CN115812718B

CN115812718B - 高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用

Info

Publication number: CN115812718B
Application number: CN202211547341.1A
Authority: CN
Inventors: 李敬涛; 杨莉梅; 张香梅; 王晨阳; 钱永盼; 宋丽敏; 王光远
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-12-05
Also published as: CN115812718A

Abstract

本发明提供了高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用。本发明经过抑菌实验及病原菌接种实验，证明了高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型病原菌具有较强的抑制作用，能够有效抑制尖孢镰刀菌番茄专化型的孢子生长、孢子萌发、菌丝生长、孢子牙管伸长，以及尖孢镰刀菌番茄专化型引起的番茄枯萎病的病情指数，进而抑制番茄枯萎病的发生，因此可以将其制备成防治尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病的杀菌剂。高良姜素作为植物源杀菌剂，具有高效和低毒的优点，适合于植物病害化学防治的要求，能够保证农产品及果蔬的高品质，符合绿色、低毒及可持续发展的要求，具有广阔的研究和市场前景。

Description

高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及植物天然杀菌活性化合物，具体涉及高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用。

背景技术

植物枯萎病是近年来对农业生产造成危害的一种重要的真菌性病害，在很多地区已有发生，尤其在作物重荏地发生程度更为严重，直接影响了农作物产量及经济效益。植物枯萎病的病原为尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)，是一种世界性分布的土传植物病原真菌，尖孢镰刀菌存在着许多的专化型，可以侵染的寄主范围很广，可引起西瓜、番茄、甘蔗、香蕉、棉花、大豆、黄瓜、豇豆、哈密瓜等100多种由尖孢镰刀菌引发的枯萎病的发生。寄主被镰刀菌侵染后，症状表现多种多样，一般导致维管束褐变，植株萎蔫枯死，球茎和根腐烂，植株生长衰弱等。对农业生产造成了极大的危害。特别是尖孢镰刀菌番茄专化型(F.oxysporum f.sp.lycopersici)引起的番茄枯萎病，严重威胁番茄生产。

尖孢镰刀菌归为真菌界半知菌门真菌，它能够侵染植物，也能在土壤中存活较长时间，是一类兼性寄生真菌。由于枯萎病菌根部侵染以及能够在土壤和有机物中生存的特点，目前生产上还没有十分有效的防治方法。目前对番茄枯萎病的防治仍然以化学防治为主，配合选用抗病品种，采用不同的药剂结合生根剂灌根，在控制病原菌的同时叶面喷洒肥料，增强植株长势，提高植物抗病力。此外，鉴于它是土传病害，生产上还可以采取轮作、种子消毒、新土育苗、土壤消毒等方法。然而，尖孢镰刀菌无性繁殖速度非常快，产生分生孢子的数量非常多，且由于化学农药的长期大量使用，也很容易发生变异而产生抗药性，目前尖孢镰刀菌已对农业生产上常用的氨基甲酸酯类等多种杀菌剂产生抗性，因此不仅导致防效的降低，而且导致药剂使用量不断加大。而化学药剂的过度使用，也能造成农产品农残超标，危害消费者的身体健康，还对周围土壤中有益微生物群落造成了不可逆转的伤害，从而导致环境污染，破坏生态平衡，影响农业的可持续健康发展。在国家“减肥、减药”的号召下，我国农业要向着健康可持续方向发展，而解决抗性、增强植物免疫能力、安全高效、与环境兼容性好等问题已经成为杀菌剂产品发展的方向。因此，针对番茄枯萎病防治，必须研发出高效、低毒、低残留和环境友好型的新型杀菌剂，并将其应用于生产实践中。

植物源杀菌剂由于对环境干扰小，符合可持续发展理念和国家绿色兴农的政策方针，为枯萎病防治成为新的思路。

高良姜素，源于姜科植物高良姜根中的提取物。别名：高良姜黄素；3,5,7-三羟基黄酮等；英文名称：Galangin；CAS号：548-83-4；分子式：C₁₅H₁₀O₅；分子量：270.24。分子结构式为：

高良姜素是一种在高良姜和蜂胶中发现的黄烷类物质。已被证明可以抑制雌激素受体阳性的MCF-7人乳腺癌细胞的增殖，并延缓乳腺肿瘤的发生。同时，高良姜素具有抗病毒，镇痛，止呕的作用。

目前，国内外尚无关于高良姜素对农业植物病原菌抑制作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用。本发明通过实验证明了高良姜素对尖孢镰刀菌具有良好的抑制活性。高良姜素作为潜在杀菌剂，其来源于植物，具有绿色、低毒的特性，适合于植物病害化学防治的要求。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用。

进一步的：所述植物枯萎病是由尖孢镰刀菌所引起的。

进一步的：所述植物枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型所引起的番茄枯萎病

进一步的：所述杀菌剂中，高良姜素的有效使用浓度为62.5μg/L–125μg/L。

进一步的：所述高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型的孢子生长、菌丝生长、孢子萌发和孢子牙管伸长的抑制呈剂量依赖性。

进一步的：所述杀菌剂中高良姜素浓度为62.5μg/L时，高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子生长的抑制率超过80％；对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长的抑制率超过10％。

进一步的：所述杀菌剂中高良姜素浓度为62.5μg/L时，高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子萌发的抑制率超过15％；对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子牙管伸长的抑制率超过50％。

进一步的：所述杀菌剂中高良姜素浓度为125μg/L时，高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子生长的抑制率超过95％；对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长的抑制率超过25％。

进一步的：所述杀菌剂中高良姜素浓度为125μg/L时，高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子萌发的抑制率超过35％；对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子牙管伸长的抑制率超过75％。

进一步的：所述高良姜素能够显著降低尖孢镰刀菌番茄专化型引起的番茄枯萎病的病情指数，进而抑制番茄枯萎病的发生。

进一步的：所述杀菌剂通过浸根或者灌根的方式施用于植物。

进一步的：所述植物为番茄、黄瓜、西瓜、香蕉、棉花。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

目前防治植物病原菌主要靠农药。农药杀菌剂的品种作用机制比较单一，并且存在农药残留问题，直接威胁着人类的环境和食品安全。因此，开发及应用无污染、无公害绿色杀菌剂已成为农业生产中的重要防治方法。许多植物源绿色杀菌剂已相继问世，并广泛应用于生产，取得了显著效果。本发明通过室内抑菌及抗病能力测定，证明了高良姜素对尖孢镰刀菌具有良好的抑制活性，能够有效抑制尖孢镰刀菌番茄专化型的孢子生长、孢子萌发、菌丝生长、孢子牙管伸长，以及尖孢镰刀菌番茄专化型引起的番茄枯萎病的病情指数，进而抑制番茄枯萎病的发生。而且高良姜素是一种植物源、无污染、对环境友好的黄酮类化合物，对非靶标生物及人畜安全，能够保证农产品及果蔬的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。

附图说明

图1是本发明中高良姜素在5％YEPD中对尖孢镰刀菌番茄专化型真菌孢子生长的抑菌实验结果；

图2是本发明中高良姜素在PDA培养基上对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长的抑菌实验结果；

图3是本发明中高良姜素在PDA培养基上对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长的菌丝直径测量结果；

图4是本发明所述实验室条件下高良姜素抑制番茄枯萎病的实验结果；

图5是本发明所述实验室条件下高良姜素抑制番茄枯萎病的病情指数统计结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

实施例1

一、实验材料

1、高良姜素购自Macklin公司，4℃保存待用。

2、本实施例中植物病原菌尖孢镰刀菌番茄转化型保存在4℃冰箱，病原菌固体培养采用的培养基为马铃薯葡萄糖培养基(简称PDA)。PDA培养基配方：马铃薯(土豆)100g，葡萄糖10g，琼脂10g，蒸馏水500ml，自然pH。配制方法：将土豆洗净去皮，称100g切成小块，加500ml蒸馏水煮沸20min，再用四层纱布过滤于大烧杯中，根据实验需要加10g琼脂，加入10g葡萄糖，搅拌均匀，补足水至50ml，分装后121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

3、本实施例中测定植物病原菌孢子萌发及生长采用是酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基(简称YEPD)。配方：1％酵母提取物(Yeast Extract)，2％蛋白胨(Peptone)，2％葡萄糖(Dextrose)。配制方法：分别称取酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，以及蒸馏水1000ml，自然pH。分装后121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

二、高良姜素对植物枯萎病菌的抑菌实验

1、高良姜素在5％YEPD培养基中对植物病原菌孢子生长的抑制作用

实验方法：将植物病原菌在PDA平板上25℃活化培养5天左右备用；用打孔器在活化好的植物病原菌菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取8个新鲜菌丝定殖的琼脂块(直径0.60cm)，置于20mL液体PDA培养基中过夜培养；在超净工作台内收集病原菌孢子，然后利用5％浓度的YEPD稀释成10⁵个/ml左右的孢子悬浮液，并取100μL加入到96孔板中，分别在分生孢子悬液中加入不同浓度的高良姜素(0、62.5和125μg/L)。然后置于SPECTROstarOmega微生物生长曲线测定仪(BMG LABTECH)中在25℃、100rpm条件下培养，实时测定600nm波长条件下的吸光度(OD₆₀₀)。利用吸光度测定病原菌孢子生长的不同状态，计算病原菌孢子随时间变化的生长曲线。每个处理重复8次。

高良姜素对植物枯萎病菌孢子生长的抑菌效果如图1所示，随着高良姜素浓度的升高，其对植物病原菌的抑制效果也显著提高。当高良姜素在62.5μg/L时，可以显著的抑制尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝的生长。

表1总结了培养36小时后，高良姜素在5％YEPD培养基中对植物病原菌孢子生长的抑菌率。抑制率(％)＝(对照病原菌孢子生长OD增加值-药物处理病原菌孢子生长OD增加值)/对照病原菌孢子生长OD增加值×100。每个处理重复8次。由表1可知，当高良姜素浓度为62.5μg/L时，对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝抑制率达到85.5％，当高良姜素浓度为125μg/L时，对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子生长抑制率达到99％，表明高良姜素对测试的植物病原真菌的生长具有显著的抑制作用。

表1高良姜素在5％YEPD中对病原菌孢子生长的抑菌率

2、高良姜素在固体PDA培养基中对植物病原菌菌丝生长的抑制作用

实验方法：将植物病原菌分别在PDA平板上25℃活化培养5天左右备用；取PDA培养基加热溶化，冷却至45-50℃，分别加入不同浓度的高良姜素制成含0、62.5μg/L和125μg/L药液的培养基，并分别倒入培养皿中冷却；用接种针在活化好的植物病原菌菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)取少量新鲜菌丝(0.1×0.10cm)，再用接种针挑至含药平板边缘，然后将培养皿倒置于培养箱(25℃)中培养。

处理后及时观察测定菌丝的生长情况。待不含药物的对照平板基本长满一半后，拍照并测量菌丝生长直径，计算抑制率。抑制率(％)＝(对照新生长菌丝直径-处理新生长菌丝直径)/对照新生长菌丝直径×100。每个处理重复3次。

高良姜素对植物枯萎病菌菌丝生长的抑菌效果如图2和图3所示，当高良姜素在62.5μg/L时，可以显著的抑制病原菌菌丝的生长。表2总结了高良姜素对植物病原菌菌丝生长的抑菌率。由表2可知，当高良姜素浓度为62.5μg/L时，对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝抑制率达到11.4％，当高良姜素浓度为125μg/L时，对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长抑制率达到29.5％，表明高良姜素对测试的植物病原真菌的菌丝生长在PDA全营养培养基上具有显著的抑制作用。

表2高良姜素对病原菌菌丝在固体培养基上生长的抑菌率

3、高良姜素对植物病原菌孢子萌发的抑制作用

实验方法：将尖孢镰刀菌番茄专化型分别接种在PDA平板培养至产生分生孢子；收集孢子并用YEPD液体培养基调整孢子浓度为10⁵个/ml左右；在孢子悬液中加入不同浓度的高良姜素(浓度0、62.5和125μg/L)；采用凹玻片法检测高良姜素对孢子萌发的抑制作用(在灭菌的凹玻片中分别加入孢子悬液50μl，26℃保湿培养，对照分生孢子萌发率达到90％以上时，检测不同浓度高良姜素处理后的孢子萌发率及抑制率。抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-药剂处理后孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100。每个处理重复3次。

如表3所示，随着高良姜素含量的增加，对尖孢镰刀菌番茄专化型分生孢子萌发的抑制作用明显提高。当高良姜素含量为62.5μg/L时，就可以明显抑制尖孢镰刀菌分生孢子的萌发，孢子萌率降低为75.4％，抑制率约18.31％，当高良姜素含量为125μg/L时，孢子萌率为58.5％，抑制率约36.62％。表明高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子的萌发具有较强的抑制作用。

表3高良姜素抑制病原菌孢子萌发

4、高良姜素对尖孢镰刀菌芽管伸长的影响

实验方法：采用同上的凹玻片法进行检测，培养6h后，显微镜观察并测量芽管伸长情况，并计算药物对芽管伸长的抑制率。抑制率(％)＝(对照芽管长度-处理芽管长度)/对照芽管长度×100。每个处理重复3次，每次测量50个萌发孢子。

实验结果如表4所示，随着高良姜素浓度的提高，对芽管伸长的抑制明显，即对病原菌分生孢子芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。当高良姜素为62.5μg/L时，抑制率为53.6％，当高良姜素浓度为125μg/L时，对尖孢镰刀菌芽管伸长抑制率可以达到75.1％。

表4高良姜素对植物病菌芽管伸长的抑菌率

5、高良姜素对番茄枯萎病抑制的影响

实验方法：采用同上的生长曲线法收集并制备孢子悬浮液，对正常条件下生长3周左右的番茄幼苗通过在62.5μg/L浓度的高良姜素溶液中进行浸根处理20分钟，随后转移到10⁵个/ml左右的孢子悬浮液进行接种，处理10分钟后，移栽回育苗盆中，继续培养2-3周，带对照番茄叶片全部黄化坏死后统计病情指数，病情指数范围设定为0-5(0，无症状；1，0-20％黄化萎蔫；2，20-40％黄化萎蔫；3，40-60％黄化萎蔫；4，60-80％黄化萎蔫；5，80-100％黄化萎蔫)。

实验结果如图4所示，62.5μg/L浓度的高良姜素明显抑制番茄枯萎病的发病程度；如图5所示，对照处理的病情指数平均为4.5，而高良姜素预处理后的病情指数为3.5，病情指数能降低约一个等级，且差异显著，说明高良姜素能显著抑制番茄枯萎病的发生，可用于番茄枯萎病的防治。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述植物枯萎病是由尖孢镰刀菌所引起的；所述杀菌剂中，高良姜素的有效使用浓度为62 .5μg/L–125μg/L。

2.根据权利要求1所述的高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述植物枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型所引起的番茄枯萎病。

3.根据权利要求2所述的高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型的孢子生长、菌丝生长、孢子萌发和孢子牙管伸长的抑制呈剂量依赖性。

4.根据权利要求1所述的高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述杀菌剂中高良姜素浓度为62 .5μg/L时，高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子生长的抑制率超过80％；对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长的抑制率超过10％。

5.根据权利要求4所述的高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述杀菌剂中高良姜素浓度为62 .5μg/L时，高良姜素对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子萌发的抑制率超过15％；对尖孢镰刀菌番茄专化型孢子牙管伸长的抑制率超过50％。

6.根据权利要求2所述的高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述高良姜素能够显著降低尖孢镰刀菌番茄专化型引起的番茄枯萎病的病情指数，进而抑制番茄枯萎病的发生。

7.根据权利要求1所述的高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述杀菌剂通过浸根或者灌根的方式施用于植物。

8.根据权利要求1所述的高良姜素在制备用于防治植物枯萎病的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述植物为番茄、黄瓜、西瓜、香蕉、棉花。