CN111019876B - 一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法及应用 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法及应用。构建方法包括以下步骤：敲除铜绿假单胞菌中pelF、pslA‑B、T3SS、Pf4和fabV基因或基因簇构建弱毒菌株PAO1Δ5，以此为底盘生物，在其基因组中融合表达prtN基因,同时在其细胞中过表达pelA、pslG、dspB以及lys，即为工程菌PAO1104。本发明工程菌PAO1104可在不同条件下启动两种细胞裂解机制，诱导工程菌裂解释放过表达的多糖水解酶PelA、PslG、DspB，从而快速破坏细菌生物被膜；以及释放不包含前导肽的溶葡萄球菌素蛋白Lys，裂解杀死被破坏的生物被膜中露出的金黄色葡萄球菌或工程菌接触到的金黄色葡萄球菌。

Description

一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，还涉及上述工程菌的应用。
背景技术
在细菌生长过程中，尤其是在不利生存的环境中，细菌往往会形成生物被膜保护自身，生物被膜可以由单一细菌形成，也可以由不同细菌共同形成，尤其在水域等潮湿的自然环境中生物被膜通常由复杂的细菌群落共同形成，这对于彻底清除带来很大的困扰。细菌生物被膜广泛存在于各种含水的潮湿表面上，例如食品、食品加工设备、自来水管道、工业管道、通风设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官表面等，它是由附着于惰性或活性实体表面的细菌细胞和包裹细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落，不仅可以通过残留、接触的方式引起污染，还可通过散播微生物或微生物团形成微生物气溶胶的方式污染整个生态，在食品加工生产中会污染食品，给企业带来经济损失，给消费者的健康带来危害。已经形成的生物被膜对抗生素和宿主防御系统具有很强的抵抗能力，这通常也是临床治疗细菌感染时治疗不彻底，易反复的原因之一。
生物被膜是由蛋白质，胞外DNA(eDNA)和胞外多糖等组成的细胞外基质中嵌入的复杂细菌群落。其中，生物膜基质中的胞外多糖在生物被膜结构的支撑骨架中起了关键作用，也是革兰氏阳性和革兰氏阴性病原细菌形成生物膜和其完整性所必需的，同时胞外多糖结构也起削弱抗生素渗透，提供抵抗宿主免疫细胞吞噬作用的屏障的作用。在生物被膜形成菌中，研究最为深入的是铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌独特的生物学特性，易产生耐药菌株，与生物被膜形成密切相关，因此它形成生物膜的能力被认为是该生物体成功导致人类持续感染的重要因素。
目前，由于生物膜基质对于抗菌剂的持久性和耐药性至关重要，因此相关研究主要集中在开发各种化合物预防生物被膜形成，这些方法通过激活内在细菌反应来抑制生物膜形成。然而，大多数化合物不能破坏已建立的生物膜，仅一氧化氮，顺式-2-癸烯酸和一些抗生物膜肽已被证明能够介导铜绿假单胞菌生物膜的预防和破坏。但这些分子针对铜绿假单胞菌PAO1菌株进行了测试，需要较长时间才能有效对抗已建立的生物膜，并且它们缺乏特异性可能会对天然微生物群产生负面影响。除此之外，临床上唯一有效破坏铜绿假单胞菌生物被膜的方式是使用脱氧核糖核酸酶I。由于eDNA参与了初始生物膜的建立，通过脱氧核糖核酸酶I处理水解细胞外基质内的eDNA发挥功能，但是该疗法仅仅对未完全成熟的生物被膜破坏效果比较明显。在工业、养殖业等领域去除生物被膜主要采用机器打捞、超声波处理等，这些方法费用达、耗时耗力，且存在生物被膜去除效果弱，去除不彻底等问题，而且在一些特殊环境如：管道深处，水域底部等，传统手段完全不能发挥作用。
除了细菌生物被膜污染问题，生活中还经常遭遇金黄色葡萄球菌感染问题，金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，食品中的重要微生物检测指标，能够造成食品污染、引起细菌性食物中毒，在冷冻食品、动物性食品和蔬菜制品、粮食制品等食品中常有检出，是最常见的食源性致病菌之一，常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、化脓疮口中，空气、土壤、污水等环境中也无处不在，在一定条件下可产生多种毒素如：肠溶素，其具有热稳定性，对人体肠道产生破坏，导致呕吐腹泻等症状。由于金黄色葡萄球菌广泛的存在性、超强感染能力和耐受性，成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。由于自然环境中由不同细菌形成的复杂生物被膜中通常也包裹着金黄色葡萄球菌，特别是铜绿假单胞菌经常与金黄色葡萄球菌形成混合生物膜，这为金黄色葡萄球菌二次感染提供了有力的保护。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种铜绿假单胞菌的工程菌的构建方法，用于破坏或预防细菌生物被膜形成及裂解金黄色葡萄球菌。
本发明的第二个目的是提供上述工程菌的应用。
本发明所采用的第一个技术方案为：一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，按照以下步骤实施：
步骤1、敲除铜绿假单胞菌的pelF，pslA-B、pscF、fabV基因，经筛选、鉴定获得无抗性筛选标记的基因删除突变株PAO1△4；
步骤2、将胞外多糖水解酶PelA、PslG，糖苷水解酶DspB，诱导金黄色葡萄球菌裂解的溶葡萄球菌素蛋白Lys的编码基因串联克隆到表达载体pBBR1MCS-6，获得重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys；
步骤3、将铜绿假单胞菌的PA2069启动子与溶菌素激活蛋白基因prtN融合并克隆至pUT18C-mini-Tn7T-Gm，获得重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm；
步骤4、将步骤1得到的PAO1△4继续敲除铜绿假单胞菌基因组上编码Pf4噬菌体的基因簇，经筛选、鉴定获得Pf4无抗性筛选标记的基因删除突变株PAO1△5；
步骤5、将步骤3获得的重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm与辅助质粒pTNS3共转化至步骤4获得的PAO1△5菌株中，经抗性筛选获得基因组融合菌株PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm，通过质粒接合转移和抗性筛选利用辅助质粒pFLP2去除PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm菌株中的抗性基因，获得无Gm抗性筛选标记基因的菌株PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN；通过质粒接合转移将步骤2获得的重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys转化到PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN菌株中，获得本发明的工程菌PAO1104。
本发明所采用第一种技术方案的特点还在于，
步骤1包括以下步骤：以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板分别PCR扩增pelF的上下游序列，通过重叠延伸PCR构建△pelF，从质粒p34s-Gm上酶切庆大霉素抗性基因GmR，将GmR基因连接到△pelF的一侧，构建基因敲除盒△pelF-GmR，将△pelF-GmR克隆至自杀载体pK18mobsacB上，转化大肠杆菌S17-1构建重组菌，并通过接合作用将重组菌中的重组自杀性载体导入铜绿假单胞菌，结合抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定，获得无抗性筛选标记的pelF基因删除突变株PAO1△1。
步骤2包括以下步骤：分别PCR扩增铜绿假单胞菌的fabV基因序列和pBBR1MCS-5载体上的非Gm抗性基因序列，经酶切和连接构建重组载体pBBR1MCS-5-GmR::fabV；同时PCR扩增pME6032载体上tac启动子，克隆至重组载体pBBR1MCS-5-GmR::fabV上，获得双启动子重组载体pBBR1MCS-5-Ptac-GmR::fabV，命名为pBBR1MCS-6；PCR扩增铜绿假单胞菌PAO1的胞外多糖水解酶基因pelA和pslG、放线共生放线杆菌CU1000的糖苷水解酶基因dspB，金黄色葡萄球菌NRRLB-2628中不包含前导肽的溶葡萄球菌素编码基因lys，经酶切后连接到pBBR1MCS-6载体上，构建重组载体pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys，转化大肠杆菌S17-1获得重组菌株S17-A。
步骤3包括以下步骤：PCR扩增铜绿假单胞菌的PA2069启动子和prtN基因，经酶切，连接到pUC18T-mini-Tn7T-Gm质粒上，获得重组质粒pUC18T-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm。
步骤4包括以下步骤：以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板分别PCR扩增Pf4基因簇的上下游序列，通过重叠延伸PCR或酶切连接的方法构建△Pf4，从质粒p34s-Gm上酶切GmR基因，将GmR基因连接到△Pf4的一侧，构建基因敲除盒△Pf4-GmR，克隆至自杀载体pK18mobsacB上，并转化大肠杆菌S17-1获得重组菌；通过接合作用将该重组菌的重组自杀性载体导入PAO1△4，结合抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定，获得无抗性筛选标记的Pf4基因簇删除突变株PAO1△5。
步骤5包括以下步骤：
步骤5.1、将步骤3获得的重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm与辅助质粒pTNS3共转化至步骤4获得的PAO1△5菌株中，经抗性筛选获得基因组融合菌株PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm；
步骤5.2、通过质粒接合转移作用，将S17-1 pFLP2菌株中的pFLP2质粒导入步骤5.1的PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm菌株中，结合抗性筛选、蔗糖筛选，获得无Gm抗性筛选标记的菌株PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN；
步骤5.3、通过质粒接合转移作用，将步骤2获得的重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys导入步骤5.2的PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN菌株中，通过抗性筛选，获得最终的工程菌PAO1104。
本发明的第二个技术方案为：工程菌PAO1104的应用，工程菌PAO1104可裂解释放胞外多糖水解酶PelA和PslG、糖苷水解酶DspB及不包含前导肽的溶葡萄球菌素蛋白Lys。
工程菌PAO1104可特异性破坏细菌生物被膜结构中的骨架成分胞外多糖，从而快速破坏细菌生物被膜；所述工程菌PAO1104还可以裂解杀死被破坏的生物被膜中露出的金黄色葡萄球菌或工程菌接触到的金黄色葡萄球菌，解决环境中金黄色葡萄球菌污染问题。
工程菌PAO1104可启动两种细胞裂解机制，使工程菌裂解释放出目的蛋白从而发挥作用。
可在工程菌PAO1104中表达目的蛋白并实现靶向投放，从而执行不同的生防功能。
本发明的有益特点是：通过过表达胞外多糖水解酶PelA、PslG和糖苷水解酶DspB，经酶解反应可特异性破坏细菌生物被膜结构中的骨架成分胞外多糖，从而快速破坏细菌生物被膜。此外，构建的工程菌中还表达了溶葡萄球菌素蛋白Lys，可裂解杀死被破坏的生物被膜中露出的金黄色葡萄球菌或工程菌接触到的金黄色葡萄球菌，解决环境中金黄色葡萄球菌污染问题。
另外，为了使过表达的目的蛋白在生物防治过程中更好的释放到胞外，本发明设计了两种裂解机制，使工程菌可以在不同条件下裂解释放出目的蛋白从而发挥作用，该方法亦可解决因工程菌逃逸带来的潜在威胁。同时，根据不同的生物防治需求，可在该工程菌中表达不同的目的蛋白并实现靶向投放，从而执行不同的生防功能，因此该工程菌的适用范围广泛，开发潜力巨大。
附图说明
图1是本发明一种铜绿假单胞菌工程菌PAO1104的构建流程图；
图2是本发明主动裂解方式中过表达prtN对铜绿假单胞菌裂解效果图；
图3是本发明被动裂解方式中敲除Pf4基因簇后铜绿假单胞菌对Pf4噬菌体敏感性的变化；
图4是本发明一种铜绿假单胞菌工程菌PAO1104的发挥作用模型图；
图5是本发明仅过表达pelA、pslG的工程菌对铜绿假单胞菌生物被膜的破坏效果图；
图6是本发明仅过表达pelA、pslG的工程菌对抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的效果图。
图7是本发明仅过表达pelA、pslG的工程菌对生物被膜抗生素耐药性的影响效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
如图1所示，为本发明一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法的流程图，按照以下步骤进行：
步骤1、以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板分别PCR扩增pelF的上下游序列，通过重叠延伸PCR或酶切连接的方法构建△pelF，从质粒p34s-Gm上酶切GmR基因，酶切后将GmR基因连接到△pelF的一侧，构建基因敲除盒△pelF-GmR，将基因敲除盒△pelF-GmR克隆至自杀载体pK18mobsacB上，再转化大肠杆菌S17-1构建重组菌，并通过接合作用将该重组菌中的重组自杀性载体导入铜绿假单胞菌，结合抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定，获得无抗性筛选标记的pelF基因删除突变株，命名为PAO1△1，再按照上述方法继续连续敲除pslA-B、pscF、fabV，获得的四重基因突变株命名为PAO1△4。
由于铜绿假单胞菌形成的生物被膜主要分为：pel型和psl型，因此敲除pelF和pslA-B可丧失铜绿假单胞菌形成生物被膜的能力；作为铜绿假单胞菌重要毒力因子的Ш型分泌系统T3SS，不管是敲除表达调控基因exsC、exsA或其针筒状结构蛋白编码基因pscF，都可破坏铜绿假单胞菌T3SS毒力系统，即可构建铜绿假单胞菌弱毒株；敲除作为三氯生抗性靶点的烯脂酰ACP还原酶编码基因fabV，可使铜绿假单胞菌对三氯生的敏感。
步骤2、为了用铜绿假单胞菌自身的三氯生抗性靶点基因fabV替换pBBR1MCS-5质粒上的Gm抗性基因，分别PCR扩增铜绿假单胞菌的fabV基因序列和pBBR1MCS-5载体上的非Gm抗性基因序列，经酶切和连接构建重组载体pBBR1MCS-5-GmR::fabV；同时PCR扩增pME6032载体上tac启动子，克隆至重组载体pBBR1MCS-5-GmR::fabV上，获得双启动子重组载体pBBR1MCS-5-Ptac-GmR::fabV，命名为pBBR1MCS-6；PCR扩增铜绿假单胞菌PAO1的胞外多糖水解酶基因pelA和pslG、放线共生放线杆菌CU1000的糖苷水解酶基因dspB，金黄色葡萄球菌NRRLB-2628中不包含前导肽的溶葡萄球菌素编码基因lys，经酶切后连接到pBBR1MCS-6载体上，构建重组载体pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys，转化大肠杆菌S17-1获得重组菌株S17-A。
步骤3、PCR扩增铜绿假单胞菌的PA2069启动子和prtN基因，经酶切，连接到pUC18T-mini-Tn7T-Gm质粒上，获得重组质粒pUC18T-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm。
本发明使用受群体感应系统调控的PA2069启动子是为了使工程菌中过表达的目的蛋白能随着细胞生长而大量积累，等到细胞密度到达阈值时再启动主动裂解机制，此时溶菌素激活蛋白PrtN可以诱导溶菌素蛋白产生而使铜绿假单胞菌细胞主动裂解。如图2所示，为验证过表达的溶菌素激活蛋白PrtN对铜绿假单胞菌的裂解效果图，在辅助质粒pTNS3的帮助下将重组质粒pUC18T-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm电转导入PAO1中获得的基因组整合菌株作为实验菌株，以基因组中整合不带prtN的重组质粒的菌株作为对照，每隔6h在培养基中检测两种菌株的OD600，结果显示在细菌生长前期两种菌株生长没有差异，在生长24h后细菌进入稳定生长期，实验菌株较对照菌株出现明显的生长衰退现象，说明细菌生长到稳定期时PA2069的启动子启动PrtN蛋白表达从而诱导细胞裂解。
步骤4、以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板分别PCR扩增Pf4基因簇的上下游序列，通过重叠延伸PCR或酶切连接的方法构建△Pf4，从质粒p34s-Gm上酶切GmR基因，将GmR基因连接到△Pf4的一侧，构建基因敲除盒△Pf4-GmR，克隆至自杀载体pK18mobsacB上，转化大肠杆菌S17-1获得重组菌，并通过接合作用将重组菌中的重组自杀性载体导入PAO1△4，结合抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定，获得无抗性筛选标记的Pf4基因簇删除突变株，命名为PAO1△5。
本发明步骤4中敲除铜绿假单胞菌基因组上编码Pf4噬菌体的完整基因簇，可显著提高铜绿假单胞菌对Pf4噬菌体的敏感性，进而可利用环境中特别是生物被膜中的Pf4噬菌体来裂解工程菌。如图3所示，当敲除铜绿假单胞菌基因组上Pf4噬菌体的包括噬菌体整合位点在内的完整基因簇时，相比于野生PAO1菌株，PAO1△Pf4突变株对Pf4噬菌体的敏感性提高了104倍。所以当工程菌遇到生物被膜中或环境中的Pf4噬菌体时可以很容易被Pf4噬菌体裂解。
步骤5、将步骤1～4组合在一起，即可构建完整的用于破坏细菌生物被膜及裂解金黄色葡萄球菌的工程菌，具体的操作步骤如下：
步骤5.1、将步骤3获得的重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm与辅助质粒pTNS3共转化至步骤4获得的PAO1△5菌株中，经抗性筛选获得基因组融合菌株PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm；
步骤5.2、通过质粒接合转移作用，将S17-1 pFLP2菌株中的pFLP2质粒导入步骤5.1的PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm菌株中，结合抗性筛选、蔗糖筛选，获得无Gm抗性筛选标记的菌株PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN；
步骤5.3、通过质粒接合转移作用，将步骤2获得的重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys导入步骤5.2的PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN菌株中，通过抗性筛选，获得最终的工程菌PAO1104。
本发明一种铜绿假单胞菌工程菌的效果原理如图4所示，本发明的工程菌可用于快速破坏细菌已形成的生物被膜、抑制细菌生物被膜的形成及特异性杀死金黄色葡萄球菌。为了验证最终构建的工程菌PAO1104破坏生物被膜、杀死金黄色葡萄球菌的效果，可以使用以下方法：
方法一：生物被膜破坏实验
将培养OD600至1.0的细菌，用新鲜培养基按1：100稀释后，混匀；取100μL加入96孔PVC板中，37℃静置培养24h；吸去培养液，用PBS洗涤PVC板两次，以除去非粘附细胞和培养基；加入工程菌孵育4～8h，然后用PBS洗涤PVC板两次将反应淬灭，空气中干燥；加入0.1％结晶紫对形成的生物被膜染色10min，再用PBS洗涤两次；最后用95％乙醇洗提96孔板上每孔中生物被膜上结合的结晶紫，并用酶标仪测定洗提液的OD570进行生物被膜定量。
方法二：生物被膜预防实验
生物被膜形成细菌和工程菌以1:1接种量共培养至OD600＝1.0，用新鲜培养基按1：100稀释后，混匀；取100μL加入96孔PVC板中，37℃静置培养24h；吸去培养液，用PBS洗涤PVC板两次，空气中干燥；加入0.1％结晶紫对形成的生物膜染色10min，再用PBS洗涤两次；用95％乙醇洗提96孔板上每孔中生物被膜上结合的结晶紫，并用酶标仪测定洗提液的OD570进行生物被膜定量。
方法三：工程菌对生物被膜包裹的金黄色葡萄球菌的裂解实验
生物被膜形成细菌和带有抗性筛选标记基因的金黄色葡萄球菌分别培养OD600至1.0，分别用新鲜培养基按1：100稀释后，两种菌各取50μL加入PVC板中，混匀后37℃静置培养24h；吸去培养液，用PBS洗涤PVC板两次，即得到包裹有金黄色葡萄球菌的生物被膜；加入工程菌孵育4～8h后，PBS洗涤PVC板将反应淬灭；通过刮擦PVC板并用力吸打，确保洗下PVC板上粘附的所有细胞以防止实验偏差，接着将附着的生物被膜和被包裹的细胞用PBS重悬；通过连续10倍稀释，每个稀释梯度吸取3μl菌液，在相应金黄色葡萄球菌的抗性平板上点板，通过CFU计数定量工程菌杀死金黄色葡萄球菌的能力。
为了验证本发明获得的工程菌能否发挥效果，我们构建仅过表达pelA、pslG的工程菌结合方法一、方法二和方法三分别检测了该工程菌对已形成的生物被膜的破坏效果、抑制生物被膜形成的效果以及生物被膜抗生素耐药性的影响。
如图5所示，构建的仅过表达pelA、pslG的工程菌使用方法一检测该工程菌对已形成的生物被膜的破坏效果，结果显示与未表达pelA、pslG的对照菌株相比，过表达pelA、pslG的工程菌将已经形成的生物被膜破坏了47.3％，这种差异达到显著水平p<0.001。
如图6所示，将野生铜绿假单胞菌与构建的仅过表达pelA、pslG的工程菌共培养后，与未表达pelA、pslG的对照菌株相比，形成的生物被膜量下降了52.8％，这种差异达到显著水平p<0.001。
如图7所示，按方法一的操作流程获得野生铜绿假单胞菌形成的生物被膜，单独或同时加入仅过表达pelA、pslG的工程菌和妥布霉素，孵育8h后，通过方法三的平板计数法对生物被膜包裹的细菌存活数进行计数，图中前五组分别显示了不处理、单独加对照工程菌、单独加实验工程菌、单独加妥布霉素以及同时加入对照工程菌和妥布霉素时生物被膜中的存活菌数，结果显示该条件下生物被膜中的存活菌数没明显差异；而相比前五组对照实验，第六组中同时加入过表达pelA、pslG的工程菌和妥布霉素，其生物被膜中存活菌数降低了37.5％，这种差异达到显著水平p<0.001。
以上结果说明，铜绿假单胞菌经裂解机制裂解，释放表达的胞外多糖水解酶PelA和PslG使生物被膜中的胞外多糖水解而破坏生物被膜，而导致生物被膜中包裹的细菌裸露出来，最终被妥布霉素杀死。
综上可知：本发明的工程菌能够起生防作用，表明该工程菌的设计思路和方案可行。同时本发明可根据不同的生物防治需求，在该工程菌中表达不同的目的蛋白并实现靶向投放，从而执行不同的生防功能，因此该工程菌的适用范围广泛，开发潜力巨大。

Claims (10)

1.一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，按照以下步骤实施：
步骤1、敲除铜绿假单胞菌的pelF，pslA-B、pscF、fabV基因，经筛选、鉴定获得无抗性筛选标记的基因删除突变株PAO1△4；
步骤2、将胞外多糖水解酶PelA、PslG，糖苷水解酶DspB，诱导金黄色葡萄球菌裂解的溶葡萄球菌素蛋白Lys的编码基因串联克隆到表达载体pBBR1MCS-6，获得重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys；
步骤3、将铜绿假单胞菌的PA2069启动子与溶菌素激活蛋白基因prtN融合并克隆至pUT18C-mini-Tn7T-Gm，获得重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm；
步骤4、将步骤1得到的PAO1△4继续敲除铜绿假单胞菌基因组上编码Pf4噬菌体的基因簇，经筛选、鉴定获得Pf4无抗性筛选标记的基因删除突变株PAO1△5；
步骤5、将步骤3获得的重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm与辅助质粒pTNS3共转化至步骤4获得的PAO1△5菌株中，经抗性筛选获得基因组融合菌株PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm，通过质粒接合转移和抗性筛选利用辅助质粒pFLP2去除PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm菌株中的抗性基因，获得无Gm抗性筛选标记基因的菌株PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN；通过质粒接合转移将步骤2获得的重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys转化到PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN菌株中，获得最终的工程菌PAO1104。
2.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括以下具体步骤：
以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板分别PCR扩增pelF的上下游序列，通过重叠延伸PCR构建△pelF，从质粒p34s-Gm上酶切抗性基因GmR，将GmR基因连接到△pelF的一侧，构建基因敲除盒△pelF-GmR，将△pelF-GmR克隆至自杀载体pK18mobsacB上，转化大肠杆菌S17-1构建重组菌，并通过接合作用将重组菌中的重组自杀性载体导入铜绿假单胞菌，结合抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定，获得无抗性筛选标记的pelF基因删除突变株PAO1△1，按照上述方法继续连续敲除pslA-B、pscF和fabV，获得四重基因突变株PAO1△4。
3.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤2包括以下具体步骤：
分别PCR扩增铜绿假单胞菌的fabV基因序列和pBBR1MCS-5载体上的非Gm抗性基因序列，经酶切和连接构建重组载体pBBR1MCS-5-GmR::fabV；同时PCR扩增pME6032载体上tac启动子，克隆至重组载体pBBR1MCS-5-GmR::fabV上，获得双启动子重组载体pBBR1MCS-5-Ptac-GmR::fabV，命名为pBBR1MCS-6；PCR扩增铜绿假单胞菌PAO1的胞外多糖水解酶基因pelA和pslG、放线共生放线杆菌CU1000的糖苷水解酶基因dspB，金黄色葡萄球菌NRRLB-2628中不包含前导肽的溶葡萄球菌素编码基因lys，经酶切后连接到pBBR1MCS-6载体上，构建重组载体pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys，转化大肠杆菌S17-1获得重组菌株S17-A。
4.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤3包括以下具体步骤：
PCR扩增铜绿假单胞菌的PA2069启动子和prtN基因，经酶切，连接到pUC18T-mini-Tn7T-Gm质粒上，获得重组质粒pUC18T-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm。
5.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤4包括以下具体步骤：
以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板分别PCR扩增Pf4基因簇的上下游序列，通过重叠延伸PCR或酶切连接的方法构建△Pf4，从质粒p34s-Gm上酶切GmR基因，将GmR基因连接到△Pf4的一侧，构建基因敲除盒△Pf4-GmR，克隆至自杀载体pK18mobsacB上，并转化大肠杆菌S17-1获得重组菌；通过接合作用将该重组菌的重组自杀性载体导入PAO1△4，结合抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定，获得无抗性筛选标记的Pf4基因簇删除突变株PAO1△5。
6.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤5包括以下步骤：
步骤5.1、将步骤3获得的重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm与辅助质粒pTNS3共转化至步骤4获得的PAO1△5菌株中，经抗性筛选获得基因组融合菌株PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm；
步骤5.2、通过质粒接合转移作用，将S17-1 pFLP2菌株中的pFLP2质粒导入步骤5.1的PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-PPA2069-prtN-Gm菌株中，结合抗性筛选、蔗糖筛选，获得无Gm抗性筛选标记的菌株PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN；
步骤5.3、通过质粒接合转移作用，将步骤2获得的重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys导入步骤5.2的PAO1△5attTn7∷PPA2069-prtN菌株中，通过抗性筛选，获得最终的工程菌PAO1104。
7.根据权利要求6所述的构建方法获得的工程菌PAO1104的应用，其特征在于，所述工程菌PAO1104可裂解释放胞外多糖水解酶PelA和PslG、糖苷水解酶DspB及不包含前导肽的溶葡萄球菌素蛋白Lys。
8.根据权利要求6所述的构建方法获得的工程菌PAO1104的应用，其特征在于，所述工程菌PAO1104可特异性破坏细菌生物被膜结构中的骨架成分胞外多糖，从而快速破坏细菌生物被膜；所述工程菌PAO1104还可以裂解杀死被破坏的生物被膜中露出的金黄色葡萄球菌或工程菌接触到的金黄色葡萄球菌，解决环境中金黄色葡萄球菌污染问题。
9.根据权利要求6所述的构建方法获得的工程菌PAO1104的应用，其特征在于，所述工程菌PAO1104可启动两种细胞裂解机制，使工程菌裂解释放出目的蛋白从而发挥作用。
10.根据权利要求6所述的构建方法获得的工程菌PA1104的应用，其特征在于，在所述工程菌PAO1104中表达目的蛋白并实现靶向投放，从而执行不同的生防功能。
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