CN102584969B

CN102584969B - 甜樱桃PaAP1基因及其应用

Info

Publication number: CN102584969B
Application number: CN 201210009886
Authority: CN
Inventors: 张开春; 王晶; 张晓明; 闫国华; 周宇
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2032-01-13
Also published as: CN102584969A

Abstract

本发明涉及如SEQ ID NO：11所示的甜樱桃PaAP1基因及其在提早花期方面的用途。所述的甜樱桃PaAP1基因对拟南芥和甜樱桃的开花期有显著影响，可以通过该基因或其衍生物筛选或改良甜樱桃及其砧木(甚至其它植物)，获得幼龄期短开花早的品种。

Description

甜樱桃PaAP1基因及其应用

技术领域

本发明涉及甜樱桃PaAP1基因及其应用。

背景技术

开花是植物从营养生长到生殖生长的一个重要转折点，研究表明MASDSbox基因从5个阶段参与花发育过程的调节(Gunter et al.，2000；Okada and Shimura，1994)。其中AP1(APETALA1)同源基因在开花诱导和花器官的形成过程中均起着至关重要的作用[Coen andMeyerowttz，1991；Bowman et al.，1993；Jofuku et al.，1994]。目前，研究人员已从甜橙、黄金梨、苹果、枇杷、桃、枣、葡萄、美洲山杨、香脂杨和柳树和蓝桉等十多种木本植物中分离克隆了AP1同源基因全长cDNA。吕晋慧等(2007)将AP1同源基因转入地被菊‘玉人面′品种中，能使菊花提早开花。2001年，Pena等将AP1和LFY同源基因导入柑橘，得到的转基因柑桔当年开花、果实正常，其种子于当年播种，第二年春天即开花结果。Nobuhiro等(2002)把苹果的MdMADS5基因(AP1同源基因)导入到拟南芥中，能使转基因拟南芥提早开花。另外，将拟南芥的花分生组织决定基因(例如LFY，AP1和FT等)导入欧洲山杨和枳橙，同样也能使转基因植物提早开花[Weigel and Nilsson，1995；Rottmann et al.，2000；Endo et al.，2005；

et al.，2006]。

甜樱桃在都市农业发展中占有重要的地位，因其具有较高的收益而在近年发展迅速，但是樱桃树体高大、进入结果期较晚，常规管理需要3-4年才能开花结果，5-7年才能进入盛果期。选育幼龄期短开花早的甜樱桃品种一直是重要的育种方向[万仁先，毕可华主编，现代大樱桃栽培，1992，中国农业科技出版社]。红蜜是国内自主培育的樱桃品种，3-4年就可开花，具有幼龄期短和丰产的特点。从红蜜中克隆AP1的同源基因，预期提供一个具有促进樱桃或其它植物早开花的基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种与甜樱桃幼龄期相关的基因，以便通过该基因或其衍生物筛选或改良甜樱桃(甚至其它植物)，获得幼龄期短开花早的品种。

本发明还涉及所述基因的一些衍生物及一些相关的应用。

具体来讲涉及以下内容：

甜樱桃PaAP1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

甜樱桃PaAP1基因，其编码的氨基酸的序列如SEQ ID NO：12所示。由于密码子简并性，会涉及多条序列。初始获得的基因是如SEQ ID NO：11所示的序列。

重组了所述的甜樱桃PaAP1基因的重组载体。

转化了所述重组载体的转化体。

将所述甜樱桃PaAP1基因转化拟南芥或甜樱桃使其早开花的应用。甜樱桃的转化在品种或砧木都可以。

所述蛋白的应用，涉及利用该蛋白筛选早开花的拟南芥或甜樱桃。

所述的甜樱桃PaAP1基因的应用，涉及利用该基因筛选早开花的拟南芥或甜樱桃。

所述的甜樱桃PaAP1基因对拟南芥和甜樱桃的开花期有显著影响，可以通过该基因或其衍生物筛选或改良甜樱桃及其砧木(甚至其它植物)，获得幼龄期短开花早的品种。

附图说明

图1为PaAP1编码区扩增结果；

图2为樱桃PaAP1蛋白属于MADS蛋白家族的分析；

图3为樱桃PaAP1蛋白和部分同源蛋白序列的进化树分析结果；

图4表示PaAP1基因在不同时期花芽及不同组织中的表达；其中中：2、34、27、40、38、37、42为花芽，分别在6月10日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、9月9日采取。19、33、41、39、21、17、32、29为叶芽，分别在6月3日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、8月20日、9月9日采取。HB：花瓣，HE：花萼，leaf：叶，steam：茎，XR：雄蕊，ZT：柱头。以上样品在图4的横坐标中按照以上顺序排列。

图5表示PaAP1表达载体；

图6为T0代转基因株系PCR鉴定结果；其中，泳道1：野生型；泳道2-5：转基因株系；泳道6：阴性对照；泳道7-12：转基因株系；

图7为转基因株系(右)和野生型(左)的GFP表达情况

图8为拟南芥转基因株系；

图9为拟南芥野生型；

图10为T1代转基因拟南芥早开花的情况，T1代转基因拟南芥(左)2片真叶出现花序分离，同时期的野生型(右)8片真叶尚未开花；

图11为转基因株系T1代的PaAP1表达分离结果。

具体实施方式

下面具体说明如SEQ ID NO：11所示的甜樱桃PaAP1基因的制得过程及其一些应用。

一、如SEQ ID NO：11所示的甜樱桃PaAP1基因的制得(为了更好地理解本发明，文中附带了一些对该基因的分析)

1.材料和方法

1.1材料

6月10日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、9月9日采取分别取红蜜花芽和叶芽。枝条基部饱满的芽为花芽，枝条上半部的形态较尖芽为叶芽。4月9日收集花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊及未展开花的子房和柱头，立即放在-80℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1RNA的提取

用艾德莱生物公司的植物RNA提取试剂盒，按照说明书进行RNA的提取，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性和浓度。

1.2.2RT-PCR反应中第一链cDNA的合成

将总RNA，1μl oligo(dT)₁₅primer，1μl 10mM dNTP，和dd H₂O按总体积13μl在冰浴中混匀，65℃加热变性5min后，冰浴中迅速冷却1min。依次加入4μl 5×reaction buffer，1μl RNAsin(Promega)，1μl 0.1M DTT，1μl Superscript III^RT逆转录酶(Invitrogen)，混匀，50℃温育60min后，70℃15min灭活，冰上冷却，产物直接用于RT-PCR。

1.2.3PaAP1编码区引物设计及全长序列获得

根据NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中已释放的樱花AP1序列(GQ267074)设计全长引物AP1-7F和AP1-7R(表1，也可见序列表SEQ ID NO：1和2)，利用花瓣cDNA做模板进行PCR。反应体系为：在20μl反应体系中，模板20ng，10×reaction buffer 2μl，1.5mM Mg²⁺，dNTP 0.25mM，Primer 0.2μM，Taq酶1u，ddH₂O 8μl。PCR反应程序为：94℃2min，35个循环(94℃30sec，55℃30sec，72℃2min)，72℃10min延伸。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后，将特异扩增片段回收。

1.2.4PCR产物的克隆、测序与序列分析

将回收PCR产物与pMD-T载体连接，转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定，将插入片段正确的8个阳性克隆提取质粒，用Beckman CEQ8000测序仪测序。将测得的序列用DNAMAN，DNAstar，MEGA4等软件分析，与已注册的其它植物AP1基因进行同源性比较。

1.2.5荧光实时定量表达分析

1.2.5.1引物设计和验证

根据克隆得到的PaAP1，和NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中已释放的樱桃ACTIN(FJ560908)序列设计引物AP1-F-Q1、AP1-R-Q1、ACT-F-Q1、ACT-R-Q1(表1，也可见序列表SEQ ID NO：3-6)，用于PaAP1荧光实时定量表达分析。利用红蜜6月16花芽cDNA为模板检测引物的特异性和最适退火温度。结果显示阴性对照的C(t)值接近于40，而且AP1-F-Q1/AP1-R-Q1和ACT-F-Q1/ACT-R-Q1只有单峰没有杂峰出现，说明可以用于荧光实时定量表达分析，AP1-F-Q1/AP1-R-Q1最适退火延伸温度是55℃。

1.2.5.2反应体系、程序及分析

10ul反应体系中包括10ng cDNA，5ul Ssofast Evagreen suppermix(伯乐公司)，200nM引物。反应程序为94℃5min，40个循环(94℃5sec，55/57℃5sec)，溶解曲线65℃-95℃5sec(+0.5℃/循环)。分析在CFX96Real-Time system(伯乐)仪器上进行。每个反应设三个重复，每个引物设三个不加模板的阴性对照。当阴性对照检测不到扩增产物而且样品三个重复的C(t)之间的标准差小于0.5时数据可用，用Bio-Rad CFX Manager软件进行数据分析及出柱状图。

表1引物序列

2.1AP1全长序列及分析

利用PaAP1全长引物在4月9日采集红蜜花瓣中扩增得到一条750bp以上条带(图1)。回收测序得到PaAP1编码区全长753bp，如SEQ ID NO：11所示，编码250个氨基酸，如SEQ ID NO：12所示。

2.2PaAP1氨基酸序列分析

将所得的PaAP1基因翻译的氨基酸序列提交NCBI网站进行BLASTp后，结果显示该蛋白属于MADS蛋白家族(图2)。进化树分析表明樱桃的PaAP1蛋白和樱花最为接近，其次是桃(图3)。

2.3.PaAP1的表达分析结果

荧光定量的结果(图4)表明PaAP1基因在花芽较早的发育时期就开始表达，6月10日的高表达量说明PaAP1在花芽中开始表达的时间更早；PaAP1的表达量随后迅速降低，19天后(6月29日)降到最低；7月10日的花芽中PaAP1开始大量表达，并且一直持续到9月9日，大约两个月的时间。PaAP1基因在叶芽中的表达模式和花芽相似，不同的是8月20日以后的叶芽中PaAP1很少有表达。比较花芽和叶芽中PaAP1的表达模式，可以推测8月20日左右是红蜜花芽分化的关键时期。PaAP1基因在花瓣和柱头中有很高的表达量，但是在花萼和叶子中表达量很低，茎和雄蕊中也有PaAP1的表达。

图4中：2、34、27、40、38、37、42为花芽，分别在6月10日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、9月9日采取。19、33、41、39、21、17、32、29为叶芽，分别在6月3日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、8月20日、9月9日采取。HB：花瓣，HE：花萼，leaf：叶，steam：茎，XR：雄蕊，ZT：柱头。以上样品在图4的横坐标中按照以上顺序排列。

二、转化拟南芥使其早开花的应用

2.1表达载体构建：

提取花瓣总RNA，用Invitrogen RT试剂盒反转录成cDNA，用AP1-7R和AP1-7F(见表1，也可见序列表SEQ ID NO：7和8)引物扩增，得到750bp单一产物，回收PCR产物并与pMD-T载体连接，转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定，将插入片段正确的8个阳性克隆提取质粒，用Beckman CEQ8000测序仪测序。通过序列比对，确定并获得AP1全长序列完全正确的attB-AP 1-clone5。

提取clone5质粒DNA，用attB-AP1F和attB-AP1R引物进行高保真扩增，得到单一扩增产物，回收，并和pDonor221质粒连接(2ul BP酶，100ng pDonor221，30ng扩增产物，PH8.0TE，共10ul，25℃4h，加入1ul蛋白酶K，混匀后37℃10min)；

取连接产物1ul转化DH5a，用50ug/ml卡那筛选阳性克隆，提取8个阳性克隆质粒，用测序的方法鉴定并得到插入方向和序列准确的pDonor221-AP1-clone3。用LR酶(Invitrogen)将pDonor221-AP1-clone3和表达载体Pk7G2D反应并构建AP1表达载体(如图5所示)。方法：依次加入150ng pDonor221-AP1-clone3，150ng Pk7G2D，4ul LR酶，TE(PH8.0)，共20ul，25℃4h，加入2ul蛋白酶K，混匀后37℃10min。

取1ul表达载体反应液转化DH5a，鉴定阳性克隆并提取质粒，5ul质粒转化100ul GV3101农杆菌，在LB+100ug/ml庆大霉素+100ug/ml壮观霉素上筛选，阳性克隆提质粒测序鉴定。序列完全正确的质粒相应的农杆菌用于后续拟南芥转化。

2.2转化过程

将春化过的拟南芥种子种于人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后光照，三天后揭膜。人工培养室条件：相对湿度80％，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗、16h光照培养。

制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。室温5000rpm离心15分钟。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使O.D600在0.8左右。将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，盖上透明的塑料盖子或保鲜膜以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。一周后再喷洒一次，方法同上。

2.3转化子的筛选

先用70％乙醇浸泡10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮，用无菌水洗四次。处理后的种子用Top agar(0.1％琼脂水溶液)均匀涂布在固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。观察种子在固体筛选培养基上生长情况，可确定为转化子时，将转化子移栽至人工土壤培养。

2.4.PaAP1转化拟南芥的结果

2.4.1T0代转基因拟南芥鉴定和表型观察

随机选择10株转基因拟南芥提取DNA，用樱桃PaAP1特异引物(用于区别拟南芥本身AP1)AP1f386-408和AP1r672-694(见表1，也可见序列表SEQ ID NO：9和10)鉴定转基因株系。结果见图6，其中，泳道1：野生型；泳道2-5：转基因株系；泳道6：阴性对照；泳道7-12：转基因株系，野生型和无引物的阴性对照没有扩增产物，其余10个株系均有樱桃特异PaAP1扩增产物。说明樱桃PaAP1基因转入了拟南芥。转基因株系均有GFP荧光，野生型拟南芥没有。间接说明樱桃AP1基因在拟南芥中正常表达(见图7转基因株系(右)和野生型(左)的GFP表达情况)。

PaAP1转化拟南芥共得到43个转基因株系，其中8个株系表现出比对照早开花(图8为转基因株系和图9为野生型)，在4-6片真叶时就有花苞出现，而对照开花需要14-20片叶子。早开花转基因株系从播种开始，14天出现花苞；而对照需要30-34天。有开花表型的转基因株系为5，10，15，16，21，28，32，33。开花时真叶数量分别是6，4，5，4，5，5，5和4。早开花株系普遍比野生型弱小，其中10和15太弱没有收到种子，16的种子很少。

2.4.2T1代转基因拟南芥表型分离比和PaAP1表达分析

将5，21，28，32，33有早开花表型的转基因株系和对照各播种30粒观察后代分离比。结果，T1代普遍比野生型早开花，见图10，T1代转基因拟南芥(左)2片真叶出现花序分离，同时期的野生型(右)8片真叶尚未开花。统计分析转基因株系表型分离比和早开花真叶数，并和野生型的开花真叶数进行比较(表2)。结果表明，株系5只成活9株，7株表现早开花，开花时叶片数为7.1±2.2，未早开花2株，分离比接近3∶1；株系21成活3株，无早开花；株系28成活23株，其中18株有早花表型，开花时叶片数为3.3±1.2，6株没有早花表型，分离比为3∶1；株系32成活24棵，有19株早开花，开花时叶片数为2.4±1，5株没有早开花表型，分离比接近4∶1；株系33成活27株，其中18有早花表型，开花时叶片数为3.1±1.4，未早开花9株，分离比例2∶1。

表2T1代转基因拟南芥表型

株系	成活	早开花	开花时叶片数(不含子叶)	T0代开花叶数	T0代GFP荧光
						5	9	7	7.1±2.2	6	Y
21	3	0	-	5	Y
						28	23	18	3.3±1.2	5	Y
33	27	18	3.1±1.4	4	Y
						32	24	19	2.4±1	5	Y
野生型	30	0	15±1.3	-	-

提取4株野生型拟南芥及20个株系28后代的总RNA，鉴定PaAP1的表达情况。结果见图11，其中，1，2，3，4：野生型；5，6，7，8，10，14，15，16，17，18，19，21，22，23，24：株系28的早开花后代；9，11，12，13，20：株系28的没有提前开花后代。4个对照拟南芥(泳道1-4)均未见樱桃PaAP1表达；株系28的15个早开花(5，6，7，8，10，14，15，16，17，18，19，21，22，23，24)后代均有樱桃PaAP1表达；株系28的5个没有提前开花后代(9，11，12，13，20)均无樱桃PaAP1表达。转基因株系的表型和PaAP1的表达完全吻合，说明拟南芥早开花是由PaAP1表达引起的。

因为樱桃育种周期长，培育出幼龄期短、早开花的品种一直是樱桃育种家的夙愿。本发明通过同源克隆、表达分析和转基因验证，获得了甜樱桃中具有促进早开花功能的基因PaAP1。甜樱桃PaAP1在拟南芥中超表达的表型特点(促使早开花)和拟南芥、菊花、杨树、柑橘、苹果等同源AP1基因的转基因表型基本一致。来自木本植物柑橘和杨树的同源AP1基因在自身物种中超表达可以使得木本植物提前开花，甚至在试管中开花。由于樱桃转基因技术已经成熟，通过使甜樱桃PaAP1基因在自身物种中超表达，预期可以获得具有早开花特性的樱桃品种和樱桃砧木。樱桃砧木的早花特性会对接穗的早花产生积极影响，从而以一种更加安全和大多数人认同的方式促进樱桃早开花结果，缩短樱桃育种和生产中的资金回流周期，为果农带来实际的利益。另外，超表达的PaAP1基因可以使拟南芥早开花，说明在甜樱桃中PaAP1是控制开花早晚的主效基因。不同的樱桃品种资源的开花早晚存在差异，预示着不同樱桃品种资源中的PaAP1基因在基因组中存在等位变异。开发和利用PaAP1不同等位变异和开花早晚的相关性，可以使PaAP1作为樱桃幼龄期长短的分子标记，辅助育种，进而促进生产。

Claims

1.甜樱桃PaAP1基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

2.甜樱桃PaAP1基因，其特征在于，其编码的氨基酸的序列如SEQ ID NO：12所示。

3.根据权利要求2所述的甜樱桃PaAP1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

4.重组了权利要求2或3所述的甜樱桃PaAP1基因的重组载体。

5.权利要求2或3所述的甜樱桃PaAP1基因的应用，其特征在于，将所述甜樱桃PaAP1基因转化拟南芥或甜樱桃，使其早开花。