CN101338338A - 杂草稻红色果皮基因的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及杂草稻红色果皮基因的分子标记方法，属于分子遗传学领域。利用水稻品种02428(白色果皮)与扬中杂草稻(红色果皮)杂交，明确扬中杂草稻红色果皮基因是显性单基因，由母体基因型决定，正反交结果表明无细胞质效应。根据已克隆的普通野生稻的红色果皮基因Rc的基因结构设计了InDel标记RID14，该InDel标记与杂草稻红色果皮基因的共分离。利用该标记可以准确有效地从栽培稻中鉴别出红米杂草稻及其衍生系，可以为杂草稻的鉴别提供分子依据。
Description
技术领域
本发明提供了杂草稻红色果皮的分子标记鉴定方法，属于分子遗传学领域，专用于杂草稻的红色果皮基因型的分子鉴定。
技术背景
水稻亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，为世界上近一半的人口提供粮食。但是，现在水稻的生产受到越来越严重的杂草危害，尤其是与它同属于一个生物物种的杂草稻(Oryza sativa L.f spontaneous)。杂草稻是广泛分布在世界各地稻田中的一种恶性杂草，能降低水稻的产量和质量。因其果皮常为红色，杂草稻也被称为红米稻(Red rice)。由于杂草稻与栽培稻的亲缘关系很近，杂草稻比稻田中的其它杂草更难防除。
由于水资源和农村劳动力的缺乏，包括中国在内的许多国家的水稻栽培方式都正在从传统的移栽方式向省水省劳动力的直播方式转变，杂草的管理方式从精细向粗放转变，这些耕作方式和管理方式的改变为杂草稻的生长和扩散提供了有利的条件。因此，近年来，杂草稻给世界各地的水稻生产造成了越来越严重的影响，在中国东北和江苏地区也频繁的发现杂草稻，并迅速扩散，治理杂草稻成为刻不容缓的事情。
杂草稻是直播稻田水稻生产主要危害因素，在苗期其形态特征与栽培稻完全一致，难以早期发现，杂草稻生命力旺盛，分蘖力强，与栽培稻竞争营养，多数抽穗早，落粒性强，对水稻生产造成危害，同时少量的杂草稻种子混入栽培稻，一方面影响稻米外观品质，另一方面可以随种子运输，加剧杂草稻的流行和泛滥，给水稻生产造成更为严重的危害。因此，急需建立可以对杂草稻基因型进行鉴定的技术体系，一方面对直播稻田中杂草稻进行早期鉴定，另一方面可以对杂草稻危害的预测预报提供依据。
世界各国发现的杂草稻决大多数是红色果皮，红色果皮是杂草稻的基本特征之一，而决大多数栽培稻是白色果皮，因此杂草稻区别于栽培稻的重要特征是果皮颜色，而果皮颜色只有在种子成熟以后才能观察到，为此本研究开发了可以对果皮颜色进行基因型鉴定的共显性分子标记，为建立杂草稻鉴定的技术体系奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是：提供江淮流域杂草稻鉴别的分子标记方法，利用本研究开发的基于PCR的实用经济型标记，可以有效地从栽培稻中鉴定出红米杂草稻，为杂草稻的鉴别提供分子证据。
本发明所提供的可鉴别杂草稻和栽培稻的InDel标记RID14，是通过以下方法获得的：
1)在江苏收集到目前在水稻直播稻田危害生产的杂草稻，其颖壳为草黄色，其果皮为红色，也称为“红米稻”。将收集到材料与广亲和粳稻品种02428配组正反交杂交组合F1。杂草稻作母本，其杂种的果皮颜色为红色，以02428作母本，其杂种果皮颜色为白色，收获正反交F1所结F2种子果皮颜色都为红色，F2所结F3种子果皮颜色分离，红色果皮：白色果皮分离比例符合3∶1，说明控制杂草稻红色果皮基因为显性单基因控制，并由母体基因型决定。
2)普通野生稻(O.rufipogon L.)是栽培稻(O.sativa L.)的祖先，普通野生稻的果皮为红色，控制其果皮颜色的基因Rc已经克隆(2006，Plant Cell)。Rc编码b-HLH型转录因子，正调控原花色素(Proanthocyanidin)的合成，其等位基因rc在第6外显子存在14bp的缺失，导致翻译提前终止。我们根据这14bp缺失设计了InDel标记，
InDel标记RID14引物序列如下：
上游引物：5′TCCAGGCACCACACAGAGA 3′
下游引物：5′GGCACTGAAATCACCTTGG 3′
对普通野生稻(红色果皮)的基因组DNA扩增产物为154bp，而栽培稻(白色果皮)的基因组DNA扩增产物为140bp。通过对杂草稻PCR产物测序证实，控制杂草稻的红色果皮基因与普通野生稻一致。
3)利用SDS方法提取02428与杂草稻的F2群体各单株的DNA，利用InDel标记RID14引物进行PCR，扩增产物在8％聚丙烯酰胺进行电泳或者3.5％的琼脂糖电泳分析，我们发现该标记与红色果皮共分离。即该标记是共显性标记，能对果皮颜色的纯合基因型和杂合基因型进行准确鉴定，标记基因型为RcRc，Rcrc的单珠，其果皮颜色为红色，标记基因型为rcrc的单珠，其果皮颜色为白色。标记基因型RcRc：Rcrc：rcrc符合1∶2∶1的比例(图1)。
4)利用该标记对江淮流域杂草稻以及近年来收集到的危害江苏水稻生产的杂草稻共24份材料(红色果皮)扩增出154bp片段，而所有白色果皮扩增出140bp片段，说明该标记可以准确鉴定红色和白色果皮基因型(图2)。
扩增杂草稻DNA，能够扩出154bp的扩增片段，而栽培稻扩增出140bp片段。由于该标记是基于果皮颜色控制基因Rc而设计的共显性分子标记，可进行基因型鉴定，即可以对果皮颜色基因的纯合基因型和杂合基因型进行鉴别。
本研究所提供的鉴别杂草稻的分子标记方法，具有如下优点：
通过本发明分子标记在国际上首次获得了对杂草稻和栽培稻进行果皮颜色基因型鉴别的共显性分子标记。
本发明的分子标记可以从栽培稻中鉴别出杂草稻，准确可靠，鉴定方便。杂草稻的基本特征之一是红色果皮，通过分子标记检测可以判断栽培稻中是否有杂草稻或者有杂草稻趋向的栽培稻。该标记检测快速经济而有效，不受环境影响。利用该标记对在江淮流域所收集到的杂草稻和栽培稻能准确地鉴定和区分。
附图说明
图1引物RID14对“W16/02428”F2群体扩增PAGE胶结果；(P1为杂草稻W16，P2为02428，F1为杂种，1-44为F2群体的部分单株)
图2引物RID14对48份材料PAGE胶结果，杂草稻、普通野生稻、Dular、Kasalath为红色果皮，带型一致，而其余19份白色果皮材料带型一致；(M为DNA ladder；a为200bp；b为150bp；c为100bp；杂草稻24份：1-24道；普通野生稻3份：43-45道；Dular：30道；Kasalath：42道；)
具体实施方法
下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、一种鉴别杂草稻的分子标记的获得
1供试材料
利用从江苏扬中收集到杂草稻W16与粳型广亲和品种02428，以及其杂种F1、F2群体。
2果皮颜色鉴定
随机取材料成熟种子10粒，用出糙机将种子外壳脱去或直接用手剥去外壳，查看种子果皮颜色。
3红色果皮遗传分析群体
2005年利用从扬中收集到的红色果皮杂草稻，编号为W16，与白色果皮广亲和粳稻品种02428配制正反交杂交种F1，2006年种植F1并收获F2种子，2007年种植F2群体200株，并在分蘖期取叶片以提取DNA，并收获F3种子。当W16作母本时，杂种F1种子果皮颜色为红色；02428做母本时，杂种F1种子果皮颜色为白色，F2种子果皮颜色都是红色，F3种子果皮颜色出现红色和白色的分离，说明红色果皮受核基因控制，与细胞质无关。由于果皮是由胚囊发育形成的，由母本基因型决定。F3种子果皮颜色由F2基因型决定，红色果皮与白色果皮的比例符合3∶1，说明杂草稻的红色果皮对白色果皮是由单基因控制的显性性状。
4DNA提取
在水稻分蘖期或孕穗期取1克左右水稻叶片，利用SDS方法提取DNA。
DNA提取参照Dellapporta等(1983)的方法，略有修改，具体步骤如下：
①取200-300mg新鲜水稻叶片(-20℃保存的叶片)，在-20℃预冷研钵中用液氮研磨成粉末。
②转移到1.5m1离心管中。
③加入600ul SDS提取液摇匀，65℃，温浴30min，振荡3-4次。
④加入1/4体积(约100ul)KAc，摇匀。
⑤加入1/2体积(约300-400ul)的氯仿∶异戊醇(体积比：24∶1)，振荡器上充分摇匀(120rpm，30min)。
⑥室温下6000-8000rpm离心15min，取上清。
⑦加入2倍体积(700ul左右)-20℃预冷的无水乙醇、摇匀，-20℃自由沉淀20min。
⑧室温下12000rpm离心6min，弃上清，沉淀用等体积(400ul左右)70％乙醇洗涤10min。
⑨弃70％乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于200ul TE(1/10)，4℃保存备用。
用0.8％的琼脂糖电泳检测DNA样品质量。
5引物设计及PCR反应
Megan(Plant cell，2006，18：283-294)利用图位克隆方法从普通野生稻(O.rufipogon)克隆了控制红色果皮基因Rc，Rc基因编码bHLH转录因子，其等位基因rc第6外显子缺失14bp导致该基因功能丧失，形成白色果皮。横跨该缺失设计PCR引物RID14，红色果皮RID14PCR产物为154bp，白色果皮RID14PCR产物为140bp，采用Primer 5软件。
RID14-For：5′TCCAGGCACCACACAGAGA 3′
RID14-Rev：5′GGCACTGAAATCACCTTGG 3′
引物合成由Invitrogen公司完成。将合成的引物用ddH2O稀释为10pmol/μl，-20℃保存备用。
以提取的DNA为模板，按下列反应体系进行PCR。PCR反应体系(25μl)为：DNA2.0μl，上游引物RID14-For 0.5μl，下游引物RID14-Rev 0.5μl，10×buffer 2.5μl，MgCl2(5mmol/L)2μl，Taq酶0.25μl，dNTP(2.5mmol/L)1μl，纯水16.25μl。扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，延伸10min；10℃，冷却10min，结束反应。PCR反应在MJ PTC200热循环仪中进行，扩增产物加入指示剂(0.25％溴酚兰、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖水溶液)，将扩增产物利用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染进行显带分析。或者在3.5％琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成相系统保存图象。
利用标记RID14引物对“W16/02428”F2群体单株进行PCR分析(图1)，我们发现标记基因型与表现型完全一致，即红色果皮RID14纯合基因型和RID14杂合基因型，其表现型均为红色，而所有白色果皮RID14基因型都与02428一致。这一结果说明02428白色果皮的基因是转录因子Rc的等位基因rc控制。
该标记与果皮颜色共分离，并能对果皮颜色的纯合和杂合基因型鉴别。
实施例2：利用RID14标记对江淮流域杂草稻和品种资源的标记基因型分析
杂草稻材料包括连云港穞稻3份，安徽怀远塘稻、来安塘稻、全椒塘稻、肥东塘稻各1份，由江苏省农业科学院粮食作物研究所品种资源室保存，以及本课题组近年来在江苏扬州、南通、镇江、泰洲、盐城收集到的杂草稻17份材料。
用于分析的其他材料分类上包括亚洲栽培稻(Oryza Sativa L.)(籼稻，粳稻)及栽培稻的祖先普通野生稻(Oryza Rufipogen)；地理分布上包括中国、印度、韩国、美国、泰国的品种资源共340份。这些材料既有大面积推广栽培品种，也包括地方品种，如太湖流域地方品种。Dular是来源于印度的Aus群的一个地方品种，具有红色果皮，它具有比02428更强的亲合力与亲合谱，是常用的广亲和基因资源；Kasalath是来源于印度的籼稻品种资源，具有红色果皮。其它籼稻如：9311，IR24，IR36，南京11，南京14，南京16，IR58，扬辐籼2号，扬稻1号，镇籼96，桂朝2号，密阳23，湖南早，早香1号，中早9号，成矮29，茉莉香籼，云南籼，小麻占，紫B，制5，多恢43等；粳稻包括日本晴，武育粳3号，武运粳7号，武粳15，南粳41，徐稻3号等。
我们利用该标记对江淮流域杂草稻，3个普通野生稻以及分布于中国和世界各地的品种资源材料进行了RID14标记分析。RID14标记PCR产物聚丙烯酰氨胶部分电泳结果见图2。24份杂草稻材料，3份普通野生稻，Dular和Kasalath是红色果皮，其带型一致，白色果皮品种资源材料共335份材料的带型也都一致。
红色果皮是杂草稻的基本特征之一，而大面积推广的高产栽培水稻品种都是白色果皮，只有极少数地方品种资源是红色果皮，因此利用该标记可以从栽培稻尤其是大面积推广的品种中鉴别出杂草稻。
Claims (2)
1、鉴别杂草稻红色果皮基因的分子标记方法，其特征在于：
开发了可以准确鉴别杂草稻果皮颜色基因型的共显性InDel标记RID14
上游引物：5′TCCAGGCACCACACAGAGA 3′
下游引物：5′GGCACTGAAATCACCTTGG 3′
扩增杂草稻DNA，能够扩出154bp的扩增片段，而栽培稻扩增出140bp片段。
2、根据权利要求书1所述杂草稻红色果皮基因型鉴定的分子标记，其特征在于，获得基因型选择标记引物的过程如下：
1)在江苏收集到目前在水稻直播稻田危害生产的杂草稻，其颖壳为草黄色，其果皮为红色，也称为“红米稻”。将收集到材料与广亲和粳稻品种02428配组正反交杂交组合F1。杂草稻作母本，其杂种的果皮颜色为红色，以02428作母本，其杂种果皮颜色为白色，收获正反交F1所结F2种子果皮颜色都为红色，F2所结F3种子果皮颜色分离，红色果皮：白色果皮分离比例符合3∶1，说明控制杂草稻红色果皮基因为显性单基因控制。
2)普通野生稻(O rifopogon)是栽培稻的祖先，普通野生稻的果皮为红色，控制其果皮颜色的基因Rc已经克隆(Plant cell，2006，18：283-294)。Rc编码b-HLH型转录因子，正调控原花色素(Proanthocyanidin)的合成，其等位基因rc在第6外显子存在14bp的缺失，导致翻译提前终止。我们根据这14bp缺失设计了InDel标记，对普通野生稻(红色果皮)的基因组DNA扩增产物为154bp，而栽培稻(白色果皮)的基因组DNA扩增产物为140bp。
3)利用SDS方法提取02428与杂草稻的F2群体各单株的DNA，利用InDel标记引物进行PCR，扩增产物在8％聚丙烯酰胺进行电泳分析或者3.5％琼脂糖电泳分析，我们发现该标记与果皮颜色共分离(图1)。标记基因型RcRc∶Rcrc∶rcrc符合1∶2∶1的比例。
4)利用该标记对江淮流域的杂草稻包括连云港穞稻3份，安徽怀远塘稻，来安塘稻，全椒塘稻，肥东塘稻，以及近年来在江苏收集到的杂草稻共24份材料(红色果皮)扩增出154bp片段，而335份分布于世界各地的栽培稻(白色果皮)扩增出140bp片段，利用该标记可以准确鉴定红色和白色果皮基因型(图2)。
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