CN102153637B - 一种野生大豆leafy类转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

一种野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该野生大豆LEAFY类转录因子，命名为GsLFY，是具有序列表中的SEQIDNO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GsLFY基因SEQIDNO.1的DNA序列。本发明野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因可用于培育早花植物品种特别是早花早熟大豆品种。GsLFY为特异性表达基因，其表达模式与组织以及植株的发育阶段相关。过量表达GsLFY的转基因烟草与对照组的转基因烟草相比，其开花期提前了约29天，说明GsLFY能控制植物的成花转变，影响植物的花期，进而调控植物的生殖生长。

Description

一种野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及与植物早花相关的LEAFY类转录因子及其编码基因与应用，并涉及来源于野生大豆的与早花相关的LEAFY类转录因子GsLFY及其编码基因与其在培育早花植物品种中的应用。

背景技术

野生大豆(Glycine soja)为一年生草本，属于豆科、蝶形花亚科大豆属，是栽培大豆的近缘野生种，在我国有着悠久的种植历史和丰富的品种资源。野生大豆具有高蛋白、多花多荚和抗病虫耐逆境等优质性状，可以为栽培大豆提供有用性状或基因源，拓宽了栽培大豆遗传背景，是重要的遗传资源。因此，野生大豆的资源利用越来越为育种家们所重视，成为改良栽培大豆品质、提高大豆产量的重要种质资源。

生殖生长是植物生长过程中重要的阶段，花的发育是这一阶段开始的重要标志。成花过程不仅是植物生长发育中的重要转折时期，也是对农业生产产生直接影响的重要时期。这一过程受到基因网络的严格控制，伴随着一些特异基因的差异性表达。LEAFY基因家族是植物特有的、单一成员的转录因子基因家族。LEAYF编码的转录因子在拟南芥中控制花序分生组织向花分生组织转变，调控开花时间，同时它还能激活下游同源异形基因的表达参与花器官的形成。

野生大豆LEAFY类转录因子及其编码蛋白的研究，有助于我们对开花机制的深入了解，实现利用基因工程手段控制花期。这不仅可以解决制种过程中的花期不遇的难题，也可以缩短育种时间加快育种步伐，在农业生产上也有助于合理安排茬口提高复种指数。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因与应用。

技术方案：本发明所提供的一种野生大豆LEAFY类转录因子，命名为GsLFY，来源于大豆属野生大豆( Glycine soja Sled．et Zucc．)，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。

上述的野生大豆LEAFY类转录因子的编码基因，其cDNA全长序列具有序列表中GsLFY基因SEQ ID NO.1的DNA序列；其中，序列表中的GsLFY基因SEQ ID NO.1由1224个碱基组成，本序列为GsLFY的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO.2的407个氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明GsLFY基因SEQ ID NO.1的表达载体是指pMDC83-GsLFY植物过量表达载体，宿主菌是指将GsLFY转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

扩增GsLFY基因组全长的引物为：

GsLFY sense:5’GGCGAATTCCCATGGATCCGGACGCA 3’；

GsLFY antisense:5’ GGCTCGAGTCTAGATTTAGAAGGGAAGGTG 3’。

扩增GsLFYcDNA全长的引物为：

GsLFY-ORF sense: 

5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCCGGACGCATTCA  3’；

GsLFY-ORF antisense:

5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGAAGGGAAGGTGAGCACT 3’。

实时荧光定量PCR分析中的扩增GsLFY引物为：

GsLFY-qPCR sense：   5’ ACAAGCCAAAGATGCGACACT 3’；

GsLFY-qPCR antisense：   5’CGTTCTCCCCTCTCTCCTTGA 3’。

上述野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因GsLFY可在培育早花植物中得到应用。

有益效果：GsLFY可能参与野生大豆生殖发育的大部分进程。GsLFY在野生大豆的根、花以及发育后期的种子中特异性表达。35S::GsLFY转基因烟草与对照组烟草相比，开花期显著提前。这一结果说明GsLFY能够控制植物的成花转变过程，调控花期。过量表达该基因可促使植物的开花期提前。

本发明的GsLFY对培育早花植物品种特别是早花早熟大豆具有重要意义，在作物育种发面具有广泛的应用前景。

利用植物过量表达载体，将本发明的GsLFY导入植物体内，可获得提前开花的转基因植株。

使用GsLFY构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因（GUS基因、GFP基因等）或具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等）。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GsLFY的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

附图说明

图1为GsLFY在野生大豆中的表达特性图

A. GsLFY在野生大豆不同器官中的表达分析。Rt，幼根；St，幼茎；Lf，叶片；Sa，茎尖；In，盛花；Sd，开花后21天的种子。B．GsLFY在野生大豆四轮花器官中的表达分析。Se，花萼；Pe，花瓣；St，雄蕊；Ca，心皮。C．GsLFY在野生大豆不同花发育时期的表达分析。Bd，花芽；Fd，花蕾；In，盛花。D．GsLFY在野生大豆不同发育时期（开花后10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天）的种子中的表达分析。

图2为含有GsLFY的植物过量表达载体的部分结构示意图

注：此载体的构建过程中采用大肠杆菌株系DH5α，转化烟草采用根癌农杆菌EHA105。

图3为35S::GsLFY转基因烟草植株LFY1、LFY3、LFY4、LFY5、LFY15、LFY39，LFY45和对照组转基因烟草植株CK-1和CK-2中GsLFY的表达分析。

图4为35S::GsLFY转基因烟草和转入pMDC83载体的烟草（control）的开花期比较。35S::GsLFY转基因植株平均开花期为移苗后141.67天，对照组开花期大约为移苗后170.75天，差异显著 (*， P<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。 

（一）野生大豆GsLFY及其编码基因的克隆与鉴定

实验材料为野生大豆江浦野生豆-5（何慧 等，2009，大豆科学，28（5）：784-790），参照栽培大豆LEAFY基因GmLFY(GenBank数据库中的cDNA序列登录号DQ448810，基因组DNA序列登录号为DQ448809)的序列信息，利用生物信息学的方法进行分析，设计引物，进行野生大豆LEAFY基因的克隆，基因命名为GsLFY。

扩增GsLFYcDNA全长的引物是：

GsLFY-ORF sense: 

5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCCGGACGCATTCA  3’；

GsLFY-ORF antisense:

5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGAAGGGAAGGTGAGCACT 3’。

应用RT-PCR的方法，从野生大豆花的cDNA中克隆GsLFY。取野生大豆的花，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒（TOYOBO公司）按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20mL PCR反应体系为： 1mL一链cDNA（0.05μg）、上下游引物各1mL（10mM）、2mL 10×PCR缓冲液、0.4mL dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20mL。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94℃预变性5min；94℃变性50 s，58℃退火50 s， 72℃延伸1min，共32个循环；然后72℃延伸10 min; 4℃保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列。GsLFY的ORF全长为1224bp，编码407个氨基酸。

（二）野生大豆GsLFY在不同器官和不同发育时期的种子中的表达特征

以野生大豆品种--江浦野生豆-5为实验材料，利用实时荧光定量PCR技术，对GsLFY在野生大豆各个器官和不同发育时期的种子中的表达情况进行了研究。野生大豆材料经过种脐背部切口处理后，于六月初播种于南京农业大学网室，苗期搭架。田间管理同常规。出苗后4周取根、茎、叶、茎尖；初花期取花芽；盛花期取花苞和盛花；取开花后10天、15天、20天、21天、25天、30天、35天、40天、45天、50天的种子。盛花取下后无菌条件下迅速分离各轮花器官：花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，分别液氮速冻后-80℃保存备用。

总RNA的提取同步骤（一）。以大豆组成型表达的Actin（GenBank acces-sion No.V00450）为内参基因，以来自野生大豆不同组织或器官的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR (qPCR)分析。GsLFY的扩增引物为： GsLFY-qPCR sense：5’ACAAGCCAAAGATGCGACACT 3’，GsLFY-qPCR antisense：5’CGTTCTCCCCTCTCTCCTTGA 3’。

结果分析表明（图1），GsLFY在根、花以及种子中表达量较高，在茎尖和幼叶中有微弱的表达。在四轮花器官中，GsLFY主要在雄蕊中表达。随着种子的发育，GsLFY的表达量逐渐上升。

（三）GsLFY转录因子的功能鉴定

利用Invitrogen 公司的Gateway? Technology with Clonase?II试剂盒，将GsLFY正向插入到植物表达载体pMDC83（Sokolov et al， 2005， PNAS， 103;9732 -9737）中，得到pMDC83-GsLFY植物过量表达载体（图2），用冻融法将pMDC83-GsLFY转入根癌农杆菌菌株EHA105（Avsian-Kretchmer et al， 2004， Plant Physiology， 135:1685-1696）中。pMDC83-GsLFY通过农杆菌株EHA105的介导，转化烟草，利用抗生素筛选和PCR技术筛选阳性转基因植株。利用实时荧光定量PCR技术，对GsLFY在7个阳性转基因株系（LFY1、LFY3、LFY4、LFY5、LFY15、LFY39，LFY45）和对照组（转入pMDC83载体的转基因烟草CK-1、CK-2）的表达情况进行了分析。结果显示，与对照组相比GsLFY在35S::GsLFY转基因烟草中显著表达。统计开花期的结果分析显示，说明在烟草中过量表达野生大豆基因GsLFY能够促使烟草提早开花，开花期提前了29.08天，差异显著（图4）。

序 列 表

 

<110>  南京农业大学

 

<120>  一种野生大豆LEAFY类转录因子及其编码基因与应用

 

<130> 

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1224

<212>  DNA

<213>  大豆属野生大豆 (Glycine soja Sled．et Zucc．)

 

<400>  1

atggatccgg acgcattcac cgccagccta ttcaagtggg acccacgtac cgtcctccca     60

 

cccgctccgg cgccgccccc gcgcccgtcc ctcctcgaat acgcgatggc tcccccgccg    120

 

gtgaccacgg cgttccaccc tgcgaggacg gcggctccgc gcgagctcgg aggactggag    180

 

gagcttttcc aggcctacgg catccgctac tacacggcgg cgaagatcgc cgagcttggg    240

 

ttcacggtga gcacgctggt ggacatgaaa gacgaggagc tcgacgacat gatgaacagc    300

 

ctttcccaga ttttccgctg ggacctcctc gtcggcgagc gctacggcat caaagccgcc    360

 

gtcagagccg aacgccgccg cgtcgaagac gacgacatca agcgccgcaa caacaacaac    420

 

aacaacctcc tctccacgga caccaccacc aacgccctcg acgccctctc tcaagaaggg    480

 

ttgtcagagg agccggtggt gcaacgagag aaggaggcgg tggggagcgg gggagggagc    540

 

acgtgggagg cggtggcagc ggaggagagg agtaagcagc agaggaggcg gaggacgagg    600

 

atgaagacga atcttcatca cgatgagaat gaggagcttg aagatgatga aggggaagag    660

 

aatgatgaag ggaacattaa cagaggtggt ggttgtgaga ggcaaagaga acaccctttc    720

 

atcgtgacag aacctggcga agttgcacgt gggaagaaga acggtttgga ctatctgttt    780

 

catctctacg agcaatgccg tgagttcttg atgcaggttc aggccattgc caaggaccgc    840

 

ggtgaaaaat gccccaccaa ggtgacaaat caggtgttta ggtacgcgaa gaaggctggg    900

 

gcaagctaca tcaacaagcc aaagatgcga cactacgtgc accgctacgc cttacactgt    960

 

ctagacgagg aggtctcaaa cgagctccga agggcgttca aggagagagg ggagaacgtt   1020

 

ggggcgtgga ggcaagcatg ttacaagccc cttgtggcca ttgccgcgcg tcaaggttgg   1080

 

gacattgatg ccatattcaa cgcacatcct cgtctttcta tttggtatgt tccgacaaag   1140

 

cttcgtcagc tttgtcacgc tgagagaaac agtgtctcgg cttcaagctc cgtgtctgct   1200

 

ggcagtgctc accttccctt ctaa                                          1224

 

 

<210>  2

<211>  407

<212>  PRT

<213>  大豆属野生大豆 (Glycine soja Sled．et Zucc．)

 

<400>  2

 

Met Asp Pro Asp Ala Phe Thr Ala Ser Leu Phe Lys Trp Asp Pro Arg

1               5                   10                  15     

 

 

Thr Val Leu Pro Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Arg Pro Ser Leu Leu

            20                  25                  30         

 

 

Glu Tyr Ala Met Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Ala Phe His Pro Ala

        35                  40                  45             

 

 

Arg Thr Ala Ala Pro Arg Glu Leu Gly Gly Leu Glu Glu Leu Phe Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Ala Tyr Gly Ile Arg Tyr Tyr Thr Ala Ala Lys Ile Ala Glu Leu Gly

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Thr Val Ser Thr Leu Val Asp Met Lys Asp Glu Glu Leu Asp Asp

                85                  90                  95     

 

 

Met Met Asn Ser Leu Ser Gln Ile Phe Arg Trp Asp Leu Leu Val Gly

            100                 105                 110        

 

 

Glu Arg Tyr Gly Ile Lys Ala Ala Val Arg Ala Glu Arg Arg Arg Val

        115                 120                 125            

 

 

Glu Asp Asp Asp Ile Lys Arg Arg Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Leu

    130                 135                 140                

 

 

Ser Thr Asp Thr Thr Thr Asn Ala Leu Asp Ala Leu Ser Gln Glu Gly

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Ser Glu Glu Pro Val Val Gln Arg Glu Lys Glu Ala Val Gly Ser

                165                 170                 175    

 

 

Gly Gly Gly Ser Thr Trp Glu Ala Val Ala Ala Glu Glu Arg Ser Lys

            180                 185                 190        

 

 

Gln Gln Arg Arg Arg Arg Thr Arg Met Lys Thr Asn Leu His His Asp

        195                 200                 205            

 

 

Glu Asn Glu Glu Leu Glu Asp Asp Glu Gly Glu Glu Asn Asp Glu Gly

    210                 215                 220                

 

 

Asn Ile Asn Arg Gly Gly Gly Cys Glu Arg Gln Arg Glu His Pro Phe

225                 230                 235                 240

 

 

Ile Val Thr Glu Pro Gly Glu Val Ala Arg Gly Lys Lys Asn Gly Leu

                245                 250                 255    

 

 

Asp Tyr Leu Phe His Leu Tyr Glu Gln Cys Arg Glu Phe Leu Met Gln

            260                 265                 270        

 

 

Val Gln Ala Ile Ala Lys Asp Arg Gly Glu Lys Cys Pro Thr Lys Val

        275                 280                 285            

 

 

Thr Asn Gln Val Phe Arg Tyr Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ser Tyr Ile

    290                 295                 300                

 

 

Asn Lys Pro Lys Met Arg His Tyr Val His Arg Tyr Ala Leu His Cys

305                 310                 315                 320

 

 

Leu Asp Glu Glu Val Ser Asn Glu Leu Arg Arg Ala Phe Lys Glu Arg

                325                 330                 335     

 

 

Gly Glu Asn Val Gly Ala Trp Arg Gln Ala Cys Tyr Lys Pro Leu Val

            340                 345                 350        

 

 

Ala Ile Ala Ala Arg Gln Gly Trp Asp Ile Asp Ala Ile Phe Asn Ala

        355                 360                 365             

 

 

His Pro Arg Leu Ser Ile Trp Tyr Val Pro Thr Lys Leu Arg Gln Leu

    370                 375                 380                

 

 

Cys His Ala Glu Arg Asn Ser Val Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ala

385                 390                 395                 400

 

 

Gly Ser Ala His Leu Pro Phe

                405        

 

 

<210>  3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

ggcgaattcc catggatccg gacgca                                          26

 

 

<210>  4

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

ggctcgagtc tagatttaga agggaaggtg                                      30

 

 

<210>  5

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggatccg gacgcattca                50

 

 

<210>  6

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ttagaaggga aggtgagcac t              51

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  7

acaagccaaa gatgcgacac t                                               21

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  8

cgttctcccc tctctccttg a                                               21

Claims (10)

1.一种野生大豆LEAFY类转录因子，命名为GsLFY，是序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的野生大豆LEAFY类转录因子的基因。

3.根据权利要求2所述的野生大豆LEAFY类转录因子的基因，其特征在于：野生大豆LEAFY类转录因子的cDNA基因，是序列表中GsLFY基因SEQ ID NO.1的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，是指pMDC83-GsLFY植物过量表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。

7.根据权利要求6所述的宿主菌，是指将GsLFY转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

8.扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是：

扩增GsLFY基因组全长的引物是：

GsLFY 正向:5’GGCGAATTCCCATGGATCCGGACGCA 3’；

GsLFY 反向:5’ GGCTCGAGTCTAGATTTAGAAGGGAAGGTG 3’；

扩增GsLFYcDNA全长的引物是：

GsLFY-ORF 正向: 

5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCCGGACGCATTCA  3’；

GsLFY-ORF 反向:

5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGAAGGGAAGGTGAGCACT 3’；

实时荧光定量PCR分析中涉及的GsLFY的qPCR引物为：

GsLFY-qPCR 正向：   5’ ACAAGCCAAAGATGCGACACT 3’；

GsLFY-qPCR 反向：   5’CGTTCTCCCCTCTCTCCTTGA 3’。

9.权利要求1所述的野生大豆LEAFY类转录因子在培育早花植物中的应用。

10.权利要求2或3所述的野生大豆LEAFY类转录因子的基因在培育早花植物中的应用。

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