CN115161255B - 一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物保护技术领域，公开了一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法及其应用。本方法通过提供特定的诱导培养基及特定的诱导方法在苹果黑星菌分生孢子诱导中的应用。本发明所用的诱导方法能够有效解决分离纯化到的苹果黑星菌在转接2‑3次后，难以再次诱导获得苹果黑星菌的分生孢子的技术问题。本发明方法简便、快速、无污染，可用于苹果黑星病的相关防治研究，对于苹果黑星病品种对于外来苹果黑星菌入侵的风险，从而为苹果育种和病害防控提供科学依据。

Description

一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及一种苹果黑星菌研究的技术领域，更具体的涉及一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法及其应用的技术领域。
背景技术
苹果黑星病是苹果上的一种重要病害，1947年冬季(Cass Smith etal.1948)在美国首次大发生，该病害主要危害叶片和果实，导致叶片早期脱落，果实开裂畸形，失去商品价值，并影响来年果树的生长势。苹果黑星病造成的损失几乎占苹果病虫害损失的一半左右，减产约为5％-15％。据报道，很多年份里该病侵染的次数高达10-12次。由于发病严重，通常在苹果生长季节需喷施9-12次杀菌剂进行病害控制，导致田间很快出现了对杀菌剂表现抗药性的病原菌群体。苹果黑星病造成的损失不仅仅导致当年果实品质和产量的下降，还影响来年花芽的分化和座果率，从而在更大程度上对来年的苹果生产造成更严重的损失。
苹果黑星菌寄主范围较广，除侵染苹果栽培种外，还侵染Malus(Crabapple，蔷薇科，海棠)，Cotoneasterintegerrima(蔷薇科，全椽枸子)，Cartaegus oxycantha(Hawthorn)(蔷薇科，杨艳山楂)，Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl(蔷薇科，枇杷)，Pyracantha fortuneana(蔷薇科，火棘果或救军粮)，Sarcocephalus esculentus，Sorbusamericana(蔷薇科，美洲花椒)和Viburnum，(忍冬科，荚莲)(Gopaljee Jha et al.2009)。
苹果黑星菌主要在落叶上以假囊壳越冬，有性阶段始于秋季苹果树落叶后，苹果黑星病的初侵染来源主要是子囊孢子。越冬后的子囊孢子在次年春季从被雨滴湿润的假囊壳中释放，散布于对病原菌敏感且易于侵染的幼嫩的枝条或萼片上。在有些地区，病原菌还可以分生孢子在枝条或芽鳞内越冬，枝条或芽鳞内隐藏的分生孢子也是初次侵染的组成部分，分生孢子随着雨水的飞溅也能到达植株或果实的初生部分。从初侵染产生的病斑再次产生的分生孢子(次生接种体)在适宜的环境条件下，随后又可以在叶片、果实、枝条上引发新的侵染。
针对现有技术中苹果黑星菌分生孢子相关诱导方法，国内胡小平报道，在分离培养苹果黑星菌过程中，适合产生分生孢子的培养基有苹果叶汁培养基，V8培养基和PSA培养基；蔗糖，葡萄糖，果糖，麦芽糖，酵母提取物，硝酸钠和牛肉膏有利于病原菌生长和产孢。最有利于苹果黑星菌产生分生孢子的条件是20℃，光周期12h，光照强度600lx。然而通过该方法诱导多次转接和经过斜面低温保藏6个月后的苹果黑星菌菌种，很难产生分生孢子。因此探寻能够有效解决分离纯化后保藏时间长以及多次转接后的难以再次诱导获得苹果黑星菌分生孢子的方法，对于苹果黑星病的相关防治研究而言意义重大。
发明内容
针对现有技术中关于苹果黑星菌分离纯化多次转接后，难以再次诱导获得苹果黑星菌的分生孢子的技术问题，本申请本方法通过提供特定的诱导培养基及特定的诱导方法在苹果黑星菌分生孢子诱导中的应用。本发明所用的诱导方法能够有效解决分离纯化到的苹果黑星菌在转接多次后，难以再次诱导获得苹果黑星菌的分生孢子的技术问题。本发明方法简便、快速、无污染，可用于苹果黑星病的相关防治研究，对于苹果黑星病品种对于外来苹果黑星菌入侵的风险，从而为苹果育种和病害防控提供科学依据。
本申请通过以下技术方案实现：
一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法，诱导培养基的配方如下：蒸馏水，燕麦片、琼脂粉按照1000：30：17的质量比例配置成培养基，pH调节为自然。
所述一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法包括以下步骤：
(1)燕麦片加蒸馏水，在沸水浴中加热1h；
(2)用双层纱布过滤，过滤后加水补足1L，然后再加入琼脂粉，继续加热，加热过程中不停搅拌避免粘锅，沸腾2-3分钟，使琼脂粉充分溶解；
(3)将充分溶解后的溶液在烧杯中定容，再用三角瓶或试管进行分装，分装好后，塞上棉塞，用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水分进入打湿棉塞，密封后在高压蒸汽下灭菌，灭菌锅自然冷却后即得诱导培养基，最后将制得的诱导培养基冷藏保存备用；
(4)取出斜面低温保藏6个月后难以产生分生孢子的苹果黑星菌菌种，在超净工作台上接种于新配制的PDA平板上，倒置在18℃的培养箱中培养；
(5)将(4)中活化后的苹果黑星菌菌种接种于步骤(3)中制备的诱导培养基，置于18℃，光周期12h，600lx-1800lx光照条件下诱导15天后，在光学显微镜下用血球计数板测定分生孢子的数量。
所述步骤(3)中是在121℃高压条件下灭菌30分钟。
所述步骤(5)中光照条件为：光照强度1200lx。
更进一步的，本申请提供一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法在诱导产生苹果黑星菌分生孢子中的应用。
本申请具有以下有益效果：
1、本发明的苹果黑星菌分生孢子诱导培养基是在常规培养基的基础上加以改进，调整了常规营养元素的配比，调整了碳源浓度，有效解决了现有技术中关于苹果黑星菌分离纯化多次转接后难以再次诱导获得苹果黑星菌分生孢子的技术问题，达到促进诱导获得苹果黑星菌分生孢子显著的技术效果。
2、本发明建立了诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法，通过，置于18℃，光周期12h，光照强度1200lx条件下诱导15天的特定诱导条件结合特定的诱导培养基，处理综合提高了苹果黑星菌分生孢子诱导率，使诱导能产生大量的分生孢子(106-7个/ml)，用于苹果黑星病的相关防治研究，对于苹果黑星病品种对于外来苹果黑星菌入侵的风险，从而为苹果育种和病害防控提供科学依据。
附图说明
图1所示为诱导培养基上产生分生孢子观察结果图。
图2所示为其他培养基上未产生分生孢子观察结果图。
图3所示为诱导培养基上产生分生孢子放大观察结果图。
图4所示为诱导培养基上产生分生孢子低倍镜观察结果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
本发明实施例中采用如下试剂及原料：燕麦片、蒸馏水、马铃薯、葡萄糖、蔗糖、琼脂粉、苹果、玉米粉等。
本发明实施例中采用如下仪器设备：高压灭菌锅、锥形瓶、培养皿、无菌操作台、酒精灯、接种针、微波炉、微量天平、药匙、试剂瓶、光学显微镜、血球计数板等。
本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的培养基
一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法，诱导培养基的配方如下：蒸馏水，燕麦片、琼脂粉按照1000：30：17的质量比例配置成培养基，pH调节为自然。
实施例二：一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的培养基
一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法包括以下步骤：
(1)燕麦片30g加蒸馏水1L，在沸水浴中加热1h；
(2)用双层纱布过滤，过滤后加水补足1L，然后再加入琼脂粉17g，继续加热，加热过程中不停搅拌避免粘锅，沸腾2-3分钟，使琼脂粉充分溶解；
(3)将充分溶解后的溶液在烧杯中定容，再用三角瓶或试管进行分装，分装好后，塞上棉塞，用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水分进入打湿棉塞，密封后在高压蒸汽下灭菌，灭菌锅自然冷却后即得诱导培养基，最后将制得的诱导培养基冷藏保存备用；
(4)取出斜面低温保藏6个月后难以产生分生孢子的苹果黑星菌菌种，在超净工作台上接种于新配制的PDA平板上，倒置在18℃的培养箱中培养；
(5)将(4)中活化后的苹果黑星菌菌种接种于步骤(3)中制备的诱导培养基，置于18℃，光周期12h，光照条件下诱导15天后，在光学显微镜下用血球计数板测定分生孢子的数量。
实施例三：不同培养基诱导效果对比
基于上述实施例一、实施例二，取出难以产生分生孢子且斜面低温保藏6个月后的苹果黑星菌菌种进行活化。分别接种于常见的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，马铃薯蔗糖培养基(PSA)，苹果果汁葡萄糖培养基(ADA)，苹果果汁蔗糖培养基(ASA)及玉米粉琼脂培养基(CA)以及本申请中提供的诱导培养基。各个对比组培养基配比情况如下：
表1：不同对比组培养基配比情况
接种后，置于18℃，光周期12h，光照强度1200lx条件下诱导15天后，在光学显微镜下用血球计数板测定分生孢子的数量，发现本申请提供的诱导培养基能产生大量的分生孢子(106-7个/ml)；马铃薯葡萄糖培养基(PDA)偶尔产生分生孢子；马铃薯蔗糖培养基(PSA)，苹果果汁葡萄糖培养基(ADA)，苹果果汁蔗糖培养基(ASA)及玉米粉琼脂培养基(CA)上未产生分生孢子。
实施例四：不同培基诱导效果对比
基于上述实施例一、实施例二、实施例三，取出斜面低温保藏6个月后的没有产生分生孢子苹果黑星菌菌种进行活化。接种于分别设置的不同原料比例的诱导培养基。置于18℃，光周期12h，1200lx光照条件下诱导15天后，在光学显微镜下用血球计数板测定分生孢子的数量。各个组培养情况如下：
表2：不同培养基配比处理组分生孢子数情况
实施例五：不同培养条件诱导效果对比
基于上述实施例一、实施例二、实施例三，取出斜面低温保藏6个月后的难以产生分生孢子苹果黑星菌菌种活化。接种于实施例三中提供的最佳诱导培养基。置于18℃，光周期12h，分别设置自然光照对照组、600lx光照强度试验一组、1200lx光照强度试验二组、1800lx光照强度试验三组光照条件下诱导15天后，在光学显微镜下用血球计数板测定分生孢子的数量。各个实验组培养情况如下：
表3：不同光照强度处理组分生孢子数情况
分组 分生孢子数量(个/ml)
对照组 0
实验一组 8.2×102
实验二组 1.23×106-7
实验三组 6.5×102
基于实验结果显示，本申请中提供的诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法，通过采用特定的诱导培养基结合特定的诱导培养方法，与对照组相比均能使纯化多次转接后无法产生分生孢子的苹果黑星菌诱导出部分分生孢子，其中光照强度1200lx条件下，诱导获得的分生孢子数量最多。可见本申请提供的技术方案，有效解决关于苹果黑星菌分离纯化多次转接后，难以再次诱导获得苹果黑星菌的分生孢子的技术问题。
本发明建立了诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法，通过，置于18℃，光周期12h，光照强度1200lx条件下诱导15天的特定诱导条件结合特定的诱导培养基，处理综合提高了苹果黑星菌分生孢子诱导率，使诱导能产生大量的分生孢子(106-7个/ml)，用于苹果黑星病的相关防治研究，对于苹果黑星病品种对于外来苹果黑星菌入侵的风险，从而为苹果育种和病害防控提供科学依据。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种诱导产生苹果黑星菌（Venturia inaequalis）分生孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）燕麦片30g加蒸馏水1L，在沸水浴中加热1h；
（2）用双层纱布过滤，过滤后加水补足1L，然后再加入琼脂粉17g，继续加热，加热过程中不停搅拌避免粘锅，沸腾2-3分钟，使琼脂粉充分溶解；
（3）将充分溶解后的溶液在烧杯中定容，再用三角瓶进行分装，分装好后，塞上棉塞，用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水分进入打湿棉塞，密封后在高压蒸汽下灭菌，灭菌锅自然冷却后即得诱导培养基，最后将制得的诱导培养基冷藏保存备用；
（4）取出斜面低温保藏6个月后难以产生分生孢子的苹果黑星菌菌种，在超净工作台上接种于新配制的PDA平板上，倒置在18℃的培养箱中培养；
（5）将（4）中活化后的苹果黑星菌菌种接种于步骤（3）中制备的诱导培养基，置于18℃，光周期12h，600lx-1800lx光照条件下诱导15天后，在光学显微镜下用血球计数板测定分生孢子的数量。
2.如权利要求1所述的一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法，其特征在于，所述步骤（3）中是在121℃高压条件下灭菌30分钟。
3.如权利要求1所述的一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法，其特征在于，所述步骤（5）中光照条件为：光照强度1200lx。
4.如权利要求1至权利要求3任意一项所述的一种诱导产生苹果黑星菌分生孢子的方法在诱导产生苹果黑星菌分生孢子中的应用，其特征在于，所述方法应用于诱导经过斜面低温保藏6个月后很难产生分生孢子的苹果黑星菌菌种。
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