JPWO2014098088A1

JPWO2014098088A1 - 抗真菌剤

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Publication number: JPWO2014098088A1
Application number: JP2014553157A
Authority: JP
Inventors: 森山　裕充; 裕充森山; 俊一浦山
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2017-01-12
Also published as: WO2014098088A1

Abstract

強い抗菌活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。また、当該ポリペプチドをコードする核酸を提供することを目的とする。更に、前記のポリペプチド又は核酸等を含む抗真菌組成物を提供することを目的とする。真菌の生育を阻害する能力を有するポリペプチドであって、少なくとも配列番号２の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでを含むアミノ酸配列から成るポリペプチド、及びその機能的類似物が提供される。

Description

本発明は、病原性又は植物病原性真菌の増殖を制御するのに有用なポリペプチド及びそれをコードする核酸に関する。

真菌は種々の疾患を引き起こす。例えば、それらの疾患には、循環器、呼吸器、消化器、尿路又は髄膜等を侵す、カリニ肺炎、カンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギルス（糸状菌症）、ムコール症（接合菌症）及びペニシリウム症等の深在性真菌症が含まれる。特に、カリニ肺炎は、エイズ感染等により生体防御能の低下した患者にとって致命的となり得るため、当該感染症の治療及び予防は重要な医療上のターゲットである。その他にも、スポロトリコーシス、クロモミコーシス（黒色真菌症）、菌腫（マイセトーマ）等の深部皮膚真菌症や、白癬、皮膚カンジダ症、口腔カンジダ症等の表在性真菌症に対する有効な治療及び予防法の提供が依然として望まれている。すなわち、真菌もヒトも同じ真核生物であるため両者の細胞機構の多くが共通する。従って、真菌細胞にだけ選択的な細胞傷害活性を示す化合物を見出すことは相対的に困難であると考えられている。

真菌により引き起こされる植物の病害については、枚挙に暇がない。例えば、イネいもち病、イネごま葉枯病、紋枯病、ムギ類の赤かび病、うどんこ病；カンキツ類の黒点病やそうか病；リンゴのモニリア病、褐斑病や赤星病；ナシの輪紋病や胴枯病；モモの縮葉病、灰星病や黒星病；ブドウの黒とう病や晩腐病；ウリ類のつる枯病やつる割病；トマトの葉かび病；ナスの褐紋病；アブラナ科野菜の白さび病や白斑病；タマネギの灰色腐敗病；イチゴの蛇の目病；ジャガイモの夏疫病；ダイズの茎疫病や紫斑病；及びシバのカーブラリア葉枯病、ダラースポット病やヘルミントスポリウム葉枯病などの植物病害を挙げることができるが、それらですらこれまでに知られている真菌性植物病害のごく一部に過ぎない。つまり、真菌感染は、植物の生存にとって最も重大なリスク因子の一つであり、従って、植物病原菌を選択的且つ効果的に防除することは、植物栽培における基本的な要求であり続けている。

近年、真菌の生育を選択的に阻害する化合物として「キラー因子」が注目されてきている。ある種の酵母には、他の株を殺すキラー株と、それにより殺される感受性株が存在し、当該現象を担う蛋白質がキラー因子と呼ばれている。非特許文献１は、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属酵母のキラー因子である「ＨＭ−１」の抗真菌剤としての利用を開示している。ＨＭ−１は、細胞壁のマンノプロテインか糖鎖構造に結合し、グルカン合成酵素を阻害すると考えられている。同文献は、その他にも、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の「Ｋ１キラー因子」、クリュイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）のキラー因子、ピキァ（Ｐｉｃｈｉａ）属の「ＳＭＫＴ」キラー因子を抗菌剤として利用する可能性を展望している。更に、キラー因子「ＨＭ−１」を抗真菌剤に応用する技術に関しては特許文献１及び２にも記載されている。また、クリュイベロマイセス・ラクティスのキラー因子の応用に関しては特許文献３にも記載されている。そして、それらのキラー因子のいくつかは、自らがコードする酵素により核とは独立して複製及び転写される細胞質内核酸分子、すなわちウイルス様エレメント（ＶＬＥ）によりコードされていることが知られている（非特許文献２）。

ウイルス由来の核酸を用いた植物病原菌の選択的防除に関連して、特許文献４は、クリ胴枯れ病菌（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａｐａｒａｓｉｔｉｃａ）に感染するマイコウイルスの一種であるハイポウイルス（Ｈｙｐｏｖｉｒｕｓ）のｄｓＲＮＡのコード鎖を、天然型の植物病原性株にトランスフェクトすることにより、当該真菌の植物病原性を減少させ得たことを開示している。そして、そのようなトランスフェクト株を強毒性の植物病原性株と同時に植物に感染させることで、強毒性の植物病原性株による病害を低減できるとされている。

また、最近、本発明者らは、特定のイネいもち病菌株に内在的に存在する新規なマイコウイルスを見出した。このマイコウイルス（以下、「ＭｏＣＶ１」と記載することもある。）は、既知のマイコウイルスＲＮＡの塩基配列のいずれとも異なる、２．８〜３．６ｋｂの４種類の二本鎖ＲＮＡをしていた。また、ＭｏＣＶ１に感染したイネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ）の分生子を、強毒性のイネいもち病菌の分生子と共にイネに接種することにより、病斑数を顕著に減少させ得た（特許文献５）。

更に、本発明者らは、ＭｏＣＶ１の４つの主要蛋白質のうちのＰ７０蛋白質をコードするＯＲＦ４を過剰発現させたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、細胞の肥大化や細胞内の顆粒化といった形態異常や、コロニー形成不良を示すことを見出した（非特許文献３）。なお、ＭｏＣＶ１は、これまで報告されてきたマイコウイルスと異なり、細胞外でも存在できることが示されている。また、Ｐ７０蛋白質に関しては、培養初期には全長タンパク質（Ｐ８４）が発現しているが、培養が長期化するに伴いＰ７０蛋白質へとプロセッシングされていることが確認されている（非特許文献３）。

しかしながら、いずれの先行文献も、ＭｏＣＶ１のＯＲＦ４によりコードされる蛋白質の部分ペプチドの機能について開示も示唆もしていない。

特開平１０−７５７８９号公報国際公開第ＷＯ２００７/０２３７８２号パンフレット特開２００７−２２８９３７号公報米国特許第５，６６５，５８１号公報国際公開第ＷＯ２００９/０９３４０９号パンフレット

ＴｈｅｂｕｌｌｅｔｉｎｏｆｔｈｅＦａｃｕｌｔｙｏｆＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＭｉｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９９，２３，ｐ．８１−９６Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１２，９６，ｐ．３４５−３５６Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１２，８６（１５），ｐ．８２８７−８２９５

本発明は、強い抗菌活性を有するポリペプチドを提供することを課題とする。また、本発明は、当該ポリペプチドをコードする核酸を提供することを課題とする。更に、本発明は、前記のポリペプチド又は核酸を含む抗真菌組成物を提供することを目的とする。

ＭｏＣＶ１のＯＲＦ４遺伝子翻訳産物（配列番号２）の部分ポリペプチドが、依然として真菌の生育阻害活性を保持していることが見出された。更に驚くべきことに、そのような部分ポリペプチドは、全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物よりも高い抗真菌活性を示した。従って、本発明の第１の局面は、
［１］真菌の生育を阻害する能力を有するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
１) 配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの一部の配列であって、少なくとも配列番号２の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでを含むアミノ酸配列；
２）上記１）に対して少なくとも６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列；、又は
３）上記１）のアミノ酸配列に対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、
から成る、前記ポリペプチド、
である。

典型的な上記１）の部分ポリペプチドは、後記実施例のとおり、配列番号２の１位から１５位までを切詰めたアミノ酸配列；並びに配列番号２の１位から１５位まで及び４３６位以降を切詰めたアミノ酸配列を含む。従って、本発明の好適な態様は、
［２］上記１）のアミノ酸配列が、配列番号２の１６位−イソロイシンから８１２位−セリンまでの配列である、上記［１］記載のポリペプチド、及び
［３］上記１）のアミノ酸配列が、配列番号２の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでの配列である、上記［１］記載のポリペプチド、
である。

本発明のポリペプチドは、それをコードする核酸を適切な宿主細胞内で過剰発現させることにより好適に生産され得る。従って、本発明の第２の局面は、
［４］上記［１］乃至［３］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸、
［５］上記［４］に記載の核酸が作動可能に連結されたベクター、及び
［６］上記［５］に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞、
である。

本発明のポリペプチド及び核酸は、抗真菌組成物の有効成分として好適に使用できる。特に、それらの組成物を、真菌による感染症の治療及び植物病原性真菌による植物病の防除に用いることが有利である。従って、本発明の更なる局面は、
［７］上記［１］乃至［３］のいずれかに記載のポリペプチド、上記［４］に記載の核酸又は上記［５］に記載のベクターを含む、抗真菌組成物、
［８］薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である、上記［７］の組成物、及び
［９］農学的に許容される担体を含む農薬組成物である、上記［７］の組成物、
である。言うなれば、本発明のこの局面は、真菌の生育を阻害するために用いる、上記［１］乃至［３］のいずれかに記載のポリペプチドである。或いは、真菌の生育を阻害するために用いる、上記［４］に記載の核酸である。更には、真菌の生育を阻害するために用いる、上記［５］に記載のベクターである。

更に、本発明は、動物又は植物であり得る対象において、有害な真菌の生育を阻害する方法を意図する。すなわち、本発明の別の局面は、
［１０］真菌による感染症を治療する方法であって、そのような処置が必要とされる患者に対して上記［１］乃至［３］のいずれかに記載のポリペプチド、上記［４］に記載の核酸又は上記［５］に記載のベクターを投与することを含む、前記方法、及び
［１１］真菌による植物病を防除する方法であって、そのような処置が必要とされる植物個体に対して上記［１］乃至［３］のいずれかに記載のポリペプチド、上記［４］に記載の核酸、上記［５］に記載のベクター又は上記［６］に記載の宿主細胞を施用することを含む、前記方法、
である。

本発明のポリペプチドは、顕著な真菌生育阻害活性を示すので、当該ポリペプチド及びそれをコードする核酸は、抗真菌剤の有効成分として有用である。また、本発明のポリペプチドの最小長は、本来のＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のほぼ半分程度であるから、そのような最小ポリペプチドは、ＯＲＦ４遺伝子によりコードされるＰ７０蛋白質中の細胞障害活性ドメインの配列及び構造をより的確に反映していると考えられる。従って、本発明のポリペプチドは、ＭｏＣＶ１ウイルスによる真菌の生育阻害機構を解明するための研究に用いることが可能である。また、そのような最小ポリペプチドは、更なる高活性ポリペプチドのリード物質として利用可能である。

図１は、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。図２は、ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。図３は、プラスミドｐＲＳ４２６のマップを示す。図４は、発現用プラスミドｐＲＳＴ４２６のマップを示す。図５は、発現用プラスミドｐＲＳＴ４２６の構築手順を示す。図６は、全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び２４を導入した酵母の成育試験（ｐＨ、濁度、溶存酸素濃度、グルコース濃度及び生菌細胞数の経時変化）の結果である。陰性対照には、空のベクターのみを導入した。全てのグラフにおいて、■は陰性対照を表している。△は全長ＯＲＦ４を表している。＊は参考例（２４）を表している。〇は実施例１（１Ｂ）を表している。図７は、全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び２４を導入した酵母の顕微鏡による細胞形態観察の結果及びコロニー形態である。図中、「ｐＲＳＴ４２６」は、空のベクターを導入した陰性対照株である。「ｐＲＳＴ４２６−ＯＲＦ４」は、全長ＯＲＦ４を発現する形質転換体である。「ｐＲＳＴ４２６−１Ｂ」は、本発明の、部分ＯＲＦ４（１−１５位トランケート）を発現する形質転換体である。「ｐＲＳＴ４２６−２４」は、本発明の部分ペプチドとは別の領域を発現する形質転換体である。細胞形態の顕微鏡写真中の白抜きバーは、１０μｍに相当する。図８は、全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び２４を導入した酵母からタンパク質を抽出し、抗ＯＲＦ４ｐ抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す。サンプルは全て不溶性画分である。上段の数字はそれぞれ培養時間を示す。使用したゲルは８％ゲルである。２４領域のサンプルからは、約２８ｋＤａのサイズにシグナルが見られる。図９は、全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び１３を導入した酵母の成育試験（ｐＨ、濁度及び生菌細胞数の経時変化）の結果である。全てのグラフにおいて、△は全長ＯＲＦ４を表している。〇は実施例１（１Ｂ）を表している。◇は実施例２（１３）を表している。

ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子翻訳産物ののうちの一部の配列を含む部分ポリペプチドである。本明細書において、用語「一部の配列」は、いかなる場合にも当該配列を含む配列が全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の配列と一致しないことを意味する。同様に、用語「部分ポリペプチド」は、いかなる場合にもそのポリペプチドが、アミノ酸配列において全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物と同一ではないことを意味する。典型的に、本発明のポリペプチドは、全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物よりも短い。

前記のとおり、そのような部分ポリペプチドが、元の全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物よりも高い抗菌活性を示したことは、驚嘆すべき発見であった。

具体的に、後記の実施例のとおり、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１位から１５位までのアミノ酸残基を切詰めて得た部分ポリペプチドは、全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物よりも、当該ポリペプチドを発現する酵母の培養における生菌数及び濁度の上昇並びにｐＨ及びグルコース濃度の低下をいっそう強く抑制した。同様に、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１位から１５位まで及び４３６位以降の全てのアミノ酸残基を切詰めて得た部分ポリペプチドも、全長ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物よりも、当該ポリペプチドを発現する酵母の培養における生菌数及び濁度の上昇並びにｐＨの低下をいっそう強く抑制した。従って、これらの結果は、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のＮ末端側のアミノ酸を削除することにより、真菌の生育を阻害する活性が上昇することを意味する。そして、そのようなアミノ酸の削除は、少なくとも、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１位から１５位までの削除を含むことが好適であり得る。

一方、後記のとおり（参考例２）、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのアミノ酸残基から成る部分ポリペプチドが、むしろ真菌の生育を有意に促進することも明らかにされた（本発明者らは、この発明について、本願と同じ優先権主張及び出願日を有する日本国特許出願において開示及び特許請求している。）。単一のポリペプチド鎖上に、宿主細胞の成育を阻害する部分と促進する部分が共存していたことは、更に驚嘆すべき発見であったが、ウイルスの種の存続という観点からすれば、その宿主を完全に殺滅してしまわないのは、ＭｏＣＶ１ウイルスにとって合理的な戦略かもしれない。いずれにせよ、真菌の生育を阻害する活性に対して、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のＣ末端側は重要でないと考えられる。

従って、本発明のポリペプチドの最小単位は、以下に示すＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでの配列から成る。

ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子に対応するＤＮＡ配列（つまり、ＭｏＣＶ１ウイルスはｄｓＲＮＡウイルスであるので、その遺伝子は、本来はＲＮＡである。）及びその全長翻訳産物のアミノ酸配列は、特許文献５において、それぞれ、同文献の配列番号３及び配列番号７として開示されている。また、特許文献５は、ラ・フランス病ウイルスのｄｓＲＮＡ断片が、ＭｏＣＶ１ウイルスのＯＲＦ４遺伝子と相同性を有することを開示している。従って、当業者は、少なくともＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでの配列を含む本発明の部分ポリペプチドと高いアミノ酸配列相同性を示すポリペプチドを得て、その中から真菌の生育を阻害する能力を有するものを容易に同定できるであろう。そして、そのようなポリペプチドも、本発明の範囲内である。当該アミノ酸配列の相同性としては、６０％以上、７０％以上、８０％以上のいずれかであればよい。特に、９０％以上のアミノ酸配列の相同性を示すポリペプチドが好ましい。なお、本明細書において、アミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義される。

また、本発明の、少なくともＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでの配列を含む部分ポリペプチドに対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するポリペプチドもまた、本発明において利用可能である。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともあり得る。従って、そのようなポリペプチドのうちで真菌の生育を阻害する能力を有するものは本発明の範囲内である。

核酸
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列をコードする核酸を適切な宿主内で過剰発現させることで、容易に得ることができる。また、そのような過剰発現は、その場で（ｉｎｓｉｔｕ）、つまり治療又は保護されるべき個体の細胞内でも行い得る。そのような目的に用いることができる核酸は、本明細書の配列番号１の２０７位−アデニンから１４６６位−グアニンまでのヌクレオチド配列を少なくとも有するであろう。その部分が、ＯＲＦ４遺伝子翻訳産物の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでのアミノ酸配列をコードする天然型の配列である。しかしながら、本発明の核酸は、上記した本発明のポリペプチドに翻訳される限り、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。

なお、本発明のポリペプチドはｄｓＲＮＡウイルスの蛋白質に由来するので、本発明の核酸はＤＮＡだけでなく、ＲＮＡであってもよい。更に、本発明の核酸は、修飾ＤＮＡ及び修飾ＲＮＡであってもよい。つまり、用途に応じて本発明の核酸を、例えばＣｙ３やＣｙ５等の蛍光物質、化学発光物質等により標識してもよい。或いは、本発明の核酸を、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート等の安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ等の安定なＲＮＡ誘導体として作製してもよい。それらの核酸も、全て本発明の核酸に含まれる。

ベクター
しかるに、本発明の核酸は、「発現カセット」として宿主細胞内に導入されることにより、より安定的で高レベルの本発明のポリペプチド生産を達成することを当業者は理解するであろう。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写及び翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主に、「作動可能」に導入される。

プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。例えば、宿主細胞が真菌細胞である場合、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ並びにアミラーゼ系遺伝子及びｔｒｐＣのプロモーターが使用できるが、ＴＤＨ３プロモーターが好ましい。宿主が動物細胞である場合、ＳＶ４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモーター等が例示できる。宿主が植物細胞である場合は、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ転写物、トウモロコシのユビキチン、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。また、原核生物宿主細胞のためには、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が利用可能である。プロモーター及びターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５”、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）に記載されている。

上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主細胞中に挿入される。これらのベクターは、宿主細胞中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。真菌宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣより入手可能）、ｐＡＵＲ１０１及びｐＡＵＲ３１６（ＴａｋａｒａＢＩＯＩｎｃ．より入手可能）、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２や“Ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｓｙｓｔｅｍｓａｎｄｖｅｃｔｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｒｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ”、ＡｐｐｌｉｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＦｕｎｇｉ、Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙｅｔａｌ．、ｅｄｓ．、ｐ．１−２８、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓに記載されたものが挙げられる。動物宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣ、並びにアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。植物宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ、ｐＧｒｅｅｎ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００等の中間ベクター系のプラスミドが挙げられる。原核生物宿主細胞のための好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。

上記ようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法及びトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。

医薬組成物
上記のようにして本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を、その細胞の至適培養条件下でインキュベーとすることにより、本発明のポリペプチドを生産することができる。その後、培養物から、遠心分離、塩析、ｐＨ沈殿、透析及び各種のクロマトグラフィーを組み合わせることで、本発明のポリペプチドを精製することができる。たとえば、本発明のポリペプチドの末端にＨｉｓタグを付加しておき、それをアフィニティ・クロマトグラフィーにより精製してもよい。従って、本発明の医薬組成物の有効成分は、本発明のポリペプチドあり得る。また、本発明のポリペプチドは、真菌用ベクター内に作動可能に連結された本発明の核酸により、その生育を阻害すべき真菌の細胞を直接形質転換することで、当該真菌自身に生産させてもよい。そのような生産は、形質転換された真菌にとって致命的結果をもたらすであろう。更に、本発明のポリペプチドは、本発明のベクターにより、治療ないし保護すべき個体の細胞を形質転換することで、ｉｎｓｉｔｕで生産させることが可能である。従って、本発明の医薬組成物の有効成分は、本発明の核酸又は本発明のベクターであってよい。

従って、本発明の医薬組成物は、有効量の本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターに加え、任意の担体、例えば薬学的に許容される担体を含むことができる。

薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。

その有効成分が核酸又はベクターである場合、本発明の医薬組成物は、更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リボソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。つまり、本発明の核酸ないしベクターをアテロコラーゲン等に含ませることにより、本発明のポリペプチドを生産させるべき細胞に対して本発明の核酸又はベクターを効率よく送達し、当該細胞に効率よく取り込ませることができる。

本発明の医薬組成物は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量或いは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び薬学的に許容される担体を一緒に凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。

本発明の医薬組成物中の有効成分の含有量としては、例えば、医薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％が例示される。そして、そのような医薬組成物の投与量は、投与方法、感染の種類、大きさ、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、成人に注射により局所投与する場合、通常、ポリペプチドの量として約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜数回／日で投与すればよい。有効成分が核酸又はベクターの場合は、核酸又はベクターの量として約ｌｐｍｏｌ／ｋｇ〜２００ｎｍｏｌ／ｋｇを１〜１０回程度投与することが例示される。

本発明の医薬組成物が有効な真菌類として、アスペルギルス・フミガタス及びアスペルギルス・フラバス等のアスペルギウス属；ニューモシスティス・カリニ菌；クモノスカビ属；アブシディア属；ヒストプラスマ・カプスラータム等のヒストプラスマ属；コクシジオイデス・イミティス等のコクシジオイデス属；ブラストミセス属；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス等のパラコクシジオイデス属；ペニシリウム属；カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルーセイ及びカンジダ・トロピカリス等のカンジダ属諸菌種；クリプトコッカス・ネオフォルマンス等のクリプトコッカス属；シューダレシア属；スポロトリクス属；黒色真菌；トリコフィトン属；ミクロスポルム属；エピデルモフィトン属；マラセチア属；ホンセンカエア属；フサリウム属；ペシロミセス属；トリコスポロン・クタネウム等のトリコスポロン属；ヒアロホーラ属；並びにクラドスポリウム等を例示することができる。また、これらの病原体によって引き起こされる疾病として、真菌血症、呼吸器真菌症、消化器真菌症、尿路真菌症、真菌髄膜炎、スポロトリコーシス、クロモミコーシス（黒色真菌症）、菌腫（マイセトーマ）、通常病型白癬、深在性白癬、難治性白癬、爪白癬、癜風、皮膚カンジダ症、口腔カンジダ症等を例示することができる。

農薬組成物
医薬組成物の場合と同様に、本発明の農薬組成物の有効成分は、本発明のポリペプチドあり得る。また、真菌用ベクター内に作動可能に連結された本発明の核酸により、その生育を阻害すべき真菌の細胞を直接形質転換することで、当該真菌自身に本発明のポリペプチドを生産させ、それにより当該真菌の生育を阻害してもよい。更に、特許文献５には、ＭｏＣＶ１に感染したイネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ）の分生子を、強毒性のイネいもち病菌の分生子と共にイネに接種することにより、病斑数を顕著に減少させ得ることが示されている。従って、その生育を阻害すべき真菌を本発明の核酸又はベクターにより形質転換して、当該真菌の弱毒性株を作製し、そのようにして得られた弱毒性株の生細胞、好ましくは分生子を植物に施用することで、野生型の強毒性株による植物病害を防除することも可能である。或いは、本発明のポリペプチドは、本発明のベクターにより、保護すべき植物個体の細胞を形質転換することで、ｉｎｓｉｔｕで生産させることが可能である。故に、本発明の農薬組成物の有効成分は、本発明の核酸又は本発明のベクター、或いは本発明の宿主細胞（例えば弱毒化された植物病原性真菌に由来する分生子）であってよい。

従って、本発明の農薬組成物は、有効量の本発明のポリペプチド、核酸又はベクター、或いは本発明の宿主細胞（分生子等）に加え、任意の担体、例えば農学的に許容される担体を含むことができる。

農学的に許容される固体担体としては、例えば、澱粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、魚粉、粉乳などの動植物性粉末、タルク、カオリン、ベントナイト、ゼオライト、珪藻土、ホワイトカーボン、クレー、アルミナ、炭酸カルシウム、塩化カリウム、硫安などの鉱物性粉末が挙げられる。液体担体として、例えば、水、イソプロピルアルコール、エチレングリコールなどのアルコール類、シクロヘキサノン、メチルエチルケトンなどのケトン類、プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテルなどのエーテル類、ケロシン、軽油などの脂肪族炭化水素類、キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、メチルナフタリン、ソルベントナフサなどの芳香族炭化水素類、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどのアミド類、脂肪酸のグリセリンエステルなどのエステル類、大豆油、ナタネ油などの植物油が挙げられる。

また、本発明の農薬組成物は、粘結剤、増粘剤、固着剤等の追加の成分を含むことが好ましい。それらの例としては、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。更に、医薬組成物に関して既に説明したように、本発明の農薬組成物においても、本発明の核酸又はベクターは、アテロコラーゲン、リボソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質から成る核酸導入用試薬と一緒に用いることが好ましい。

本発明の農薬組成物の剤型は、例えば、乳剤、懸濁剤、粉剤、粒剤、錠剤、水和剤、水溶剤、液剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、エアゾール剤、ペースト剤、油剤、乳濁剤などであってよい。本発明の農薬組成物中の有効成分の含有量としては、例えば、農薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％が例示される。当該組成物の施用量は、有効成分の濃度や種類、製剤の形態、対象病害や作物の種類、病害による被害の程度、施用場所、施用方法、施用時期、混用・併用する薬剤や肥料などの使用量、種類などの条件に応じて、適宜選択すればよい。

例えば、本発明のポリペプチドを含む農薬組成物の場合、本発明のポリペプチドを約０．０１から２．０ｋｇ／ｈａの割合で施用すればよい。施用は、所望により、例えば、８から３０日間隔で反復できる。また、本発明の核酸又はベクターを含む農薬組成物の場合、核酸又はベクターの量として約ｌｎｍｏｌ／ｋｇ〜２００μｍｏｌ／ｈａを１〜１０回程度施用することが例示される。

また、本発明の宿主細胞（分生子等）を含む農薬組成物の場合、例えば、１×１０^３〜１×１０^１０個／ｍＬに調整した分生子含有液を約１０〜１，０００Ｌ／ｈａの割合で施用すればよい。

本発明の農薬組成物により防除され得る植物病害として、例えば、イネいもち病（原因菌「Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ」）、イネごま葉枯病（原因菌「Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｍｉｙａｂｅａｎｕｓ」）、紋枯病（原因菌「Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓｃｕｃｕｍｅｒｉｓ」）、ばか苗（原因菌「Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉ」）、苗立枯病（原因菌「Ｆｕｓａｒｉｕｍ菌」、「Ｒｈｉｚｏｐｕｓ菌」、「Ｐｙｔｈｉｕｍ菌」、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ」）、イネこうじ病（原因菌「Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｖｉｒｅｎｓ」）、ムギ類の赤かび病（原因菌「Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｚｅａｅ」、「Ｆｕｓａｒｉｕｍａｖｅｎａｃｅｕｍ」、「Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ」、「Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａｎｉｖａｌｅ」）、雪腐病（原因菌「Ｐｙｔｈｉｕｍ菌」、「Ｔｙｐｈｕｌａ菌」、「Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａｎｉｖａｌｉｓ」、「Ｍｙｒｉｏｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｂｏｒｅａｌｉｓ」）、裸黒穂病（原因菌「Ｕｓｔｉｌａｇｏｎｕｄａ」）、なまぐさ黒穂病（原因菌「Ｔｉｌｌｅｔｉａｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ」）、眼紋病（原因菌「Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ」）、葉枯病（原因菌「Ｓｅｐｔｏｒｉａｔｒｉｔｉｃｉ」）、ふ枯病（原因菌「Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａｎｏｄｏｒｕｍ」）、うどんこ病（原因菌「Ｂｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ」）、カンキツ類の黒点病（原因菌「Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｃｉｔｒｉ」）、小黒点病（原因菌「Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｍｅｄｕｓａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｃｉｔｒｉ」）、そうか病（原因菌「Ｅｌｓｉｎｏｅｆａｗｃｅｔｔｉｉ」）、褐色腐敗病（原因菌「Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃｉｔｒｏｐｈｔｈｒａ」）、緑かび病（原因菌「Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｉｇｉｔａｔｕｍ」）、青かび病（原因菌「Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｉｔａｌｉｃｕｍ」）、リンゴのモニリア病（原因菌「Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｍａｌｉ」）、黒星病（原因菌「Ｖｅｎｔｕｒｉａｉｎａｅｑｕａｌｉｓ」）、斑点落葉病（原因菌「Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｍａｌｉ」）、黒点病（原因菌「Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｐｏｍｉ」）、すす斑病（原因菌「Ｇｌｏｅｏｄｅｓｐｏｍｉｇｅｎａ」）、すす点病（原因菌「Ｚｙｇｏｐｈｉａｌａｊａｍａｉｃｅｎｓｉｓ」）、輪紋病（原因菌「Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｂｅｒｅｎｇｅｒｉａｎａ」）、褐斑病（原因菌「Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎｍａｌｉ」）、赤星病（原因菌「Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｙａｍａｄａｅ」）、腐らん病（原因菌「Ｖａｌｓａｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ」）、ナシの黒星病（原因菌「Ｖｅｎｔｕｒｉａｎａｓｈｉｃｏｌａ」）、赤星病（原因菌「Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ」）、輪紋病（原因菌「Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｂｅｒｅｎｇｅｒｉａｎａ」）、胴枯病（原因菌「Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓｆｕｋｕｓｈｉｉ」）、モモの縮葉病（原因菌「Ｔａｐｈｒｉｎａｄｅｆｏｒｍａｎｓ」）、灰星病（原因菌「Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ」）、黒星病（原因菌「Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ」）、ホモプシス腐敗病（原因菌「Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓｓｐ．」）、オウトウの灰星病（原因菌「Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ」、「Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ」）、幼果菌核病（原因菌「Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｋｕｓａｎｏｉ」）、ウメの黒星病（原因菌「Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ」）、ブドウの黒とう病（原因菌「Ｅｌｓｉｎｏｅａｍｐｅｌｉｎａ」）、晩腐病（原因菌「Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍ」、「Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｃｉｎｇｕｌａｔａ」）、褐斑病（原因菌「Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｖｉｔｉｓ」）、つる割病（原因菌「Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓｖｉｔｉｃｏｌａ」）、カキの角斑落葉病（原因菌「Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｋａｋｉ」）、円星落葉病（原因菌「Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｎａｗａｅ」）、茶の輪斑病（原因菌「Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓｌｏｎｇｉｓｅｔａ」、「Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓｔｈｅａｅ」）、褐色円星病（原因菌「Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｏｃｅｌｌａｔａ」、「Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｃｈａａｅ」）、もち病（原因菌「Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍｖｅｘａｎｓ」）、網もち病（原因菌「Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ」）、ウリ類のつる枯病（原因菌「Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｍｅｌｏｎｉｓ」）、つる割病（原因菌「Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ」）、黒星病（原因菌「Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ」）、褐斑病（原因菌「Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａｃａｓｓｉｉｃｏｌａ」）、トマトの葉かび病（原因菌「Ｆｕｌｖｉａｆｕｌｖａ」）、輪紋病（原因菌「Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉ」）、ナスの褐紋病（原因菌「Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓｖｅｘａｎｓ」）、すすかび病（原因菌「Ｍｙｃｏｖｅｌｌｏｓｉｅｌｌａｎａｔｔｒａｓｓｉｉ」）、アブラナ科野菜の白さび病（原因菌「Ａｌｂｕｇｏｍａｃｒｏｓｐｏｒａ」）、白斑病（原因菌「Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａｂｒａｓｓｉｃａｅ」、「Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａｃａｐｓｅｌｌａｅ」）、タマネギの灰色腐敗病（原因菌「Ｂｏｔｒｙｔｉｓａｌｌｉｉ」）、イチゴの蛇の目病（原因菌「Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｆｒａｇａｒｉａｅ」）、ジャガイモの夏疫病（原因菌「Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉ」）、ダイズの茎疫病（原因菌「Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｓｏｊａｅ」）、紫斑病（原因菌「Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｋｉｋｕｃｈｉｉ」）、アズキの茎疫病（原因菌「Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｖｉｇｎａｅ」）、ラッカセイの褐斑病（原因菌「Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａａｒａｃｈｉｄｉｓ」）、テンサイの褐斑病（原因菌「Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｂｅｔｉｃｏｌａ」）、葉腐病（原因「Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓｃｕｃｕｍｅｒｉｓ」）、シバのカーブラリア葉枯病（原因菌「Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ菌」）、ダラースポット病（原因菌「Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ」）、ヘルミントスポリウム葉枯病（原因菌「Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ菌」）、バラの黒星病（原因菌「Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎｒｏｓａｅ」）、キクの白さび病（原因菌「Ｐｕｃｃｉｎｉａｈｏｒｉａｎａ」）、各種作物のべと病（原因菌「Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ菌」、「Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ菌」、「Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ菌」、「Ｂｒｅｍｉａ菌」）、疫病（原因菌「Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ菌」）、うどんこ病（原因菌「Ｅｒｙｓｉｐｈｅ菌」、「Ｂｌｕｍｅｒｉａ菌」、「Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ菌」、「Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒｅａ菌」、「Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ菌」、「Ｕｎｃｉｎｕｌａ菌」、「Ｏｉｄｉｏｐｓｉｓ菌」）、さび病（原因菌「Ｐｕｃｃｉｎｉａ菌」、「Ｕｒｏｍｙｃｅｓ菌」、「Ｐｈｙｓｏｐｅｌｌａ菌」）、黒斑病（原因菌「Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ菌」）、灰色かび病（原因菌「Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ」）、菌核病（原因菌「Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ」）、白紋羽病（原因菌「Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａｎｅｃａｔｒｉｘ」）、紫紋羽病（原因菌「Ｈｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍｍｏｍｐａ」）、白絹病（原因菌「Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍｒｏｌｆｓｉｉ」）、その他各種土壌病害（原因菌「Ｆｕｓａｒｉｕｍ菌」、「Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ菌」、「Ｐｙｔｈｉｕｍ菌」、「Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ菌」、「Ｐｈｏｍａ菌」、「Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ菌」、「Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａｂｒａｓｓｉｃａｅなど」）が挙げられる。

その他の用途
上記のとおり、本発明のポリペプチドの最小長は、本来のＯＲＦ４遺伝子翻訳産物のほぼ半分程度である。従って、そのような最小ポリペプチドは、ＯＲＦ４遺伝子によりコードされるＰ７０蛋白質中の細胞障害活性ドメインの配列及び構造をより的確に反映していると考えられる。故に、本発明のポリペプチドは、ＭｏＣＶ１ウイルスによる真菌の生育阻害機構を解明するための研究に用いることが可能である。また、そのような最小ポリペプチドは、更なる高活性ポリペプチドのリード物質として利用可能である。そのような用途のために、本発明のポリペプチド、核酸及びベクターのいずれも、研究のための試薬として利用できる。当該試薬は、本発明のポリペプチド、核酸又はベクターを、例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、及び界面活性剤等の分散剤とともに、適切なｐＨの緩衝液に溶解して得ることができる。

以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載され、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端方向に向けて記載される。

参考例１：全長ＯＲＦ４コード化配列を導入した酵母の作製
ＭｏＣＶ１のＯＲＦ４遺伝子中のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質を生産する形質転換体を、以下の手順で作製した。

＜１−ａ＞発現ベクターの構築
ＡＴＣＣより購入したプラスミドｐＲＳ４２６（図３）をもとにして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域の間に挟まれたマルチ・クローニング・サイトを有する、プラスミドｐＲＳＴ４２６を作製した（図４）。詳細には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３−１Ａ［Ｌ−Ａ−ｏ］株よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにてＴＤＨ３遺伝子のプロモーター領域（Ｐｒｉｍｅｒ１：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒ２：ｒｅｖｅｒsｅ）とターミネーター領域（Ｐｒｉｍｅｒ３：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒ４：ｒｅｖｅｒsｅ）を増幅し、それぞれ市販のｐＵＣ１９プラスミドへクローニングした。なお、ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。次に、プロモーター領域を含むプラスミドからＢｌｎＩ１／ＢａｍＨＩでプロモーター領域を切り出し、同じ制限酵素で切断したターミネーター領域を含むプラスミドに挿入した。ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩでこのプラスミドから遺伝子発現用カセット部分を切り出し、同じ制限酵素で切断したｐＲＳ４２６プラスミドに挿入した（図５）。

一方、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにてＯＲＦ４（ＰｒｉｍｅｒＡ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＢ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、全長ＯＲＦ４の発現ベクターを構築した。

＜１−ｂ＞酵母の形質転換
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３−１Ａ（Ｍａｔａｕｒａ３ｌｅｕ２ｈｉｓ３ｔｒｐ１ａｄｅ２Ｌ−Ａ−ｏ）株を３０℃で培養した後、遠心分離により回収してから蒸留水で懸濁し、再度遠心分離にかけて洗浄した。沈殿物にＳｏｌＡ（０．１ＭＬｉｔｈｉｕｍａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８、１ｍＭＥＤＴＡ）を加えて懸濁して遠心分離し、沈殿物に再びＳｏｌＡを加えて懸濁して酵母溶液とした。これを３０℃で５０分間インキュベートした後、熱処理したｓｓＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ、サーモンスパーム）１０μｌ、酵母溶液５０μｌ、上記の全長ＯＲＦ４の発現ベクター１０μｌ、ＳｏｌＡ２０μｌ、５０％ポリエチレングリセロール７５０μｌの順に加えた後、３０℃で３０分間、４２℃で１５分間インキュベートした。遠心分離後、沈殿物に蒸留水を加えてＳＣ寒天平板培地（シャトルベクターの選択マーカーに合わせてドロップアウト培地を選択する）にまいて、３０℃で培養した。

実施例１：ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから８１２位−セリンまでのコード化配列を導入した酵母の作製
上記＜１−ａ＞で作製した発現ベクターｐＲＳＴ４２６のマルチ・クローニング・サイトに、ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから８１２位−セリンまでのコード化配列（以下、当該配列及びその翻訳産物を「１Ｂ」と略す。）を挿入した。詳細には、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにて１Ｂ（ＰｒｉｍｅｒＣ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＢ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、１Ｂの発現ベクターを構築した。

上記＜１−ｂ＞と同じ手順で、得られた１Ｂ発現ベクターによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３−１Ａ（Ｍａｔａｕｒａ３ｌｅｕ２ｈｉｓ３ｔｒｐ１ａｄｅ２Ｌ−Ａ−ｏ）株を形質転換した。

実施例２：ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでのコード化配列を導入した酵母の作製
上記＜１−ａ＞で作製した発現ベクターｐＲＳＴ４２６のマルチ・クローニング・サイトに、ＯＲＦ４の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでのコード化配列（以下、当該配列及びその翻訳産物を「１３」と略す。）を挿入した。詳細には、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにて１３（ＰｒｉｍｅｒＣ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＤ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、１３の発現ベクターを構築した。

上記＜１−ｂ＞と同じ手順で、得られた１３発現ベクターによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３−１Ａ（Ｍａｔａｕｒａ３ｌｅｕ２ｈｉｓ３ｔｒｐ１ａｄｅ２Ｌ−Ａ−ｏ）株を形質転換した。

参考例２：ＯＲＦ４の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのコード化配列を導入した酵母の作製
上記＜１−ａ＞で作製した発現ベクターｐＲＳＴ４２６のマルチ・クローニング・サイトに、ＯＲＦ４の４３６位−グリシンから６９３位−システインまでのコード化配列（以下、当該配列及びその翻訳産物を「２４」と略す。）を挿入した。詳細には、ＭｏＣＶ１−ｄｓＲＮＡ４ｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、ＰＣＲにて２４（ＰｒｉｍｅｒＥ：ｆｏｒｗａｒｄとＰｒｉｍｅｒＦ：ｒｅｖｅｒｓｅ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）のマニュアルに従った。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＵＣ１９プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したｐＲＳＴ４２６へ挿入して、２４の発現ベクターを構築した。

上記＜１−ｂ＞と同じ手順で、得られた２４発現ベクターによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３−１Ａ（Ｍａｔａｕｒａ３ｌｅｕ２ｈｉｓ３ｔｒｐ１ａｄｅ２Ｌ−Ａ−ｏ）株を形質転換した。

実施例３：全長ＯＲＦ４、１Ｂ、１３及び２４導入酵母の生育試験
ジャーファーメンター培養により、それぞれの形質転換酵母の生育を試験した。

＜３−ａ＞全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び２４の比較
微生物培養装置（ＢＭ２−０２ＮＰ３、ＡＢＬＥ社製）を用いて標題の配列を導入した酵母を培養し、その生育を試験した。なお、陰性対照としては、ｐＲＳＴ４２６を導入した酵母を用いた。培地は全てＳＣ−ｕｒａ液体培地を用いた。詳細には、５ｍｌの液体培地（試験管）に３０℃、３日間寒天培地上で培養した酵母を植菌し、２８℃、１４５ｒｐｍで１６時間震盪培養した（前々培養）。この培養液をＯＤ６００＝０．１となるように５０ｍｌの液体培地（２００ｍｌコルベン）に加え、２８℃、１４０ｒｐｍで１２時間培養した（前培養）。この培養液をＯＤ６００＝０．０３となるように液体培地１Ｌを入れた微生物培養装置に植菌し、温度３５℃、空気流量１．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌１００ｒｐｍの条件で培養した（本培養）。溶存酸素濃度を、ＡＢＬＥ社製のＤＯセンサー（直径１２ミリ密閉型Ｌ＝２２０ｍｍ）により測定した。

上記の培養液を経時的にサンプリングした。詳細には、微生物培養装置のサンプルング口にシリコンチューブでシリンジを接続し、培養液１０ｍｌをシリンジで取り出し、滅菌遠心管に移した。そのようにして得た培養液サンプルの一部を滅菌水で希釈した後に寒天平板上に撒いた。それらの平板を２８℃で３日間インキュベートした後、平板上のコロニーの形成数を計測して、生菌細胞数を測定した。また、培養液サンプルの別の一部の吸光度を、分光光度計（ＵＶ−１８００、島津社製）により測定した。次いで、吸光度を測定した後のサンプルを遠心分離して、上清と菌体に分けた。上清中のグルコース濃度を、バイオセンサー（ＢＦ−５、ＢＦ−３０ＡＳ、グルコースセンサー：ＥＤ０５−０００３、王子計測機器社製）を用いて測定した。また、菌体からはタンパク質を抽出し、抗ＯＲＦ４ｐ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより目的のタンパク質が生産されていることを確認した（図８）。更に、一部の菌体について、顕微鏡（倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７１Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて細胞形態を観察した（倍率１，０００倍、微分干渉）。

培養液サンプルの試験結果として、１Ｂ導入株で顕著な生育不良が認められた。一方、２４導入株では生育速度の上昇が見られた（図６）。なお、２４導入株において、濁度の上昇とＣＦＵの上昇が培養２６時間付近で停滞しているが、下記のように菌体の異常な凝集が確認されており、その影響と考えられた。

また、細胞形態観察の結果として、ＯＲＦ４と１Ｂの導入株では細胞が肥大化し、細胞内が顆粒化しているのが認められた。一方、２４導入株では細胞の肥大化はあまり見られなかったが、多数の細胞が集まり、巨大な細胞凝集体を形成していた（図７）。また、プレート上のコロニーは、１Ｂ導入株でサイズが顕著に小さく、逆に２４導入株では凸凹したサイズの大きなコロニーが見られた（図７）。

＜３−ｂ＞全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び１３の比較
上記＜３−ａ＞の生育試験（ｐＨ、濁度及び生菌細胞数）を、全長ＯＲＦ４、１Ｂ及び１３を導入した酵母について行った。結果として、ｐＨの低下、濁度の上昇及び生菌細胞数の増加のいずれの項目においても、１Ｂ及び１３導入株は、全長ＯＲＦ４よりも優れた生育阻害活性を示した。なお、ｐＨの低下や濁度の上昇速度は１Ｂ導入株が最も緩やかであった。しかし、生菌細胞数は１３導入株でも１Ｂ導入株と同程度の抑制が見られ、常に低い値が示された（図９）。

本発明のポリペプチドは、顕著な真菌生育阻害活性を示すので、医薬製造業、農薬製造業、農業などにおいて利用可能である。また、研究用試薬としても利用可能であるので、化学品製造業においても有用であり得る。

Claims

真菌の生育を阻害する能力を有するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
１) 配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの一部の配列であって、少なくとも配列番号２の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでを含むアミノ酸配列；
２）上記１）に対して少なくとも６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列；、又は
３）上記１）のアミノ酸配列に対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、
から成る、前記ポリペプチド。
上記１）のアミノ酸配列が、配列番号２の１６位−イソロイシンから８１２位−セリンまでの配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
上記１）のアミノ酸配列が、配列番号２の１６位−イソロイシンから４３５位−グルタミンまでの配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
請求項４に記載の核酸が作動可能に連結されたベクター。
請求項５に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載の核酸又は請求項５に記載のベクターを含む、抗真菌組成物。
薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である、請求項７の組成物。
農学的に許容される担体を含む農薬組成物である、請求項７の組成物。
真菌による感染症を治療する方法であって、そのような処置が必要とされる患者に対して請求項１乃至３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載の核酸又は請求項５に記載のベクターを投与することを含む、前記方法。
真菌による植物病を防除する方法であって、そのような処置が必要とされる植物個体に対して請求項１乃至３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクター又は請求項６に記載の宿主細胞を施用することを含む、前記方法。