ES2344877B1 - Planta con resistencia a estres por bajas temperaturas y metodo de produccion de la misma. - Google Patents
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Abstract
Planta con resistencia a estrés por bajas
temperaturas y método de producción de la misma.
La presente invención está relacionada con un
método de producción de plantas con resistencia mejorada a estrés
por bajas temperaturas, comprendiendo la etapa de transformación de
células de una planta con una secuencia del gen exógeno ADC1 de la
arginina descarboxilasa bajo el control de un promotor capaz de
funcionar en la planta. Las plantas así obtenidas muestran
resistencia a estrés por bajas temperaturas sin ser afectado el
fenotipo cuando se compara con el fenotipo de las plantas de tipo
silvestre.
Description
Planta con resistencia a estrés por bajas
temperaturas y método de producción de la misma.
La presente invención está relacionada con
plantas que tienen resistencia mejorada a bajas temperaturas.
Además, la presente invención describe un método para la producción
de dichas plantas.
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Las plantas se adaptan a diferentes tipos de
estrés ambiental tales como la temperatura de su hábitat. Sin
embargo, en condiciones de estrés por temperatura, por ejemplo, las
plantas son susceptibles al calor o a temperaturas frías cuando
están expuestas a ambientes por encima o por debajo de su
temperatura óptima de crecimiento máxima o mínima, lo que lleva a su
debilidad debida a la pérdida gradual o súbita de las funciones
fisiológicas de las células.
Se han realizado esfuerzos para ampliar la
adaptación de las plantas a la temperatura mediante procedimientos
de mejora tales como la selección o cruzamiento con el objeto de
utilizar plantas silvestres adaptadas a diferentes temperaturas
ambientales como cultivos comestibles, plantas de horticultura, y
similares. El período en el que pueden cultivarse verduras, flores y
plantas ornamentales, árboles frutales y similares se ha expandido
mediante estos procedimientos de mejora, así como mediante
horticultura protegida.
Las poliaminas, término general aplicado a
hidrocarburos alifáticos con 2 o más grupos amino primarios, son
sustancias naturales ubicuas en los organismos, con más de 20 tipos
descubiertos hasta el momento. Las poliaminas típicas incluyen la
putrescina, la espermidina y la espermina. Las enzimas conocidas
relacionadas con el metabolismo de poliaminas implicadas en la
biosíntesis de las poliaminas mencionadas incluyen la arginina
descarboxilasa (ADC), la ornitina descarboxilasa (ODC), la
S-adenosil-metionina descarboxilasa
(SAMDC), la espermidina sintasa (SPDS), y la espermina sintasa
(SPMS). Recientemente se ha publicado que algunas de las enzimas
relacionadas con el metabolismo de poliaminas están implicadas en
diferentes tipos de estrés ambiental.
La solicitud de patente europea EP 1.329.153
enseña que en tejidos vegetales que exhiben resistencia a estrés por
frío, se incrementa el contenido de espermidina y espermina. En esta
solicitud de patente se ejemplifica que introduciendo el gen de la
espermidina sintasa en una planta, se incrementan los niveles de
espermidina y espermina. Cuando la planta transgénica se sometió a
bajas temperaturas, se confirmó que tenía mayor resistencia a estrés
por frío.
La solicitud de patente de número US
2006/0225154 enseña que los niveles de espermidina, espermina y
putrescina están incrementados cuando una planta se transforma con
un gen espermidina sintasa. Esta solicitud de patente indica que la
defensa a estrés por bajas temperaturas puede ser implementada en la
planta introduciendo el gen de la espermidina sintasa.
Respecto a la utilización del gen ADC
para conferir resistencia a estrés por frío en plantas, es
destacable el hecho de que en la familia de las Brassicaceae,
el gen ADC parece estar duplicado, dando lugar así a dos
parálogos, denominados generalmente ADC1 y ADC2 (cfr.
Galoway et al., "Phylogenetic utility of the nuclear gene
Arginine Decarboxylase: an example from Brassicaceae", Molecular
Biology and Evolution, 1998, v. 15, p.1312-1320).
Se han estudiado las diferentes funciones desempeñadas por cada uno
de los parálogos.
En Hummel I. et al. (cfr. Hummel et
al, "Differetial expresión of ARGININE DECARBOXYLASE
ADC1 y ADC2 in Arabidopsis thaliana:
characterization of transcriptional regulation during seed
germination and seedling development", New Phytologist, 2004, v.
163, p. 519-531), se estudiaron las actividades de
los promotores de ADC1 y ADC2 en plantas transformadas
de forma estable. En este estudio, se demostró que el frío tenía un
poderoso efecto en la actividad de los promotores de ADC1 y
ADC2. Se concluyó que en Arabidopsis la respuesta de
poliaminas al frío se demuestra que correlaciona con la activación
transcripcional del promotor del gen ADC1.
En Alcázar et al. (Alcazar et al.,
"Overexpression of ADC2 in Arabidopsis induces dwarfism and
late-flowering through GA deficiency", The Plant
Journal, 2005, v. 43, p. 425-436) se generó una
planta transgénica de Arabidopsis. La planta transgénica
sobreexpresaba el gen ADC2, dando lugar a una acumulación de
putrescina, sin afectar los niveles de espermidina o espermina.
Además, las plantas sobreexpresoras de ADC2 mostraron
enanismo y retraso en la floración.
A pesar de los esfuerzos previos realizados en
el estado de la técnica, la búsqueda de nuevas plantas con
resistencia mejorada a estrés y de métodos para su obtención es
todavía un campo activo.
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Los inventores de la presente invención han
encontrado que introduciendo en una planta una secuencia del gen
ADC1, la planta transgénica resultante presenta resistencia a
estrés por baja temperatura. Además, el fenotipo de la planta
transgénica no difiere del fenotipo de la planta de tipo silvestre,
tal como se ilustra más abajo.
En Alcázar et al. (ver más arriba), se
describió que sobreexpresando el gen ADC2 (el parálogo del
gen ADC1), la planta transgénica resultante experimentaba
cambios en su fenotipo (tales como enanismo) y en su crecimiento
(retraso en la floración).
Por otra parte, en Hummel I. et al. (ver
más arriba) se menciona que el efecto del frío estaba correlacionado
con cambios en los niveles de RNAm, y era coherente con la presencia
específica de dos copias de un elemento de respuesta a bajas
temperaturas en el promotor de ADC1 y con el impacto
potencial del elemento transponible en la expresión del gen, ya que
una copia de este elemento de respuesta a temperaturas bajas forma
parte del elemento transponible de ADC1.
Sorprendentemente, se encontró que la
sobreexpresión de ADC1 confiere a la planta resistencia a
estrés por las bajas temperaturas y no afecta al fenotipo o
crecimiento de la planta transgénica.
Además, y tal como se ilustra más abajo, la
resistencia a estrés por bajas temperaturas se consigue por
sobreexpresión del gen ADC1, independientemente del promotor
utilizado para su expresión. Tal como se muestra más abajo, la
construcción utilizada para introducir el gen ADC1 en la
planta comprendía un promotor constitutivo distinto al promotor
ortólogo del gen. Por tanto, los inventores de la presente invención
han encontrado que el factor relevante para conferir resistencia a
estrés por bajas temperaturas es la sobreexpresión del gen
ADC1, independientemente de si el promotor ortólogo de
ADC1 está presente en la construcción utilizada para
transformar la planta.
Por otra parte, los inventores han descubierto
que cuando el gen ADC1 se sobreexpresa en la planta: a) hay
una acumulación de putrescina; b) los niveles de espermidina casi no
cambian; y c) los niveles de espermina se reducen (niveles
comparados con una planta de tipo silvestre). Este descubrimiento
contraviene las divulgaciones realizadas en el estado de la técnica
utilizando otro gen de síntesis de poliaminas (i.e. el gen
espermidina sintasa), en el que los efectos observados se basaban en
un incremento de espermidina y/o espermina como consecuencia de una
acumulación de putrescina, o una producción estable de las
poliaminas mencionadas.
Así, en un primer aspecto la presente invención
se refiere a un método de producción de plantas con resistencia
mejorada a estrés por bajas temperaturas, que comprende el paso de
la transformación de células de una planta con una secuencia exógena
del gen ADC1 de la arginina descarboxilasa bajo el control de
un promotor capaz de funcionar en la planta.
Los inventores creen que las plantas
transgénicas resultantes no presentan alteraciones en su desarrollo
debido a la diferente localización subcelular de ADC1,
incrementándose la productividad y el rendimiento, en comparación
con las que sobreexpresan ADC2.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a una planta transformada obtenible por el método definido
de acuerdo con en el primer aspecto de la invención.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1: Estructura de la construcción de
expresión que contiene el gen de la biosíntesis de putrescina
ADC1 bajo el control del promotor constitutivo CaMV35S.
Fig. 2: Niveles relativos de transcrito del gen
de la biosíntesis de putrescina ADC1 en plantas transgénicas
(I11, I7, I9) y control (wt).
Fig. 3: Niveles de poliaminas en plantas de
Arabidopsis de tipo silvestre (wt) y transgénicas
sobreexpresoras de ADC1 (I11, I7, I9).
Fig. 4: Tolerancia a la congelación de plantas
de tipo silvestre y transgénicas. Plantas de 3 semanas de edad se
expusieron a diferentes temperaturas de congelación durante 6 horas:
(A)- 5ºC (no aclimatadas), y (B) -12ºC (aclimatadas al frío). La
tolerancia a la congelación se estimó como el porcentaje de plantas
que sobreviven a cada temperatura específica después de 14 días de
recuperación en condiciones de ausencia de estrés.
En la presente invención "plantas con
resistencia mejorada a estrés por temperaturas bajas" son plantas
en las que la limitación de crecimiento o el daño ocasionados por el
estrés por bajas temperaturas puede eliminarse o reducirse.
Como se usa aquí, "exógeno", indica que no
es intrínseco a la planta sino que se ha introducido externamente.
De este modo, una "secuencia exógena del gen ADC1" puede
ser un gen que codifica la enzima ADC1 homólogo a la planta huésped
(es decir, derivado de la planta huésped) que se introduce
externamente por manipulación genética. El uso de un gen derivado
del huésped que codifica la enzima ADC1 es preferible al considerar
la identidad del uso de codones.
En una realización del primer aspecto de la
invención, el método además comprende la regeneración de la planta a
partir de las células transformadas que contienen la secuencia
génica exógena del gen ADC1 bajo el control de un promotor
capaz de funcionar en plantas.
La secuencia completa del gen ADC1 está
disponible en la base de datos GenBank con la referencia génica ID
816149.
La secuencia codificante del gen ADC1 de
la arginina descarboxilasa de Arabidopsis thaliana (SEQ ID
NO: 1) está disponible en la base de datos GenBank. Su número de
acceso es NM_127204.
La secuencia de aminoácidos de la arginina
descarboxilasa ADC1 (SEQ ID NO: 2) está disponible en la base de
datos GenBank. Su número de acceso es Q9SI64.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, la secuencia exógena del gen ADC1 de la arginina
descarboxilasa se selecciona de un grupo que consiste en: a) una
secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1; b)
una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de
aminoácidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2; c) una
secuencia de nucleótidos que híbrida con la SEQ ID NO: 1 o una
secuencia complementaria de la misma en condiciones severas y que
codifica una proteína con actividad arginina descarboxilasa, y d)
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad
arginina descarboxilasa que comprende la secuencia (a) con una o más
bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas.
Preferiblemente, la secuencia corresponde a la SEQ ID NO: 1.
La secuencia exógena del gen ADC1 puede
ser introducida en las células por cualquier método de ingeniería
genética. Ejemplos incluyen fusión de protoplastos con células
vegetales heterólogas que tienen la secuencia del gen ADC1,
infección con virus de plantas con el genoma viral manipulado
genéticamente para expresar el gen que codifica la enzima ADC1, o
transformación de células de la planta huésped usando un vector de
expresión que contiene el gen que codifica la enzima ADC1.
Ejemplos de promotores capaces de funcionar en
plantas incluyen el promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV) que se expresa de forma estructural en las células
vegetales, el promotor del gen que codifica la nopalina sintasa
(NOS), el promotor del gen que codifica la octopina sintasa (OCS),
el promotor del gen que codifica la fenilalanina amonio liasa (PAL)
y el promotor del gen que codifica la chalcona sintasa (CHS).
También hay disponibles otros promotores de plantas bien conocidos
además de los mencionados.
No sólo promotores que se expresan
constitutivamente en todos los órganos como el promotor 35S, sino
también promotores regulados por bajas temperaturas, estrés, sequía,
luz, calor, hormonas, daño mecánico o similar pueden utilizarse para
expresar el gen diana de acuerdo con el medio ambiente. Por ejemplo,
se puede utilizar un gen que codifica la enzima ADC1 y un promotor
que active su transcripción sólo cuando la planta se expone a bajas
temperaturas, para controlar el metabolismo de poliaminas de la
planta sólo en condiciones de bajas temperaturas y así mejorar la
resistencia a estrés por bajas temperaturas. Un promotor específico
de órgano o tejido también puede utilizarse para expresar el gen
diana sólo en órganos o tejidos específicos.
Cuando la secuencia del gen exógeno ADC1 se
introduce por infección con Agrobacterium tumefaciens, el
casete de expresión que incluye el gen que codifica la enzima ADC1
puede insertarse en la región T-DNA (región que se
transfiere al cromosoma de la planta) en un plásmido Ti o Ri de las
células. En la actualidad se utilizan sistemas de vectores binarios
en los métodos de transformación estándar con Agrobacterium.
Ejemplos de vectores binarios comerciales incluyen los plásmidos
pBI101 y pBI121 (ambos comercializados por Clontech). La región Vir
implicada en la incorporación del T-DNA tiene acción
en trans en el plásmido Ti (o Ri), en un vector conocido como
plásmido de ayuda o "helper".
Para la transformación de plantas pueden
utilizarse varios métodos conocidos convencionales. Ejemplos
incluyen el método del PEG, en el que los protoplastos se aíslan de
células vegetales por tratamiento con un enzima que degrada la pared
celular como la celulasa o la hemicelulasa, y se añade el
polietilenglicol a una suspensión de protoplastos junto a un vector
de expresión que contiene el casete de expresión del gen que
codifica la enzima ADC1 mencionado antes, para incorporar el vector
de expresión en los protoplastos por un proceso como la endocitosis;
el método de liposomas en el que un vector de expresión se introduce
por tratamiento de ultrasonidos o similar en vesículas de membranas
lipídicas como fosfatidilcolina, y las vesículas se fusionan con los
protoplastos en presencia de PEG; métodos de fusión en un proceso
similar utilizando micelas; y por electroporación, en el que se
aplican pulsos eléctricos a una suspensión de protoplastos y un
vector de expresión para incorporar los vectores que se encuentran
en la solución externa en los protoplastos. Sin embargo, estos
métodos son complejos puesto que requieren técnicas de cultivo para
la re-diferenciación de los protoplastos en plantas.
Procesos para introducir el gen de interés en células intactas con
pared celular incluyen la inyección directa como la microinyección
en la que una micropipeta se inserta en las células para inyectar el
DNA del vector por presión a gas o hidráulica, o el método del cañón
de partículas en el que se aceleran micropartículas de metal
cubiertas con DNA por la detonación de un explosivo o presión
gaseosa y de esta forma se introducen en las células, y métodos que
emplean la infección con Agrobacterium. Los inconvenientes de
la microinyección son la necesidad de una experiencia considerable y
el pequeño número de células que se manipulan. Por ello es más
aconsejable transformar plantas con métodos más prácticos tales como
el método Agrobacterium y el método del cañón de partículas.
En el método del cañón de partículas, bolas diminutas de metal
(normalmente oro) cubiertas con el DNA de interés se disparan
directamente sobre la célula vegetal. El método del cañón de
partículas es útil ya que los genes pueden ser introducidos
directamente en el meristemo apical de las plantas mientras son
cultivadas. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del
suelo que contiene, además de su cromosoma, un minicromosoma extra
circular denominado plásmido inductor de tumores (Ti). Parte del
plásmido Ti se transfiere a los cromosomas de la planta huésped
donde queda integrado (T-DNA). Varios loci génicos
del cromosoma bacteriano y un grupo de genes de virulencia (vir)
localizados en el plásmido Ti codifican para funciones que
intervienen en el reconocimiento de la célula vegetal y su unión,
así como en la excisión, transferencia e integración del
T-DNA en el genoma de la planta. En general el
método de Agrobacterium está más aceptado que el cañón de
partículas por la mayor frecuencia de inserciones únicas en el DNA
foráneo, siendo más fácil su monitorización.
Ejemplos ilustrativos no limitantes de células
vegetales que pueden ser transformadas con el gen exógeno
ADC1 de acuerdo con el primer aspecto de la invención, son
las células derivadas de: callos, semillas, hojas, tallos,
sarmientos, raíces, tubérculos de raíz o tallo, flores y
similares.
Ejemplos de plantas que pueden ser transformadas
con el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la
invención incluyen, pero no están limitadas a, dicotiledóneas,
monocotiledóneas, plantas herbáceas y arbustos. Ejemplos incluyen
patatas dulces, tomates, pepinos, calabaza, melones, sandías, tabaco
(Nicotinia tabacum), Arabidopsis thaliana, pimientos,
berenjena, judías, taro, espinaca, zanahorias, fresas, patatas
blancas, arroz, maíz, alfalfa, trigo, cebada, soja, colza, sorgo,
Eucaliptos, olmo, kenaf, Eucommia ulmoides, caña de azúcar,
remolacha, cassaya, cica, Chenopodium album, lirios,
orquídeas, claveles, rosas, crisantemo, petunias, Torenia
fournieri, antirrhinum, ciclamen, gypsohila, geranio, girasol,
Zoisia japónica, algodón, hongos matsutake, hongos shiitake,
champiñones, ginseng, frutos cítricos, bananas y kiwi.
Las "secuencias de base con una o más bases
deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas" aquí
referidas, son ampliamente conocidas para aquellas personas expertas
en la materia, para retener algunas veces actividad fisiológica
incluso cuando la secuencia de aminoácidos de una proteína que
generalmente tiene dicha actividad fisiológica tiene uno o más
aminoácidos sustituidos, deleccionados, insertados o añadidos. Los
genes que tienen dichas modificaciones y que codifican una enzima
ADC1 están incluidos en el ámbito de la presente invención. Sin
embargo, es esencial que dichas modificaciones no resulten en una
pérdida de actividad para la enzima mencionada.
Las "condiciones severas" aquí referidas,
significan condiciones bajo las cuales sólo secuencias de bases que
codifican un polipéptido con actividad enzimática ADC1 equivalente a
la enzima ADC1 codificada por una secuencia génica específica de la
enzima ADC1 forma híbridos con la secuencia específica (referido
aquí como híbridos específicos), y secuencias de bases que codifican
polipéptidos que no tienen dicha actividad equivalente no forman
híbridos con la secuencia específica (referidos aquí como híbridos
no específicos). Un experto en la materia puede seleccionar
fácilmente tales condiciones variando la temperatura durante la
reacción de hibridación y proceso de lavado, la concentración de
sales durante reacción de hibridación y proceso de lavado, y así
otras cosas.
Ejemplo
1
El cDNA de ADC1 de Arabidopsis se
amplificó por PCR a partir de DNA genómico, utilizando los
siguientes cebadores: sentido directo
5'-ATGCCTGCTCTAGCTTTTG-3' (SEQ ID
NO: 3), y sentido inverso 5-ACCGAAA
TAAGACCAATTC-3' (SEQ ID NO: 4). El fragmento de DNA amplificado se clonó en el vector pGEM (Stratagene, Heidelberg) y se comprobó por secuenciación. La construcción que contiene el cDNA de ADC1, flanqueado por el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) y el terminador de la nopalina sintasa (NOS), en un vector binario (pBI121-ADC1), se obtuvo reemplazando el gen GUS SmaI/SacI en el vector pBI121 (cfr. Chen et al., "Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning t-DNA insertion from transgenic plants", Molecular Breeding, 2003, v. 11, p. 289-293; accession number AF485783), por el cDNA de ADC1, como un fragmento XbaI/XbaI (2.6 kb). Esta construcción se introdujo por electroporación en Agrobacterium tumefaciens C58C1, que se utilizó para transformar diferentes especies vegetales, tal como se explica más abajo.
TAAGACCAATTC-3' (SEQ ID NO: 4). El fragmento de DNA amplificado se clonó en el vector pGEM (Stratagene, Heidelberg) y se comprobó por secuenciación. La construcción que contiene el cDNA de ADC1, flanqueado por el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) y el terminador de la nopalina sintasa (NOS), en un vector binario (pBI121-ADC1), se obtuvo reemplazando el gen GUS SmaI/SacI en el vector pBI121 (cfr. Chen et al., "Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning t-DNA insertion from transgenic plants", Molecular Breeding, 2003, v. 11, p. 289-293; accession number AF485783), por el cDNA de ADC1, como un fragmento XbaI/XbaI (2.6 kb). Esta construcción se introdujo por electroporación en Agrobacterium tumefaciens C58C1, que se utilizó para transformar diferentes especies vegetales, tal como se explica más abajo.
Plantas de Arabidopsis thaliana Col0 se
transformaron con A. tumefaciens, que contenía la
construcción pBI121-ADC1 por inmersión floral (cfr. Clough S.
J. et al., "Floral dip: a simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis
thaliana", Plant J., 1998, v. 16, p.
735-743). Las semillas producidas por estas plantas
se recolectaron y se seleccionaron en medio de cultivo de Murashige
and Skoog, abreviado a partir de ahora como "MS" (cfr.
Murashige T. et al., "A revised médium for rapid growth and
bioassays with tobáceo tissue culture", Physiol. Plant., 1962, v.
15, p. 473-497), que contenía 50 mg/l de kanamicina
como antibiótico para la selección de los transformantes. La
progenie de las plantas resistentes a kanamicina se analizó para la
segregación de resistencia a kanamicina. Las semillas de las plantas
con una proporción de segregación 3:1 se cultivaron de nuevo y la
progenie resultante se analizó de nuevo para la segregación de
resistencia a kanamicina para identificar plantas homocigotas para
el T-DNA insertado. Se seleccionaron tres líneas
homocigotas (I7, I9 e I11) para posteriores análisis.
El RNA total se obtuvo de toda la parte aérea de
plantas de Arabidopsis thaliana de 4 semanas no transformadas
(wt) y transformadas con el plásmido pBI121ADC1 (I7, I9, I11)
utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un
microgramo de RNA total se trató con DNasa de grado amplificación
(Invitrogen) para eliminar la contaminación con DNA genómico. La
hebra complementaria de cDNA se obtuvo con hexámeros degenerados
utilizando el sistema de retrotranscripción SuperScript III
(Invitrogen), siguiendo las especificaciones del fabricante. La
RT-PCR a tiempo real con el método de mareaje SYBR
Green I se llevó a cabo utilizando la primera hebra de cDNA como
molde en un sistema detector de secuencias (modelo 7700; Applied
Biosystems, Foster, CA). La eficiencia de la amplificación de cada
muestra analizada se determinó utilizando la hoja de cálculo
DART-PCR (cfr. Peirson S. N. et al.
"Experimental validation of novel and conventional approaches to
quantitative real-time PCR data analysis",
Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, e73), que utiliza un algoritmo
simple (cfr. Tichopad A. et al., "Standardized
determination of real-time PCR efficiency from a
single reaction set-up", Nucleic Acids Res.,
2003, v. 31, e122.) y los datos de fluorescencia sin tratar, lo cual
permite obtener resultados comparables sin necesidad de curvas de
calibración con patrones. Las eficiencias de amplificación se
calcularon para cada reacción individual a partir de su perfil de
amplificación y se comprobaron por ANOVA para detectar muestras
anómalas (outliners) y diferencias entre grupos (equivalencia de
amplificación) utilizando la misma hoja de calculo
DART-PCR. La media de fluorescencia inicial
(R_{0}) obtenida a partir de la eficiencia media se normalizó
utilizando RNAm de Actina2 como control interno en cada
experimento. Estos análisis se llevaron a cabo dos veces en
experimentos independientes con resultados muy similares. Se
utilizaron los siguiente juegos de cebadores específicos para cada
gen: ADC1 (sentido directo:
5'-GTGGTGATAAGGGGAACGA
CA-3' (SEQ ID NO: 5), sentido inverso: 5'-CAACCGAAATAAGACCA-ATTCTCAT-3' (SEQ ID NO: 6)), y Actina2 (sentido directo: 5'-GATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-3' (SEQ ID NO: 7), sentido inverso: 5'-TGGATTCCAG
CAGCTT-CCAT-3' (SEQ ID NO: 8).
CA-3' (SEQ ID NO: 5), sentido inverso: 5'-CAACCGAAATAAGACCA-ATTCTCAT-3' (SEQ ID NO: 6)), y Actina2 (sentido directo: 5'-GATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-3' (SEQ ID NO: 7), sentido inverso: 5'-TGGATTCCAG
CAGCTT-CCAT-3' (SEQ ID NO: 8).
Como se puede comprobar en la Fig. 2, los
niveles relativos de transcrito de ADC1 en las líneas transgénicas
I11, I7 e I9, fueron significativamente superiores en relación con
el control (wt).
Las poliaminas (PAs) se analizaron por
separación de los derivados de PAs con cloruro de dansilo mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los métodos de
extracción y determinación se habían descrito previamente (cfr.
Mareé M. et al., "Rapid high-perfomance
liquid chromatographic method for quantitation of polyamines as
their dansyl derivatives: Application to plant and animal
tissues", J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., 1995, v. 666, p.
329-33).
Como se muestra en la Fig. 3, los niveles de
putrescina en las plantas transgénicas están incrementados, mientras
que la espermidina no está afectada y el nivel de espermina está
reducido. A partir de estos resultados, se puede concluir que la
sobreexpresión de ADC1 incrementa la acumulación de
putrescina.
En este ensayo se utilizaron plantas de 3
semanas (wt, I7, I9, I11). Para obtener las plantas, las semillas se
sembraron en macetas que contenían una mezcla de tierra y
vermiculita (3:1 v/v), se regaron con agua y una solución mineral de
Hogland, y crecieron a 21\pm1ºC en fotoperíodos de día neutro (12
horas de luz fluorescente blanca fría, flujo de fotones de
70-90 \mumol m^{-2} seg^{-1}).
Los tratamientos a bajas temperaturas se
llevaron a cabo transfiriendo las plantas a cámaras de crecimiento
programadas a 4\pm1ºC durante diferentes períodos de tiempo en las
condiciones de luz y fotoperíodo descritas más arriba.
Los ensayos de congelación se realizaron en un
congelador de temperatura programable. Plantas de 3 semanas
no-aclimatadas o aclimatadas a frío (7 días, 4ºC) se
expusieron a 4ºC durante 30 min en la oscuridad y a continuación se
bajó la temperatura 2ºC por hora. La temperatura final de
congelación (-5ºC para no aclimatadas, y -11ºC para aclimatadas a
frío) se mantuvo durante 6 horas, y luego se incrementó de nuevo la
temperatura hasta 4ºC a la misma velocidad. Tras descongelarlas a
4ºC durante 12 horas en la oscuridad, las plantas se devolvieron a
sus condiciones originales de crecimiento (ver arriba). La
resistencia a congelación se determinó como la capacidad de las
plantas para reanudar el crecimiento tras 14 días de recuperación en
condiciones control.
Como se deduce de los resultados obtenidos (ver
Fig. 4), las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen exógeno
ADC1 son más resistentes a estrés por bajas temperaturas
mostrando, al mismo tiempo, las mismas características fenotípicas
que las plantas de tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Discos de hojas de plantas de tabaco
(Nicotiana tabacum cv. Burley 21) se transforman con
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 portador de la construcción
de interés tal como se describe en Horsch et al. (cfr. R.B.
Horsch et al., "A simple and general method for
transferring genes into plants" Science 1985, vol. 227, pp.
1229-1231). El medio para el desarrollo de yemas
contiene sales minerales MS (Duchefa, ND), vitaminas B5 Gamborg
(Duchefa), 1 mg/l de benziladenina (BA, Sigma), 0.1 mg/l de ácido
naftalenacético (NAA, Sigma), 50 mg/l de kanamicina como antibiótico
para la selección de células transformadas y 100 mg/l de Claforan
para evitar el crecimiento de A. tumefaciens. Tras
6-7 semanas en este medio, se obtienen yemas del
tamaño adecuado para ser transferidas a medio de enraizamiento.
Las yemas regeneradas se separan y se
transfieren a medio de enraizamiento: MS con 50 mg/l kanamicina pero
sin hormonas (BA, NAA). Las plantas resistentes a kanamicina
(3-10 cm alto) se transfieren a substrato con abono
y se cultivan en invernadero. Después de 3 meses las plantas están
floreciendo y se consigue la autopolinización cubriendo una
inflorescencia entera y las yemas con una bolsa de papel.
Normalmente, un mes más tarde las semillas están maduras y pueden
utilizarse para germinación. Estas semillas se analizan para
segregación por resistencia a kanamicina, y las plantas que son
capaces de crecer en presencia de kanamicina se utilizan para
posteriores análisis.
Los niveles de expresión de ADC1 en las
plantas transgénicas, así como los niveles de putrescina, se
determinan en la parte aérea de plantas de tabaco de 4 semanas como
se describe en el protocolo de Arabidopsis.
La resistencia a congelación de 3 líneas
transgénicas seleccionadas por sus elevados niveles de putrescina se
determina como se describe para Arabidopsis.
<110> Universidad de Barcelona
\hskip1cmUniversitat de València
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Planta que presenta resistencia al
estrés por frío y procedimiento de producción de la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B536ES00/AVCRI051
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 702
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> cebador sentido directo para
amplificación del ADN genómico de ADC1 de Arabidopsis
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcctgctc tagcttttg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido inverso para
amplificación del ADN genómico de ADC1 de Arabidopsis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgaaataa gaccaattc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido directo para
determinar la cantidad de ARNm de ADC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtgataa ggggaacgac a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido inverso para
determinar la cantidad de ARNm de ADC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaccgaaat aagaccaatt ctcat
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido directo para
determinar la cantidad de ARNm de Actin2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattcagatg cccagaagtc ttgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido inverso para
determinar la cantidad de ARNm de Actin2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggattccag cagcttccat
\hfill20
Claims (8)
1. Método para producir plantas con resistencia
mejorada a estrés por bajas temperaturas, que comprende la etapa de
transformar células de una planta con una secuencia exógena del gen
ADC1 de la arginina descarboxilasa bajo el control de un
promotor capaz de funcionar en plantas.
2. Método según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de regeneración de plantas a partir de las
células transformadas.
3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2,
donde la secuencia exógena tiene una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en:
- a)
- una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1;
- b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2;
- c)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína con actividad arginina descarboxilasa, que comprende la secuencia (a) con una o más bases deleccionadas, sustituidas, insertadas o añadidas.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método según la reivindicación 3, donde la
secuencia exógena tiene la secuencia SEQ ID NO: 1.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de putrescina se incrementa
en las células transformadas.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el nivel de expresión del gen exógeno
ADC1 de la arginina descarboxilasa se sobreexpresa en las
células transformadas.
7. Planta transformada obtenible por el método
como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Uso de la secuencia del gen ADC1 de la
arginina descarboxilasa para conferir resistencia a estrés por baja
temperatura a una planta.
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