CN111139311B - 一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法及应用，该方法包括以下步骤：通过隔行种植或包围种植的方式混种，分别收获转基因水稻与杂草稻的后代种子，正向漂移检测和筛选幼苗抗性，存活植株再检测抗性基因；反向漂移检测子实中红皮Rc基因。根据抗性基因和Rc基因的检出率，合并计算转基因水稻基因漂移率，评价基因漂移风险。该方法克服了以往仅考虑正向漂移风险忽视反向漂移风险而低估实际漂移风险的弊端，从而可以更准确评估转基因水稻通过花粉介导的基因漂移风险大小，为转基因水稻商业化过程中的环境安全评价和管理提供技术支撑。

Description

一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法及应用
技术领域
本发明属于生物安全评估领域，具体涉及一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法及应用。
背景技术
转基因作物已经被广泛种植，给社会带来巨大获益，与此同时，也潜在着一定的生态风险。已有大量研究表明转基因作物通过花粉介导向常规品种和野生近缘种的基因漂移风险的存在。虽然世界转基因水稻商业化种植尚处于起步阶段，而我国还没有商业化种植，转基因水稻的抗性基因可通过花粉漂移至常规水稻中，污染常规稻种子。并且转基因水稻的抗性基因还可通过花粉漂移介导的基因漂移(Gene flow)逃逸到野生近缘杂草中，使之抗性基因在杂草种群中延续、蔓延，谓之杂草化。其中，转水稻野生近缘种杂草稻是最值得关注的水稻近缘杂草。
由于杂草稻和栽培水稻同属于稻属稻种，且与栽培水稻在形态结构和生理生化代谢等方面极其相似，因此杂草稻是最难防除的农田杂草之一，在世界各地大多数水稻种植区均有发生，严重影响水稻产量。如果转基因水稻的抗性基因漂移到杂草稻种群，提高了杂草稻的种群适合度，特别是抗除草剂基因的漂移，转基因抗除草剂水稻使用目标除草剂将完全失效。已经有大量研究工作证实转基因水稻和杂草稻能发生初始杂交，后代中可以稳定获得转基因水稻的目标基因。
目前已有大量关于转基因水稻花粉向杂草稻漂移介导的正向基因漂移的研究报道，为此，也建立了相应的基因漂移风险评价的方法。但是，很长时间以来由于人们普遍关注正向基因漂移，忽略了近缘杂草的基因也通过花粉漂移到转基因作物导致的转基因作物后代的杂草化，导致基因逃逸，也可能会给农业生产带来潜在生态风险。这也就是说转基因作物与野生近缘杂草种间的基因漂移是双向的。因此，迄今，基于转基因作物花粉向野生近缘杂草种漂移介导的基因漂移检测评估技术体系，几乎过半的风险被低估了。转基因水稻与杂草稻间的基因漂移也是双向的，例如张晶旭等(2015)发现杂草稻向抗除草剂转基因水稻的反向花粉漂移会导致转基因水稻快速演化为抗性杂草稻，这样就导致抗性基因的逃逸。所以，建立双向基因漂移风险的安全检测和评估十分必要。
转基因水稻向非转基因水稻、杂草稻及野生稻的基因漂移的抗性检测方法主要有生物学检测和分子检测。收获的种子种植后根据筛选标记的生化特性对水稻幼苗进行检测是否含有抗性基因，如对抗除草剂性状，可以采用叶面喷洒除草剂的方法进行检测，即将检测的种子直接种植于田间，生长到一定时期用适合浓度的除草剂喷雾处理，根据植株是否死亡，判断该植株是否含有抗性基因。除此之外还可以将种子用一定浓度的除草剂溶液浸泡来进行检测，如将检测的种子用浓度为40mg/L的草铵膦溶液浸泡，放在温室内培养10d后测量胚芽鞘的长度。若胚芽鞘长度大于2cm，则认为该幼苗携带有抗性基因。分子生物学的方法需要对收获的非转基因材料幼苗中的DNA或蛋白质进行检测。
转基因水稻向杂草稻的基因漂移率可以采用生物学检测和分子检测的方法来确定，但杂草稻向转基因抗性水稻的反向基因漂移尚没有可行的方法，因此，要开展杂草稻向转基因水稻反向基因漂移的风险检测和评估，反向基因漂移的检测方法是关键。由于转基因水稻含有抗性基因，因此无法用常规抗性筛选的技术检测杂草稻向转基因水稻花粉漂移后产生的杂交种，而直接用分子检测，则工作量过大，也会花费更多的人力、物力。通常情况下，杂草稻的果皮为红色，转基因水稻的果皮为白色，杂草稻的果皮色基因型为RcRc，而转基因水稻的果皮色基因型rcrc，因此转基因水稻与杂草稻的杂交种的基因型为Rcrc，杂草稻具有红皮基因(Rc)，如果发生反向花粉漂移，转基因水稻收获种子中就能检测到该基因，依此，红皮基因(Rc)可以作为反向基因漂移的检测依据。但是，要从大量转基因水稻品种的后代中检测出极低频率花粉漂移导致的杂交后代，工作量十分巨大，因此，需要发展相应的取样和检测技术。
转基因水稻中的抗性基因在生长阶段可通过花粉漂移至到非转基因水稻中，产生携带抗性基因的非转基因水稻，这会造成非转基因水稻收获的种子中有少量含有抗性基因的水稻种子。尽管在自然条件下水稻主要通过自花授粉繁殖后代，但研究发现水稻也能够不同程度地接受稻属其他来源的花粉。通过大量研究发现转基因水稻通过花粉向非转基因水稻的基因漂移率为0.003％～0.919％。如果是花粉受体不育系水稻，则基因漂移率会提高至3.145％～46.25％。除与非转基因水稻发生基因漂移，转基因水稻的花粉也可能漂移到野生稻和近缘杂草稻中，现有研究表明，转基因水稻向野生稻的基因漂移率介于3.55％～18.0％；向杂草稻的基因漂移率介于0.011％～0.666％。
我国现有的对转基因水稻外源基因漂移的检测标准中，对采用隔行种植检测异交率的试验中规定，对收获的非转基因材料种子，包括野生稻、杂草稻以及非转基因常规稻，每个处理检测不能低于1000粒，低于1000粒的全部检测，试验设置3个重复，按照这个标准每种非转基因材料的种子检测量不低于3000粒，但没有明确更科学的检测量。对采用同心圆种植的非转基因材料具体检测的种子数量也未有明确规定。
很多研究者检测转基因水稻的基因漂移率均是从收获的种子中随机抽取一部分种子进行抗性筛选。转基因水稻向不育系水稻的基因漂移研究中，研究发现在包围种植方式下，在收获的种子中随机抽取236～336粒种子进行抗性检测，得到抗潮霉素转基因水稻L7T4向水稻雄性不育系矮培64S的基因漂移率为6.06％～23.3％。转基因水稻向杂草稻的基因漂移研究中，有研究者采用包围种植和隔行种植两种方式，在收获的种子中随机抽取了5000～10000粒种子进行抗性筛选，得到抗草铵膦水稻Nam29/TR18向杂草稻的基因漂移率为0.011％～0.046％；也有研究发现在包围种植和隔行种植两种方式下，在收获的种子中随机抽取10000粒种子进行抗性筛选，得到复合性状转基因水稻T1c-19向3种杂草稻的基因漂移率为0.106％～0.23％。有研究者采用同心圆、包围和隔行三种种植方式，对收获的种子随机抽取10000～20000粒种子进行抗性筛选，得到抗草铵膦转基因水稻125S/Bar68-1向杂草稻的基因漂移率为0.011％～0.47％。
部分研究者将收获的种子全部进行抗性检测，虽然能够准确的反映其真实的漂移情况，但检测种子量过多会很耗费时间和成本。有研究者采用平行种植的方式研究发现，将收获的种子(6739～343008粒)全部进行抗性筛选，得到抗草铵膦转基因水稻粳稻品系L201的抗性基因向不育系的漂移率高达3.145％～36.116％，向杂交水稻的基因漂移率为0.037％～0.045％。有研究发现在同心圆种植下，将收获的种子(18997～30743粒)全部进行抗性筛选，得到抗原卟啉原氧化酶抑制剂转基因水稻向三种不同栽培水稻基因漂移率分别为0.039％、0.003％和0.005％。有研究者在研究抗草铵膦转基因水稻Y0003向杂草稻WRZJ003的基因漂移率时，将收获的种子(90255粒)全部检测得到的基因漂移率为0.131％。有研究者在研究转基因水稻Ⅱ优86B向泰州杂草稻的基因漂移率时，将收获的花粉受体种子全部进行检测得到的基因漂移频率为0.136％。虽然该研究者没有表明检测的种子数，但根据其种植方式和种植面积可以推断出其收获的花粉受体种子超过100000粒。
以上研究均是转基因水稻向非转基因水稻、杂草稻的基因漂移研究，在检测基因漂移率时可通过转基因水稻的抗性基因进行先一步的筛选，能够减少研究人员的工作量和成本，但对于杂草稻向转基因水稻的基因漂移研究，在进行基因漂移率检测时，由于转基因水稻作为花粉受体，杂交产生的杂交1代都携带抗性基因，因此无法通过抗性筛选检测基因漂移率。
发明内容
针对现有转基因基因漂移风险的检测评估技术仅考虑正向漂移，几乎低估了一半风险所存在的问题，本发明提供一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法及应用，设计转基因水稻花粉向杂草稻的正向漂移和杂草稻花粉向转基因水稻的反向漂移试验，抗性检测和红皮基因Rc检测，评估漂移风险。通过隔行种植或包围种植的方式混种，分别收获转基因水稻与杂草稻的后代种子，正向漂移检测幼苗抗性筛选，存活植株再检测抗性基因；反向漂移检测子实中红皮Rc基因。根据抗性基因和Rc基因的检出率，合并计算转基因水稻基因漂移率，评价基因漂移风险。双向基因漂移率检测的抽样技术，常规的转基因水稻向杂草稻基因漂移的检测技术，以及杂草稻向转基因水稻基因漂移的检测方法，通过模拟转基因水稻抗性基因漂移后以及杂草稻向转基因水稻基因漂移后形成的杂交种通过收获混杂在花粉受体种子中的空间分布型，并以分布型为基础，采用随机抽样的方法，以抽样得到漂移率的偏离系数小于0.05为标准，得出不同基因漂移率下的最佳抽样量。该评估方法可以准确评估转基因水稻通过花粉介导的基因漂移风险大小，为转基因水稻环境安全评价提供技术支撑。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，包括以下步骤：
S1：通过分期将转基因水稻与杂草稻分别作为花粉供体和受体通过隔行种植或包围种植的方式混种；
当采用隔行种植时，分别收集转基因水稻后代种子与杂草稻后代种子；
当采用包围种植时，只需收集作为花粉受体的后代种子；
S2：收集种子后，采用分步抽样法抽取所需种子用于基因漂移检测，具体如下：
S21：采用随机抽样的方法，从收获的种子中抽取20000粒种子；
S22：若得到的基因漂移率大于0.2％，则不必继续增加抽样量；
若得到的基因漂移率小于0.2％，则需再检测10000粒种子；在此基础上，若得到的基因漂移率大于0.05％，则不需要增加种子检测量；若得到的基因漂移率小于0.05％，还需再检测10000粒种子，直至得到的基因漂移率大于0.05％；
S3：对转基因水稻向杂草稻基因漂移率，即正向基因漂移率进行检测，具体如下：
S31：对收获的杂草稻种子打破休眠后进行发芽率检测，把装有100粒种子的培养皿放置于30℃光照培养箱培养7d，测定发芽率，试验重复4次，每种受体材料抽样方法采用S2所述的分步抽样法；
S32：根据作为标记基因的抗性基因，选择对应的抗性筛选方法；将经过筛选出来的幼苗移栽在育苗盘内培养至3叶期，采取叶片，进行分子检测；
S33：计算正向基因漂移率：正向基因漂移率＝(抗性种子数/检测种子总数/发芽率)×100％；
S4：对杂草稻向转基因水稻基因漂移率，即反向基因漂移率进行检测，具体如下：
S41：在抽取的样本中随机抽样60粒作为一组，并进行脱壳磨样；将脱壳磨样后的样品进行DNA提取；
S42：将提取到的DNA进行Rc基因检测，根据是否存在104bp和118bp的扩增片段，来判断该样品中是否存在杂草稻向转基因水稻漂移形成的杂交种；若存在104bp和118bp的扩增片段，则该组水稻中存在一粒由于杂草稻花粉漂移到转基因水稻种子产生的杂交种子；
S43：重复步骤S41～S42，直至样本全部检测完；并计算反向基因漂移率：反向基因漂移率＝(发生基因漂移的粒数/样本总粒数)×100％；
S5：统计正向基因漂移率和反向基因漂移率，最终得出基因漂移率：基因漂移率＝(正向基因漂移率+反向基因漂移率/2)×100％。
优选地，所述步骤S1中，所述隔行种植为：在转基因水稻间，间隔5天分4批移栽隔行种植杂草稻；所述包围种植为：一次种植花粉供体，间隔5天分4批围绕种植花粉受体；或一次种植花粉受体，间隔5天分4批围绕种植花粉供体。
优选地，所述步骤S41中：将种子脱壳磨样后过60目筛，进行DNA提取的样品体积为0.5mL，样品重量为0.342～0.377g，DNA浓度为39.8～77.7μg/mL。
优选地，所述步骤S42中，所述Rc基因的扩增引物序列为：
上游引物：5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′；
下游引物：5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′。
优选地，所述步骤S42中，所述Rc基因扩增的PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 4μL，ddH2O 3.5μL，上、下游引物各0.25μL，DNA 2μL；其中，所述2×Taq PCR Mix成分为：dNTP0.2mmol/L each、KCl 100mmol/L、Tris-HCl 20mmol/L、Taq Polymerase 5U/100μL、MgCl23.0mmol/L。
优选地，所述步骤S42中，所述Rc基因扩增的PCR反应程序为：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，降温至4℃，结束反应后用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色照相。
一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法在基因漂移检测方面的应用：将步骤S2所述分布抽样法应用于采用小RNA干扰或基因编辑改造过的水稻与杂草稻或栽培稻之间发生的基因漂移。
一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法在基因漂移检测方面的应用：将步骤S42所述Rc基因检测法应用于杂草稻向采用小RNA干扰或基因编辑改造过的水稻发生的基因漂移。
本发明的有益效果如下：
1、迄今建立的转基因作为向野生近缘杂草种通过花粉漂移介导的基因漂移仅考虑正向漂移，因此，几乎低估了一半的风险。尤其是杂草稻花粉漂移到转基因水稻，其杂交后代混杂在种子中具有隐蔽性，其潜在的风险更大，本发明首次确立的正反双向的花粉漂移介导双向基因漂移的风险评估及其检测技术，使得评价更趋于科学和准确。
2、转基因水稻向非转基因受体，包括野生稻、杂草稻以及常规水稻抗性基因漂移的检测方法主要有生物学检测和分子检测。检测的对象是受体种子。但关于转基因水稻与杂草稻之间的基因漂移检测的取样量并没有明确的标准规定。目前的抽样方法带有较大的随机性，抽样过少会低估漂移频率，抽样过多，工作量繁重，也是人力和物力的浪费。本发明涉及的转基因水稻与非转基因水稻、杂草稻的基因漂移率检测时，根据统计学的规律，科学地明确了抽取种子数量，从而能够正确的反映其田间真实的基因漂移率，本发明达到了既能真实的反映田间实际发生的基因漂移率，也能节省检测时间和经济成本的目的。
3、目前由于忽略了杂草稻向转基因水稻的基因漂移风险问题外，违背重视的另一个原因之一是没有建立快速的检测方法，本发明基于杂草稻具有红皮基因(Rc)，形成的杂交种中可以检测出Rc基因，建立2mL离心管反应体系，用于检测Rc基因的PCR反应体系。
4、本发明为节约检测成本和时间，并保证检测的精确度，确定了能检测出Rc基因最佳磨样量。
附图说明
图1为隔行种植的示意图；
图1中：×为杂草稻；●为转基因水稻；
图2为包围种植的示意图；
图2中：■为花粉供体或花粉受体；○为花粉受体或花粉供体，○中的数字代表批次；●为隔离行作物；
图3为染色水稻与非染色水稻在不同混合比时各抽样量下的偏离系数；
图4为WRYY与T1c-19混合比1:40下0.5mL体积混合磨样样品的Rc基因的PCR检测；
图5为WRYY与T1c-19混合比1:50下0.5mL体积混合磨样样品的Rc基因的PCR检测；
图6为WRYY与T1c-19混合比1:60下0.5mL体积混合磨样样品的Rc基因的PCR检测；
图7为WRYY与T1c-19混合比1:70下0.5mL体积混合磨样样品的Rc基因的PCR检测；
图8为WRYY与T1c-19混合比1:80下0.5mL体积混合磨样样品的Rc基因的PCR检测；
图4～8中：M为Mark；1为T1c-19；2为WRYY；3～22为杂草稻；
图9为实施例5所述组合的种植方式示意图；
图9中：×为转基因水稻；●为杂交水稻；▲为杂交水稻的F2代；
图10为正向(T2A-1向杂草稻及MH63基因漂移)隔行和包围种植下杂草稻及MH63收获的种子中Cry1C*与Bar基因的PCR检测；
图10中：(a)为Bar基因；(b)为Cry1C*基因；M为Mark；1为T2A-1；2为WRYY；3～5为T2A-1与MH63隔行种植；6～8为T2A-1与WRTZ隔行种植；9～11为T2A-1与WRYY隔行种植；12～14为T2A-1与WRTZ包围种植；15～17为T2A-1与WRYY包围种植。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细说明。
一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，包括以下步骤：
S1：通过分期将转基因水稻与杂草稻分别作为花粉供体和受体通过隔行种植或包围种植的方式混种；
当采用隔行种植时，分别收集转基因水稻后代种子与杂草稻后代种子；
隔行种植：如图1所示(图1中×为杂草稻，●为转基因水稻)，在转基因水稻间，间隔5天分4批移栽隔行种植杂草稻；
当采用包围种植时，只需收集作为花粉受体的后代种子；
包围种植：如图2所示，一次种植花粉供体，间隔5天分4批围绕种植花粉受体(此时■为花粉供体，○为花粉受体，○中的数字代表批次)；或一次种植花粉受体，间隔5天分4批围绕种植花粉供体(此时■为花粉受体，○为花粉供体，○中的数字代表批次体)。
S2：收集种子后，采用分步抽样法抽取所需种子用于基因漂移检测，具体如下：
S21：采用随机抽样的方法，从收获的种子中抽取20000粒种子；
S22：若得到的基因漂移率大于0.2％，则不必继续增加抽样量；
若得到的基因漂移率小于0.2％，则需再检测10000粒种子；在此基础上，若得到的基因漂移率大于0.05％，则不需要增加种子检测量；若得到的基因漂移率小于0.05％，还需再检测10000粒种子，直至得到的基因漂移率大于0.05％。
S3：对转基因水稻向杂草稻基因漂移率，即正向基因漂移率进行检测，具体如下：
S31：对收获的杂草稻种子打破休眠后进行发芽率检测，把装有100粒种子的培养皿放置于30℃光照培养箱培养7d，测定发芽率，试验重复4次，每种受体材料抽样方法采用S2所述的分步抽样法；
S32：根据作为标记基因的抗性基因，选择对应的抗性筛选方法；将经过筛选出来的幼苗移栽在育苗盘内培养至3叶期，采取叶片，进行分子检测；
S33：计算正向基因漂移率：正向基因漂移率＝(抗性种子数/检测种子总数/发芽率)×100％。
S4：对杂草稻向转基因水稻基因漂移率，即反向基因漂移率进行检测，具体如下：
S41：在抽取的样本中随机抽样60粒作为一组，并进行脱壳磨样；将脱壳磨样后的样品进行DNA提取；
S42：将提取到的DNA进行Rc基因检测，根据是否存在104bp和118bp的扩增片段，来判断该样品中是否存在杂草稻向转基因水稻漂移形成的杂交种；若存在104bp和118bp的扩增片段，则该组水稻中存在一粒由于杂草稻花粉漂移到转基因水稻种子产生的杂交种子；
S43：重复步骤S41～S42，直至样本全部检测完；并计算反向基因漂移率：反向基因漂移率＝(发生基因漂移的粒数/样本总粒数)×100％。
S5：统计正向基因漂移率和反向基因漂移率，最终得出基因漂移率：基因漂移率＝(正向基因漂移率+反向基因漂移率/2)×100％。
实施例1
一种杂草稻向转基因水稻基因漂移率(反向基因漂移率)的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用随机抽样的方法，从收获的转基因水稻种子中抽取20000粒种子。
(2)在抽取的20000粒样本中随机抽样60粒，并进行脱壳磨样，过60目筛；
取0.5mL样品(0.342～0.377g)进行DNA提取；
将提取到的浓度为39.8～77.7μg/mL DNA进行Rc基因检测，根据是否存在104bp和118bp的扩增片段，来判断该样品中是否存在杂草稻向转基因水稻漂移形成的杂交种；如果存在104bp和118bp的扩增片段，则该组水稻中存在一粒水稻种子发生基因漂移；
所述Rc基因扩增引物序列为：
上游引物：5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′；
下游引物：5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′。
Rc基因扩增的PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 4μL，ddH2O 3.5μL，上、下游引物各0.25μL，DNA2μL。2×Taq PCR Mix成分为dNTP 0.2mmol/L each、KCl 100mmol/L、Tris-HCl(pH＝8.5)20mmol/L、Taq Polymerase 5U/100μL、MgCl2 3.0mmol/L。
PCR反应程序：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，降温至4℃，结束反应后用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色照相。
(3)重复步骤(2)直至20000粒全部检测完；并计算杂草稻向转基因水稻基因漂移率(反向基因漂移率)：
反向基因漂移率＝发生基因漂移的粒数/检测的总粒数；
(4)若得到的基因漂移率高于0.2％，则不必继续增加抽样量；
若得到的漂移频率小于0.2％，则需再随机抽取10000粒种子，重复步骤(2)；
(5)若漂移频率小于0.05％，还需再检测10000粒种子，重复步骤(2)。
Rc基因检测法适用于杂草稻向其他水稻如小RNA干扰、基因编辑等发生的基因漂移；分步抽样法同样适用于用小RNA干扰、基因编辑等方法改造过的水稻与杂草稻或栽培稻之间发生的基因漂移。
实施例2模拟转基因水稻抗性基因漂移后杂交种以及杂草稻的花粉漂移到转基因水稻后形成的杂交种在转基因水稻后代种子中的空间分布型
用常规水稻作为实验材料，从中挑选出大小一致的水稻用红墨水染色，代替转基因水稻。按照染色水稻与非染色水稻混杂比例(重量比)2.5％、1.25％、0.8％、0.625％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.025％，总量10kg，模拟在收获、运输和储藏过程中可能导致两种水稻混杂的因素，将混合水稻翻转30次后，取样，样本量占总量的20％，即2kg。将取样的水稻摊开铺平，每隔10cm×10cm面积，共50格，统计该面积内染色水稻数量。每个基因漂移率均设置4个重复，分别采用平均拥挤度与平均密度之比、方差均值比、Morisita指数检验、χ2检验检测判定该比例水稻分布类型。
染色水稻与非染色水稻混合后的聚集度指标结果见表1。在供试的11个染色水稻和非染色水稻混合比例即0.025％～2.5％下，平均拥挤度与平均密度之比m*/m为0.985～0.1004，均近似于1，根据m*/m＝1为随机分布的原则，可以判断染色水稻在非染色水稻中的空间分布型为随机分布；方差均值比V/X的值为0.951～1.201，Morisita指数Iδ值为0.948～1.004，均近似于1，根据V/X＝1和Iδ＝1为随机分布的原则，也证明在染色水稻在非染色水稻中的空间分布型为随机分布。卡方检测的计算值为46.067～57.398，均小于理论卡方值65.171，根据卡方检测的原则也可知染色水稻在非染色水稻中为随机分布。因此应用种群空间分布型聚集度指标，推断转基因水稻抗性基因漂移或杂草稻向转基因水稻基因漂移后形成的杂交种通过收获混杂在花粉受体种子中的空间分布型为随机分布。
表1染色水稻与非染色水稻混杂后的聚集度指标
Figure GDA0003642578600000111
表1中：m、X：各区红色染色水稻粒数的平均值；m*：各区红色染色水稻粒数的平均拥挤度；V：各区红色染色水稻粒数的方差；Morisita指数：各区红色染色水稻粒数的Morisita指数；χ2检验的计算值：各区红色染色水稻粒数的卡方值；理论卡方值：根据自由度和显著性水平查找卡方检测临界值表。
实施例3转基因水稻基因漂移率检测的最佳抽样量的确定
将染色水稻与非染色水稻按照0.025％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％比例(重量比)混合后，模拟在收获、运输、储藏过程中可能导致两种水稻混匀的因素，将混合水稻翻转30次，根据测量的该水稻种子千粒重(26.1123+0.0820g)，随机从总量10kg的水稻中，称取5000粒、10000粒、20000粒、30000粒、40000粒、50000粒重量的种子，并统计染色水稻数量，重复16次，之后以染色水稻与非染色水稻的模拟的漂移率和抽样得到的漂移率的偏离系数小于0.05为标准，确定不同混杂比下的最佳抽样量。在染色水稻和非染色水稻不同混合比下，随着抽样量的增加，实际混合比和抽样得到的混合比的偏离系数变小，抽样得到的混合比也越接近实际混合比。
从图3和表2可知，在染色水稻种子和非染色水稻种子不同混杂比下，随着抽样量的增加，实际混杂比和抽样得到的混杂比的偏离系数变小，抽样得到的混杂比也越接近实际混杂比。在实际混杂比为0.025％，抽样量为5000～30000粒时，抽样得到的混杂比为0.0213％～0.0248％，与实际混杂比的偏离系数为0.1008％～0.799％，均大于0.05％；抽样量为40000～50000粒时，抽样得到的混杂比为0.0245％～0.0254％，与实际混杂比的偏离系数为0.0448％～0.0444％，均小于0.05％，因此推断基因漂移频率为0.025％时，最少需要抽取40000粒种子才能检测出在田间发生的漂移频率。
在染色水稻种子和非染色水稻种子混杂比为0.05％～0.1％，抽样量为5000～20000粒时，抽样得到的混杂比与实际混杂比的偏离系数为0.0892％～0.6995％，均大于0.05％；抽样量为30000～50000粒时，抽样得到的混杂比与实际混杂比的偏离系数为0.0059％～0.049％，均小于0.05％，因此推断基因漂移频率为0.05％～0.1％时，最少需要抽取30000粒种子才能检测出在田间发生的漂移频率。
在染色水稻种子和非染色水稻种子实际混杂比为0.2％～0.5％，抽样量为5000～10000粒时，抽样得到的混杂比与实际混杂比的偏离系数为0.0.0618％～0.2478％，均大于0.05％，抽样量为20000～50000粒，抽样得到的混杂比与实际混杂比的偏离系数为0.0072％～0.0433％，均小于0.05％，可以推断基因漂移频率为0.2％～0.5％时，最少需要抽取20000粒种子才能检测出在田间发生的漂移频率。
表2染色水稻与非染色水稻在不同抽样量下抽样得到的混合比和偏离系数
Figure GDA0003642578600000131
表2中：实际混合比：染色水稻数量在非染色水稻中的所占比例。
实施例4 2mL离心管反应体系下检测方法的建立
将杂草稻和转基因水稻种子脱壳后按照数量比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100混合，每个比例设置10个重复，混杂比为1:10～1:50的混合样品在研钵中加入液氮研磨，1:60～1:100的混合样品使用广东小熊电器有限公司提供的磨豆机(型号MDJ-D4072)研磨，将颖果磨成粉末(过60目标准检测筛)，并称量每个比例的粉末重量，计算各个混合样品粉末的平均重量。各混合比下均在2mL离心管中加入0.5mL体积的磨样粉末，称量0.5mL体积的不同混合比磨样粉末的重量，如混合磨样的样品不足0.5mL时，则该混合比例下的样品重量不用于计算样品的平均重量，超过0.5mL的所有样品用于计算样品的平均重量，作为提取混合磨样样品DNA时的样品质量，由表3结果可知，当杂草稻与转基因水稻的混合比为1:20～1:100时，均从磨好的样品粉末中称取0.342g～0.377g用于提取DNA。
表3WRYY和T1c-19不同混合比下样品总质量和0.5mL样品质量
Figure GDA0003642578600000141
提取DNA所用试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)。DNA提取后对不同混合比例下的DNA进行浓度测定，每个混合比例随机选取10个重复，统计不同混合比下的DNA的浓度，由表4结果可知，杂草稻与转基因水稻在1:20～1:100混合比时，混合样品所提取的DNA浓度范围为51.8+12μg/mL～58.6+19.1μg/mL，且不同混杂比下提取的DNA浓度没有显著性差异，表明浓度范围的39.8～77.7μg/mL的DNA可以用于Rc基因的检测。
表4 WRYY和T1c-19不同混合比下0.5mL样品的DNA浓度
Figure GDA0003642578600000151
对提取的DNA进行Rc检测，每个混合比设置40个重复。鉴别杂草稻红果皮基因Rc的引物RED4-For：5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′，RED4-Rev：5′-TCTTCTCCTCTCTT TCAGCAC-3′，为确定最佳混合磨样量，根据设计的特异性引物RED4对杂草稻和转基因水稻T1c-19不同混合比下磨样样品0.5mL体积的总DNA进行扩增。以杂草稻作为阳性对照，转基因稻作为阴性对照，电泳结果显示，在混合比1:10、1:20、1:30、1:40(图4)、1:50(图5)、1:60(图6)、1:70(图7)时均能检测到118bp和104bp两条扩增条带，这说明在这些混合比下均可以检测到杂草稻的Rc基因。当混合比为1:80(图8)、1:90、1:100时均只能检测到104bp一条扩增条带，即只能检测到转基因水稻，不能检测到杂草稻的Rc基因，如图8所示，图8中所有泳道均未能形成118bp扩增条带。由表5结果可知，当混合比为1:10、1:20、1:30、1:40时，检测到Rc基因的概率为100％，如图4所示，图4(a)、图4(b)中所有泳道均形成了118bp扩增条带；混合比为1:50时检测到Rc基因的概率为97.5％，如图5所示，图5(a)中所有泳道均形成118bp扩增条带，图5(b)中泳道7未能形成118bp扩增条带；混合比为1:60时检测到Rc基因的概率为92.5％，如图6所示，图6(a)中泳道16未能形成118bp扩增条带，图6(b)中泳道3、7未能形成118bp扩增条带；混合比为1:70时检测到Rc基因的概率为40％，如图7所示，图7(a)、图7(b)中共有24个泳道未能形成118bp扩增条带。虽然前7个混合比均能检测到其中的杂草稻Rc基因，但考虑到时间和成本及结果的准确性，将60粒作为杂草稻向转基因水稻基因漂移时检测收获的转基因水稻种子中是否有杂交种时的混合磨样数量。
表5 WRYY与T1c-19在不同混合比下0.5mL样品提取的DNA中检测到Rc基因的次数和概率
Figure GDA0003642578600000161
通过从装有30000粒转基因水稻和150粒红色杂草稻的网袋中盲数60粒种子，发现所有的60粒种子中都只有一粒红墨水染色过的杂草稻，不存在抽60粒种子中有2粒及以上的杂草稻种子，所以随机抽取60粒种子中含有2粒及以上的杂草稻种子的可能性几乎为零。因此可以认为最佳磨样量60粒能够真实的检测出杂草稻向转基因水稻的基因漂移率。
表6 Rc基因扩增引物序列及扩增产物大小
Figure GDA0003642578600000171
Rc基因的扩增引物序列及扩增产物大小如表6所示。
PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 4μL，ddH2O 3.5μL，上、下游引物各0.25μL，DNA2μL。PCR反应程序：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，降温至4℃，结束反应后用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色照相。其中2×Taq PCR Mix成分为dNTP 0.2mmol/L each、KCl 100mmol/L、Tris-HCl(pH＝8.5)20mmol/L、Taq Polymerase 5U/100μL、MgCl2 3.0mmol/L；PCR反应由TAKARA(TaKaRaPCR Thermal cycler)热循环仪完成。电泳仪(DYY-6D型)由北京市六一仪器厂提供，电泳条件为220V，1h。
实施例5杂草稻花粉压下转基因杂交水稻向抗性杂草稻的快速演化
以3种抗草铵膦转基因水稻(×)86B、Bar68-1和T1c-19作为花粉供体，杂交水稻(●)6两优9368、Ⅱ优98及其各自的F2代(▲)被用作花粉受体，两两组合(共12个组合)进行基因漂移试验，每个组合重复4次，每个重复设置60株花粉受体，每种组合的小区示意图如图9所示。材料采用移栽的栽培方式，株距25cm，行距30cm。
成熟后在每棵不育株中取1个稻穗用于测定基因漂移率。成熟期收取各花粉受体的种子，抽取不少于总种子量的10％采用的方法进行抗草铵膦异交后代的检测，并计算基因漂移率。
实验结果表明，杂交稻后代群体中出现类杂草稻植株，利用基于红果皮基因、野败型细胞质不育基因、抗草铵膦基因的分子标记对类杂草稻进行检测。结果发现所有这些类杂草稻材料都含有杂合的Rc红果皮基因，说明红色果皮性状是由于存在的Rc基因所致。所有类杂草稻植株都含有抗草铵膦Bar基因；取自种植F3－ⅡU86B、F4－ⅡU86B田中的类杂草稻材料都含有野败型细胞质不育基因WA352；而取自种植F3-X125B、F4-X125B田中发现的类杂草稻都不含该细胞质基因。说明类杂草稻植株都具有作为杂草稻的显著红色果皮性状，对草铵膦具有抗性，且其原始母本是以各自小区的转基因杂交水稻后代。
在同质园种植条件下通过测定10项营养及生殖性状指标计算得到的相对适合度结果显示，大部分类杂草稻组的相对适合度是高于其原始母本和各种潜在的原始父本的。两种来源的类杂草稻组的平均落粒性及平均株高也均显著高于作为原始母本的转基因杂交水稻的。以上这些证据说明类杂草稻的后代完全有演化成为有抗性的新类型的杂草稻的潜力。
实施例6转基因水稻T2A-1与杂草稻基因漂移的研究
隔行种植：根据前期试验已经掌握了试验材料的生育期。由于3种杂草稻的开花早于T2A-1和MH63，为保证供试杂草稻与T2A-1花期重叠时间最大，将T2A-1和MH63提前育秧，5d后再对杂草稻进行育秧。所有试验材料的育秧过程均是将试验材料的种子提前在水中浸泡2～3d(期间每天早晚各换一次水)，之后用纱布包裹对种子进行催芽，待种子萌发后将种子撒入育秧田中，并在种子表面覆上一层薄土，之后进行正常管理。30d后选择大小一致的水稻秧苗移栽进各小区，一株一穴。每小区的面积为15m2(5m×3m)，即每个小区移栽10行，每行26株。小区之间间隔1m，每处理4次重复。如图1所示，转基因水稻T2A-1(●)和杂草稻(×)隔行种植，移栽行的方向与当地盛行风向垂直，即南北方向，之后，每间隔5天种植一批，共4批。
正向包围种植：如图2所示，将T2A-1(■)种植1批，杂草稻(○)种植4批，每批间隔5d，○中的数字代表批次，●为隔离行作物。选择大小一致的秧苗进行移栽，一株一穴。株距、行距分别为20cm、30cm。每一处理小区的面积为8m2(4m×2m)，即每个小区种植T2A-1共42株，4个批次的杂草稻分别共种植22株、44株、17株和14株。小区之间间隔1m，4次重复。转基因水稻T2A-1和杂草稻包围种植，移栽行的方向与当地盛行风向垂直，即南北方向。
反向包围种植：如图2所示，将杂草稻(■)种植1批，T2A-1(○)种植4批，每批间隔5d，○中的数字代表批次，●为隔离行作物。选择大小一致的秧苗进行移栽，一株一穴。株距行距分别为20cm、30cm。每一处理小区的面积为8m2(4m×2m)，即每个小区种植杂草稻共42株，4个批次的T2A-1分别共种植22株、44株、17株和14株。小区之间间隔1m，4次重复。转基因水稻T2A-1和杂草稻包围种植，移栽行的方向与当地盛行风向垂直，即南北方向。
T2A-1向杂草稻及MH63的漂移率检测：将收获的花粉受体材料种子打破休眠(放入55℃烘箱5d)后，进行发芽率检测，把装有100粒种子的培养皿放置于30℃光照培养箱培养7d，测定每种花粉受体材料的发芽率，试验重复4次，作为计算基因漂移率的依据。每种受体材料选取50000粒种子，参照Song等(2011)的方法进行抗性筛选(Song et al.,2011)，重复4次。将待测花粉受体收获的种子用70％的乙醇溶液消毒30s，然后浸泡在无菌水中15min，吸干水后再用无菌水反复冲洗种子5次。将待测的种子置于两层滤纸的周转箱中，用浓度为40mg/L的草铵膦溶液浸泡，放在南京农业大学杂草研究室的温室内(温度约为25℃)培养10d后测量胚芽鞘的长度。若胚芽鞘长度大于2cm，则认为该幼苗携带有抗性基因。将筛选出来的幼苗移栽在育苗盘内培养至3叶期，采取叶片，进行Cry1C*、Bar基因的分子检测。
表7 Cry1C*、Bar基因扩增引物序列及扩增产物大小
Figure GDA0003642578600000191
Cry1C*、Bar基因扩增引物序列及扩增产物大小如表7所示。
PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，上、下游引物各1μL，DNA 1μL。PCR反应程序：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，降温至4℃，结束反应后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段。其中，2×Taq PCRMix成分为dNTP 0.2mmol/Leach、KCl 100mmol/L、Tris-HCl(pH＝8.5)20mmol/L、TaqPolymerase 5U/100μL、MgCl2 3.0mmol/L；PCR反应由TAKARA(TaKaRa PCR Thermalcycler)热循环仪完成。
对每种受体材料的种子进行抗性筛选时以转基因水稻作为阳性对照，杂草稻作为阴性对照，结果发现用浓度为40mg/L的草铵膦溶液浸泡10d后，转基因水稻的胚芽鞘能正常生长(长度大于2cm)，杂草稻的胚芽鞘不能正常生长(长度小于2cm)。2种种植方式下的花粉受体材料WRMM收获的种子均不能正常生长，胚芽鞘长度小于2cm，因此没有检测到T2A-1向WRMM的基因漂移。与T2A-1隔行种植的MH63、WRYY和WRTZ收获的种子中存活幼苗总数分别为332株、52株和68株。与T2A-1包围种植中WRTZ、WRYY收获的种子存活幼苗数分别为75株和97株。
根据设计的Cry1C*和Bar基因特异性引物对存活植株的总DNA进行扩增。电泳结果显示(如图10所示)，筛选出的抗性植株均有Bar基因(图10(a))的429bp扩增条带和Cry1C*基因(图10(b))的602bp扩增条带，和作为阳性对照的转基因水稻T1c-19扩增出来的条带一致。而作为阴性对照的杂草稻亲本没有发现扩增产物。从而进一步证明了受体收获的种子用草铵膦浸泡筛选出的存活植株携带了复合性状转基因水稻的Bar基因和Cry1C*基因。
根据基因漂移公式计算，在两种种植方式下，转基因水稻向WRMM均没有发生基因漂移。隔行种植下转基因水稻T2A-1向其受体水稻MH63、WRYY和WRTZ的漂移率分别为0.7595％、0.1387％和0.1103％，其中向MH63的基因漂移率显著高于向WRYY和WRTZ的漂移率，T2A-1向WRYY的基因漂移率显著高于T2A-1向WRTZ的基因漂移率。包围种植下T2A-1向WRYY和WRTZ的漂移率分别为0.2065％和0.1538％，且T2A-1向WRYY的漂移率也显著高于T2A-1向WRTZ的漂移率。
杂草稻向T2A-1基因漂移率的检测：根据T2A-1向杂草稻的基因漂移率，采取分布抽样法，将隔行种植和包围种植方式下收获的T2A-1种子充分混匀，每个区取30000粒种子，将这30000粒种子脱壳后。采用杂草稻向转基因水稻的基因漂移率的检测方法进行检测。采用高盐法提取DNA。参照张富丽等(2011)提取水稻种子DNA方法进行DNA提取，具体DNA提取步骤如下：
(1)将磨成粉末的样品取0.5mL装入2mL离心管中，加入400μL 65℃预热的DNA提取缓冲液(0.4mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，5mmol/LEDTA pH＝8.0，20μg/mLDAase-free RNase A)，将离心管震荡几次使粉末与DNA提取缓冲液充分混匀；
(2)再加入40μL 20％SDS和300μL 6mol/L NaCl，充分混匀，65℃预热30min(SY-1220恒温水浴槽)，每10min轻轻颠倒振荡一次促进细胞裂解，然后在室温下14000g离心10min；
(3)取上清液转入灭过菌的2mL离心管中，再加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀后室温下放置5min，12000g离心10min；
(4)取上清液，再加入等体积氯仿和2倍体积异丙醇，-20℃放置30min后，4℃12000g低温离心5min；
(5)弃上清液，加入1mL 70％乙醇，静置2～3min，4℃12000g低温离心3min，弃上清液，重复2次；
(6)室温放置数1h晾干后，加入300μL TE buffer(10mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，1mmol/L EDTA pH＝8.0)溶解，放置-20℃保存。
结果显示，2种种植方式下与WRTZ混种的T2A-1植株上收获的种子均只检测到一条104bp的扩增条带。在T2A-1植株上收获的3000粒种子进行的500次检测中，同时能检测到104bp和118bp条扩增条带的次数分别为：隔行种植下，与WRYY混种的有22次；与WRMM混种的T2A-1有17次；在包围种植下，与WRYY混种的有42次；与WRMM混种的有26次。
根据基因漂移率公式计算得出：两种种植方式下WRTZ向T2A-1均没有发生基因漂移；隔行种植下WRYY和WRMM向T2A-1的漂移率分别为0.0725％和0.055％；包围种植下WRYY和WRMM向T2A-1的漂移率为0.1408％和0.0867％。在两种种植方式下，WRYY向T2A-1的基因漂移率均显著高于WRMM向T2A-1的基因漂移率。
当将正向漂移包围种植的花粉供体所结种子，同上述方法进行红皮Rc基因检测，所获的漂移频率结果与反向漂移包围种植的漂移频率类似，WRYY和WRMM向T2A-1的漂移率为0.106％和0.0941％。另外，将反向漂移包围种植的花粉供体所结种子，同上述方法进行抗性及其抗性基因检测，所获的漂移频率结果与正向漂移包围种植的漂移频率类似，T2A-1向WRYY和WRTZ的漂移率分别为0.124％和0.168％。这表明，包围种植下，正反向基因漂移检测均可。
本发明并不限于以上实施例，还可以有许多变形。分步抽样法同样适用于用小RNA干扰、基因编辑等方法改造过的水稻与杂草稻或栽培稻之间发生的基因漂移。Rc基因检测法仅适用于杂草稻向其他水稻如小RNA干扰、基因编辑等发生的基因漂移。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttacagggga gcagaaaca 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcttctcctc tctttcagca c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttctactggg gaggacatcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggtatcttc gggtgattgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaccatcgt caaccactac 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccagaaacc cacgtcat 18

Claims (9)

1.一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：通过分期将转基因水稻与杂草稻分别作为花粉供体和受体通过隔行种植或包围种植的方式混种；
当采用隔行种植时，分别收集转基因水稻后代种子与杂草稻后代种子；
当采用包围种植时，只需收集作为花粉受体的后代种子；
S2：收集种子后，采用分步抽样法抽取所需种子用于基因漂移检测，具体如下：
S21：采用随机抽样的方法，从收获的种子中抽取20000粒种子；
S22：若得到的基因漂移率大于0.2％，则不必继续增加抽样量；
若得到的基因漂移率小于0.2％，则需再检测10000粒种子；在此基础上，若得到的基因漂移率大于0.05％，则不需要增加种子检测量；
若得到的基因漂移率小于0.05％，还需再检测10000粒种子；在此基础上，若得到的基因漂移率大于0.025％，则不需要增加种子检测量；
S3：对转基因水稻向杂草稻基因漂移率，即正向基因漂移率进行检测，具体如下：
S31：对收获的杂草稻种子打破休眠后进行发芽率检测，把装有100粒种子的培养皿放置于30℃光照培养箱培养7d，测定发芽率，试验重复4次，每种受体材料抽样方法采用S2所述的分步抽样法；
S32：根据作为标记基因的抗性基因，选择对应的抗性筛选方法；将经过筛选出来的幼苗移栽在育苗盘内培养至3叶期，采取叶片，进行分子检测；
S33：计算正向基因漂移率：正向基因漂移率＝[抗性种子数/(检测种子总数×发芽率)]×100％；
S4：对杂草稻向转基因水稻基因漂移率，即反向基因漂移率进行检测，针对的反向基因漂移率小于0.5％时，具体如下：
S41：基于S2所述的分步抽样法，在抽取的转基因水稻种子样本中随机抽样60粒作为一组，并进行脱壳磨样；将脱壳磨样后的样品进行DNA提取；
S42：将提取到的DNA利用Rc基因的扩增引物进行Rc基因检测，根据是否存在104bp和118bp的扩增片段，来判断该样品中是否存在杂草稻向转基因水稻漂移形成的杂交种；若存在104bp和118bp的扩增片段，则该组水稻中存在一粒由于杂草稻花粉漂移到转基因水稻种子产生的杂交种子；
所述Rc基因的扩增引物序列为：
上游引物：5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′；
下游引物：5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′；
S43：重复步骤S41～S42，直至样本全部检测完；并计算反向基因漂移率：反向基因漂移率＝(发生基因漂移的粒数/样本总粒数)×100％；
S5：统计正向基因漂移率和反向基因漂移率，最终得出基因漂移率：基因漂移率＝(正向基因漂移率+反向基因漂移率/2)×100％。
2.根据权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述隔行种植为：在转基因水稻间，间隔5天分4批移栽隔行种植杂草稻；所述包围种植为：一次种植花粉供体，间隔5天分4批围绕种植花粉受体；或一次种植花粉受体，间隔5天分4批围绕种植花粉供体。
3.根据权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，所述步骤S41中：将转基因水稻种子脱壳磨样后过60目筛，进行DNA提取的样品体积为0.5mL，样品重量为0.342～0.377g，DNA浓度为39.8～77.7μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，所述步骤S42中，Rc基因扩增的PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 4μL，ddH2O 3.5μL，上、下游引物各0.25μL，DNA 2μL；其中，2×Taq PCR Mix成分为：dNTP 0.2mmol/L each、KCl100mmol/L、Tris-HCl 20mmol/L、Taq Polymerase 5U/100μL、MgCl2 3.0mmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，所述步骤S42中，Rc基因扩增的PCR反应程序为：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，降温至4℃，结束反应后用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色照相。
6.权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法在基因漂移检测中的应用，其特征在于，将步骤S2所述分步抽样法应用于采用小RNA干扰改造过的水稻与杂草稻或栽培稻之间发生的基因漂移。
7.权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法在基因漂移检测中的应用，其特征在于，将步骤S2所述分步抽样法应用于采用基因编辑改造过的水稻与杂草稻或栽培稻之间发生的基因漂移。
8.权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法在基因漂移检测中的应用，其特征在于，将步骤S42所述Rc基因检测应用于杂草稻向采用小RNA干扰改造过的水稻发生的基因漂移。
9.权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法在基因漂移检测中的应用，其特征在于，将步骤S42所述Rc基因检测应用于杂草稻向采用基因编辑改造过的水稻发生的基因漂移。
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