CN104245724A - 在烟草中提供花抑制特性的ft 家族核酸序列和肽/蛋白质和以其转化的转基因植物 - Google Patents

在烟草中提供花抑制特性的ft 家族核酸序列和肽/蛋白质和以其转化的转基因植物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及编码特定蛋白质的核酸序列，该蛋白(1)在相应的启动子下，能够阻碍或抑制或延缓植物的开花，并且(2)包括基序(motive)“NAPDIIDS”，或者基序“VNAPDIIDS”(在优选的情况下)，不包含StSP5G基因或其部分的核酸序列。优选地，所述核酸序列在系统发育上属于PEBP基因家族的FT-进化支，其中促进开花的蛋白质AtFT和BvFT2的基序“(V)YAPGW”被基序“(V)NAPDIIDS”所替代。本发明还涉及肽或蛋白质，可由如前述任一条权利要求中所述的核酸、包含如上所述的一段核酸序列的载体表达而获得，以及涉及对于所提及的植物、植物的部分结构或植物的种子，所述植物也包含了这样一段核酸序列。

Description

在烟草中提供花抑制特性的FT 家族核酸序列和肽/蛋白质和以其转化的转基因植物
本发明涉及新的核酸序列，其衍生的氨基酸、肽和蛋白质序列，以及以其转化的植物和其后代。此核酸序列导致开花的延迟或是抑制。进一步，本发明涉及用于对不开花植物进行工程化以确保限制转基因植物的方法，特别是对于可以无性繁殖的植物。
从营养生长向生殖生长的转变是植物的生命周期的一个重要特征。精确的开花起始时间对确保植物的成功繁殖至关重要。在农业和林业中，这种转变也是非常重要的，因为它显著影响产量和生物量。比如，花发育对于以产生高生物量为目的的培育来说是一个障碍，因为在植物中，花发育经常伴有营养生长的终止以及衰老。因此，对开花时间的调控，特别是延迟开花时间，可以导致生物量的增加，因为植物可以把它所有的能量转换为营养生长，而植物材料的衰老被抑制或至少是推迟。
通过调节大量基因的表达，一个包含了外源信号，如光周期和春化，的信号通路的交错网络紧紧控制着植物生命周期中开花的发育步骤。在进化过程中，鉴于同源基因建立了新功能，控制开花的关键基因的加倍似乎起重要作用。突出的例子是植物磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族的成员，这一家族还出现在细菌和动物中，在那里它们参与各种生物学过程，例如蛋白酶和激酶的抑制剂。但是，在植物中，PEBP家族成员在控制出芽分生组织特性和开花时间的控制行为中起重要作用。它们中最突出的成员是FLOWERING LOCUS T(FT)，FT感应叶片中的花诱导条件，并在顶端分生组织(SAM)中引发花的发育，因此是移动的花信号分子，被称为“花激素”，此术语已于1937年由Chailakhyan定义。对若干物种中的同源物的研究表明，FT具有跨越物种的广泛的促进开花作用，例如双子叶物种如拟南芥、番茄、杨树、苹果、瓜类、甜菜(Pin等人，2010)以及许多其他物种。
在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，B-box锌指转录因子CONSTANS(CO)在诱导性长日照条件下于叶子的韧皮伴胞中激活FT的表达，因为CO蛋白只在有光的时候稳定。接着，FT蛋白进入筛管的筛管元件，并通过质量流(mass flow)运输到SAM，在那里它与bZIP转录因子FD相互作用，两者一起激活花发育的下游目标，如第二花整合蛋白CONSTANS1(SOC1)过表达抑制子和花分生组织特征性基因APETALA1(AP1)。在拟南芥中，FT最接近的同源物是TWIN SISTER OF FT(TSF)，是通过基因加倍进化而来。TSF是CO的直接调节目标，并且担当花启动基因，因此与FT功能冗余。在非诱导性短日照条件下，长日照兼性植物拟南芥的开花是由不依赖于FT的赤霉素通路所控制，此通路直接激活SOC1的表达。
拟南芥开花的另一个重要调节因子是TERMINAL FLOWER1(TFL1)，它在金鱼草(Antirrhinum majus)中的同源物CENTRORADIALES是植物PEBP基因家族的最早成员。虽然和FT的序列大部分相似，但是TFL1是一个开花的抑制子且与花序结构有关，因此对与其有亲缘关系的FT有功能拮抗作用。然而，替换一些确定的氨基酸分别可以将TFL1转换成开花诱导因子而把FT转换成开花抑制因子(Hanzawa Y.,Money T.,and Bradley D.(2005)。单一氨基酸将开花抑制因子转化为激活因子(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,7748；Ahn J.H.,Miller D.,Winter V.J.,Banfield M.J.,Lee J.H.,YooS.Y.,Henz S.R.,Brady R.L.,and Weigel D.(2006))。有差异的外部环结构赋予开花调节子FT和TFL1的拮抗活性(EMBO J.25,605-614)。FT和TFL的具体界定是在转录水平上进行的。FT仅仅在叶片中表达，并随后传送到SAM，而TFL1的表达和翻译仅发生在SAM中。据报道，TFL和FT这两种蛋白质都与位于茎尖的相同的辅助因子FD作用，调节靶基因的转录抑制或是激活：TFL/FD复合物抑制花分生组织特征性基因的转录，而TF/FD复合物起激活作用。因此，假设花的发育过程是由两个具有拮抗作用且各代表一个PEBP家族亚家族的蛋白质共同完成调节的。TFL1的具有抑制开花的相似功能的同源物广泛存在于其他物种中，组成PEBP家族的3大主要进化支之一。除了FT、TSF和TFL，在拟南芥中还表征了三个PEBP家族成员，命名为MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)，其功能似乎与FT相冗余，和BROTHER OF FT AND TFL1(BFT)以及ARABIDOPSIS THALIANACENTRORADIALES(ATC)，它们的活性与TFL1相冗余。即使FT和TFL1被认为属于相同的家族且具有57％的氨基酸序列相同性，它们在开花的发育过程中发挥着拮抗作用，此外，在系统发育学上，它们各代表着PEBP家族的不同亚家族。
现有技术提示开花时间的调控。这可以通过过表达花发育抑制因子或是通过RNA干扰下调花发育的激活因子来实现。然而，所有这些只能延迟开花时间而不能完全阻止。一个例子是拟南芥的FLC蛋白，其可以用作一个花朵发育抑制因子可以延迟开花时间，见WO 2000/050615。
近来，鉴定了甜菜中另一种抑制开花的方式。在这种植物中，进化出一对互相拮抗的FT同源物(Bv FT1和Bv FT2的)衍生，调节花转变，其中，尽管是FT同源物，Bv FT1抑制开花，而Bv FT2促进开花(Pin et al.,Science330,1397(2010))。已有这样的提示，调节这些蛋白质的基因的表达，具体地，下调或阻碍Bv FT2基因表达或者上调Bv FT1基因表达，以便在正在生长的甜菜植物中获得延迟的春化响应或使甜菜植物产生不抽苔表型(参见WO 2010/025888)。然而，因为抗抽苔的甜菜不会开花，并且由于没有抽苔，所以不会产生种子。因为甜菜不能无性繁殖，为了能够维持、繁殖并商业化抗抽苔的甜菜，所述调节应该是有条件的或隐性的。因此，建议使用诱导型启动子作为用于转染的杂合的构建体。例如，通过RNAi盒使Bv FT2的表达沉默。在29个案例中的一个里，观察到的开花延迟时间在0到超过87天之间。此外，在一年生和二年生转基因植物中都在拟南芥组成型Ubi3启动子的控制下表达了Bv FT1。这表明抽苔的延迟范围是从几个星期到三个月以上。
因为开花时间对生物量产生具有巨大的影响，有必要了解在农艺学感兴趣的物种中如何调节开花时间。虽然烟草(Nicotiana tabacum)与茄科的许多其他成员一样，是具有重大经济意义的作物，但对于烟草调节花调节知之甚少，只分析了少数几个基因。为深入研究花的发育，烟草引起极大兴趣，因为这一物种很可能是四倍体化事件的结果，并且具有与近亲兼性SD栽培种茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)的基因组组合的LD栽培种林地烟草(Nicotiana s ylvestris)基因组。然而，与模式植物拟南芥恰好不同，对烟草的花发育的分子基础了解很少，因为到目前为止只鉴定和表征了几个基因。
表达在有条件的或隐性的启动子控制下的开花抑制物(inhibitor)的转基因植物会使得花发育提早或延迟，这是不期望的，或者用于获得后代。因此，此类植物迟早必然用于生产花粉粒。很明显，就温室外生长的具有商业意义的作物来讲，控制其花粉是困难的。因此，与野生亲缘植物以及与相应的作物异型杂交仍然是可能的，而且无法限制转基因传播到自然界中。
本发明的目的或问题在于要克服至少部分上述缺点，并提供编码能够阻碍或延迟开花或花发育的氨基酸序列的核酸，优选地，所述氨基酸序列的大部分氨基酸序列和基序属于FT进化支，但在任何情况下其部分序列不属于本领域已知的所有FT蛋白质的序列和基序，并且赋予以包括所述核酸的构建体转化的植物新的、独特的特征。特别地，所述核酸可用于产生转基因植物，优选地，作物，使其开花延迟，或者更优选地，使其不开花，并保持不开花状态超过一个营养生长期。因此，本发明以使用能够无性繁殖的植物(如烟草或马铃薯)为重点。
本发明的发明人在烟草中鉴定了4种FT同源物，命名为Nt FT1-4，其在系统发育上属于FT亚家族，但在花发育中有着拮抗作用。通过过表达对这些蛋白质的功能进行研究。出人意料的是，研究显示，过表达Nt FT的植物表现出完全不同的表型，从在组织培养很早出现花芽(Nt FT4)到9个月、超过5m高的植物仍不开花(Nt FT1-3)。一般情况下，SR1品种的烟草植物大约萌发后6到8周开花并且在那个时间会达到约1至1.5m。通过过表达一个能够引起开花抑制的FT，可以产生完全营养生长至少9个月并在此期间达到超过5m的高度的烟草。本发明人说明，这种效果可以转移到除烟草外的其他物种，至少在茄科内。这些结果使得所述Nt FT1，Nt FT2和Nt FT3或其部分可以用于构建体，所述构建体不仅可以用于转化烟草还可以用于转化其它茄科植物如马铃薯。此外，可以转化其他科的植物以抑制花转变，如十字花科和菊科植物，例如橡胶作物哈萨克斯坦蒲公英(Taraxacumkoksaghyz)(菊科植物)。优选地，所选择的植物物种应为无性繁殖。
图10表示示例性选择的植物中PEBP家族成员的蛋白质比对。在比对中的所有序列完全一致的氨基酸列以*标记；保守性氨基酸替换以:标记；半保守性氨基酸替换以.标记。星号标记的氨基酸是At FT vs.At TFL1功能所必需的(Ahn et al.,2006，见上文)以斜体字标记的氨基酸介导Bv FT1vs.BvFT2的功能(Pin et al.,2010，见上文)。在At FT、Nt FT4以及甜菜中的促进开花的蛋白Bv FT2中有一个非保守区域，该区域显示相同的基序“YAPGW”。
本发明提供一类新的蛋白质和编码所述蛋白质的核酸，其中所述蛋白质(1)具有抑制特性，和(2)用基序“NAPDIIDS”替代了原所有促进开花的蛋白质的基序“YAPGW”。此外，这种基序序列与抑制开花的Bv FT1中相同蛋白质区域中的已表征的“NAPQQ”也不同。优选地，(3)该蛋白质属于FT进化支。优选地，术语“属于FT进化支”是指该蛋白可以在系统发育上被划分到FT进化支和/或分享至少50％、优选80％、最优选100％的那些在At FT、At TFL1、Bv FT1和Bv FT2中的每一个中均为保守性的氨基酸，(见图10标有*的氨基酸列)，和/或分享至少70％，优选80％，更优选90％的At FT、At TFL1、Bv FT1和Bv FT2中的任何蛋白质中的氨基酸序列链。
此外，本发明的发明人发现基序“APDIIDS”，甚至基序“NAPDIIDS”与所述以及相关肽和蛋白质的花抑制特性相关，并因此首次发现，马铃薯基因StSP5G(来自马铃薯(Solanum tuberosum))和番茄基因SlSP5G(来自番茄(Solanum lycopersicum))及其衍生的蛋白质在该马铃薯和番茄及所述基因的转基因植物的开花的抑制中起重要作用，目前的报告称所述马铃薯基因StSP5G是块茎发育中的一个可能的抑制子。
本发明进一步提供了核酸和可通过所述核酸表达蛋白质或者的肽，其中所述核酸的序列部分或完全是SEQ-ID No.1、2、3和4中的一个(图1至图4)，或其中所述蛋白质或肽的序列部分或完全是SEQ-ID No.5、6、7和8中的一个(图5至图8)，优选地，如从属权利要求中指明。
此外，本发明的任何核酸序列可以在启动子的控制下。该启动子可以是细胞特异性，时间诱导的(temporally induced)启动子，最初存在于烟草植物中，优选天然控制基因FT1至FT4，从而在韧皮部伴胞诱导FT的表达的启动子。此外，该启动子可以是烟草来源的组织特异性或细胞特异性的，随着时间推移具有组成型活性的启动子，如FD启动子(FD是FT的一种辅助因子)，这是优先表达在花诱导组织SAM中。
或者，所述启动子可以来源于另一种植物，例如拟南芥FT或蔗糖转运蛋白At SUC的细胞特异性、时间诱导启动子，其在来源叶片的韧皮部伴细胞中均有活性。进一步，该启动子可以是组织特异性或细胞特异性的，随着时间推移，具有组成型活性的启动子，如拟南芥FD的启动子，使其在SAM中表达。
其它市售或可从其他来源得到的启动子，以及合成型启动子均可，任选地，与其他调节元件组合，具体地与增强元件组合，使用，例如具有时空强组成型活性的、病毒的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。在任何情况下，该启动子可以是组成型的，但这个特征不是必需的。
优选地，本发明中的核酸和肽/蛋白质用于通过对植物开花时间的调控(延迟)，或完全阻碍其开花而增加每株植物生物量/每单位时间。
随后，本发明将通过优选实施方案和实施例做进一步的说明。
鉴定来自烟草FT同源物的系统发育及分类
为鉴定烟草中可能的FT同源物，用拟南芥FT(At FT)的编码区作为BLAST查询对公共序列数据库(NCBI)进行筛选，该查询可鉴定相应的cDNA克隆(DV999455.1)，该克隆包含整个开放阅读框，如在与At FT的比对所示。基于此cDNA克隆，设计随后用于多种PCR方法的引物，所述PCR方法使用烟草叶的cDNA和基因组DNA。在这些操作中，可以鉴定四个可能的FT同源物的开放阅读框和基因组序列，命名为Nt FT1-4；其核酸序列见序列号SEQ-ID No.1-4(见图1-4)。在基因组和cDNA序列之间的比对显示了Nt FT1-4的外显子-内含子结构，如图9A所示。该图表明了烟草的FT同源物Nt FT1-4的分类。从(A)部分可以看出，烟草Nt FT1-4的外显子-内含子结构与At FT相类似。方框表示外显子，而线条代表内含子。虚线表示未知大小的内含子。(B)部分描述Karlgren等人(2011)定义的植物PEBP家族的系统发生树，包括在烟草中鉴定出的FT同源物Nt FT1-4。其中缩写词的含义如下：ATC：拟南芥Centroradialis；BFT：拟南芥Brother of FT andTFL1；FT：拟南芥Floweing Locus T；MFT：拟南芥Mother of FT and TFL1；NT CET1,2,4：来自烟草的烟草Centroradialis样基因；NT FT1-4：烟草Floweing Locus T；TFL1：拟南芥Terminal Flower 1；TSF：拟南芥Twin Sisterof Flowering Locus T。
从这些序列可很明显地看出，所有可能的Nt FT之间、以及与其他物种的FT基因(例如与At FT相比)之间都有着类似的基因组结构，即四个外显子中间插入三个内含子。外显子的长度是高度保守的，而内含子的长度在不同Nt FT中是有差异的。
对假定的烟草FT序列分析表明，它们属于PEBP基因家族，因为所有的蛋白质都具有典型的PEBP结构域。为阐明自烟草中所鉴定的FT同源物之间的系统发生关系，建立这四个假定的FT的比对的最大似然树，以帮助将烟草中的FT同源物分配到PEBP家族的三个进化支(参见图9B和实施例1)。不同于所预期的方式，即如拟南芥蛋白At FT，At TFL1和At MFT靶向三个主进化支，烟草FT同源物明显聚集在FT状进化支，表明其在促进开花方面的作用。
为验证Nt FT1-4的系统发生分类，将烟草中假定的FT与促进开花拟南芥FT以及抑制开花的拟南芥TFL1和其在烟草中同源物CET1、CET2和CET4的氨基酸序列进行比对(图10)。可能的烟草FT的所有序列之间表现出相对高的相同性，从～70％(Nt FT3与Nt FT4)至～89％(Nt FT1与Nt FT3)，与At FT之间的相同性为～62％(Nt FT2)到～73％(Nt FT4)。与此相反，它们与烟草CET(～52％)及拟南芥TFL1(～52％)之间显示出较低的序列相同性。用EMBOSS针头(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)获得的所有序列相同性的详细列表如表1所示。考虑系统发生树和序列相似性，很明显假定的烟草FT(命名为Nt FT1-4)属于FT-进化支而非TFL1-进化支。
表1
检测烟草的FT基因在开花控制过程的拮抗作用
为评估Nt FT1-4在调节开花过程中的功能，在烟草中将相应基因在强而组成型花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下(35S:Nt FT)异位过表达。农杆菌介导的转化后，每个构建体都再生了多达7个独立的转基因品系。
在烟草组织培养中，发明人发现，35S:NT FT4构建体能够有力地促进开花并且其过表达导致花和花状结构在植物发育的一个非常早期的阶段出现。这可以从图11A和11B看出：照片(A)和(B)表示植物的芽，其中Nt FT4的编码区克隆在花椰菜花叶病毒(35S)的组成型启动子的下游，并通过农杆菌介导的转化导入到烟草中。只有具有花状结构的芽可被再生，而芽发育停滞，且没有形成根，因而无法再生出成熟植物。因此，它们不能再生为成熟植物。该表型几乎与本实验中作为对照的拟南芥FT(35S:At FT)过表达产生的表型相同(图11C和11D)。
与此相反，在组织培养中，构建体35S:Nt FT1，35S:Nt FT2和35S:Nt FT3转化子都发育出几乎正常的芽。三个构建体的具有不同的表达水平的组培苗通过切割(cuttings)繁殖(以获得各品系的具有相同的表达水平的两个克隆)，并以组织培养的方式进行培养，直到组培苗发育出根。此后，将各品系的转基因克隆转移到人工气候室，其中一个克隆在LD(长日照)条件下培育，另一个克隆在SD(短日照)条件下培育，并测量开花时间。在这些条件下，共培育的野生型对照植物分别在4周长日照(LD)和5周短日照(SD)后开始产生花，说明开花日期会在短日照条件下延迟。在相同的LD/SD培育实验中，Nt FT1，Nt FT2或NT FT3转基因植物在两个培育条件下的开花时间和生长都有不同的发育，出现轻度、中度和重度的差异。这可以在图12A-12F中观察到：FT过表达Nt FT1(A，D)、Nt FT2(B，E)或Nt FT3(C，F)的代表性转基因烟草品系在长日照(A-C)或短日照(D-F)的条件下生长。当野生型(WT)植物开始开花的时间点，根据其生长行为和开花时间将转基因品系分为三个表型组：具有轻度表型的转基因品系仅比野生型植物晚几天开始开花，中度表型的品系中，开花迟缓大约一个星期。只有35S:Nt FT3克隆没有观察到中度的表型。在WT开花的时候，所有轻度影响的植物与野生型植物相比显示表型，开花时间稍微延迟(～3天)，而受中度影响植物的第一朵花的发育迟1至1.5周并且显示节间长度稍微缩短。相比之下，重度受影响的植物同一时间段内没有产生任何的花朵，并且显著的节间长度缩短导致的植物长度生长的强烈下降变得明显。在此生长时期期间，植物无论是否表现出轻度、中度或重度的表型，叶片的数目与野生型相当。使用叶总RNA进行全面定量(q)RT-PCR的实验，在受影响最重度的植物中，发现了给定Nt FT基因的最高转录水平，表明植物表型与转基因表达水平之间有直接的关系。这一点可以从图12G-12I看出，所述图表明植物生长行为和开花时间的表型剧烈性与相应的转基因的表达水平呈正相关。图12J-L的曲线表示qRT-PCR的结果，其中WT表达水平设定为1，且显示了代表三个表型分类的所有品系的平均值。条(bar)表示平均值的标准偏差；在n＝1时的条件下，条表示对应的qRT-PCR的三次重复的标准偏差。图(J)-(L)表明野生型和转基因植物过表达Nt FT1(J)、Nt FT2(K)或Nt FT3(L)在长日照(LD)和短日照(SD)条件下直至开花所需的周数(转移到人工气候室后)。符号“>”表明在所记录的周内植物仍然不开花。
接着，开始确定受到重度影响植物的花发育是否真正受抑制或仍然延迟。因此，在长日照条件下进一步于温室培育所有受重度影响的35S:NtFT1-3植物。图13表明表型重度的过表达Nt FT1-3的转基因烟草品系的生长行为。图(A)-(J)表明在长日照条件下的生长的示例性选择的过表达NtFT1、Nt FT2或Nt FT3的品系的时间序列。在植物转移至人工气候室后8周、11.5周和29周后拍摄照片(转移至人工气候室后的周数，wat)。在I和J图中的野生型(WT)植物是8周龄。重度表型品系的抽苔时间点与过表达水平相关联(表3)，因为在8.5wat已抽苔的植物(35S:Nt FT1L1和35S:Nt FT2L1)在重度表型的植物中表现出最低表达水平。虽然在8.5wat有扁平表型的植物在11.5周时开始抽苔，但是在长日照条件下它们仍只进行营养生长，而没有任何开始花的发育的征兆(attempt)。左边的标尺(bar)指示50厘米，右侧的标尺表示1米。图13(K)描述28wat在野生型和重度过表达的品系之间叶片数，高度，茎的直径和叶片大小wat的对比。显然，在重度过表达株系中，所有的参数都显著上升。图13(L)描述了28周龄的35S:Nt FT2L2、35S:Nt FT3L1和8周已开花的野生型之间顶端的(顶部)、中间的(中部)和基部的(底部)叶子的对比。标尺为10cm。
所有35S:Nt FT1转基因株系和35S:Nt FT2转基因株系之一在6-8周后开始抽苔，而后约在11周后长到接近2米的高度时发育出花(如图13A、B、E和F中所示的一个单独品系)，而其余的35S:Nt FT2转基因株系和所有35S:Nt FT3转基因品系保留了扁平和无花表型(图13C、13D、13G和13H)。定量qRT-PCR实验表明在保留了扁平表型的植物中Nt FT转录水平普遍较高(表3)。扁平且不开花的35S:Nt FT2转基因株系和所有35S:Nt FT3转基因品系在温室中继续生长9个月以上，而没有转变到生殖阶段(图13I和J)，这是最长期的观察。转基因株系达到了5米大小，从而显示在生物量上的巨大增加：在实验结束时，其拥有～120片叶片与最大长度65厘米的成熟叶片，相比于8周的野生型植物其大小约增长了1.5倍(图13K和L)。在茎方面也有着相似的约3.5倍的生物量增长(图13K)。应当注意的是，应在6个月后植物高2m已达到了人工气候室的天花板的高度时终止重度过表达植物在短日照条件的培养。这时，使植物将以与其在长日照培养条件下生长的对应植物一样的方式成长。这可以从图14看出，该图描述了过表达NtFT1-3的重度表型的转基因烟草品系在短日照条件下的生长行为。图片(A)至(J)描绘了在SD条件下生长的示例性选择的过表达Nt FT1、Nt FT2或NtFT3的品系的时间序列。照片如以下每个图像(wat：转移到人工气候室后的周数)所说明的进行拍摄。I和J图中是8周龄的野生型植物。重度表型的抽苔的时间点与过表达水平相关联(表3)，因为在4-6wat已抽苔的植物(35S:NtFT1L1和35S:Nt FT2L1)表现出重度影响表型的植物中最低表达水平。虽然在4-6wat时有一个扁平表型的植物在14-16wat开始抽苔，它们在短日照条件下仍只进行营养生长，而没有任何开始花的发育的征兆。由于人工气候室中的高度有限，在短日照条件下的培育不得不停止，因为植物已达到人工气候室的顶层。
检测叶中所有Nt FT的基础表达模式
对抑制花的Nt FT1-3以及促进花的Nt FT4的时空表达谱进行分析。为此，从在长日照及短日照条件下培养的4周龄的烟草植物提取叶、尖端、茎、及根中的总RNA，进行qRT-PCR。在图15中，单个Nt FT的表达水平表示为相比于参照基因Nt EF1α。NT FT1、Nt FT2和Nt FT4在两种光照条件下都能够在叶组织中特异性表达，然而，在LD条件下全部基因的转录水平都较弱，几乎接近于检测极限。这可以从图15的A和B中看出，图15A和B表明Nt FT1、2和4在SD(A)及LD(B)条件下均可在叶片中表达，虽然在LD条件下的表达水平接近检测极限。数值已标准化到参照基因EF1a的转录水平。虽然可获得Nt FT3的cDNA，但由于其表达水平太低而不能通过qRT-PCR对其时空表达进行可靠的分析。
为了更深入地了解抑制性Nt FT基因的表达的位置，通过示范性地表达在Nt FT3的1kb启动子片段(PNt FT3)控制下的带有ER标签的绿色荧光蛋白(GFPER)来研究空间表达。通过农杆菌介导的植物转化获得五个独立的转基因烟草品系，并命名为PNt FT3:GFPER。选择带有ER标签的GFP以防止其通过韧皮部扩散，以便正确地鉴定表达GFP的细胞。图15(C)及(D)显示通过共聚焦激光扫描显微镜CLSM拍摄的Nt FT3表达定位。将1kb Nt FT3启动子克隆在报告基因GFP-ER的上游，并且通过农杆菌介导的转化稳定地转化进烟草植物。CLSM显示GFP表达被限制在叶片的维管束，如图15(C)的叶柄的横截面图所示。在基生叶的叶脉中可以观测到最强的信号，不过表达和由表达产生的荧光弱，通过进行检测所需的高激光强度导致木质部的强自发荧光可以看出这一点。因此，Nt FT3的表达可以定位于维管束，更精确地，伴侣细胞(D，叶柄的纵截面)。木质部(X)自发荧光反映Nt FT3的低表达水平。(C)中箭头指示维管束。(D)中箭头标记以苯胺蓝染色的标志筛板。CC：伴细胞；SE：筛分子；标尺为50微米。从叶柄的纵向截面可明显看出，在细胞水平，PNT FT3在韧皮部伴胞(CCS)中是有活性的，其通常与筛分子(SE)相邻，所述筛分子的筛板用胼胝质染色的染料苯胺蓝进行染色(图15D)。因此，PNT FT3活性反应了Nt FT1、Nt FT2和Nt FT4的叶片特异性表达，从而表明具有激活及抑制功能的FT都有相同的空间表达模式。
接着，通过比较各个发育阶段的表达水平，更详细地分析Nt FT的时间表达模式在。为此，每周收获的LD以及SD条件下栽培的烟草植物烟草幼苗和基生叶，直到开花，从所述幼苗和基生叶中提取总RNA，所述总RNA用于通过qRT-PCR估计Nt FT1-4的表达。从图15(E)至15(G)可以看出，Nt FT1(E)、Nt FT2(F)和Nt FT4(G)在SD条件下表达水平随发育过程逐步增加，显示在幼苗中表达水平最低(时间点1)，在开花植物的叶中表达水平最高(时间点6)。测定幼苗中(时间点1)和每周收获的基生叶中(时间点2-6)的转录水平，所述基生叶的收获直到第一朵花开放。数值已通过参照基因EF1a的转录物水平进行标准化。
如在空间表达模式的分析中已经注意到的，Nt FT3在SD和LD条件下的表达水平以及其余Nt FT在LD条件下的表达水平都接近检测极限。对于Nt FT1、Nt FT2和Nt FT4在SD条件下观察到相似的表达模式；所有基因显示在幼苗中表达很低，但随着发育过程逐渐增加，在开花时间点，所有Nt FT的表达水平达到最大，对于Nt FT3似乎也是如此。虽然Nt FT4表达水平似乎一般表现得低于Nt FT1和Nt FT2，但到了开花时间点时Nt FT4表达量的增加(4400倍)显著超过Nt FT1(164倍)和Nt FT2(936倍)的增加。图15(H)表示了表达水平的增加。各基因在时间点2-6的值与时间点1(对于每一个基因设定为1)的值作比较。显然，Nt FT4(编码花激活因子)表达水平提高的倍数远高于Nt FT1或Nt FT4(编码花抑制因子)表达水平提高的倍数。至于已描述的几个物种如拟南芥或水稻，以光周期依赖性方式调节FT-表达。由于在LD条件下烟草FT的表达几乎检测不到，但在SD条件下的表达逐渐增加，可以得出结论，在烟草中FT表达也是光周期依赖性的，并且在SD条件下，开花也是以FT-依赖性的方式调节的。但是在LD条件下成花诱导的分子基础仍然不清楚。由于丢失了一些测序数据，还不能被阐明LD条件下花诱导发生是否不依赖FT，或者进一步，是否FT直系同源物参与该过程。
Nt FT1-3的花抑制功能在其他植物物种的可转移性
为了阐明Nt FT的花抑制功能是否在原则上也适用于其他物种，在模式植物拟南芥中示例性过表达35S:Nt FT2，该植物属于十字花科且不具备有花转变抑制功能的FT。通过农杆菌介导的转化获得35S:Nt FT2转基因拟南芥植物并进行表型分析。通过分析不同转化株的开花时间，很明显地，结果与那些在烟草中过表达35S:Nt FT1-3而获得的类似。在诱导型LD条件下，35S:Nt FT2过表达的植物表现出晚花的表型。如图16A至16C所示。正常地，野生型拟南芥植物萌发～8周后开花(图16A)，表现出重度表型的转化子在～1-2周重度后开花(在图16B中例示为Nt FT2L2)。因此，在拟南芥中过表达Nt FT2也会延迟开花。进一步，导致生物量的增加(C)：在诱导型长日照条件下培养植物，照片拍摄的时间点为野生型对照植物开始开花(A和C)，以及开花一周后(B)。虽然没有在烟草中明显，但明显的是，在拟南芥植物中过表达Nt FT2会增加生物量，特征在于叶片大小、数目及茎直径等增加(图16B和16C)。
此外，在马铃薯品种马铃薯(Solanum tuberosum)中过表达35S:Nt FT1-3。通过农杆菌介导的转化获得转基因马铃薯植物并进行表型分析。通过分析不同的马铃薯转化株的开花时间，很明显地，结果与那些在烟草植物中过表达35S:Nt FT1-3而获得的类似。具有35S:Nt FT1、35S:Nt FT2或者35S:NtFT3高表达水平的植物在LD条件下表现出晚开花的表型(图17)。正常地，野生型的马铃薯植物一般转移到温室中～8周后开花(图17A)，转化子在温室中连续生长超过5个月而不转变到生殖阶段(图17B，示例性地显示35S:NtFT1)，这是观察的最长期限。转基因品系的大小达到了～3米，从而显示生物量增加。
因而，明显地，由抑制性Nt FT介导的花抑制可以跨越物种，并且本发明可用于其它植物的转化，不仅仅是烟草，例如，茄科的其它属，如茄属植物(例如马铃薯)或甚至其它科如十字花科的植物。
尽管在系统发生上都清楚地与FT进化支有关，但是Nt FT1-3的最显着的特征是，所有三种蛋白质都有着花抑制功能，因此功能上与TFL1相当。拟南芥TFL1和FTX射线分析表明了这些PEBP-家族蛋白的两种典型的结构特征：一方面是假定的配体结合口袋，另一方面是外部环(Benfield andBrady,2000；Hanzawa et al,2005；Ahn et al.,2006)。有提示这些结构特征中的关键氨基酸对拟南芥中FT-与TFL1-功能是重要的(Hanzawa et al.,2005；Ahnet al.,2006)。位于所述结合口袋入口的Tyr85对于FT-功能是必需的，而His88(在TFL1相应位置上)介导了TFL1-功能。第二个关键氨基酸是由第四外显子编码的包含外部环(区段B)的14个氨基酸的部分，所述外部环在TFL1直系同源物中演变非常迅速，但是在FT直系同源物几乎不变(Ahn etal.,2006)。在TFL1中，Asp144与His88形成氢键，而FT在相应的位置携带一个谷氨酰胺(Gln140)，其不与Tyr85互作。表2显示部分的序列比对，与拟南芥的FT/FTL1、促进开花的Bv FT2、花抑制因子Bv FT1、以及花抑制因子(来自番茄的SlSP5G和来自马铃薯的StSP5G)相比较，阐明所描述的烟草中抑制性及促进性FT蛋白的重要氨基酸。顶部标有星号的是指在对At TFL1(His88/Asp144)和At FT(Tyr85/Gln140)的功能必需的氨基酸(Ahnet al.,2006)。区段B为第四外显子的一部分，编码一个在TFL1的同系物演变非常迅速，但在FT同源物中几乎是不变的外部环。字母以斜体标记的氨基酸对于Bv FT1和Bv FT2的拮抗作用是重要的(Pin et al.,2010)。关于氨基酸序列，明显地，Nt FT1-3以及Bv FT1包含两个关键的氨基酸残基(或其保守性取代)，它们在拟南芥中的相应位置的残基(Tyr-85和Gln-140)对于FT功也是必需的。因此，这些氨基酸并不是必须在烟草中才能确定FT功能，对于甜菜的FT中也描述了这一事实(Pin et.2010)。
表2
所描述的另一个关键序列三元组(LYN，位于区段C)，明显地在Nt FT1-3中发生了变化，所述三元组序列在FT同源物中保守，因此可能对于FT功能是必需的，然而，它存在于花抑制因子Bv FT1(表2)。Bv FT1与其花诱导直系同源物Bv FT2在区段B的三个氨基酸残基有区别(表2中斜体部分)，这些残基的取代使得激活因子转变为抑制因子，反之亦然(Pin et al.,2010)。已知茄科特异性活化型FT(Nt FT4，)在该位置处具有与花诱导型At FT和Bv FT2相同的氨基酸，抑制型Nt FT1-3、抑制型StSP5G和抑制因子SISP5G的氨基酸序列与抑制型Bv FT1显著不同，表现为在相应位置上是一个保守性的三氨基酸IID插入。因此，发明人假设抑制型与促进型FT功能物种特异性氨基酸模式。
为了验证这一假设，进行了一个结构域交换实验。通过定点诱变实验，将具有抑制功能烟草FT(Nt FT1)中的基序(motiv)NAPDIIDS以具有激活功能的烟草FT(Nt FT4)的YAPGW替换(图18)。这样，35S:Nt FT1swap在烟草中过表达，通过农杆菌介导的转化获得转基因烟草植物并进行表型分析。由于转基因植物在转移到温室后四周开花，明显地，通过更换NAPDIIDS基序而消除了花抑制功能。
实施例
实施例1：烟草FT同源物的克隆及其进化关系分析
为鉴定烟草可能的FT同源物，使用拟南芥FT(At FT；GenBank:AB027504.1)的编码区作为BLAST查询在公共序列数据库(NCBI)进行筛选。鉴定了用于设计初始引物对的烟草EST克隆(GenBank:DV999455.1)，所述引物对位于1号外显子(氨基酸1至8)及4号外显子(氨基酸173-177)上。为了在cDNA水平上分离出烟草中可能的FT，用RNA Plant试剂盒(Macherey-Nagel)从烟草的叶组织中提取总RNA并按照生产商说明使用SuperScriptII(Invitrogen)将其反转录为成cDNA。对cDNA进行PCR或利用PCR技术诸如cDNA末端的快速扩增(SMARTer RACE cDNAamplification kit；Clontech)和基因组步移(Universal kit；Clontech)以鉴定相应的基因组序列，可获得一些PCR产物。这些PCR产物按照本领域技术人员已知的常规操作流程完成切割、纯化、克隆和测序。序列分析表明有4个具有不同序列的同系物(Nt FT1-4)与At FT具有高度序列相似性存在。基因组和cDNA序列比对显示了Nt FT1-4的外显子-内含子结构，如图9A中所示。如从该图中可明显看出，所有可能的Nt FT之间及其与其他物种的FT基因(如与At FT相比)具有相似的基因组结构，都是4个外显子中间插入3个内含子。并且在Nt FT之间各外显子的长度是高度保守的，而内含子的长度不同。
使用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)对烟草中可能的FT蛋白进行序列分析，表明它们属于PEBP基因家族，因为所有的蛋白质都具有特征性的PEBP结构域。最近的对植物PEBP基因进行的系统发育分析揭示了有三个主要进化支的存在：FT-样、TFL1-样和MFT-样(Chardonand Damerval,2005)。PEBP基因家族所有成员都编码负责从营养生长到生殖生长阶段转变的关键调节蛋白，并且FT/MFT-进化支的基因促进开花，TFL-进化支的基因抑制开花。为了阐明所鉴定的烟草FT同源物的系统发生关系，对4个可能的烟草FT、来自拟南芥的重要调节因子FT、TFL1和MFT、以及已描述的来自烟草的TFL1同源物CET1、CET2和CET4进行蛋白序列比对而建立最大似然树(Amaya et al.,1999)。此外，我们把Karlgrenand coworkers(Karlgren et al.,2011)鉴定的PEBP蛋白及马铃薯PEBPStSP3D，StSP6A、StSP5G、StSP5G样、StSP9D、StMFT、StCEN1a和StCEN1b列为系统发生树的一部分，以便于将烟草FT同源物分配在PEBP家族的三个进化支中(图9B)。而拟南芥蛋白At FT、At TFL1和At MFT按照预期的方式靶向三个主要的进化支(系统发生树中标示为红色)，烟草FT-同系物(在系统发生树中标记为绿色)明显聚集在FT-样进化支，说明它们的促进开花的作用。
为了验证Nt FT1-4的系统发生分类，使用T-Coffee(EMBL-EBI)将这些假定的烟草FT、促进开花的拟南芥FT和抑制开花的拟南芥TFL1及其烟草同源物CET1、CET2和CET4的氨基酸序列进行比对(图10)。可能的烟草FT相互之间显示相对高的全序列相同性，从～70％(Nt FT3与Nt FT4)至～89％(Nt FT1与Nt FT3)，同时与At FT的相同性从～62％(Nt FT2)到～73％(Nt FT4)。与此相反，它们在与烟草CET(～52％)及拟南芥TFL1(～52％)序列相同性较低。用EMBOSS针(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)获得的所有序列相同性的详细列表如表1所示。考虑系统发生树和序列相似性，明显地，假定的烟草FT，即Nt FT1-4，属于FT-进化支而非TFL1进化支.
实施例2：通过在烟草中过表达Nt FT1-4表征其分子功能
为评估Nt FT1-4在调节开花时间中的功能，接下来我们在烟草中异位过表达相应基因，所述基因受强组成型花椰菜花叶病毒35S启动子(35S:NtFT)的控制。因此，进行了如下的克隆策略。
为了得到其携带受nos启动子控制的潮霉素抗性基因二元载体，用NheI和AFL II消化pCambia1300，然后将潮霉素抗性基因的编码区域按照酶切位点插入Nhe I和AFL II消化的pBin19(Bevan,1984)中，得到二元载体pBin19Hyg。
为克隆Nt FT1-4的过表达构建体，用表4中所示的含有限制性酶切位点的引物通过PCR从(Invitrogen)中的cDNA扩增所述基因的编码区。PCR产物经消化得到相应的限制性酶切位点，并克隆到pRT104载体中，组成型花椰菜花叶病毒启动子(35S)的下游(et al.,1987)。然后，切下35S:Nt FT1-4构建体并将其插入到经Hind III消化的二元载体pCambia1300或pBin19Hyg从而得到pCambia130035S:Nt FT1和pBin19Hyg 35S:Nt FT2-4。作为阳性对照，从拟南芥叶的cDNA扩增At FT编码区，将其克隆到(Invitrogen)中并测序。然后，用表4所示的含有限制性酶切位点的引物通过PCR从(Invitrogen)中的cDNA扩增At FT编码区。PCR产物经消化得到相应的限制性酶切位点，并克隆到pRT104载体中，组成型35S启动子下游。然后，切下35S:At FT的构建体并将其插入经Hind III消化的二元载体pCambia1300。通过测序验证所有二元载体，随后通过电穿孔将其转入根癌农杆菌LBA4404(Hoekema et al.,1983)。用于转化实验的烟草cv.SR1植物在无菌条件下，在MS培养基(Murashige and Skoog,1962)上生长(LD；23℃，100μmol m-2sec-1)，如Horsch等人(1986)所述进行农杆菌介导的转化。
在组织培养中，发现35S:Nt FT4构建体有力地加速开花，而且其过表达会导致在植物发育过程中较早时期产生花及花样结构(图11A和B)。芽发育停滞且不形成根，因而无法再生出成熟植物。其表型与本实验中作为对照的拟南芥FT(35S:At FT)过表达几乎是相同的(图11C和D)。
与此相反，构建体35S:Nt FT1，35S:Nt FT2和35S:Nt FT3的转化子在组织培养中发育出几乎正常的芽。再生各构建体的独立转基因品系(7个35S:Nt FT1，5个35S:Nt FT2及3个35S:Nt FT3)，并且通过在无菌条件下切割而产生全部转基因品系和野生型植物的相同克隆，待生根后移入土中，在长日照(LD；16小时/光和8小时/暗)或短日照(SD，8小时/光和16小时/暗)条件下在人工气候室中生长(25℃光，22℃暗，200μmol m-2sec-1)。根据野生型植物的开花时间及各植物的具体开花时间和生长行为将其表型进行分类(轻度，中度，重度)。由于人工气候室的高度限制，将在LD条件下培育的植物转移到温室中(光下22-25℃，黑暗中20-25℃；如果自然光条件低于700μmol m-2sec-1，接通人工照明)，而当植物到达人工气候室顶层时停止SD条件下的栽培。
在上述这些条件下，共培育的野生型对照植物分别在4周(LD)和5周(SD)后开始产生花，说明在SD条件下开花延迟。在同一个LD(图12A至C)/SD(图12D至F)培育实验中，Nt FT1、Nt FT2或Nt FT3转基因植物的发育有差异，两种培育条件下的开花时间及生长表现出轻度、中度及重度表型。仅对于35S:Nt FT3构建体，没有观测到中度表型。在WT开花的时候，所有轻度受影响植物展现与野生型植物相当的表型，开花时间稍微延迟(～3d)，而中度受影响植物约1至1.5周后发育出第一朵花，且在节间长度上有着轻微地减少。相比之下，重度受影响植物在相同时间段内没有产生任何的花朵，并且由节间长度显著减少造成的植物高度下降变得明显。在此生长期间，植物无论是否表现出轻度，中度或重度的表型，其叶片数目与WT植物相当。综合定量(q)RT-PCR实验用植物叶片总RNA进行，所述总RNA用RNA Plant kit(Macherey-Nagel)提取，用DNAse I(NEB)消除基因组DNA，而后进行酚-氯仿法抽提。按照生产商的说明书，将1μg总RNA用SuperScript II(Invitrogen公司)进行反转录，各实时定量PCR反应(qRT)中使用1μl的cDNA。使用iQ SYBR Green Supermix(Biorad)在CF x96cycler(Biorad)中进行45个循环后得到溶解曲线。每个Nt FT1-4的RT样品进行三次实验，而参照基因NRT(没有反转录)和NTC(无模板对照)进行两次实验。在各RT样品中检测两个可能的参照基因EF1α和L25(Schmidt and Delaney,2010)的转录水平。在这些基因中，发现EF1α是表达最稳定的，因此，该基因被用于标准化Nt FT1-4的转录水平。用REST-MCS软件(Pfaffl et al.,2002)计算相对表达水平。用于实时定量PCR的引物示于表4。
qRT-PCR表明在表型和基因表达直接相关，因为发现在受影响最重的植物中给定的Nt FT基因的转录水平最高(图12G至12I)。
接下来，我们开始着手确定是否受到重度影响植物的花发育是真正受抑制(inhibit)或仍是延迟。因此，在温室中LD条件下进一步培养所有受重度影响的35S:Nt FT1-3植物(图13)。所有35S:Nt FT1转基因品系和35S:NtFT2转基因品系之一在6-8周后开始抽苔，而后在11周后档植物长到约2米高度时开花(图5A和B、E和F中示例性显示了一个单独的品系)，而其余的35S:Nt FT2转基因品系和所有35S:Nt FT3转基因品系保持扁平和无花的表型(图13C和D、G和H)。定量RT-PCR实验表明在保持扁平的表型的植物中Nt FT转录水平普遍较高(表3)。
扁平且不开花的35S:Nt FT2转基因品系和所有35S:Nt FT3转基因品系在温室中持续增长至少9个月(试验终点)，没有转变到生殖阶段(图5I和J)。转基因品系的大小达到了5米，从而显示在生物量的大幅增加：在实验结束时，它们具有～120片叶，叶最大长度65厘米，与8周的野生型植物相比增加约1.5倍(图13K和13L)。明显地，茎的生物量也类似地增加约3.5倍(图13K)。
表4(分别具有终止密码子，for：正向引物；rev：反向引物；Tm：退火温度)
实施例3：Nt FT1-4的基因表达分析
接下来，我们分析了抑制花的Nt FT1-3和促进花的Nt FT4的时空表达谱。因此，将烟草种子播种于土壤中并分别在LD或SD条件下在人工气候室中生长。为研究空间表达模式，收集(pool)3～4周植物的叶、尖端、茎和根用于总RNA提取。为了检验Nt FT1-4的时间表达水平，收获幼苗并确定为时间点1，然后每周收获三棵植物的基生叶，直到第一朵花开放为止，在LD和SD条件下共收获5次和6次基生叶。用RNA Plant kit(Macherey-Nagel)提取总RNA，用DNase I(NEB)消除基因组DNA，而后进行酚-氯仿法抽提。将1μg总RNA通过SuperScript II(Invitrogen公司)进行反转录，取1μl的cDNA进行qRT-PCR。使用iQ SYBR Green Supermix(Biorad)在CF x96cycler(Biorad)中进行45个循环后得到溶解曲线。每个Nt FT1-4的RT样品进行三次实验，而对照基因NRT(没有反转录)和NTC(无模板对照)进行两次实验。在各RT样品中检测两个可能的参照基因EF1α和L25(Schmidt and Delaney,2010)的转录水平。在这些基因中，发现EF1α是表达最稳定的，因此，该基因被用于标准化Nt FT1-4的转录水平。用REST-MCS软件(Pfaffl et al.,2002)计算相对表达水平。用于实时定量PCR的引物示于表4。
在图15中，显示单个Nt FT表达水平与参照基因Nt EF1α相关。NtFT1、Nt FT2和Nt FT4在LD和SD两种光条件下都特异性表达于叶组织中，然而，在LD条件下所有基因的转录水平都很弱，邻近于检测极限(图15A和B)。虽然可以获得，Nt FT3的cDNA但其表达水平太低而不能通过qRT-PCR来对其时空表达进行可靠的分析。
为了更深入地了解抑制型Nt FT基因表达的位置，我们也通过示范性地表达在Nt FT3的1kb启动子片段控制下(PNt FT3)带有ER标签的绿色荧光蛋白(GFPER)对空间表达进行研究。为构建这一克隆，使用如表4所示的含有限制性酶切位点的引物扩增1kb的PNt FT3。对PCR产物进行消化，以得到相应的限制性位点并克隆到载体pBs GFPER(Noll et al.,2007)中GFPER报告基因的上游。选择ER标记的GFP，是为了防止其通过韧皮部扩散，以便精确地鉴定表达GFP的细胞。通过测序进行验证之后，使用带有Sal I限制性位点的引物扩增PNt FT3:GFPER和花椰菜花叶病毒的终止子组成的盒。以Sal I消化PCR产物，插入到Sal I消化的带有潮霉素抗性的二元载体pBin19，通过测序验证，随后通过电穿孔的转染方式导入到根癌农杆菌LBA4404(Hoekema et al.,1983)。
通过农杆菌介导的植物转化获得命名为为PNt FT3:GFPER的五个独立的转基因烟草品系。生根后将转基因植物转移到土壤中，在温室中生长。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析四到六周龄的植物，所述CLSM使用Leica TCS SP5X显微镜(Leica Microsystems,Germany)，激发/发射波长为488/500-600nm。
CLSM分析显示，GFP的表达被限定在叶片的维管束，如图15C中叶柄的横截面所示。在基生叶的叶脉中可以观测到最强的信号，不过表达和由表达产生的荧光弱，通过进行检测所需的高激光强度导致木质部的强自发荧光可以看出这一点。从叶柄的纵向截面可明显看出，在细胞水平上，可以显示PNt FT3在韧皮部伴胞(CCS)中是有活性的，CCS通常与局部筛分子(SE)相邻，其筛板以胼胝质染色染料苯胺蓝进行染色(图15D)。因此，PNt FT3的活性反映了Nt FT1、Nt FT2和Nt FT4的叶组织特异性表达，从而表明两种FT有着共同的空间表达模式。
接下来，我们通过比较各个发育阶段的更详细地对Nt FT时间表达模式进行了分析。出于这个原因，用来自幼苗和每周收获的基生叶的总RNA，通过qRT-PCR评估Nt FT1-4的表达，所述基生叶是从LD以及SD条件下培育的烟草植物收获的，所述收获直到开花(图15E至G)。虽然Nt FT4似乎一般表现得比Nt FT1和Nt FT2表达水平低，但到了开花的时间点，Nt FT4表达量的增加(4400倍)显著高于Nt FT1(164倍)和Nt FT2(936倍)的增加(图7H)。
实施例4：Nt FT2在拟南芥中也抑制开花
为了阐明Nt FT的花抑制功能是否在原则上也适用于其它物种，我们示范性地在模式植物拟南芥中过表达35S:Nt FT2，所述拟南芥是十字花科成员，是一种不具备在花转变中具有抑制功能的FT基因的植物。为在拟南芥中过表达Nt FT2，将35S:Nt FT2构建体插入到Hind III消化过的二元载体plab12.1，该载体携带有在甘露碱合成酶启动子控制下的BASTA抗性基因(Post et al.,2012)。通过测序验证所有二元载体，并随后通过电穿孔将其导入到根癌农杆菌LBA4404(Hoekema et al.,1983)。对于在拟南芥中的过表达研究，将拟南芥Col的种子播种于土壤中，并在人工气候室(23℃，光，夜晚17℃，100μmol m-2sec-1)中在LD条件下培育。通过浸花法(Clough andBent,1998)产生转基因拟南芥植物。将转化的拟南芥植物的种子播种于土壤中，萌发后喷洒BASTA以选择阳性的转基因植物。
通过分析不同的转化子的开花时间可以明显看出，结果与在烟草中过表达35S:Nt FT1-3获得的结果是类似的。在诱导型LD条件下，35S:Nt FT2表达水平高的植物表现出晚开花的表型(图16A至C)。而WT拟南芥植物在发芽后～8周正常开花(图16A)，表现重度表型的转化子～1-2周后开花(图16B中示例性显示Nt FT2L2)。虽然在烟草中没有如此明显的表型，没有烟草中那么令人印象深刻，但是过表达Nt FT2的拟南芥植物显示生物量增加，其特征在于叶尺寸、数目及茎直径的增加(图16B和C)。

Claims (26)

1.编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质(1)在相应的启动子下，能够阻碍或抑制或延迟植物开花，并且(2)包括基序“NAPDIIDS”，不包括马铃薯基因StSP5G或其部分的核酸。
2.权利要求1的核酸序列，其中所述基序是“VNAPDIIDS”。
3.权利要求1或2的核酸序列，其在系统发生上属于PEBP基因家族的FT-进化支，其中所述基序“(V)NAPDIIDS”替代促进开花的蛋白质At FT和Bv FT2的基序“(V)YAPGW”。
4.权利要求1-3中任一项的核酸序列，其包含4个外显子，其中所述基序“(V)NAPDIIDS”是第四外显子的一部分。
5.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述基序“(V)NAPDIIDS”是所述蛋白质外环的一部分。
6.前述权利要求中任一项的核酸序列，其编码蛋白质，所述蛋白质分享至少50％、优选80％、最优选100％的那些在At FT、At TFL1、Bv FT1和Bv FT2中的每一个中均为保守性的氨基酸，和/或分享至少50％、优选70％、更优选80％的At FT、At TFL1、Bv FT1和Bv FT2中任一种蛋白质中的氨基酸序列链。
7.前述权利要求中任一项的核酸，其编码的肽或蛋白质包含至少SEQ-ID No.5的第6、7、12、14、16、18、20、28、30、36、38、42、44、51-53、57、61、65、68、70-72、74、76、77、79、83、85-87、89、90、92、93、96、100、101、103、107、108、110、112、115-118、123、126、129、134-141位氨基酸，优选地第131-141、144-147、155、158-161、165、168、169、175位氨基酸，按此顺序但不必与在SEQ-ID No.5的肽或蛋白质中的位置号相同。
8.权利要求7的核酸，所述肽或蛋白质进一步包含SEQ-ID No.5的第8-11、13、15、17、21、23、25、26、29、31、32、35、37、39-41、43、45-48、50、54、55、58、59、62、64、67、69、73、75、78、80、82、84、88、94、95、102、104、113、114、119-122、124、127、131-133、148-152、156、163、164、167、171-174、176-167位氨基酸，按此顺序但不必与在SEQ-ID No.5的肽或蛋白质中的位置号相同。
9.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸编码的蛋白质由SEQ-ID No.5、6和7中任一序列组成或者包含SEQ-ID No.5、6和7中任一序列，或者由SEQ-ID No.1、2、3中任一序列组成或包含SEQ-ID No.1、2、3中任一序列。
10.前述权利要求中任一项的核酸，其进一步包含可行使启动子功能的组件。
11.权利要求10的核酸，其中所述启动子选自细胞特异性启动子、时间诱导型启动子、最初存在于烟草植物中的启动子、优选地天然控制基因Nt FT1至Nt FT4的启动子、烟草来源的组织特异性和/或细胞特异性启动子、随时间变化的组成型活化的启动子、来自于另一种植物的启动子、优选地拟南芥FT的细胞特异性时间诱导启动子或蔗糖转运子AtSUC的细胞特异性时间诱导启动子、组织特异性和/或细胞特异性和/或随时间变化组成型活化的启动子、商业可获得的启动子、可从其他来源获得的启动子、合成的启动子，或具有上述功能的组合的启动子。
12.权利要求10和11的核酸，其中所述能够行使启动子功能的核酸序列会上调所述核酸的表达。
13.权利要求10-12中任一项的核酸，其中所述核酸与一个或多个独立的调节组件组合使用，优选地，与增强组件组合。
14.由前述权利要求中任一项的核酸所编码的肽或蛋白质。
15.包含权利要求1-13中任一项的核酸序列的载体。
16.权利要求15的载体，其中所述载体选自二元载体，优选地，所述载体携带抗生素、代谢或者除草剂抗性基因。
17.权利要求16的载体，其中所述抗生素、代谢或者除草剂抗性基因受到时空组成型活化的启动子或者时间诱导型启动子的控制。
18.权利要求16或17的载体，其中所述抗生素抗性基因选自卡那霉素和潮霉素基因，或其中所述除草剂抗性基因是BASTA抗性基因和/或其中所述抗生素、代谢或除草剂抗性基因受nos或35SCaMV启动子或乙醇诱导的35SCaMV启动子控制。
19.植物、植物的部分或者植物的种子，其包含权利要求1-13中任一项的核酸，权利要求14的肽或蛋白质，和/或权利要求15-18中任一项的载体。
20.权利要求19的植物、植物的部分或者植物的种子，其中所述植物是茄科成员，优选地是作物，更优选地选自烟草、马铃薯和番茄。
21.权利要求19的植物、植物的部分或者植物的种子，其中所述植物是十字花科成员。
22.编码蛋白质的核酸序列用于产生转基因植物的用途，其中所述蛋白质(1)在相应的启动子下，能够阻碍或抑制或延迟植物开花，并且(2)包括基序“APDIIDS”，在所述转基因植物中，开花的进程被阻碍、抑制或延迟。
23.权利要求22的用途，其中所述核酸序列在系统进化上属于PEBP基因家族的FT-进化支，其中基序“APDIIDS”替代促进开花的蛋白质At FT和Bv FT2的基序“YAPGW”。
24.权利要求23的用途，其中所述转基因植物是茄科成员。
25.权利要求22-24中任一项的用途，其中所述核酸是StSP5G或其部分、SISP5G或其部分、或者是Nt FT1、Nt FT2、Nt FT3或其部分。
26.权利要求22-25中任一项的用途，其中所述核酸受组成型启动子控制。
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