JP2017524344A - バイオフィルムの阻害及び分散における可溶性細菌及び真菌タンパク質並びに方法並びにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年6月6日に出願された米国仮特許出願第62/008,836号に基づく優先権を主張し、該仮出願の内容は参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。
微生物バイオフィルムの組成物は、株/種及び環境条件の間でさまざまであるが、一般に主な構成成分として、タンパク性のアドヘシン、核酸、及び菌体外多糖を含む(Branda et al 2005, Sutherland 2001a, Vu et al 2009)。菌体外多糖は、多くの微生物の大部分を占めるバイオフィルムマトリックス構成成分であり、バイオフィルム付着、構造、及び耐性に寄与する(Colvin et al 2011, Colvin et al 2012, Ma et al 2009, Ma et al 2006, Mah et al 2003, Matsukawa & Greenberg 2004)。バイオフィルムは、肺上皮細胞又は他の器官などの生物的表面、及び限定されないが、医療装置及びインプラントを含む非生物的表面に形成され、限定されないが、パイプ及び排水設備、水濾過装置、並びに食品接触表面を含む工業的及び商業的環境における生物付着の原因である(Bjarnsholt et al 2013, Kumar & Anand 1998)。慢性のバイオフィルム関連感染症の顕著な特徴は、抗生物質の対する高度な耐性及び宿主免疫系から逃れる能力である(Bjarnsholt 2013, Hoiby et al 2010, Kim et al 2009, Mishra et al 2012, Rybtke et al 2011, Stewart 2003, Stewart & Costerton 2001)。細菌性バイオフィルムの抗生物質及び界面活性剤に対する耐性は、多くの場合、その浮遊するものと比較して1,000倍高い(Alhede et al 2011, Costerton et al 1987, Costerton et al 1999, Davies 2003)。成熟したバイオフィルムは、栄養素及び老廃物が移動できる高度に複雑な構造を有する(Hall-Stoodley et al 2004, Sutherland 2001b)。バイオフィルムは、多くの病原性細菌種を含む大きな微生物集団を隔離する働きをして、各生物が宿主での生存する力を共生的に利用する(Wolcott et al 2013)。したがって、バイオフィルムを阻害する戦略は、微生物バイオマス全体を減らすという意味合いをもつことになりうる(Bragonzi et al 2012)。
感染中、細菌P. aeruginosaは、自由に遊泳する状態から、表面に付着し、マトリックスに埋め込まれたバイオフィルム状態への生活環の変化を経る(図1)。バイオフィルムは抗生物質に対して強い耐性があり、変化する環境に細菌が適応する助けとなるので、バイオフィルムが確立されると、感染症は慢性で且つ治療不可能になる(Colvin et al 2011, Mishra et al 2012, Zegans et al 2012)。CF患者では、このバイオフィルムは、細菌が肺内に何十年も生き続けることを可能にし(Ma et al 2012, Mann & Wozniak 2012, Starkey et al 2009)、一方創傷では、バイオフィルムは初期コロニー形成及び防御を可能にする。P. aeruginosaバイオフィルムは、主に菌体外多糖;Psl、Pel、及びアルギン酸塩から成る。3種の多糖は全て重要な病原性因子であり、細菌の遺伝的適応の助けとなる(Skurnik et al 2013)。2つの一般的な臨床バイオフィルム形成株、P. aeruginosa PA14及びPAO1が広く研究されてきた(Hare et al 2012, Kukavica-Ibrulj et al 2008)。PA14は世界中で最も多い株(Wiehlmann et al 2007)であり、もともと熱傷分離株中で同定された(Rahme et al 1995)。この株は病原性が強く、Pelだけを利用し(Colvin et al 2012)、一方でもう一つの臨床株PAO1は、バイオフィルム産生のために主にPslを利用する中程度に病原性をもつ株(Lee et al 2006)である(Colvin et al 2012)。強制的には、Pslの産生が低下した場合PAO1はPelを利用でき(Colvin et al 2012)、宿主中での感染症の維持を可能にする(Byrd et al 2011)。幾つかの最近の研究から、Pel及びPslはバイオフィルム形成の初期の間に決定的に重要であることが示された。くわえて、CF患者で示されているように、Pslは確立されたバイオフィルムの継続的な維持に重要であることが示されている(Billings et al 2013, Huse et al 2013, Irie et al 2012, Wang et al 2013, Zhao et al 2013)。
Pslは、D−マンノース、D−グルコース、及びL−ラムノースの五糖類反復単位から成り、他の既知の多糖と化学的に異なる(図2)。pslオペロンは2004年に発見され(Jackson et al 2004)、15個のオープンリーディングフレーム(ORF)pslABCDEFGHIJKLMNOから成り、菌体外多糖の生合成に必要な推定タンパク質をコードする。これらのORFのうち4つ、pslB、pslM、pslN、pslOはPsl生合成に必要ではない(Byrd et al 2009)。pslオペロンは多くのPseudomonas株に存在する(図3)。Psl生合成の最初の初期段階は細胞質で起こるという説が出されており、次いでペリプラズムに移行した後、外膜を通して分泌される(Franklin et al 2011)。
気液界面に形成するバイオフィルムはペリクルと呼ばれる。臨床分離株P. aeruginosa PA14によって形成されるペリクルは7つの遺伝子オペロンpelABCDEFGにコードされ、それらすべてがPel依存性バイオフィルム形成に必要である(図4)(Colvin et al 2011, Friedman & Kolter 2004a)。pelオペロンは、2004年にトランスポゾンライブラリ中で最初に発見された(Friedman & Kolter 2004b)。Pel及び結合の化学組成は現在のところわかっていない。その生合成は細胞質で開始されると考えられ、ポリマーはペリプラズムを通る移動に向けて内膜を横切って輸送される。最近の研究から、バイオフィルム形成が生じるには、マルチドメインペリプラズムタンパク質PelAによってPel多糖が脱アセチル化又は部分的に脱アセチル化されなければならないことが示唆されている(Colvin et al 2013)。他の株と比較して、P. aeruginosa PA14は付着及び細胞間相互作用に関して主にPel多糖を依存する。多糖は細胞間相互作用の維持に決定的に重要であり、バイオフィルム群落のための構造的スキャホールドを形成する(Colvin et al 2011)。またPelは、広く一般に使用されている抗生物質トブラマイシン及びシプロフロキサシンに対して保護的な役割を担う(Colvin et al 2011)。
多糖PNAG(図5)は、Staphylococcus epidermidis(Mack et al 1996)、S. aureus(McKenney et al 1999)、E. coli(Wang et al 2004)、Pseudomonas fluorescens(Itoh et al 2005)、Acinetobacter baumannii(Choi et al 2009)、Actinobacillus pleuropneumoniae(Izano et al 2007)、Yersinia pestis(Jarrett et al 2004)、Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Izano et al 2008)、Bordetella bronchiseptica(Sloan et al 2007)、Bordetella pertussis(Conover et al 2010)、及びBurkholderia spp.のバイオフィルムに見出されている(Yakandawala et al 2011)。PNAGの生合成は、グラム陽性及びグラム陰性細菌においてicaADBC及びpgaABCDオペロンを必要とする。興味深いことに、PNAGの生合成のための標準的な遺伝子座を含まない多種多様な原核病原体及び真核病原体の細胞表面を調べた最近の免疫原性研究から、表面結合PNAGの存在が明らかになった(Cywes-Bentley et al 2013)。それには、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus dysgalactiae、Enterococcus faecalis、Listeria monocytogenes、Clostridium difficile、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium smegmatis、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrheae、nontypable Haemophilus influenzae、Haemophilus ducreyi、Helicobacter pylori、Campylobacter jejuni、Citrobacter rodentium、Salmonella enterica、Candida albicans、Aspergillus flavus、Fusarium solani、Cryptococcus neoformans、Trichomonas vaginalis、Plasmodium berghei、及びPlasmodium falciparum(Cywes-Bentley et al 2013)が含まれた。さらに、PNAGに結合するモノクローナル抗体の投与は、多くの病原菌による局所又は全身感染症に対してマウスを保護する補体依存オプソニン食作用又は殺作用を媒介できた(Cywes-Bentley et al 2013)。
PNAGは、キチンと同様、N−アセチル−D−グルコサミンユニットを反復するホモポリマーであるが、PNAGはβ(1,6)結合で合成される。成熟した形態のPNAGは部分的に脱アセチル化され、一般的にdPNAGと呼ばれ、多数の細菌においてバイオフィルムの形成に必要とされる(図6)。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の細胞壁構造の違いを考えると、2つの遺伝子座のタンパク質産物の間の配列相同性は、IcaAとPgaC、及びIcaBとPgaBのN末端ドメインに限られる。PgaB、2ドメイン外膜リポプロテイン、及びIcaB、細胞外単一ドメインタンパク質は、PNAGの部分的な脱−N−アセチル化に必要である(Little et al 2012a, Pokrovskaya et al 2013)。PNAGの脱−N−アセチル化の機能障害はE. coli、S. aureus、及びS. epidermidisにおいてバイオフィルム形成を妨げることが示されている(Cerca et al 2007, Itoh et al 2008, Vuong et al 2004)。
Aspergillus fumigatusは病原真菌であり、免疫機能の低下した人で疾患を引き起こす最も一般的なAspergillus種の1つである(Geiser et al 2007)。Aspergillus種はC. albicansに次いで、ヘルスケアの環境における真菌感染の2番目に多い原因である(Ellis et al 2000)。平均的な人は日々、数百個のA. fumigatus分生子(真菌胞子)を吸い込み、気道を通って、肺胞に堆積される。重要なことには、これらの分生子は全空中浮遊真菌分生子の0.1%未満を占める一方で、A. fumigatus分生子はヒトの侵襲性感染症の>80%を占める。正常な肺機能をもつ健常人では、分生子は粘液線毛エレベーター(elevator)によって除去されるか、又は肺胞マクロファージによって急速に貪食され、死滅させられ、感染を防ぐ。しかし、免疫機能の低下した人では、これらの分生子は死滅せず、代わりに肺上皮細胞及びマクロファージに付着した後、宿主細菌内に内部移行し、発芽する(Wasylnka et al 2005, Wasylnka & Moore 2002, Wasylnka & Moore 2003)。発芽に続いて、新たに形成した菌糸は宿主の上皮、内皮、及び免疫細胞と密接に結合したままで、結果として炎症及び組織傷害になることがありうる(Gravelat et al 2013, Wasylnka & Moore 2000)。免疫系が完全である、慢性肺疾患をもつ患者では、Aspergillus胞子が発芽して気道又は既存の肺腔にコロニーを作る菌糸を生じるが、組織の中には侵襲しない。Aspergillus感染症のこれらの形態は、持続性の気道の炎症、アレルギー反応、及び肺機能の低下に関連する。侵襲性及び慢性の肺アスペルギルス感染症の両方において、真菌の菌糸は密集した細胞外マトリックス内に見出される(Loussert et al 2010)。バイオフィルム形成及び菌糸の上皮細胞への付着が、菌体外多糖、ガラクトサミノガラクタン(galactosaminogalactan)(GAG)によって媒介されることが示されている(Gravelat et al 2013)。Aspergillus属はまた、創傷及び角膜感染症の原因でもある。他のアスペルギルス種及び非Aspergillus属真菌、例えば病原真菌Fusarium、並びに多くの植物病原真菌がGAGを産生する遺伝的能力をもつ。
ガラクトサミノガラクタン(GAG)はα1−4結合ガラクトース及びα1−4結合N−アセチルガラクトサミンから成る混成直鎖細胞外多糖である(Fontaine et al 2011)。菌体外多糖はA. fumigatusによって分泌されてバイオフィルムを形成し、菌糸を封入し、生物的(上皮細胞及びフィブロネクチン)並びに非生物的(ガラス及びプラスチック)表面の両方への付着を可能にする(Gravelat et al 2013)。くわえて、GAGはA. fumigatus細胞壁の構成成分であり、静置(static)及び気中菌糸の細胞壁の総多糖の〜2%を構成する(Loussert et al 2010)。A. fumigatus発症機序におけるGAGの機能は次の通りである(Gravelat et al 2013);A. fumigatus菌糸の生物的表面及び非生物的表面への付着を媒介し(Gravelat et al 2013)、免疫抑制体として作用し(Fontaine et al 2011)、菌糸の表面上のβ−グルカン及び他の病原菌関連分子パターン分子を覆い隠すことを通して宿主免疫応答を変化させる(Gravelat et al 2013)。
セルロース、アルギン酸塩、Psl、Pel、及びGAG多糖の系を含む、多くの菌体外多糖生合成の機構系は、推定グリコシルヒドロラーゼ又は機能的に特徴付けられたグリコシルヒドロラーゼをコードする。これらの酵素はバイオフィルム形成が起こるのに必要である可能性があるが、この過程の正確な生物学的役割は依然として定かでない。
PslGはポリマー産生(Byrd et al 2009)に必須であるが、Pslの生合成におけるPslGの生物学的役割は十分に分かっていない。グリコシルヒドロラーゼ(GH)はアミノ酸配列に基づいてファミリーに分類されている(Davies & Henrissat 1995, Henrissat & Bairoch 1996)。アミノ酸配列同一性に基づいて、糖質関連酵素データベース(CAZy)(Lombard et al 2014)はPslGをGH39ファミリーのメンバーに分類する。興味深いことに、このファミリーの現在の細菌メンバーはすべて、現時点ではβ−キシロシダーゼとして注釈付けられ、一方でヒトメンバーはα−L−イズロニダーゼとして注釈付けられる。構造はすべて、保存された活性部位を含有するN末端の(β/α)8TIMバレル及びC末端のβ−サンドウィッチドメインから成る。触媒作用に関与する2つの触媒グルタミン酸残基をもつ機構を保持することを介して触媒反は起こる(Vocadlo et al 2002)。
PelAのバイオインフォマティクス解析から、PelAは3つの潜在的な触媒活性をもつマルチドメインペリプラズムタンパク質であることが示された。Phyre2(Kelley & Sternberg 2009)サーバーは、該タンパク質は、残基47〜303を構成する予想TIMバレルドメイン、残基304〜409のレダクターゼドメイン、残基520〜800の脱アセチル化酵素ドメイン、及び残基840〜927のβ−ジェリーロールフォールド構造(Colvin et al 2013)を含む、5つを超える異なるドメイン(図7)を有することを示唆する(Colvin et al 2013)。脱アセチル化酵素ドメインの推定触媒残基の部位特異的突然変異がバイオフィルム形成を妨げたことが以前に示されている(Colvin et al 2013)。ヒドロラーゼドメインの提案されている触媒機能がPel生合成に必要か否かはわかっていない。
バイオインフォマティクス解析から、PgaBは触媒脱N−アセチル化ドメイン及び予想炭水化物結合ドメインをもつpga生合成オペロン中で唯一のペリプラズムタンパク質であることを示す。PNAGの脱N−アセチル化に必須であることは公知であるが、PNAGの脱−N−アセチル化におけるPgaB C末端ドメイン(PgaB310−672)の生物学的役割はごく最近になって究明されてきた(Little et al 2014)。PgaB310−672はPNAGオリゴマーに結合することが示され、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、グルコサミン(GlcN)、及びPNAG六量体をもつ複合体の構造と組み合わせた分子動力学シミュレーションから、該ドメインがdPNAGに優先的に結合することが示唆される。Bordetella spp.では、pgaABCDオペロンはbpsABCDとして知られている(図6)(Parise et al 2007)。B. bronchisepticaのBpsBは、PgaB及びIcaBに対してそれぞれ40%及び24%の配列同一性を共有する脱アセチル化酵素ドメインを含むことが予想される(Parise et al 2007)。
バイオフィルム関連感染症はすべての慢性、持続性細菌感染症の65〜80%を占め、バイオフィルムを伴う感染症及び病態の数は増え続けている(Bjarnsholt et al 2013, Flemming & Wingender 2010)。P. aeruginosa及びその強い抵抗性を示すバイオフィルムの形成は、3つ具体的な領域;熱傷患者、慢性創傷感染症、及び嚢胞性線維症(CF)において主要な細菌種である。また、他の細菌、限定されないが、S. epidermis、S. aureus、及びE. coliなども、バイオフィルム形成、特に、医療装置関連感染症に大きな影響を与える。産業では、生物付着−非的生物表面上のバイオフィルムに埋まっている微生物の蓄積−は、非生物的表面と生物的表面の間のバイオトランスファー・ポテンシャル(biotransfer potential)に起因して大きな問題であり(Van Houdt & Michiels 2010)、且つ効力(drag)の増加に起因してパイプ及び他の物体中の流量を減少させる(Tian et al 2014)。
バイオフィルム内の微生物が抗菌剤の作用及び宿主防御に耐える能力は非常に大きな課題を提起する。外科的介入(適切な場合)は別として、抗菌剤が唯一の治療の選択肢として残り、保護的なバイオフィルムバリアを透過し、感染を根絶するために長期間投与される。この方法は細菌及び真菌による抗菌耐性の増加の責任を部分的に負うべきである。非致死量の抗菌剤が持続して存在することは感受性を下げることにつながり、それによって、耐性突然変異菌の選択を誘発する(Hoiby et al 2011)。インビトロでも生体内でも、バイオフィルムの進化的変異率はより速く起こることが示されている。さらに、P. aeruginosa感染症の治療に使用された阻害濃度未満の抗生物質はバイオフィルム形成を誘導し、こられの細菌感染への対処不能をさらに深刻にすることが示されている(Hoffman et al 2005)。
別途定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。以下の定義は当該技術分野での用語を補足し、本開示を対象にするもので、いかなる関連事例又は非関連事例に帰属すべきではない。一般に、本明細書に記載されている、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関して使用される術語体系、並びに分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションの技術は、当該技術分野において周知で、よく使用されているものである。本開示で採用される方法及び技術は全体として、当該技術分野において公知の常法に従って、例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及びAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)などの一般的な参考文献に記載のように実施された。本明細書に記載のものに類似又は同等のいずれの方法及び材料が本発明の実行に使用できるが、特定の材料及び方法が本明細書に記載されている。
1つの態様では、本開示は、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも1つの可溶性微生物タンパク質を投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法を提供する。また本明細書で提供されるのは、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも1つの可溶性微生物タンパク質の使用である。さらに提供されるのは、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための薬剤の製造における、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも1つの可溶性微生物タンパク質の使用である。さらに一層提供されるのは、バイオフィルム関連感染症の治療又は予防で用いる、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも1つの可溶性微生物タンパク質である。
本発明の発明者らは、プラスチック表面を本明細書で開示される可溶性タンパク質で予め被覆することが、表面にバイオフィルム層を形成する微生物の能力を減少させることを示した。
また本明細書で提供されるのは、アクセッション番号AAG05625.1でジェンバンクに寄託されているPslG配列のアミノ酸31〜442から成る単離タンパク質、アクセッション番号AAG06452.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸47〜303若しくはアクセッション番号AAY92244.2でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸35〜291から成る単離タンパク質、アクセッション番号CAQ62201.1でジェンバンクに寄託されているRagA配列のアミノ酸61〜317若しくはアクセッション番号ABB32191.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸23〜277から成る単離タンパク質、アクセッション番号CAE32265.1でジェンバンクに寄託されているBpsB配列のアミノ酸318〜670若しくはアミノ酸27〜701から成る単離タンパク質、アクセッション番号AAC74108.1でジェンバンクに寄託されているPgaB配列のアミノ酸310〜672から成る単離タンパク質、アクセッション番号EAL92786.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸52〜298から成る単離タンパク質、アクセッション番号EAW09379.1でジェンバンクに寄託されているAspergillus clavatus NRRL 1のSph3AC配列のアミノ酸54〜304から成る単離タンパク質、アクセッション番号EAA63523.1でジェンバンクに寄託されているAspergillus nidulans FGSC A4のSph3AN配列のアミノ酸43〜299から成る単離タンパク質、及び/又はアクセッション番号EAL92787.1でジェンバンクに寄託されているEga3配列のアミノ酸46〜318から成る単離タンパク質である。
方法:
P. aeruginosa PAO1のpslGのアミノ酸配列は、2000年8月にアクセッション番号AAG05625.1でジェンバンクに寄託され、公開された(Stover et al 2000)。TMHMMサーバーv2.0(Krogh et al 2001)は、Pseudomonas aeruginosa PAO1のPslGが触媒ドメインを細胞膜に連結する残基5〜24の膜貫通ヘリックスをもつことを示す。P. aeruginosaのpslG遺伝子の可溶性タンパク質構築物を得るために、ゲノムDNAをプライマーGGGCATATGGAGATCCAGGTACTGAAG(配列番号1)及びGGGAAGCTTTCACTCCCAGACCAGCA(配列番号2)を用いるPCRによって増幅した。
残基31〜442を含む可溶性PslG構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は細菌培養物1リットル当たり7mg生じ、分子量は46.9kDaである(図8)。タンパク質の純度はSDS−PAGEによって>95%であると判断された。タンパク質を8〜10mg/mLに濃縮し、沈殿又は分解することなく4℃で1か月を超えて保存できた。
方法:
Gryphonロボット(Art Robbins社)を96ウェルArt Robbins Instruments Intelli−Plates(登録商標)(Hampton Research社)及びMicrolytic社のMCSG1−4スパースマトリックススクリーンとともに用いて、初期結晶化試験を8mg/mL PslG31−442で行った。タンパク質(1μL)を1:1の割合で沈殿剤と混ぜ、20℃でシッティングドロップ蒸気拡散法を用いて60μLの沈殿剤に対して平衡化した。48ウェルVDXプレート(Hampton Research社)中で、等量の沈殿剤(1mM CdCl2、0.1M HEPES pH7.0、及び5%(重量/体積)PEG3350)とともに1μLのタンパク質を用いて最適結晶を成長させ、130μLの沈殿剤に対して20℃で平衡化した。PslG31−442結晶を、25%(体積/体積)エチレングリコールを補充した沈殿剤溶液中で10秒間凍結保護した後、液体窒素中でガラス化した。回折データをビームラインX29、国立シンクロトロン光源研究所(National Synchrotron Light Source)(NSLS)で1.075オングストロームの波長を用いて100Kにて集めた。0.16mmコリメーターを使用して、ADSC Quantum−315検出器にて250mmの結晶検出器間距離及び1画像当たり0.3秒の露出時間で、合計720の0.5°振動の画像を含む高い冗長性(redundancy)360°データセットを収集した。ビームを弱め、2°振動の90の画像を180°にわたって収集した。HKL2000を用いて、統合データを積分し、縮小し、及びスケーリングした(Otwinowski & Minor 1997)。PslG31−442については、Autosolve(Terwilliger & Berendzen 1999)を使用して、カドミウム単一波長分散(SAD)法を用いて実験的位相を生じさせた。合計で4つのカドミウム結合部位が見つかり、続いてそれらを使用して密度改変マップ(density-modified map)を作成した。各マップの得られた電子密度は質が高く、PHENIX AutoBuildが>95%のタンパク質を作ることを可能にした。COOTで残りの残基を手作業で作った(Adams et al 2010, Emsley & Cowtan 2004)。PHENIX.REFINEを用いて精密化を行った(Afonine et al 2010)。TLSグループをTLSMDサーバーの使用を通したPHENIXでの精密化に加えた(Painter & Merritt 2006)。PyMOL分子グラフィックシステム(DeLano Scientific社)を用いて構造図を作成した(Dolinsky et al 2007)。
Ni、Cu、Co、Zn、及びCdを含む二価金属イオンの存在下でPslG31−442を結晶化し、1mM CdCl2の存在下で成長した結晶で2.0オングストロームに回折データを集めた。該タンパク質は4つのカドミウムイオンと結合し、カドミウムSAD法を用いて構造を解明することができた。精密化によって、良好な形状及びR因子をもつ最終モデルが生み出された。PslGは空間群P41212に晶出し、非対称ユニットに1つのプロモーターを有した。これは、PslGが溶液中で単量体であることを示す較正分析用サイズ排除カラムと一致する。該酵素は2つドメインを含有する:TIMバレルモチーフ及びN末端からの1つのβ鎖及びタンパク質のC末端からの数個のβ鎖から成るβ−サンドウィッチドメイン(図9A)。TIMバレルフォールドは、既知のタンパク質構造のタンパク質データバンク(PDB)中で最もよく見られる酵素フォールドである。このフォールドを含有する既知のすべての酵素のうち10%と推定されている(Wierenga 2001)。推定活性部位はTIMバレルドメインに位置し、該ドメインをエカトリアルに40オングストローム横切る(図9B)。PatchDockを用いた、Psl多糖の分子ドッキングシミュレーション(Schneidman-Duhovny et al 2005)は、このグルーブが理論的に12〜15個の糖ユニットを収容できることを示唆する。GH39ファミリーの他のメンバーと一致して、TIMバレルドメインのみを単離する試みは不成功であった(St John et al 2010)。このことは、β−サンドウィッチが適切なタンパク質フォールド及び/又はタンパク質の安定性に決定的に重要であるという仮説を支持する。
方法:
Psl−アラビノースで誘導可能なP. aeruginosa PAO1 pBADpslを37℃にて200rpmで振盪しながら一晩増殖させた。培養物をLBで1:100希釈し、アラビノースを0.5%(重量/体積)の最終濃度で加えてPsl生合成を誘導した。95μLの希釈培養物を滅菌96ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート(サーモサイエンティフィック社、カタログ番号243656)に加えて、さまざまな濃度(1nM〜10μM)のPelA47−303又はPslG31−442を5μLの分注量で加え、最終体積を100μLとした。次の日、一晩培養したものから1:100の希釈を用いて新鮮な培養物を調製した。95μLの希釈培養物を滅菌96ウェルポリスチレン丸底マイクロタイタープレートに加えて、さまざまな濃度(2nM〜5μM)のPslG31−442を5μLの分注量で加え、最終体積を100μLとした。培養物を26℃で24時間静的にインキュベーションしてバイオフィルム形成をさせた。エッジ効果をなくすため、〜200μLの滅菌水をすべての外側ウェルに入れ、プレートをパラフィルムで密封した。インキュベーション後、プレートを脱イオン水で十分に洗うことによって非付着細胞及び培地を除去した。ウェルを150μLの0.1%(重量/体積)クリスタルバイオレットで10分間染色した後、水で洗い流した。残った色素を200μLの95%(体積/体積)エタノールを加えることによって溶かし、10分間放置した後、吸光度をモレキュラーデバイス社(サニーベール、カリフォルニア州)のSpectraMax M2を用いて595nmで測定した。バイオフィルムの量はクリスタルバイオレットでの染色の吸光度に比例する(Merritt et al 2005)。反応はすべて3連で行い、精製PelA47−303及びバッファーBを陰性対照として加えた。細胞増殖が起こらないので、バイオフィルム形成前の2.5mg/mLのカナマイシンの培養物への添加を陽性対照として用いた。
臨床的なPAO1株と比べて、顕著に多くのPslを産生するP. aeruginosa PAO1 pBADpslでは、PslG31−442の添加は≧50nMでバイオフィルム形成を防止し、EC50が4.1±1.1nMであった(図10)。効果がPslG活性の直接的な結果か否かを調べるために、二重触媒バリアントPslG31−442 E165Q/E276Qを構築して試験した。このバリアントの添加によって、pBADpsl誘導可能株ではEC50が>100倍増加した(図10)。10μMを超える酵素濃度はPsl依存性バイオフィルム形成を防いだ。別の推定グリコシルヒドロラーゼであるPelA47−303の添加は、Pslバイオフィルム形成を阻害しなかった。バイオフィルム阻害はタンパク質特異的であることを示唆している。くわえて、10μMのPslG31−442はPAO1増殖を防がなかった。バイオフィルムの消失は細菌増殖の混乱に起因しないことを示唆している。理論に拘束されるものではないが、酵素バリアントは多糖に結合する能力を持ち続け、それによって非生物的プレートに付着する細菌の能力を減少させる可能性がある。
方法:
Pslを発現している細菌培養物を上述のように植え付け、37℃にて200rpmで振盪しながら一晩増殖させた。培養物をすべてLBで1:100希釈し、アラビノースを0.5%(重量/体積)の最終濃度で加えてPsl生合成を誘導した。Psl産生培養物を含む培地を200μg/mL アンピシリン及び100μg/mL カナマイシンで補充した。培養物を26℃で24時間静的にインキュベーションしてバイオフィルム形成を可能にした。インキュベーション後、非付着細胞及び培地はプレートを脱イオン水で3回洗うことによって除去した。ウェルに95μLの100mM ナトリウムHEPESバッファー pH7.0を入れた後、5μLのさまざまな濃度(2nM〜5μM)の各加水分解酵素を入れた。回転ニューテーター上で最大60分間25℃にて反応を進行させ、その後プレートを脱イオン水で洗うことによって反応を止めた。ウェルを200μLの0.1%(重量/体積)クリスタルバイオレットで10分間染色し、水で3回洗った。Psl培養物のクリスタルバイオレット色素を100μLの95%エタノールで回転しながら10分間溶かし、その後、吸光度をモレキュラーデバイス社(サニーベール、カリフォルニア州)のSpectraMax M2を用いて595nmで測定した。バイオフィルムの量はクリスタルバイオレットでの染色の吸光度に比例する(Merritt et al 2005)。反応はすべて少なくとも3連で行い、100mM ナトリウムHEPESバッファー pH7.0を未処理対照として用いた。細胞増殖が起こらないので、バイオフィルム形成前の2.5mg/mLのカナマイシンの培養物への添加を陽性対照として用いた。
86nMのPslG31−442の添加は35分でバイオフィルムを分散できた(図11A)。このことから、試験した条件下ではこれらのバイオフィルムを分散させるのに非常に少量のタンパク質しか必要でないことが示唆される。PslG31−442 E165Q/E276Q二重触媒バリアントを野生型酵素(5μM)に対して100倍過剰で加えた場合、未処理のバイオフィルム非常に少量のタンパク質しかと比べて有意差は見られなかった(図11B)。このことから、これらの残基が触媒作用に決定的に重要であることが示唆される。また、バイオフィルム阻害が触媒活性の真の指標ではないことが示される。PelA47−303のヒドロラーゼドメインの添加は、Psl依存性バイオフィルムの消失をもたらさなかった。分散がタンパク質特異的であることを示唆している。
方法:
P. aeruginosa PAO1のpelAのタンパク質配列は、2000年8月にアクセッション番号AAG06452.1でジェンバンクに寄託され、公開された(Stover et al 2000)。PRED−TATサーバー(Bagos et al 2010)は、Pseudomonas aeruginosa PAO1のPelAが、タンパク質を細胞質基質からペリプラズムに折りたたまれた状態で移行させることを可能にする残基1〜45のTATシグナル配列をもつことを示す。可溶性タンパク質構築物pelA47−303を得るために、遺伝子(残基47〜303)をP. aeruginosa POA1のゲノムDNAからプライマーCTGCATATGGGCGGGCCGTCCAGCGTGGCG(配列番号3)及びTTTCTCGAGTCACGGTTGCACCTCGACGTC(配列番号4)を用いるPCRによって増幅した。Ralstonia solanacearumのRagAの残基61〜317をコードする構築物をプライマーGCGCATATGGCGGACGCACCGAACATTGCC(配列番号5)及びGGGAAGCTTTCACGGCAGCACCTCGATGCGCC(配列番号6)を用いて単離し、Geobacter metallireducensのPelAの残基23−277をプライマーGGGCATATGCACCTCCTTTAAGCGTGGCCTTG(配列番号7)及びGCGAAGCTTTCACGGCATAACCTCCACGCTCCC(配列番号8)を用いて単離して、細胞質基質にタンパク質を発現するためのシグナル配列を除去した。下線は導入したNdeI、HindIII、及びXhoI制限酵素認識部位である。各遺伝子をN末端のHisタグをコードするpET28a(ノバジェン社)発現ベクターにライゲーションした。PelA47−303及びそのオーソログのタンパク質発現は実施例1でPslG31−442について記載したのと同じであった。
残基47〜303を含むPelA47−303構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は1リットルの細菌培養物当たり〜50mg生じ、分子量は28.2kDaである(図12)。タンパク質の純度はSDS−PAGEによって>95%であると判断された。タンパク質を8〜10mg/mLに濃縮し、沈殿又は分解することなく4℃で1か月を超えて保存できた。比較すると、アミノ酸残基47〜948を含む可溶性全長構築物PelA47−948は、〜1m/Lの細菌培養物しか生じない(Colvin et al 2013)。
方法:
精製PelA47−303を20mg/mLに濃縮し、市販の結晶化スクリーニングキット(Microlytic社)を用いてスクリーニングした。広く用いられているハンギングドロップ蒸気拡散法で、ネイティブ結晶をセットアップし、成長させた。結晶を1:2のタンパク質対ウェル溶液比を用いて最適化し、25%(重量/体積)PEG MME 5K及び20℃でpH7.5のビス−トリスから成る溶液スクリーン(solution screen)で結晶化した。セレノメチオニン(SeMet)で標識したPelA47−303を同様にセットアップし、その条件が僅かに高いPEG濃度(26%(体積/体積))を含んだことを除いて同じスクリーニング条件で結晶化した。15%(体積/体積)エチレングリコールを補充した結晶溶液を用いて、結晶を凍結保護した後、液体窒素でガラス化した。ビームラインX29でのデータ収集のために、結晶をNSLSに送付した。セレンSAD位相決定にはPelA47−303のセレン部位を用いた。すべてのモデル構築及び精密化を、実施例2で前述したように完了した。
P. aeruginosaのPelA47−303を発現させ、精製し、結晶化した。SDS−PAGE分析から明らかなように最終タンパク質試料を精製して均一にし、1Lのルリア−ベルターニ培地から〜40mgのタンパク質の高い収量を生じた。ネイティブタンパク質結晶及びSeMetタンパク質結晶からそれぞれ1.5オングストローム及び1.9オングストロームにて回折データを収集した。SAD法を用いて構造を解明し、1.5オングストロームの最終分解能まで精密化した。良好な精密化統計を含んだ。PelA47−303は直方晶系空間群P21212で晶出し、非対称ユニットに1つのプロモーターを有した。構造は、PelA47−303が合計で12個のβシート及び9個のαヘリックスを含むTIMバレル様のフォールドをもつことを示す(図13)。推定活性部位はTIMバレルドメインに位置し、エカトリアルにドメインを横切る深い電子陰性グルーブから成る(図14)。このグルーブの電気陰性度は、Pelが以前に提案されていたように(Colvin et al 2011)負に帯電していないことを示唆する。グルコサミン残基のポリマーのPatchDockを用いた分子ドッキングシミュレーション(Schneidman-Duhovny et al 2005)から、このグルーブが理論的に8個の糖ユニットを収容できることが示唆される。
方法:
Pelバイオフィルム形成の阻害を調べる方法は、使用した株がP. aeruginosa PAO1 ΔwspFΔpslpBADpelであることを除いて、実施例3でPslバイオフィルムについて前述したものと同一である。Pelの化学組成は現在のところわかっていない。
バイオフィルム形成前に外から加えたPelAがPel多糖バイオフィルム形成を防止できるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。Psl多糖を産生できないPel過剰産生株(PAO1ΔwspFΔpslPBADpel)を全ての実験に用いた。この株は、培養培地にアラビノースを添加すると誘導可能にPel多糖を過剰発現できる。500nMのP. aeruginosa POA1のPelA47−303の添加はPel依存性バイオフィルムの形成を防いだ。比較すると、2つの推定触媒バリアント、D160A及びE218Aはこの濃度でバイオフィルム形成を防止できなかった(図15)。P. protogens Pf−5のPelA35−291の添加は、バイオフィルム形成を≧70nMで防止し、EC50が69.3±1.2nMであった(図16)。PslG31−442、別の推定グリコシルヒドロラーゼの添加はPelバイオフィルム形成を阻害しなかった。バイオフィルム阻害がタンパク質特異的であることが示唆される。理論に拘束されるものではないが、酵素バリアントは多糖に結合する能力を持ち続け、それによって非生物的プレートに付着する細菌の能力を減少させる可能性がある。
方法:
予め形成されたPelバイオフィルムを産生させる方法は、使用した株がP. aeruginosa PAO1 ΔwspFΔpslpBADpelであることを除いて、実施例4で記載したPslバイオフィルムのものと同一である。
PelA47−303並びに2つの推定触媒バリアントD160A及びE218Aを2つの濃度;1.14mg/mL(38μM)及び0.57mg/mL(19μM)でインキュベーションした。2時間インキュベーションした後、PelA47−303はPelバイオフィルムを成功裡に分散させた。一方で、E218Aバリアントはバッファー対照と同様のバイオフィルムレベルを保持した。D160Aバリアントは、バッファー対照のように〜50%のバイオフィルムレベルを保持した(図17A)。このことから、アミノ酸D160及びE218が触媒反応に重要であることを示唆する。同様の実験をP. protogens Pf−5のPelA35−291を用いて完了し、1μMの酵素は最短30分でもバイオフィルムを分散でき、10倍希釈はほとんどすべてのバイオフィルムを1時間で分散できることを明らかにした(図17B)。これは両方の野生型ヒドロラーゼドメインがともに触媒として活性があり、効率良く加えられてバイオフィルムを分散できることを示唆する。
方法:
各ウェルに40μg/mLのPelA47−303又はPslG31−442を含む100μLの1×PBS(pH7.4)を4℃で12時間浸すことによって、滅菌96−ウェルポリスチレンプレートを予め被覆した。酵素溶液を取り除き、100μLの1×PBS(pH7.4)5分間加えた後、取り除くことによってウェルを洗った。プレートを37℃で1時間乾燥させ、使用した。最終濃度が40μg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を対照として使用した。次の日、1:100希釈したP. aeruginosa Psl又はPelアラビノース誘導可能培養物をプレートに植え付けた。吸着又は架橋結合のいずれかによるPslG31−442又はBSAの固定化は、耐蝕性の平板ガラススライド上に均一に薄く(0.17〜0.25mm)行った。まず最初に、ガラス表面をピラニア溶液(H2SO4: H2O2、3:1)に30分間浸けて、いずれの有機物質残渣も除去し、表面をヒドロキシル化することによって活性化し、次に再蒸留水で数回洗い流して残留化学物質残留物を除去した。化学的架橋による固定化については、カバーガラスを3−アミノプロピルトリメトキシシラン(APTMS)溶液(80%(体積/体積)エタノール中0.05g/mL)に室温で2時間浸けるシラン処理によって表面をアミン(NH2)基で官能基化した。表面を80%(体積/体積)エタノールで3回洗浄して未反応のAPTMSを除去した。静かに撹拌する室温の条件下でPBS緩衝溶液(pH7.2)中の4%グルタルアルデヒドに表面を2時間浸けることによって、PslG31−442を分子カップリング剤、グルタルアルデヒドを介してアミノ官能基化したガラス表面に連結した。次に混合物を3時間、80% エタノールで洗い流して未反応のグルタルアルデヒドを除去した。活性化ガラス又は変性ガラス(NH2−グルタルアルデヒド)を酵素溶液(80μg/mL)に浸し、4oCで一晩インキュベーションした。最後に、表面をPBSバッファーで数回洗浄して結合していない酵素を除去した。次の日、1:100希釈したP. aeruginosa Psl又はPelアラビノース誘導可能培養物をプレートに植え付けた。培養物を少なくとも20時間静的に増殖させ、その後バイオフィルム形成を実施例4で前述したクリスタルバイオレット法又はSYTOX Greenを用いて測定して細菌を共焦点顕微鏡法を介して可視化した。
PelA47−303でウェルを予め被覆することは、試験した条件下でバイオフィルムを完全に妨げた(図18A)。くわえて、BSAで処理したウェルはバイオフィルムを減少させなかった。PelA47−303での被覆は特異的にP. aeruginosaバイオフィルム形成を標的とし、阻害することが示唆される。また、酵素処理は、共焦点顕微鏡法を用いて可視化された細胞及びバイオフィルム付着を防いだので、PslG31−442はプラスチックに吸着できた(図18B)。また、PslG31−442はグルタルアルデヒドを用いてガラスに化学的に架橋でき、この処理も細胞付着及びバイオフィルム形成を防止した(図18C)。BSAでの処理は、非特異的なタンパク質被覆はバイオフィルム形成を防ぐのに不十分であることを示した。PslG31−442と共有結合したガラス表面は少なくとも8日間、バイオフィルム形成を防ぐことができた(図18D)。理論に拘束されるものではないが、恐らく他の酵素オーソログもプラスチックに吸着でき、細菌付着及びバイオフィルム形成を防ぐのに使用されうるであろう。
方法:
B. bronchiseptica RB50のbpsBのタンパク質配列は、2008年7月にアクセッション番号CAE32265.1でジェンバンクに寄託され、公開された。SignalPサーバーv4.0(Petersen et al 2011)は、B. bronchiseptica RB50のBpsBが、残基1〜26のペリプラズムシグナル配列をもつことを示す。可溶性タンパク質作成に関して、残基27〜701を含むbpsB遺伝子をゲノムDNAから、隣接するNdeI及びHindIIIエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位とともにインバースPCRによって増幅し、次に切断して、N末端ヘキサヒスチジンタグをコードするpET28a(ノバジェン社)発現ベクターにライゲーションした。次に、結果として得たプラスミド、pET28−BpsB27−701を、BpsBのC末端ドメイン、残基318〜670をクローニングするための鋳型として用いて、上記と同様の手順でプラスミドpET28−BpsB318−670を得た。BpsBのタンパク質発現はPslG31−442について記載したのと同じであった。
残基27〜701を含む全長BpsB(BpsB27−701)及び残基318〜670を含むC末端ヒドロラーゼドメイン構築物(BpsB318−670)を発現させ、精製した。BpsB27−701タンパク質は、1リットルの細菌培養物当たり〜30mg生じ、分子量は78.5kDaであり(図19)、一方でBpsB318−670は、1リットルの細菌培養物当たり〜50mg生じ、分子量は42.3kDaである。各タンパク質の純度はSDS−PAGEによって>95%であると判断された。タンパク質を8〜10mg/mLに濃縮し、沈殿又は分解することなく4℃で1か月を超えて保存できた。
方法:
精製したBpsB318−670を10mg/mLに濃縮し、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、48ウェルVDXプレート(Hampton Research社)及びMCSG1−4 スパースマトリックススイート(Microlytic社)で結晶化条件に対して20℃でスクリーニングした。初期結晶化ヒットがMCSG-1スイートの条件#77で得られた。8.6mg/mL BpsB318−670を、250μLの沈殿剤溶液(0.1 M ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ‐トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス−トリス)pH6.9、及び1.7 M 硫酸アンモニウム)に対して平衡化した等量のタンパク質及び沈殿剤を含む3μLの液滴とともに用いて最適結晶を成長させた。液体窒素中でガラス化する前に、BpsB318−670結晶を、25%(体積/体積)エチレングリコールを補充した沈殿剤溶液中で10秒間凍結保護した。回折データを、NSLSでビームラインX29上で1.075オングストロームの波長を用いて100Kにて集めた。0.16mmコリメーターを使用して、ADSC Quantum−315r検出器にて220mmの結晶検出器間距離及び1画像当たり0.4秒の露出時間で、1.0°振動の360°データセットを収集した。ビームを弱め、2°振動の90の画像を180°にわたって収集した。AutoMRを使用して、PgaB残基310〜646との分子置換を通して位相情報を得た(PDB 4F9D)。
BpsB318−670は空間群P21で結晶化し、回折データを1.76オングストローム分解能で集めた。構造を分子置換法を用いて解明し、精密化は良好な形状及びR因子をもつ非対称ユニットに2分子を含有する最終モデルを生み出した。分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって、BpsB318−670が溶液中で単量体であることを示される。BpsB318−670は、グリコシルヒドロラーゼではよく見られる(β/α)8バレルフォールドをとり(図20)、既知のタンパク質構造のタンパク質データバンク(PDB)中で最もよく見られる酵素フォールドである。推定活性部位は(β/α)8バレルの上部でグルーブ内に位置し、長さが41オングストロームで、幅が11オングストロームである(図20)。BpsB318−670及びPNAGのPatchDockを用いた分子ドッキングシミュレーション(Schneidman-Duhovny et al 2005)は、このグルーブが理論的に10〜12個の糖ユニットを収容できることを示唆する。
方法:
プラスミドpET28−PgaB22−672(Little et al 2012a, Little et al 2012b)を鋳型として用い、pgaB特異的プライマーを設計して、インバースPCRを用いて残基遺伝子断片に隣接するNdeI及びXhoIサイトとともに310〜672をpET28a発現ベクター(ノバジェン社)にサブクローニングした。結果として得たプラスミドpET28−PgaB310−672は、トロンビンで切断可能なヘキサヒスチジンタグをもつPgaBのC末端ドメインをコードする。精製中はグリセロールを溶解バッファーにのみ含みという修正を加えて、以前に記載されたように(Little et al 2012a, Little et al 2012b)、PgaB310−672を発現させ、精製した。
残基22〜672を含むPgaB(PgaB22−672)を作成する方法は以前に記載されている(Little et al 2012a、Little et al 2012b)。本明細書において、PgaBの残基310〜672を含むC末端ヒドロラーゼドメイン構築物(PgaB310−672)を発現させ、精製した。〜10m/Lの細菌培養物のPgaB310−672の収量が得られた。タンパク質の純度はSDS−PAGEによって>95%であると判断された(図21)。タンパク質は8〜10mg/mLに濃縮できたが、沈殿及び分解最小限にするために0.5〜1.0mg/mLで4℃にて2週間保存した。
方法:
PNAGバイオフィルムを阻害する方法は実施例3に記載のPslバイオフィルムのものと同じである。簡潔に、PNAG過剰産生E. coli又はS. carnosusを37℃で一晩、200μg/mL アンピシリン及び100μg/mL カナマイシン、並びに10μg/mL テトラサイクリンをそれぞれ補充したLB培地中で200rpmで振盪しながら増殖させた。一晩培養したものから、E. coliにはLB培地、S. carnosusにはトリプチックソイブロスを用いて1:100の希釈で抗生物質を含む新鮮な培養物を調製した。95μLの希釈培養物を滅菌96ウェルポリスチレン丸底マイクロタイタープレートに加えて、さまざまな濃度(2nM〜5μM)のタンパク質を5μLの分注量で加え、100μLの最終体積を得た。培養物を、E. coliについては26℃で、S. carnosusについては37℃で24時間静的にインキュベーションしてバイオフィルム形成させた。エッジ効果をなくすために、〜200μLの滅菌水をすべての外側ウェルに入れ、プレートをパラフィルムで密封した。インキュベーション後、プレートを脱イオン水で3回洗うことによって非付着細胞及び培地を取り除いた。ウェルを150μLの0.1%(重量/体積)クリスタルバイオレットで10分間染色した後、水で3回洗った。残った色素を100μLの33%(体積/体積)酢酸で10分間回転しながら溶かし、その後、吸光度をモレキュラーデバイス社(サニーベール、カリフォルニア州)のSpectraMax M2を用いて595nmで測定した。バイオフィルムの量はクリスタルバイオレットでの染色の吸光度に比例する(Merritt et al 2005)。反応はすべて少なくとも3連で行い、バッファーGを未処理対照として加えた。E. coli pgaABCDノックアウト株(DPGA)又はゲンタマイシンで処理したS. carnosusのいずれかを背景染色用の対照として用いた。
抗生物質の添加で活性化できるE. coli及びS. carnosusの過剰産生PNAG株を用いた。BpsB27−701、BpsB318−670、PgaB22−672、及びPgaB310−670のE. coli培養物への添加はバイオフィルム形成を防止し、EC50値がそれぞれ〜40nM、〜60nM、〜90nM、及び〜230nMであった(図22A)。PNAG依存性S. carnosusバイオフィルムに関するバイオフィルム阻害の予備試験は、BpsB318−670はバイオフィルム形成を5μMで阻害することを示す(図22B)。
方法:
以下の異なる点を除いて、PNAG依存性バイオフィルムを形成する方法は、実施例4で記載したPslのものと同様の方法を利用する。PNAG過剰産生E. coliは37℃で一晩、200ug/mL アンピシリン及び100ug/mL カナマイシンを補充したLB培地中で、200rpmで振盪しながら増殖させた。E. coli pgaABCDノックアウト株を背景染色用の非バイオフィルム形成対照として用いた。異なる製造業者プレートを試験するために、ヌンク社及びザルスタット社の両社の滅菌96ウェルポリスチレン丸底マイクロタイタープレートを用いて実験を行った。
BpsB27−701、BpsB318−670、PgaB22−672、及びPgaB310−672が予め形成されたPNAGバイオフィルムを分解できるか否かを調べるために、E. coliバイオフィルムを一晩増殖させた後、酵素を加えた。酵素反応の触媒反応速度は基質の量及び加えた酵素の量の両方に依存する。したがって、バイオフィルム質量の実験間の変動に留意することが重要である。BpsB27−701、BpsB318−670、PgaB22−672、及びPgaB310−672の、60分間、平均開始OD595が0.5の予め形成されたバイオフィルムへの添加は、バイオフィルムを分解し、EC50値がそれぞれ ̄170nM、 ̄90nM、>1000nM、及び200nMであった(図23A)。また、異なる製造業者のプレートを試験したところ、異なるレベルの付着が生じたが、分散のレベルは同様であった(図23B)。最後に、バイオフィルム分解酵素PelA47−303及びPslG31−442は影響がなかったので、PNAG依存性バイオフィルムの分散は特異的であることが示された(図23C)。次のBpsBのアラニンバリアント:D326A、D328A、H473A、D474A、及びE585AはPNAG依存性バイオフィルムを分散できなかった。これらの残基がPNAGの結合及び/又は加水分解に重要な役割は果たすことが示唆される。菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
方法:
S. aureus株 MN8m由来の単離dPNAGを6N HCl中で〜10mg/mLに溶かした。10N NaOHを用いて中性〜pH7〜8に達するまで再懸濁液を滴定した。50μLの反応で、1μM BpsB318−670を、1〜5mg/mLのdPNAGとともに100mM HEPES pH7.0中で18時間インキュベーションした。試料を2つの20μLの分注量の分け、DTT/3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩水和物で処理して、80℃で15分間加熱した。0.5%(重量/重量)鉄(III)硫酸アンモニウム十二水和物、0.5%(重量/重量)スルファミン酸、及び0.25N 塩酸の溶液を加えて混合し、室温に冷やした。次に、100μLを96ウェル透明底プレートに移し、吸光度をモレキュラーデバイス社(サニーベール、カリフォルニア州)のSpectraMax M2を用いて620nmで測定した。バッファーH中のタンパク質及びdPNAGを背景対照として用いた。
BpsB及びPgaBの抗バイオフィルム活性がPNAG多糖の切断に直接起因するか否かを試験するために、還元糖アッセイを行った。24時間エンドポイントアッセイを用いた結果はバックグラウンドを超えた明らかな信号を示し、酵素が多糖を加水分解できることを示している(図24)。dPNAGは〜5% 脱アセチル化されていると推定され、dPNAGポリマーの平均の長さ(〜200ユニット)及び加水分解アッセイで生じた信号から、切断がグルコサミン残基で起こりうることが示唆される。これによって、ポリマーあたり約10個のさらなる還元末端が生じることになると思われる。理論に拘束されるものではないが、この結果は加水分解がグルコサミン残基で起こりうることを示すので、脱アセチル化酵素ドメインを含むBpsB又はPgaB構築物をもつことは、dPNAGに存在するグルコサミン残基の量を増やし、その結果加水分解の部位を増やすのに有益なはずである。これによって今度は、バイオフィルム阻害及び分解の効率を上がるはずである。くわえて、BpsB27−701及びBpsB318−670は、PgaB22−672及びPgaB310−672と比べて約4倍の加水分解活性を示した。このアッセイの条件下では、BpsB27−701及びBpsB318−670がより良好なヒドロラーゼであることを示唆している。この結果はバイオフィルムアッセイと相関する(図23A)。BpsBの次のアラニンバリアント:D326A、D328A、H473A、D474A、及びE585Aは、dPNAGを加水分解できなかった。これらの残基がdPNAGの結合又は加水分解に重要な役割を担っていることを示唆している。上述のように、菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
方法:
PelA47−303がGAG依存性バイオフィルムの形成を阻害しうるか否かを調べるために、5×104個のA. fumigatus分生子/ウェルをPelA47−303を補充したブレイン培地中で37℃及び5% CO2にて20時間増殖させた。GAGバイオフィルム形成を定量するために、各ウェルを400μLのdH2Oで2回洗い、300μLの0.1%(重量/体積)クリスタルバイオレットで10分間染色した(Merritt et al 2005)。この染色に続いて、ウェルを2回洗い、残った色素を300μLの95%(体積/体積)エタノールを加えることによって溶かし、10分間放置した後、吸光度を600nmで測定した。
バイオフィルム形成前に外から加えたPelAがGAG多糖バイオフィルムを防止できるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。クリスタルバイオレットアッセイを通して見られるように、≧2μMのPelA47−303の添加はGAGバイオフィルム形成を防止するのに充分であった(図25A)。また、2つの推定触媒バリアントD160A及びE218Aもこれらの濃度で阻害することが示された。同様の結果がPpPelA35−291についても得られた(図25B)。理論に拘束されるものではないが、酵素バリアントは多糖に結合する能力を持ち続け、それによって非生物的プレートに付着するA. fumigatusの能力を減少させ可能性がある。
方法:
粗GAGをA. fumigatusバイオフィルムから分離した。200μLのGAG分注量を遠心分離してゼラチン状の画分を沈殿させた。ペレットを350μLのPBSで2回洗った。洗浄手順には、5分間ボルテックスすること、浴内で3分間超音波処理すること、及びピペット操作によって均一に達するまで手動で混ぜることが含まれた。最終ペレットを200μLのPBSに再懸濁した。試料を10〜20μM タンパク質で処理し、26℃でインキュベーションした。24時間で試料を取り出した。少し修正を加えた、以前に記載されている還元糖アッセイを用いて(Anthon & Barrett 2002)、GAG加水分解を定量した。簡潔に、20μLの酵素反応を20μLの0.5M NaOH並びに20μLのMBTH/DTT溶液(1.5m/L 3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラジン(MBTH)及び0.5m/L DTT)と混ぜた。試料を80℃で15分間インキュベーションした後、40μLの酸性鉄試薬(0.5%(FeNH4(SO4)2)・12H2O、0.5% スルファミン酸、及び0.25 N HCl)を加えた。試料を水で2倍に希釈した後、吸光度を620nmで定量した。
PelA47−303がGAG多糖を加水分解できるか否かを決定するために、A. fumigatus株Af293由来の精製GAGを用いて還元糖アッセイを完了した。未処理試料と比較して、溶液中の還元末端の数は24時間の反応時間にわたって増加した(図26)。キチン及びキトサンの放出が背景加水分解より顕著ではなかったので、活性は特異的であった。単一位置バリアントE218Aは活性を失った。菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
方法:
計5×104個のA. fumigatus分生子/ウェルをブレイン培地中で37℃及び5% CO2にて20時間増殖させて、GAGを産生させ、滅菌24ウェルプレートに付着させた。GAGバイオフィルムの分散を測定するために、培地を吸引し、PelA47−303又は推定触媒バリアントを0.28μMの低濃度で含む培地と交換し、新鮮な培地中でさらに20時間インキュベーションした。反応を止めるために、各ウェルを400μLのdH2Oで2回洗い、300μLの0.1%(重量/体積)クリスタルバイオレットで10分間染色した。この染色に続いて、ウェルを2回洗い、残った色素を300μLの95%(体積/体積)エタノールを加えることによって溶かし、10分間放置した後、吸光度を600nmで測定した。
P. aeruginosa PAO1のPelA47−303及びP. protogensのPelA35−291はGAGバイオフィルムの消失をもたらしたが、一方で推定触媒バリアント及びBSA対照はバイオフィルムを分散できなかったことが観察された(図27)。また、PelAオーソログRagA61−317はGAG依存性バイオフィルムを分散できた。一方でG. metallireducensのPelAオーソログ(GmetPelA23−277)は効果は少なかったものの(図28)、それでもなお作用した。
方法:
24ウェル組織培養プレートで培養した単層を、3mCiの51Crとともに37℃にて5% CO2中で24時間インキュベーションすることによって、不死化気道上皮細胞株A549にクロム51を入れた。過剰なクロムをハンクス平衡塩溶液(HBSS)で洗うことによって取り除いた。次に、標識したA549細胞を、0.5μM PelA47−303又はE218Aバリアントを含む1mLの血清を含まないDF12K培地5×105個の分生子で感染させた。発芽管を試験するために、分生子をSAB培地中で37℃にて7時間生育させ、次に真菌を集め、DF12K培地に再懸濁した後、0.5μMのヒドロラーゼを加えた。発芽管をヒドロラーゼと1時間インキュベーションした後、A549細胞に加えた。16、20、及び24時間共インキュベーションした後、細胞上部の培地の分注量を取り出し、新鮮な培地と換えた。次に細胞を6N NaOHで溶かし、溶解物を集めた。次いで、培地及び溶解物の51Cr含有量をガンマカウンターで測定し、上皮細胞傷害の程度を51Cr放出の度合いの関数として計算した。各株を3連で試験して、結果はすべて、非感染上皮細胞による自然発生的なクロム放出に対して補正した。
16時間にわたるクロム放出アッセイによって測定されるように、外からのPelA47−303の添加はA. fumigatusの肺上皮細胞傷害を誘発する能力を阻止した(図29)。比較すると、以前にGAG依存性バイオフィルムを分散できなかったことが示されているPelA47−303 E218Aの外からの添加は上皮細胞傷害を防止しなかった。野生型酵素で観察された保護効果がGAG依存性バイオフィルムの阻害及び分散における直接的な結果であることが裏付けられる。理論に拘束されるものではないが、本明細書で言及されるPelAオーソログは恐らく同じ機能を果たす。上述のように、菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
方法:
P. aeruginosa PAO1 ΔwspFΔpslpBADpelを一晩培養したものをLB+0.5% アラビノースでOD600が0.05に希釈して、96ウェルの組織培養用に処理したプレートに100μl/ウェルの最終体積で植え付けた。プレートを28℃で20時間静的にインキュベーションした。上清を吸引し、0.5μMのPelA47−303を含む100μLのフェノールレッドを含まないRPMI+10% ウシ胎児血清(FBS)を加えた。プレートをニューテーター上で室温にて1時間インキュベーションした。ヒドロラーゼで前処理した後、6×106個の分化HL−60細胞を含む100μL RPMI+10% FBSをウェルに加え、プレートを37℃、5% CO2で90分間インキュベーションした。ウェルを吸引し、上清を1/200000〜1/400000に希釈して、LB寒天上に蒔いた(50μl)。吸引したウェルに、200μLの「破壊溶液(disruption solution)」(2μMのPelA47−303及び2μM PslG31−442を含むPBS)を加え、プレートをニューテーター上で室温にて1〜1.5時間インキュベーションした。ウェルを吸引し、希釈し、上記のようにLB寒天上に蒔いた。
ヒドロラーゼ処理が免疫殺作用に対する微生物の感受性を増強しうるか否かを判断するために、P. aeruginosaの好中球に対する感受性を増強するPelA47−303の能力を調べた。PelAでのPel含有P. aeruginosaバイオフィルムの処理は、HL−60好中球細胞株による微生物殺作用の程度を約22%から42%に増加させた(図30)。他の可溶性グリコシルヒドロラーゼもまた、似たように機能して好中球殺作用を強めることが予想される。
方法:
ポロクサマー407(商品名プルロニック(登録商標)F−127又はPF−127)は親水性非イオン界面活性剤であり、多くの投与経路のための薬物送達システムとして使用されてきた(Escobar-Chavez et al 2006)。PF−127の20%ゲルを1×PBSをプルロニック(登録商標)F−127とポリマーが溶けるまで4℃で混ぜることによって調製した。PelA47−303を、3つの濃度;100μg/mL、200μg/mL、及び500μg/mLでこの溶液に加えた。株P. aeruginosa PAO1 ΔwspFΔpslpBADpelのPel依存性バイオフィルムを実施例8で記載したように形成した。バッファー、ゲル、及びさまざまな濃度のPelA47−303を含有するゲルをバイオフィルムに加えた。
1×PBSバッファー又は20% プルロニック(プルロニック)(登録商標)F−127でのバイオフィルムの処理は、バイオフィルム分散をもたらさなかった。しかし、1時間の処理後のクリスタルバイオレット染色(図31)を通して明らかなように、3つの濃度のPelA47−303を含むプルロニック(プルロニック)(登録商標)F−127は成功裡にバイオフィルムを分散させた。理論に拘束されるものではないが、同様の送達戦略が、酵素を封入できる薬剤を用いて、本明細書に開示のグリコシルヒドロラーゼのいずれにも利用できると考えられる。
方法:
臨床及び環境P. aeruginosa分離株のバイオフィルムを増殖及び分散させる方法は、初めに実施例4で記載した実験室株のものと同一である。この方法の1つの例外は、L−アラビノースはそれらの株ではバイオフィルムの形成を誘導するのに必要ではなく、したがってバイオフィルム形成能は株特異的なことである。それらの選ばれた株の多様性は以前に報告されており(Wolfgang et al 2003)、それらの株がPel及びPsl多糖を利用する傾向が、pelオペロン及びpslオペロンの遺伝子欠失を用いて特徴付けられた(Colvin et al 2012)。
外から加えたPslG、PelA、及びそれらの組み合わせが利用されて、臨床及び環境P. aeruginosa分離株によって形成されるバイオフィルムを分散できうるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。100〜1000nMのPslG31−442、PelA47−303、又は等モル濃度の両酵素の添加はともに、クリスタルバイオレット染色を通して見られるように、1時間でバイオフィルムバイオマスの≧90%の減少をもたらした(図32)。これは、これらのグリコシルヒドロラーゼが組み合わせて適用されて、臨床的に関連する株のバイオフィルムを分散できることを示す。
方法:
GAG産生が損なわれた転写因子変異体の比較トランスクリプトーム解析から、GAG生合成に必要なタンパク質をコードすることが予想される5つの同時調節遺伝子のクラスターが特定された。A. fumigatusのGAG生合成に必要な幾つかの遺伝子は、ゲノムの第3染色体上にコードされる(図33)。構築されたΔsph3ノックアウトは脱アセチル化GAGを作ることができない。A. fumigatus Af293のsph3及びega3のタンパク質コード配列はそれぞれ、アクセッション番号EAL92786.1及びEAL92787.1でジェンバンクに寄託された。Sph3は、膜貫通ヘリックス(アミノ酸20〜42)をそのN末端に含有することがTMHMMサーバーによって予想されている298個のアミノ酸のタンパク質である(Krogh et al 2001)。TMHMMは、Sph3は細胞の細胞外表面にC末端ドメインをもつII型膜タンパク質として分類する。構造相同性検索から、Sph352−298が(β/α)8TIMバレルフォールドから成ることが示唆されている。Phyre2では、これらのモデルは最高で96.9%の信頼度でグリコシルヒドロラーゼに基づく(Kelley & Sternberg 2009)。ヌクレオチド配列を用いて、推定膜貫通ヘリックスを除く残基52〜298をコードする領域を増幅することになる遺伝子特異的プライマーを設計した。Sph3について、フォワードプライマー、5’−GGGCATATGTCCAAGGTCTTTGTGCCTCTCTATGTG −3’(配列番号9)はNdeI部位をコードし、リバース5’−GGCTCGAGCTATTTTCCCATCAAATCCACAAACTC −3’(配列番号10)はXhoI部位を含む(図34)。PCR増幅産物をNdeI及びXhoIエンドヌクレアーゼを用いて切断し、次にpET28aベクター(ノバジェン社)にライゲーションした。配列は使用前に、ACGT DNA Technologies Corporationによって確認された。
残基52〜298を含むSph352−298構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は1リットルの細菌培養物当たり〜10mg生じ、分子量は29.6kDaである。タンパク質はSDS−PAGEによって純度が>95%であると判断された。タンパク質を8〜10mg/mLに濃縮し、4℃で保存できた(図35)。
方法:
Sph352−298を用いるGAG多糖の加水分解を調べる方法は、PelA47−303の使用に関して実施例17で前述したものと同一である。
Sph352−298がGAG多糖を加水分解できるか否かを判断するために、精製したGAGを用いて還元糖アッセイを完了した。未処理試料と比較して、溶液中の還元末端の数は24時間の反応期間にわたって増加した(図26)。単一位置バリアントD166Aは活性を失った。菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
方法:
Sph352−298を用いるGAGバイオフィルムの分散を調べる方法は、PelA47−303の使用に関して実施例18で前述したものと同一である。A. fumigatusの臨床分離株はマギル大学ヘルスセンターの臨床菌学研究室(clinical mycology lab)から入手した。
外から加えたSph352−298が予め形成されたバイオフィルムを分散できるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。クリスタルバイオレットアッセイを通してされるように、280nMのSph352−298の添加はGAGバイオフィルム形成を防止するのに十分であった(図36)。このことから、Sph352−298は、PelA47−303がP. aeruginosaのPel多糖バイオフィルムを分散させるのと同様の方法で、GAGバイオフィルムを分散できること、及びこの酵素が新規の抗真菌療法でありうることが示唆される。A. fumigatus、A. nidulans、及びA. clavatusの組換えSph3はすべて、A. fumigatusバイオフィルムの形成を用量依存的に阻害する。同様に、3つのアスペルギルス種の可溶性Sph3はすべて、前形成されたA. fumigatusのバイオフィルムを用量依存的に破壊した(図37)。これらの可溶性Sph3タンパク質の触媒ドメインに点変異を導入することは、活性の減少又は消失につながった。これらのタンパク質の抗バイオフィルム活性が酵素活性によって媒介されることが示唆される。A. fumigatusのSph352−298は、A. fumigatusの複数の株に対して活性があることが見出された。これらの薬剤は多様な臨床分離株に対して活性があると思われることが示唆される(図38)。
方法:
ヒドロラーゼ処理のTrichosporon asahiiに対する効果を評価するために、1×105個のT. asahii酵母細胞又はA. fumigatus分生子をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に植え付け、37℃、5% CO2にてカバーガラス上で10時間増殖させた。ウェルをハムF−12K(カイン(Kaighn's))培地(F12K)培地で1回静かに洗い、Sph3AC(54−304)を0.5μMの最終濃度でF12Kに加えた、37℃、5% CO2にてさらに3時間インキュベーションした。若い菌糸をPBSで2回洗い、FITCタグSBAで1時間染色した。染色した試料をPBSで洗い、4% PFAで15分間固定した。次に、スライドをマウントし、シールし、488nmレーザーを備える共焦点顕微鏡(ツァイス)下で撮像した。
図39に示されるように、日和見感染病原真菌Trichosporon asahiiは、Sph3AC(54−304)によって分解できる、GalNAcに富む菌体外多糖を産生する。SBA−FITC染色によって判断されるように、A. fumigatusと同様に、未処理T. asahiiは細胞表面にGalNAc修飾を呈する(左上及び中央)。しかし、0.5μM Sph3AC(54−304)での3時間の処理は、検出可能な表面GalNAcの完全な消失をもたらす(右上)。真菌をDRAQ5で対比染色した(下パネル)。
方法:
Sph352−298を用いたA. fumigatusによって引き起こされる上皮細胞傷害を予防する方法は、PelA47−303の使用に関して実施例19で前述したものと同一である。P. aeruginosaによって誘発される傷害に関して、0.5μMのSph3AN(43−299)の存在又は非存在下でPel産生P. aeruginosaにA549を16時間曝し、哺乳類細胞傷害を乳酸脱水素酵素(LDH)の上清への放出によって分析した。
組換えヒドロラーゼがA. fumigatusによる傷害から宿主細菌を保護できうるか否かを判断するために、クロム放出傷害アッセイを用いてA. fumigatusによるA549肺上皮細胞株の傷害を評価した。A. clavatus、A. nidulans、又はA. fumigatus由来のSph3でのA. fumigatusの処理は上皮細胞への真菌による傷害を減らした(図40A)。なお注目すべきことに、A. clavatus(Sph3AC(54−304))及びA. nidulans(Sph3AN(43−299))のSph3は上皮細胞をA. fumigatusによる傷害から24時間完全に保護した。また、Sph3AN(43−299)はP. aeruginosaによって引き起こされる傷害を減らすことができる(図40B)。
方法:
抗真菌剤と、Sph3AC(54−304)又はPelA47−303との併用治療のA. fumigatus分生子の生育に対する効果をマルチタイタープレートアッセイを用いて判定した。MOPS(3−(N−モルホリノ)プロパン−スルホン酸)(フィッシャー)で緩衝化したRPMI1640培地(Life Technology社)(RPMI−MOPS)中の休眠A. fumigatus分生子を、組織培養用に処理したマルチタイタープレート(BDファルコン社)に加えた。分生子を37℃、5% CO2にて9時間インキュベーションした。抗真菌剤のストック溶液をジメチルスルホキシド(DMSO)で調製し、さらにRPMI−MOPSで希釈した。ヒドロラーゼのストック溶液をRPMI−MOPSで調製及び希釈した。抗真菌化合物を、横列にわたって2倍段階希釈し、0.5μMのSph3AC(54−304)又はPelA47−303を加えた。次に、プレートを37℃及び5% CO2でインキュベーションし、15時間後に倒立光学顕微鏡(ツァイス社)下で観察し、Infinity2カメラ(ルメネラ社)を用いて画像を取得した。続いて、真菌の生存性を測定するために、XTT[2,3−ビス−(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム−5−カルボキシアニリド](シグマ社)代謝アッセイを行った。メナジオン(シグマ社)をXTT溶液に加え、さらにRPMI−MOPSで希釈した。溶液を菌糸に加え、90分間インキュベーションした。分光光度計(ASYS UVM 340)を用いてOD450を測定した。
組換えヒドロラーゼでの処理が抗微生物剤の活性を増強しうるか否かを判断するために、Sph3AC(54−304)及びPelA47−303のA. fumigatusの抗真菌剤感受性に対する効果を調べた。Sph3AF、Sph3AC(54−304)、Sph3AN(43−299)、又はPelA47−303でのA. fumigatusバイオフィルムの処理は、抗真菌剤サコナゾール、アンホテリシンB、及びキャスポファンギンの最小発育阻止濃度のポ≧50%の減少をもたらした(図41)。A. fumigatusの感受性株及び耐性株に関して、同様のMICの減少が見られた。
方法:
赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現するAf293の菌糸を、0.5μM Sph3AC(54−304)ヒドロラーゼで90分間前処理した後、ボディピー結合ポサコナゾール(BDP−PCZ)で処理した。異なる時点で、試料を固定し、蛍光共焦点顕微鏡法を用いて撮像して、菌糸の薬物浸透の速度論を決定した。
組換えグリコシルヒドロラーゼの存在下での抗真菌薬の感受性の増加が、菌体外多糖の非存在下の細胞への浸透の増強に由来するか否かを判断するために、A. fumigatusによるポサコナゾールの取り込みの速度をSph3AC(54−304)の存在又は非存在下で調べた。共焦点顕微鏡法によって可視化されたように、Sph3AC(54−304)での菌糸の処理は、蛍光標識したポサコナゾールの取り込みの速度及び程度を増加させた(図43)。まとめると、これらのデータは、組換えヒドロラーゼによる菌体外多糖の分解は、真菌細胞を浸透する能力を増強することを通して抗真菌薬の活性を増加できることを示す。
方法:
バイオインフォマティクス解析のために、GAG生合成クラスター:AFU_3G07860(Gtb3)、AFU_3G7870(Agd3)、AFU_3G7890(Ega3)、AFU_3G7900(Sph3)、及びAFU_3G7910(Uge3)内の遺伝子のアミノ酸配列をAspergillus属ゲノムデータベース(http://www.aspergillusgenome.org)から入手し、NCBIタンパク質データベースのBLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)で照会した。保存ドメインデータベース(Conserved Domain Database)(CDD)を使用して各推定タンパク質の機能ドメインを予想した。クラスター遺伝子に類似するドメインをもつタンパク質のアミノ酸配列を、ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)を用いた多重整列(MSA)によってアラインメントした。TreeVector(http://supfam.cs.bris.ac.uk/TreeVector/)を用いてクラスターの各メンバーを視覚化するために、得られた系統関係結果(output)をエクスポートし、フォーマットし、描写した。分類学的解析に関して、GAGクラスターを含有する真菌のクラスを選択し、PhyloT(http://phylot.biobyte.de)を用いて視覚化した。
バイオインフォマティクス解析から、多くの子嚢菌及び担子菌Trichosporonの真菌内にGAG生合成の遺伝子クラスターが存在することが明らかになった(図44)。これらに真菌としては、植物病原菌種:Saccharata proteae、Zopfia rhizophila、Phaeosphaeria nodorum、Setosphaeria turcica、Botrytis cinerea、Cryphonectria parasitica、Melanconium sp.、Verticillium dahlia、Nectria haematococca、Neurospora crassa、Leptosphaeria maculans、Pleomassaria siparia、Cochliobolus heterostrophus、Pyrenophora tritici-repentis、Blumeria graminis、Marssonina brunnea、Sclerotinia sclerotiorum、Taphrina deformans、Cercospora zeae-maydis、並びにヒト病原真菌:Fusarium、Trichosporon、及びAspergillus種が挙げられる。これらのクラスターの他の真菌での存在がGAGの産生を予想することを確かめるために、T. asahiiの菌糸(図39)、及びB. cinerea(図45)をGalNAc特異的レクチンで染色してGAGの存在を検出した。これらの種のゲノム内にGAG生合成のクラスターが存在することと一致して、両生物においてレクチン染色はGAG様の菌体外多糖の産生を示した。
方法:
ポリ−D−リジンを被覆したカバーガラス(コーニング社、ベッドフォード、マサチューセッツ州)上で、Botrytis cinerea分離株7b1を6×103個の分生子/mLの濃度で500μlのブレイン培地に、17時間、室温にて暗中で植え付けた。1μM Sph3AC(54−304)の存在下又は非存在下で試料をインキュベーションした。次に培地を除去し、菌糸を1μM Sph3AC(54−304)を含むPBS又は含まないPBS中で室温にて1時間インキュベーションした。試料をPBSで2回洗い、30μg/mLの、フルオレセインに結合したWisteria fluoribunda(WFL)レクチンで4℃にて2時間染色した。試料をPBSで2回洗い、4% パラホルムアルデヒドで10分間、4℃で固定した。試料を1回洗い、1:1000希釈のDRAQ5(商標)(イーバイオサイエンス社、サンディエゴ、カリフォルニア州)で室温にて5分間染色した。試料をPBSで1回洗い、SlowFade(登録商標)Gold褪色防止剤(ライフテクノロジーズ(商標)、ユージーン、オレゴン州)を用いて顕微鏡スライドにマウントし、マニキュア液でシールした。BA505−525及びBA650IFフィルターとそれぞれ連結した488及び633nmレーザーを用いてオリンパスFluoview共焦点レーザー顕微鏡で画像を取得した。ImageJソフトウェア(アメリカ国立衛生研究所)を用いて、0.2μmづつの増加のzスタックを取り込み、3Dレンダリングした。
Sph3AC(54−304)でのB. cinereaの菌糸の処理は、その菌体外多糖の完全な消失をもたらした(図45)。理論に拘束されるものではないが、このデータは組換えヒドロラーゼが他の真菌種のGAGバイオフィルムを消化できることを示唆する。
方法:
バイオインフォマティクス予想は、Ega3がアミノ酸23〜45の単一膜貫通(TM)ヘリックスをもつことを示唆する。アミノ酸46〜318を含むC末端ドメインはTMHMMによって細胞外にあることが予想されている。Phyre2構造相同性認識サーバーは、タンパク質が(β/α)8TIMバレルを含有し、グリコシルヒドロラーゼファミリーGH114に合致すると予想する。E. coliでの発現に最適化されたega3遺伝子コドンを含有するプラスミドをGeneArt社から入手した。予想される細胞外ドメイン、アミノ酸46〜318をコードする配列をpET28ベクターのNdeI及びHindIII部位の間にサブクローニングした。MlyI部位をコードするフォワードプライマー、5’−GGGAGTCATCGTATGGGCAGCAGCCATCATCATCATC−3’(配列番号 24)及びKpnI部位を含有したリバース、5’−GGGGGTACCTTAGCAATATTCCACCCA−3’(配列番号25)を用いて、N末端ヘキサヒスチジンタグをもつEga346−318構築物を増幅した。PCR増幅産物をMlyI及びKpnIエンドヌクレアーゼを用いて切断し、次にエンドヌクレアーゼStuI及びKpnIで予め切断したpPinkα−HCベクター(インビトロジェン社)にライゲーションした。配列は使用前に、ACGT DNA Technologies Corporationによって確かめられた。
残基46〜318を含むEga346−318構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は1リットルの酵母培養物当たり〜3mg生じ、分子量は31.8kDaである。タンパク質はSDS−PAGEによって>95%の純度であると判断された(図46)。タンパク質グリコシル化は、P. pastorisにおいて組み換えタンパク質発現及び分泌の間に良く起こる。グリコシル化に起因してEga346−318の見かけの質量がより大きいか否かを判断するために、タンパク質の試料をエンドグリコシダーゼH(EndoH)で処理した。処理後、試料をSDS−PAGEにかけた。EndoHで処理したEga346−318は、31kDaで非グリコシル化タンパク質の予想質量に近いバンドを生じた。
方法:
A. fumigatus分生子を、ポリスチレンの丸底24ウェルプレートに、DMEM培地中105個の分生子/ウェルの濃度で植え付けた。バイオフィルム形成の阻害を評価するために、1μMの最終濃度でEga346−318を加え、分生子を37℃、5% CO2にて18時間インキュベーションした。次に、結果として生じたバイオフィルムを静かに蒸留水で2回洗い、0.1% クリスタルバイオレットで10分間染色した。試料を水で2回洗い、ウェルを撮像した。
未処理の18時間増殖A. fumigatusバイオフィルムが、静かに洗った後にポリスチレンに付着したままであった一方で、1μM Ega346−318の存在下で増殖させた分生子は全く付着しないことが見出された(図47)。また、1μMの濃度でのEga346−318の、前形成された、18時間、A. fumigatusバイオフィルムへの添加及び室温での1.5時間のインキュベーションは、バイオフィルムの破壊をもたらした。図47から、Ega346−318がA. fumigatusの表面からN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基を分解できることが示唆される。蛍光レクチンSBA−FITCで染色したとき、未処理の菌糸が広い範囲の表面GalNAc修飾を示す一方で(左上)、0.5μM Ega346−318での菌糸の3時間の処理は表面の検出可能なGalNAcの完全な消失をもたらした(右上)。菌糸をDRAQ5で対比染色した(下パネル)。両試料はともにA. fumigatus分生子の同じ密度で植え付け、Ega346−318での処理は結果として付着の消失、すなわち保持された菌糸の消失をもたらしたことに留意することは重要である。
PslG31−442(P. aeruginosa PAO1)
EIQVLKAPRAVVWKDFLGVNAQFLWFSPERYNKQIDRLQDLGLEWVRLDLHWDRLETAEDQYQLASLDQLVKDLEARQLKSVFYLVGSARFITTAPFYSPFQDQYPPRDPEVFARRMAMLSQRYPSVAAWQVWNEPNLIGFWRPKADPEGYAKLLQASTIALRMVDPEKPVVSAGMAFFSEMPDGRTMFDALGHLGVESLGTIATYHPYTQLPEGNYPWNLDFVSHANQINRALRNAGVPAIWSTEWGWSAYKGPKELQDIIGVEGQADYVLRRLALMSALDYDRIFLFTLSDLDQRASVRDRDYGLLDLDANPKPVYLALQRFLKVTGPKLRPADPPVTEDLPDGSFSIGWTREDGRNVWLFWSARGGNVRLPKLKEATLHDPLSGKVTPLSGSDGLEVPVKSSLQMLVWE(配列番号11)
PelA47−303(P. aeruginosa PAO1)
GGPSSVAFWYAERPPLAELSQFDWVVLEAAHLKPADVGYLKEQGSTPFAYLSVGEFDGDAAAIADSGLARGKSAVRNQAWNSQVMDLAAPSWRAHLLKRAAELRKQGYAGLFLDTLDSFQLQAEERREGQRRALASFLAQLHRQEPGLKLFFNRGFEVLPELPGVASAVAVESIHAGWDAAAGQYREVPQDDRDWLKGHLDALRAQGMPIVAIDYLPPERRDEARALAARLRSEGYVPFVSTPALDYLGVSDVEVQP(配列番号12)
PelA35−291(P. protogens Pf−5)
AAPASVGFWYAEQPPLQELAQFEWAVVEPGHMASADVATLRKLGSQPFAYLSVGEFDGNRAALAKQALAQGASPVRNKAWDSQVMDIATPAWREHLFKRAKALQDQGYAGLFLDTLDSFQLLPEADREPQRKALASFLRELHSRLPNLKLFFNRGFEVLGELDGVASAVAVESIHAGWDASAKRYRPVSEADRTWLEGELKPLRARNIPLVAIDYLPANRREEARKLVRQLSQEGFIPVVTTPDLNALSMSTVEVQP(配列番号13)
PelA23-277(Geobacter metallireducens)
PPLSVALYYGKQPPVNDLHAFDIVVIDPDSGLTPSEYGSGRSELFAYVSVGEADTARSYTKQMPDRWIIGKNPVWKSKIVDVSSEEWKQFFLDDVVEPLWQAGYRGFFLDTLDSYLIAAPTEAHPRMEAGLVSVVRAIRQRHPEARLILNRGFEIFDRVKDLVYAVAAESLFQNFNTVSGKYGAVDDKDRSWLTSRLNVIRETGVPVIAIDYVDPGNRPLMRETADKIRSLGFTPWVTDKDLAGLGIGSVEVMPRTVLGLYDGGEGAG(配列番号14)
RagA61−317(Ralstonia solanacearum GMI1000)
ADAPNIAWFYGDKPPVAQLRAFDAVVVEPDHGFDPSRAKTPTTQWFAYVSVGEVAPERRWYKELPKAWLAGSNAAWASHVIDQSQPQWPAFYVDRVIAPLWDRGYRGFFLDTLDSYQLVAKDDAARAAQEAGMVRVIRAIKARYPEAKLIFNRGFEILPQVHDLAYAVAFESLYRAWDQGNKQYREVNDADRAWLMGQARKIQDEYHLPVISIDYCPPADRACARETAKRIKAQGLIPYVTDPALSTIGVGRIEVLP(配列番号15)
PgaB22−672(Escherichia coli K−12 MG1655)
ISQSRTSFIPPQDRESLLAEQPWPHNGFVAISWHNVEDEAADQRFMSVRTSALREQFAWLRENGYQPVSIAQIREAHRGGKPLPEKAVVLTFDDGYQSFYTRVFPILQAFQWPAVWAPVGSWVDTPADKQVKFGDELVDREYFATWQQVREVARSRLVELASHTWNSHYGIQANATGSLLPVYVNRAYFTDHARYETAAEYRERIRLDAVKMTEYLRTKVEVNPHVFVWPYGEANGIAIEELKKLGYDMFFTLESGLANASQLDSIPRVLIANNPSLKEFAQQIITVQEKSPQRIMHIDLDYVYDENLQQMDRNIDVLIQRVKDMQISTVYLQAFADPDGDGLVKEVWFPNRLLPMKADIFSRVAWQLRTRSGVNIYAWMPVLSWDLDPTLTRVKYLPTGEKKAQIHPEQYHRLSPFDDRVRAQVGMLYEDLAGHAAFDGILFHDDALLSDYEDASAPAITAYQQAGFSGSLSEIRQNPEQFKQWARFKSRALTDFTLELSARVKAIRGPHIKTARNIFALPVIQPESEAWFAQNYADFLKSYDWTAIMAMPYLEGVAEKSADQWLIQLTNQIKNIPQAKDKSILELQAQNWQKNGQHQAISSQQLAHWMSLLQLNGVKNYGYYPDNFLHNQPEIDLIRPEFSTAWYPKND(配列番号16)
PgaB310−672(Escherichia coli K−12 MG1655 )
EKSPQRIMHIDLDYVYDENLQQMDRNIDVLIQRVKDMQISTVYLQAFADPDGDGLVKEVWFPNRLLPMKADIFSRVAWQLRTRSGVNIYAWMPVLSWDLDPTLTRVKYLPTGEKKAQIHPEQYHRLSPFDDRVRAQVGMLYEDLAGHAAFDGILFHDDALLSDYEDASAPAITAYQQAGFSGSLSEIRQNPEQFKQWARFKSRALTDFTLELSARVKAIRGPHIKTARNIFALPVIQPESEAWFAQNYADFLKSYDWTAIMAMPYLEGVAEKSADQWLIQLTNQIKNIPQAKDKSILELQAQNWQKNGQHQAISSQQLAHWMSLLQLNGVKNYGYYPDNFLHNQPEIDLIRPEFSTAWYPKND(配列番号17)
BpsB27−701(Bordetella bronchiseptica RB50 )
YKVDMLPPPDPDDGLTFRVLCMHDVRDNLRASFADMPDQFAIETRTLTDLFEWIRVKGFNPISMQQIIDSRAGVRPLPPRPILLTFDDGYASTYTKVFPLLKKFNYPAVVAVVTSWTDAPAGTKIRLSPKIEVPHDFFMTWAQLREMAQSGLVELASHSHNLHRGVLANPQGNEQPAASSRQYLPASGRYENDAEYRARVRQDLKTSADLIREHTGVTIRSIVWPYGAHNRDTDQVAAEVGLNIGLTLQPGPNTPDVALTQIRRSLVDYEVNVATVARAMREPVSYHGQVRPIERIVQVDLDYIYDPDPEQQNRNLGQLIDRMKDLAPSAVYLQAFADPKGDGDITEVYFPNRHLPMRADLFNRVAWQLKTRAGVMVYAWLPVLTFSVPPGNPAYGKVVQSTTRKPGERGLGSPTRLSPFHPDAHRVISEIYEDLAKAAHFDGLLFHDDAVLDDTEDSSPEALATYQGWGLPPDIAAIRADPKLAQQWSKGKIRYLIDFTMHLRHIVSGYQNDRDMVVARNLYAQPVLDPVSEAWYGQSLPEFLKSYDFVALMAMPNMEGAARPEQWMRQLVAAVARQKGLDRTIFELQARDWRVGKPIDTEILRRQMVQLRSLGAINYGYYPDDFIANHPDAEALRDVMSLKSTLEKRRLTKAQELSRQTTLYGSASQAEPTQR(配列番号18)
BpsB318−670(Bordetella bronchiseptica RB50 )
PIERIVQVDLDYIYDPDPEQQNRNLGQLIDRMKDLAPSAVYLQAFADPKGDGDITEVYFPNRHLPMRADLFNRVAWQLKTRAGVMVYAWLPVLTFSVPPGNPAYGKVVQSTTRKPGERGLGSPTRLSPFHPDAHRVISEIYEDLAKAAHFDGLLFHDDAVLDDTEDSSPEALATYQGWGLPPDIAAIRADPKLAQQWSKGKIRYLIDFTMHLRHIVSGYQNDRDMVVARNLYAQPVLDPVSEAWYGQSLPEFLKSYDFVALMAMPNMEGAARPEQWMRQLVAAVARQKGLDRTIFELQARDWRVGKPIDTEILRRQMVQLRSLGAINYGYYPDDFIANHPDAEALRDVMSLKS(配列番号19)
Sph352−298(Aspergillus fumigatus Af293)
SKVFVPLYVYPAPGAWTPLEDVISKHPDVNFTVVINPGSGPGPNALPDGNYTREIPKLASYENVRLLGYVATTYAKRNISLVRRDIETYAAWPTNSSNPALAVRGIFFDETPQQYDEDALAYLQELTDVVKNTPGLGPDHYVVHNPGAIPDSRYLSTADSTVVFEATYDTFQERHGAKLFEAIPDSNRSQLCAVIHSVPESVEGSALRSLVKQVRKVADEIFITHLDTDYYASFGRQWPEFVDLMGK(配列番号20)
Sph3AC(54−304)(Aspergillus clavatus NRRL 1)
MGPKSKVFVPLYVYPAPGAWDPLEDVISKHPDVNFTVVINPGSGPGPEALPDGNYTREIPKLASYENVRLLGYVATTYAKRNISEVRRDIETYAAWPTQSSNANLAVRGIFFDETPQQ YDADILAYLRELTDVVKGTSGLGPDHYVVHNPGAIPDSRYLSTADSTVVFEATYATFQERHGAELFDTIPDSHRDQLCAVIHSVPTSVEGSDLRGLVKQVRQVADEIFITHLETDYYAGFGGQWSEFVDLMAS(配列番号22)
Sph3AN(43−299)(Aspergillus nidulans FGSC A4)
RRKNNNMGPKAKVFVPLYVYPAPGAWDPLVNVITAHPDVNFTVVVNPGSGPGPNPLPDRNYTQEIPRLTAHDNVRVLGYVATTYAKRNISSVRNDIETYAAWPTISANPKLAVRGIFFDETPQQYNASDLAYLEELTSVVKNTPGLGPDHFVFHNPGVVPDPRYLSTADSTVVFEATYDTFQDRDGARLFETIPNSNRSQLCAVVHSVPDSVEGSELRKFVKQARRVADEIFVTHLSTNYYASFGDKWDDFVRLMAQ(配列番号23)
Ega346−318Aspergillus fumigatus Af293)
GLGGGGGGEGEEGSGGETTPPEGNYTTAKWQPAVGTKWQIELLYALNDTSVDAEIYDIDLFINDKSTIAGLQRAGRKVICYFSAGSYENWRPDKDKFKDSDLGHDLDDWPGEKWLNISSANVRQIMLDRLDMARDKGCDGVDPDNVDGYDNDNGLDLTQADSISFVNFLANAAHARNMSIGLKNAGDIIPSVIKNMQWSVNEQCAQYNECDTYAVFPQNGKPVFHIEYPKGDKTNNDLSVTASQKNAACDFAGSANFSTVIKNMNLNNWVEYC(配列番号21)
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Claims (78)
- 少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、又は全ての:(i)Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、(ii)PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iii)BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iv)PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(v)PslGグリコシルヒドロラーゼ(GH)ドメインを含む可溶性タンパク質、及び(vi)Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログを、それらを必要としている動物又は植物に投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法。
- 前記Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92786.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸52〜298又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAW09379.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸54〜304又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAA63523.1でジェンバンクに寄託されているSph配列のアミノ酸43〜299又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG06452.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸47〜303若しくはアクセッション番号AAY92244.2でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸35〜291又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記PelA GHドメインオーソログを含むタンパク質が、アクセッション番号CAQ62201.1でジェンバンクに寄託されているRagA配列のアミノ酸61〜317若しくはアクセッション番号ABB32191.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸23〜277又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号CAE32265.1でジェンバンクに寄託されているBpsB配列のアミノ酸318〜670若しくはアミノ酸27〜701又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAC74108.1でジェンバンクに寄託されているPgaB配列のアミノ酸310〜672若しくはアミノ酸22〜672又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記PslG GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG05625.1でジェンバンクに寄託されているPslG配列のアミノ酸31〜442又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92787.1でジェンバンクに寄託されているEga3配列のアミノ酸46〜318又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項1に記載の方法。
- 前記バイオフィルム関連感染症が、前記動物における創傷、熱傷後感染、角膜炎、生物義装具、又は留置医療装置感染の結果である請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオフィルム関連感染症が前記動物の肺にあり、前記動物が慢性肺疾患又は肺感染症をもつ請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオフィルム関連感染症が前記植物又は植物部位の表面にある請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオフィルム関連感染症の前記バイオフィルムが、Pel依存性、Psl依存性、PNAG依存性、及び/又はGAG依存性バイオフィルムである請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオフィルム関連感染症が、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、T. asahii、B. cineria、及びFusarium spp.によって引き起こされる請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 抗菌剤を前記それらを必要としている動物又は植物に併用投与することをさらに含む請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの可溶性タンパク質がベクターによって発現され、前記方法が前記ベクターを前記それらを必要としている動物又は植物に投与することを含む請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、前記バイオフィルムの細菌に侵入できるファージベクターである請求項18に記載の方法。
- 前記ベクターが、前記バイオフィルムの真菌に侵入できるマイコウイルスベクターである請求項18に記載の方法。
- 留置医療装置又はインプラントにおけるバイオフィルム形成を防止する方法であって、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、又はすべての:(i)Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、(ii)PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iii)BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iv)PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(v)PslGグリコシルヒドロラーゼ(GH)ドメインを含む可溶性タンパク質、及び(vi)Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで、それらを必要としている動物に使用する前に、前記装置を被覆することを含む方法。
- 前記Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92786.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸52〜298又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAW09379.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸54〜304又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAA63523.1でジェンバンクに寄託されているSph配列のアミノ酸43〜299又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG06452.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸47〜303若しくはアクセッション番号AAY92244.2でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸35〜291、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号CAQ62201.1でジェンバンクに寄託されているRagA配列のアミノ酸61〜317若しくはアクセッション番号ABB32191.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸23〜277、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号CAE32265.1でジェンバンクに寄託されているBpsB配列のアミノ酸318〜670若しくはアミノ酸27〜701又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAC74108.1でジェンバンクに寄託されているPgaB配列のアミノ酸310〜672若しくはアミノ酸22〜672又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記PslG GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG05625.1でジェンバンクに寄託されているPslG配列のアミノ酸31〜442又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92787.1でジェンバンクに寄託されているEga3配列のアミノ酸46〜318又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項21に記載の方法。
- 前記留置医療装置又はインプラントがカテーテル又は静脈内チューブである請求項21〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記留置医療装置又はインプラントが人工関節又は生物義装具である請求項21〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオフィルムが、Pel依存性、Psl依存性、PNAG依存性、及び/又はGAG依存性バイオフィルムである請求項21〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオフィルムがP. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、及びFusarium spp.によって引き起こされる請求項21〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記留置医療装置又はインプラントを抗菌剤で被覆することをさらに含む請求項21〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項35に記載の方法。
- バイオフィルム形成の影響を受けやすい非医療用表面のバイオフィルム形成を処理又はする方法であって、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、又はすべての:(i)Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、(ii)PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iii)BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iv)PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(v)PslGグリコシルヒドロラーゼ(GH)ドメインを含む可溶性タンパク質、及び(vi)Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで、それらを必要としている動物に使用する前に、前記表面を塗布すること又は前記表面を被覆することを含む方法。
- 前記Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92786.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸52〜298又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAW09379.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸54〜304又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAA63523.1でジェンバンクに寄託されているSph配列のアミノ酸43〜299又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG06452.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸47〜303若しくはアクセッション番号AAY92244.2でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸35〜291又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号CAQ62201.1でジェンバンクに寄託されているRagA配列のアミノ酸61〜317若しくはアクセッション番号ABB32191.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸23〜277、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号CAE32265.1でジェンバンクに寄託されているBpsB配列のアミノ酸318〜670若しくはアミノ酸27〜701又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAC74108.1でジェンバンクに寄託されているPgaB配列のアミノ酸310〜672若しくはアミノ酸22〜672又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記PslG GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG05625.1でジェンバンクに寄託されているPslG配列のアミノ酸31〜442又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92787.1でジェンバンクに寄託されているEga3配列のアミノ酸46〜318又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項37に記載の方法。
- 前記バイオフィルム関連感染症の前記バイオフィルムが、Pel依存性、Psl依存性、PNAG依存性、及び/又はGAG依存性バイオフィルムである請求項37〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオフィルムが、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、及び/又はFusarium spp.によって引き起こされる請求項37〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 抗菌剤と併用投与する又は抗菌剤で被覆することをさらに含む請求項37〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項49に記載の方法。
- 少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、又はすべての:(i)Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、(ii)PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iii)BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iv)PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(v)PslGグリコシルヒドロラーゼ(GH)ドメインを含む可溶性タンパク質、及び(vi)Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで被覆された留置医療装置又はインプラント。
- 前記Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92786.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸52〜298又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAW09379.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸54〜304又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAA63523.1でジェンバンクに寄託されているSph配列のアミノ酸43〜299又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記PelA GHドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号AAG06452.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸47〜303若しくはアクセッション番号AAY92244.2でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸35〜291又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号CAQ62201.1でジェンバンクに寄託されているRagA配列のアミノ酸61〜317若しくはアクセッション番号ABB32191.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸23〜277、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記BpsB GHドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号CAE32265.1でジェンバンクに寄託されているBpsB配列のアミノ酸318〜670若しくはアミノ酸27〜701又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記PgaB GHドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号AAC74108.1でジェンバンクに寄託されているPgaB配列のアミノ酸310〜672若しくはアミノ酸22〜672又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記PslG GHドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号AAG05625.1でジェンバンクに寄託されているPslG配列のアミノ酸31〜442又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92787.1でジェンバンクに寄託されているEga3配列のアミノ酸46〜318又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記装置又はインプラントがさらに抗菌剤で被覆される請求項51に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項61に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記留置医療装置がカテーテル又は静脈内チューブである請求項51〜62のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記留置医療装置が人工関節又は生物義装具である請求項51〜62のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記バイオフィルムが、Pel依存性、Psl依存性、PNAG依存性、及び/又はGAG依存性バイオフィルムである請求項51〜64のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
- 前記バイオフィルムが、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.及び/又はFusarium spp.によって引き起こされる請求項51〜64のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
- (i)Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、(ii)PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iii)BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(iv)PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質、(v)PslGグリコシルヒドロラーゼ(GH)ドメインを含む可溶性タンパク質、若しくは(vi)Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログ、又はその組み合わせをコードするベクター。
- 前記Sph3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92786.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸52〜298又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAW09379.1でジェンバンクに寄託されているSph3配列のアミノ酸54〜304又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記Sph3 GHドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAA63523.1でジェンバンクに寄託されているSph配列のアミノ酸43〜299又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG06452.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸47〜303若しくはアクセッション番号AAY92244.2でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸35〜291又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記PelA GHドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号CAQ62201.1でジェンバンクに寄託されているRagA配列のアミノ酸61〜317若しくはアクセッション番号ABB32191.1でジェンバンクに寄託されているPelA配列のアミノ酸23〜277、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記BpsB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号CAE32265.1でジェンバンクに寄託されているBpsB配列のアミノ酸318〜670若しくはアミノ酸27〜701又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記PgaB GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAC74108.1でジェンバンクに寄託されているPgaB配列のアミノ酸310〜672若しくはアミノ酸22〜672又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記PslG GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号AAG05625.1でジェンバンクに寄託されているPslG配列のアミノ酸31〜442又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記Ega3 GHドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号EAL92787.1でジェンバンクに寄託されているEga3配列のアミノ酸46〜318又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項67に記載のベクター。
- 前記ベクターが溶菌ファージである請求項67〜77のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターがマイコウイルスである請求項67〜77のいずれか一項に記載のベクター。
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