CN102206262B - 一种大豆ap1类转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents
一种大豆ap1类转录因子及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102206262B CN102206262B CN201110089240.XA CN201110089240A CN102206262B CN 102206262 B CN102206262 B CN 102206262B CN 201110089240 A CN201110089240 A CN 201110089240A CN 102206262 B CN102206262 B CN 102206262B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gmap1
- soybean
- transcription factor
- plant
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种大豆AP1类转录因子及其编码基因与应用。该大豆AP1类转录因子，命名为GmAP1，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因GmAP1具有SEQ ID NO.1所示序列。本发明大豆AP1转录因子及其编码基因可用于改变植物花期，培育早花植物品种，进行花器官改造等方面。GmAP1为花器官特异性表达基因，其表达模式与组织以及植株的发育阶段相关。与野生型烟草相比，过量表达GmAP1的转基因烟草开花期提前，并出现了花器官同源异型突变性状。说明GmAP1能控制植物的成花转变，影响植物的花期，决定四轮花器官的特化和发育。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大豆AP1类转录因子及其编码基因与应用，具体涉及来源于大豆的与花期和花器官发育相关的AP1类转录因子GmAP1及其编码基因与其在改变植物花期和花器官改造中的应用。
背景技术
生殖生长是高等植物生活史中最重要的阶段，是植物繁殖后代和种群扩散的手段和基础，也是农业生产获得产品的关键时期。花器官是生殖过程中重要的功能器官，它的发育状况直接影响到果实和种子的形成以及品质。花的发育是植物生殖生长期开始的重要标志。植物必须在适当的时间开始花的发育，以利于受精和种子的形成，确保繁殖的最大成功。
花的发育，即成花过程，是一个复杂而有序的生理活动。植物进入生殖生长期后，营养分生组织形成花序分生组织，花序分生组织逐步形成花分生组织，然后产生花器官原基，花器官原基最终分化成各种花器官，形成一朵完整的花。这一过程受到外界环境诱导和基因网络的严格控制，伴随着一些特异基因的差异性表达。目前已发现许多基因家族与花发育调控密切相关。其中，MADS-box基因是调控植物生殖生长的重要因子，也是研究最为深入的一个基因家族。
AP1类基因属于MADS-box基因家族，编码的转录因子具有序列特异性。该类转录蛋白因子具有保守的MADS域、I域、K域和C域。AP1属于花分生组织特征基因，在拟南芥中控制花序分生组织向花分生组织转变，调控开花时间。同时，AP1又属于花器官特征基因，具有ABC型MADS-box基因的A类基因功能，参与萼片和花瓣的特化。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆AP1类转录因子。
本发明的另一目的是提供编码该大豆AP1类转录因子的基因。
本发明的又一目的是提供该转录因子的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种大豆AP1类转录因子GmAP1，具有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列。
编码所述的大豆AP1类转录因子GmAP1的基因GmAP1。
该基因的开放阅读框具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
含有所述大豆AP1类转录因子基因GmAP1的表达载体。
所述的表达载体优选将SEQ ID NO.1所示的大豆AP1类转录因子基因GmAP1开放阅读框利用gateway技术插入植物表达载体pMDC32得到的植物过量表达载体pMDC32-GmAP1。
使用GmAP1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、GFP基因等)或者抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
含有所述大豆AP1类转录因子基因GmAP1的工程菌。
所述的工程菌优选将所述的GmAP1基因转入根癌农杆菌EHA105所得。
扩增大豆AP1类转录因子基因GmAP1开放阅读框的引物，正向引物和反向引物序列如下：
正向引物序列：5’ATGGGAAGGGGTAGGGTT 3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物序列：5’TGTCAAATGCCATACCAAAGC 3’(SEQ ID NO.4)。
所述的大豆AP1类转录因子GmAP1在改变植物花期和/或花器官改造中的应用。
所述的大豆AP1类转录因子基因GmAP1在改变植物花期和/或花器官改造中的应用。
携带有本发明GmAP1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是烟草、大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
有益效果
本发明提供的大豆AP1类转录因子基因GmAP1在花中特异性表达。该转录因子可能参与大豆的花序分生组、花分生组织和花器官(萼片和花瓣)的发育调控。GmAP1转基因烟草与野生型烟草相比，开花期显著提前，并出现了花器官同源异型突变现象。这一结果说明GmAP1能够影响植物的成花转变过程，调控花期，控制花器官形成。过量表达该基因可促使植物的开花期提前，花器官改变。这不仅可以解决制种过程中的花期不遇的难题，也可以缩短世代，减少耕种时间，加快育种步伐，在农业生产上也有助于合理安排茬口提高复种指数。
本发明的大豆AP1类转录因子及其编码基因对改变植物花期和花器官改造，特别是培育早花早熟大豆具有重要意义，在作物育种发面具有广泛的应用前景。
利用植物过量表达载体pMDC32-GmAP1，将本发明的GmAP1导入植物体内，可获得提前开花的转基因植株。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1为GmAP1在大豆中的表达特性图
A.GmAP1在大豆不同器官中的表达分析，分别为：根、茎、叶、花、荚皮、种子(开花后25天)；B.GmAP1在大豆四轮花器官中的表达分析，花器官分别为：萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊。C.GmAP1在大豆花发育不同时期的表达分析，其中1-4表示的发育时期对应于D图中1-4所示的从绿色的花芽到完全成熟开放的花所经过的四个不同时期；D从绿色的花芽到完全成熟开放的花所经过的四个不同时期，1-4与C图相对应。
图2为含有GmAP1的植物过量表达载体的部分结构示意图。
图3为转基因烟草的PCR鉴定。
M为DNA分子量DL2000(Takara)；1-10为不同的转基因株系；WT为野生型烟草(阴性对照)。
图4为转基因烟草的RT-PCR鉴定。
1-8为不同的株系；P：pMDC32-GmAP1质粒DNA(阳性对照)；WT为野生型烟草(阴性对照)；M为DNA分子量DL2000(Takara)。
图5为35S::GmAP1转基因烟草的Southern杂交鉴定。
M为Marker；WT为野生型烟草；2、6、17、30、23表示不同的35S::GmAP1转基因株系；箭头表示杂交带位置。
图6为35S::GmAP1转基因烟草出现花器官变异。
A和G，野生型烟草正常发育的花，花瓣、萼片均为5枚。B-C，35S::GmAP1转基因烟草的花瓣和雄蕊发育异常，出现同源异型突变现象。D-F，转基因烟草的花瓣、萼片突变为4枚。
图7为35S::GmAP1转基因烟草和野生型烟草的开花期时间比较。35S::GmAP1转基因植株平均开花期要明显早于野生型烟草，存在0.01水平显著差异。
图8为35S::GmAP1转基因烟草与野生型烟草的株高比较。
35S::GmAP1转基因植株在开花期时平均株高要明显低于野生型烟草，存在0.01水平显著差异。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例1 大豆GmAP1及其编码基因的克隆与鉴定
实验材料为栽培大豆品种Jackson，由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供。参照拟南芥AP1基因(GeneBank数据库中的登录号为Z16421)的序列信息和大豆EST数据库，利用生物信息学的方法进行分析，设计引物，进行大豆AP1类基因的克隆，基因命名为GmAP1。具体方法如下：
取大豆的花，置于液氮中研碎，采用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN DP404)进行总RNA提取。取5μg总RNA用反转录试剂盒(TOYOBO公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的扩增GmAP1开放阅读框的引物进行PCR反应。50μl PCR反应体系为：2μl cDNA(0.05μg)、上、下游引物各2μl(10μM)、5μl 10×PCR缓冲液、1μl dNTP(10mM)和2U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足50μl。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94℃预变性5min；94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min，共32个循环；然后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经回收、测序后，进行序列分析，结果表明该GmAP1的开放阅读框具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，全长为711bp，编码SEQ ID NO.2所示的236个氨基酸。
实施例2 GmAP1在大豆不同器官和不同发育时期的花中的表达特征
利用实时荧光定量PCR技术，对GmAP1在大豆各个器官和不同发育时期的花中的表达情况进行了研究。大豆实验材料于六月初播种于南京农业大学网室，田间管理同常规。第三片复叶展开时取根、茎、叶；初花期取花芽，盛花期取花苞和盛花；取开花后25天的种子。盛花取下后在无菌条件下迅速分离各轮花器官：花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，分别液氮速冻后-80℃保存备用。
总RNA的提取同实施例1。以大豆组成型表达基因Tubulin(GenBank登陆号为：AY907703)为内参基因，其扩增引物为：Tubulin正向引物序列：5’GGAGTTCACAGAGGCAGAG 3’(SEQ IDNO.7)，Tubulin反向引物序列：5’CACTTACGCATCACATAGCA 3’(SEQ ID NO.8)。以来自大豆不同组织或器官的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。GmAP1的扩增引物为：GmAP1-qPCR正向引物序列：5’ATGATTCCGAGTCACAGGGAA 3’(SEQ ID NO.5)，GmAP1-qPCR反向引物序列：5’TGTCAAATGCCATACCAAAGC 3’(SEQ ID NO.6)。
结果(图1)分析表明，GmAP1在花中特异性表达，在根、茎、叶和种子中均不表达。在四轮花器官中，GmAP1只在花瓣和萼片中表达，萼片中表达量较高。随着花的成熟、开放，GmAP1的表达量总体趋势是逐渐上升，在花瓣快速生长的花苞期表达量最高。
实施例3 GmAP1转录因子的功能鉴定
利用Invitrogen公司的
Technology with ClonaseTMI I试剂盒，将GmAP1重组到植物表达载体pMDC32(Curtis et al，2003，Plant Physiology.133，462-469)中，转化大肠杆菌DH5α，转化液涂布于含50mg/L潮霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后，提取质粒，得到pMDC32-GmAP1植物过量表达载体(图2)，用冻融法将pMDC32-GmAP1转入根癌农杆菌菌株EHA105(Biovector Co.，LTD)中。将pMDC32-GmAP1通过农杆菌株EHA105的介导转化烟草，在含有50mg/L潮霉素的MS培养基上培养，初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因植株。
提取初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因烟草的基因组DNA，使用基因特异性引物GmAP1-BF：SEQ ID NO.9，和GmAP1-BR：SEQ ID NO.10进行PCR鉴定。能够扩增出约为800bp大小条带的为阳性转基因烟草，扩增不出约为800bp大小条带的为阴性植株(图3)。选择PCR鉴定为阳性的植株，以GmAP1-BF(SEQ ID NO.9)和GmAP1-BR(SEQ ID NO.10)为引物，进行RT-PCR。结果表明GmAP1可在转基因烟草中表达(图4)。将PCR、RT-PCR检测均为阳性的转基因植株命名为35S::GmAP1转基因烟草。大量提取35S::GmAP1转基因烟草的基因组总DNA，用EcoR I充分酶切后与DIG标记的GmAP1探针进行Southern杂交。GmAP1探针序列为GmAP1开放阅读框全长，实验设野生型烟草的基因组DNA作为阴性对照，操作按照DIG HighPrime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche)试剂盒的说明书进行。转基因植株显示特征条带，阴性对照没有带(图5)。这表明GmAP1基因的开放阅读框区域已经整合到35S::GmAP1转基因烟草的基因组DNA中，且均以多个拷贝方式插入。
对35S::GmAP1转基因烟草进行表型观察。在25℃、长日照的生长条件下，与野生型烟草相比，35S::GmAP1转基因烟草出现了花瓣状雄蕊、雄蕊状花瓣的花器官同源异型突变性状，萼片和花瓣数目突变为4枚(图6)，说明GmAP1的异源表达能够影响花器官的正常发育。统计开花期的结果显示，烟草中过量表达GmAP1能够促使植株提早开花，且差异极显著(图7)。由于开花提前，转基因烟草过早地结束营养生长期进入生殖生长阶段，进而会导致植株矮化。对比处于开花期的转基因烟草和野生型烟草的株高，结果显示35S::GmAP1转基因烟草株高平均值明显低于野生型烟草，差异极显著(图8)。
Claims (1)
1.SEQ ID NO.1所示的大豆AP1类转录因子的编码基因GmAP1在大豆花器官改造中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110089240.XA CN102206262B (zh) | 2011-04-11 | 2011-04-11 | 一种大豆ap1类转录因子及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110089240.XA CN102206262B (zh) | 2011-04-11 | 2011-04-11 | 一种大豆ap1类转录因子及其编码基因与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102206262A CN102206262A (zh) | 2011-10-05 |
| CN102206262B true CN102206262B (zh) | 2014-01-08 |
Family
ID=44695352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110089240.XA Expired - Fee Related CN102206262B (zh) | 2011-04-11 | 2011-04-11 | 一种大豆ap1类转录因子及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102206262B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102584969B (zh) * | 2012-01-13 | 2013-08-21 | 北京市农林科学院 | 甜樱桃PaAP1基因及其应用 |
| CN116606362A (zh) * | 2023-04-26 | 2023-08-18 | 青岛农业大学 | 绿豆VrAP1基因及其在调控植物株型和开花中的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845085B (zh) * | 2009-12-07 | 2012-03-14 | 南京农业大学 | 一种野生大豆ap1类蛋白及其编码基因与应用 |
-
2011
- 2011-04-11 CN CN201110089240.XA patent/CN102206262B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102206262A (zh) | 2011-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Over‐expression of sly‐miR156a in tomato results in multiple vegetative and reproductive trait alterations and partial phenocopy of the sft mutant | |
| Wang et al. | Multi-gene co-expression can improve comprehensive resistance to multiple abiotic stresses in Brassica napus L. | |
| Huang et al. | Overexpression of BpAP1 induces early flowering and produces dwarfism in Betula platyphylla× Betula pendula | |
| EP3091076A1 (en) | Polynucleotide responsible of haploid induction in maize plants and related processes | |
| WO2013023623A1 (en) | Isolation, cloning and application of pms3, a gene for photoperiod-sensitive genic male-sterility in rice | |
| Zhang et al. | Alternative splicing of the AGAMOUS orthologous gene in double flower of Magnolia stellata (Magnoliaceae) | |
| AU2017234920B2 (en) | Methods and compositions for producing clonal, non-reduced, non-recombined gametes | |
| CN111032684A (zh) | 提高谷物生产率的方法 | |
| Liu et al. | Genomic characterization of miR156 and SQUAMOSA promoter binding protein-like genes in sweet orange (Citrus sinensis) | |
| CN105087640B (zh) | 调节植物种子发育的基因及其应用 | |
| CN108893469A (zh) | 植物调控元件及其用途 | |
| CN105985954B (zh) | 水稻miR160b基因在调控分蘖角度中的应用 | |
| Šimášková et al. | KIL1 terminates fertility in maize by controlling silk senescence | |
| CN106701778A (zh) | 一种利用水稻snb基因来增加穗粒数和降低株高的方法 | |
| CN103667317B (zh) | 一种大豆MYB类转录因子GmMYB181的应用 | |
| CN102206262B (zh) | 一种大豆ap1类转录因子及其编码基因与应用 | |
| US20150024388A1 (en) | Expression of SEP-like Genes for Identifying and Controlling Palm Plant Shell Phenotypes | |
| CN102153637B (zh) | 一种野生大豆leafy类转录因子及其编码基因与应用 | |
| CN102373224A (zh) | 一种水稻生长素运输蛋白基因及其应用 | |
| CN101845085B (zh) | 一种野生大豆ap1类蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN105132436A (zh) | 一种调控杨树不定根发育的生长素受体基因及其应用 | |
| CN104651366B (zh) | 小麦microRNA408及其编码基因与应用 | |
| CN104805100B (zh) | 水稻基因OsSμBP‑2在延缓植物叶片衰老中的应用 | |
| CN104805093B (zh) | 水稻基因OsLOL3在延缓植物叶片衰老和提高植物耐旱性中的应用 | |
| CN102250229B (zh) | 一种大豆ofp类转录因子及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140108 Termination date: 20170411 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |