CN115851765A - 粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粉蕉成熟相关基因MaMYC2‑10及其应用，所述基因MaMYC2‑10CDS的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示；基因MaMYC2‑10编码的蛋白MaMYC2‑10，其氨基酸序列为如SEQ IDNO:2所示。本发明通过实时定量PCR技术筛选出来的对粉蕉果实采后成熟起着重要调控作用的一个功能基因MaMYC2‑10；本发明构建了植物表达载体pCAMBIA1304_MaMYC2‑10，转入农杆菌GV3101，通过农杆菌侵染技术将粉蕉的MaMYC2‑10整合到番茄基因组中，在获得的独立转基因株系中，通过实验证明MaMYC2‑10通过调控乙烯生物合成关键酶基因的表达，参与乙烯生物合成，实现调控果实成熟，促进番茄果实的采后成熟，为香蕉早熟品种培育提供有益基因资源。

Description

粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10及其应用。

背景技术

香蕉是重要的热带水果，在世界经济贸易中占有重要的地位。其中粉蕉(Musa ABBPisang Awak，FJ)属于芭蕉属香蕉杂交品种，与巴西蕉(Musa acuminate L.AAA groupcv.Cavendish，BX)相比风味和口感明显不同，营养丰富，酸甜可口，其成熟过程比巴西蕉快，在国际国内市场上受到普遍欢迎，应用前景广阔。

因此深入研究粉蕉果实采后成熟的分子调控机制，挖掘调控粉蕉果实快速成熟的关键基因，通过生物技术对香蕉进行遗传改良，能进一步提高粉蕉产业商品价值，拓展粉蕉产业的可持续性发展，是发展热带特色高效农业的国家战略需求之一。

目前，香蕉基因组中还没有找到与果实采后成熟相关基因，因此，迫切希望找到一个调控香蕉果实成熟的有意义基因，从而促进香蕉的采后成熟，实现香蕉的遗传改良。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10及其应用。本发明为香蕉成熟相关基因的挖掘做贡献，也为果实早熟基因的开发与应用的生产问题提供基因资源。

为实现上述目的，本发明所设计一种粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10，所述基因MaMYC2-10 CDS的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明还提供了一种上述基因MaMYC2-10编码的蛋白MaMYC2-10，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种用于获得上述成熟相关基因MaMYC2-10的引物对，所述引物对为：

正向引物F：5′-ATGAACCTGTGGGCCGACGACAACG-3′，如SEQ ID NO:3所示；

反向引物R：5′-CCAACTAGATAAGGCCTCA-3′，如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种利用上述引物对获得成熟相关基因MaMYC2-10的方法，包括以下步骤：

以粉蕉果实的cDNA为模板和上述成熟相关基因MaMYC2-10的引物对，进行PCR扩增，纯化得到成熟相关基因MaMYC2-10。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述成熟相关基因MaMYC2-10的植物表达载体，其中，所述植物表达载体为pCAMBIA-1304。

上述表达载体可以采用基因重组领域中的常用载体，例如病毒、质粒等；本发明对此不设限定。

本发明还提供了一种上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

将目的片段导入克隆载体

18T中，然后进行将含目的基因的克隆载体MaMYC2-10-/>

18T和pCAMBIA-1304用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切进行酶切，再将得到的目的片段连接到酶切过的pCAMBIA-1304载体上即得到重组表达载体pCAMBIA-1304-MaMYC2-10。

本发明还提供了一种含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。

下述各项之一在调控果实成熟乙烯生物合成中的应用，其中，它包括：

(1)上述的成熟相关基因MaMYC2-10；

(2)上述的重组表达载体；

(3)上述的宿主细胞。

作为优选方案，所述植物为番茄或粉蕉。

下述各项之一在培育果实易成熟新品种中的应用，其中，它包括：

(1)上述的成熟相关基因MaMYC2-10；

(2)上述的重组表达载体；

(3)上述的宿主细胞。

上述新品种为番茄或香蕉；

以番茄为例；将含有粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10的pCAMBIA-1304载体质粒(pCAMBIA-1304-MaMYC2-10)的农杆菌菌液活化，侵染番茄叶片，进行共培养后的外植体置于芽诱导培养基中进行继代培养，之后进行生根培养，获得转MaMYC2-10基因番茄植株。

本发明的原理：

本发明通过实时定量PCR技术筛选出来的对粉蕉果实采后成熟起着重要调控作用的一个功能基因MaMYC2-10，属于碱性螺旋-环-螺旋bHLH类转录因子基因超家族成员。MYC在结构上包含bHLH保守结构域，可与其它转录因子形成同源或异源二聚体，另外一个结构域为碱性区域，是转录激活域，是MYC调控的含有G-box元件的启动子结合区。

MYC类转录因子是茉莉酸信号反应中的关键核心转录因子。茉莉酸是一种重要的植物激素，在调控乙烯生物合成和促进果实成熟过程已得到广泛研究。研究表明MYC类转录因子通过与其N端的MIR作用区与MYB类转录因子结合，参与调控植物的花青素合成，酵母单杂和双荧光素酶实验表明MYC类转录因子通过与二氢黄酮醇还原酶启动子的结合可激活二氢黄酮醇还原酶基因的转录。最近在拟南芥的研究证明KIX-PPD-MYC复合物能够参与调控种子的发育。苹果中已有研究证明MdMYC2能够与MdACS1和MdACO1的启动子结合，直接参与对苹果成熟过程中的乙烯生物合成的调控。此外MdMYC2能够与MdERF2结合，通过MdERF2与MdERF3的相互作用解除MdERF3对MdACS1的转录抑制，间接地参与了乙烯的生物合成的调控。

MaMYC2-10蛋白保守结构域分析表明，它含有典型的bHLH-MYC_N结构域、bHLH-AtAIB和PHA03247结构域，我们推测MaMYC2-10可能参与了对粉蕉果实成熟乙烯的生物合成调控作用。

本发明验证了基因MaMYC2-10在转MaMYC2-10基因番茄植株果实发育不同时期的表达量逐渐升高。进一步的验证了乙烯合成关键基因SIACS2、SIACS4、SIACO1和SIACO3在转MaMYC2-10基因的不同株系中果实发育成熟不同时期的表达量与野生型对照相比较明显增加，甚至显著增高，同时发现乙烯在转MaMYC2-10基因的番茄果实采后成熟不同时期的释放量显著高于非转基因(野生型)番茄果实的。表明MaMYC2-10通过调控番茄果实发育过程中乙烯生物合成相关基因的表达来调控番茄果实中乙烯的生物合成。

本发明的有益效果：

本发明通过实时定量PCR技术筛选出来的对粉蕉果实采后成熟起着重要调控作用的一个功能基因MaMYC2-10；本发明构建了植物表达载体pCAMBIA1304_MaMYC2-10，转入农杆菌GV3101，通过农杆菌侵染技术将粉蕉的MYC2蛋白基因MaMYC2-10整合到番茄基因组中，在获得的独立转基因株系中，通过实验证明MaMYC2-10通过调控乙烯生物合成关键酶基因的表达，参与乙烯生物合成，实现调控果实成熟，促进番茄果实的采后成熟，为香蕉早熟品种培育提供有益基因资源。

附图说明

图1为基因MaMYC2-10扩增电泳结果图；

图中，M为DL2000 DNA Marker，泳道1为基因MaMYC2-10PCR产物；

图2为pCAMBIA-1304-MaMYC2-10载体鉴定图谱；

图中，M为DL2000 DNA Marker，泳道1-8为pCAMBIA-1304-MaMYC2-10载体菌液中为基因MaMYC2-10 PCR鉴定图谱；

图3为基因MaMYC2-10在粉蕉果实采后0、2、3、5和6天中的表达量；

图4为本发明中叶盘法转化观赏番茄品种“Micro-Tom”的遗传转化过程图，

图中，从左至右A、B和C依次分别是愈伤组织的诱导、有效愈伤的筛选和愈伤的分化；

图5为过表达MaMYC2-10基因的番茄植株的不同株系PCR检测结果图；

图中，1-11分别为OE1-7的叶片DNA的PCR扩增结果，K+为阳性对照，K-、K1、K2为分别阴性对照、DNA提取空白对照和ddH₂O的对照。

图6为外源基因MaMYC2-10在MaMYC2-10过表达植株不同株系的相对表达量图，

图中，OE1、OE4和OE5分别是所筛选的三个独立的转基因株系。

图7为外源基因MaMYC2-10在过表达MaMYC2-10基因株系OE1、OE4和OE5中，发育成熟度分别为绿熟期(MR)、转色期(BR)和红熟期果实(RR)中的相对表达量图；

图8为内源基因SIACS2在过表达MaMYC2-10基因OE1、OE4、OE5和WT株系中，发育成熟度分别为绿熟期(MR)、转色期(BR)和红熟期果实(RR)中的相对表达量图；

图9为内源基因SIACS4在过表达MaMYC2-10基因OE1、OE4、OE5和WT株系中，发育成熟度分别为绿熟期(MR)、转色期(BR)和红熟期果实(RR)中的相对表达量图；

图10为内源基因SIACO1在过表达MaMYC2-10基因OE1、OE4、OE5和WT株系中，发育成熟度分别为绿熟期(MR)、转色期(BR)和红熟期果实(RR)中的相对表达量图；

图11为内源基因SIACO3在过表达MaMYC2-10基因OE1、OE4、OE5和WT株系中，发育成熟度分别为绿熟期(MR)、转色期(BR)和红熟期果实(RR)中的相对表达量图；

图12为在过表达MaMYC2-10基因OE1、OE4、OE5和WT株系的绿熟期果实在采后不同时期的乙烯释放量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10

以粉蕉果实cDNA为模板，以下述有引物对：

5′-ATGAACCTGTGGGCCGACGACAACG-3′，

5′-CCAACTAGATAAGGCCTCA-3′，

通过PCR方法扩增获得核苷酸序列为2082的片段(图1)，经测序分析：得到粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10 CDS的核苷酸序列和蛋白MaMYC2-10氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示：

ATGAACCTGTGGGCCGACGACAACGCCTCCATGATGGAGGCCTTCATGGCCGCCACCGACCTCGTCCATGGCATCCCCTGGGCGACTCCTCCTCCCACCCCTCCTCGGCCCTCCGGTATGGCCTCGGCCTTGGATCCTGGGAGGGCTATCGTCGGCCCTCCCACTCCCTCTCCTCCTCCGTCGGCGTTCTTCAACCAGGAGACGCTCCAGCAGCGGCTGCAGGCCCTGATCGAGGGGGCCCGGGAAAGCTGGACCTACGGCATCTTCTGGCAGGCGTCGGTGGATGCCGCCACCGGGACGTCCTTCCTCGGCTGGGGCGACGGCTACTACAAGGGCTGCGGGGAGGACAAGCGGAAGCAACGGGCCGCGAGCACCGCCTCTGCTGCCGATCAGGATCACCGGAAGCGCGTCCTGCGGGAGCTCAACTCGCTCATCTCCGGCGGCGTGTCCTTGGCGCCGGACGAGATCGTCGAGGAGGAGGTCACCGACACGGAGTGGTTCTTTCTCGTCTCCATGACCCAGTCCTTCGTCAACGGGGCCGGCCTCCCCGGCCAGGCCCTCTACGCCGGCGCGCCCTACTGGATCGCAGGCGCCGGCCGTCTAGCCGCGGCGTCGTGCGAGCGCGCGCGGCAGGCCCAGTTGTTCGGCATCCAGACCATGGTCTGCGCTCCCGTCGGCTCCGGCGTGCTCGAGCTCGGATCCACCGACACGATCCTCTACAGCCTCGACCTCATGGGCAAGATTCGCGTCCTCTTCAACTTCAGCTCCCGGGACGCGCCCGATCCTGCGGCGGCCCAATCATGGCTCGCGCAGCAATCTGCTGCAGCGACTCCCGCCGCCGGCCACGGAGAGTCGGATCCACCGGTTCTCTGGCTCACTGACCCCTCCACGGTCGAGATCAAGGACTCCGTCTCCCGTGTCTCGACCTCCGTCGGCATCTCCGTCACGAAACCCCCGATCCAATCCGACAGCAATCCTAGCTCCAGTATCCTCACCGAGAACCCAACCTCTGCTATGCAGATCCCAAAAGTCCACGACGACCACCAGCGACAGATCCACCAACTGCAGCATCAGAGCAGCTGCAGTAAACCGCAGGCCCAATCTTTCATGTCCAAAGAGTTCGATTTCTCCGGATTCGCCTCGAACGGCTCGGTCGCTCCCGCCCGCTCGTTCAAGCCGGAGTCTAGGGATATCCCGAGTTTCGCCGGTGGCAAGAGGGATTCCTCGCCGGCTCCTGTCGCCAGCAGCCTCTTCTCCCGCCAACAAGCTACCGCTGTGGCGGAAGACAAGAAGACCAACAGATCCACGGGGGCGACATCCAGGGCGAGCAACGACGGCGAGGGGATGCTCTCCTTCTCGTCGGCTCCTGCCCCCTCCAGTGGCCAATTGAGGTCTTCTGGCGGCGGCGTCCCCGATGGACCCGATTCGGATCAGTCCGAACTCGAGCCATCGGTACGGGAGGTGGAGAGCAGCCGGGCGGTGGAACCCGAGAAGCGGCCGCGGAAGCGTGGCCGGAAGCCCGCCAACGGCCGTGAGGAGCCGCTGAACCACGTCGAAGCCGAGCGGCAGCGCCGCGAGAAGCTCAACCAGAGGTTCTATGCCCTCCGTGCGGTGGTTCCCAATGTGTCCAGGATGGACAAAGCCTCCCTCCTGGGCGACGCCGTCTCCTACATCAACGAACTCCGGTCAAAGCTGCAAGCTTTGGAGGCGAACAAGGAGGATCTGCAAGCACAGATTCAATGCCTCAAAAAGGAGCGTGAATCCGCCCCAACGCAGCGGCCTGAGAGCAACCTTAAGATGATGAACGGCGGCGGTCGATGTTACGGGGTTGAAATCGAGGTGAAGCTACTGGGATCGGAGGCCATGATCAGGTTGCAGAGCCAAAAGAGGAATCACCCAGCTGCTGTGCTGATGGCTGCCCTGCAAGACCTTGATCTGGAAGTGCATTACGCAAGCGTGTCGGTGGTGAAGGACCTCATGATCCAGCAGGCGACGGTGAAGATGTCGAGCCGGGTGTTCACGCAGGAGCAGCTCAGCTCTGTTCTCTACGCTAGATTGGCGGCTGAGGCCTTATCTAGTTGG；

MNLWADDNASMMEAFMAATDLVHGIPWATPPPTPPRPSGMASALDPGRAIVGPPTPSPPPSAFFNQETLQQRLQALIEGARESWTYGIFWQASVDAATGTSFLGWGDGYYKGCEEDKRKQRAASTASAADQDHRKRVLRELNSLISGGVSLAPDEIVEEEVTDTEWFFLVSMTQSFVNGAGLPGQALYAGAPYWIAGAGRLAAASCERARQAQLFGIQTMVCAPVGSGVLELGSTDTILYSLDLMGKIRVLFNFSSRDAPDPAAAQSWLAQQSAAATPAAGHGESDPPVLWLTDPSTVEIKDSVSRVSTSVGISVTKPPIQSDSNPSSSILTENPTSAMQIPKVHDDHQRQIHQLQHQSSCSKPQAQSFMSKEFDFSGFASNGSVAPARSFKPESRDIPSFAGGKRDSSPAPVASSLFSRQQATAVAEDKKTNRSTGATSRASNDGEGMLSFSSAPAPSSGQLRSSGGGVPDGPDSDQSELEPSVREVESSRAVEPEKRPRKRGRKPANGREEPLNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNVSRMDKASLLGDAVSYINELWSKLQALEANKEDLQAQIQCLKKERESAPTQRPESNLKMMNGGGRCYGVEIEVKLLGSEAMIRLQSQKRNHPAAVLMAALQDLDLEVHYASVSVVKDLMIQQATVKMSSRVFTQEQLSSVLYARLAAEALSSR。

实施例2粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10在粉蕉果实采后不同时期的相对表达量分析

八成熟粉蕉果实(Musa ABB group,cv Pisang Awak,FJ)从实验基地成串采回，回到实验室落梳，同时用自来水冲洗干净，晾干，晚上用0.1％的次氯酸纳溶液浸泡进行表面消毒10分钟，放在通风良好的25℃培养房(200μmol·m-2·s-1光照条件、16h光照/8h黑暗、70％相对湿度和25℃)晾干，无处理，取0、2、3、4、5和6天果实于液氮中速冻，储存于-80℃冰箱中备用。

按照RNAprep Pure Plant Kit(DP441，天根，中国)试剂盒的说明书提取粉蕉采后不同时期的总RNA。将提取后的总RNA通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰完整度，并使用Agilent2100Bioanalyzer(Agilent RNA 6000Nano Kit)检测总RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片断大小，样本的纯度使用紫外分光光度计NanoDropTM进行检测。cDNA合成参照Promega的M-MLV Transcriptase反转录试剂盒说明书进行。以正常果实采后0、2、3、5和6天的cDNA第一链为模板进行qRT-PCR分析。引物序列：

MaMYC2-10-F为5′-ACGCCGTCTCCTACATCAAC-3′，

MaMYC2-10-R为5′-CGATTTCAACCCCGTAACAT-3′。

qRT-PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq(2×)(Takara)12.5μL、Rox referenceDyeⅡ(50×)(TAKARA)0.5μL、10μmol/L的引物0.75μL，cDNA模板1μL，然后用水补足至20μL。每个样品重复3次。

反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共40个循环，循环数结束后在94～56℃进行融解曲线分析。

采用2-ΔΔΔCT相对定量方法分析基因表达量的差异。MaMYC2-10在粉蕉采后成熟的1-3天表达量逐渐升高，3天达到最高，4-5天表达量下降。与粉蕉果实采后乙烯的释放量密切相关，初步表明MaMYC2-10可能参与了对粉蕉果实的成熟乙烯生物合成的调控过程，结果如图3。

实施例3重组表达载体pCAMBIA-1304-MaMYC2-10构建

将上述克隆所获得的2082bp MaMYC2-10的核苷酸利用同源重组的方法连接到pCAMBIA-1304载体上，所用的克隆引物为：

5′-ATGAACCTGTGGGCCGACGACAACG-3′，

5′-CCAACTAGATAAGGCCTCA-3′，

PCR验证正确的克隆经测序进一步验证确认(图2)，获得重组表达载体pCAMBIA-1304-MaMYC2-10。

实施例4重组表达载体pCAMBIA-1304-MaMYC2-10转化番茄

1、pCAMBIA-1304-MaMYC2-10表达载体转化农杆菌

取100μl的GV3101农杆菌感受态细胞，置于冰上融化，加入100ng的pCAMBIA-1304-MaMYC2-10的重组质粒，冰上放置30min，液氮冷冻5min，37℃水浴5min，加入700μl YEB液体培养基，28℃，180rpm预培养2-3小时，吸取100μl涂布于含有50mg/L利福平和卡那霉素的YEB固体培养基平板上，28℃培养2-3天，挑选单菌落，经PCR验证正确的菌株进行下一步的实验。并保存于-80℃超低温冰箱中备用。其中培养农杆菌常用的YEB培养基配方为胰蛋白胨10克/L,酵母提取物1克/L,MgSO₄·7H₂O 0.4g/L,pH 7.0。分装后121℃高压灭菌20分钟。

2、农杆菌介导的番茄遗传转化

(1)取一定量的“Micro-Tom”的番茄种子，用75％的乙醇浸泡消毒30秒，迅速倒掉。再用2％的次氯酸钠浸泡消毒10分钟，消毒后用无菌水洗涤8-9次，每次充分洗涤，彻底去掉残留的消毒剂。种子洗涤干净后，将种子播在1/2MS培养基上。黑暗培养2-3天，种子发芽后移至25℃，光周期16h/8h(光照/黑暗)的条件下培养。待刚长出子叶，未长真叶前用于转化。

(2)取上述(1)中未长出真叶的无菌子叶，剪去叶尖及叶柄部，将剩余子叶剪成10mm²的方块，置于无抗生素的MS固体培养基上，28℃预培养2天。

(3)将保存于-80℃超低温冰箱中的pCANBIA1304-MaMYC2-10-GV3101菌株在YEB培养基中进行活化和扩大培养。活化后的菌液用5000rpm离心6分钟，沉淀用无菌水稀释至OD600为0.6左右，加入0.1％的乙酰丁香酮，制备成侵染番茄外植体的农杆菌侵染液。用制备的农杆菌侵染液侵染用上述(2)中番茄子叶外植体，侵染10分钟。将侵染后的外植体置于无抗生素的MS固体培养基上，28℃暗培养2天。共培养培养基为MS+2mg/LZT+0.2mg/L IAA+10mg/L潮霉素。

(4)将共培养2天后的外植体取出，置于芽诱导培养基，在光下培养7天后转入新的培养基中进行继代培养。每隔两周换一次培养基，直至外植体发育完全。芽诱导培养基的成分为MS+2mg/LZT+0.2mg/L IAA。

(5)经过芽诱导期后，待外植体发芽芽长约为2-3cm时转入芽伸长培养基中，培养3-4周。芽伸长培养基成分是MS+0.5mg/LZT+0.2mg/L IAA+10mg/L潮霉素。

(6)芽长约为4-5cm时，剪掉愈伤组织后将芽转入到生根培养基中，培养3-4周。其中生根培养基成分为1/2MS+2mg/LIBA+10mg/L潮霉素。

(7)将生根旺盛，生长到一定高度的小苗转入水中培养，培养一周左右，待长出新根后，再放入土盆中继续培养。转化过程如图4所示。

2、MaMYC2-10转基因番茄的筛选和纯化

(1)提取土培阶段正常生长的番茄叶片DNA，用基因特异性引物进行PCR鉴定，PCR鉴定结果如图5所示。

检测得到的阳性植株进行正常培养，并标记为T1代。检测MaMYC2-10所用的PCR引物为：

MaMYC2-10-F为5′-ACGCCGTCTCCTACATCAAC-3′，

MaMYC2-10-R为5′-CGATTTCAACCCCGTAACAT-3′。

(2)为得到纯合的转基因株系，单株收获T1代种子并播种，得到T2代转基因幼苗。

(3)提取T2代转基因番茄叶片DNA，取出产生基因分离植株，收获T2代种子，种植收获的种子，得到T3代转基因番茄幼苗。

(4)PCR检测T3代转基因番茄群体的分离情况。在T3代不出现基因分离的株系即为纯合的转基因株系。检测引物序列：

MaMYC2-10-F为5′-ACGCCGTCTCCTACATCAAC-3′，

MaMYC2-10-R为5′-CGATTTCAACCCCGTAACAT-3′。

(5)采用qRT-PCR技术检测转基因株系中MaMYC2-10基因的相对表达量，检测结果表明外源基因MaMYC2-10在MaMYC2-10OE1-7中的叶片中均有表达，其中在MaMYC2-10OE1、OE4和MaMYC2-10OE5三个株系中的表达量较高如图6所示。

qRT-PCR的引物序列为：

MaMYC2-10-FP为5′-ACGCCGTCTCCTACATCAAC-3′，

MaMYC2-10-RP为5′-CGATTTCAACCCCGTAACAT-3′。

(6)收集纯合的转基因番茄株系的种子，用于后续试验。

3、野生型和MaMYC2-10过表达番茄植株同时播种于4:1的营养土和蛭石中，放置于25℃，光周期16h/8h(光照/黑暗)的培养室中，每周浇一次霍格兰营养液。

4、外源基因MaMYC2-10在转基因不同株系中的的表达量分析

选取生长发育一致的野生型和MaMYC2-10过表达番茄植株的绿熟期、转色期和红熟期的果各3-4个。测定外源基因MaMYC2-10在过表达番茄植株的发育不同时期的表达量，结果表明外源基因MaMYC2-10在MaMYC2-10 OE4和OE5株系中发育期为绿熟期、转色期和红熟期果中表达量逐渐升高，其中在MaMYC2-10OE1株系中的表达量变化量不大，结果如图7所示。

MaMYC2-10的检测引物为：

MaMYC2-10-FP为5′-ACGCCGTCTCCTACATCAAC-3′，

MaMYC2-10-RP为5′-CGATTTCAACCCCGTAACAT-3′。

5、乙烯合成关键酶基因在MaMYC2-10过表达番茄株系番茄果实发育不同时期的表达分析

在乙烯生物合成途径中，ACC合成酶与ACC氧化酶为限速酶和关键酶。限速酶和关键酶基因的表达决定着乙烯的生成量。选取生长发育一致的野生型和MaMYC2-10过表达番茄植株的绿熟期果、转色期和红熟期的果各3-4个。测定乙烯合成途径相关基因在野生型和MaMYC2-10过表达番茄发育成熟不同时期的表达量。

检测结果如图8、图9、图10和图11所示，SIACS2、SIACS4、SIACO1和SIACO3在转基因番茄株系果实发育不同时期的表达量明显或者显著高于野生型果实中的表达量，尤其是三个株系中SIACS2和SIACS4在转色期中果实的表达量显著高于野生型的，SIACO1和SIACO3在不同时期的表达量变化不如SIACS2和SIACS4的变化明显，但是OE1和OE4果实中SIACO1在绿熟期和转色期的表达量显著高于野生型果实的。三个株系中SIACO3在绿熟期和转色期果实中的表达量明显高于野生型果实。表明MaMYC2-10基因影响了番茄果实发育过程中乙烯合成酶基因的表达，进而影响了番茄的乙烯生物合成。

检测SIACO1、SIACO3、SIACS2和SIACS4基因表达量所用的qRT-PCR的引物序列为：

SlACS2-F：5-TGTTAGCGTATGTATTGACAACTGG-3；

SlACS2-R：5-TCATAACATAACTTCACTTTTGCATTC-3；

SlACS4-F：5-CTCCTCAAATGGGGAGTACG-3；

SlACS4-R：5-TTTTGTTTGCTCGCACTACG-3；

SlACO3-F：5-CTCCCATGCGCCACTCTATT-3；

SlACO3-R：5-AGATCACCGCGTCATTTCCT-3；

SlACO1-F：5-GCCAAAGAGCCAAGATTTGA-3；

SlACO1-R：5-TTTTTAATTGAATTGGGATCTAAGC-3；

6、MaMYC2-10过表达番茄植株不同株系和野生型对照中，果实采后不同时期的乙烯释放量分析

采用气相色谱直接进样的方法对过表达MaMYC2-10的转基因和野生型番茄果实采后不同时期的乙烯含量进行测定：同一株系的番茄果实为一组，选取绿熟期的果实同时摘下，进行称重和测量体积。每组份选取标准为：果数25-30个；总果量90-100g；总果实体积100-110ml。番茄果实采后于25℃；16h光照/8h黑暗；相对湿度70％的人工培养室通风放置。在采后0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d和14d等不同时期测定乙烯释放量。乙烯测定前，不同组的果实分别放在350毫升的闷罐瓶中，盖子出口用橡胶软管封闭，密闭三个小时，采用气相色谱仪(Agilent，美国)测定乙烯释放量，采集气样前，轻摇密闭罐，将取样气密针(安捷伦1mL气密针)推到底部，将针杆反复推拉4次，将针头插入橡胶软管，深入罐中采样。色谱条件为安捷伦7890B型气相色谱仪。色谱柱型号为：HP-5(毛细管柱)30.0m×0.32mm×0.25μm。测定条件为进样口230.0℃、柱温60℃，持续5min；氢离子火焰检测器(FID)温度250℃；载气N₂，流速1.6mL/min；燃气H₂，流速30mL/min；空气流速400mL/min；流量：1.6mL/min；分流比2：1；尾吹气N₂流速10mL/min；出峰时间：3.38min。

采用外标法，以标准样品的出峰时间定性，峰面积大小定量制备标准曲线，利用气相色谱法测定不同浓度的乙烯标准样，利用峰面积与进样量的比值绘制乙烯标准曲线图。通过乙烯标准曲线及样品峰面积大小，求出采后不同时期果实的乙烯释放量。MaMYC2-10过表达和野生型对照的番茄果实在采后不同时期的释放量图12所示。

结果表明：在MaMYC2-10OE1、OE4、OE5和野生型对照组中，OE1、OE4、OE5果实采后不同时期的乙烯释放量高于野生型对照组的，尤其是MaMYC2-10OE4株系的果实采后各个时期的乙烯释放量高于或者极显著高于对照组野生型的；OE1和OE5果实采后1-8天内的乙烯释放量高于野生型对照组，8-14天后乙烯释放量与对照相比变化不明显；表明MaMYC2-10能通过影响果实中乙烯的生物合成进而促进了番茄果实采后的早熟过程。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种粉蕉成熟相关基因MaMYC2-10，其特征在于：所述基因MaMYC2-10 CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述基因MaMYC2-10编码的蛋白MaMYC2-10，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.一种用于获得权利要求1所述成熟相关基因MaMYC2-10的引物对，其特征在于：所述引物对为：

正向引物F：5′-ATGAACCTGTGGGCCGACGACAACG-3′，

反向引物R：5′-CCAACTAGATAAGGCCTCA-3′。

4.一种利用权利要求3所述引物对获得成熟相关基因MaMYC2-10的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以粉蕉果实的cDNA为模板和上述成熟相关基因MaMYC2-10的引物对，进行PCR扩增，纯化得到成熟相关基因MaMYC2-10。

5.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体含有权利要求1所述成熟相关基因MaMYC2-10的植物表达载体，其中，所述植物表达载体为pCAMBIA-1304。

6.一种权利要求5所述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

将目的片段导入克隆载体

18T中，然后进行将含目的基因的克隆载体MaMYC2-10-/>

18T和pCAMBIA-1304用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切进行酶切，再将得到的目的片段连接到酶切过的pCAMBIA-1304载体上即得到重组表达载体pCAMBIA-1304-MaMYC2-10。

7.一种含有权利要求6所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为农杆菌GV3101。

8.下述各项之一在调控果实成熟乙烯生物合成中的应用，其特征在于：它包括：

(1)权利要求1所述的成熟相关基因MaMYC2-10；

(2)权利要求5所述的重组表达载体；

(3)权利要求7所述的宿主细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为番茄或香蕉。

10.下述各项之一在培育果实易成熟新品种中的应用，其特征在于：它包括：

(1)权利要求1所述的成熟相关基因MaMYC2-10；

(2)权利要求5所述的重组表达载体；

(3)权利要求7所述的宿主细胞。

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