CN108342392A - 一个叶绿体定位基因ToxABP1-V及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个叶绿体定位基因ToxABP1‑V及其应用。ToxABP1‑V的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。该基因来自二倍体簇毛麦，能与白粉病抗性相关基因CMPG1‑V互作，在抗白粉病二倍体簇毛麦中受白粉菌诱导下调表达。通过单细胞瞬间沉默技术将该基因RNAi沉默载体pWMB006‑ToxABP1转化感病小麦品种扬麦158，结果表明瞬间沉默ToxABP1可以降低扬麦158的吸器指数。通过转基因技术获得3棵阳性RNAi转基因植株，其对小麦白粉病表现出中高抗性水平。因此，ToxABP1‑V可望用于基因工程育种。

Description

一个叶绿体定位基因ToxABP1-V及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个叶绿体定位基因ToxABP1-V及其应用。

背景技术

由专性寄生真菌小麦白粉病菌(Blumeria graminis DC f.sp.tritici)引起的小麦白粉病是小麦(Triticum aestivum L.,2n＝6x＝42,基因组AABBDD)最严重的叶部病害之一，在中国及其他许多国家广泛发生。该病在小麦整个生育期都可发生，并且可侵害小麦地上植株各个部分，以叶片和叶鞘为主。

随着栽培品种、栽培条件以及气候条件的影响，目前我国小麦白粉病危害呈加重趋势。白粉病能用杀菌剂防治，但化学防治必然增加人力、物力投入，而且还会引起环境污染等生态问题，因此发掘抗病基因、培育抗病品种是防治小麦白粉病的有效措施。明确小麦抗白粉病的机制，克隆抗病相关基因，可以为小麦白粉病防治、小麦抗白粉病育种提供重要的理论和物质基础。

栽培小麦的近缘物种在长期进化和自然选择过程中，保留了大量的抗病虫害、抗逆、优质等有益基因，是普通小麦品种改良的重要基因来源，因此，研究和利用亲缘物种抗病基因，是改良小麦抗病性的重要途径。

簇毛麦(Haynaldia villosa L.,2n＝2x＝14,基因组VV,)是普通小麦的二倍体近缘物种，具有高抗白粉病的优良性状。在研究过程中发现，来自簇毛麦的CMPG1-V基因受白粉病诱导快速上调表达，在抗白粉病中发挥重要的正向调控作用。CMPG1-V基因编码一个E3连接酶，参与泛素化过程，识别目标底物蛋白并对其进行泛素化修饰(Hershko A,TheUbiquitin System.Springer,1998)，或与底物蛋白互作或通过26S蛋白酶体将底物蛋白降解。为筛选CMPG1-V基因的互作蛋白，构建了簇毛麦叶片酵母双杂交cDNA文库(III Gold Cloning Kit,Stratagene)，以CMPG1-V基因为诱饵利用酵母双杂交技术、筛选簇毛麦酵母双杂交cDNA文库，获得了一个编码ToxinA BindingProtein 1(ToxABP1-V)。该基因在簇毛麦叶片中受白粉菌诱导下调表达；利用单细胞瞬间沉默技术(参考文献：Schweizer,P.,A.Christoffel and R.Dudler,Transientexpression of members of the germin-like gene family in epidermal cells ofwheat confers disease resistance.Plant J,1999.20(5):p.541-52.)对ToxABP1-V进行了功能验证，结果显示，利用基因枪在感白粉病的小麦品种扬麦158(公知公用材料,周祥胜等,小麦扬麦158的特征特性及其栽培要点.浙江农业科学,1999(06):13-14.)叶片中瞬间沉默ToxABP1，能够显著降低白粉菌的吸器指数；进一步利用基因枪介导的遗传转化技术(邢莉萍.小麦/簇毛麦抗白粉病相关基因的转化及功能鉴定[D].南京农业大学，2007)，将ToxABP1-V基因的RNAi沉默载体pWMB006-ToxABP1转化扬麦158中，获得转基因阳性植株，分子鉴定和抗性鉴定结果表明，沉默该基因可以提高白粉病抗性，表明该基因在小麦白粉病抗性中发挥负调控功能。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一个叶绿体定位基因ToxABP1-V。

本发明的另一目的是提供该基因的RNAi沉默载体。

本发明的又一目的是提供该基因和RNAi沉默载体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

基因ToxABP1-V，来自二倍体簇毛麦，可以和白粉病抗性相关基因CMPG1-V互作,其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

该基因编码的蛋白质ToxABP1-V，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

构建ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006插入片段序列为SEQ ID NO.2

所述的含有权利要求1所述的ToxABP1-V基因的沉默载体，优选以pWMB006为出发载体，将权利要求1所述的ToxABP1-V基因的200bp片段(SEQ ID NO.2)分别反向插入pWMB006载体的Kpn I和BamH I酶切位点间以及正向插入pWMB006载体的Spe I和Sac I酶切位点间所得。

所述的ToxABP1-V基因的RNAi沉默载体在抗白粉病小麦品种中的应用。

有益效果

本发明从簇毛麦中克隆得到了一个与小麦白粉病抗性基因CMPG1-V的互作基因ToxABP1-V及其所编码的蛋白质ToxABP1-V。ToxABP1-V可用于基因工程育种，将其片段插入RNAi载体pWMB006，得到该基因的RNAi沉默载体导入感病小麦品种扬麦158中，可以提高扬麦158对白粉病的抗性。

附图说明

图1利用酵母双杂交克隆CMPG1-V的互作基因ToxABP1-V，上行为：SD-His,Leu,Trp+X-α-Gal培养基，下行为SD-Ade,His,Leu,Trp培养基；从左至右分别为pGADT7-T+pGBKT7-p53(阳性对照)、pGADT7+pGBKT7(阴性对照)、pGBKT7-CMPG1-V+pGADT7-ToxABP1-V图2ToxABP1-V在二倍体簇毛麦白粉菌诱导后的叶片中的实时荧光定量RT-PCR分析X轴：0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h分别表示簇毛麦叶片受白粉菌诱导的不同时间段；Y轴：ToxABP1-V基因在不同样品中受白粉菌诱导前后的表达倍数。

图3 ToxABP1-V基因RNAi沉默载体构建图谱

图4利用单细胞瞬间沉默技术研究ToxABP1-V抗白粉病效应

图5 ToxABP1-V基因RNAi沉默载体转化扬麦158的T₀代阳性转基因植株PCR分子鉴定结果泳道1为Marker，泳道2为水空白对照，泳道3为未转化扬麦158对照，泳道4为包含目的基因的质粒，泳道4-13依次为阳性转化植株RNAi-ToxABP1-T₀-24、RNAi-ToxABP1-T₀-39、RNAi-ToxABP1-T₀-59、RNAi-ToxABP1-T₀-66、RNAi-ToxABP1-T₀-87、RNAi-ToxABP1-T₀-93、RNAi-ToxABP1-T₀-102、RNAi-ToxABP1-T₀-107、RNAi-ToxABP1-T₀-29-2。

图6 ToxABP1-V基因RNAi沉默载体转化扬麦158的T₀代阳性植株Q-RT-PCR分析结果X轴：受体扬麦158、以及上述9棵转基因阳性植株；Y轴：ToxABP1-V基因在转基因植株中相对于扬麦158的表达倍数。

图7 ToxABP1-V基因RNAi载体转化扬麦158T₀代植株白粉病离体鉴定

具体实施方式

实施例1利用酵母双杂交筛选CMPG1-V互作蛋白，并克隆ToxABP1-V基因

CMPG1-V是南京农业大学细胞遗传研究所克隆的一个位于二倍体簇毛麦6V上的白粉病抗性相关基因(参考文献：Zhu,Y.,Li,Y.,Fei,F.,Wang,Z.,Wang,W.,Cao,A.,Liu,Y.,Han,S.,Xing,L.,Wang,H.,Chen,W.,Tang,S.,Huang,X.,Shen,Q.,Xie,Q.,and Wang,X..E3ubiquitin ligase geneCMPG1-V from Haynaldia villosa L.contributes topowdery mildew resistance in common wheat(Triticum aestivum L.).The PlantJournal.2015.84,154-168)，以CMPG1-V为诱饵，用聚乙二醇-醋酸锂转化法筛选酵母双杂交cDNA文库，得到一个CMPG1-V的互作基因(图1)。对该互作基因测序，该序列编码一个ToxinA binding protein1的C端186个氨基酸，根据其同源基因设计了同源克隆引物P1(CAATAGCCTTTCCTCGCACCTG,SEQ ID NO.4)以及P2(CGAGTACTACACCACGCAAAGAGCAG,SEQ IDNO.5)克隆得到1038bp序列，该序列如SEQ ID NO.1所示。通过NCBI网站中的ORF finder搜索该序列，发现其包含一个全长ORF的基因，其中5’-UTR(非翻译区)长116bp、3’-UTR长61bp、ORF(开放阅读框)861bp，编码286个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示，将该基因命名为ToxABP1-V。

实施例2ToxABP1-V基因受白粉菌诱导的表达特征

把抗白粉病的簇毛麦种子(参考文献：齐莉莉，陈佩度，等，小麦白粉病新抗源—基因Pm21，作物学报，1995，21(3):257-262)播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵(周围用圆柱状透明塑料片隔离，顶端用滤纸封闭，形成无白粉菌的环境)。待三叶期，把在感病品种苏麦三号上培养的南京本地混合白粉菌新鲜孢子轻轻抖落在簇毛麦的幼苗上。接种白粉菌后的簇毛麦在16℃继续培养。接种后0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h取样，置于-70℃冰箱内保存备用。用TRIZOL(Invitrogen)提取受白粉菌诱导的簇毛麦叶片的RNA，利用AMV酶(Takara)合成反转录第一链，得到反转录产物。

应用能特异扩增ToxABP1-V的特异引物P3(CAGCAACGAGGACAGGGAT,SEQ ID NO.6)和P4(CTCAAGCAAACGGAACAA，SEQ ID NO.7)，对该基因在受白粉菌诱导样品中进行Q-PCR分析。PCR反应在Q-PCR仪(Roche Light Cycler 480，Roche)上扩增。20μl PCR反应体系中含2μl cDNA,10μl 2×SYBR EX Taq TM(TakaRa)，0.4μl引物P1(10μM)和P2(10μM)。扩增参数为：95℃5min，然后95℃10s、60℃30s，72℃15s，共41个循环。反应结束后，计算相对表达量：根据得到的CT值计算目标基因在处理后的不同时间点相对于未处理的相对表达量，即2^-△△CT。其中，△△C_T＝(C_T.Target-C_T.Tublin)_{Time x}-(C_T.Target-C_T.Tublin)_{Time 0}。Time x表示任意时间点，Time 0表示未处理点。结果表明：在簇毛麦叶片中ToxABP1-V受白粉菌诱导后6小时后下调表达，在簇毛麦叶片受白粉菌诱导72h后表达水平达到最低值为0.02％。Q-PCR的结果表明，ToxABP1-V可能与白粉病抗性负向相关(图2)。

实施例2ToxABP1-V基因RNAi沉默载体的构建

利用上述经白粉菌诱导后的簇毛麦cDNA为模板，以可特异扩增ToxABP1-V基因片段(SEQ ID NO.2)的引物对P5(GGGGTACCCCATATCGTCGCTTCCGTTC,SEQ ID NO.8)和P6(CGGGATCCAGTTCTTGTAGGACTGTAC，SEQ ID NO.9)进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和KpnI双酶切将扩增目标片断插入到载体pWMB006(参考文献：Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile genefusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6:3901-3907)的Ubiquitin启动子后面的多克隆位点BamHI和KpnI之间；以可特异扩增ToxABP1-V基因片段(SEQ ID NO.2)的引物P7(GGACTAGTCCATATCGTCGCTTCCGTTC,SEQ ID NO.10)和P8(CGAGCTCAGTTCTTGTAGGACTGTAC,SEQ ID NO.11)进行PCR扩增，回收扩增片段。用Spe I和Sac I双酶切将扩增目标片断插入到载体pWMB006的Osintron后面的多克隆位点Spe I和Sac I之间。由此获得ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1(图3)。

实施例3利用单细胞沉默方法将ToxABP1-V基因RNAi载体转入小麦叶片

单细胞瞬间沉默方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(参考文献：Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the FunctionalAssessment of Defense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654)。本研究利用单细胞瞬间沉默方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒轰击到小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击后的GUS细胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。

载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：

制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中，加入1ml 70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使金粉完全沉淀。12,000rpm离心1min后弃上清。加入1ml ddH₂O，涡旋混匀后，离心弃上清(重复3次)。最后加入500μl 50％甘油涡旋混匀，备用。

包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA(总量应为1μg，如质粒浓度较大不够5μl的用ddH₂O稀释成5μl/1μg的浓度)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl 2.5M CaCl₂，然后加入20μl 0.1M亚精氨(现配现用)，涡旋3min。

静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl 70％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入140μl 100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl 100％酒精，充分涡旋，以备使用。

实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25(参考文献：ChristensenA H,Quail P H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression ofselectable and/or screenable marker genes in monocotyledonousplants.Transgenic Research,1996,5:213-218)的质粒DNA与钨粉包裹；实施ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1与GUS基因共转化时，将含有ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1的质粒DNA与含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。GUS基因与ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1进行共转化，Marker基因GUS转入的细胞也是ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经GUS染色后整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色细胞作为ToxABP1基因沉默的细胞。

基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：0.1molL Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.0)，含10mmolL EDTA，5mmolL铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100，20％甲醇，)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。

白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，细胞会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞，其吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(公知公用,Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment ofDefense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。

当单独转化GUS基因时，感白粉病小麦品种扬麦158中的吸器指数为47.86％；当GUS基因与ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1共转化感白粉病小麦品种扬麦158后，统计了GUS基因表达且有白粉菌互作的细胞的吸器指数，结果表明当ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1转入后，扬麦158的吸器指数显著下降至20.48％(图4)。该结果说明，瞬间沉默ToxABP1可以显著地降低吸器指数，ToxABP1-V对小麦抗白粉病具有负向调控作用。

实施例4ToxABP1基因沉默载体pWMB006-ToxABP1稳定遗传转化及基因功能研究

利用基因枪介导的遗传转化方法(邢莉萍.小麦/簇毛麦抗白粉病相关基因的转化及功能鉴定[D].南京农业大学，2007)将pWMB006-ToxABP1转化感病品种扬麦158的幼胚愈伤组织。挑取预培养7d的约2500个扬麦158幼胚愈伤组织，轰击前在高渗培养基(MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理6–8h，将ToxABP1-V基因RNAi载体pWMB006-ToxABP1通过基因枪轰击法转化到扬麦158愈伤组织中，轰击后在高渗培养基上继续培养16h。之后将愈伤组织转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+4mg/LBialaphos，pH5.8)，筛选培养4周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺l mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中，至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2d，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共107棵。提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用基因内部引物P9(CGGGATCCAGTTCTTGTAGGACTGTAC,SEQ IDNO.12)和水稻内含子序列特异引物P10(ACTGCCGTGGAACTGTCATA，SEQ ID NO.13)进行PCR扩增，鉴定阳性转基因植株。PCR程序：50-100ng/ul基因组模板，10μM的P5和P6各0.5μl；2.5μl10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg²⁺；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃45s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测，其中3株可以扩增736bp的目的条带，鉴定为阳性植株，株系编号依次为：RNAi-ToxABP1-T0-24；RNAi-ToxABP1-T0-39；RNAi-ToxABP1-T0-59；RNAi-ToxABP1-T0-66；RNAi-ToxABP1-T0-87；RNAi-ToxABP1-T0-93；RNAi-ToxABP1-T0-102；RNAi-ToxABP1-T0-107；RNAi-ToxABP1-T0-29-2(图5)。提取了这9棵阳性植株的RNA，利用qPCR鉴定各个阳性植株中ToxABP1基因的表达情况。结果表明：RNAi-ToxABP1-T0-24；RNAi-ToxABP1-T0-39；RNAi-ToxABP1-T0-66这三棵转基因阳性植株的ToxABP1的表达量显著降低至扬麦158中的表达量的3-8％。RNAi-ToxABP1-T0-59；RNAi-ToxABP1-T0-87；RNAi-ToxABP1-T0-93；RNAi-ToxABP1-T0-102；RNAi-ToxABP1-T0-29-2，5棵转基因植株的ToxABP1的表达量为扬麦158表达量的30-65％。RNAi-ToxABP1-T0-107这棵转基因阳性植株的表达量为扬麦158的1.18倍，略有提高(附图6)。

苗期白粉病抗性采用江苏南京地区田间采集的白粉病菌混合菌种，对所有PCR鉴定的T₀代阳性植株以及扬麦158的离体叶片进行白粉病抗性鉴定。苗期白粉病抗性鉴定标准采用“0-5级”白粉病抗性反应型的分级标准，0-1级为高抗、2-3级为中抗、4-5级以上为感病。成株期抗性采用江苏南京地区田间采集的白粉病菌混合菌种在田间接种T0代阳性植株以及扬麦158并进行白粉病抗性鉴定。成株期白粉病抗性鉴定标准采用“0-9级”白粉病抗性反应型的分级标准，0-2级为高抗、3-4级为中抗、5-6级为中感、7-9级以上为高感。苗期离体白粉病抗性鉴定以及成株期白粉病抗性结果表明：扬麦158在苗期和成株期都表现为高感，而RNAi-ToxABP1-T0-24；RNAi-ToxABP1-T0-39；RNAi-ToxABP1-T0-66植株苗期和成株期白粉病抗性表现为中高抗水平，而ToxABP1表达量相对较高的植株RNAi-ToxABP1-T0-59；RNAi-ToxABP1-T0-87；RNAi-ToxABP1-T0-93；RNAi-ToxABP1-T0-102；RNAi-ToxABP1-T0-29-2；RNAi-ToxABP1-T0-107在苗期和成株期表型出中高感。(表1，图7)。

表1ToxABP1 RNAi转基因T₀代植株的白粉病抗性鉴定

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 一个叶绿体定位基因ToxABP1-V及其所编码的蛋白应用

<160> 13

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 簇毛麦

<223> 簇毛麦 ToxABP1-V基因

<400> 1

caatagcctt tcctcgcacc tgcccctggc aattaccctt ttgccctccc cggcggtgtc 60

gaccatccgc cgccgcatcc cctgagagag ccggtagtag cccgaggact ctcccatggc 120

ggccatatcg tcgcttccgt tcgctgcact gcgccgggcg gccgactgga ggccgtcaac 180

ggcgactgcc gcggtgagcg tctccggtgg cgtcatgctc aacgcgaggg ctcggcgggg 240

ctcacgttcg gtggtgcgct gcgtcgccac tgccggtgat atcccaccta ctgtgtcaga 300

tacaaagatg aacttcctga agtcatacaa acgtcctatt ccaagcattt acagtacagt 360

cctacaagaa cttttggtgc agcaacatct gatgagatac aaaagtacct atcagtatga 420

tcctgtgttt gctcttggat ttgtcaccgt ctatgaccag cttatggaag ggtaccccag 480

caacgaggac agggatgcca tcttcaagtc atacgtaacg gcgtgctcac aaaatggtaa 540

cttgttagtt gaattttcgt ccagagatgg ggaaatagag tccattctga aagatatatc 600

agaaagggca cagggtaagg gaaacttcag ctacagccgg ttctttgctg ttggcttgtt 660

ccgtttgctt gagctctcaa atgcgacgga gccaaccgta ctggacaagc tttgcgctgc 720

tctaaacatc aataaaaaga gcgtggatag agaccttgac gtttaccgca acttactctc 780

gaaattggtt caagccaagg aacttctcaa ggaatacgtc gagagggaaa agaagaagag 840

agcggagaga ttggagacgc ccaagccgaa tgaggctgtt gcaaaattcg atggaagcgc 900

ttatcccttg aagcattaac tcaacctttc cccagaggac agcttgtccg gataacagat 960

attaacagtt atacatctgg atagcgttga gaactaccgg gggcatcttt ggctgctctt 1020

tgcgtggtgt agtactcg 1038

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 簇毛麦

<223> 簇毛麦 ToxABP1-V基因的片段

<400> 2

ccatatcgtc gcttccgttc gctgcactgc gccgggcggc cgactggagg ccgtcaacgg 60

cgactgccgc ggtgagcgtc tccggtggcg tcatgctcaa cgcgagggct cggcggggct 120

cacgttcggt ggtgcgctgc gtcgccactg ccggtgatat cccacctact gtgtcagata 180

caaagatgaa cttcctgaag tcatacaaac gtcctattcc aagcatttac agtacagtcc 240

tacaagaact 250

<210> 3

<211> 286

<212> PRT

<213> 簇毛麦

<223> 簇毛麦 ToxABP1-V蛋白

<400> 3

Met Ala Ala Ile Ser Ser Leu Pro Phe Ala Ala Leu Arg Arg Ala Ala

1 5 10 15

Asp Trp Arg Pro Ser Thr Ala Thr Ala Ala Val Ser Val Ser Gly Gly

20 25 30

Val Met Leu Asn Ala Arg Ala Arg Arg Gly Ser Arg Ser Val Val Arg

35 40 45

Cys Val Ala Thr Ala Gly Asp Ile Pro Pro Thr Val Ser Asp Thr Lys

50 55 60

Met Asn Phe Leu Lys Ser Tyr Lys Arg Pro Ile Pro Ser Ile Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Val Leu Gln Glu Leu Leu Val Gln Gln His Leu Met Arg Tyr Lys

85 90 95

Ser Thr Tyr Gln Tyr Asp Pro Val Phe Ala Leu Gly Phe Val Thr Val

100 105 110

Tyr Asp Gln Leu Met Glu Gly Tyr Pro Ser Asn Glu Asp Arg Asp Ala

115 120 125

Ile Phe Lys Ser Tyr Val Thr Ala Leu Asn Glu Asp Pro Glu Gln Tyr

130 135 140

Arg Ala Asp Ala Gln Arg Met Glu Glu Trp Ala Arg Ser Gln Asn Gly

145 150 155 160

Asn Leu Leu Val Glu Phe Ser Ser Arg Asp Gly Glu Ile Glu Ser Ile

165 170 175

Leu Lys Asp Ile Ser Glu Arg Ala Gln Gly Lys Gly Asn Phe Ser Tyr

180 185 190

Ser Arg Phe Phe Ala Val Gly Leu Phe Arg Leu Leu Glu Leu Ser Asn

195 200 205

Ala Thr Glu Pro Thr Val Leu Asp Lys Leu Cys Ala Ala Leu Asn Ile

210 215 220

Asn Lys Lys Ser Val Asp Arg Asp Leu Asp Val Tyr Arg Asn Leu Leu

225 230 235 240

Ser Lys Leu Val Gln Ala Lys Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Val Glu Arg

245 250 255

Glu Lys Lys Lys Arg Ala Glu Arg Leu Glu Thr Pro Lys Pro Asn Glu

260 265 270

Ala Val Ala Lys Phe Asp Gly Ser Ala Tyr Pro Leu Lys His

275 280 285

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P1

<400> 4

caatagcctt tcctcgcacc tg 22

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P2

<400> 5

cgagtactac accacgcaaa gagcag 26

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P3

<400> 6

cagcaacgag gacagggat 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P4

<400> 7

ctcaagcaaa cggaacaa 18

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P5

<400> 8

ggggtacccc atatcgtcgc ttccgttc 28

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P6

<400> 9

cgggatccag ttcttgtagg actgtac 27

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P7

<400> 10

ggactagtcc atatcgtcgc ttccgttc 28

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P8

<400> 11

cgagctcagt tcttgtagga ctgtac 26

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P9

<400> 12

cgggatccag ttcttgtagg actgtac 27

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物P10

<400> 13

actgccgtgg aactgtcata 20

Claims (6)

1.一个簇毛麦ToxABP1-V基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的ToxABP1-V基因所编码的蛋白质ToxABP1-V，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

3.含有权利要求1所述的ToxABP1-V基因的RNAi沉默载体。

4.根据权利要求3所述的RNAi沉默载体，其特征在于以RNAi空载体pWMB006为出发载体，将SEQ ID NO.2所示的ToxABP1-V基因的片段反向插入pWMB006的BamHI和KpnI酶切位点间以及正向插入pWMB006载体的Spe I和Sac I酶切位点间所得。

5.权利要求1所述的ToxABP1-V在培育抗白粉病小麦品种中的应用。

6.权利要求3、4所述的含ToxABP1-V基因片段的RNAi沉默载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。