CN102083973A - 新型真菌病毒、植物病害真菌减毒菌株、植物病害防治剂、真菌病毒的生产方法、植物病害真菌减毒的方法以及植物病害的防治方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供抑制稻瘟病菌的新型真菌病毒(mycovirus)和植物病害的新型防治方法。新发现一种内在性存在于规定的稻瘟病菌株、具有2.8～3.6kb的四种类的双链RNA、抑制植物病害真菌的新型真菌病毒。由于该病毒抑制稻瘟病菌等植物病害真菌，因此可适用于植物病害真菌的减毒、植物病害的防治等。此外，该真菌病毒与以往的不同，还可以在细胞外存在，因此具有可不依赖丝菌融合而从细胞外直接感染宿主菌的优点。

Description

新型真菌病毒、植物病害真菌减毒菌株、植物病害防治剂、真菌病毒的生产方法、植物病害真菌减毒的方法以及植物病害的防治方法 

技术领域

本发明涉及抑制植物病害真菌的新型真菌病毒，与此相关的基因、核酸、蛋白质，内含该真菌病毒的植物病害真菌减毒菌株，含有它们的植物病害防治剂，真菌病毒的生产方法，植物病害真菌减毒的方法，植物病害的防治方法等。 

背景技术

植物病害中有因气象、土壤等环境的因素而引发的，有因病毒、细菌、真菌(丝状菌)等的感染性因素而引发的，有因生理性障碍而引发的，有因这些的综合的因素而引发的等。目前在植物病害之中，包含许多在食粮、花卉、花木、树木等的生产中成为阻碍因素的病害，也有很多造成了很大的经济影响。 

在植物病害中，真菌是最重要的病害因子之一。约80％的植物病害被认为是由真菌引起的。 

例如，稻瘟病是发生在世界各地的最重要的植物病害之一。病原菌是霉(丝状菌)的一种，称为稻瘟病菌(学名“Magnaportheoryzae”)。稻瘟病菌在25℃左右是发育、孢子形成、感染的适宜温度，还喜欢湿润的环境。因此，由于夏季的低温、多雨、日照不足等的气象因素会导致大爆发，造成稻子的欠收、品质下降，带来重大的经济损失。 

此外，纹枯病、锈病、白粉病、炭疽病、菌核病、霜霉病、灰霉病等以真菌为原因的经济上影响也较大的植物病害还存在许多。 因此，目前正在尝试新农药的开发及品种改良等(有关稻瘟病的防治，例如参照专利文献1、2)。 

在此，对于与本发明有关的事项的真菌病毒进行如下说明。 

感染真菌类(Fungi，下同)的病毒称为真菌病毒(mycovirus)。其中，基因组为双链RNA的真菌病毒已有报道。这些真菌病毒潜在地感染宿主菌，大多对宿主的性状几乎不生产影响。 

基因组为双链RNA的真菌病毒，目前被分类为分体病毒科(学名“Partitiviridae”，下同)、全病毒科(学名“Totiviridae”，下同)、金色病毒科(学名“Chrysoviridae”，下同)等5科。分体病毒科病毒在病毒颗粒中具有两条大致相同大小的直链状双链RNA，全基因剂量为4～6kbp。全病毒科病毒在病毒颗粒中具有4～7kb的一条直链状双链RNA。此外，在栗疫病菌(学名“Cryphonectria parasitica”)中，发现菌内在性存在，具有9～13kbp的双链RNA的病毒(低毒性病毒(Hypoviridae)等)。 

金色病毒科病毒具有球形的病毒样颗粒，具有四种成分的双链RNA。此外，已知金色病毒科病毒与分体病毒科和全病毒科的病毒一样，具有编码RdRP(RNA-directed RNA polymerase(以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶)；RNA依赖性RNA聚合酶，下同)的区域。作为属于金色病毒科的病毒，已知例如有Hv145SV(“Helminthosprium victoriae 145S virus(维多利蠕孢菌145S病毒)”，下同)、PcV(“Pencillium chrysogenum virus(产毒青霉病毒)”，下同)、AbV1(“Agaricus bisporus virus 1(双孢蘑菇病毒1)”，下同)等(参照非专利文献1等)。 

近年来，对于特定的植物病害，研究了用真菌病毒等使该病原菌减毒，使用该减毒菌来防治该病害的方法，其中一部分已经实际应用。例如，已经公开了使用抑制栗疫病菌的毒性的病毒性双链RNA的全长cDNA使该菌减毒，应用于栗疫病防治的方法(参照非专利文献2等)，以及发现抑制紫纹羽病菌(学名“Helicobasidium  mompa”)的双链RNA病毒，使用内含该双链RNA的紫纹羽病菌减毒菌株来防治紫纹羽病的方法(参照非专利文献3、专利文献3等)等。 

专利文献1：日本特开2004-143045号公报 

专利文献2：日本特开2003-250370号公报 

专利文献3：日本特开2001-78752号公报 

非专利文献1：C.M.Fauquet，Mary Ann Mayo，J.Maniloff，U.Desselberger，L.A.Ball，“Virus Taxonomy：Classification andNomenclature of Viruses；EighthReport Of The International Committee On Taxonomy Of Viruses”，ElsevierAcademic Press：591-595页 

非专利文献2：Gil H.Choi and Donald L.Nuss，“Hypovirulence ofchestnut blightfungus conferred by an infectious viral cDNA.”Science.1992 Aug 7；257(5071)：800-3 

非专利文献3：H.Osaki等人，“Detection of Double-Stranded RNAVirus from a Strain of the Violet Root Rot Fungus Helicobasidium mompa Tanaka”Virus Genes 25：2，139-145，2002 

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，植物病害真菌对植物、作物的品质和收获量等产生重大的影响。另一方面，很少发现抑制植物病原真菌的真菌病毒，使用这样的真菌病毒的植物病害防治的尝试也几乎没有进行过。因此，本发明的主要目的在于提供抑制植物病害真菌的新型真菌病毒以及植物病害的新型防治方法等。 

解决课题的方法

本发明人等单独地采集天然存在的植物病害真菌，探索对这些真菌具有抑制性作用的真菌病毒。其结果分离并鉴定了具有抑制植 物病害真菌的作用、具有2.8～3.6kbp的四种类的双链RNA的新型真菌病毒，并且得到了其全长序列。 

因此，本发明提供具有抑制植物病害真菌的作用、具有2.8～3.6kbp的四种类的双链RNA、天然存在的、由发明人等分离的新型真菌病毒，它们的基因，至少具有其核苷酸序列、该序列中具有规定机能的特定部分的序列的核酸，该序列所编码的单个或多个蛋白质等。 

该真菌病毒在双链RNA的序列中含有RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)的保守基序，且编码该领域的RNA的核苷酸序列与已知的金色病毒科病毒具有同源性。因此，推测该真菌病毒是分类为金色病毒科的新型病毒。 

如上所述，该真菌病毒具有抑制植物病害真菌的生长等的作用。因此，可以通过例如使该真菌病毒感染宿主菌等，使宿主菌内含该真菌病毒，来制备植物病害真菌的减毒菌株。 

此外，通过例如将至少含有本发明的真菌病毒和/或制备的植物病害真菌减毒菌株的植物病害防治剂附加(散布，涂抹等)于植物(稻等)，有可能防治该植物病害。 

此外，本发明的真菌病毒具有如下所述的特征。 

以往，人们认为真菌病毒通过菌丝融合从宿主菌的细胞垂直传播到细胞，在真菌病毒的生活环境中，不存在宿主菌的细胞外存在的阶段。相对与此，本发明人等的研究表明，本发明的真菌病毒也可以存在于细胞外。 

因此，由于可不依赖菌丝融合从细胞外感染宿主菌，因此也可在接合型的不同主菌、菌株之间广范围地感染本发明的真菌病毒，且可对宿主菌高效率感染。也就是说，通过这种方法，很有可能简单且高效率进行植物病害真菌的减毒及植物病害的防治。 

此外，由于本发明的真菌病毒也存在于细胞外，因此通过例如用液体培养基培养宿主菌，从该培养上清中回收真菌病毒，可以简 单且相对大量地生产真菌病毒。 

发明效果

通过本发明，有可能简单且高效率地防治植物病害。 

附图说明

[图1]表示实施例1中的57株稻瘟病菌中的9株的双链RNA检测结果的电泳照片。 

[图2]表示实施例9中的接种了稻瘟病菌的叶上的病斑数的图。 

[图3]为实施例11中本发明的病毒颗粒的电子显微镜照片。 

具体实施方式

<关于本发明的病毒> 

本发明包含全部具有抑制植物病害真菌的作用、具有2.8～3.6kb的4种类的双链RNA的真菌病毒。 

该真菌病毒的各病毒颗粒均具有2.8～3.6kb的4种类的双链RNA，且该四种类的病毒颗粒以同时存在的状态生存、传代。需要说明的是，上述栗疫病菌真菌病毒和紫纹羽病菌真菌病毒均为由12kb以上的单一成分的双链RNA构成，与本发明的真菌病毒在结构上有很大差异。因此，很有可能是完全不同的病毒种类，此外，对宿主菌的减毒化作用的机制也可能有很大差异。 

如上所述，该真菌病毒在双链RNA的序列中含有RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)的保守基序，且编码该区域的RNA的核苷酸序列与金色病毒科病毒具有同源性。因此，推测该真菌病毒是分类为金色病毒科的新型病毒。 

将该真菌病毒的四种类的双链RNA的核苷酸序列分别以SEQID NO：1～4来表示，将该核苷酸序列所编码的蛋白质的氨基酸序列 分别以SEQ ID NO：5～8来表示。 

需要说明的是，序列表记载的核苷酸序列全部以DNA序列来记载，但本发明的序列包括这些序列，也包括全部RNA时的序列(胸腺嘧啶取代为尿嘧啶)(下同)。 

序列分析的结果，关于编码RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)的区域的核苷酸序列，该真菌病毒与Hv145SV的同源性为22％，相似性为39％，该真菌病毒与PcV的同源性为23％，相似性为38％，该真菌病毒与AbV1的同源性为28％，相似性为45％。 

因此，本发明的真菌病毒包含全部的与金色病毒科病毒(例如Hv145SV、PcV、AbV1的任一种)的基因组中编码RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)的区域的同源性为20～100％的病毒，或者相似性为40～100％的病毒。此处，“同源性”是指核苷酸序列完全一致的情况，“相似性”是指通过取代腺嘌呤和鸟嘌呤、或是取代胸腺嘧啶(尿嘧啶)和胞嘧啶核苷酸序列完全一致的情况。 

本发明的真菌病毒是内在性存在于规定的稻瘟病菌内。因此，例如，通过从潜在地感染该真菌病毒的稻瘟病菌株中分离、回收病毒等，可以获得该真菌病毒。需要说明的是，关于内含本发明的真菌病毒的稻瘟病菌，可以在与一般的稻瘟病菌同样的培养基、培养条件下进行培养。 

作为本发明的真菌病毒，可列举例如本发明人等鉴定并命名的MoCV1(Magnaporthe oryzae chrysovirus 1)。该病毒至少存在于稻瘟病菌(学名“Magnaporthe oryzae”)的“S-0412-II 1a”菌株内。该稻瘟病菌的菌株，曾经向独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心及独立行政法人制品评价技术基础机构特许微生物寄托中心申请保藏，但因内在病毒的理由而拒绝受理。本菌株保存于国立大学法人东京农工大学农学部植物病理学研究室，在遵守各法令的条件下，可分让给第三方。 

此外，稻瘟病菌(学名“Magnaporthe oryzae”)的“S-0412-II 1a”株 已国际保藏于德国的国际保藏机构·DMSZ(Deutsche Sammlung con Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，地址：Inhoffenstr.7B D-38124 Braunschweig GERMANY)(保藏日：2008年3月25日，保藏号：DSM21334)。同株也国际保藏于美国的国际保藏机构·ATCC(American Type Culture Collection，地址：10801 University Boulevard Manassas，VA 20110-2209 USA)(保藏日：2008年4月9日，保藏号：PTA-9137)。需要说明的是，本菌株的原产地为越南。 

作为病毒的分离、回收方法，可采用公知的方法。例如，可以用液氮等冷冻、破碎菌体，用规定的缓冲液中混悬后，通过超离心分离等分离病毒，可回收病毒。 

此外，如上所述，该病毒也可存在于细胞外。因此，例如也可以用液体培养基培养含有真菌病毒的植物病害真菌(规定的稻瘟病菌等)，从该培养上清中分离、回收病毒。该病毒本身也可时常在国立大学法人东京农工大学农学部植物病理学研究室调制，可时常分让给第三方。 

<关于本发明的基因、核酸、蛋白质等> 

本发明人等对本发明的真菌病毒之一进行了序列分析，得到了全长的核苷酸序列(SEQ ID NO：1～4)。因此，本发明包含全部该真菌病毒基因、具有该核苷酸序列或其一部分的核酸、这些核苷酸序列所编码的蛋白质等。 

本发明包含具有SEQ ID NO：1～4的四种类的序列的真菌病毒基因。 

此外，本发明也包含全部具有这些核苷酸序列的全部或一部分的核酸。核酸可以是双链、单链的任意一种，此外，DNA、cDNA、RNA等也全部包括在内。 

例如，SEQ ID NO：1～4的全部或任一序列、在序列中具有规 定机能的特定部分的序列、与这些序列具有同等核苷酸序列的cDNA、插入了与这些序列有同等核苷酸序列的重组载体(质粒、病毒等)等，均包含在本发明中。 

序列解析的结果显示，在SEQ ID NO：1的序列部分存在RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)的保守基序，以及在SEQ ID NO：3的序列部分与La France病(勒法士郎病)病毒的双链RNA片段具有同源性。因此，依照目的、用途，例如也可制备、使用至少具有作为有规定机能的特定部分的这些序列部分的核酸、重组载体等。 

需要说明的是，本发明的核酸(或基因)中也广泛包含与上述核苷酸序列具有同源性的核酸，例如，在严格的条件下与和该核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的核酸杂交，且具有稻瘟病菌抑制作用的核酸。在此，严格的条件、双链核酸的Tm等，可以通过公知技术获得。 

此外，本发明也包含上述的真菌病毒基因及核酸所编码的全部蛋白质。本发明的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5～8。 

SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：1记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO：6为SEQ ID NO：2记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO：7为SEQ ID NO：3记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO：8为SEQ IDNO：4记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列。 

需要说明的是，本发明的蛋白质，除了具有SEQ ID NO：5～8的任意一种的氨基酸序列的蛋白质之外，还包含全部与这些具有同源性且保持该机能的蛋白质。 

例如，将上述核酸插入到重组载体中，并使其在宿主中强制表达，由此可大量调制这些蛋白质。宿主可以考虑利用大肠杆菌类、酵母类、培养细胞等公知的宿主。考虑到真菌病毒可以感染真菌，酵母类具有高增殖性且利用也比较方便等，作为宿主可能以酵母类最适合。至于重组载体，也可以利用公知的载体。插入有SEQ ID NO：1～4的任一序列的多个载体，通过使该四种类的基因的多个共表达，有可能再构成真菌病毒。在这种情况下，也可考虑利用公知的宿主及公知的重组载体，但是从可以同时导入多个载体的角度考虑，可能以酵母类最为适合。 

<关于植物病害真菌的减毒菌株> 

本发明的植物病害真菌减毒菌株，包含全部内含本发明的真菌病毒的菌株。即，例如包含已经内含该真菌病毒的稻瘟病菌等的菌株以及感染了该真菌病毒的植物病害真菌的菌株两类。 

作为使真菌病毒感染植物病害真菌等的方法，例如有按照以往在菌丝融合时使宿主菌感染的方法。此外，如上所述，本发明的真菌病毒也可存在于细胞外，因此例如也可以从细胞外直接地感染宿主菌。 

作为该植物病害真菌减毒菌株的实例，可列举上述的S-0412-II1a株。该菌株是经本发明的真菌病毒感染的稻瘟病菌的菌株。因此，有关形态的性质、培养的性质、孢子形成、生理学的及化学分类学的性质，基本上与公知的稻瘟病菌相同。但是，与一般的稻瘟病菌相比其生长迟缓，菌丝呈非同心环状生长，色素的沉淀也不均匀。此外，可见气生菌丝异常的发达，并观察到扇形形成及溶菌。 

<关于植物病害防治剂> 

本发明的植物病害防治剂包含全部至少含有本发明的真菌病毒或本发明的植物病害真菌减毒菌株的任意一种的防治剂。此外，也可同时含有该真菌病毒和该植物病害真菌减毒菌株，也可含有其它的成分。 

作为其它的成分，可含有例如规定的载体、粘结剂、增粘剂、固定剂、防腐防霉剂、溶剂、稳定剂、抗氧剂、紫外线吸收剂、晶体析出防止剂、消泡剂、物性改善剂、着色剂等。此外，也可以含 有其它的农药成分，例如杀螨剂、杀线虫剂、杀菌剂、抗病毒剂、引诱剂、除草剂、植物生长调节剂、增效剂等。 

作为载体，例如可以使用固体载体和/或液体载体。作为固体载体，可列举例如淀粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、鱼粉、奶粉等动植物性粉末，滑石、高岭土、膨润土、沸石、硅藻土、白炭黑、粘土、氧化铝、碳酸钙、氯化钾、硫酸铵等矿物性粉末。作为液体载体，可列举例如水、异丙醇、乙二醇等醇类，环己酮、甲基乙基酮等酮类，丙二醇单甲基醚、二甘醇单正丁基醚等醚类，煤油、轻油等脂肪族烃类，二甲苯、三甲苯、四甲苯、甲基萘、溶剂粗汽油等芳香族烃类，N-甲基-2-吡咯烷酮等酰胺类，脂肪酸的甘油酯类，大豆油、油菜籽油等植物油。 

作为粘结剂、增粘剂、固定剂，可列举例如淀粉、糊精、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基淀粉、普鲁兰、海藻酸钠、海藻酸铵、海藻酸丙二醇酯、瓜尔胶、刺槐豆胶、阿拉伯胶、黄原胶、明胶、酪蛋白、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇、乙烯-丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等。 

对本防治剂的剂型无特殊限定。例如可适用乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、水合剂、水溶剂、液剂、水悬剂(フロアゲル剤)、颗粒水合剂、气溶胶剂、糊剂、油剂、乳浊剂等形态。 

<关于植物病害真菌抑制性真菌病毒的生产方法> 

本发明的植物病害真菌抑制性真菌病毒的生产方法，包含全部的至少包括用液体培养基等培养含有真菌病毒的植物病害真菌，从该培养上清中回收真菌病毒的步骤的方法。 

如上所述，本发明的真菌病毒也可存在于宿主菌的细胞外。因此，例如可用液体培养基等培养经真菌病毒感染的植物病害真菌，通过离心分离法来分离菌体后，从该培养上清中分离、回收病毒， 从而可简便且相对大量地回收病毒。 

但是，本发明的真菌病毒并不仅限于用这种生产方法获得的病毒。即，例如从内含真菌病毒的稻瘟病菌中分离、回收所获取的病毒，也广义地包含在本发明中。 

<关于植物病害真菌减毒的方法> 

如上所述，例如通过使本发明的真菌病毒感染特定的植物病害真菌等，抑制该宿主菌的生长等而可使该菌减毒。至于真菌病毒的感染方法，可以采用和上述相同的方法。 

<关于植物病害的防治方法> 

本发明的植物病害防治方法，包含全部的至少含有将上述的稻瘟病防治剂附加于特定的植物(稻等)的步骤的方法。 

作为使防治剂附加于植物的方法，可列举例如在叶的表面或里面涂抹防治剂的方法、使用规定的载体等使防治剂附着于叶的表面或里面的方法、将防治剂散布或供应于叶上的方法等。 

防治剂的涂抹量或散布量，根据有效成分的浓度、制剂的形态、对象病害和作物的种类、病害导致的受害程度、施用场所、施用方法、施用时期、混用、合用的药剂和肥料等的使用量、种类等种种条件，可进行适当的选择。 

例如，通过向每叶喷雾或供应1～1000mL的调整为1×10³～1×10⁷个/mL的稻瘟病菌减毒菌株的分生孢子含有液，此外，通过使叶每1mm²涂抹或附着1×10³～1×10¹⁰个稻瘟病菌减毒菌株的分生孢子于叶表面或里面，有可抑制植物病害的可能性。 

本发明可适用于以真菌为主要病因的所有的植物病害。作为有适用可能性的植物病害，可列举例如下述的病害(不限定于这些)。 

作为针对禾本科植物的植物病害，可列举例如：稻瘟病(病原菌“Magnaporthe oryzae(稻瘟病菌)”)、水稻胡麻叶斑病(病原菌 “Cochliobolus miyabeanus(水稻胡麻叶枯病菌)”)、纹枯病(病原菌“Thanatephorus cucumeris(水稻纹枯病菌)”)、恶苗病(病原菌“Gibberella fujikuroi(藤仓赤霉菌)”)、苗立枯病(病原菌“Fusarium(镰刀菌属)菌”、“Rhizopus菌(根霉属菌)”、“Pythium菌(腐霉属菌)”、“Trichoderma viride(绿色木霉菌)”)、稻曲病(病原菌“Claviceps virens(有性世代归子囊菌亚门麦角菌属)”)、麦类赤霉病(病原菌“Gibberella zeae(玉蜀黍赤霉)”、“Fusarium avenaceum(燕麦镰孢)”、“Fusarium culmorum(黄色镰孢菌)”、“Monographella nivale”)、雪腐病(病原菌“Pythium菌(腐霉菌)”、“Typhula菌(瑚菌)”、“Monographella nivalis”、“Myriosclerotinia borealis(核盘霉)”)、散黑穗病(病原菌“Ustilago nuda(裸黑粉菌)”)、矮腥黑穗病(病原菌“Tilletia controversa(小麦矮腥黑穗病菌)”)、眼斑病(眼紋病)(病原菌“Pseudocercosporella herpotrichoides(小麦基腐病菌)”)、叶斑病(葉枯病)(病原菌“Septoria tritici(小麦壳针孢)”)、颖枯病(病原菌“Phaeosphaeria nodorum(颖枯壳针孢)”)、白粉病(病原菌“Blumeria graminis(白粉菌)”)。 

作为其它的植物病害，可列举例如：柑橘类黑点病(病原菌“Diaporthe citri(柑橘间座壳菌)”)、黑腐病(病原菌“Diaporthe medusa、Alternaria citri(柑桔黑腐病菌)”)、疮痂病(病原菌“Elsinoe fawcettii(柑桔痂囊腔菌)”)、褐腐病(病原菌“Phytophthora citrophthra”)、绿霉病(病原菌“Penicillium digitatum(指状青霉)”)、青霉病(病原菌“Penicillium italicum(青霉病菌)”)、苹果花腐病(病原菌“Monilinia mali(苹果花腐病菌)”)、黑星病(病原菌“Venturia inaequalis(苹果黑星病菌)”)、斑点落叶病(病原菌“Alternaria mali(轮斑病菌)”)、黑点病(病原菌“Mycosphaerella pomi(苹果黑点病菌)”)、煤污病(病原菌“Gloeodes pomigena(苹果煤污病菌)”)、蝇斑病(病原菌“Zygophiala jamaicensis”)、轮纹病(病原菌“Botryosphaeria berengeriana(苹果轮纹病病菌)”)、褐斑病(病原菌“Diplocarpon mali(苹果双壳菌)”)、赤星病(病原菌“Gymnosporangium yamadae(苹果赤星病菌)”)、腐烂病(病原菌“Valsa ceratosperma(苹果树腐烂病菌)”)、梨黑星病(病原菌“Venturia nashicola(梨黑星菌)”)、赤星病(病原菌“Gymnosporangium asiaticum(梨胶锈菌)”)、轮纹病(病原菌“Botryosphaeria berengeriana(贝伦格葡萄座腔菌)”)、胴枯病(病原菌“Phomopsis fukushii(福士拟茎点霉)”)、桃缩叶病(病原菌“Taphrina deformans(畸形外囊菌)”)、褐腐病(病原菌“Monilinia fructicola(桃褐腐菌)、Monilinia fructigena(桃褐腐病菌)”)、黑星病(病原菌“Cladosporium carpophilum(嗜果枝孢菌)”)、拟茎点霉腐败病(病原菌“Phomopsis sp.(拟茎点霉)”)、樱桃褐腐病(病原菌“Monilinia fructicola(桃褐腐菌)”、“Monilinia fructigena(桃褐腐病菌)”)、樱桃核盘菌病(病原菌“Monilinia kusanoi(樱桃核盘菌)”)、梅黑星病(病原菌“Cladosporium carpophilum(嗜果枝孢菌)”)、葡萄黑痘病(病原菌“Elsinoe ampelina(痂囊腔菌)”)、晚腐病(病原菌“Colletotrichum acutatum(炭疽病菌)”、“Glomerella cingulata(炭疽病菌)”)、褐斑病(病原菌“Pseudocercospora vitis(葡萄拟尾孢菌)”)、蔓割病(病原菌“Phomopsis viticola(葡萄生拟茎点菌)”)、柿角斑落叶病(病原菌“Cercospora kaki(柿角斑病菌)”)、圆星落叶病(病原菌“Mycosphaerella nawae(柿叶球腔菌)”)、茶轮斑病(病原菌“Pestalotiopsis longiseta(茶轮斑病菌)”、“Pestalotiopsis theae(荼轮斑病菌)”)、褐色圆星病(病原菌“Pseudocercospora ocellata”、“Cercospora chaae”)、荼饼病(病原菌“Exobasidium vexans(坏损外担菌)”)、荼网饼病(病原菌“Exobasidium reticulatum(网状外担菌)”)、瓜类蔓枯病(病原菌“Mycosphaerella melonis(蔓枯病菌)”)、蔓割病(病原菌“Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)”)、黑星病(病原菌“Cladosporium cucumerinum(黄瓜黑星病菌)”)、褐斑病(病原菌“Corynespora cassiicola(棒孢菌)”)、番茄叶霉病(病原菌“Fulviafulva(番茄叶霉病菌)”)、轮纹病(病原菌“Alternaria solani(番茄早疫 病菌)”)、茄褐纹病(病原菌“Phomopsis vexans(茄褐纹病病菌)”)、叶霉病(すすかび病)(病原菌“Mycovellosiella nattrassii(灰毛茄菌绒孢)”)、十字花科蔬菜白锈病(病原菌“Albugo macrospora(大孢白锈菌)”)、白斑病(病原菌“Cercosporella brassicae(芜青白斑病菌)”、“Pseudocercosporella capsellae(芥假小尾孢)”)、洋葱灰色腐败病(病原菌“Botrytis allii(洋葱灰色腐败病菌)”)、草莓蛇眼病(病原菌“Mycosphaerella fragariae(草莓蛇眼小球壳菌)”)、马铃薯早疫病(病原菌“Alternaria solani(马铃薯早疫病菌)”)、大豆疫霉根腐病(ダィズの茎疫病)(病原菌“Phytophthora sojae(大豆疫霉根腐病菌)”)、紫斑病(病原菌“Cercospora kikuchii(紫斑病菌)”)、豇豆疫霉颈腐病(アズキの茎疫病)(病原菌“Phytophthora vignae(豇豆疫霉)”)、花生褐斑病(病原菌“Mycosphaerella arachidis(花生褐斑病菌)”)、甜菜褐斑病(病原菌“Cercospora beticola(甜菜尾孢菌)”)、叶腐病(病原菌“Thanatephorus cucumeris(瓜亡革菌)”)、禾草弯孢叶枯病(シバのカ一ブラリア葉枯病)(病原菌“Curvularia菌(弯孢菌)”)、币斑病(病原菌“Sclerotinia homoeocarpa(核盘菌)”)、Helminthosporium叶枯病(病原菌“Cochliobolus菌”)、蔷薇黑星病(病原菌“Diplocarpon rosae(蔷薇双壳菌)”)、菊花白锈病(病原菌“Puccinia horiana(堀氏菊柄锈菌)”)、各作物的霜霉病(病原菌“Peronospora菌(霜霉病菌)”、“Pseudoperonospora菌(假霜霉菌)”、“Plasmopara菌(轴霜霉菌)”、“Bremia菌(盘霜霉菌)”)、疫病(病原菌“Phytophthora菌(疫霉菌)”)、白粉病(病原菌“Erysiphe菌(白粉菌)”、“Blumeria菌(布氏白粉菌)”、“Sphaerotheca菌(单囊壳菌)”、“Podosphaerea菌”、“Phyllactinia(球针壳属)菌”、“Uncinula(钩丝壳属)菌”、“Oidiopsis(拟粉孢型)菌”)、锈病(病原菌“Puccinia(柄锈菌属)菌”、“Uromyces(单胞锈菌属)菌”、“Physopella菌(壳锈菌)”)、黑斑病(病原菌“Alternaria(链格孢属)菌”)、灰霉病(病原菌“Botrytis cinerea(草莓灰霉菌)”)、菌核病(病原菌“Sclerotinia sclerotiorum(核盘菌)”)、白纹羽病(病原菌“Rosellinia  necatrix(褐座坚壳菌)”)、紫纹羽病(病原菌“Helicobasidium mompa(桑卷担菌)”)、白绢病(病原菌“Sclerotium rolfsii(齐整小核菌)”)、其它的各种土传病害(病原菌“Fusarium菌(镰刀菌)”、“Rhizoctonia菌(丝核菌)”、“Pythium菌(腐霉菌)”、“Aphanomyces(丝囊霉属)菌”、“Phoma菌(茎点菌)”、“Verticillium菌(轮枝孢菌)”、“Plasmodiophora brassicae(芸苔根肿菌)等”)。 

实施例1

在实施例1中，尝试从57株稻瘟病菌中检测内在性双链RNA。 

首先，磨碎单独采集的57株稻瘟病菌的各菌体，用酚SDS法提取核酸后，通过DNase1及S1核酸酶选择性地分解DNA和单链核酸，得到菌体内在性的双链RNA液。然后，在1％琼脂糖凝胶中于20V下电泳18小时，用溴化乙锭进行染色。 

其结果57株中，有11株检测到双链RNA的谱带。其中，7株检测到2.8～3.6kb的4种成分的谱带，3株检测到1.0～2.6kb的3种成分的谱带，1株检测到1.0～3.6kb的8种成分的谱带。 

需要说明的是，图1是表示关于57株稻瘟病菌中的9株的双链RNA检测结果的电泳照片。图1中，泳道1是DNA标记，泳道2至泳道10是从菌体制备的样品。在图1中，泳道6和泳道8未检测出双链RNA的谱带，相对与此，泳道2、泳道3、泳道4、泳道5和泳道10检测到2.8～3.6kb的4种成分的谱带，泳道7检测到1.0～2.6kb的3种成分的谱带，泳道9检测到1.0～3.6kb的8种成分的谱带。 

在上述的试验结果中，考虑到从一株中可以检测到多条谱带这一点以及双链RNA的长度，从11株稻瘟病菌中检测出的双链RNA很有可能就是构成真菌病毒的双链RNA。即，本实施例的结果暗示这些稻瘟病菌株中内含新型的真菌病毒。 

实施例2

实施例2是根据实施例1的结果，比较了内含双链RNA的菌株和不含的菌株的生长速度。 

在实施例1中，对于未检测出内在性双链RNA的菌株和检测出的菌株，分别用PDA培养基进行培养，于培养开始6天后和10天后观察菌落。 

其结果，未检测出内在性双链RNA的菌株其菌丝生长成同心环状，色素的沉淀也均匀。另一方面，检测出内在性双链RNA的菌株和未检测出的菌株相比较，其生长迟缓，菌丝呈非同心环状地生长，色素的沉淀也不均匀。此外，可见到气生菌丝的异常发达，并观察到扇形形成和溶菌。 

即，内含双链RNA的菌株和不含的菌株相比较，可见到生长抑制。这些试验结果暗示实施例1中所得的双链RNA(真菌病毒)是稻瘟病菌的生长抑制因子(减毒化因子)。 

实施例3

在实施例3中是用低浓度的放线菌酮(蛋白质合成抑制剂)处理内含双链RNA的菌株，尝试制备真菌病毒治愈株。 

制备添加有0.25～0.50μg/ml放线菌酮的YG平皿培养基，并向其中移植实施例2中培养的菌株(检测出内在性双链RNA的菌株)。然后，所形成的菌落中，将回复正常生长的部位进一步移植到别的YG平皿培养基中，得到放线菌酮处理菌株。结果显示放线菌酮处理菌株比一般的稻瘟病菌株生长更好。 

接着，从所得的放线菌酮处理菌株中，用与实施例1同样的方法提取双链RNA，通过电泳来尝试检测双链RNA的谱带。其结果是来自放线菌酮处理菌株未检测到双链RNA的谱带。 

此外，也以别的方法制备真菌病毒治愈菌株，进行同样的试 验。 

使在实施例2中培养的菌株在PDA培养基或燕麦片培养基上生长1～3周后，分离分生孢子，将该分生孢子一个个移植到新的PDA培养基中，选拔真菌病毒脱落的菌落，以此作为真菌病毒治愈菌株。 

其结果，即使是该治愈菌株，其生长也明显比病毒保有菌株良好。此外，与上述同样，通过电泳尝试检测双链RNA的谱带，结果显示从治愈菌株中未检测出双链RNA的谱带。 

这些结果显示，稻瘟病菌中内含的双链RNA为真菌病毒，以及该真菌病毒为稻瘟病菌的生长抑制因子。 

实施例4

在实施例4中，对本发明的真菌病毒是否也存在于稻瘟病菌的菌体外进行了研究。 

在实施例1中检测出2.8～3.6kb的4种成分的内在性双链RNA的谱带的菌株中，将3株移植于液体培养基中并进行培养，离心培养液并回收该培养上清。接着，将所得培养上清在1％琼脂糖凝胶中于20V下电泳18小时后，用溴化乙锭进行染色。 

其结果，在这些菌株的培养上清中，也在与菌内在性双链RNA相同的位置上检测出双链RNA的谱带。 

该结果显示本发明的真菌病毒不仅存在于稻瘟病菌的菌体内，也可存在于菌体外。

实施例5

在实施例5中，对于菌体外存在的真菌病毒对正常的菌株(不保有真菌病毒的菌株)是否具有感染能力进行了研究。

首先，将实施例1中检测出2.8～3.6kb的4种成分以上的内在性双链RNA的谱带的菌株移植到液体培养基中，培养4周后，离 心培养液并回收该培养上清。对于该培养上清，采用与实施例4同样的步骤，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，其结果可确认双链RNA的谱带。至于所得培养上清，使用0.22μL的滤器进行过滤灭菌。 

接着，在100ml的烧瓶(kolben)中加入50ml YG培养基，并在其中接种稻瘟病菌的正常菌株(不保有真菌病毒的菌株)，培养3天后，添加500μL所得的培养上清，观察菌体的生长。 

其结果，在观察的第3天，未添加培养上清的菌株，其菌丝的前端笔直延伸，表现出正常的生长，相对与此，添加了培养上清的菌株，其菌丝的前端基本未延伸，而呈缠绕状态。 

考虑该结果的原因是，存在于培养上清中的真菌病毒感染了稻瘟病菌的正常菌株，而抑制其生长。即，本实验结果暗示菌体外存在的真菌病毒对正常的菌株具有感染能力。 

实施例6

在实施例6中，对于已感染真菌病毒的稻瘟病菌株，测定了其分生孢子数。 

将实施例1中检测出2.8～3.6kb的4种成分以上的内在性双链RNA的谱带的菌株移植到YG平皿培养基中，培养2周后，用直径4mm的cork borer(コルクボ一ラ一)选出菌体，进行采集。 

接着，在1.5ml的离心管内加入5％甘油，再加入采集的菌体，混和、悬浮5分钟。然后使用血细胞计数器来计算悬浮液中存在的分生孢子数。 

其结果是在稻瘟病菌的正常菌株(对照组，未保有真菌病毒的菌株)中分生孢子数为33×10⁴个/mL，相对与此，内含真菌病毒的稻瘟病菌中分生孢子数为1×10⁴个/mL以下。 

该结果显示本发明的真菌病毒抑制宿主菌的分生孢子形成。 即，本发明暗示在抑制植物病害菌增殖的同时，也很有可能会抑制其传播、感染扩大等。 

实施例7

在实施例7中，对从稻瘟病菌中提取的双链RNA的核苷酸序列进行了分析。 

(1)双链RNA的提取、纯化 

首先，依照下述的步骤进行双链RNA的提取、纯化。 

对于在实施例1中检测出双链RNA的一个菌株，用液氮冷冻后磨碎，在0.1g菌体中添加1ml提取缓冲液(2×STE、1％SDS、10mM β-巯基乙醇)。在该溶液中，加入与提取缓冲液等量的PCI(50％苯酚、48％氯仿，2％异戊醇)，在室温下充分搅拌30分钟，离心分离(8,000rpm、20分钟、室温)后，采集其上清(水相)。然后，在采集的上清中加入等量的100％乙醇(终浓度为50％乙醇/1×STE溶液)，进行乙醇沉淀。 

将所得的沉淀物(核酸)溶解于17.5％乙醇/1×STE溶液中，在65℃下加热处理10分钟后放入冰中骤冷，离心分离(8,000rpm、10分钟、4℃)后，采集其上清。在其上清中加入纤维性纤维素填料(商品名“CF11”、Whatman公司生产)中，在4℃下搅拌30～60分钟后，填充到柱(直径1.5cm、高12cm)中。 

其次，向柱中供给17.5％乙醇/1×STE溶液，除去非吸附组分后，供给1×STE溶液，将吸附组分洗脱并回收。为了除去洗脱组分中混入的DNA，在其中加入25U的DNase I(Takara生物株式会社生产)，在37℃下反应30分钟后，进行乙醇沉淀，得到目的双链RNA。 

(2)cDNA克隆 

接着，以所得的双链RNA为模板合成cDNA，然后进行cDNA的壳隆。 

对于所得的双链RNA，使用随机引物、SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen公司生产、下同)来合成第一链cDNA。接着用RNaseH处理后，使用DNA聚合酶合成cDNA第二链。用T4DNA聚合酶将合成的双链cDNA进行末端平滑化后，再用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen公司生产、下同)进行纯化。 

其次，将其末端进行磷酸化修饰后，将该cDNA插入到pUC19质粒载体(Takara生物株式公司生产，下同)中，使该重组载体转化大肠杆菌，得到各cDNA的克隆。然后对各cDNA克隆进行序列测定。 

根据所得的各核苷酸序列信息，制作叠连序列(contig sequence)，结果是，对于菌体中存在的四种类的双链RNA，均可获得大体上为全长的核苷酸序列。 

(3)使用5’RACE法进行末端序列的分析 

接着，根据这些序列信息，合成基因特异性的反义引物，按照与上述同样的步骤从菌体中提取、纯化双链RNA，使用SuperScriptIII逆转录酶及其引物合成cDNA，用RNase H处理，得到单链的第一链cDNA。 

然后，使用末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)(Takara生物株式会社生产)将脱氧胞嘧啶均聚物作为锚序列附加到该单链cDNA上。接着合成附加有脱氧鸟嘌呤均聚物的接头引物，合成基因特异性的反义引物，并通过PCR法扩增两引物之间的部分，合成cDNA。 

然后，使用T4DNA聚合酶将该cDNA进行末端平滑化，再用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化，对其末端进行磷酸化修饰后，将该cDNA插入到pUC19质粒载体中，使该重组载体转化大肠杆菌，得到各cDNA的克隆。然后对各cDNA克隆进行序列测定。 

根据以上的步骤，得到新型真菌病毒的基因信息的全长序列。 该真菌病毒由四种类的双链RNA构成。各双链RNA的序列示于SEQ ID NO：1～4。需要说明的是，为了将双链RNA取代为cDNA后进行序列测定，在序列表中“尿嘧啶”被取代为“胸腺嘧啶”。 

需要说明的是，对所得的核苷酸序列进行分析的结果，SEQID NO：1所示的RNA序列中含有存在于全病毒及其近缘病毒等中的RdRp(RNA依赖性RNA合成酶)的保守基序。此外，SEQ IDNO：3所示的RNA序列中含有与La France病(勒法士郎病)病毒的L3双链RNA片段具有同源性的区域。 

该结果显示本发明的四种类的双链RNA为新型真菌病毒的基因信息。 

实施例8

在实施例8中，对本发明的真菌病毒的病毒颗粒进行了生物化学特性的分析。 

用液氮冷冻稻瘟病菌S-0412-II 1a株，用乳钵磨碎。在该样本中加入4～6倍容量的0.1M的磷酸缓冲液(pH7.0)，用混合器进行搅拌。然后相对于磷酸缓冲液加入40％容积的丁醇、氯仿(体积比1∶1)，搅拌30分钟，离心(8,000×g、10分钟)并回收其上清，并反复进行该操作数次。 

然后，在该上清中加入聚乙二醇(平均分子量6,000)使终浓度为8％，加入氯化钠使终浓度为1％，使其溶解后，在4℃下放置3小时而使病毒彼此凝集，离心(12,000×g、20分钟)，得到通过聚乙二醇而凝集的病毒沉淀物。

将该病毒沉淀物溶解于适量的0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)中，离心(6,000×g、5分钟)除去不溶的杂质，回收该上清。 

然后，分注20％蔗糖使成为从离心管的底约1cm左右的高度作为缓冲，使回收的上清分层后，超离心(100,000×g、2小时)，将该沉淀物溶于少量的0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)中，以此作为部分 纯化病毒标准品。 

将该病毒标准品的一部分进行SDS-PAGE(7.5％凝胶、Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.8)、20mA、90分钟)电泳，用CBB(考马斯亮蓝)染色，进行病毒蛋白质的主要成分(外壳蛋白)的分子量分析。 

其结果检测到约70kDa大小来自病毒颗粒的蛋白质的谱带。 

因此，用SDS-苯酚法从检测出该70kDa的蛋白质的成分中进行核酸提取。其结果检测出2.8～3.6kbp的4种成分的双链RNA。 

以上，通过本实施例可以确认存在本发明的真菌病毒的病毒颗粒。 

实施例9

在实施例9中，使用喷雾接种法研究了本发明对植物病害真菌的防治是否有效。 

在燕麦片培养基平皿中接种稻瘟病菌S-0412-II 1a株，在25℃的室内进行培养。如在接种后第15天未能充分产生分生孢子时，在平皿中注入灭菌蒸馏水约2mL左右，用笔擦搓培养基表面以除去气生菌丝，将该平皿置于黑光下3天以诱导分生孢子形成，注入灭菌蒸馏水约1mL左右，再次用笔擦搓培养基表面以回收气生菌丝及分生孢子，得到含有分生孢子的液体。接种后第15天分生孢子充分产生时，在平皿中注入灭菌蒸馏水约2mL左右，用笔擦搓培养基表面以回收气生菌丝及分生孢子，得到含有分生孢子的液体。此外，作为对照，用与实施例3同样的步骤制作稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株，用同样的步骤从该菌得到含有分生孢子的液体。 

然后，使用擦拭纸(Kimwipe)或是纱布过滤这些含有分生孢子的液体，将分生孢子浓度调整为2×10⁶个/mL，在其中加入0.02％(v/v)的吐温20，作为分生孢子悬浮液。 

然后，使用喷嘴对稻苗(考虑稻瘟病真实的抗性基因型和菌的 种类而适当选择的品种，播种后的第2～3周的苗)平均地喷雾分生孢子悬浮液，将植物体置于26℃、相对湿度为100％的接种箱内静置24小时后，将苗盆(ポツト)移至温室内，并维持室温在23～30℃，喷雾接种后培养7天。然后在喷雾接种后第7天计测每一定叶面积的3～4mm的患病性病斑的数目。 

结果如图2所示，图2为显示接种稻瘟病菌的叶中病斑数的图。图中纵轴表示接种有稻瘟病菌的叶上的病斑数。图中，“混合感染株”表示的是在喷雾了由感染本发明的真菌病毒的稻瘟病菌制备的分生孢子悬浮液的情况下的病斑数，而“完全治疗株”表示的是在喷雾了由稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株制备的分生孢子悬浮液的情况下的病斑数(对照)。 

如图2所示，与对照相比，喷雾由感染了本发明的真菌病毒的稻瘟病菌制备的分生孢子悬浮液的情况下，病斑数明显减少。其结果显示本发明在植物病害真菌的防治上是有效的。 

实施例10

在实施例10中，用打孔器付伤接种法研究了本发明对植物病害真菌的防治是否有效。 

用与实施例9同样的步骤来制备分生孢子悬浮液，将该液附着于3％的不含营养成分的琼脂膜上，切取约2mm方形的琼脂膜，制成琼脂片。用接种用打孔器剪在20～30℃的温室培育的稻的第4叶，造成浸润状的伤，在该付伤部分覆盖琼脂片，将植物体置于26℃、相对湿度为100％的接种箱中静置24小时后，将苗盆移到温室内，并维持室温在23～30℃，在接种后培养14天。然后计测接种后第14天的病斑的大小。 

其结果是，与对照相比，在接种由感染了本发明的真菌病毒的稻瘟病菌制备的分生孢子悬浮液的情况下，病斑的大小显著减小。该结果显示：与实施例9同样，本发明对植物病害真菌的防治是有 效的。 

实施例11

在实施例11中，通过电子显微镜鉴定菌体外存在的病毒颗粒。 

将稻瘟病菌S-0412-II 1a株在YG培养基(0.5％酵母提取物(Yeast Extract)、2％葡萄糖)中培养，从该培养上清中分离病毒颗粒。将该培养上清离心(10,000×g、5分钟)，然后超离心(100,000×g、30分钟)该上清，可得含病毒颗粒的沉淀物。将该沉淀物溶于0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)中，使用磷钨酸或醋酸铀进行负染色，用电子显微镜(倍数：×20,000～40,000)观察。 

结果如图3所示。图3为从稻瘟病菌S-0412-II 1a株的培养上清中所得的病毒颗粒的电子显微镜照片。如图3所示，通过电子显微镜，可鉴定本发明的真菌病毒的病毒颗粒。该病毒颗粒为约30～40nm的正六角形状，包在包膜样的结构中。 

Claims (15)

1.真菌病毒，其具有抑制植物病害真菌的作用，且具有2.8～3.6kb的四种类的双链RNA。

2.权利要求1所述的真菌病毒，其抑制上述植物病害真菌的分生孢子形成。

3.权利要求1所述的真菌病毒，其具有与金色病毒科病毒基因组中编码RdRp的区域有同源性的双链RNA，所述RdRp为RNA依赖性RNA合成酶。

4.权利要求1所述的真菌病毒，其对禾本科植物抑制植物病害真菌。

5.权利要求1所述的真菌病毒，其抑制稻瘟病菌。

6.权利要求1所述的真菌病毒，其具有SEQ ID NO：1～4的序列。

7.真菌病毒基因，其具有SEQ ID NO：1～4的四种类的序列。

8.核酸，其至少具有SEQ ID NO：1～4中的任一序列或该序列中具有规定功能的特定部分的序列。

9.蛋白质，其具有SEQ ID NO：5～8中的任一序列。

10.植物病害真菌的减毒菌株，其含有权利要求1所述的真菌病毒。

11.权利要求10所述的减毒菌株，其是保藏号为DSM21334的菌株。

12.植物病害防治剂，其至少含有权利要求1所述的真菌病毒和/或权利要求10所述的植物病害真菌的减毒菌株。

13.植物病害真菌抑制性真菌病毒的生产方法，其至少包括：用液体培养基培养含有权利要求1所述的真菌病毒的植物病害真菌，从该培养上清中回收上述真菌病毒的步骤。

14.植物病害真菌减毒的方法，其包括使权利要求1所述的真菌病毒感染植物病害真菌的步骤。

15.植物病害真菌的防治方法，其包括将权利要求12所述的防治剂附加于植物的步骤。

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