JP6823315B2 - エンドファイト共生ニンニク - Google Patents
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Description
本発明は、Pseudomonas sp. MYK105又はその変異株をニンニク植物体に感染させる工程を含む、ニンニクの収量を増加させる方法、ニンニクの生育を促進する方法、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる方法、並びにニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させる方法等に関する。
多くの植物は病徴が見られていなくても植物ウイルスに感染しており、ウイルス感染によってその成長が抑制されている。したがって、作物からウイルスを除去することにより成長が促進されることが想定され、実際にニンニク、イチゴ、ナガイモ、及びアスパラガス等でウイルスフリー作物が作製され栽培に利用されている。例えば、特許文献1には、葉基部からドーム状組織を増殖させた後に分離及び培養してウイルスフリーニンニクを作出する方法が記載されている。
上記の通り、ニンニクをウイルスフリー化することにより成長が促進されるが、その促進の程度は必ずしも満足いくものではなかった。また、植物ウイルスがニンニク中に含まれる栄養成分及び／又は機能性成分の産生を促進し得るため、ニンニクをウイルスフリー化することによりニンニク中の栄養成分及び／又は機能性成分が減少する可能性があった。さらに、ウイルスフリーニンニクの作製の際に通常低温乾燥処理が行われているが、この低温乾燥処理により植物が枯死するリスクがあった。
本発明は、ニンニクの収量を増加又は生育を促進する方法、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる方法、並びにニンニクのストレス耐性を増加させる方法等を提供すること等を課題とする。
本発明者は、Pseudomonas sp. MYK105株をニンニクに感染させることによって、ニンニクの収量を増加させ、ニンニクの生育を促進し、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させ、並びに／又はニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させ得ることを見出し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は以下の態様を包含する。
（１）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの収量を増加させる方法。
（２）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの生育を促進する方法。
（３）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる方法。
（４）ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分が、糖質及び／又はアリシン若しくはアリインである、（３）に記載の方法。
（５）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程を含む、ニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させる方法。
（６）前記感染時のニンニクがウイルスフリーニンニクである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）感染工程の前に、ニンニク茎頂を切除して培養することによって、ウイルスフリーニンニクを得る工程をさらに含む、（６）に記載の方法。
（８）ウイルスフリーニンニクを得る工程の後に、ニンニク植物体に低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程をさらに含む、（７）に記載の方法。
（９）感染工程を、低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程の前及び／又は低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程中に行う、（８）に記載の方法。
（１）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの収量を増加させる方法。
（２）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの生育を促進する方法。
（３）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる方法。
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（５）Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程を含む、ニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させる方法。
（６）前記感染時のニンニクがウイルスフリーニンニクである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）感染工程の前に、ニンニク茎頂を切除して培養することによって、ウイルスフリーニンニクを得る工程をさらに含む、（６）に記載の方法。
（８）ウイルスフリーニンニクを得る工程の後に、ニンニク植物体に低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程をさらに含む、（７）に記載の方法。
（９）感染工程を、低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程の前及び／又は低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程中に行う、（８）に記載の方法。
本発明に従ってPseudomonas sp. MYK105株を感染させることにより、ニンニク、特にウイルスフリーニンニクの生育をさらに促進し、収量を増加させることが可能となり得る。また、Pseudomonas sp. MYK105株を処理することによりニンニクにストレス耐性を付与し、糖質及び／又はアリイン含量を増加させることが可能となり得る。
１.細菌
本発明に用いることができる細菌は、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌株であるPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061；以下では、単に「NITE P-02061株」又は「MYK105株」と称することもある。）又はその変異株である。NITE P-02061株又はその変異株はエンドファイトとして植物に有益な影響を与え得る。一般に、「エンドファイト」なる用語は、植物に共生する微生物をいう。
本発明に用いることができる細菌は、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌株であるPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061；以下では、単に「NITE P-02061株」又は「MYK105株」と称することもある。）又はその変異株である。NITE P-02061株又はその変異株はエンドファイトとして植物に有益な影響を与え得る。一般に、「エンドファイト」なる用語は、植物に共生する微生物をいう。
上記のPseudomonas sp. MYK105は、自生しているユリ科植物から単離された菌株である。Pseudomonas sp. MYK105は、2015年5月29日を受託日として、ブダペスト条約下の国際寄託機関である、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に本出願人により寄託され、受託番号NITE P-02061が付与されている。
このNITE P-02061株は、種々の細菌の属及び種について、16S rDNAの部分配列（本件の場合、Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）株の16S rDNAの対応する部分塩基配列（配列番号1）との比較）を用いて、相同性検索を行った結果、相同性の高い菌として、相同性が高いほうから順に、Pseudomonas sp. WXGSA1（Accession No.：KJ184866.1、相同性： 100％）、Pseudomonas koreensis strain JH18（Accession No.：KF424274.1、相同性： 99.9％）、Pseudomonas sp. WXGSY2（Accession No.：KJ184891.1、相同性： 99.9％）、Pseudomonas koreensis strain JH14（Accession No.：KF424272.1、相同性： 99.8％）、Pseudomonas koreensis strain RK18 (Accession No.：KC790278.1、相同性： 99.8％）が認められたことから、Pseudomonas属に属する細菌であることが判明した。また、この結果から、NITE P-02061株は、Pseudomonas koreensisである可能性が高いと考えられた。
本発明において用いることができるPseudomonas sp. MYK105株の変異株は、ニンニクの植物体内に共生して、（１）該ニンニクの収量を増加させる能力、（２）該ニンニクの生育を促進する能力、（３）該ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる能力、並びに／又は（４）該ニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させる能力の少なくとも一つ、例えば二つ、三つ、又は四つを有する株であれば特に限定されない。
上記変異株は、NITE P-02061株に対し任意の適当な変異原を用いて、突然変異誘発処理することによって産生することができる。ここで、「変異原」なる用語は、広義の意味を有し、例えば変異原作用を有する薬剤のみならずUV照射等の高エネルギー線照射のような変異原作用を有する処理も含むものとする。適当な変異原の例として、エチルメタンスルホネート、UV照射、ガンマ線照射、X線照射、重イオンビーム照射、N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、ブロモウラシル等のヌクレオチド塩基類似体、及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
或いは、NITE P-02061株に変異を導入する他の手段には、遺伝子組換え法を利用する方法がある。特に、虫害対策の場合、細菌ゲノムへの、害虫忌避物質の産生を可能とする遺伝子若しくはcDNAの導入、Btトキシンなどの殺虫蛋白質をコードする遺伝子若しくはcDNAの導入等が挙げられる。
本発明に用いられる細菌は、振とう培養等の通常の培養法により、Pseudomonas属細菌について通常使用されるような条件下で培養されうる。培養に用いる培地としては炭素源としてグルコース、スクロース、デンプン、デキストリン等の糖類を、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素源、又は、酵母エキス、コーン・スティープ・リーカー、肉エキス、小麦胚芽、ポリペプトン、サトウキビ絞り粕（バカス）、ビールカス、大豆粉、米糠、魚粉等の有機窒素源を、無機塩としてリン酸一カリ、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等の、リン、カリウム、マンガン、マグネシウム、鉄等を含む塩類を、それぞれ含有する合成又は天然の培地が挙げられる。培養温度は、通常、20〜37℃、好ましくは27〜32℃で、12〜48時間、好気的条件下で行うことができる。
本発明の方法には、細菌の培養液をそのまま使用することができるが、細菌の培養液を膜分離、遠心分離、濾過分離等の方法により分離した、細菌の高濃度物を用いることもできる。
本発明の方法ではまた、細菌の培養液を乾燥させたものを使用することができる。また、細菌の培養液を活性炭、珪藻土、タルク、ゼオライト、ピートモス、パーライト、ベントナイト、モンモリナイト、バーミュキュライト等の多孔吸着体に吸着させ乾燥させたものを使用することができる。多孔吸着体は、１種類でもよいし、複数の担体を組合せて用いてもよい。乾燥方法は通常の方法でよく、例えば凍結乾燥又は減圧乾燥でよい。これらの乾燥物は乾燥後さらにボールミル等の粉砕手段で粉砕されてもよい。
細菌は、上記の培養液、高濃度物又は乾燥物としてそれ自体単独で本発明の用途に用いることができるが、更なる他の任意成分と組み合わせて通常の微生物製剤と同様の形態（例えば粉剤、水和剤、粒剤、乳剤、液剤、懸濁液、フロアブル剤、塗布剤等の形態）に製剤化して用いることもできる。組み合わせて使用することができる任意成分としては例えば固体担体、補助剤のような植物への適用が許容される材料が挙げられる。
２．ニンニク
本明細書において、ニンニクは、ヒガンバナ科ネギ属に属する（過去にユリ科に分類されたこともある）多年生植物で、アリウム・サティヴム（Allium sativum）の学名を有する。用いるニンニクの品種は限定しないが、例えば八紘、ホワイト6片、富良野、上海早生、壱州早生、及び沖縄早生、好ましくは八紘及びホワイト6片が挙げられる。
本明細書において、ニンニクは、ヒガンバナ科ネギ属に属する（過去にユリ科に分類されたこともある）多年生植物で、アリウム・サティヴム（Allium sativum）の学名を有する。用いるニンニクの品種は限定しないが、例えば八紘、ホワイト6片、富良野、上海早生、壱州早生、及び沖縄早生、好ましくは八紘及びホワイト6片が挙げられる。
本発明の方法において、Pseudomonas sp. MYK105又はその変異株を感染させるニンニクは、感染時にウイルスフリーニンニクであることが好ましい。本明細書において、「ウイルスフリーニンニク」は、ウイルスが全く若しくは実質的に感染していないニンニクであってもよい。ここで「実質的に感染していない」とは、本発明の処理によるニンニクに与える効果に影響を及ぼさない程度のウイルスの存在が許容されることを意味する。本明細書において、ウイルスフリーニンニクは、例えばニンニクにとって主要なウイルスであるアレクシウイルス（Allexivirus）、リーキイエローストライプウイルス(LYSV：Leek Yellow Stripe Virus)、及びタマネギ萎縮ウイルス（OYDV：Onion Yellow Dwarf Virus）のいずれか一つ又は二つ、好ましくは三つ全てに感染していないニンニクであってよい。ニンニクがウイルスフリーであるか否かは、例えば特異的なプライマーを用いるRT-PCR法により確認することができる。ウイルスフリーニンニクは、圃場に移植された後にウイルスに感染してもよいし、ウイルスに感染せずにウイルスフリーニンニクのままであってもよい。
ウイルスフリーニンニクは、当業者に知られる方法、例えばニンニク茎頂を切除して培養する茎頂培養により得ることができる。茎頂培養の詳細については、以下の３において記載する通りであるからここでは記載を省略する。
茎頂培養工程の後、ニンニクに低温及び／又は乾燥ストレスを与える処理を行ってよい。本処理により、ニンニクの球形成を促すことができる。本処理の詳細については、以下の３において記載する通りであるからここでは記載を省略する。
３．収量増加、生育促進、栄養成分及び／又は機能性成分増加、並びに／又はストレス耐性増加のための方法
一態様において、本発明は、上記１に記載のPseudomonas sp. MYK105又はその変異株をニンニク植物体に感染させる工程を含む、ニンニクの収量を増加させる方法、ニンニクの生育を促進する方法、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる方法、並びにニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させる方法に関する。
一態様において、本発明は、上記１に記載のPseudomonas sp. MYK105又はその変異株をニンニク植物体に感染させる工程を含む、ニンニクの収量を増加させる方法、ニンニクの生育を促進する方法、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる方法、並びにニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させる方法に関する。
ニンニクの収量を増加することは、本発明の細菌を接種しない対照と比較して、例えば、鱗片、花茎、及び盤茎等を含む鱗茎、特に鱗片等の食用部分を増収させることを意味する。
ニンニクの生育（生長）を促進することは、本発明の細菌を接種しない対照と比較してニンニクの成長を早めることを意味する。
ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させることは、本発明の細菌を接種しない対照と比較して栄養成分及び／又は機能性成分の含量を増加させることを意味する。栄養成分の例として、糖、脂質、タンパク質、及びビタミン等、好ましくは糖が挙げられる。機能性成分の例として、アリシン又はアリイン（アリナーゼによってアリシンに変換されるアリシンの前駆体）、S-アリルシステイン、及びシクロアリイン等、好ましくはアリシン又はアリインが挙げられる。
ニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させることは、本発明の細菌を接種しない対照と比較して低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させること、例えばこれらのストレス下での枯死率の低下を意味する。低温条件及び乾燥条件の例として、例えば以下の「ニンニクに低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程」において記載する条件が挙げられる。
本発明の方法は、上記感染工程の前に、ニンニク茎頂を切除して培養することによって、ウイルスフリーニンニクを得る茎頂培養工程をさらに含んでよい。ニンニクの茎頂部位はウイルスの感染が比較的少ないため、本茎頂培養工程によりウイルスフリーニンニクを得ることができる。茎頂培養工程の詳細は特に限定しないが、例えば、以下の方法により行うことができる。まずニンニクの鱗茎を鱗片に分け、必要に応じて鱗片から薄皮等を物理的に取り除き、水及び／又は洗剤で洗浄する。その後鱗片を、例えば70〜90%、75〜85%又は約80%の濃度のエタノール水溶液、及び／又はアンチホルミン（次亜塩素酸ナトリウム）溶液中に静置することにより表面殺菌を行う。その後必要に応じて滅菌水等で鱗片を洗浄する。続いて剃刀等を使用して鱗片から茎頂組織を切り取り、培地に移植する。培地の種類は限定しないが、例えば任意に栄養成分を補充したMS培地等が挙げられる。
本発明の方法は、茎頂培養工程の後、ニンニクに低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程を含んでよい。本処理により、ニンニクの球形成を促すことができる。低温条件として、例えば4℃〜20℃、7℃〜18℃、好ましくは10℃〜15℃が挙げられる。乾燥条件として、例えば10日〜30日、15日〜25日、18日〜22日又は20日潅水しない条件、又は土が乾いたら湿る程度に潅水する条件が挙げられる。低温及び／又は乾燥ストレスの例として、例えば（i）潅水しながら3℃〜5℃又は4℃で約3週間〜1ヶ月低温処理を行い、（ii）その後乾燥条件で、例えば又は土が乾いたら湿る程度に潅水するか又は潅水せずに6℃〜14℃、8℃〜12℃、又は約10℃で6日〜14日、8日〜12日、又は約10日間培養し、（iii）続いて乾燥条件で、例えば又は土が乾いたら湿る程度に潅水するか又は潅水せずに10℃〜20℃、13℃〜17℃、又は約15℃で6日〜14日、8日〜12日、又は約10日間培養する条件が挙げられる。
ニンニク植物体への感染工程における施用方法は特に限定しない。例えば、ニンニクへの施用方法としては、苗への潅注又は塗布、ニンニク根部の菌液への浸漬、又は植物体に噴霧処理する方法等が挙げられる。特に苗への潅注が好ましく、上記低温及び／又は乾燥ストレスへの曝露前及び／又は曝露中に行うことが好ましい。例えば、上記ニンニクに低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程であれば、（i）の処理の前、及び／又は（i）の処理の後（ii）の処理の前に行うことが好ましい。これらの処理により、菌がニンニク植物体に感染し、やがてニンニクに共生するようになると考えられる。
菌液の濃度は、１×105〜1×109個/ml又はそれ以上であってよいが、これらの濃度範囲に限定されない。菌を懸濁する媒体は、水又は培地であることが好ましい。通常、高濃度菌液を水又は培地で所定濃度に希釈して使用することができる。
本発明の方法は、上記感染工程の後に、ニンニク植物体を栽培する工程を含んでよい。ニンニクの栽培は通常の方法で行うことができる。感染工程の後、いったんポット等で栽培し、その後圃場に移してもよいし、直接圃場に移して栽培工程を行ってもよい。
本発明は全体として、具体的に以下の工程：茎頂培養工程、ニンニクに低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程（本工程の前及び／又は本工程中に感染工程）、及び栽培工程をこの順序で含み得る。
［実施例１：Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）株の単離及び同定］
（材料と方法）
Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）株の単離
自生しているユリ科植物を採取し、切断した。切断したユリ科植物を70%エタノールに30秒、2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に5分浸すことにより表面殺菌を行った。その後、植物体を乳鉢に移し滅菌した生理食塩水1mlと海砂を適量加えながら磨砕した。磨砕した上澄みを100μl、NA(Nutrient Agar)培地に塗布し、30℃、数日間培養後、シングルコロニーを単離することにより標題のNITE P-02061株を得た。
（材料と方法）
Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）株の単離
自生しているユリ科植物を採取し、切断した。切断したユリ科植物を70%エタノールに30秒、2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に5分浸すことにより表面殺菌を行った。その後、植物体を乳鉢に移し滅菌した生理食塩水1mlと海砂を適量加えながら磨砕した。磨砕した上澄みを100μl、NA(Nutrient Agar)培地に塗布し、30℃、数日間培養後、シングルコロニーを単離することにより標題のNITE P-02061株を得た。
Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）株の同定
Pseudomonas sp. MYK105株菌体を0.85%NaCl水溶液500μlに懸濁し、遠心後に上清を除去した。菌体に滅菌水20μl、BL buffer（40ｍM Tris、1%Tween20、0.5% Nonidet P-40、1mM EDTA、pH 8.0）25μl、Proteinase K（1mg/ml）5μlを加え、軽く懸濁した。60℃、20分間放置後に105℃で5分間放置した。遠心し、上清をDNA抽出液とした。
Pseudomonas sp. MYK105株菌体を0.85%NaCl水溶液500μlに懸濁し、遠心後に上清を除去した。菌体に滅菌水20μl、BL buffer（40ｍM Tris、1%Tween20、0.5% Nonidet P-40、1mM EDTA、pH 8.0）25μl、Proteinase K（1mg/ml）5μlを加え、軽く懸濁した。60℃、20分間放置後に105℃で5分間放置した。遠心し、上清をDNA抽出液とした。
滅菌水を6.95μl、Ex Taq Buffer（20ｍM）を1μl、dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM）を0.8μl、Ex Taq(5units/μl)を0.05μl、100nMプライマー（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（配列番号2）及び5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'（配列番号3））を1μlずつ、滅菌水で10倍に希釈したDNA抽出液１μlを混合し、PCRを行った。反応は94℃、5分間を1サイクル、94℃、60秒間、55℃、60秒間、72℃、90秒間を35サイクル、72℃、2分間を1サイクルで実施した。
PCR後の溶液をアガロースゲルで電気泳動し、目的のDNA断片部分 (約1400bp)を切り出した。ゲルからDNA断片を抽出し、塩基配列の決定に使用した。決定された塩基配列は、配列番号1の配列からなるものであった。
（結果）
Pseudomonas sp. MYK105株（NITE P-02061）について、得られた16SrDNAの塩基配列をDDBJ、EMBL、GenBankデータベースと比較した。その結果、相同性の高い菌として、相同性が高いほうから順に、Pseudomonas sp. WXGSA1（Accession No.：KJ184866.1、相同性： 100％）、Pseudomonas koreensis strain JH18（Accession No.：KF424274.1、相同性： 99.9％）、Pseudomonas sp. WXGSY2（Accession No.：KJ184891.1、相同性： 99.9％）、Pseudomonas koreensis strain JH14（Accession No.：KF424272.1、相同性： 99.8％）、Pseudomonas koreensis strain RK18 (Accession No.：KC790278.1、相同性： 99.8％）が認められた。以上から、本細菌はPseudomonas sp. と同定された。また、この結果から、NITE P-02061株は、Pseudomonas koreensisである可能性が高いと考えられた。
Pseudomonas sp. MYK105株（NITE P-02061）について、得られた16SrDNAの塩基配列をDDBJ、EMBL、GenBankデータベースと比較した。その結果、相同性の高い菌として、相同性が高いほうから順に、Pseudomonas sp. WXGSA1（Accession No.：KJ184866.1、相同性： 100％）、Pseudomonas koreensis strain JH18（Accession No.：KF424274.1、相同性： 99.9％）、Pseudomonas sp. WXGSY2（Accession No.：KJ184891.1、相同性： 99.9％）、Pseudomonas koreensis strain JH14（Accession No.：KF424272.1、相同性： 99.8％）、Pseudomonas koreensis strain RK18 (Accession No.：KC790278.1、相同性： 99.8％）が認められた。以上から、本細菌はPseudomonas sp. と同定された。また、この結果から、NITE P-02061株は、Pseudomonas koreensisである可能性が高いと考えられた。
＜実施例２：ニンニクの成長促進及び生存率の評価＞
（材料と方法）
茎頂培養
ニンニクの品種は八紘及びホワイト6片を使用した。ニンニクの鱗茎を鱗片に分け、鱗片の皮を取り除いた。鱗片を水道水に10分間浸けた後に薄皮を取り除き、中性洗剤で洗浄した。その後鱗片を水道水で洗浄し、80%エタノール溶液に1分間、その後10%アンチホルミン溶液中に20分間静置することにより表面殺菌を行った。その後滅菌水を用い、クリーンベンチ内で3回以上鱗片を洗浄した。次にクリーンベンチ内において実体顕微鏡と剃刀を使用して鱗片から茎頂組織を必要な大きさに切り取り、プラスチックシャーレに作製した1.18μM塩酸チアミン、0.56mMミオイノシトール、0.88Mスクロース、0.7%寒天含有MS培地（ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬株式会社））に移植した。
（材料と方法）
茎頂培養
ニンニクの品種は八紘及びホワイト6片を使用した。ニンニクの鱗茎を鱗片に分け、鱗片の皮を取り除いた。鱗片を水道水に10分間浸けた後に薄皮を取り除き、中性洗剤で洗浄した。その後鱗片を水道水で洗浄し、80%エタノール溶液に1分間、その後10%アンチホルミン溶液中に20分間静置することにより表面殺菌を行った。その後滅菌水を用い、クリーンベンチ内で3回以上鱗片を洗浄した。次にクリーンベンチ内において実体顕微鏡と剃刀を使用して鱗片から茎頂組織を必要な大きさに切り取り、プラスチックシャーレに作製した1.18μM塩酸チアミン、0.56mMミオイノシトール、0.88Mスクロース、0.7%寒天含有MS培地（ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬株式会社））に移植した。
ニンニクの鉢上げ及び栽培
試験管に2倍希釈の上記MS培地を作製し、上記の通り調製した培養植物を発根に合わせてシャーレから移植した。そして多数の発根が観察された後に根を水で洗い流し、園芸培土を充填したポットに鉢上げした。
試験管に2倍希釈の上記MS培地を作製し、上記の通り調製した培養植物を発根に合わせてシャーレから移植した。そして多数の発根が観察された後に根を水で洗い流し、園芸培土を充填したポットに鉢上げした。
鉢上げ後、4℃で3週間から1ヶ月の低温処理を行い、その後馴化のため土が乾いたら湿る程度に潅水する乾燥条件にて10℃で10日間栽培し、続いて上記乾燥条件にて15℃で10日間栽培して徐々に栽培温度を上げ、その後潅水しながら20℃又は25℃で栽培を行った。
ニンニクからのウイルス検出方法
作出された植物個体のウイルスの感染について、葉片又は鱗片を試料としたRT-PCRにより評価した。すなわち、葉組織又は鱗片を緩衝液中で磨砕し、上清から核酸を抽出した。抽出した核酸を鋳型に使用した逆転写によりcDNAを合成し、RT-PCRを行い、アガロースゲル電気泳動によりウイルス特異的増幅断片を検出した。
作出された植物個体のウイルスの感染について、葉片又は鱗片を試料としたRT-PCRにより評価した。すなわち、葉組織又は鱗片を緩衝液中で磨砕し、上清から核酸を抽出した。抽出した核酸を鋳型に使用した逆転写によりcDNAを合成し、RT-PCRを行い、アガロースゲル電気泳動によりウイルス特異的増幅断片を検出した。
検出したウイルス、使用したプライマー、増幅部位、及び増幅断片サイズを表１に記す。
エンドファイト処理
実施例１で得たPseudomonas sp. MYK105（受託番号 NITE P-02061）を滅菌水で生菌数1×108個/mlに濃度調製し、上記の通り鉢上げした低温処理の前にニンニク苗に1株あたり1ml灌注することにより処理を行った。また、鉢上げ1ヵ月後に10℃処理に移行する際に、同様の方法で2回目のエンドファイト処理を行った。
実施例１で得たPseudomonas sp. MYK105（受託番号 NITE P-02061）を滅菌水で生菌数1×108個/mlに濃度調製し、上記の通り鉢上げした低温処理の前にニンニク苗に1株あたり1ml灌注することにより処理を行った。また、鉢上げ1ヵ月後に10℃処理に移行する際に、同様の方法で2回目のエンドファイト処理を行った。
成長促進効果及び生存率の評価
茎頂培養により作製したニンニクの25℃栽培10日目に、ウイルス感染ニンニク、ウイルスフリーニンニク、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理したウイルスフリーニンニクの生存率及び草丈を測定した。
茎頂培養により作製したニンニクの25℃栽培10日目に、ウイルス感染ニンニク、ウイルスフリーニンニク、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理したウイルスフリーニンニクの生存率及び草丈を測定した。
また、茎頂培養により作製したニンニク個体を人工気象器において20℃で地上部が枯れるまで栽培し、地下部に形成された鱗茎の重量を評価した。
（結果）
同時に茎頂培養を開始したウイルス感染ニンニク（表1に示した3種のウイルスのうち少なくとも一つが検出されたニンニク）、ウイルスフリーニンニク、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理したウイルスフリーニンニクの草丈を各3〜6株（品種：八紘）で評価した。その結果、ウイルスに感染したニンニクに比較しウイルスフリーニンニクは草丈が約30%高くなり、ウイルスフリーニンニクにPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理したニンニクにおいてはウイルス感染ニンニクに比較し200%以上草丈が増加した（図1）。ニンニクからウイルスを除去することにより成長が促進されることは知られているが、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）はその成長促進効果をさらに向上させることが明らかとなった。
同時に茎頂培養を開始したウイルス感染ニンニク（表1に示した3種のウイルスのうち少なくとも一つが検出されたニンニク）、ウイルスフリーニンニク、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理したウイルスフリーニンニクの草丈を各3〜6株（品種：八紘）で評価した。その結果、ウイルスに感染したニンニクに比較しウイルスフリーニンニクは草丈が約30%高くなり、ウイルスフリーニンニクにPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理したニンニクにおいてはウイルス感染ニンニクに比較し200%以上草丈が増加した（図1）。ニンニクからウイルスを除去することにより成長が促進されることは知られているが、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）はその成長促進効果をさらに向上させることが明らかとなった。
茎頂培養により作製されたウイルスフリーニンニク（品種：ホワイト六片）にPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理したところ、形成された鱗片重量はPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理しなかったウイルス感染ニンニク（品種：ホワイト六片）と比較し3倍程度増加した（図2）。品種：八紘についてもPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）処理により、ウイルス感染ニンニクに対しウイルスフリーニンニクで重量が増加した（データ示さず）。
また、低温処理から徐々に温度を上げる馴化期間においてはほとんど潅水しないため、乾燥ストレス環境となり枯死する個体が発生する。本試験において、ウイルス感染ニンニクでPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理していない試験区は8個体中5個体が枯死し生存率は38%であったが、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）が処理されたウイルス感染ニンニクにおいては6個体中1個体しか枯死せず、生存率は83 %であった（表2、用いた品種は八紘、生存率は、生存個体数／全個体数及び括弧内の割合で示す）。以上より、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）がニンニクに低温及び／又は乾燥ストレス耐性を付与したことが明らかになった。
＜実施例３：ニンニク成分の評価＞
（方法）
アリイン含量の評価
アリシンの前駆体であるアリインの含有量を測定し、指標にすることによりアリシン含有量を評価した。ニンニク5gを秤量し、20mLエタノールに浸漬し抽出液を得た。抽出液50μLに対して500μLの80%メタノール水溶液を加え、また回収率補正用の内部標準物質（重水素標識フェニルアラニン）を添加した。UPLC MS/MSを使用しMRMモードで解析を実施した。標品のアリインのMSパターンとUPLCの保持時間の一致するピークのエリア面積を算出し、以下の計算式により、各サンプルのアリイン含量の相対値を評価した。
アリイン含量の相対値＝アリインのピーク面積／（ニンニクサンプルの重量×重水素標識フェニルアラニンのピーク面積）
（方法）
アリイン含量の評価
アリシンの前駆体であるアリインの含有量を測定し、指標にすることによりアリシン含有量を評価した。ニンニク5gを秤量し、20mLエタノールに浸漬し抽出液を得た。抽出液50μLに対して500μLの80%メタノール水溶液を加え、また回収率補正用の内部標準物質（重水素標識フェニルアラニン）を添加した。UPLC MS/MSを使用しMRMモードで解析を実施した。標品のアリインのMSパターンとUPLCの保持時間の一致するピークのエリア面積を算出し、以下の計算式により、各サンプルのアリイン含量の相対値を評価した。
アリイン含量の相対値＝アリインのピーク面積／（ニンニクサンプルの重量×重水素標識フェニルアラニンのピーク面積）
糖成分の評価
各試験区ニンニクの3〜4鱗片を使用した。各鱗片をすりおろし、絞り汁の糖度を糖度計（PAL-J ATAGO（アタゴ株式会社））を用いて評価した。
各試験区ニンニクの3〜4鱗片を使用した。各鱗片をすりおろし、絞り汁の糖度を糖度計（PAL-J ATAGO（アタゴ株式会社））を用いて評価した。
（結果）
ニンニク（品種：ホワイト六片）に含まれるアリシン含量について、前駆体であるアリイン含量を指標に評価した。その結果、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）処理によりニンニク鱗片中のアリシン含有量が増加した（図3）。作物からウイルスを除去することにより成長が促進されるが、含有する成分が減少する場合がある事が知られている。本試験により、ニンニクにおいてはウイルスフリー化によりアリシン含有量が低下してしまうが、ウイルスフリーニンニクに Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理することによりアリシン含量が増加すること、またウイルス感染ニンニク（表1に示した3種のウイルスのうち少なくとも一つが検出されたニンニク）にPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理することにより、さらにアリシン含有量を増加させることが可能である事が明らかになった。
ニンニク（品種：ホワイト六片）に含まれるアリシン含量について、前駆体であるアリイン含量を指標に評価した。その結果、Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）処理によりニンニク鱗片中のアリシン含有量が増加した（図3）。作物からウイルスを除去することにより成長が促進されるが、含有する成分が減少する場合がある事が知られている。本試験により、ニンニクにおいてはウイルスフリー化によりアリシン含有量が低下してしまうが、ウイルスフリーニンニクに Pseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理することによりアリシン含量が増加すること、またウイルス感染ニンニク（表1に示した3種のウイルスのうち少なくとも一つが検出されたニンニク）にPseudomonas sp. MYK105株（受託番号NITE P-02061）を処理することにより、さらにアリシン含有量を増加させることが可能である事が明らかになった。
また、糖度を測定したところ、Pseudomonas sp. MYK105株を処理することにより、ウイルス感染ニンニクに比較し、ウイルスフリーニンニクにおいて「八紘」において約2%（図4A）、「ホワイト六片」において約5%糖度が上昇した（図4B）。
本発明に従いPseudomonas sp. MYK105株を処理することにより、ニンニク、特にウイルスフリーニンニクの生育をさらに促進し、収量を増加させることが可能となり得る。また、Pseudomonas sp. MYK105株を処理することによりニンニクにストレス耐性を付与し、及び／又はアリシン含量を増加させることが可能となり得る。本発明によって、ニンニクが増収し、またその成分も増加することから、本発明のニンニク生産に与える影響は大きい。
Claims (9)
- Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ウイルスフリーニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの収量を増加させる方法。
- Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ウイルスフリーニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの生育を促進する方法。
- Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程、及び該ニンニク植物体を栽培する工程を含む、ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分を増加させる方法。
- ニンニクの栄養成分及び／又は機能性成分が、糖質及び／又はアリシン若しくはアリインである、請求項３に記載の方法。
- Pseudomonas sp. MYK105（受託番号NITE P-02061）又はその変異株を、ニンニク植物体に感染させる工程を含む、ニンニクの低温及び／又は乾燥ストレス耐性を増加させる方法。
- 前記感染時のニンニクがウイルスフリーニンニクである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 感染工程の前に、ニンニク茎頂を切除して培養することによって、ウイルスフリーニンニクを得る工程をさらに含む、請求項１、２又は６に記載の方法。
- ウイルスフリーニンニクを得る工程の後に、ニンニク植物体に低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
- 感染工程を、低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程の前、並びに／或いは、低温及び／又は乾燥ストレスを与える工程中に行う、請求項８に記載の方法。
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