CN111542600A

CN111542600A - 植物病原微生物的病毒介导的生物防治

Info

Publication number: CN111542600A
Application number: CN201880081389.3A
Authority: CN
Inventors: M·E·E·E·哈利法; R·M·麦克迪尔米德
Original assignee: New Zealand Insitiute for Plant and Food Research Ltd
Current assignee: New Zealand Insitiute for Plant and Food Research Ltd
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-08-14
Also published as: WO2019123349A1; EP3728569A1; AU2018392973A1; US20200323218A1; EP3728569A4

Abstract

本发明涉及DNA真菌病毒的分离菌株或其简并菌株，分离的低毒性真菌菌株或其部分，以及DNA真菌病毒的分离菌株或低毒性真菌菌株或其部分作为生物防治剂的用途。还提供了使用DNA真菌病毒和低毒性真菌菌株来生物防治植物病原微生物，特别是真菌的方法和组合物。

Description

植物病原微生物的病毒介导的生物防治

技术领域

本发明总体上涉及使用病毒，特别是真菌病毒，用于植物病原微生物(特别是真菌)的生物防治方法。具体地，本发明涉及具有生物防治活性的新型真菌病毒株，并且涉及使用病毒株抑制植物或其部分上的植物病原微生物，特别是真菌的存活、生长和/或增殖的方法。

背景技术

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，不同于大多数其它限制于某些宿主的葡萄孢属，是普遍存在的子囊菌(asomycetic)植物病原体(Elad等人，1996)，它能够感染新西兰和世界范围内广泛的宿主物种。据报道该真菌在新西兰(Pennycook 1989)具有超过100种宿主，在世界范围内具有超过230种宿主(Jarvis 1977)。它引起几种收获前和收获后的疾病，包括灰霉病，叶枯病，花枯病，成串腐烂病和收获后果实腐烂(Jarvis1977；elad等人2004)，其中灰模最常见。

在世界范围内，据估计，灰葡萄孢菌导致的葡萄作物损失每年高达20亿美元(Elmer&Michailides，2007)，病原是降低产量和质量的葡萄孢菌丛腐病(Botrytis bunchrot)(Bulit&Dubos，1988)，。在2002年，$NZ 9900000是估计的葡萄作物损失，对葡萄酒行业价值的潜在损失为$NZ 49000000(Beresford 2005)。最常见的是通过施用杀真菌剂来化学控制灰葡萄孢菌。然而，这种施用杀真菌剂的做法由于它们的高成本、它们对环境的有害影响(Rocha&Oliveira 1998)和宿主真菌产生杀真菌剂抗性的能力而受到越来越多的关注(Williamson等人，2007)。因此，需要其它防治真菌疾病的方法。

本发明的一个目的是提供至少一种病毒生物防治剂和/或包含至少一种病毒生物防治剂的组合物和/或使用这种药剂和/或这种组合物来防治至少一种植物或其部分上的至少一种植物病原真菌的方法，优选地其中真菌是葡萄孢真菌(Botrytis spp.)；和/或至少为公众提供有用的选择。

在已经参考专利说明书、其他外部文献或其他信息源的本说明书中，这通常是为了提供用于讨论本发明的特征的上下文。除非另外明确说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何权限范围内是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。

发明内容

在一个方面，本发明涉及一种分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其编码至少一种多肽，所述至少一种多肽与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的群组中的多肽具有至少70％的氨基酸序列同一性。

在另一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成群组中的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性。

另一方面，本发明涉及一种分离的核酸序列，其编码本发明的分离的多肽。

在另一方面，本发明涉及一种分离的核酸序列，其与SEQ ID NO:1具有至少70％的核苷酸序列同一性。

在另一方面，本发明涉及一种分离的DNA真菌病毒，其包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO:1或其简并菌株具有至少70％的核苷酸序列同一性。

在另一方面，本发明涉及一种分离的DNA真菌病毒，其包含SEQ ID NO:1或其简并菌株。

在另一方面，本发明涉及一种介体，其包含根据本发明的核酸序列。

在另一方面，本发明涉及分离的宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸序列，介体，多肽或DNA真菌病毒或其简并菌株。

在另一方面，本发明涉及低毒性真菌菌株或其部分，其包含本发明的分离的核酸序列，介体，多肽或DNA真菌病毒或其简并菌株。

在另一方面，本发明涉及组合物，其包含本发明的分离的核酸序列，介体，多肽，DNA真菌病毒或其简并菌株，分离的宿主细胞，低毒性真菌菌株或其部分，或其组合，以及载体，稀释剂或赋形剂。

在另一方面，本发明涉及一种降低至少一种植物病原真菌的毒性的方法，其包含使真菌与本发明的分离的DNA真菌病毒或其简并菌株接触。

在另一方面，本发明涉及一种葡萄孢真菌的生物防治方法，其包含使至少一种葡萄孢真菌与分离的DNA真菌病毒或其简并菌株接触。

在另一方面，本发明涉及治疗至少一种由植物病原真菌引起的植物病害的方法，其包含使植物与本发明的分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，或本发明的低毒性真菌菌株或其部分，或两者接触。

在另一方面，本发明涉及一种防治至少一种植物病原真菌的方法，其包含使真菌与本发明的分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，或本发明的低毒性真菌菌株或其部分，或两者接触。

在另一方面，本发明涉及一种分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其用于防治至少一种植物病原真菌菌株。

在另一方面，本发明涉及用于一种分离的低毒性真菌细胞或其部分，其用于防治至少一种植物病原真菌菌株。

在另一方面，本发明涉及分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其用于防治葡萄孢属真菌。

虽然本发明的某些方面的各种实施例可以在上面提出，但是本发明不限于此。在本申请的具体实施方式中进一步描述并且在权利要求书中陈述了上述本发明各方面的附加实施例。

本发明的其它方面和实施例可以根据以下仅通过示例并参考附图给出的描述中变得容易理解。

本文公开的数字范围(例如，1至10)还旨在包括该范围内的所有有理数(例如，1，1.1，2，3，3.9，4，5，6，6.5，7，8，9和10)以及该范围内的有理数的任何范围(例如，2至8，1.5至5.5，以及3.1至4.7)，因此，本文明确公开了本文明确公开的所有范围的所有子范围。这些仅仅是具体意图的示例，并且在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合被认为以类似的方式在本申请中明确地陈述。

附图说明

现在将仅通过示例并参考附图来描述本发明，在附图中：

图1是在不同DNA池中对根据在Varsani和Krupovic，2017，病毒进化3(1):vew 037中建立的类双生病毒科(Genomoviridae)的命名法建议的Botrytis gemydayravirus 1(BGDaV1)进行PCR检测。存在于不同的DNA库中。M：1kb⁺DNA分子量标记(Invitrogen)；W：水阴性对照。

图2(A)是在透射电子显微镜下观察到分离物339-13中的病毒颗粒。Bar＝200nm。(B)与分离物339-13和339-42相关的环状DNA的EcoRV消化的RCA产物。(C)分离自分离物339-13的纯化病毒样颗粒(VLP)的病毒核酸(DNA)。(D)BGDaV1的基因组组织的示意图。(E)BGDaV1和其它环状ssDNA序列的Rep AA序列比对用于识别BGDaV1 Rep保守基序。

图3是BGDaV1和其它选择的环状ssDNA病毒之间的系统发育关系。使用MUSCLE对所推导的Rep的AA序列进行多重序列比对。使用MEGA 7软件，使用LG模型结合跨位点的γ-分布速率来显示最大似然树。100次复制的自举分析结果用分支上的数字表示。

图4是含BGDaV1的分离物的DsRNA图谱。M：1kb⁺DNA分子量标记(Invitrogen)。

图5是在卡诺拉(canola)的分离叶上生长的不同处理的灰葡萄孢菌分离物之间的病变直径比较。在处理702中，使用无病毒分离物702的菌丝体栓接种卡诺拉的分离叶。在处理702-V101和702-V49中，用分别从分离物339-101和339-49纯化的VLP机械接种无病毒分离物702，并用新感染的后代接种卡诺拉的分离叶。在处理702-Vmix中，将从真菌分离物339-13、339-49和339-101纯化的VLP混合物滴施用于卡诺拉的分离叶上，然后用无病毒分离物702的菌丝体栓接种。在每次处理中复制三次的4至5天温育期后进行病变直径测量。不同的字母表示显著不同的(P<0.050)处理。

图6是在仙客来叶上用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)或生长在PDA上的接种物的栓接种4天(测定1)或接种5天(测定2)后，用BGDaV1感染或未感染的灰葡萄孢菌生长的示例。PDA接种没有导致疾病。葡萄孢菌，无病毒(仅灰葡萄孢菌)，导致疾病症状，其包括超过接种栓边缘(测定1)或在接种栓内(测定2)的叶组织的棕色变色。葡萄孢菌21918，葡萄孢菌21919，葡萄孢菌21220以及葡萄孢菌21921减少疾病表达，特别是在测定1，菌株葡萄孢菌21918和葡萄孢菌21919中。

图7是用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)或生长在PDA上的接种物的栓在草莓叶(两个栽培种)上接种6天(测定1)后，感染或未感染BGDaV1的灰葡萄孢菌的生长的示例。每个栽培种只显示一个叶。PDA接种导致没有葡萄孢菌生长。葡萄孢菌，无病毒(仅灰葡萄孢菌)，导致多产的白色菌丝体生长超过有时到达边缘叶的接种栓的边缘(超过1cm)。葡萄孢菌21918，葡萄孢菌21919，葡萄孢菌21220和葡萄孢菌21921减少葡萄孢菌生长；或者在接种栓之外没有观察到葡萄孢菌丝体生长，或者葡萄孢菌丝体生长达到小于离接种栓0.5cm的最大值。

图8是用生长在无病毒或感染BGDaV1的PDA上的接种物栓在猕猴桃叶上接种5天(测定2)后感染或未感染BGDaV1的灰葡萄孢菌生长的示例。PDA接种导致没有葡萄孢菌生长。葡萄孢菌，无病毒(仅灰葡萄孢菌)，导致接种栓周围的一些葡萄孢菌丝体生长和褐色变色病变。葡萄孢菌21918，葡萄孢菌21919，葡萄孢菌21220和葡萄孢菌21921导致接种栓周围几乎没有或没有可见病变。

图9是用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)或生长在PDA上的接种物的栓在A)葡萄浆果(切割或未切割)上接种4天(测定1)后感染或未感染BGDaV1的灰葡萄孢菌生长的示例。将3个未接种的葡萄加入切开的葡萄测定中以识别任何污染(灰色框)。b)为了评估灰葡萄孢菌对浆果的穿透性，在接种后天数(dpi)7天将浆果切成两半。箭头表示葡萄浆果内完整性丧失的位置。在测定1中，鲜葡萄未预切开，BGDaV121918感染分离物，4dpi，BGDaV1感染的灰葡萄孢菌导致比无病毒的灰葡萄孢菌更慢的生长(图3A)。此外，当葡萄在7dpi下切成两半时，与接种了BGDaV1感染的灰葡萄孢菌的葡萄(它们较硬并保持它们的形状)相比，用无病毒的灰葡萄孢菌接种的葡萄分离物通常具有松散的葡萄完整性(与葡萄丛腐病相似的表型)，葡萄较软，并且显著地变形。

图10是用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)或生长在PDA上的接种物的栓在A)葡萄浆果(切开或未切开)上接种4天(测定2)后感染或未感染BGDaV1的灰葡萄孢菌生长的示例。将未接种的葡萄置于处理的葡萄之间(灰色框)。B)为了评估灰葡萄孢菌对浆果的穿透性，在7dpi时将它们切成两半。箭头表示葡萄浆果内完整性丧失的位置。无病毒的灰葡萄孢菌接种的葡萄在切成两半时失去形状。相比之下，接种了病毒感染的灰葡萄孢菌(葡萄孢菌21918、21919和21920)的葡萄保持它们的形状和坚固的质地。

具体实施方式

定义

给出以下定义以更好地定义本发明，并作为本领域普通技术人员实施本发明的指导。

除非另外指明，否则本文所用的所有技术和科学术语应理解为具有与本公开所属相关领域的普通技术人员所理解的相同的含义。

在植物学、微生物学、分子生物学和生物化学中常见术语的定义的示例可见于植物生物学(Biology of Plants)，Raven等人，W.H.Freeman and Company，(2005年)；植物生理学(Plant Physiology)，Taiz等人，Sinauer Associates,Incorporated，(2010年)；植物学：植物生物学概论(An Introduction to Plant Biology)，J.D.Mauseth，Jones&Bartlett Learning，(2003年)；普通和分子微生物学方法(Methods for General andMolecular Microbiology)，第三版，C.A.Reddy等人编辑，ASM Press，(2008年)；微生物学百科全书(Encyclopedia of Microbiology)，第2版，Joshua Lederburg编辑，美国学术出版社，(2000年)；微生物学(Microbiology)，Cliffs Notes，I.Edward Alcamo，Wiley编著(1996)；微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology)，Singleton等人(第2版)(1994年)；Brock等人，Pearson Prentice Hall，(2006年)；真菌的生物多样性：详细目录和监测方法(Biodiversity of Fungi:Inventory andMonitoring Methods)，Mueller等人，美国学术出版社，(2004年10月)；基因IX(Genes IX)，Benjamin Lewin，Jones&Bartlett Publishing，(2007年)；分子生物学百科全书(Jones&Bartlett Publishing)，Kendrew等人编辑，Blackwell Science Ltd.(1994)；以及分子生物学和生物技术：全面的案头参考文献(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference)，Robert A.Meyers编辑，VCH Publishers,Inc.，(1995年)

还相信本发明的实施可以使用本领域已知的标准植物学，微生物学，分子生物学和生物化学方案和程序进行，以及例如在如下中描述的：环境微生物学：方法和协议(Environmental Microbiology:Methods and Protocols)，J.F.T.Spencer等人，HumanaPress,(2004)；Environmental Microbiology,P.D.Sharma,Alpha ScienceInternational,(2005)；环境微生物学(Environmental Microbiology)，J.R.Leadbetter,Gulf Professional Publishing,(2005)，以及本公开所属领域中相关的其它通常可获得的参考材料，其全部通过引用整体并入本文。

本说明书中使用的术语“包含(comprising)”是指“至少部分由……组成”。当解释本说明书中包括术语“包含”的每个陈述时，也可以存在不同于该术语或由该术语开头的那些特征。相关术语例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”将以相同的方式解释。

如本文所用，术语“基本上由…组成”意指指定的材料或步骤以及实质上不影响所要求保护的发明的基本特征和新颖特征的那些。

如本文所用，术语“由……组成”意指所要求保护的发明的指定材料或步骤，排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。

如本文所用的术语“植物”涵盖来自植物生命周期的所有阶段的整个植物和植物的所有部分，包括但不限于营养和生殖细胞和组织、繁殖体、种子、胚、果实、芽、茎、叶、叶鞘和叶片、花序、根、花药、舌叶、细胞层、叶肉、表皮、耳片、托苞、外稃和分蘖。

本文所用的术语“生物防治剂”是指用作一种或多种植物病原体的拮抗剂的试剂。拮抗剂可以采取多种形式。在一种形式中，生物防治剂可以比病原体更能竞争宿主植物的可用营养物和/或空间。在另一种形式中，生物防治剂可以使环境对病原体不利。因此，拮抗剂机制包括但不限于低毒性、抗菌、菌寄生、营养竞争和物理移位。

术语“防治(control)”、“防治(controlling)”，“生物防治(biocontrol)”或“生物防治(biological control)”在本文中可互换使用，是指降低由一种或多种微生物或通过一种或多种微生物实现的病原体的接种物或疾病产生活性的量。通常包括预防或减少植物病原性细菌或真菌，特别是植物病原真菌(包括葡萄孢真菌)，特别是或抑制这样的感染的速率或程度，包括细菌或真菌的存活、生长和/或增殖的任何减少。还考虑了治愈性治疗。

如本文所用，术语“统计上显著的”是指结果或关系由除随机机会之外的某物引起的可能性。使用本领域已知和使用的统计假设检验可以发现结果是统计上显著的。统计假设检验提供了本领域已知的“P值”，其表示测量结果仅归因于随机机会的概率。认为本领域普遍接受的是，5％(0.05)或更低的显著性水平被认为是统计上显著的。

本文所用的术语“有效量”是指有效防止、延迟、减少、稳定、改善或治疗植物中和/或植物上的植物病原细菌或真菌感染的量。

如本文所用，短语“降低毒性”意指与不存在病毒相比，病毒的存在导致宿主真菌的较少或较慢生长，或宿主植物或其部分的疾病的较少或较慢发作。

本文所用的短语“低毒性真菌菌株或其部分”涵盖真菌菌株的细胞、菌丝、菌丝体，分生孢子、菌核、子囊和孢子，以及真菌菌株的细胞、菌丝、菌丝体，分生孢子、菌核、子囊和孢子的任何和所有部分。

如本文所用的“农业上可接受的助剂”是指在农业领域中通常理解为农业制剂中的有用添加剂或者用农业处理进行的化合物或材料。

如在此使用的“另外的活性剂”是指通过可用于本发明的DNA真菌病毒能够有助于防治(如在此定义的)植物病原真菌，特别是葡萄孢真菌的任何化合物或材料，或能够增强可用于本发明的DNA真菌病毒在防治由植物病原真菌，特别是葡萄孢真菌，但不限于此引起的植物病害中的作用的任何化合物或材料。

本文所用的“配制剂”是指促进或优化本发明的组合物或用于本发明在植物上的生产、处理、储存、运输、施用和/或持久性的任何化合物或材料(如本文所定义)，但不限于此。

本申请使用本领域通常理解的“农业上可接受的载体(carrier)”。优选的农业上可接受的载体是水，但不限于此。

如本文所用，术语“多核苷酸”意指任何长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且作为非限制性示例包括基因的编码和非编码序列、有义和反义序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多核苷酸、分离和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物、片段、遗传构建体、介体和修饰的多核苷酸。提及的核酸、核酸分子、核苷酸序列和多核苷酸序列将被类似地理解。

本文所用的术语“介体(vector)”是指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其用于复制或表达遗传构建体。介体可用于将遗传构建体转运到给定的宿主细胞中。

术语“编码区”或“开放读码框架”(ORF)是指能够在适当调节序列的控制下产生转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的有义链。通过5'翻译起始密码子和3'翻译终止密码子的存在来识别编码序列。当插入遗传构建体或表达盒时，“编码序列”在其与启动子和终止子序列和/或其它调节元件可操作地连接时能够被表达。

多肽的“功能性片段”是执行多肽的生物活性或结合所需的功能和/或提供多肽的三维结构的多肽的亚序列。该术语可以指多肽，多肽例的聚集体，如二聚体或其他多聚体，融合多肽，多肽片段，多肽变体，或能够执行多肽活性的其功能性多肽衍生物。

本文所用的关于多核苷酸或多肽序列的“分离的”描述已经从其天然细胞环境中移除的序列。分离的分子可以通过本领域已知和使用的任何方法或方法的组合获得，包括生物化学、重组和合成技术。多核苷酸或多肽序列可以通过至少一个纯化步骤制备。

当在本文中用于涉及细胞或宿主细胞时，“分离的”描述已经从生物体或其天然环境中获得或移除并且随后如本领域已知的在实验室环境中维持的细胞或宿主细胞。该术语涵盖单细胞本身，以及包含在细胞培养物中的细胞或宿主细胞，并且可以包括单细胞或单一宿主细胞。

术语“重组体”是指从在其天然环境中围绕它的序列中移除和/或与在其天然环境中不存在的序列重组的多核苷酸序列。“重组”多肽序列通过从“重组”多核苷酸序列翻译而产生。

如本文所用，术语“变体”是指不同于具体识别的序列的多核苷酸或多肽序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基缺失、被取代或添加。变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变体可以来自相同的或来自其他物种，并且可以涵盖同系物、旁系同源物和直向同源物。在某些实施例中，可用于本发明的多肽的变体具有与相应野生型分子的那些相同或相似的生物活性；即，亲本多肽或多核苷酸。

在某些实施例中，本文所述多肽的变体具有与它们相应的野生型分子相似或基本上相似的生物活性。在某些实施例中，相似性是相似的活性和/或结合特异性。

在某些实施例中，本文所述多肽的变体与其相应野生型分子的生物学活性存在差异。在某些实施例中，所述不同是改变的活性和/或结合特异性。

关于多核苷酸和多肽的术语“变体”涵盖本文定义的所有形式的多核苷酸和多肽。

变体多核苷酸序列优选地表现出与本发明的序列具有至少50％，至少60％，优选至少70％，优选至少71％，优选至少72％，优选至少73％，优选至少74％，优选至少75％，优选至少76％，优选至少77％，优选至少78％，优选至少79％，优选至少80％，优选至少81％，优选至少82％，优选至少83％，优选至少84％，优选至少85％，优选至少86％，优选至少87％，优选至少88％，优选至少89％，优选至少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优选至少94％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％，以及优选至少99％的同一性。在至少8个核苷酸位置，优选至少10个核苷酸位置，优选至少15个核苷酸位置，优选至少20个核苷酸位置，优选至少27个核苷酸位置，优选至少40个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置，优选至少60个核苷酸位置，优选至少70个核苷酸位置，优选至少80个核苷酸位置，优选在根据本发明的方法中使用或识别的多核苷酸的整个长度的比较窗口上发现同一性。

多核苷酸变体还涵盖那些表现出与一个或多个特异性识别序列的相似性的多核苷酸变体，所述相似性可能保留那些序列的功能等价性，并且不能合理地预期随机发生。

本领域技术人员可以容易地确定多核苷酸序列的同一性和相似性。

变体多核苷酸还涵盖与在此描述的多核酸序列不同的多核苷酸，但是由于遗传密码的简并性，其编码与由本发明的多核苷酸编码的多肽具有类似活性的多肽。不改变多肽的氨基酸序列的序列改变是“沉默变异”。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)外，相同氨基酸的其它密码子可以通过本领域公知的技术改变，例如，以优化特定宿主生物中的密码子表达。

关于核酸序列的术语“其简并序列”意指仅由于核酸密码中的简并性而不同于初始序列的初始序列的核酸序列变体。

术语“其简并菌株”是指如本文所述的分离的DNA真菌病毒株，其是初始DNA真菌病毒株的核酸序列变体，并且由于1)核酸密码的简并性，或2)不改变或更改病毒的生物功能的非编码区中的核酸取代、添加和/或缺失，或3)编码至少一种变体真菌病毒多肽的核酸序列变异而不同于初始菌株，其中由于不改变或更改多肽生物学功能的氨基酸改变，特别是保守性氨基酸改变，简并菌株中至少一种变体多肽的氨基酸序列不同于初始真菌病毒菌株产生的等价多肽的氨基酸序列。

导致所编码的多肽序列中一个或几个氨基酸的保守取代而不显著改变其生物活性的多核酸序列改变也包括在本发明中。本领域技术人员知道用于进行表型沉默的氨基酸取代的方法(参见，例如，Bowie等人，1990，Science 247，1306)。

关于多肽的术语“变体”还涵盖天然存在的、重组的和合成产生的多肽。变体多肽序列优选地表现出与本发明的序列具有至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少71％，优选至少72％，优选至少73％，优选至少74％，优选至少75％，优选至少76％，优选至少77％，优选至少78％，优选至少79％，优选至少80％，优选至少81％，优选至少82％，优选至少83％，优选至少84％，优选至少85％，优选至少86％，优选至少87％，优选至少88％，优选至少89％，优选至少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优选至少94％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％，以及优选至少99％的同一性。在至少2个氨基酸位置，优选至少3个氨基酸位置，优选至少4个氨基酸位置，优选至少5个氨基酸位置，优选至少7个氨基酸位置，优选至少10个氨基酸位置，优选至少15个氨基酸位置，优选至少20个氨基酸位置，优选在根据本发明的方法中使用或识别的多肽的整个长度的比较窗口上发现同一性。

多肽变体还涵盖那些表现出与一个或多个特异性识别序列的相似性的多肽变体，所述相似性可能保留那些序列的功能等价性，并且不能合理地预期随机发生。

本领域技术人员可以容易地确定多肽序列的同一性和相似性。

变体多肽包括其中氨基酸序列通过一个或多个不影响肽的生物活性的保守氨基酸取代、缺失、添加或插入而不同于本文多肽的多肽。保守取代通常包括将一个氨基酸取代为具有相似特征的另一个氨基酸，例如，在以下组内的取代：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。

非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别的成员。

对进化的生物序列的分析表明，并非所有的序列改变都是同样可能的，至少部分地反映了在生物学水平上保守取代与非保守取代的差异。例如，某些氨基酸取代可频繁发生，而其它氨基酸取代非常罕见。氨基酸残基的进化改变或取代可通过评分矩阵(也称为取代矩阵)模拟。这种基质用于生物信息学分析以识别序列之间的关系，并且是本领域技术人员已知的。

其它变体包括具有影响肽稳定性的修饰的肽。这样的类似物可以含有例如肽序列中的一个或多个非肽键(其替代肽键)。还包括类似物，其包括除天然存在的L-氨基酸之外的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸，例如β或γ氨基酸和环状类似物。

本发明总体上涉及一种从灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)分离的新型的环状单链(ss)DNA真菌病毒，其被临时命名为Botrytis gemydayravirus 1(BGDaV1)。本文所述的BGDaV1和包含BGDaV1的组合物可用于生物防治由植物病原真菌，特别是葡萄孢属真菌(Botrytis spp.fungi)引起的植物病害。本发明还总体上涉及通过使植物或其部分与BGDaV1或其简并菌株或与低毒性的真菌菌株，特别是低毒性的葡萄孢真菌(Botrytisspp.)或其部分接触，来防治植物病原真菌，特别是植物或其部分上的真菌中的葡萄孢的方法。

申请人首次提供了一种赋予葡萄孢属真菌低毒性的DNA真菌病毒，以及包含DNA真菌病毒和农业上可接受的载体的组合物，该组合物有效防治植物上的葡萄孢属真菌。在一些实施例中，DNA真菌病毒是BGDaV1。在一些实施例中，DNA真菌病毒包含在低毒性真菌菌株中，特别是低毒性葡萄孢真菌菌株，或其部分。在一些实施例中，DNA真菌病毒或其简并菌株或低毒性真菌菌株或其部分或两者包含在组合物中，其中组合物与农业上可接受的助剂一起配制。

本申请人还首次提供了使用DNA真菌病毒或葡萄孢真菌的低毒性菌株(含有DNA真菌病毒)用于防治葡萄孢真菌的方法。具体地，本申请人首次表明，DNA真菌病毒株BGDaV1或包含BGDaV1的组合物有效地抑制葡萄孢真菌在植物上的存活、生长和/或增殖。

不希望受理论的约束，本申请人相信本发明的DNA真菌病毒的效力涉及病毒赋予植物病原真菌(特别是葡萄孢真菌)低毒性的能力。在一些实施例中，传播至植物病原真菌，特别是葡萄孢真菌，是细胞外的，特别是通过机械传动。如本文所用，机械传动意指病毒能够通过真菌细胞壁感染新型真菌细胞。

不管具体的作用方式如何，本发明人惊奇地发现BGDaV1，含有BGDaV1的低毒性真菌菌株，以及包含BGDaV1的组合物对于治疗植物和/或其植物部分感染的葡萄孢真菌是有效的。

BGDaV1是对抗葡萄孢属真菌的特别有效的生物防治剂。BGDaV1证明了在制剂和应用方案中存活、快速定殖处理的植物，以及抑制处理植物上的葡萄孢属真菌生长的能力。已发现BGDaV1在控制灰葡萄孢菌方面特别有效。

DNA真菌病毒和组合物

相应地，在一个方面，本发明涉及一种分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其编码至少一种多肽，所述至少一种多肽与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的群组中的多肽具有至少70％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，DNA真菌病毒编码至少两种多肽，优选所有三种多肽。

在一个实施例中，DNA真菌病毒编码一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％的氨基酸序列一致性，以及包含至少一个RCR或S3解旋酶氨基酸基序，如图1E所示。在一个实施例中，多肽包含至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，优选至少6个，优选所有7个RCR和/或S3解旋酶基序，如图1E中所示。在一个实施例中，RCR基序选自图1E所示的基序I、基序II、GRS和基序III。在一个实施例中，S3解旋酶基序选自由Walker-A、Walker-B和基序C组成的群组，如图1E所示。

在一个实施例中，图1E中的每个基序基本上由以下氨基酸残基组成：

基序I-XLTXXX，

基序II-XHXHXX，

基序GRS-XXFDXXXXHPNXXXXX，

基序III-YXXK，

Walker-A-GXXXXGKT，

Walker-B-XXDDX，和

基序C-NXXX的，

其中X是任何氨基酸残基。

在一个实施例中，RCR基序基本上由或由基序I(MLTYAQ)、基序II(HIHAY)、GRS(DELDYCNHHPNILPIR)和基序III(YVGK)组成。

在一个实施例中，S3解旋酶氨基酸基序基本上由或由SF3解旋酶Walker-A(GDTRLGKT)、Walker-B(IFDDI)和基序C(NTDP)组成。

在一个实施例中，DNA真菌病毒编码包含基序I(MLTYAQ)、基序II(HIHAY)、GRS(DELDYCNHHPNILPIR)、基序III(YVGK)、Walker-A(GDTRLGKT)，Walker-B(IFDDI)和基序C(NTDP)的多肽。

在一个实施例中，至少一种多肽与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选100％的序列一致性。

在一个实施例中，至少两种多肽与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6中的两个具有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选100％的序列一致性。

在一个实施例中，三种多肽中的每一种都分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:6中每一个具有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选100％的序列一致性。

在另一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的群组中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。

在一个实施例中，分离的多肽与SEQ ID NO:2具有至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％的氨基酸序列一致性，以及包含如图1E所示的至少一个RCR或S3解旋酶氨基酸基序。在一个实施例中，分离的多肽包含至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，优选至少6个，优选所有7个RCR和/或S3解旋酶基序，如图1E中所示。在一个实施例中，RCR基序选自图1E所示的基序I、基序II、GRS和基序III。在一个实施例中，S3解旋酶基序选自由Walker-A、Walker-B和基序C组成的群组，如图1E所示。

基序I-XLTXXX，

基序II-XHXHXX，

基序GRS-XXFDXXXXHPNXXXXX，

基序III-YXXK，

Walker-A-GXXXXGKT，

Walker-B-XXDDX，和

基序C-NXXX的，

其中X是任何氨基酸残基。

在一个实施例中，分离的多肽包含基序I(MLTYAQ)、基序II(HIHAY)、GRS(DELDYCNHHPNILPIR)、基序III(YVGK)、Walker-A(GDTRLGKT)，Walker-B(IFDDI)和基序C(NTDP)。

在一个实施例中，分离的多肽包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4以及SEQID NO:6组成的群组的氨基酸序列具有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选100％的序列一致性。

在一个实施例中，分离的多肽是多肽(包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或者SEQ IDNO:6)的功能变体、类似物或衍生物。

另一方面，本发明涉及编码本发明多肽的分离的核酸序列。

在一个实施例中，分离的多肽与选自由SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7组成的群组中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。在一个实施例中，分离的核酸序列与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选100％的序列一致性。

在一个实施例中，分离的核酸序列与选自由SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:7组成的群组中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。

在另一方面，本发明涉及一种分离的核酸序列，其与SEQ ID NO:1具有至少70％的序列同一性。在一个实施例中，分离的核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选100％的序列一致性。

在另一方面，本发明涉及一种分离的DNA真菌病毒，其包含SEQ ID NO:1或其简并菌株。在一个实施例中，DNA真菌病毒基本上由SEQ ID NO:1组成。在一个实施例中，DNA真菌病毒由SEQ ID NO:1组成。在一个实施例中，DNA真菌病毒是BGDaV1。

在另一方面，本发明涉及一种介体，其包含根据本发明的核酸序列。在一个实施例中，介体选自由以下组成的群组：质粒，噬菌体，噬菌粒，粘粒，福斯质粒，细菌人工染色体，酵母人工染色体和噬菌体人工染色体。

在一个实施例中，分离的宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞，优选真菌细胞。在一个实施例中，真菌细胞是葡萄孢真菌细胞，优选灰葡萄孢菌、B.pseudocinerea、B.allii、芍药葡萄孢、B.porri或郁金香葡萄孢。

在另一方面，本发明涉及低毒性真菌菌株或其部分，其包含本发明的分离的核酸序列，介体，多肽或DNA真菌病毒或其简并菌株。在一个实施例中，分离的菌株是葡萄孢真菌，优选灰葡萄孢菌，B.pseudocinerea，B.allii，芍药葡萄孢，B.porri，或者郁金香葡萄孢。

在一些实施例中，本发明的组合物可以包含或基本上由核酸序列，多肽，DNA真菌病毒或其简并菌株，分离的宿主细胞，低毒性真菌菌株或其部分，或其组合组成，如本文对于本发明的任何其他方面所述。

在一个实施例中，载体是农业上可接受的载体，优选水。

在一些实施例中，组合物包含根据本发明的DNA真菌病毒或其简并菌株，分离的宿主细胞或低毒性真菌菌株或其部分。在这样的实施例中，组合物中DNA真菌病毒的病毒样颗粒(VLP)的浓度，或者低毒性真菌菌株的分离的宿主细胞或菌丝体的细胞和/或其菌丝或其部分的浓度将取决于组合物的应用。对于特定的应用，优化VLP、细胞和/或菌丝和/或其部分的浓度被认为是在本领域的技术范围内。

在一个实施例中，本发明的组合物中的细胞是活细胞。

在一个实施例中，组合物包含低毒性真菌菌株的菌丝或其部分。在一个实施例中，组合物基本上由低毒性真菌菌株的菌丝或其部分组成。

在一些实施例中，本发明组合物中VLP或细胞的浓度范围为约1×10³至约1×10¹⁴，优选约1×10⁵至约1×10¹¹，优选约1×10⁶至约1×10⁹，优选约1×10⁷至约1×10⁸，优选约2×10⁷PFU或CFU，优选约1×10⁷PFU或CFU/克固体组合物和/毫升液体组合物。

在一些实施例中，本发明组合物中VLP或细胞的浓度范围为1×10³至约1×10¹⁴，优选1×10⁵至约1×10¹¹，优选1×10⁶至约1×10⁹，优选1×10⁷至约1×10⁸，优选2×10⁷CFU，优选约1×10⁷CFU/克固体组合物和/毫升液体组合物。

在一些实施例中，本发明组合物中VLP或细胞的浓度范围为约1×10³至1×10¹⁴，优选约1×10⁵至1×10¹¹，优选约1×10⁶至1×10⁹，优选约1×10⁷至1×10⁸，优选约2×10⁷CFU，优选约1×10⁷CFU/克固体组合物和/毫升液体组合物。

在一些实施例中，在本发明组合物中VLP或细胞的浓度范围为1×10³至1×10¹⁴，优选1×10⁵至1×10¹¹，优选1×10⁶至1×10⁹，优选1×10⁷至1×10⁸，优选2×10⁷CFU，优选约1×10⁷CFU/克固体组合物以及/毫升液体组合物。

在本发明的组合物中有效作为生物防治剂的VLP或细胞或菌丝或其部分的浓度可以根据VLP或细胞在其中使用的形式，VLP或细胞所施用的植物的生理条件；病原体感染的类型、浓度和程度；温度；季节；湿度；土壤类型；生长季节的阶段；植物的年龄；施用的常规农药和杀真菌剂的数量和类型以及植物处理(例如修剪，但不限于修剪)而变化。在配制本发明的组合物或在用于本发明的方法的组合物中可以考虑所有因素。

本发明的组合物可以使用本领域已知的和如本文示例中所述的标准技术制备。在一个实施例中，组合物中的菌丝或其部分是通过浸软本文描述的低毒性真菌菌株，优选本文所述的低毒性葡萄孢真菌的菌丝和/或菌丝体来制备的。

在一个实施例中，组合物包含农业上可接受的助剂。在一个实施例中，农业上可接受的助剂选自由另外的活性剂和配制剂组成的群组。

在一个实施例中，农业上可接受的助剂是一种或多种另外的活性剂。在一个实施例中，农业上可接受的助剂是一种或多种配制剂。

在一个实施例中，组合物包含一种或多种另外的活性剂和一种或多种配制剂的组合。在一些实施例中，组合物配制为预先制备的组合物或浓缩形式。在一些实施例中，组合物包含固体或液体制剂。

在一个实施例中，本发明的组合物包含一种或多种农业上可接受的助剂。在一个实施例中，农业上可接受的助剂选自由另外的活性剂和配制剂组成的群组。。优选地，一种或多种农业上可接受的助剂是另外的活性剂。优选地，一种或多种农业上可接受的助剂是配制剂。

在一个实施例中，本发明的组合物包含一种或多种另外的活性剂和一种或多种配制剂的组合。

在一些情况下，还可能希望在本发明的组合物中包括一种或多种另外的活性剂，其中此类另外的活性剂能够有助于防治(例如，治疗和/或预防)植物病原真菌，包括葡萄孢真菌，但不限于此。

用于本发明的合适的另外的活性剂可以能够防治植物病原真菌，包括葡萄孢真菌(但不限于此)，或者可以能够增强DNA真菌病毒、低毒性真菌菌株或本发明的组合物的生物防治作用，以防治葡萄孢真菌，特别是灰葡萄孢菌。另外的活性剂可以直接包括在本发明的组合物中或用于本发明，或者可以根据本发明的方法适当地同时或依次单独施用。

合适的另外的活性剂包括但不限于植物防御激发剂，包括活化酯-S-甲基(Actigard/Bion，Syngenta)，壬二酸，派可林酸，茉莉酮酸，Seaweed Mix，Lema油，Foodcoat(DOMCA)，Fungicover(bioDURACAL农业)和布洛芬，拮抗微生物，硅酸钾，无机盐(包括钙盐、钾盐或钠盐)，刺激剂包括(糖醛酸，amnnanns，和β1-3葡聚糖)，抗生素，以及其他抗细菌和抗真菌化合物(包括小的有机和无机分子)。

在一个实施例中，本发明的组合物包含一种或多种配制剂。

在一个实施例中，将本发明的组合物配制成固体或液体制剂。

在一个实施例中，本发明的组合物可以包含一种或多种固体或液体配制剂。可以使用本领域已知的任何合适的配制剂。认为合适制剂的选择在本领域技术人员的技能范围内。例如，合适的配制剂可以是促进或优化本发明的组合物在植物上或其部分上的生产、处理、储存、运输、施用和/或持久性或用于本发明的化合物或其他材料，但不限于此。

配制剂可特别适用于特定用途，例如但不限于在从生产设施运输、现场储存或在制备最终处理混合物期间保存和维持组合物中包含的或用于本发明的酵母的生物防治活性。制剂试剂也可用于其它目的，例如促进在植物上的粘附和持续性或穿透到植物组织，但不限于此。合适的制剂可以是固体、液体、单独或组合。特别合适的配制剂包括表面活性剂、分散剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、湿润剂、粘着剂、铺展剂、稳定剂、渗透剂、粘合剂、pH缓冲剂和营养物，单独或以技术人员可确定的各种组合。

本发明的组合物可以作为备用的预先制备的组合物提供，或者以浓缩的固体或液体形式提供。

在一个实施例中，组合物是具有固体或液体制剂的预先制备的组合物。在一个实施例中，预先制备的组合物是选自粉末、小丸、颗粒体和小球的固体制剂。在一个实施例中，预先制备的组合物是液体制剂。

本发明的组合物或用于本发明的组合物可以以预先制备的形式或以浓缩的形式提供。如果以干燥形式提供，则预先制备的组合物可以作为粉末、颗粒体、小丸或球粒提供，但不限于此。在干燥形式的情况下，组合物优选为脱水、干燥和/或包封形式。在一些实施例中，脱水、干燥和/或包封形式包括本领域已知的另外的保护剂；例如，冻干保护剂等。

在一个实施例中，组合物可以以颗粒体形式提供。例如，根据本发明的DNA真菌病毒、细胞或低毒性真菌菌株或其部分可以以具有至少0.5×10¹⁰PFU/gm或CFU/gm，优选1×10¹⁰PFU/gm或CFU/gm，优选2×10¹⁰PFU/gm或CFU/gm的颗粒体提供。当预先制备的组合物以液体形式，特别是水性形式提供时，该组合物可以作为分散体、悬浮液、浆液、霜剂、糊剂或凝胶提供，但不限于此。优选地，所述预先制备的形式以适于喷雾和/或适于喷雾的含水液体形式提供。在一个实施例中，预先制备的液体形式本身可例如作为浸液用于接种花、果实、蔬菜、种子或植物，包括植物插条。

在一个实施例中，配制本发明的预制组合物用于植物，特别是葡萄藤。例如，可以将根据本发明的VLP、细胞或低毒性真菌菌株或其部分与能够喷雾施用的农业上可接受的载体液体，肥料，引发剂，助剂，润湿剂或任何其它所需的合适的额外试剂混合。在根据本发明的方法使用的预先制备的组合物中，还可以将VLP、细胞或低毒性真菌菌株或其部分与能够喷雾施用的农业上可接受的载体液体，肥料，引发剂，助剂，润湿剂或任何其它所需的合适的额外试剂混合。

将根据本发明的DNA真菌病毒、细胞或低毒性真菌菌株或其部分配制成本发明的预先制备的组合物以及用于施用至植物或其部分的预先制备的组合物的最终形式被认为是在本领域的技术范围内。例如，用农业上可接受的载体例如水配制组合物的最终形式以形成喷雾剂、泡沫、浸液、注射剂、凝胶、蘸液或糊剂，但不限于此。在一个实施例中，本发明的组合物可以通过喷雾、浸蘸、涂抹、铺展、涂覆、摩擦或刷涂或其组合施用至植物或其部分。优选地，将组合物配制成用于喷雾或雾施用的水性悬浮液或分散体。在一个实施例中，喷雾或雾应用于葡萄藤、樱桃树和/或水果和/或蔬菜和/或花。

在一个实施例中，本发明的组合物是浓缩形式。在一个实施例中，浓缩形式是选自滤饼、粉末、颗粒体、小丸和小球的固体形式。在一个实施例中，浓缩形式是液体制剂。在一个实施例中，液体制剂是乳剂或凝胶。

当本发明的组合物以浓缩形式提供时，其可能需要使用者进行额外的配制以产生准备施用至植物或其部分的组合物。例如，浓缩形式可以与各种配制剂混合以形成用于植物施用的最终组合物。优选的制剂是水或水溶液，其中溶解适量的组合物的浓缩物(例如，颗粒体或粉末)或稀释(例如，液体，悬浮液或分散体)以获得用于施用至植物的最终组合物。

如果将根据本发明的DNA真菌病毒、细胞或低毒性真菌菌株或其部分以浓缩形式脱水，则如果用于施用至植物的组合物旨在呈液体形式，则将需要如本领域已知的再水化。可以使用本领域已知的用于使酵母再水化的常规预防措施进行再水化；例如，再水化可以有利地在20-25℃的温度下实现，但不限于此。

方法-葡萄孢真菌

在另一方面，本发明涉及降低至少一种植物病原真菌的毒性的方法，其包含使真菌与本发明的分离的DNA真菌病毒或其简并菌株接触。

在一个实施例中，该至少一种植物病原真菌是葡萄孢真菌，优选灰葡萄孢菌，B.pseudocinerea，B.allii，芍药葡萄孢，B.porri，或郁金香葡萄孢。

在一个实施例中，DNA真菌病毒或其简并菌株是根据本发明任何其它方面的DNA真菌病毒或其简并菌株。在一个实施例中，DNA真菌病毒或其简并菌株包含在本发明任何其它方面所述的组合物中。在一个实施例中，组合物基本上由DNA真菌病毒或其简并菌株组成。

在一个实施例中，接触是与植物或其部分接触或在其上接触。

在一个实施例中，植物或其部分选自单子叶植物，双子叶植物，一年生、两年生和多年生植物，新西兰本地植物，菜苗或采后蔬菜，观果植物或树或采后果实，带花植物或树或采后的花，谷类植物，油类作物，蛋白质植物，木本植物和观赏植物。

在一个实施例中，植物或其部分是农业上重要的作物植物，栽培种或其产品，其选自玉米植物，烟草植物，小麦植物，甘蔗植物，油菜植物，大麦植物，水稻植物，高粱植物，小米植物，大豆植物，莴苣植物，卷心菜植物，洋葱植物，大蒜植物和卡诺拉植物。

在一个实施例中，植物或其部分是选自由农业上重要的藤蔓植物和农业上重要的果树、产花植物及其栽培种和产品组成的群组的农业上重要的植物、其栽培种或其产品。在一些实施例中，产花植物为牡丹或郁金香。在一些实施例中，农业上重要的果树或其栽培种选自葡萄藤，橄榄树，苹果树，梨树，柑橘果树，香蕉树，菠萝植物，桃树，杏树，樱桃树，核桃树，榛树，草莓植物，蓝莓植物，树莓植物，黑莓植物，并且其产品是葡萄，橄榄，苹果，梨，柑橘果实，香蕉，菠萝，桃，杏，樱桃，核桃，榛子，草莓，蓝莓，树莓，黑莓。优选地，农业上重要的藤蔓或其栽培种选自马铃薯藤蔓，甜菜藤蔓，豆藤蔓，豌豆藤蔓，番茄藤蔓，黄瓜藤蔓，甜瓜藤蔓，浆果藤蔓，葡萄藤和猕猴桃藤蔓，并且其产品是马铃薯，甜菜，豆类，豌豆，番茄，黄瓜，甜瓜，浆果，葡萄和猕猴桃。优选地，农业上重要的藤蔓为葡萄藤或葡萄藤接穗或其栽培种，产品为葡萄。

在一个实施例中，葡萄藤或葡萄藤接穗是Vinus spp.，或其栽培种，优选欧亚种葡萄，或其栽培种。在一些实施例中，欧亚种葡萄是酿酒葡萄品种，优选白苏维浓，灰比诺，霞多丽，雷司令，梅鹿辄，席拉或西拉，卡百内红葡萄，品丽珠，丹魄或歌海娜。在一些实施例中，欧亚种葡萄是食用葡萄品种，优选“汤姆逊无核”，火焰无核，红地球，Concord，Cardinal，Ruby Roman，Delaware或Canadace品种。在一些实施例中，Vinus spp.是具有不是Vinus vinifera的根状茎的嫁接的葡萄藤。

在一个实施例中，草莓植物是Pajaro或Camarosa栽培种。

在一个实施例中，其部分是花或其部分或果实或其部分。

在一个实施例中，植物或其部分是带花植物。在一个实施例中，带花植物是多年生开花植物。在一个实施例中，多年生带花植物是报春花科，优选紫金牛亚科，优选仙客来属，更优选波斯仙客来。

在一个实施例中，接触包含通过施用至植物或其部分的种子、叶、茎、花、果实、树干和/或根，或施用在其内，将DNA真菌病毒或其简并毒株或包含DNA真菌病毒或其简并毒株的组合物施用于植物或其部分。优选施用为喷雾、雾化、浸蘸、滴加、撒粉、涂漆、铺展、喷射或喷洒。在一些实施例中，接触包括破坏植物角质层(当存在时)，以允许DNA真菌病毒或其简并菌株与植物或其部分的细胞或细胞间隙接触。施用可以只进行一次，或根据需要重复进行。本文还考虑了在一年中的不同时间和/或在植物生命周期的不同阶段期间的施用，如由技术人员适当确定的。

DNA真菌病毒或其简并菌株，或包含DNA真菌病毒或其简并菌株的组合物可在一年中的适当时间和植物发育的适当阶段施用，这可由技术人员确定。例如，DNA真菌病毒或其简并菌株，或包含DNA真菌病毒或其简并菌株的组合物可从芽突发至开花、在开花和开花后/坐果期期间施用，但不限于此。

在一个实施例中，施用是通过喷雾到茎和/或芽和/或叶表面和/或花和/或水果和/或蔬菜上。

在一个实施例中，在以常规方式施用之前，通过地面喷雾、机械掺入或通过与富化剂或肥料混合来施用至根部。

在一些实施例中，分离的DNA真菌病毒或其简并菌株如本文对于本发明的任何其它方面所述。在一些实施例中，分离的低毒性真菌菌株或其部分如本文对于本发明的任何其它方面所述。在一些实施例中，分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，或分离的低毒性真菌菌株或其部分包含在本文所述的组合物中。在一些实施例中，组合物基本上由分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，或分离的低毒性真菌菌株或其部分组成。在一些实施例中，接触如本文对于本发明的任何其它方面所述。在一些实施例中，植物病原真菌是如在此对于本发明的任何其他方面所描述的。在一些实施例中，植物或其部分是如在此对于本发明的任何其他方面所描述的。

在另一方面，本发明涉及一种分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其用于防治至少一种植物病原真菌菌株。在一些实施例中，分离的DNA真菌病毒或其简并菌株如本文所述，如本文所述提供，包含在本文所述的组合物中和/或如本文所述用于本发明的任何其它方面。在一些实施例中，植物病原真菌菌株是如在此对于本发明的任何其他方面所描述的。

在另一方面，本发明涉及用于一种分离的低毒性真菌细胞或其部分，其用于防治至少一种植物病原真菌菌株。在一些实施例中，分离的低毒性真菌菌株或其部分如本文所述，如本文所述提供，包含在如本文所述的组合物中，和/或如本文所述用于本发明的任何其它方面。在一些实施例中，植物病原真菌菌株是如在此对于本发明的任何其他方面所描述的。

在另一方面，本发明涉及分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其用于防治葡萄孢属真菌。在一些实施例中，分离的DNA真菌病毒或其简并菌株如本文所述，如本文所述提供，包含在本文所述的组合物中，和/或如本文所述用于本发明的任何其它方面。在一些实施例中，葡萄孢属真菌如本文对于本发明的任何其他方面所述。

在另一方面，本发明涉及一种分离的低毒性葡萄孢属真菌或其部分，用于防治葡萄孢属真菌。在一些实施例中，分离的葡萄孢属真菌或其部分如本文所述，如本文所述提供，包含在本文所述的组合物中，和/或如本文所述用于本发明的任何其他方面。在一些实施例中，葡萄孢属真菌如本文对于本发明的任何其他方面所述。

现在将通过参考以下实例以非限制性方式说明本发明的各个方面。

示例

示例1-真菌分离物和培养条件

从新西兰的土地保护研究所获得灰葡萄孢菌的500个分离物(表1)。这些分离物的选择基于它们分离自无症状的植物；从而增加了发现低毒性分离物和/或环状DNA真菌病毒的机会。将分离物传代培养并以4℃维持在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上直至使用。

表1来自土地保护研究所的灰葡萄孢菌的分离物的识别号

使用连续稀释和倾倒平板技术分离新西兰不同区域的土壤真菌(273个分离物)(表2)。将土壤真菌保持在4℃的麦芽提取物琼脂(MEA)培养基上。

表2土壤样品详情

分离物的数量	用于分析的土壤样品的来源
		34	新西兰沃克沃斯
58	新西兰安伯利
		53	新西兰罗托鲁瓦
24	新西兰波里鲁瓦
		62	新西兰瓦纳卡
42	新西兰奥克兰
		273	总计

示例2-病毒核酸纯化、富集和测序

灰葡萄孢菌的分离物在玻璃纸覆盖的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养，并在20℃下温育5天。收集约250mg的每种分离物菌丝体，并在病毒样颗粒(VLP)部分纯化和DNA提取之前将菌丝体组成十组。这产生50个样品(代表所有500个分离物)，将其进一步处理和测序。将真菌菌丝体均质化并与5ml SM(0.1M氯化钠，50mM Tris-HCl，pH 7.4)或磷酸盐缓冲液混合。通过在10000xg下离心5分钟使匀浆澄清，并且将上清液通过0.45μm注射器式滤器过滤。根据制造商的方案，使用高纯病毒核酸大体积试剂盒(Roche，瑞士)从这些滤液中提取总病毒核酸，并且如制造商所述，使用Illustra^TM TempliPhi^TM DNA扩增试剂盒(GEHealthcare，USA)，通过滚环扩增(RCA)富集环状DNA。将来自50个样品的RCA产物等摩尔合并，然后使用Macrogen Inc.的Illumina Hiseq2000 100bp(首尔，韩国)测序。

在覆盖玻璃纸的MEA上培养土壤真菌，并在室温下温育5-7天。为了部分纯化VLP，将200mg的每种分离物菌丝体均质化，与700μl的SM缓冲液混合，通过在10000xg下离心5分钟使匀浆澄清，并且然后将上清液通过0.2μm注射器式滤器过滤。根据制造商的方案，使用高纯病毒核酸试剂盒(Roche)从200μl的滤液中提取总病毒核酸。如制造商所述，使用Illustra^TM TempliPhi^TM NA扩增试剂盒(GE Healthcare)通过RCA富集环状DNA元件。将RCA产物汇集，并送来用于使用Macrogen Inc.的Illumina Hiseq2500 100bp的成对末端测序。

生物信息学和Illumina测序分析

运行从第一轮测序获得的Illumina读数(以检测和测序来自灰葡萄孢菌的500个分离物的环状DNA病毒)，利用银河项目服务器(Goecks等人，2010)对质量分数小于Q20的进行过滤，并对剩余的读数进行修剪，移除在5'端的低质量序列延伸段，如FastQC报告所确定的(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)。接下来，使用Geneious R8.1(http://www.geneious.com，Kearse等人，2012年)的从头组装工具将读数组装为重叠群，将其设置为中等灵敏度和默认参数。在NCBI的非冗余(nr)数据库上进行BLASTX分析(Altschul等人，1990年)，用长度大于1kb的装配重叠群的共有序列识别环状病毒样序列。

BGDaV1的检测和序列确认

设计两对引物用于PCR检测和扩增两个重叠片段，这两个重叠片段一起覆盖了BGDaV1(暂定命名为Botrytis gemydayravirus)的环状病毒基因组的全长序列，环状病毒基因组通过Illumina测序(第一轮)回收，如在结果部分中稍后所示。对50个推测的病毒DNA池(没有RCA富集)进行PCR筛选，确定BGDaV1序列的存在。使用ZR真菌/细菌DNA MiniPrep或高纯度病毒核酸试剂盒(Roche)从测试BGDaV1阳性的每个池的分离物中纯化DNA，并针对BGDaV1进行PCR筛选。

表3用于PCR检测和扩增Botrytis gemydayravirus 1(BGDaV1)DNA的引物名称、序列和预期扩增子大小。

BGDaV1序列和系统发育分析

使用Geneious R8.1(http://www.geneious.com，Kearse等人，2012年)从Sanger测序的读数组装BGDaV1环状序列。使用MUSCLE对BGDaV1的Rep进行多重序列比对和保守基序的检测(Edgar，2004)。为了进行系统发育分析，利用MEGA7的MUSCLE插件对环状ssDNA病毒的Rep氨基酸序列进行比对(Kumar等人，2016年)。修整比对序列以确保它们具有相同的长度。检测最佳拟合替代模型，利用MEGA7软件建立最大似然(ML)系统发育树，其中100次复制的自举。使用LG模型结合位点上的γ-分布速率。

循环Rep编码ssDNA(CRESS)回收

对Illumina读数(来自第一轮)的分析揭示了与蜻蜓相关环状病毒1(DfasCV-1)相似的新型ssDNA样序列的存在(Rosario等人，2012)以及其他环状植物和真菌DNA病毒。在6个DNA池(来自60种灰葡萄孢菌分离物)中发现含有与通过Illumina测序检测的序列类似的序列，并且与DfasCV-1密切相关(图1)。这些扩增子统称为BGDaV1。

测试代表6个病毒阳性池的分离物显示：11个分离物(339-13，339-19，339-30，339-34，339-38，339-42，339-48，339-49，339-98，339-99以及339-101)含有BGDaV1，所有这些分离物均分离自奥克兰的同一葡萄园(Matua Valley)。

BGDaV1序列分析

BcCDV-1的BcCDV-1测序确认序列(图1D)是1701nt长，具有三个单向ORF。最长的ORF(ORF I)是966nt长(nt位置：152-1117)，而其余两个ORF，ORF II和ORF III，分别以375(nt位置：1137-1511)和294nt(nt位置：1454-46)长重叠。病毒基因组含有两个基因间隔区；ORF III和ORF I之间的105nt的长基因间隔区(LIR)(nt位置：74-151)和ORF I和II之间的19nt的短基因间隔区(SIR)(nt位置：1118-1136)。在位于ORF III末端的茎-环结构的顶部识别了推定的非核酸序列基序(CTATCAACAC)。ORF I编码计算分子量为36.7kDa的321aa长蛋白。对其序列的BLASTx检索揭示其与回收自各种环境来源，昆虫，植物和植物病原真菌核盘菌(S.sclerotiorum)的环状病毒样序列的Reps密切相关。BGDaV1 Rep与DfasCV-1共享最高的aa序列同一性(39％)(Rosario等人，2012年)，而最近分配给已知宿主的是在中国分离的真菌病毒SsHADV-1(登录号：YP_003104706；35％同一性)，澳大利亚植物感染的mastrevirus，虎尾草条点花叶病毒(CSMV；登录号：AFN80688；32％同一性)。Rep含有针对BGDaV1紧密相关的ssDNA病毒所描述的保守PCR(基序I(MLTYAQ)，基序II(HIHAY)，GRS(DELDYCNHHPNILPIR)和基序III(YVGK)和SF3 Heliase(Walker-A(GDTRLGKT)，Walker-B(IFDDI)和基序C(NTDP))的基序(图2E)。

系统发育分析

基于BGDaV1的Rep序列和其它环状ssDNA序列的ML树(图3)揭示BGDaV1与类双生病毒科(Genomoviridae)中的Gemycircularvirus属序列密切相关，但不同。

示例3-BGDaV1颗粒的机械传输

BGDaV1颗粒纯化

使用无菌研钵和杵在液氮中将10g分离物339-13菌丝体研磨成细粉末。将粉末转移到灭菌的50ml的falcon管中，加入20ml等份的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7)。将试管在冰上振荡10分钟，加入10ml等份的氯仿，将试管在冰上进一步振荡30分钟，然后在4℃以10000xg离心30分钟。在两个超速离心管之间分离水相，并将管在120000xg下旋转80分钟。超速离心后，将沉淀重悬于小体积的0.02M磷酸钠缓冲液(pH 7)，通过在4℃下以10000xg低速离心10分钟使悬浮液澄清，使用0.02M磷酸钠缓冲液(pH 7)将上清液补至10ml，并如上重复超速离心。将所得沉淀重悬并如上所述澄清，通过透射电子显微镜检查上清液中病毒颗粒的存在。

病毒样颗粒(VLP)的纯化和TEM

纯化来自分离物339-13(BGDaV1测试+ve)的VLP，并表征为等体积VLP(约22nm直径，图A)。从不同分离物中共纯化病毒DNA以及真菌宿主基因组，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测病毒DNA的尝试是不成功的。不希望受理论的约束，本发明人相信该结果可能是由于病毒DNA以低浓度存在，这一浓度不能通过琼脂糖凝胶电泳检测。用RCA富集病毒DNA，再用单一切割限制酶对其基因组进行RCA消化，可以检测BGDaV1的线性dsDNA形式(图2B)。这也揭示了在分离物339-42中存在BGDaV1(约500nt)的缺陷型(截短型基因组)(图2C)。

筛选含有BGDaV1的分离物中是否存在RNA病毒

使用Khalifa&Pearso(2014年)描述的dsRNA纯化方案来筛选含有BGDaV1的分离物中是否存在RNA病毒。在1xTAE缓冲液(pH 7.4)中，纯化的dsRNA在SYBR安全预染色的1％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳分离，使用Gel Doc(Bio-Rad，CA，USA)在UV下可视化并拍照。

含BGDaV1分离物中dsRNA的存在

使用dsRNA检测方法测试含有BGDaV1的分离物是否存在其它RNA病毒。如图4所示，在7个分离物中检测到dsRNA。分离物339-13，339-49，339-99以及339-101似乎不含dsRNA，因此适用于进一步的传输和致病性实验。

作为纯化颗粒的BGDaV1的感染性

为了研究与3个无dsRNA分离物(339-13，339-49和339-101)相关的BGDaV1的机械传输能力，将纯化的VLP应用于无病毒的灰葡萄孢菌分离物702的生长边缘。在20℃温育4天后，将菌丝体栓从接种菌落的生长边缘转移到新的MEA平板上，以产生分离物702-V13，702-V49以及702-V101。从所得分离物中提取总DNA，并使用引物P01-1F1和P01-1R1通过PCR检测BGDaV1的传输。传输实验重复三次，并且对新后代3次传代培养进行BGDaV1的PCR检测。

BGDaV1的传输率

如表4所示，当应用于无病毒分离物时，BGDaV1作为纯化的颗粒是可机械传输的。

表4BcGCV1的机械传输和稳定性。PCR检测新发育子代不同传代培养物中BcGCV1的存在(+)或不存在(-)。

*这在第一次VLP纯化尝试中完成，阴性传输可能是由于不能有效纯化病毒。

¹分离物用于毒性评估。

BGDaV1感染对灰葡萄孢菌的影响

目的：研究BGDaV1对灰葡萄孢菌毒性的影响，将由第三次传输实验产生的培养物的菌丝体栓施加到分离的卡诺拉叶上。此外，将从分离物339-49和339-101纯化的VLP的混合物直接施用于卡诺拉叶片，导致两种病毒的预防性施用，并且将无病毒分离物702的菌丝体栓施用到卡诺拉(欧洲油菜)叶上的病毒混合物。将接种的叶片在测量叶上灰葡萄孢菌病变的直径之前温育4-5天。各处理重复三次。

灰葡萄孢菌分离物702-V101或702-Vmix的病变直径显著小于(P<0.050)单独的灰葡萄孢菌702或灰葡萄孢菌702-V49(图5)。使用来自实验3的传代培养物2的菌丝体栓再次重复该实验(表4)。在生物复制中，在由无病毒和病毒感染的分离物形成的病变直径之间没有显著差异。

BGDaV1感染对灰葡萄孢菌的进一步影响

本发明人进一步研究了BGDaV1在生长在葡萄浆果、葡萄藤、猕猴桃、草莓和仙客来上的灰葡萄孢菌中复制并赋予其低毒性的能力。

方法和材料

真菌分离物和病毒状态证实。

新鲜的葡萄孢培养物(一种无病毒的培养物和四种病毒感染的培养物)来自于土地保护研究所(表5)，并且将分离物在如前所述的PDA板上传代培养(Khalifa和MacDiarmid，2017年)。为了确认培养物的病毒状态，通过常规CTAB法或Qiagen Plant总提取试剂盒从来自每个分离物的约100mg菌丝体中提取总DNA，并通过如前所述的终点PCR进行测试(Khalifa和macromid，2017年)。

表5-本示例中使用的葡萄孢培养物

生物测定

对仙客来和草莓(两个栽培种，Pajaro和Camarosa)叶和鲜葡萄浆果进行两次生物测定，并且对Hort16A猕猴桃叶进行一次生物测定，以证明BGDaV1赋予灰葡萄孢菌低毒性。每个生物测定实验对每种植物培养基一式三份测试6种处理(5种葡萄孢分离物和阴性葡萄孢对照，即没有接种物的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA))。

为了从仙客来和草莓植物中除去潜在的残留杀真菌剂施用，在将叶用于实验之前将其在水中漂洗并放置至少一周。将分离的叶片和鲜葡萄表面灭菌(生物测定复制1次，在80％乙醇中洗涤叶片3至5分钟，然后用高压蒸汽处理的水漂洗；生物测定重复2次，在10％漂白剂中洗涤叶20分钟，然后用高压蒸汽处理的水漂洗)，然后放置在水琼脂上，叶柄下降到琼脂中。将一个4mm栓(没有菌丝体的PDA栓或来自葡萄孢分离物之一的菌丝体栓)放置在分离的叶或鲜葡萄上(将栓放置在没有切口的鲜葡萄上或具有小切口的鲜葡萄上)。将接种的叶片和鲜葡萄在室温下温育4-5天并拍照。为了研究葡萄孢属对葡萄的穿透性，在接种后天数(dpi)7天将葡萄切成两半并拍摄照片。

结果

所有4个含有BGDaV1的葡萄孢属分离物和无病毒分离物均成功地从新的样品(购自Manaaki Whenua Landcare)中重新起始。

对仙客来叶(每次测定3叶，复制两次)，草莓叶(每次测定3叶，复制两次)，葡萄浆果(每次测定3叶，复制两次)和猕猴桃叶(每次测定3叶，复制一次)；仅测定2，无用于测定1。使用PDA，灰葡萄孢菌(无病毒)上生长的PDA或病毒感染的PDA(葡萄孢分离物21918、21919、21920和21921)，在生物复制和实验区之间观察到一定水平的变异，如图6-图9所示。

在测定1中仙客来叶上，BGDaV1感染的灰葡萄孢菌导致比无病毒的灰葡萄孢菌更慢的生长(图6，上部)。对于用草莓叶的两次复制都发生了类似的结果(图7)。然而，在重复实验(测定2)后，无病毒的灰葡萄孢菌没有很好地生长，导致对仙客来叶(图6，下部)、猕猴桃叶(图8)和草莓叶(数据未显示)的功效不佳。

对测定1中的鲜葡萄，BGDaV1感染的灰葡萄孢菌导致比无病毒的灰葡萄孢菌更慢的生长，特别是当葡萄未被预切开并且分离物在4dpi感染BGDaV1 21918时(图9)。此外，当葡萄在7dpi切成两半时时，用无病毒灰葡萄孢菌分离物接种的葡萄通常具有显著松散的葡萄完整性(葡萄孢软腐病的经典指标)，葡萄较软，如图9B所示，与接种BGDaV1感染的灰葡萄孢菌的葡萄(更硬并保持其形状)相比，该葡萄明显畸形。在复制实验(测定2)时，这种观察到的趋势不明显(图10)。在葡萄上的外表面上的生长对于两种表葡萄测定看起来均一。当与用感染病毒的灰葡萄孢菌接种的葡萄相比，当无病毒的灰葡萄孢菌接种的葡萄被切成两半时，葡萄仍然失去形状(葡萄孢分离物21918、21919和21920)。值得注意的是，在每个测定复制内的生物复制之间存在一些可变性。

讨论

在上述一组实验中，本发明人证明了在某些条件下，感染BGDaV1病毒的灰葡萄孢菌可有效地防治葡萄孢对酿酒葡萄(浆果)和其它水果或花卉作物(包括猕猴桃、草莓和仙客来)的毒性。在重复试验之间，特别是在测定2中的各个处理之间观察到差异的原因尚未完全清楚。不希望受理论的束缚，发明人相信这些差异可能是由于在接种源板内取样的灰葡萄孢菌菌丝体的寿命和/或BGDaV1分布。然而，不管这些差异，本文报道的一组实验证明BGDaV1在降低通常感染该真菌病原体的五种重要宿主植物上的灰葡萄孢菌的毒性方面是有效的。

不希望受理论的约束，本发明人相信他们的试验结果表明，使用本文所述的DNA真菌病毒可以实现对植物病原真菌的有效生物防治，并且基于本说明书的公开内容，技术人员可以容易地进行这样的生物防治。

工业实用性

本发明在可用于生物防治植物病原真菌，特别是葡萄孢真菌(Botrytis spp.)，尤其是灰葡萄孢菌(B.cinerea)具有工业应用。

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序列表

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M·E·E·E·哈利法

<120> 植物病原微生物的病毒介导的生物防治

<130> 816690 JBA/rla

<160> 11

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 1701

<212> DNA

<213> Botrytis gemydayravirus

<400> 1

ctatcaacac cctataatta cagcgcctta caggctatca ctataacacc ctgaagtttc 60

agggtctcac cgctatattt acaggcttta caggctttaa atcgctaaca ctaacagtga 120

caacaggttt cggatcaggg cgcaacgttt aatgttgacc tatgcccaga tagatgacac 180

gtttgacacc gaaaacttcg ggccatgggt gaagaaaaag tgtggagctc tgactataag 240

agtagccctc gaggagcaca aacaaactgg tggtctacac atccacgcct acgtagaagc 300

acctacacaa ttcacgataa actcatccga ctttctcgat tactgcaacc accatccaaa 360

catactgcca atcagagtca cgttttacaa aacttgggat tacgtaggca aagacaacaa 420

catcatcttt gaagaagggc cgccgccacc acgacctgca gaaaaatcag gatcagctgc 480

cgtgtggact gccatcgtaa tgtcagccaa tacaatcgac gagtttttgg aggagtcctt 540

caaagcaagg cctgggaact tgattaaaaa cttcacccaa ttcaaggcgt tcgcagagtg 600

gagatacaag ccaaaggggt tggaatacgt gtcaccagcc attgagtgtc acatggaaga 660

ttacccacaa cttgagcaat gggtaatgga aaacttacgt ggaggactgc cagcgggtgc 720

ccgcaagcag tcattggtta tgtggggtga tacaaggctg ggcaaaaccc tttgggctag 780

gtcgttgggc aagcacgcat acttcccagg tatgtttatg ttggacggtt tcagcgagga 840

gggctgcgag tatgccatct tcgatgacat aatcgaagga ttcaaaggca tcaacagtta 900

caaggggtgg tttgggtctc aacacgaggt ggtcgtcacc gacaagtacc gtgggaagag 960

gagaatcacg tggggaagac cttcggtctt catcagcaac actgatccac gtgacgactt 1020

gcctcgagac caagtcaagt ggttagaggg aaattgtgtt tttgtacata ttgataaagt 1080

gctatgcagg ccttatgttg gtgattcacc tacataggcg cccaaaaaat aattaattgt 1140

ttccttgtca tgtgacttcg tcccattcac tcacaatatt tgctataaag tgtggtcatg 1200

tccaaacgca aatgaagagt aaaattttaa gacaacaagt tgtcctactc ttcatttgct 1260

gctgccttaa cgttttttgt ggaatatgcc taaacgaacc tatagcgaaa gggaagaaac 1320

ccctggaagc atcgctggtt ttatcgatga tcaggcggag ctttcaggct ccgatgtggc 1380

tgaagacccg gaagacgccg atatccaagc cccaaagagg cgcaaacagt gagtcactgc 1440

ctattttttt aagatgtgca acaaaacccc acagggtgtt tcaggcacgt gtcaatcccg 1500

tgatacgctg aagcagccta atcgttcagg ctatgtgcgc tcgatccctc cctcgtgcct 1560

cggggggagc ccatctcgct caaggaccaa aactggtgaa ccggaggtgg tgtttattgt 1620

gaagacgcac tcgctcccag gtcgctctgc tcccttcccg gcgggggggc ccctacccct 1680

cccttacgtg ctagttatag g 1701

<210> 2

<211> 321

<212> PRT

<213> Botrytis gemydayravirus

<400> 2

Met Leu Thr Tyr Ala Gln Ile Asp Asp Thr Phe Asp Thr Glu Asn Phe

1 5 10 15

Gly Pro Trp Val Lys Lys Lys Cys Gly Ala Leu Thr Ile Arg Val Ala

20 25 30

Leu Glu Glu His Lys Gln Thr Gly Gly Leu His Ile His Ala Tyr Val

35 40 45

Glu Ala Pro Thr Gln Phe Thr Ile Asn Ser Ser Asp Phe Leu Asp Tyr

50 55 60

Cys Asn His His Pro Asn Ile Leu Pro Ile Arg Val Thr Phe Tyr Lys

65 70 75 80

Thr Trp Asp Tyr Val Gly Lys Asp Asn Asn Ile Ile Phe Glu Glu Gly

85 90 95

Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ala Glu Lys Ser Gly Ser Ala Ala Val Trp

100 105 110

Thr Ala Ile Val Met Ser Ala Asn Thr Ile Asp Glu Phe Leu Glu Glu

115 120 125

Ser Phe Lys Ala Arg Pro Gly Asn Leu Ile Lys Asn Phe Thr Gln Phe

130 135 140

Lys Ala Phe Ala Glu Trp Arg Tyr Lys Pro Lys Gly Leu Glu Tyr Val

145 150 155 160

Ser Pro Ala Ile Glu Cys His Met Glu Asp Tyr Pro Gln Leu Glu Gln

165 170 175

Trp Val Met Glu Asn Leu Arg Gly Gly Leu Pro Ala Gly Ala Arg Lys

180 185 190

Gln Ser Leu Val Met Trp Gly Asp Thr Arg Leu Gly Lys Thr Leu Trp

195 200 205

Ala Arg Ser Leu Gly Lys His Ala Tyr Phe Pro Gly Met Phe Met Leu

210 215 220

Asp Gly Phe Ser Glu Glu Gly Cys Glu Tyr Ala Ile Phe Asp Asp Ile

225 230 235 240

Ile Glu Gly Phe Lys Gly Ile Asn Ser Tyr Lys Gly Trp Phe Gly Ser

245 250 255

Gln His Glu Val Val Val Thr Asp Lys Tyr Arg Gly Lys Arg Arg Ile

260 265 270

Thr Trp Gly Arg Pro Ser Val Phe Ile Ser Asn Thr Asp Pro Arg Asp

275 280 285

Asp Leu Pro Arg Asp Gln Val Lys Trp Leu Glu Gly Asn Cys Val Phe

290 295 300

Val His Ile Asp Lys Val Leu Cys Arg Pro Tyr Val Gly Asp Ser Pro

305 310 315 320

Thr

<210> 3

<211> 966

<212> DNA

<213> Botrytis gemydayravirus

<400> 3

atgttgacct atgcccagat agatgacacg tttgacaccg aaaacttcgg gccatgggtg 60

aagaaaaagt gtggagctct gactataaga gtagccctcg aggagcacaa acaaactggt 120

ggtctacaca tccacgccta cgtagaagca cctacacaat tcacgataaa ctcatccgac 180

tttctcgatt actgcaacca ccatccaaac atactgccaa tcagagtcac gttttacaaa 240

acttgggatt acgtaggcaa agacaacaac atcatctttg aagaagggcc gccgccacca 300

cgacctgcag aaaaatcagg atcagctgcc gtgtggactg ccatcgtaat gtcagccaat 360

acaatcgacg agtttttgga ggagtccttc aaagcaaggc ctgggaactt gattaaaaac 420

ttcacccaat tcaaggcgtt cgcagagtgg agatacaagc caaaggggtt ggaatacgtg 480

tcaccagcca ttgagtgtca catggaagat tacccacaac ttgagcaatg ggtaatggaa 540

aacttacgtg gaggactgcc agcgggtgcc cgcaagcagt cattggttat gtggggtgat 600

acaaggctgg gcaaaaccct ttgggctagg tcgttgggca agcacgcata cttcccaggt 660

atgtttatgt tggacggttt cagcgaggag ggctgcgagt atgccatctt cgatgacata 720

atcgaaggat tcaaaggcat caacagttac aaggggtggt ttgggtctca acacgaggtg 780

gtcgtcaccg acaagtaccg tgggaagagg agaatcacgt ggggaagacc ttcggtcttc 840

atcagcaaca ctgatccacg tgacgacttg cctcgagacc aagtcaagtg gttagaggga 900

aattgtgttt ttgtacatat tgataaagtg ctatgcaggc cttatgttgg tgattcacct 960

acatag 966

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> Botrytis gemydayravirus

<400> 4

Met Phe Pro Cys His Val Thr Ser Ser His Ser Leu Thr Ile Phe Ala

1 5 10 15

Ile Lys Cys Gly His Val Gln Thr Gln Met Lys Ser Lys Ile Leu Arg

20 25 30

Gln Gln Val Val Leu Leu Phe Ile Cys Cys Cys Leu Asn Val Phe Cys

35 40 45

Gly Ile Cys Leu Asn Glu Pro Ile Ala Lys Gly Lys Lys Pro Leu Glu

50 55 60

Ala Ser Leu Val Leu Ser Met Ile Arg Arg Ser Phe Gln Ala Pro Met

65 70 75 80

Trp Leu Lys Thr Arg Lys Thr Pro Ile Ser Lys Pro Gln Arg Gly Ala

85 90 95

Asn Ser Glu Ser Leu Pro Ile Phe Leu Arg Cys Ala Thr Lys Pro His

100 105 110

Arg Val Phe Gln Ala Arg Val Asn Pro Val Ile Arg

115 120

<210> 5

<211> 375

<212> DNA

<213> Botrytis gemydayravirus

<400> 5

ttgtttcctt gtcatgtgac ttcgtcccat tcactcacaa tatttgctat aaagtgtggt 60

catgtccaaa cgcaaatgaa gagtaaaatt ttaagacaac aagttgtcct actcttcatt 120

tgctgctgcc ttaacgtttt ttgtggaata tgcctaaacg aacctatagc gaaagggaag 180

aaacccctgg aagcatcgct ggttttatcg atgatcaggc ggagctttca ggctccgatg 240

tggctgaaga cccggaagac gccgatatcc aagccccaaa gaggcgcaaa cagtgagtca 300

ctgcctattt ttttaagatg tgcaacaaaa ccccacaggg tgtttcaggc acgtgtcaat 360

cccgtgatac gctga 375

<210> 6

<211> 97

<212> PRT

<213> Botrytis gemydayravirus

<400> 6

Met Cys Asn Lys Thr Pro Gln Gly Val Ser Gly Thr Cys Gln Ser Arg

1 5 10 15

Asp Thr Leu Lys Gln Pro Asn Arg Ser Gly Tyr Val Arg Ser Ile Pro

20 25 30

Pro Ser Cys Leu Gly Gly Ser Pro Ser Arg Ser Arg Thr Lys Thr Gly

35 40 45

Glu Pro Glu Val Val Phe Ile Val Lys Thr His Ser Leu Pro Gly Arg

50 55 60

Ser Ala Pro Phe Pro Ala Gly Gly Pro Leu Pro Leu Pro Tyr Val Leu

65 70 75 80

Val Ile Gly Tyr Gln His Pro Ile Ile Thr Ala Pro Tyr Arg Leu Ser

85 90 95

Leu

<210> 7

<211> 294

<212> DNA

<213> Botrytis gemydayravirus

<400> 7

atgtgcaaca aaaccccaca gggtgtttca ggcacgtgtc aatcccgtga tacgctgaag 60

cagcctaatc gttcaggcta tgtgcgctcg atccctccct cgtgcctcgg ggggagccca 120

tctcgctcaa ggaccaaaac tggtgaaccg gaggtggtgt ttattgtgaa gacgcactcg 180

ctcccaggtc gctctgctcc cttcccggcg ggggggcccc tacccctccc ttacgtgcta 240

gttataggct atcaacaccc tataattaca gcgccttaca ggctatcact ataa 294

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ggagatacaa gccaaagggg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ctgtttgcgc ctctttgggg 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ctactcttca tttgctgctg cc 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

cttgcccaac gacctagccc 20

Claims

1.一种分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其编码至少一种多肽，所述至少一种多肽与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的群组中的多肽具有至少70％的序列同一性。

2.一种分离的多肽，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的群组中的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。

3.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1或权利要求2所述的至少一种多肽。

4.一种分离的核酸序列，其与SEQ ID NO:1具有至少70％的序列同一性。

5.一种分离的DNA真菌病毒，其包含SEQ ID NO:1，或其简并菌株。

6.一种介体，其包含根据权利要求4所述的分离的核酸序列。

7.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求3或权利要求4所述的核酸序列、根据权利要求5所述的分离的DNA真菌病毒，或根据权利要求6所述的介体。

8.根据权利要求7所述的分离的宿主细胞，其为低毒性真菌菌株的细胞。

9.一种组合物，其包含根据权利要求1或权利要求5所述的分离的DNA真菌病毒，根据权利要求2所述的分离的多肽，根据权利要求3或权利要求4所述的分离的核酸序列，根据权利要求6所述的介体，或根据权利要求7或权利要求8所述的分离的宿主细胞，或其组合，以及载体，稀释剂或赋形剂。

10.一种降低至少一种植物病原真菌的毒性的方法，其包含使所述真菌与根据权利要求1或权利要求5所述的分离的DNA真菌病毒，根据权利要求6所述的介体，根据权利要求7或权利要求8所述的分离的细胞，根据权利要求9所述的组合物或其组合接触。

11.一种葡萄孢真菌的生物防治方法，其包含使至少一种葡萄孢真菌与分离的DNA真菌病毒或其简并菌株接触。

12.一种治疗至少一种由植物病原真菌引起的植物病害的方法，其包含使所述植物与根据权利要求1或权利要求5所述的分离的DNA真菌病毒，根据权利要求6所述的介体，根据权利要求7或权利要求8所述的分离的宿主细胞，根据权利要求9所述的组合物或其组合接触。

13.一种防治至少一种植物病原真菌的方法，其包含使所述真菌与根据权利要求1或权利要求5所述的分离的DNA真菌病毒，根据权利要求6所述的介体，根据权利要求7或权利要求8所述的分离的宿主细胞，根据权利要求9所述的组合物或其组合接触。根据权利要求10、12或13所述的方法，其中所述植物病原真菌是葡萄孢真菌，更优选灰葡萄孢菌。

14.一种根据权利要求1或权利要求5所述的分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其用于防治至少一种植物病原真菌菌株。

15.一种根据权利要求8所述的分离的低毒性真菌细胞或其部分，其用于防治至少一种植物病原真菌菌株。

16.根据权利要求14所述的分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，或者根据权利要求15所述的分离的低毒性真菌细胞或其部分，其中所述植物病原真菌菌株是葡萄孢真菌，优选灰葡萄孢菌。

17.一种分离的DNA真菌病毒或其简并菌株，其用于防治葡萄孢属真菌。