JP5754716B2 - マイコウイルス、植物病害真菌、植物病害防除剤、植物病害防除方法及び植物病害真菌弱毒化方法 - Google Patents

マイコウイルス、植物病害真菌、植物病害防除剤、植物病害防除方法及び植物病害真菌弱毒化方法 Download PDF

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Description

本発明は、植物病害真菌を植物に対する感染力を抑制する新規なマイコウイルスに関し、当該マイコウイルスが感染した植物病害真菌、当該マイコウイルスを利用した植物病害防除剤並びに植物病害防除方法、及び当該マイコウイルスを用いた植物病害真菌弱毒化方法に関する。
植物病害には、気象・土壌など環境的要因で発生するもの、ウイルス・細菌・真菌（糸状菌）などの感染性要因で発生するもの、生理的障害により発生するもの、それらの複合的な要因で発生するものなどが存在する。現在においても、植物病害の中には食糧、花き、花木、樹木などの生産に阻害要因となるものが数多く含まれ、経済的影響が大きいものも多い。
植物病害のうち、真菌は、最も重要な病害因子の一つである。植物病害の約８割は真菌によって引き起こされるといわれている。
例えば、いもち病は、世界各地で発生している最も重要な植物病害の一つである。病原菌は、カビ（糸状菌）の一種であるイネいもち病菌（学名「Magnaporthe oryzae」）である。イネいもち病菌は、２５℃前後が発育・胞子形成・感染の適温であり、また、湿潤な環境を好む。そのため、夏季の低温、多雨、日照不足などの気象要因により大発生し、イネの不作・品質低下をもたらし、経済的に大きな打撃を与える。
その他、紋枯病、さび病、うどんこ病、炭疸病、菌核病、べと病、灰色かび病など、真菌が原因で経済的影響も大きい植物病害は数多く存在する。そのため、現在においても、新しい農薬の開発や、品種改良などが試みられている（いもち病の防除に関して、例えば、特許文献１、２参照）。
ここで、本発明に関連する事項であるマイコウイルスについて、以下説明する。
真菌類（Ｆｕｎｇｉ、以下同じ）に感染するウイルスをマイコウイルスという。その中で、二本鎖ＲＮＡをゲノムとするマイコウイルスが報告されている。それらのマイコウイルスは、宿主菌に潜在的に感染し、宿主の形質にほとんど影響を与えないものが多い。
二本鎖ＲＮＡをゲノムとするマイコウイルスは、現在、パルチチウイルス科（学名「Partitiviridae」、以下同じ）、トチウイルス科（学名「Totiviridae」、以下同じ）、クリソウイルス科（学名「Chrysoviridae」、以下同じ）など、５科に分類されている。パルチチウイルス科ウイルスは、ウイルス粒子中に、二つのほぼ同じ大きさの直鎖状二本鎖ＲＮＡを有し、全遺伝子量は４〜６ｋｂｐである。トチウイルス科ウイルスは、ウイルス粒子中に４〜７ｋｂｐの一本の直鎖状二本鎖ＲＮＡを有する。その他、クリ胴枯れ病菌（学名「Cryphonectria parasitica」）では、菌内在性に存在し、９〜１３ｋｂｐの二本鎖ＲＮＡを有するウイルスが発見されている（ハイポウイルスなど）。
クリソウイルス科ウイルスは、球形のウイルス様粒子を有し、四成分の二本鎖RNAを有する。また、パルチチウイルス科及びトチウイルス科のウイルスと同様、RdRP（RNA-dependent RNA polymerase；RNA依存性RNAポリメラーゼ）をコードする領域を有することが知られている。クリソウイルス科に属するウイルスとして、例えば、Hv145SV（「Helminthosprium victoriae 145S virus」、以下同じ）、PcV（「Pencillium chrysogenum virus」、以下同じ）、AbV1（「Agaricus bisporus virus 1」、以下同じ）などが知られている（非特許文献１など参照）。
近年、特定の植物病害に対し、その病原菌をマイコウイルスなどで弱毒化し、その弱毒菌を用いてその病害を防除する方法が検討され、一部実用化されている。例えば、クリ胴枯れ病菌の毒性を抑制するウイルス性二本鎖RNAの完全長cDNAを用いてその菌を弱毒化し、クリ胴枯れ病の防除に応用する方法（非特許文献１など参照）や、紫紋羽病菌（学名「Helicobasidium mompa」）を抑制する二本鎖RNAウイルスを発見し、その二本鎖RNAを内在する紫紋羽病菌弱毒菌株を用いて紫紋羽病を防除する方法（非特許文献２、特許文献３など参照）などが開示されている。
また、特許文献４には、イネいもち病菌に感染し、イネいもち病菌の感染力を低減させるマイコウイルス、及び当該マイコウイルスが感染した植物病害真菌弱毒株が開示されている。特許文献４に開示されたマイコウイルスを使用することで植物病害真菌を弱毒化することができ、植物病害の新規な防除手段が提供できるとされている。
特開2004-143045号公報 特開2003-250370号公報 特開2001-78752号公報 国際公開 WO/2009/093409号公報
C. M. Fauquet, Mary Ann Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, L. A. Ball, "Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses; Eighth Report Of The International Committee On Taxonomy Of Viruses", Elsevier Academic Press: p591-595 Gil H.Choi and Donald L.Nuss, "Hypovirulence of chestnut blight fungus conferred by an infectious viral cDNA." Science. 1992 Aug 7;257(5071):800-3 H.Osaki et al, "Detection of Double-Stranded RNA Virus from a Strain of the Violet Root Rot Fungus Helicobasidium mompa Tanaka" Virus Genes 25:2,139-145, 2002
上記特許文献４には、植物病害真菌を弱毒化するマイコウイルスが開示されているものの、当該マイコウイルス及び当該マイコウイルスが感染した植物病害真菌弱毒株を用いた時の防除価は十分とは言えず、より高い防除価を達成することが求められていた。そこで、本発明では、植物病害真菌に対してより優れた防除効果を有するマイコウイルス、当該マイコウイルスが感染した植物病害真菌、当該マイコウイルス及び/又は当該植物病害真菌を含む植物病害防除剤、当該マイコウイルス及び/又は当該植物病害真菌を利用した植物病害防除方法、及び植物病害真菌の弱毒化方法を提供することを目的としている。
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）五種類の二本鎖ＲＮＡを有し、当該五種類の二本鎖ＲＮＡのうち四種類の二本鎖ＲＮＡがそれぞれ配列番号１〜４に示す塩基配列に対して８１％、７５％、７２％及び７３％以上の相同性を有することを特徴とするマイコウイルス。
（２）当該五種類の二本鎖ＲＮＡがそれぞれ配列番号１〜５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする（１）記載のマイコウイルス。
（３）上記（１）又は上記（２）のマイコウイルスが宿主に感染した植物病害真菌。
（４）上記宿主がイネいもち病菌であることを特徴とする（３）記載の植物病害真菌。
（５）上記（１）又は上記（２）記載のマイコウイルス若しくは上記（３）又は（４）記載の植物病害真菌を含む植物病害防除剤。
（６）上記（５）記載の植物病害防除剤を植物に接触させる工程を含む植物病害真菌防除方法。
（７）上記（１）又は上記（２）記載のマイコウイルスを植物病害真菌に感染させる工程を含む植物病害真菌弱毒化方法。
（８）上記植物病害真菌がイネいもち病菌であることを特徴とする（７）記載の植物病害真菌弱毒化方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-38951号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
本発明に係るマイコウイルスは、従来のマイコウイルスと比較して植物病害真菌に対する防除価が非常に優れている。したがって、本発明に係るマイコウイルス及び当該マイコウイルスが感染した植物病害真菌を使用することによって、従来と比較して優れた効率で植物病害を防除できることとなる。
PDA培地におけるイネいもち病菌Ｓ−０４１２−II ２ａ株及びイネいもち病菌Ｓ−０４１２−II １ａ株のコロニーを観察した結果を示す写真である。 イネいもち病菌Ｓ−０４１２−II ２ａ株及びイネいもち病菌Ｓ−０４１２−II １ａ株のウイルス治癒株をPDA培地にてコロニー観察した結果を示す写真である。 (A)イネいもち病菌Ｓ−０４１２−II ２ａ株及びそのウイルス治癒株について菌糸生産量を示す特性図であり、(B) イネいもち病菌Ｓ−０４１２−II １ａ株及びそのウイルス治癒株について菌糸生産量を示す特性図である。 イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株を噴霧接種した際の病斑数を示すグラフである。 MoCV3粒子を電子顕微鏡写真である。 MoCV3全長cDNAクローンdsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及びdsRNA5をPCRにより増幅した後、pUC19にサブクローニンしたプラスミドの構成を示す図である。 シャトルベクターを構築するために使用したpRSA313、pRSA314及びpRSA315の構成を示す図である。 シャトルベクターを構築するために使用したpRSA316及びpRSA317の構成を示す図である。 (a)は再構築したMoCV3をショ糖濃度勾配遠心により分画し、得られた分画に対して抗MoCV3抗血清を用いたウエスタン解析を行った結果を示す図であり、(b)は電子顕微鏡観察にてMoCV3ウイルス様粒子を観察した結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るマイコウイルスは、五種類の二本鎖ＲＮＡを有している。これら五種類の二本鎖ＲＮＡのうち四種類の二本鎖ＲＮＡは、それぞれ配列番号１〜４に示す塩基配列に対して８１％、７５％、７２％及び７３％以上の相同性を有する塩基配列からなる。本発明に係るマイコウイルスは、イネいもち病菌（学名「Magnaporthe oryzae」）に感染して、イネいもち病菌等の植物病害真菌を弱毒化する機能を有している。
本発明に係るマイコウイルスとしては、一例として、配列番号１〜５に示す塩基配列からなる五種類の二本鎖ＲＮＡを有している。なお、配列表における配列番号１〜５の塩基配列は全てＤＮＡ配列として記載されているが、これらは全て、ＲＮＡの場合の配列（チミンがウラシルに置換したもの）も包含する
本発明に係るマイコウイルスは、イネいもち病菌に内在するかたちで保存できる。本発明に係るマイコウイルスとしては、一例として、本発明者らが同定し、命名したMoCV3（Magnaporthe oryzae chrysovirus 3）を挙げることができる。このMoCV3は、配列番号１〜５に示す塩基配列からなる五種類の二本鎖ＲＮＡを有し、イネいもち病菌に内在するかたちで保存されている。
このMoCV3を内在するイネいもち病菌Ｓ−０４１２−II ２ａ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにておいて、ウイルスを内在することを理由として受託拒否に該当すると証明されている。また、本菌は、国立大学法人東京農工大学農学部植物病理学研究室において保存されており、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲可能である。また、本菌をAmerican Type Culture Collectionへ寄託するための手続きが進行している。
なお、本菌株の原産地はベトナムである。二本鎖ＲＮＡのうち配列番号１に示す塩基配列には、ＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）の保存モチーフをコードする領域が含まれており、かつその領域の塩基配列がクリソウイルス科ウイルスと相同性を有する。従って、このマイコウイルスは、クリソウイルス科に分類される新種のウイルスであると推測する。
このMoCV3は、国際公開 WO/2009/093409号公報にて公開されたMoCV1と非常に類似しているものの、MoCV1と比較してイネいもち病菌の弱毒化能に優れている点で異なっている。また、MoCV3における五種類の二本鎖ＲＮＡのうち配列番号１〜４に示す四種類の二本鎖ＲＮＡは、MoCV1の四種類の二本鎖ＲＮＡに対してそれぞれ、８０．５％、７４．５％、７１．３％及び７２．５％の相同性を示した。すなわち、配列番号１〜４に示す四種類の二本鎖ＲＮＡに対してそれぞれ８１％、７５％、７２％及び７３％以上の相同性を有する塩基配列からなる四種類の二本鎖ＲＮＡを含むマイコウイルスは、新規なマイコウイルスとして本発明の技術的範囲に包含される。
また、本発明に係るマイコウイルスは、配列番号１〜５に示す塩基配列に対してそれぞれ例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９７％以上の相同性を有する五種類の二本鎖ＲＮＡを有し、イネいもち病菌等の植物病害真菌を弱毒化できるマイコウイルスであっても良い。ここで、「相同性」とは塩基配列が完全に一致していることを、「類似性」とは、アデニンとグアニンとを、又は、チミン（ウラシル）とシトシンとを置換することにより塩基配列が完全に一致することをいう。
なお、本発明に係るマイコウイルスは、このMoCV3に限定されず、MoCV3に対して人為的に或いは自然に変異が導入されたマイコウイルスも包含する。すなわち、本発明に係るマイコウイルスは、配列番号１〜５に示す塩基配列に対して１又は複数個（例えば２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２５個、もっとも好ましくは２〜１０個）の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列であって、イネいもち病菌等の植物病害真菌を弱毒化できる変異体であっても良い。
また、配列番号１乃至５に示す塩基配列には、それぞれタンパク質のコーディング領域が含まれている。配列番号１乃至５に含まれるコーディング領域によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６〜１０に示す。
本発明に係るマイコウイルスは、植物病害真菌の生育などを抑制する作用を有する。従って、例えば、このマイコウイルスを所定の植物病害真菌に感染などさせ、当該植物病害真菌に内在させることにより、当該植物病害真菌の弱毒菌株を作製することができる。
また、例えば、本発明に係るマイコウイルス、及び／又は、作製した植物病害真菌の弱毒菌株を含有する植物病害防除剤を、植物（イネなど）に付加（散布、塗布など）することにより、その植物病害を防除できる可能性がある。その他、本発明に係るマイコウイルスには、次のような特徴がある。従来、マイコウイルスは、菌糸融合により、宿主菌の細胞から細胞へ垂直伝播されるとされており、マイコウイルスの生活環の中に、宿主菌の細胞外に存在する段階は存在しないと考えられている。それに対し、本発明者らの研究により、本発明に係るマイコウイルスは細胞外にも存在しうることが分かった。
従って、菌糸融合に依存せずに細胞外から宿主菌に感染させることができるため、本発明に係るマイコウイルスを、接合型の異なる菌主・菌株間でも幅広く感染させることができ、かつ、宿主菌に対し高効率で感染させることができる。即ち、これにより、植物病害真菌の弱毒化や植物病害の防除を、簡易かつ高効率に行うことができる可能性が高い。
また、本発明に係るマイコウイルスは細胞外にも存在するため、例えば、宿主菌を液体培地で培養し、その培養上清からマイコウイルスを回収することにより、簡易かつ比較的大量にマイコウイルスを生産することができる。
本発明に係るマイコウイルスは、所定のイネいもち病菌に内在性に存在する場合、例えば、当該イネいもち病菌株から公知の手法により分離・回収することができる。なお、本発明に係るマイコウイルスを内在するイネいもち病菌は、通常のイネいもち病菌と同様の培地・培養条件で培養できる。
＜本発明に係る遺伝子、核酸、タンパク質などについて＞
本発明者らは、本発明に係るマイコウイルスの一つについてシークエンス解析を行い、全長の塩基配列を得た（配列番号１〜5）。従って、本発明は、そのマイコウイルス遺伝子、その塩基配列又はその一部を有する核酸、それらの塩基配列がコードするタンパク質などを全て包含する。
本発明は、また、それらの塩基配列の全部又は一部を有する核酸も全て包含する。核酸は、二本鎖・一本鎖のどちらでもよく、また、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡなどを全て包含する。
例えば、配列番号１〜５の全て又はいずれかの配列、該配列中、所定機能を有する特定部分の配列、それらと同等の塩基配列を有するｃＤＮＡ、それらと同等の塩基配列を組み込んだ組換えベクター（プラスミド、ウイルスなど）なども、本発明に包含される。
シークエンス解析の結果、配列番号１の配列部分にはＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）の保存モチーフが存在すること、及び、配列番号４の配列部分にはラ・フランス病ウイルスの二本鎖ＲＮＡ断片と相同性を有することが分かった。従って、目的・用途に応じ、例えば、所定機能を有する特定部分としてこれらの配列部分を少なくとも有する核酸、組換えベクターなどを作製し、用いてもよい。
なお、本発明に係る核酸（又は遺伝子）には、上記塩基配列と相同性を有する核酸、例えば、その塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イネいもち病菌抑制作用を有するものも広く包含される。ここで、ストリンジェントな条件は、二本鎖核酸のＴｍ値など、公知技術により取得できる。
本発明は、また、上述のマイコウイルス遺伝子及び核酸がコードする全てのタンパク質も包含する。本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６〜１０に示す。
それぞれ、配列番号６は配列番号１記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、配列番号7は配列番号２記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、配列番号８は配列番号３記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、配列番号９は配列番号４記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、配列番号１０は配列番号５記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列である。
なお、本発明に係るタンパク質は、配列番号６〜１０のいずれかのアミノ酸配列を有するもののほか、それらと相同性を有しかつその機能を保持しているものを全て包含する。
例えば、組換えベクターに上述の核酸を組み込み、その宿主に強制発現させることにより、それらのタンパク質を大量調製できる可能性がある。宿主には大腸菌類、酵母類、培養細胞など公知のものを利用可能であると考えられる。マイコウイルスが真菌に対して感染すること、酵母類が高増殖性を有しかつ利用も比較的簡便なことなどを考慮すると、宿主としては酵母類が最適である可能性がある。組換えベクターについても、公知のものを利用可能であると考える。
また、例えば、配列番号１〜５のいずれかを組み込んだベクターを複数用いて、その五種類の遺伝子の複数を共発現させることにより、マイコウイルスを再構成できる。その場合も、公知の宿主及び公知の組換えベクターを利用可能であり、複数のベクターを同時に導入できる点で、酵母類が最適な宿主となる。なお、配列番号１〜５に示す五種類の核酸断片は、マイコウイルスから抽出したdsRNAを鋳型としたRT-PCR法により取得することができる。また、配列番号１〜５に示す五種類の核酸断片は、その配列情報に基づいて全合成することもできる。言い換えると、本発明に係るマイコウイルス自体及び/又は当該マイコウイルスを内在するイネいもち病菌Ｓ−０４１２−II ２ａ株が寄託機関に寄託されていなくとも、当業者であれば上記組換えベクターを用いて当該マイコウイルスを製造することができる。
＜植物病害真菌弱毒菌株について＞
本発明に係る植物病害真菌弱毒菌株は、本発明に係るマイコウイルスを内在するものを全て包含する。即ち、例えば、そのマイコウイルスを既に内在するイネいもち病菌などの菌株、及び、そのマイコウイルスを感染させた植物病害真菌の菌株の両方を包含する。
植物病害真菌にマイコウイルスを感染などさせる手段として、例えば、従来通り、菌糸融合の際に宿主菌に感染させる方法がある。また、上述の通り、本発明に係るマイコウイルスは細胞外でも存在しうるため、例えば、細胞外から直接的に宿主菌に感染させることもできる。
この植物病害真菌弱毒菌株の例として、上述のＳ−０４１２−II ２ａ株が挙げられる。この菌株は、本発明に係るマイコウイルスが感染したイネいもち病菌の菌株である。従って、形態的性質、培養的性質、胞子形成、生理学的・化学分類学的性質は、基本的に公知のイネいもち病菌と同様である。但し、通常のイネいもち病菌よりも成長が遅く、菌糸が非同心円状に成長し、色素沈着も不均一である。また、気中菌糸の異常な発達が見られ、セクター形成や溶菌が観察される。
＜植物病害防除剤について＞
本発明に係る植物病害防除剤は、本発明に係るマイコウイルス又は本発明に係る植物病害真菌弱毒菌株のいずれか一方を少なくとも含有するものを全て包含する。また、そのマイコウイルスとその植物病害真菌弱毒菌株の両方を含有していてもよく、その他の成分を含有していてもよい。
その他の成分として、例えば、所定の担体、粘結剤、増粘剤、固着剤、防腐防かび剤、溶剤、安定化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、着色剤などを含有していてもよい。また、他の農薬成分、例えば、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺菌剤、抗ウイルス剤、誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤などを含有していてもよい。
担体としては、例えば、固体担体・液体担体のいずれかまたは両方を用いることができる。固体担体として、例えば、澱粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、魚粉、粉乳などの動植物性粉末、タルク、カオリン、ベントナイト、ゼオライト、珪藻土、ホワイトカーボン、クレー、アルミナ、炭酸カルシウム、塩化カリウム、硫安などの鉱物性粉末が挙げられる。液体担体として、例えば、水、イソプロピルアルコール、エチレングリコールなどのアルコール類、シクロヘキサノン、メチルエチルケトンなどのケトン類、プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテルなどのエーテル類、ケロシン、軽油などの脂肪族炭化水素類、キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、メチルナフタリン、ソルベントナフサなどの芳香族炭化水素類、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどのアミド類、脂肪酸のグリセリンエステルなどのエステル類、大豆油、ナタネ油などの植物油が挙げられる。
粘結剤、増粘剤、固着剤として、例えば、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
本防除剤の剤型は、特に限定されない。例えば、乳剤、懸濁剤、粉剤、粒剤、錠剤、水和剤、水溶剤、液剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、エアゾール剤、ペースト剤、油剤、乳濁剤などの形態を適用できる。
＜植物病害真菌抑制性マイコウイルス生産方法について＞
本発明に係る植物病害真菌抑制性マイコウイルス生産方法は、マイコウイルスを含有する植物病害真菌を液体培地などで培養し、その培養上清からマイコウイルスを回収する手順を少なくとも含むものを全て包含する。
上述の通り、本発明に係るマイコウイルスは、宿主菌の細胞外にも存在しうる。従って、例えば、マイコウイルスが感染した植物病害真菌を液体培地などで培養し、遠心分離により菌体を分離した後、その培養上清からウイルスを分離・回収することにより、簡易かつ比較的大量にウイルスを回収できる。
但し、本発明に係るマイコウイルスは、この生産方法により得られたものに狭く限定されない。即ち、例えば、マイコウイルスを内在するイネいもち病菌から分離・回収して取得したものも、本発明に広く包含される。
一方、本発明に係る植物病害真菌抑制性マイコウイルス生産方法としては、上述したように、配列番号１〜５のいずれかの核酸断片を組み込んだベクターを複数用いて、その五種類の遺伝子の複数を宿主細胞内において共発現させ、当該宿主細胞内に再構築したマイコウイルスを回収する方法も含まれる。宿主細胞としては酵母を使用することができる。上記五種類の遺伝子を組み込むためのベクターとしては、組み込んだ遺伝子を宿主細胞内で発現させることができるものであれば特に限定されず、如何なるベクターを使用してよい。また、ベクターに組み込む核酸断片は、配列番号１〜５に示す塩基配列に基づいて全合成することができる。
＜植物病害真菌弱毒化方法について＞
上述の通り、例えば、本発明に係るマイコウイルスを特定の植物病害真菌に感染などさせることにより、その宿主菌の生育などを抑制し、その菌を弱毒化させることができる。マイコウイルスの感染手段については、上述と同様の方法を採用できる。
＜植物病害防除方法について＞
本発明に係る植物病害防除方法は、上述のイネいもち病防除剤を特定の植物（イネなど）に付加する工程を少なくとも含むものを全て包含する。
植物に防除剤を付加させる手段として、例えば、防除剤を葉の表面又は裏面に塗布する方法、所定の担体などを用いて防除剤を葉の表面又は裏面に付着させる方法、防除剤を葉に散布又は供給する方法などが挙げられる。
防除剤の塗布量又は散布量は、有効成分の濃度、製剤の形態、対象病害や作物の種類、病害による被害の程度、施用場所、施用方法、施用時期、混用・併用する薬剤や肥料などの使用量、種類などの種々の条件に応じて、適宜選択すればよい。
例えば、１×１０３〜１×１０１０個／ｍＬに調整したイネいもち病菌弱毒菌株の分生子含有液を一葉当たり１〜１，０００ｍＬ噴霧又は供給することにより、また、葉１ｍｍ２当たり１×１０３〜１×１０１０個、イネいもち病菌弱毒菌株の分生子を葉表面又は裏面に塗布する又は付着させることにより、植物病害を抑制できる可能性がある。
また、培養上清中に存在するMoCV3を適度に希釈したウイルス溶液（原液の１０倍〜１００倍程度）、または、イネいもち病菌Ｓ−０４１２−II ２ａ株の菌体から抽出したMoCV3ウイルス粒子成分を適度に希釈して、イネ葉に直接散布を施すことにより、イネいもち病菌に対する防除効果、または治癒効果によるイネいもち病菌の防除法が可能となる。実際の防除価として、MoCV3をウイルス散布剤として用いた際には、63.6以上の防除価の結果が得られており、国際公開 WO/2009/093409号公報にて公開されたMoCV1の防除価である56.8以上に優る結果を得ることができる
本発明は、真菌を主な病因とする全ての植物病害に適用できる可能性がある。適用可能性のある植物病害として、例えば、以下のものが挙げられる（それらに限定されない）。
イネ科植物に対する植物病害として、例えば、イネいもち病（原因菌「Magnaporthe oryzae」）、イネごま葉枯病（原因菌「Cochliobolus miyabeanus」）、紋枯病（原因菌「Thanatephorus cucumeris」）、ばか苗（原因菌「Gibberella fujikuroi」）、苗立枯病（原因菌「Fusarium菌」、「Rhizopus菌」、「Pythium菌」、「Trichoderma viride」）、イネこうじ病（原因菌「Claviceps virens」）、ムギ類の赤かび病（原因菌「Gibberella zeae」、「Fusarium avenaceum」、「Fusarium culmorum」、「Monographella nivale」）、雪腐病（原因菌「Pythium菌」、「Typhula菌」、「Monographella nivalis」、「Myriosclerotinia borealis」）、裸黒穂病（原因菌「Ustilago nuda」）、なまぐさ黒穂病（原因菌「Tilletia controversa」）、眼紋病（原因菌「Pseudocercosporella herpotrichoides」）、葉枯病（原因菌「Septoria tritici」）、ふ枯病（原因菌「Phaeosphaeria nodorum」）、うどんこ病（原因菌「Blumeria graminis」）。
その他の植物病害として、例えば、カンキツ類の黒点病（原因菌「Diaporthe citri」）、小黒点病（原因菌「Diaporthe medusa、Alternaria citri」）、そうか病（原因菌「Elsinoe fawcettii」）、褐色腐敗病（原因菌「Phytophthora citrophthra」）、緑かび病（原因菌「Penicillium digitatum」）、青かび病（原因菌「Penicillium italicum」）、リンゴのモニリア病（原因菌「Monilinia mali」）、黒星病（原因菌「Venturia inaequalis」）、斑点落葉病（原因菌「Alternaria mali」）、黒点病（原因菌「Mycosphaerella pomi」）、すす斑病（原因菌「Gloeodes pomigena」）、すす点病（原因菌「Zygophiala jamaicensis」）、輪紋病（原因菌「Botryosphaeria berengeriana」）、褐斑病（原因菌「Diplocarpon mali」）、赤星病（原因菌「Gymnosporangium yamadae」）、腐らん病（原因菌「Valsa ceratosperma」）、ナシの黒星病（原因菌「Venturia nashicola」）、赤星病（原因菌「Gymnosporangium asiaticum」）、輪紋病（原因菌「Botryosphaeria berengeriana」）、胴枯病（原因菌「Phomopsis fukushii」）、モモの縮葉病（原因菌「Taphrina deformans」）、灰星病（原因菌「Monilinia fructicola、Monilinia fructigena」）、黒星病（原因菌「Cladosporium carpophilum」）、ホモプシス腐敗病（原因菌「Phomopsis sp.」）、オウトウの灰星病（原因菌「Monilinia fructicola」、「Monilinia fructigena」）、幼果菌核病（原因菌「Monilinia kusanoi」）、ウメの黒星病（原因菌「Cladosporium carpophilum」）、ブドウの黒とう病（原因菌「Elsinoe ampelina」）、晩腐病（原因菌「Colletotrichum acutatum」、「Glomerella cingulata」）、褐斑病（原因菌「Pseudocercospora vitis」）、つる割病（原因菌「Phomopsis viticola」）、カキの角斑落葉病（原因菌「Cercospora kaki」）、円星落葉病（原因菌「Mycosphaerella nawae」）、茶の輪斑病（原因菌「Pestalotiopsis longiseta」、「Pestalotiopsis theae」）、褐色円星病（原因菌「Pseudocercospora ocellata」、「Cercospora chaae」）、もち病（原因菌「Exobasidium vexans」）、網もち病（原因菌「Exobasidium reticulatum」）、ウリ類のつる枯病（原因菌「Mycosphaerella melonis」）、つる割病（原因菌「Fusarium oxysporum」）、黒星病（原因菌「Cladosporium cucumerinum」）、褐斑病（原因菌「Corynespora cassiicola」）、トマトの葉かび病（原因菌「Fulvia fulva」）、輪紋病（原因菌「Alternaria solani」）、ナスの褐紋病（原因菌「Phomopsis vexans」）、すすかび病（原因菌「Mycovellosiella nattrassii」）、アブラナ科野菜の白さび病（原因菌「Albugo macrospora」）、白斑病（原因菌「Cercosporella brassicae」、「Pseudocercosporella capsellae」）、タマネギの灰色腐敗病（原因菌「Botrytis allii」）、イチゴの蛇の目病（原因菌「Mycosphaerella fragariae」）、ジャガイモの夏疫病（原因菌「Alternaria solani」）、ダイズの茎疫病（原因菌「Phytophthora sojae」）、紫斑病（原因菌「Cercospora kikuchii」）、アズキの茎疫病（原因菌「Phytophthora vignae」）、ラッカセイの褐斑病（原因菌「Mycosphaerella arachidis」）、テンサイの褐斑病（原因菌「Cercospora beticola」）、葉腐病（原因菌「Thanatephorus cucumeris」）、シバのカーブラリア葉枯病（原因菌「Curvularia菌」）、ダラースポット病（原因菌「Sclerotinia homoeocarpa」）、ヘルミントスポリウム葉枯病（原因菌「Cochliobolus菌」）、バラの黒星病（原因菌「Diplocarpon rosae」）、キクの白さび病（原因菌「Puccinia horiana」）、各種作物のべと病（原因菌「Peronospora菌」、「Pseudoperonospora菌」、「Plasmopara菌」、「Bremia菌」）、疫病（原因菌「Phytophthora菌」）、うどんこ病（原因菌「Erysiphe菌」、「Blumeria菌」、「Sphaerotheca菌」、「Podosphaerea菌」、「Phyllactinia菌」、「Uncinula菌」、Oidiopsis菌」）、さび病（原因菌「Puccinia菌」、「Uromyces菌」、「Physopella菌」)、黒斑病（原因菌「Alternaria菌」）、灰色かび病（原因菌「Botrytis cinerea」）、菌核病（原因菌「Sclerotinia sclerotiorum」）、白紋羽病（原因菌「Rosellinia necatrix」）、紫紋羽病（原因菌「Helicobasidium mompa」）、白絹病（原因菌「Sclerotium rolfsii」）、その他各種土壌病害（原因菌「Fusarium菌」、「Rhizoctonia菌」、「Pythium菌」、「Aphanomyces菌」、「Phoma菌」、「Verticillium菌」、「Plasmodiophora brassicaeなど」）。
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、国際公開 WO/2009/093409号公報にて公開された手法に準じて、新規なマイコウイルスが内在するイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株を単離同定した。具体的に、本実施例で単離同定したイネいもち病菌Ｓ−０４１２−II ２ａ株と、国際公開 WO/2009/093409号公報にて同定されたマイコウイルスが内在するイネいもち病菌Ｓ−０４１２−II １ａ株とをそれぞれ培養してコロニーを観察した。これらイネいもち病菌の培養にはＰＤＡ培地を使用した。結果を図１に示す。
図１に示すように、本実施例で同定したイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株は、白くアルビノ化した菌叢を示し、生育阻害が観察された。また分生子形成も全く観察されなかった。また、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株は、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II １ａ株と異なり、PDA培地上で色素沈着（メラニン化）が起きない、気中菌糸の生育阻害、ウェット化など、異常な生育不良を示すといった特徴的なコロニーを形成した。
また、これらイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株及びイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II １ａ株のウイルス治癒株を作製して、同様にコロニー観察を行った。結果を図２に示す。なお、ウイルスの治癒方法は、国際公開 WO/2009/093409号公報にて公開された手法に準じて行った。図２に示すように、両菌株ともウイルス治癒によって、通常のいもち病菌と同様なコロニーを形成した。
さらに、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株及びイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II １ａ株並びにこれらのウイルス治癒株について生育速度を比較した。比較の方法として、培地の中心から菌糸の先端までの距離の測定を行なった。なお、全ての菌株の生育条件は、PDA培地を使用し、明期を12時間及び暗期を12時間とするサイクルとし、培養日数を9日間とした。結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。図３Ａはイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株及びそのウイルス治癒株についての測定結果である。図３Ｂはイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II １ａ株及びそのウイルス治癒株についての測定結果である。図３Ａ及び３Ｂに示すように、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II １ａ株についてはウイルス治癒によっても生育速度に有意な差が見られなかったが、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株では生育速度に有意な差が存在し、ウイルス感染株の生育速度が低下していることが分かった。
これら図１及び図２の結果から、両菌株ともマイコウイルスを内在することによって生育抑制されていることが明らかとなった。また、図３に示すように、本実施例では、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株に内在するマイコウイルスは、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II １ａ株に内在するマイコウイルス（MoCV1）と比較すると、イネいもち病菌に対してより強力な生育抑制能を有することが示された。
本実施例で単離同定されたイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株に内在するマイコウイルスをMoCV3と命名した。このMoCV3は、イネいもち病菌の強力な生育抑制因子（弱毒化因子）と結論付けた。
〔実施例２〕
本実施例では、実施例１で単離同定したイネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株に内在するMoCV3が菌体外にも存在するかどうかを調べた。
実施例１において２．８〜３．６ｋｂに５成分の内在性二本鎖ＲＮＡのバンドを検出した菌株のうち、３株を液体培地に移植・培養した後、培養液を遠心し、その培養上清を回収した。次に、得られた培養上清を１％アガロースゲルで、２０Ｖ、１８時間、電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、これらの菌株の培養上清中にも、菌内在性二本鎖ＲＮＡと同じ位置に、二本鎖ＲＮＡのバンドを検出した。この結果は、本発明に係るマイコウイルスが、イネいもち病菌の菌体内だけでなく、菌体外にも存在することを示している。
〔実施例３〕
本実施例では、菌体外に存在するマイコウイルスMoCV3に、正常の菌株（マイコウイルスを保持しない菌株）に対する感染能力があるかどうかについて調べた。
まず、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株を液体培地に移植し、４週間培養した後、培養液を遠心し、その培養上清を回収した。この培養上清について、実施例２と同様の手順で、１％アガロースゲルで電気泳動した結果、二本鎖ＲＮＡのバンドを確認できた。得られた培養上清については、０．２２μＬのフィルターを用いてろ過滅菌を行った。
次に、１００ｍｌコルベンにＹＧ培地５０ｍｌを入れ、そこにイネいもち病菌の正常菌株（マイコウイルスを保持しない菌株）を接種し、３日間培養した後、得られた培養上清を５００μＬ添加し、菌体の生育を観察した。
その結果、観察３日目において、培養上清を添加していない菌株では、菌糸の先端がまっすぐに伸び、正常の生育を示したのに対し、培養上清を添加した菌株では、菌糸の先端があまり伸びずに絡まった状態になった。
この結果は、培養上清中に存在するマイコウイルスがイネいもち病菌正常菌株に感染し、その生育を抑制したためであると考える。即ち、本実験結果は、菌体外に存在するマイコウイルスに、正常の菌株に対する感染能力があることを示している。
〔実施例４〕
本実施例では、マイコウイルスが感染したイネいもち病菌株について、その分生子数を測定した。
イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株をＹＧプレートに移植し、２週間培養した後、直径４ｍｍのコルクボーラーで菌体を抜き取り、採取した。次に、１．５ｍｌチューブに、５％グリセロールを入れ、採取した菌体を入れ、５分間混和・懸濁した。そして、血球計算盤を用いて、懸濁液中に存在する分生子数を計測した。
その結果、イネいもち病菌の正常菌株（コントロール、マイコウイルスを保持しない菌株）では分生子数が３３×１０４個／ｍＬであったのに対し、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株では分生子数が１×１０４個／ｍＬ以下であった。
この結果は、本発明に係るマイコウイルスが、宿主菌の分生子形成を抑制することを示す。即ち、MoCV3が、植物病害菌の増殖を抑制するとともに、その伝播・感染拡大なども抑制できることを示している。
〔実施例５〕
本実施例では、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株から抽出された二本鎖ＲＮＡの塩基配列を解析した。イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株からの二本鎖ＲＮＡの抽出・精製、得られた二本鎖ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成、続いて５’ＲＡＣＥ法による両末端配列の解析は、国際公開 WO/2009/093409号公報にて公開された手法に準じて行った。
その結果、MoCV3には五種類の二本鎖ＲＮＡが含まれていることが明らかとなった。これら五種類の二本鎖ＲＮＡの塩基配列を配列番号１〜5に示した。なお、二本鎖ＲＮＡをｃＤＮＡに置換してシークエンス測定を行っているため、配列表では「ウラシル」が「チミン」に置換されている。
なお、得られた塩基配列について解析を行った結果、配列番号１に示すＲＮＡ配列には、トチウイルス及びその近縁ウイルスなどに存在するＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）の保存モチーフが含まれていた。また、配列番号４に示すＲＮＡ配列には、ラ・フランス病ウイルスのＬ３二本鎖ＲＮＡ断片と相同性を有する領域が含まれていた。
この結果は、本発明に係る五種類の二本鎖ＲＮＡが、新規マイコウイルスの遺伝子情報であることを示している。
〔実施例６〕
本実施例では、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株が植物病害真菌の防除に有効であるかどうかを、噴霧接種法で検討した。
イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株をオートミール培地プレートに接種し、２５℃の室内で培養した。接種後１５日目に分生子が充分できていない場合は、プレートに滅菌蒸留水を２ｍＬ程度注ぎ、筆で培地表面をこすって気菌糸を取り除き、このプレートを３日間ブラックライト下に置いて分生子形成を誘導し、滅菌蒸留水を１ｍＬ程度注ぎ、再び筆で培地表面をこすって気菌糸ごと分生子を回収し、分生子含有液を得た。接種後１５日目に分生子が充分できている場合は、プレートに滅菌蒸留水を２ｍＬ程度注ぎ、筆で培地表面をこすって気菌糸ごと分生子を回収し、分生子含有液を得た。また、対照として、イネいもち病菌のマイコウイルス完全治癒株を実施例１と同様の手順で作製し、その菌から同様の手順で分生子含有液を得た。
次に、それらの分生子含有液をキムワイプ又はガーゼでろ過し、分生子濃度を２×１０６個／ｍＬに調整し、０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を加え、分生子懸濁液とした。
次に、イネ苗（いもち病真性抵抗性遺伝子型と菌のレースを考慮して適宜選択した品種、播種後２〜３週間目のもの）に、ノズルを用いて分生子懸濁液をまんべんなく噴霧し、植物体を２６℃、相対湿度１００％の接種箱で２４時間静置した後、ポットを温室に移して室温を２３〜３０℃に維持し、噴霧接種後７日間培養した。そして、噴霧接種後７日目に一定葉面積あたりの３〜４ｍｍとなった罹病性病斑の数を計測した。
結果を図４に示す。図４は、イネいもち病菌を接種した葉における病斑数を示すグラフである。図中、縦軸はイネいもち病菌を接種した葉における病斑数を表す。図中、「混合感染株」は本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合の病斑数を、「完全治癒株」はイネいもち病菌のマイコウイルス完全治癒株から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合の病斑数（対照）を、それぞれ表す。
図４に示す通り、本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合、対照と比較し、病斑数が顕著に減少した。この結果は、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株が植物病害真菌の防除に有効であることを示している。
〔実施例７〕
本実姉例では、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株が植物病害真菌の防除に有効であるかどうかを、パンチ付傷接種法で検討した。
実施例６と同様の手順で分生子懸濁液を調製し、３％素寒天膜に同液を付着させ，寒天膜を約２ｍｍ角に切り取り、寒天片を作製した。２３〜３０℃の温室で栽培したイネの第４葉を接種用パンチではさみ、浸潤状の傷をつけ、その付傷部分に寒天片を乗せ、植物体を２６℃、相対湿度１００％の接種箱で２４時間静置した後、ポットを温室に移して室温を２３〜３０℃に維持し、接種後１４日間培養した。そして、接種後１４日目に病斑の大きさを計測した。
その結果、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株から調製した分生子懸濁液を接種した場合、対照と比較し、病斑の大きさが顕著に小さかった。この結果は、実施例６と同様、本発明が植物病害真菌の防除に有効であることを示している。
〔実施例８〕
本実施例では、菌体外に存在したMoCV3粒子を電子顕微鏡により同定した。それに先立って、に開示された手法と同様にMoCV3のウイルス粒子について、生化学的特性の解析を行った。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてウイルスタンパク質の主な成分（外皮タンパク質）の分子量が約７０ｋＤａのサイズであることが明らかとなった。すなわち、MoCV3粒子の存在を確認できた。
電子顕微鏡観察では、先ず、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株を、ＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ０．５％、グルコース２％）中で培養し、その培養上清からウイルス粒子を単離した。その培養上清を遠心（１０，０００×ｇ、５分間）し、その上清を超遠心（１００，０００×ｇ、３０分間）し、ウイルス粒子を含む沈殿物を得た。その沈殿物を０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解し、リンタングステン酸又は酢酸ウランを用いてネガティブ染色し、電子顕微鏡（倍率：×２０，０００〜４０，０００）で観察した。
結果を図５に示す。図５は、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株の培養上清から得られたウイルス粒子の電子顕微鏡写真である。図５に示す通り、電子顕微鏡により、本発明に係るマイコウイルスのウイルス粒子を同定できた。このウイルス粒子は、約３０〜４０ｎｍの正６角形様であり、エンベロープ様の構造に包まれていた。
〔実施例９〕
本実施例では、単離されたMoCV3を直接イネ葉に散布剤として、イネいもち病菌に対する防除効果と治癒効果について検討を行った。
具体的には、培養上清中に存在するMoCV3を適度に希釈したウイルス溶液（原液の１０倍〜１００倍程度）をウイルス噴霧液として準備した。次に、発芽から2週間〜3週間を経過したイネ苗に、希釈した培養上清由来ウイルス溶液を噴霧した後、次にイネいもち病菌を感染させ、そして、各試験区について防除価を算出した。防除価は、特定防除資材（特定農薬）指定のための評価に関する指針に従い、防除価＝１００−（処理区の被害／無処理区の被害）×１００として算出した。
その結果、MoCV3をウイルス散布剤として用いた際には、63.6以上の防除価の結果が得られた。また、同様な方法により、国際公開 WO/2009/093409号公報にて開示されたMoCV1の防除価を算出したところ56.8であった。この結果から、イネいもち病菌株Ｓ−０４１２−II ２ａ株に内在するMoCV3は、従来公知のマイコウイルスと比較してイネいもち病菌に対する防除効果、または治癒効果によるイネいもち病菌の防除効果が極めて優れることが明らかとなった。
〔実施例１０〕
本実施例では、酵母細胞内におけるMoCV3ウイルス粒子の再構築を検討した。すなわち、MoCV3ウイルスをパン酵母(Saccharomyces cerevisiae)の細胞内で再構築させるため、MoCV3が有する５つのdsRNAゲノムを鋳型とした完全長ｃDNAクローンを作製し、5種類のマーカー遺伝子を有するシャトルベクター（以下参照）にそれぞれ連結させ、パン酵母細胞内でMoCV3遺伝子産物を発現させて、MoCV3ウイルス粒子の再構築を行った。
＜酵母遺伝子発現用シャトルベクターの構築＞
基本ベクターとなるpRS313、pRS314、pRS315、pRS316はナショナルバイオリソース(http://yeast.lab.nig.ac.jp/nig/index.html)より、pRS317、pRS412、pRS423、pRS424、pRS425、pRS426をATCC(http://www.atcc.org/)より購入した。
ADH1(Alcohol dehydrogenase 1)カセット（ADH1プロモーター＋MCS＋ADH1ターミネーター）はpAUR123（TaKaRa Bio社製）よりBamHIを用いて切り出し、pUC19へサブクローニングした。TDH3(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)カセットを構築するため、ますパン酵母株W303-1A(Mat a ura3 leu2 his3 trp1 ade2 can1)のゲノムDNAを鋳型としたPCRにより、TDH3上流600bpの3’側にMCS(Malti Cloning Site)の半分を付加した増幅産物、及びTDH3下流350bpの5’側にMCSの残り半分を付加した増幅産物をサブクローニングした。得られた2つのコンストラクトをTDH3上流600bp＋MCS＋TDH3下流350bpとなるように連結し、TDH3カセットとした。
上記基本ベクターのMCSを除去し、その部位に新たにADH1カセット又はTDH3カセットを挿入した。ADH1を挿入したpRS313、pRS314、pRS315、pRS316及びpRS317をそれぞれpRSA313、pRSA314、pRSA315、pRSA316及びpRSA317とした。TDH3を挿入したpRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS317、pRS423、pRS424、pRS425及びpRS426をそれぞれpRST313、pRST314、pRST315、pRST316、pRST317、pRST423、pRST424、pRST425及びpRST426とした。
＜MoCV3由来遺伝子(dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及びdsRNA5)を発現するシャトルベクターコンストラクトの作製＞
MoCV3全長cDNAクローンdsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及びdsRNA5を鋳型とし、全長配列をPCRにより増幅した。得られたDNA断片をpUC19にサブクローニング後、シークエンス解析を行い、正確なクローンを選抜した（図６）。得られたクローンより目的領域を制限酵素により切り出し、精製、上述したシャトルベクターへ挿入した。最後に、挿入配列及びその周辺配列に変化がないかシークエンスにより確認した。
＜MoCV3全長cDNAの作製＞
＜dsRNA1＞
native PAGEにより成分ごとに分離したdsRNA1又は精製MoCV3 dsRNAを鋳型としたRT-PCRを行い、全長のDNA断片を得た。蒸留水に溶解した鋳型2本鎖RNA（約50ng-100ng）にdsRNA1特異的プライマー（MoCV3-cDNA-dsRNA1-5end-SmaI及びMoCV3-cDNA-dsRNA1-3end-XbaI）を各20pmol加え、98℃で5分間インキュベートした後、氷上で3分間急冷した。その後、40μlの反応系で１×first strand synthesis buffer（invitrogen社製）、1 mMのCH3HgOH、10 mMのDDT、1 mMのdNTPmix、40UのRNase OUT Recombinant（invitrogen社製）、200UのSuper Script III逆転写酵素の条件で、42℃で30分間、その後70℃で15分間インキュベートした後、5UのRNase Hを添加した。37℃で10分間、その後70℃で15分間インキュベートした後、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製)を用いてcDNAを精製・濃縮した。このcDNA溶液を鋳型とし、PCRには2UのPfu-x (Greiner社製)とその添付バッファー、リン酸化プライマー（MoCV3-cDNA-dsRNA1-5end-SmaI： GCC CCG GGG CAA AAA AGA GAA TAA AGC TTT CTC C（配列番号１１）及びMoCV3-cDNA-dsRNA1-3end-XbaI： GTT CTA GAG GTA CTT ACA CCT CAC AGC GTA AGA A（配列番号１２））を用いた。反応条件を95℃で2分の後、95℃で30秒、55℃で30秒及び68℃で3分30秒を１サイクルとして30サイクル行い、その後68℃で7分とした。アガロースゲル電気泳動後、目的cDNA増幅断片をゲルから抽出・精製し、DNA Ligation kit Ver.2.1 (TaKaRa Bio社製)を用い、プラスミドベクターpUC19 DNA SmaI（MBI Fermentas社製）へ組み込んだ。青白選抜で得られたクローンの挿入断片の全長配列をシークエンスにより取得し、MoCV3 dsRNA 1の配列と完全一致するクローンを選択した。
＜dsRNA2＞
dsRNA2特異的プライマー(MoCV3-cDNA-dsRNA2-5end-SacI： GCG AGC TCG CAA AAA AGA GAA TAA AGC ATT CCC T（配列番号１３）及びMoCV3-cDNA-dsRNA2-3end-Hpa1：GTG TTA ACG GTA CTT ACG TTG TCA CGT AAG AAG T（配列番号１４））を用い、dsRNA1の全長cDNA作製と同様の手法でMoCV13dsRNA 4の配列と完全一致するクローンを得た。
＜dsRNA3＞
dsRNA3特異的プライマー（MoCV3-cDNA-dsRNA3-5end-Sal1：GCG TCG ACG CAA AAA AGA GAA TAA AGC TTT CTC C（配列番号１５）及びMoCV3-cDNA-dsRNA3-3end-Xba1：GTT CTA GAG GTA CTT GTT GGG ACC CTA CGT CCG A（配列番号１６））を用い、dsRNA1の全長cDNA作製と同様の手法でMoCV13dsRNA 4の配列と完全一致するクローンを得た。
＜dsRNA4＞
dsRNA4特異的プライマー（MoCV3-cDNA-dsRNA4-5end-Sal1：GCG TCG ACG CAA AAA AGA GAA TAA AGC TTT CTC C（配列番号１７）及びMoCV3-cDNA-dsRNA4-3end-Xba1：GTT CTA GAG GTA CTT GTT GAA GCC CCA TGC TCA A（配列番号１８））を用い、dsRNA1の全長cDNA作製と同様の手法でMoCV13dsRNA 4の配列と完全一致するクローンを得た。
＜dsRNA5＞
dsRNA5特異的プライマー（MoCV3-cDNA-dsRNA5-5end-Sma1：GCC CCG GGG CAA AAA AGA GAA TAA AGC ATT CTC C（配列番号１９）及びMoCV3-cDNA-dsRNA5-3end-Xba1：GTT CTA GAG GTA CTT ACG TCA TCA CGT AAG AAG T（配列番号２０））を用い、dsRNA1の全長cDNA作製と同様の手法でMoCV13dsRNA 5の配列と完全一致するクローンを得た。
＜酵母へのプラスミドDNA形質転換＞
＜酢酸リチウム法＞
酢酸リチウム法による形質転換は以下のように行った。先ず、酵母を5mlの液体培地に植菌し、30℃で10〜16時間前培養した。培養後、吸光度（OD600）を測定し、OD600=0.1〜0.2となるように50mlの液体培地に植菌した。30℃、100 rpmでOD600=0.8となるまで培養し、遠心分離により細胞を回収してから蒸留水で懸濁して洗浄した。沈殿した細胞をSol A（0.1M Lithium acetate、10 mM Tris-HCl pH 7.8、1 mM EDTA）にて懸濁して遠心分離し、沈殿物に再びSol Aを加えて懸濁して酵母溶液とした。これを30℃で50分間インキュベートした後、熱処理したssDNA（1mg/ml、鮭精巣由来）10μl、酵母溶液50μl、シャトルベクター10μl、Sol A 20μl、50%ポリエチレングリセロール750μlの順に加えた後、30℃で30分間、その後42℃で15分間インキュベートした。遠心分離後、沈殿物に蒸留水を加えてSC寒天平板培地（シャトルベクターの選択マーカーに合わせてドロップアウト培地を選択する）に塗布し、30℃で培養した。
＜スフェロプラスト法＞
スフェロプラスト法による形質転換は以下のように行った。先ず、上述した酢酸リチウム法と同様に酵母細胞を培養・回収し、1.2Mのソルビトール溶液にて細胞を懸濁、遠心分離（2500rpm、5分）により細胞を回収した。沈殿した細胞を再び1.2 Mのソルビトール溶液にて懸濁し、Zymorase（20T、1/10量l）を添加した。30℃で大多数の細胞がスフェロプラスト化するまでインキュベートした。1.2 Mのソルビトール溶液にて細胞を3回洗浄し、STC溶液に懸濁した。このスフェロプラスト懸濁液100μlに対し、プラスミド溶液23μulと熱処理したssDNA（1 mg/ml、鮭精巣由来）1μl、PEG溶液4mlを加え、優しく混和した。10分間の静置後、遠心分離（1200rpm、5分）によりスフェロプラストを沈殿させ、SOS溶液150μlに懸濁した。30℃で1時間培養した後、5mlのSDソルビトール・低融点アガロース溶液と混和し、SDソルビトールプレートに塗布した。
＜エレクトロポレーション法＞
エレクトロポレーション法による形質転換は以下のように行った。先ず、酢酸リチウム法と同様に酵母細胞を培養・回収し、遠心分離により細胞を回収してから蒸留水で懸濁して洗浄した。12.5 mlのLiAC/DTT/TE溶液に懸濁し、室温で1時間静置した後、遠心分離（6,000rpm、5分）により細胞を沈殿させた。この沈殿を12.5mlの氷冷水で懸濁し、2回洗浄した。細胞を1Mのソルビトール溶液5mlに懸濁し、遠心分離（6,000 rpm、5分）により細胞を沈殿させた。この沈殿を1Mのソルビトール溶液50μlに懸濁し、細胞懸濁液とした。細胞懸濁液70μlに対し、プラスミド溶液5μlを加え、5分間氷上で静置した。これを0.2 cmキュベットにアプライし、1.5 kV、25μFD、200 ohmsでエレクトロポレーションを行った。直ちに1Mのソルビトール溶液1mlを添加し、1Mのソルビトールプレート培地に塗布した。
＜MoCV3 dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及びdsRNA5-導入による酵母内MoCV3再構築＞
MoCV3 dsRNA1〜5を発現すべくpRSAA313-dsRNA1、pRSA314-dsRNA2、pRSA315-dsRNA3、pRSA316-dsRNA4及びpRSA317-dsRNA5を作製するために、上記の方法で作製したdsRNA1からdsRNA5までの完全長ｃDNAクローンをそれぞれ、pRSA313、pRSA314、pRSA315、pRSA316、pRSA317の制限酵素サイトにライゲーションさせたシャトルベクターを構築した（図７及び８）。dsRNA1のｃDNA完全長をpRSA313にライゲーションさせる際には制限酵素サイトSmaIとXbaIを利用し（図７a）、dsRNA2の完全長ｃDNAをpRSA314にライゲーションさせる際には制限酵素サイトSacIとHpaIサイトを利用し（図７b）、dsRNA3の完全長ｃDNAをpRSA315にライゲーションさせる際には制限酵素サイトSalIとXbaIを利用し（図７c）、dsRNA4の完全長ｃDNAをpRSA316にライゲーションさせる際には制限酵素サイトSalIとXbaIを利用し（図８a）、dsRNA5の完全長ｃDNAをpRSA317にライゲーションさせる際には制限酵素サイトSmaIとXbaIを利用した（図８b）。ライゲーションにより得られた各dsRNA1からdsRNA5の遺伝子を発現するシャトルベクターは酢酸リチウム法を用いてパン酵母YPH499株(Mat a ura3 lys2 ade2 leu2 his3 trp1)に導入した。
得られた形質転換コロニーを微生物培養装置にて培養し、ウイルス様粒子の精製を試みた。フレンチプレスを用いて酵母細胞を破砕後、MoCV3ウイルス粒子精製法と同様の方法で精製を行い、ショ糖濃度勾配遠心により分画を行った。得られた分画に対して、抗MoCV3抗血清を用いたウエスタン解析を行った（図９a）。その結果、MoCV3 dsRNA1-5導入酵母サンプルのショ糖濃度24 %付近にMoCV3タンパク質由来と考えられるシグナルが検出された。電子顕微鏡観察を行ったところMoCV3ウイルス様粒子が観察された（図９ｂ）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 五種類の二本鎖ＲＮＡを有し、当該五種類の二本鎖ＲＮＡがそれぞれ配列番号６〜１０に示すアミノ酸配列をコードすることを特徴とするマイコウイルス。
  2. 当該五種類の二本鎖ＲＮＡがそれぞれ配列番号１〜５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載のマイコウイルス。
  3. 請求項１又は２記載のマイコウイルスが宿主に感染した植物病害真菌。
  4. 上記宿主がイネいもち病菌であることを特徴とする請求項３記載の植物病害真菌。
  5. 請求項１又は２記載のマイコウイルス若しくは請求項３又は４記載の植物病害真菌を含む植物病害防除剤。
  6. 請求項５記載の植物病害防除剤を植物に接触させる工程を含む植物病害真菌防除方法。
  7. 請求項１又は２記載のマイコウイルスを植物病害真菌に感染させる工程を含む植物病害真菌弱毒化方法。
  8. 上記植物病害真菌がイネいもち病菌であることを特徴とする請求項７記載の植物病害真菌弱毒化方法。
  9. 配列番号６〜１０に示すアミノ酸配列から選ばれる１つのアミノ酸配列をコードする又は配列番号１〜５に示す塩基配列から選ばれる１つの塩基配列を有する核酸。
  10. 請求項９の核酸を有する発現ベクター。
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