中分布广泛，长度从一个核苷酸到几百甚至几万不等。对InDel标记临侧保守的序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示InDel位点在不同个体间的多态性，从而达到鉴定的目的。与应用较广的SSR标记相比，InDel标记具有以下优点：(1)数量十分丰富，广泛分布于各条染色体上；(2)是共显性标记，符合孟德尔遗传规律；(3)设计简单，易于操作，技术重复性好，结果可靠。
发明内容
针对上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法，通过开发的14对特异性引物用以鉴定杂交稻品种交源优69，旨在快速鉴定某特定品种是否为新培育的优质杂交稻品种交源优69，对待鉴定品种进行基因组DNA的提取，使用本研究报道的特定引物对组合对其进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色，当天即可得到品种的鉴定结果，高效、准确、可靠。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定用InDel特异引物对，所述特异引物对如下列表所述：
| 编号 | 引物对名称 | 正向引物序列(5'->3') | 反向引物序列(5'->3') |
| 1_1 | ZFA69_chr1_1 | ATACTGCTCTAGAATCTGTTGATCG | ACTAGCATTGAACTTACATGGTTTC |
| 1_2 | ZFA69_chr1_2 | GAATTAAAAACCATTCCGTGTTGAC | GATTCTTCAATCTTTACCCATCTTC |
| 2_2 | ZFA69_chr2_2 | AGAATACAGAAAATGCATCACTCAC | TGTGTTTGTTGACGTACTTTAGATG |
| 4_1 | ZFA69_chr4_1 | GTCTTCGTTTTGGTTATGGTATTTC | CCTATTCAATGGACCTAGGATGTC |
| 4_2 | ZFA69_chr4_2 | TTAGTCCTTTACTTATGCGTAGTCG | CTACCAGGTGATTATCCATCCATAG |
| 4_4 | ZFA69_chr4_4 | ACTACTATGGGCCTATTTGGTAGAG | ACCTCAGCTCCACTTAAAATAGAAG |
| 5_1 | ZFA69_chr5_1 | GAAGACAACACAATTACAGAGAGAG | GCTGAACTATTGCTGAAAATGTTAC |
| 7_2 | ZFA69_chr7_2 | CTGGTAAACACAAGTGATAATAACC | GTAAGAATTGTTTCCTTGGATATGG |
| 9_1 | ZFA69_chr9_1 | ACATACTTACGTTAGCAGGAATGAG | AAGTAGATATGGAGGATGTGTATGC |
| 9_2 | ZFA69_chr9_2 | ATATCTTTGGTCTCTACCAATACGC | TTCAATTATATATGGACTGTGGTGG |
| 9_3 | ZFA69_chr9_3 | ACACTTGTGTCGCCTTATACTTTAC | ATAGTTCATCTTGTTTCACGTGCC |
| 10_1 | ZFA69_chr10_1 | ATAGACGACACAAGAAGATAGAGAG | ATAGAACACATTCTTAGGTCCGAG |
| 11_2 | ZFA69_chr11_2 | GTCATACCATTAGGCAAATCTACTC | GGTATAACACCTCCTTTCTAAGGC |
| 11_3 | ZFA69_chr11_3 | GTCATGCATTCTGTAAGACCCTAAC | AGTGGCATCTTATGTATTGTTTCAG |
第二方面，本发明提供一种基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法：对InDel标记旁邻保守的序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示InDel位点在不同个体间的多态性，从而达到鉴定的目的；
所述鉴定方法包括步骤如下：
步骤一、选取水稻植株的任何器官或组织提取总DNA；
步骤二、用所述引物对扩增步骤一所述DNA；
步骤三、对步骤二所述扩增的产物进行凝胶电泳分析，14个位点的结果完全一致，则为杂交稻品种交源优69。
优选地，步骤一中，所述提取总DNA具体是指用CTAB法提取核基因组DNA。
优选地，步骤二中，所述扩增体系：20μL，包括30-50ng的模板的DNA，0.25个单位的DNA聚合酶(申能博彩)，2.0μL的10×Buffer(含Mg2+)，2.0mM dNTPs 2μL，1.0μL的二甲基亚砜(DMSO)；
所述扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸10min。
步骤二中，本发明使用的聚合酶链式扩增体系为常规PCR体系，不需要特殊的PCR仪和特殊的反应试剂，任何公司生产的PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可使用而达到目的。
优选地，步骤三中，凝胶电泳具体：加入适量上样缓冲液于步骤二所述扩增的产物中，在22V/cM恒定电场强度下，经10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟后，银染显色；含有水稻DNA的样品在前述14对引物组合时，能分别在不同位点(引物对)上扩增出现明显的多态性带型(下面的两条主带和上面的重组带)。
本发明利用粳稻品种(日本晴)与籼稻品种(93-11)的全基因组DNA序列的比对而获得插入/缺失差异片段所设计的14对特异DNA引物。对交源优69及其亲本交源5A和JP69进行DNA提取、DNA片段扩增和电泳分离以及电泳图谱的分析来鉴定交源优69。具体而言，利用14对InDel引物组合，基于聚合酶链式反应和凝胶垂直饭电泳获得的指纹图谱进行分析，根据14个InDel位点的电泳带型，进而确定是否是杂交稻品种交源优69。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明利用水稻全基因组特异位点上的InDel片段差异设计的特异引物，籼-粳杂合带型来鉴定杂交稻交源优69，方法简便，样品用量少，准确性高，速度快；基于PCR扩增反应，利用籼-粳稻14个位点上的InDel片段序列差异和PCR反应的快速高效性，在短时间内能精确鉴定杂交稻品种交源优69；本发明方法简便、快捷，有很好的应用推广前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为PCR电泳图，泳道1至泳道4分别为水稻品种日本晴、交源5A、JP69和交源优69。从图1可以看出，杂交稻品种交源优69在14个位点均为杂合子，具有两条亲本带型(交源5A和JP69)以及重组带。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Smbrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
所述水稻14个InDel标记为水稻品种日本晴序列和水稻品种93-11序列所示核苷酸序列，共同构成的DNA序列差异。
实施例1、水稻功能基因的图位克隆
利用该发明所用的引物对和基于粳稻-籼稻杂交构建的突变体定位群体进行水稻基因的图位克隆。
使用扩增体系为：20μL，包括30-50ng的模板的DNA，0.25个单位的DNA聚合酶(申能博彩)，2.0μL的10×Buffer(含Mg2+)，2.0mM dNTPs 2μL，1.0μL的二甲基亚砜(DMSO)；
使用扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸10min。
电泳检测：加入适量上样缓冲液于步骤二所述扩增的产物中，在22V/cM恒定电场强度下，经10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟后，银染显色；含有水稻DNA的样品在前述14对引物组合时，能分别在不同位点(引物对)上扩增出现明显的多态性带型。水稻样品扩增的电泳产物为：1)与参考基因组日本晴的带型一致(亲本一，如这里的交源5A)；2)与参考基因组日本晴的带型不一致(亲本二，如这里的JP69)；3)具有两种带型和重组带型的杂合子(F1代，如这里的交源优69)。
实施例2、水稻粳稻品种和籼稻品种的种质资源鉴定
以该发明下述引物对用于水稻品种交源优69的鉴定。
利用InDel分子标记鉴定水稻品种日本晴、交源5A、JP69和交源优69。
使用扩增体系为：20μL，包括30-50ng的模板的DNA，0.25个单位的DNA聚合酶(申能博彩)，2.0μL的10×Buffer(含Mg2+)，2.0mM dNTPs 2μL，1.0μL的二甲基亚砜(DMSO)；
使用扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸10min。
电泳检测：加入适量上样缓冲液于步骤二所述扩增的产物中，在22V/cM恒定电场强度下，经10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟后，银染显色；含有水稻DNA的样品在前述14对引物组合时，能分别在不同位点(引物对)上扩增出现明显的多态性带型。水稻样品扩增的电泳产物为：1)与参考基因组日本晴的带型一致(如这里的交源5A)；2)与参考基因组日本晴的带型不一致(如这里的JP69)；3)具有两种带型和重组带型的交源优69。
图1：利用该发明的14对引物对的组合(电泳条带包括两条主带和重组带)可以对交源优69进行准确的鉴定，单独某个引物对并不具有说服力。
由上述结果可见，同一水稻品种在14个InDel特异位点上表现出的籼稻和粳稻基因型是不一样的，交源优69会出现除两条主带外的重组带，通过对所有特异位点带型的读取记录和统计，可以确定样品是否为交源优69。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (5)
1.一组基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定用InDel特异引物对，其特征在于，所述特异引物对如下列表所述：
2.一种基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括步骤如下：
步骤一、选取水稻植株的任何器官或组织提取总DNA；
步骤二、用权利要求1所述引物对扩增步骤一所述DNA；
步骤三、对步骤二所述扩增的产物进行凝胶电泳分析，14个位点的结果完全一致，则为杂交稻品种交源优69。
3.根据权利要求2所述的基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法，其特征在于，步骤一中，所述提取总DNA具体是指用CTAB法提取核基因组DNA。
4.根据权利要求2所述的基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法，其特征在于，步骤二中，所述扩增体系：20μL，包括30-50ng的模板的DNA，0.25个单位的DNA聚合酶，2.0μL的10×Buffer，2.0mM dNTPs 2μL，1.0μL的二甲基亚砜；
所述扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述的基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法，其特征在于，步骤三中，凝胶电泳分析具体为：加入适量上样缓冲液于步骤二所述扩增的产物中，在22V/cM恒定电场强度下，经10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟后，银染显色。
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| CN201510171095.8A CN104789671B (zh) | 2015-04-10 | 2015-04-10 | 基于InDel标记的杂交稻品种交源优69的鉴定方法 |
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Citations (5)
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- 2015-04-10 CN CN201510171095.8A patent/CN104789671B/zh not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (2)
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| 新一代遗传标记——InDel研究进展;孙宽 等;《法医学杂志》;20130430;第29卷(第2期);134-139,143 * |
| 水稻功能基因组育种数据库(RFGB):3K水稻SNP与InDel子数据库;郑天清 等;《科学通报》;20150228;第60卷(第4期);367-371 * |
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