CN108504663A

CN108504663A - 桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因及其应用

Info

Publication number: CN108504663A
Application number: CN201810555879.4A
Authority: CN
Inventors: 曾文芳; 王志强; 丁义峰; 牛良; 鲁振华; 崔国朝; 潘磊; 高昂
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: CN108504663B

Abstract

本发明涉及桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因在番茄中的应用。本发明首先从桃果实中克隆得到Ppa011935m基因，将上述Ppa011935m基因转入番茄中进行应用，结果表明，Ppa011935m基因超表达能改变番茄的株型，使其节间伸长、株高增加，果形改变、形成尖形果，减少了果实中种子数量，甚至形成无籽果实。同时Ppa011935m转基因促进了果实乙烯的释放，使果实成熟提前。本发明提供了一种改变番茄株型、种子数并促进果实成熟的方法，包括：将本发明Ppa011935m基因基因引入到番茄中，能够有效改变番茄的营养生长和生殖生长相关性状。

Description

桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因及其应用

技术领域

本发明涉及桃生长素原初响应因子基因，尤其涉及桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因在改变番茄株型、果形、根系和果实成熟期方面的应用。

背景技术

生长素对桃果实的生长发育和成熟起着非常重要的作用。高浓度的生长素对跃变型果实乙烯的合成是必需的，可引起溶质型桃在成熟后期的软化。相比之下，硬质型桃果实成熟时由于产生的生长素浓度较低，几乎不产生乙烯，果实不能软化。外源萘乙酸处理可引起硬质型桃果实成熟软化，证明了生长素在此过程中的作用。生长素通过对Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)蛋白水平的调节进而快速诱导一系列的生长素响应基因表达。Aux/IAA蛋白是生长素信号转导的调控中心。研究发现桃基因组中存在22个Aux/IAA基因，其中10个Aux/IAA(包括Ppa011935m)基因在溶质型桃成熟时的的表达水平明显高于硬质型桃。

Aux/IAA基因编码半衰期较短的核蛋白，在拟南芥和番茄基因组中分别有29和25个家族成员。在番茄中，沉默SlIAA9基因影响了叶片的形态、果实坐果和发育，顶端优势以及其它许多营养生长和生殖生长的改变。沉默SlIAA27基因不仅引起了番茄的单性结实，果实的大小和形状也发生了改变。近来沉默番茄SlIAA17基因的研究发现，相对于野生型，转基因植株果实细胞明显增大，果皮增厚，果实变大，同时果实可溶性固形物、pH值、硬度均发生改变。同样，抑制土豆StIAA2基因表达导致了更明显表型的改变，植株高度增加，叶柄偏上生长和茎尖叶片生长原基弯曲。菊花CmIAAl基因转化拟南芥，导致转基因拟南芥生长发育较野生型缓慢，而且其主根也比野生型短；杨树PtrIAA14.1转化拟南芥，转基因植物表现出一系列生长素相关表型，包括叶片下卷，花序茎分枝增加，结实率降低。因此，Aux/IAA基因在植物生长发育和形态建成过程中扮演着重要的角色。

发明内容

本发明目的之一是提供桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因、Ppa011935m基因编码的蛋白或含有Ppa011935m基因的重组载体或宿主细胞在促进番茄果实成熟和/或促进单性结实中的应用。

本发明目的之二是提供桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因、Ppa011935m基因编码的蛋白或含有Ppa011935m基因的重组载体或宿主细胞在提高番茄株高和/或减少番茄侧根数量中的应用。

本发明目的之三是提供桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因、Ppa011935m基因编码的蛋白或含有Ppa011935m基因的重组载体或宿主细胞在番茄果形改变中的应用。

进一步地，所述番茄果形改变为番茄果实长出果尖。

本发明目的之四是提供桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因在番茄育种中的应用。

进一步地，所述应用为培育转Ppa011935m基因番茄，包括以下步骤：步骤1：构建含有所述Ppa011935m基因的重组植物表达载体；步骤2：将所构建的重组植物表达载体转化到番茄组织或细胞中；步骤3：筛选培育得到转基因番茄。

上述Ppa011935m基因的序列如SEQ ID No：1所示，所述Ppa011935m基因编码的蛋白的序列如SEQ ID No：2所示。

本发明从桃果实中提取RNA，通过反转录试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR获得Ppa011935m基因的全长序列。引物序列为：

正向IAA19f：5'-ATGGCCAAAGAAGGTTTAG-3'，

反向IAA19r：5'-TTATTTAGGATCATCTTTCATAG-3'，PCR的退火温度为58℃。

将PCR获得的目的片段通过pTOPO-blunt载体克隆，然后用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)连接到pCambia1380载体上。使用引物

vIAA19f：5'-GGAGTCCACCATGGTAATGGCCAAAGAAGGTTTAG-3'，

vIAA19r：5'-TAGCGTTAACACTAGTCAATTTAGGATCATCTTTCATAG-3'，检测阳性克隆。然后将阳性克隆送至上海生工生物科技股份有限公司测序。

采用模式植物Micro-Tom番茄用于Ppa011935m基因的功能验证，番茄转化参照Sunet al(2006)，Bee Lynn Chew and Yu Pan(诺丁汉大学)提供的方法进行。利用农杆菌介导的叶盘法将构建的含有Ppa011935m基因的pCambia1380载体导入Micro-Tom番茄中，经过共培养、潮霉素筛选培养、生根培养等过程获得潮霉素抗性植株，结合抗生素筛选、PCR鉴定阳性植株，确保下一步转基因植株材料的准确性。

PCR鉴定阳性植株所用引物：

1380F：5'-TTCTTGTTCCCATTTCTCTCT-3'，

1380R：5'-AGCTGGTCACCTGTAATTCAC-3'。

本发明为研究Ppa011935m基因在转基因番茄中的作用，以野生型为对照，测定了转Ppa011935m基因番茄在生长42d时植株高度，结果转Ppa011935m基因番茄植株高度明显高于野生型(图5)。对果实形状的观察发现，转基因番茄植株的果实带有明显的果尖，果实中种子数量明显减少，有的甚至形成无籽果实(图7和图8)；对果实发育期的乙烯进行测定发现，Ppa011935m基因促进了乙烯的释放(图10)。因此Ppa011935m基因改变了番茄的株型、果形和种子数，促进了番茄果实的成熟。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

相对于其它转基因引起植物表型的局部改变，如叶片形态或花结构单方面改变，或根系长度及侧根数目的变化，以及果实大小或果皮厚度的改变，转Ppa011935m基因引起了番茄营养生长和生殖生长全方位的改变，从侧根数量减少到果实种子数减少，从株高增加到果实果尖形成，同时乙烯合成酶基因表达升高，乙烯释放量增多，促进番茄果实的快速成熟。

附图说明

图1为实施例1从桃中克隆的Ppa011935m基因扩增电泳图，图中两侧的M为DL2000marker，中间单一条带为Ppa011935m基因，大小为890bp。

图2为实施例1番茄转Ppa011935m基因阳性植株PCR鉴定电泳图，图中-表示阴性对照，+表示阳性对照。

图3为实施例1中桃品种CN13发育期不同组织中Ppa011935m基因相对表达量。

图4为实施例1中桃品种CN13和CN16果实成熟期Ppa011935m基因的相对表达量。

图5为实施例1中野生型番茄和转Ppa011935m基因番茄植株高度比较图。

图6为实施例1中野生型番茄和转Ppa011935m基因番茄侧根数目比较图。

图7为实施例1中野生型番茄和转Ppa011935m基因番茄果尖长度比较图。

图8为实施例1中野生型番茄和转Ppa011935m基因番茄种子数量比较图。

图9为实施例1中番茄果实不同成熟期的硬度比较图。

图10为实施例1中番茄果实不同成熟期的乙烯释放量比较图。

图11为实施例1中番茄果实不同成熟期的ACS1表达量比较图。

图12为实施例1中番茄果实不同成熟期的ACO表达量比较图。

图13为实施例1中番茄果实不同成熟期形态比较图。

附图中，R表示root，Sm表示stem，L表示leaves，Fr表示flower，S1表示果实第一次指数生长时期，S2表示果实果核硬化起始期，S3表示果实第二次指数生长时期，S4I表示果实跃变前期，S4II表示果实跃变期，S4III表示果实跃变后期，Sd表示seed，WT表示野生型，13、24和25表示转基因株系，TG表示转基因，GR表示番茄绿熟期，B表示转色期，B3表示转色3天，B6转色6天，R表示成熟期。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1Ppa011935m基因的分离及鉴定

试验材料：溶质型桃品种CN13和硬质型桃品种CN16，Micro-Tom番茄，pCambia1380质粒，农杆菌GV3101。

试验方法

1.1Ppa011935m基因的分离

利用植物多糖多酚试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)从桃果实中提取RNA，通过反转录试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR获得Ppa011935m基因的全长序列(890bp)，如图1所示。引物序列为：

正向IAA19f：5'-ATGGCCAAAGAAGGTTTAG-3'，

反向IAA19r：5'-TTATTTAGGATCATCTTTCATAG-3'，PCR的退火温度为58℃。

vIAA19f：5'-GGAGTCCACCATGGTAATGGCCAAAGAAGGTTTAG-3'，

1.2桃组织中Ppa011935m基因表达分析

采用qRT-PCR检测Ppa011935m基因在CN13桃不同组织中的表达情况，以及Ppa011935m基因在溶质型(CN13)和硬质型(CN16)桃果实和种子中的表达情况。选取Actin(Ppa007242m)作为内参基因(Brandi et al.,2011)，用2^-ΔΔCT公式计算基因相对表达量(Livak and Schmittgen，2001)。

Ppa011935m基因在溶质型桃CN13的根、茎、叶、花、种子和果实不同生长发育时期均有表达，在果实发育期中的S1期Ppa011935m基因表达最高，S3时期下降到最低点，果实跃变期又升高，S4II期达到峰值(图3)。通过对溶质型(CN13)和硬质型(CN16)桃果实成熟期(S3～S4III期)Ppa011935m基因的表达比较发现，果实成熟期(S3～S4III期)Ppa011935m基因在溶质型(CN13)的表达明显高于硬质型(CN16)，同时随着果实的成熟表达上调，而硬质型(CN16)的表达几乎检测不到(图4)。

1.3Ppa011935m基因的功能鉴定

为研究Ppa011935m基因是否在桃成熟时生长素信号途径中发挥作用，通过转基因番茄的分析鉴定其功能。

采用模式植物Micro-Tom番茄用于Ppa011935m基因的功能验证，番茄转化参照Sunet al(2006)，Bee Lynn Chew and Yu Pan(诺丁汉大学)提供的方法进行。Micro-Tom番茄种子用体积百分数70％酒精表面消毒，无菌水漂洗3次后，10％次氯酸钠消毒1h。取出后在无菌水中清洗6次，滤纸上晾干。种子播种于pH 5.9、含有0.8％琼脂的50％MS培养基中，然后置于在14h/10h光暗、25℃、80％相对湿度、250μmol m^-2s^-1光强的组培室中培养。

1.3.1转基因番茄阳性植株的筛选

提取经过测序的Ppa011935m-pCMABIA1380载体的质粒，液氮冻融法转入农杆菌GV3101中。调整农杆菌菌液浓度OD＝0.5，叶盘法浸染转化Micro-Tom番茄，生根培养基上分化叶和根。待长成小苗后，提取DNA，常规PCR鉴定阳性植株。收获T0代种子后，在含有潮霉素的1/2MS培养基上筛选阳性植株。转基因阳性植株含有抗生素基因，能够在含有抗生素的培养基上长出真叶和主根，然后移栽到土壤中收获T1代种子。T1代种子播下后，利用T2代转基因番茄观察其与野生型的差别。

选取3个表达量高的转Ppa011935m基因株系(13、24和25)作为代表株系与野生型进行比较。

1.3.2超表达Ppa011935m基因对番茄株高生长的影响

与野生型相比，3个典型的转基因株系(13、24和25)在生长45d时节间长度明显伸长，株高比野生型的明显增加；3个典型的转基因株系的侧根数量减少，侧根数目几乎只有野生型的一半(图5和图6)。

1.3.3超表达Ppa011935m基因对番茄果实发育的影响

Ppa011935m基因在3个典型的转基因株系果实发育中超表达，导致了果实形状的改变：转基因株系的果实带有明显的果尖。经过测量，野生型和转基因果实的果尖长度明显不同，转基因株系的果实的果尖可达到2～3mm，而野生型的则没有果尖(图7)。

1.3.4超表达Ppa011935m基因对番茄果实种子数量的影响

与野生型相比，3个典型的转基因株系果实的种子数量明显减少，且转基因株系表现出了较高的单性结实率(图8)。

1.3.5Ppa011935m基因对番茄果实硬度和乙烯释放量的影响

对不同发育期(GR、B、B3、B6和R)果实的硬度和乙烯释放量进行测定，野生型和转基因果实硬度随着果实成熟不断下降。与野生型相比，转基因果实的硬度稍有下降(图9)。乙烯释放量在果实成熟前期不断上升，在B3时达到峰值，随后乙烯释放量开始下降。与野生型相比，Ppa011935m基因促进了转基因植株中的乙烯的释放(图10)。乙烯合成酶关键基因ACS1和ACO基因的表达和乙释放烯量一致(图11和图12)。上述数据说明Ppa011935m基因促进了番茄果实的成熟(图13)，成熟期可提前3天以上。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因及其应用

<130> 无

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> Prunus persica L.

<400> 1

atggccaaag aaggtttagg gcttgaaatc acagagctga ggctggggct atccagtggt 60

ccaagattgg tggacaaaaa cgagaagaaa agggtttttt cacagattgc tggcggagat 120

ggacataata atagcacatc cagtgatgac gaccggaaaa gcgaaacgaa gaaccaagtt 180

gtggggtggc ctccggtgtg ttcttaccgg aggaagatta atagcttaaa tgagacgtcc 240

aaaatgtacg tcaaggttag catggatgga gctccttttc ttcgtaaaat tgacttgagc 300

atacacaacc agtacgcaga tcttgccgtg gcattggaga agctatttgg ttgttttggc 360

atcggcgagg tgttgaagga tgcagagaac tgcgaatttg ctcctattta tgaagacaaa 420

gatggagact ggatgcttgt gggagacgtc ccttgggaga tgtttattga gtcatgcaag 480

aggctgagga tcatgaagag atcggatgcc aagggatttg gactgcagcc caagggcttc 540

ctcaaggcaa ctatgaaaga tgatcctaaa taa 573

<210> 2

<211> 190

<212> PRT

<213> Prunus persica L.

<400> 2

Met Ala Lys Glu Gly Leu Gly Leu Glu Ile Thr Glu Leu Arg Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ser Gly Pro Arg Leu Val Asp Lys Asn Glu Lys Lys Arg Val

20 25 30

Phe Ser Gln Ile Ala Gly Gly Asp Gly His Asn Asn Ser Thr Ser Ser

35 40 45

Asp Asp Asp Arg Lys Ser Glu Thr Lys Asn Gln Val Val Gly Trp Pro

50 55 60

Pro Val Cys Ser Tyr Arg Arg Lys Ile Asn Ser Leu Asn Glu Thr Ser

65 70 75 80

Lys Met Tyr Val Lys Val Ser Met Asp Gly Ala Pro Phe Leu Arg Lys

85 90 95

Ile Asp Leu Ser Ile His Asn Gln Tyr Ala Asp Leu Ala Val Ala Leu

100 105 110

Glu Lys Leu Phe Gly Cys Phe Gly Ile Gly Glu Val Leu Lys Asp Ala

115 120 125

Glu Asn Cys Glu Phe Ala Pro Ile Tyr Glu Asp Lys Asp Gly Asp Trp

130 135 140

Met Leu Val Gly Asp Val Pro Trp Glu Met Phe Ile Glu Ser Cys Lys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Ile Met Lys Arg Ser Asp Ala Lys Gly Phe Gly Leu Gln

165 170 175

Pro Lys Gly Phe Leu Lys Ala Thr Met Lys Asp Asp Pro Lys

180 185 190

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccaaag aaggtttag 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttatttagga tcatctttca tag 23

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagtccacc atggtaatgg ccaaagaagg tttag 35

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tagcgttaac actagtcaat ttaggatcat ctttcatag 39

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttcttgttcc catttctctc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agctggtcac ctgtaattca c 21

Claims

1.桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因、Ppa011935m基因编码的蛋白或含有Ppa011935m基因的重组载体或宿主细胞在促进番茄果实成熟和/或促进单性结实中的应用，所述Ppa011935m基因的序列如SEQ ID No：1所示，所述Ppa011935m基因编码的蛋白的序列如SEQ ID No：2所示。

2.桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因、Ppa011935m基因编码的蛋白或含有Ppa011935m基因的重组载体或宿主细胞在提高番茄株高和/或减少番茄侧根数量中的应用，所述Ppa011935m基因的序列如SEQ ID No：1所示，所述Ppa011935m基因编码的蛋白的序列如SEQ ID No：2所示。

3.桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因、Ppa011935m基因编码的蛋白或含有Ppa011935m基因的重组载体或宿主细胞在番茄果形改变中的应用，所述Ppa011935m基因的序列如SEQ ID No：1所示，所述Ppa011935m基因编码的蛋白的序列如SEQ ID No：2所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述番茄果形改变为番茄果实长出果尖。

5.桃生长素原初响应因子Ppa011935m基因在番茄育种中的应用，所述Ppa011935m基因的序列如SEQ ID No：1所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述应用为培育转Ppa011935m基因番茄，包括以下步骤：步骤1：构建含有所述Ppa011935m基因的重组植物表达载体；步骤2：将所构建的重组植物表达载体转化到番茄组织或细胞中；步骤3：筛选培育得到转基因番茄。