WO2010135893A1 - 防治作物土传病害的复合生防菌剂ps和psx及其制备方法和用途 - Google Patents

防治作物土传病害的复合生防菌剂ps和psx及其制备方法和用途 Download PDF

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soil
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郭坚华
刘红霞
李师默
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南京农大生物源农药创制有限公司
南京农业大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus

Definitions

  • the invention relates to a composite biocontrol agent for controlling soil-borne diseases of various crops, and belongs to the technical field of crop disease prevention and treatment, and is specially used for pollution-free prevention and control of soil-borne diseases of various crops. Background technique
  • the pathogens of plant-borne diseases are mostly soil-inhabited bacteria, such as Ralstonia solanacearum, which causes bacterial wilt of Solanaceae crops, Fusarium oxysporium, which causes a variety of plant blight and Verticillium wilt, large Verticil Uum dahlaei, Rhizoctonia solani Kuhn, and the root line of Mehidogyne spp.
  • soil-inhabited bacteria such as Ralstonia solanacearum, which causes bacterial wilt of Solanaceae crops, Fusarium oxysporium, which causes a variety of plant blight and Verticillium wilt, large Verticil Uum dahlaei, Rhizoctonia solani Kuhn, and the root line of Mehidogyne spp.
  • Solanum tuberculosis is a worldwide disease. Pathogenic bacteria can infect more than 200 plants in more than 50 families. The economic losses caused by the world are as high as 12 billion US dollars. Phytophathom ch. is caused by vegetable production in China. Huge losses; Meloidogyne spp. infested protected vegetables, causing the host to reduce production by 15-25% per year, sometimes more than 70%, severely restricting the production of vegetables and exporting foreign exchange. In production, these diseases often occur at the same time. For example, root-knot nematodes, bacterial wilt and fungal blight in the tomato greenhouse often occur at the same time, forming a complex infection, and the damage is very serious.
  • Banana wilt is a devastating soil-transmitting vascular disease, and the spread of germs is fast and difficult to cure.
  • Rice sheath blight is a global rice disease that seriously restricts rice production and is one of the three major diseases of rice in China. Due to its strong saprophytic ability and broad host range, especially with the promotion of high-quality rice varieties and the application of high-fertilization technology, the disease is becoming more and more serious, causing certain losses to rice production every year. Can reduce production by 50%. It directly threatens the stable and high yield of rice. Although there are some differences in resistance to rice sheath blight among different rice varieties, no immune and high resistance varieties have been found so far.
  • the object of the present invention is to solve the current situation that the chemical pesticides used in the prevention and control of crop soil-borne diseases are seriously polluted and the use cost is too high, and the current situation of the biocontrol bacteria preparations which have no high control effect on the mixed soil-borne diseases of the crops is developed.
  • a compound microbial agent that can be used for biological control of various crop soil-borne diseases, and is specially used for controlling soil bacterial wilt, epidemic diseases, root knot nematode disease, banana wilt, rice sheath blight and other soil-borne diseases, and the efficacy of microbial agents High, and has a production increase function.
  • the invention relates to a composite biocontrol agent PSX mixture for controlling soil-borne diseases of various crops, comprising three kinds of bacterial components: PX35, SM21 and XY21.
  • PX35 and SM21 strains are all Bacill spp.), which are deposited in the General Microbiology Center of China Microbial Culture Collection Management Committee, PX35 strain.
  • the accession number is CGMCC NO. 1930, and the SM21 strain is deposited as CGMCC NO.2058.
  • XY21 is a genus of Serrat a sp., which was deposited on May 24, 2007 at the General Microbiology Center of the China Microbial Culture Collection Management Committee.
  • the strain collection number is CGMCC NO.
  • the preparation method of the biocontrol preparation is:
  • PX35, SM21 and XY21 strains were inoculated into PDA medium and cultured at 37 °C and 180 rpm respectively. After 16-20 hours, the OD value at 600 nm was sampled and measured in the ultra-clean workbench.
  • the culture medium is used for zero adjustment;
  • the preparation method of the PDA culture solution is as follows: After peeling with 200 g of potatoes, cut into small pieces and put them into water, boil them, boil for at least 20 minutes, then filter with four layers of medical gauze, and add the filtrate. 20 grams of ordinary sucrose, to a volume of 1000 ml, pH adjusted to 7.2-7.4, and then sterilized at 121 ° C for 20 minutes;
  • the seed broth is added to the PDA medium at a ratio of 1:100 by volume, shaken at 30 ° C for 180-24 rpm for 20-24 hours, then centrifuged at 4000 g for 10 min, and cultured per 1000 ml.
  • the liquid obtains 13-16 g of wet bacteria, and each gram of wet bacteria contains 4 X 10 1Q - 10 15 bacteria;
  • the cell preservation solution is 0.01 mol/L phosphate buffer solution, and also contains Tween20 at a concentration of 0.001 mol/L;
  • the microbial agent of the third strain is required to be uniformly mixed according to a volume ratio of 1: 1:1 to obtain a composite biocide PSX mixture, and the total concentration of the living bacteria in the finished product is 1 X 10 9 — l X 10 12 cfu/ml.
  • the advantages and positive effects of the present invention are as follows:
  • the present invention is a biocontrol agent specially developed for crop soil-borne diseases, and has a significantly improved control effect compared with other biobacterial agents with other antibacterial spectrums in controlling crop soil-borne diseases. And it has good control effect on a variety of crop soil-borne diseases. Because it is a biological preparation, there is no problem caused by the use of chemical pesticides, so it is beneficial to the pollution-free production of vegetables. farmers can eliminate or reduce the amount of chemical pesticides, which not only saves farmers, but also benefits The export of vegetables. At the same time, the fungicide has the function of increasing production, which can increase income for farmers.
  • the microbial agent is formulated into a microbial agent by using a wet fungus and a cell preservation solution at a ratio of 1:40 (g/ml), and can be stored at room temperature for 2 to 3 years.
  • the cell preservation solution was O.Omol/L phosphate buffer and also contained a nonionic surfactant: Tween20 at a concentration of 0.001 mol/L.
  • the microbial agent can be poured into organic fertilizer before being transplanted in the greenhouse to be composted or sprayed on the field with organic fertilizer before transplanting, and then buried in the soil with the fertilizer during the land preparation process, or can be filled during transplanting. Root use. After planting the seedlings, the preparation works through various biocontrol mechanisms to achieve the effect of controlling soil-borne diseases.
  • PSX mixture is used to control plant-borne diseases that occur in mixed or separate occurrences, such as Tomato, pepper, cucumber, loofah, watermelon and other fruits and vegetables root knot nematode disease, bacterial wilt, verticillium wilt and disease, its disease prevention effect is 60-100%, the yield increase effect is 30-200%.
  • the disease prevention effect on banana wilt and rice sheath blight is also above 50%, and the yield is increased by 20-80%.
  • PSX mixture can also improve soil compaction.
  • Figure 4 Control effect of PSX mixture on tomato mixed diseases under field conditions (Shandongzhou test site)
  • Figure 5 Field control effect of PSX mixture on tomato bacterial wilt (Fujian province experimental site)
  • Figure 8 Control effect of PSX mixture on watermelon root-knot nematode disease under field conditions (Huai'an City, Jiangsu Province)
  • Figure 9 Control effect of PSX mixture on banana wilt under greenhouse conditions
  • Figure 10 Field biocontrol effect of PSX mixture on banana wilt (Guangdong Dongguan test site)
  • Figure 11 Effect chart after 30 days of PSX mixture treatment under field conditions (Anhui Minjiang Experimental Site)
  • Figure 12 PSX mixture under field conditions at harvest time Biocontrol and growth promotion effect (Jiangsu Zhenjiang Experimental Site)
  • a compound biocontrol agent PSX mixture for controlling soil-borne diseases of various crops containing three kinds of bacterial components: PX35, SM21 and XY21.
  • PX35 and SM21 strains are all Bacus spp. (Bac us spp., both deposited in the General Microbiology Center of China Microbial Culture Collection Management Committee, PX35 strain storage number is CGMCC NO. 1930, SM21 strain storage number is CGMCC NO.2058 XY21 is a genus of Serrat a sp., which was deposited on May 24, 2007 at the General Microbiology Center of the China Microbial Culture Collection Management Committee.
  • the strain collection number is CGMCC NO.
  • the preparation method of the biocontrol preparation is:
  • PX35, SM21 and XY21 strains were inoculated into PDA medium and cultured at 37 °C and 180 rpm respectively. After 16-20 hours, the OD value at 600 nm was sampled and measured in the ultra-clean workbench.
  • the culture solution is used for zero adjustment; the preparation method of the PDA culture solution used is: 200 After peeling the potatoes, cut them into small pieces and put them in water. Cook for at least 20 minutes after boiling. Then filter with four layers of medical gauze. Add 20 grams of ordinary sucrose to the filtrate, and dilute to 1000 ml. Adjust the pH to 7.2- 7.4, then sterilized at 121 ° C for 20 minutes;
  • the seed broth is added to the PDA medium at a ratio of 1:100 by volume, shake cultured at 30 ° C for 180-24 rpm, then centrifuged at 4000 g for 10 min, cultured at 1000 ml.
  • the liquid obtains 13-16 g of wet bacteria, and each gram of wet bacteria contains 4 X 10 1Q - 10 15 bacteria;
  • the cell preservation solution is 0.01 mol/L phosphate buffer solution, and also contains Tween20 at a concentration of 0.001 mol/L;
  • the microbial agent of the third strain is required to be uniformly mixed according to a volume ratio of 1: 1:1 to obtain a composite biocide PSX mixture, and the total concentration of the living bacteria in the finished product is 1 X 10 9 — l X 10 12 cfu/ml.
  • Biocontrol effect of three two bacteria mixture and three bacteria mixture was set up in the experiment, and control 1 was treated with water.
  • Controls 2, 3, and 4 were streptomycin, metalaxyl manganese zinc, and avermectin (three pesticides for controlling bacterial diseases, diseases, and root-knot nematodes). Commonly used agents). The results are shown in Table 1 and Figure 1.
  • Table 2 shows the growth promoting effects of the single bacteria, the two bacteria mixture and the three bacteria mixture in the PSX family.
  • the three bacteria mixture showed the best growth-promoting effect, the biomass increased by 64.67%, and the other treatments of the PSX family promoted the effect of 4.85-21.14%.
  • Plants treated with PSX mixture had significantly higher root fresh weight and aboveground fresh weight (96.19% and 59.73%) than the PSX family (11.74-50.33% and 3.79-16.63%).
  • Each plot is 4mx4m and 100 tomatoes are planted.

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Abstract

一种防治多种作物土传病害的生防复合菌剂PSX合剂及其细菌组成成分，属于农作物防病治病技术领域。PSX合剂由三种生防细菌组成，分别是Bacillus sp. PX35、Bacillus sp. SM21和Serratia sp. XY21。三种细菌分别在PDA培养液中37℃ 180rpm振荡培养20~24小时，然后4000g离心10 min，取湿菌菌体保藏液按1：40配成菌剂，再按1：1：1比例混匀，成品中活菌总浓度为1X109 ~1X1012 cfu/ml。PSX合剂用于防治混合发生或单独发生的植物土传病害，如番茄、辣椒、黄瓜、丝瓜、西瓜等果蔬根结线虫病、青枯病、黄萎病和疫病，其防病效果在60-100%，增产效果30-200%。对香蕉枯萎病、水稻纹枯病的防病效果亦在50%以上，增产20-80%。此外，PSX合剂还可以改善土壤板结现象。

Description

防治作物土传病害的复合生防菌剂 PS和 PSX及 其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及防治多种作物土传病害的复合生防菌剂， 属于农作物防病治 病技术领域， 专用于多种作物土传病害的无公害防治。 背景技术
植物土传病害的病原物多为土壤习居菌， 如引起茄科作物青枯病的青枯 劳尔氏菌 Ralstonia solanacearum ， 引起多种植物枯、 黄萎病的尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporium, 大 轮枝菌 VerticilUum dahlaei, 弓 1起水稻纹古病的立古 丝核菌（ Rhizoctonia solani Kuhn)以及近年来在各地危害越来越严重的根结线 l Mehidogyne spp.等。
茄科作物青枯病属世界性病害， 病原细菌可侵染 50多科 200多种植物， 全球范围内造成的经济损失多达 120亿美元；辣概疫霉 Phytophathom ch 在 我国蔬菜生产上常年造成巨大损失； 根结线虫 (Meloidogyne spp.)侵染保护地 蔬菜， 致使寄主常年减产 15-25%， 有时达 70%以上， 严重地制约了蔬菜的生 产和出口创汇。 而生产上， 这些病害往往同时发生， 如番茄大棚中根结线虫、 细菌性青枯和真菌性枯黄萎常同时发生， 形成复合侵染， 造成的损失非常严 重。
我国香蕉栽培面积和产量居全国水果第 4 位。 香蕉枯萎病是一种毁灭性 土传维管束病害， 病菌蔓延快， 很难根治。 近年来在我国有加重趋势， 发病 率为 10%~40%， 严重时达 90%以上。
水稻纹枯病是一类严重制约水稻生产的全球性水稻病害， 是我国水稻三 大主要病害之一。 由于纹枯病菌腐生能力强， 寄主范围广， 尤其是随着水稻 优质品种的推广和高肥密植技术的应用， 该病危害日趋严重， 每年都会给水 稻生产造成一定损失， 发病严重的区域水稻可减产 50 %。 直接威胁水稻的稳 产高产。 水稻不同品种间对纹枯病的抗性虽有一定的差异， 但至今尚未发现 免疫和高抗品种。
这些土传病害都有寄主范围广、 抗逆性强、 难以根除等特点， 对复合侵 染防治尤其困难。 生产中往往既缺乏优良的抗病品种， 又缺乏有效的化学防 治药剂。 而过多施用化学农药会带来一系列生态和社会问题， 如病虫草产生 的抗性， 对非靶标生物的直接危害， 对土壤、 水、 大气的污染， 生物富集作 用对人健康的影响， 国际贸易对农药残留农产品的限制等。 早在 1992年世界 环境与发展大会就要求 "在全球范围内控制化学农药的销售和使用"， 不能过 分依赖化学农药已成为人类的共识。 随着经济的发展， 人们生活水平的提高， 人们越来越注重食品安全问题， 绿色蔬菜、 有机农产品等也越来越受人青睐。
无公害蔬菜早已成为世界蔬菜生产的主流。 我国无公害蔬菜的研究和生 产始于 1982年， 该年召开全国生物防治会议， 江苏省率先提出用生物防治代 替化学农药防治。 1983年， 在全国植保总站的大力支持下， 全国 23个省、 市 开展了无公害蔬菜的研究、 示范与推广工作。 社会对安全、 健康食品的需求 促进了利用无公害方法来控制有害生物的研究。 生防菌株通过空间位点竞争 和营养的竞争， 直接分泌胞外酶降解作用， 产生抗生素抑制病原， 诱导植物 产生抗病性等机制， 既可以减少化学农药使用带来的环境污染， 提高农产品 的价值， 又可以改善土壤微生态环境， 压低有害生物的种群数量， 利于农作 物的可持续生产， 为我国无公害绿色蔬菜的生产提供有力保障。
通过几年的研究实践， 人们探索出一套综合防治病虫害、 减少农药污染 的无公害蔬菜生产术， 也开发了一些生物杀菌剂， 如农用链霉素、 井岗霉素， 前者可以配成 200 mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成 1000-1500 倍液防治蔬菜炭疽病、 霜霉病。 但目前尚未有能同时防治蔬菜、 香蕉、 水稻 等多种作物土传病害的生防制剂产品。 现有技术中按照本实验室的菌体保藏 液专利 （公开专利号 CN1358838 , 公开日： 2002年 7月 17日）方法， 菌体可 室温保存 2〜3年。 发明内容
技术问题
本发明的目的是针对当前防治作物土传病害使用的化学农药污染严重、 使用成本过高的缺陷， 且对作物多种土传病害混发没有较高防效的生防菌制 剂现状， 开发一种可用于多种作物土传病害的生物防治的复合菌剂， 专用于 防治蔬菜青枯病、 疫病、 根结线虫病， 香蕉枯萎病， 水稻纹枯病等土传病害， 菌剂的防效高， 并且有增产功能。
技术方案
本发明为一种防治多种作物土传病害的复合生防菌剂 PSX合剂， 含三种 细菌成分： PX35、 SM21和 XY21。 PX35、 SM21菌株均为芽孢杆菌属 Bacill spp. )， 均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， PX35菌种 保藏号为 CGMCC NO. 1930， SM21菌种保藏号为 CGMCC NO.2058。 XY21 为沙雷氏菌属 （Serrat a sp.)， 于 2007年 05月 24日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC NO.2059。
该生防制剂的制备方法为：
1 ) 分别将 PX35、 SM21和 XY21三菌株接种到 PDA培养液中分别培养 37°C 180rpm， 16— 20小时后在超净工作台中分别取样测 600nm处的 OD值， 测定过程中以未接菌的培养液来调零； 所用 PDA培养液配制方法为： 用 200 克土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至少煮 20分钟以上， 接着用四层 医用纱布过滤， 滤液加 20克普通蔗糖， 定容至 1000毫升， pH值调至 7.2-7.4， 然后 121 °C灭菌 20分钟；
2 )当培养至 OD值在 0.5— 0.8之间时， 将种子菌液以 1 : 100体积比加入 PDA培养液中， 30°C 180rpm振荡培养 20— 24小时，然后 4000g离心 10min， 每 1000ml培养液获得 13— 16g湿菌， 每克湿菌含 4 X 101Q— 1015个菌体；
3 ) 分别取湿菌与菌体保藏液按 1 g : 40 ml 配成菌剂， 菌体保藏液为 0.01mol/L磷酸盐缓冲液， 还含有浓度为 0.001mol/L的 Tween20; 再将权利要 求 3所述三菌株菌剂按体积比 1 : 1： 1混合均匀， 得复合生防菌剂 PSX合剂， 成品中活菌总浓度为 1 X 109 — l X 1012cfu/ml。
有益效果
本发明的优点和积极效果表现在： 本发明是专门针对作物土传病害而开 发的生防制剂， 在防治作物土传病害方面与目前其他抗菌谱单一的生物杀菌 剂相比防治效果显著提高， 并且对多种作物土传病害均有很好的防效。 由于 是生物制剂， 完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题， 因而有利于 蔬菜的无公害生产， 农民可以不用或减少化学农药的用量， 这不仅可为农民 节省开支， 而且有利于蔬菜的出口。 同时， 该菌剂还有增产功能， 可为农民 增加收入。
该菌剂用湿菌与菌体保藏液按 1 : 40(g/ml)配成菌剂，可室温保存 2〜3年。 菌体保藏液为 O.Olmol/L磷酸盐缓冲液， 还含有非离子型表面活性剂： 浓度为 0.001mol/L的 Tween20。
该菌剂可以在温室移栽前倒入有机肥中制成堆肥或于移栽前喷在有有机 肥的田块， 然后随肥料在整地过程中埋到土里， 也可以在移栽时灌根使用。 栽苗后， 制剂通过多种生防机制起作用达到防治土传病害的效果。
试验表明， PSX 合剂用于防治混合发生或单独发生的植物土传病害， 如 番茄、 辣椒、 黄瓜、 丝瓜、 西瓜等果蔬根结线虫病、 青枯病、 黄萎病和疫病， 其防病效果在 60-100%， 增产效果 30-200%。 对香蕉枯萎病、 水稻纹枯病的防 病效果亦在 50%以上， 增产 20-80%。 此外， PSX合剂还可以改善土壤板结现 象。 附图说明
图 1 :温室条件下 PSX合剂对辣椒疫病防治效果
图 2:温室条件下 PSX 合剂对辣椒的促生效果
图 3 :PSX合剂对田间辣椒土传病害的防病及促生效果
图 4:大田条件下 PSX合剂对番茄混合病害的防治效果 （山东省试验地） 图 5 :PSX合剂对番茄青枯病的田间防治效果 （福建省试验地）
图 6:PSX合剂对黄瓜混合性土传病害的防治效果（江苏徐州，处理 80天） 图 7:大田条件下 PSX合剂对黄瓜根结线虫病的防治效果 （河北邯郸， 处 理 120天）
图 8:大田条件下 PSX合剂对西瓜根结线虫病的防治效果（江苏省淮安市） 图 9:温室条件下 PSX合剂对香蕉枯萎病的防治效果
图 10:PSX合剂对香蕉枯萎病的田间生防效果 （广东东莞试验地） 图 11 :大田条件下 PSX合剂处理 30天后效果图 （安徽庐江试验地） 图 12:大田条件下 PSX合剂在收获时的生防促生效果 （江苏镇江试验地） 具体实施方式：
PSX合剂制备
一种防治多种作物土传病害的复合生防菌剂 PSX合剂，含三种细菌成分: PX35 , SM21和 XY21。 PX35、 SM21菌株均为芽孢杆菌属 (Bac us spp. ， 均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， PX35菌种保藏号 为 CGMCC NO. 1930， SM21菌种保藏号为 CGMCC NO.2058。 XY21为沙雷 氏菌属 （Serrat a sp.)， 于 2007年 05月 24日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC NO.2059。
该生防制剂的制备方法为：
1 ) 分别将 PX35、 SM21和 XY21三菌株接种到 PDA培养液中分别培养 37°C 180rpm， 16— 20小时后在超净工作台中分别取样测 600nm处的 OD值， 测定过程中以未接菌的培养液来调零； 所用 PDA培养液配制方法为： 用 200 克土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至少煮 20分钟以上， 接着用四层 医用纱布过滤， 滤液加 20克普通蔗糖， 定容至 1000毫升， pH值调至 7.2-7.4， 然后 121 °C灭菌 20分钟；
2)当培养至 OD值在 0.5— 0.8之间时， 将种子菌液以 1 : 100体积比加入 PDA培养液中， 30°C 180rpm振荡培养 20— 24小时，然后 4000g离心 10min， 每 1000ml培养液获得 13— 16g湿菌， 每克湿菌含 4 X 101Q— 1015个菌体；
3 ) 分别取湿菌与菌体保藏液按 1 g: 40 ml 配成菌剂， 菌体保藏液为 0.01mol/L磷酸盐缓冲液， 还含有浓度为 0.001mol/L的 Tween20; 再将权利要 求 3所述三菌株菌剂按体积比 1 : 1： 1混合均匀， 得复合生防菌剂 PSX合剂， 成品中活菌总浓度为 1 X 109— l X 1012cfu/ml。
实施效果
1、 PSX家族在温室条件下对混合发生的青枯病、 疫病和根结线虫病的防 治效果
在温室试验中，我们比较了 PSX家族中的 3个单剂 PX35、SM21和 XY21 ,
3个两菌合剂及三菌合剂 （PSX合剂） 的生防效果。 试验设 4个对照， 对照 1 为清水处理， 对照 2、 3、 4分别为链霉素、 甲霜灵锰锌及阿维菌素 （3种农药 为防治细菌病害、 疫病和根结线虫病的常用药剂） 处理。 结果如表 1、 图 1所 示。
温室条件下 PSX家族对混合发生的青枯病、 疫病和根结线虫病的综合 防治效果 病害严重度 * (%) 生防效果 （％) 处理
根结线虫 根结线虫 青枯病 疫病 青枯病 疫病
病 病
PX35 18.08±2.4 30.10±3.6d 17.88±1.5e 64.39±2.2 80.48±4.3b 65.04±3.1b
SM21 27.60±4.9cd 4.73±4.5c 31.2±3.2b 50.3±2.7f 63.36±3.6e 41.65±2.7e
XY21 32.50±5.1c 60.30±4.6b 28.94±2.6bc 80.2±3.2c 53.45±2.7g 21.33±1.6g
PX35+SM21 15.23±2.3e 30.93±3.8d 23.925±2.2cd 75.27±3.2d 79.83±2.7b 65.53±4.7b
PX35+XY21 15.35±2.6e 29.30±2.6d 20.88±1.5de 82.85±4.7b 71.79±4.4c 51.01±2.5c
SM21+XY21 21.95±4.1de 41.35±2.6c 27.43±2.1bc 82.71±4.8b 57.66±2.4f 36.05±2.4f
Figure imgf000008_0001
注： * 病害严重度根据青枯病、 疫病、 和根结线虫病的病情等级计算， 数值为平均值 ±标准差， 不同字母表示处理在 Ρ = 0.05的显著水平下， 差异性 显著 (Duncan test)。
2、 温室条件下 PSX家族对辣椒的促生作用
表 2显示了 PSX家族中单菌、 两菌合剂及三菌合剂的促生效果。 其中三 菌合剂 （PSX合剂） 表现出最好的促生效果， 生物量增加达 64.67%， 而 PSX 家族的其他处理促生效果为 4.85-21.14%。 由 PSX合剂处理的植株， 其根部鲜 重和地上部分鲜重的增量（96.19%和 59.73%)显著高于 PSX家族的其他处理 ( 11.74-50.33%和 3.79-16.63%)
表 2温室条件下 PSX家族对辣椒的促生作用
Figure imgf000008_0003
注： * 数据为 3次重复的平均值， 不同字母表示处理在 P = 0.05的显著水 平下， 差异性显著 （LSD test)。
Figure imgf000008_0002
3、 大田条件下 PSX合剂对辣椒混合病害的防治效果
在江苏省淮安地区和山东省临沂地区， 包括青枯病、 疫病和根结线虫病 等的混合病害常年发生。 在淮安用 PSX合剂处理 90天后， 防效达到 79.05%， 增产 149.2%; 而化学农药处理的防效和增产效果只有 52.55%和 80.0% (表 3、 4)。 在山东省临沂地区进行的试验， 也得到了相似的结果。
PSX合剂处理 90天后对辣椒混合病害的防治效果 （江苏淮安)
Figure imgf000009_0001
注： * 试验重复 3次， 不同字母表示处理在 P = 0.05的显著水平下， 性显著 （Duncan test)。
** 对照 1为清水处理； 对照 2为链霉素、 甲霜灵锰锌及阿维菌素共同处 理。
4、 大田条件下 PSX合剂对番茄混合病害的防治效果
在山东青枯病、 根结线虫病和疫病混合发生长达 8 年的塑料大棚里， 我 们进行了 PSX合剂的生物防治试验， 结果如表 5、 图 4所示。
表 5 山东省番茄田间试验 （2008)
Figure imgf000009_0002
注： * 数据为 4次重复的平均值， 不同字母表示处理在 P = 0.05的显著水 平下， 差异性显著 （LSD test)。
每个小区为 4mx4m， 种植 100株番茄。
5、 大田条件下 PSX合剂对黄瓜混合病害的防治效果
在江苏省徐州市铜山县连续 10年连作黄瓜的大棚里， 根结线虫病及一些 未知病原菌的根部病害发生非常严重。 2007 年， 我们在此进行了田间生物防 治试验， 结果如表 6、 图 6所示。 在河北省邯郸市永年县进行的另一项田间试 验中， PSX合剂对根结线虫的防效达 86.5%， 增产 56.4%。 图 7显示了不同处 理下黄瓜根部的明显区别。
PSX合剂对黄瓜混合性土传病害的防治效果 （江苏徐州， 处理 120天)
Figure imgf000010_0001
注： * 数据为 4次重复的平均值， 不同字母表示处理在 P = 0.05的显著水 平下， 差异性显著 （LSD test)。
6、 大田条件下 PSX合剂对西瓜根结线虫病的防治效果
在中国和其他一些国家， 西瓜是一种很受欢迎的水果， 然而它却受到多 种土传病害的侵染， 严重时甚至导致整块地绝收。 除严重雨水的气候条件外， PSX合剂对西瓜上混合发生的土传病害的防效达到 70% (表 7、 图 8 )。
表 7 江苏省淮安市西瓜田间试验 （2008)
Figure imgf000010_0002
注： * 数据为 3次重复的平均值，每个重复为半个大棚，每大棚 7分地 （50 米 X 4米)。 不同字母表示处理在 P = 0.05的显著水平下， 差异性显著 （LSD test) o
7、 温室条件下 PSX合剂对香蕉枯萎病的防治效果
在华南地区， 特别是广东省， 由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎 病发生严重。 温室试验中 PSX合剂对香蕉枯萎病的防治效果为 53.23%， 生物 量的增加为 27.55% (图 9)。 在 2009年广东珠海的大田试验中， 移栽四个月 时 PSX合剂的生防效果为 75.02% (表 8 ) ; 东莞试验地的生防效果为 64.29% (图 10)。 本次田间试验将于 2010年 4月结束， 进一步的结果统计仍在继续 进行。 预计病田其最终增产效果为 40-50%， 无病田的增产效果约 5-10%。 PSX合剂对香蕉枯萎病的田间生防及促生效果 （广东珠海试验地)
Figure imgf000011_0001
注： *不同字母表示处理在 P = 0.05的显著水平下，差异性显著（LSD test 数据为 3次重复的平均值， 每个重复小区面积为 67 m2， 其中种植 12株香蕉 (品种为 "巴西"）。
8、 大田条件下 PSX合剂对水稻纹枯病的防治效果
作为中国最重要的作物之一， 水稻受到了由立枯丝核菌引起的水稻纹枯 病的严重侵害。 我们在安徽省巢湖市庐江县的田间防治试验， PSX 合剂表现 出了比井岗霉素更好的防治效果 （表 9、 图 11 )。 江苏镇江的田间试验也取得 了类似的结果 （图 12)。
表 9 大田条件下 PSX合剂对水稻纹枯病的防治效果 （安徽省庐江县） 病害严重度 （％)
处理 - • 平均值 防效 （％)
I II III
PSX合剂 17.50 15.30 15.67 16.49 ± 1. 11c 81.22 井岗霉素 （20%) 27.43 26.52 25.60 26.51 ±0. 91b 69.81 清水对照 89.20 88.94 85.30 87.81 ±2. 18a -

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂 PS合剂， 含两种细菌成 分： PX35和 SM21， 两个菌株均为芽孢杆菌属 (Bac us spp. ) , 均保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， PX35菌种保藏号为 CGMCC NO. 1930， 保藏日期 2007年 1月 26日； SM21菌种保藏号为 CGMCC NO.2058 , 保藏日期 2007年 5月 24日。 已申请中国专利， 申请号为 200910026822.9， 申请日为 2009年 5月 27日， 申请国际专利优先权。
2、一种防治多种作物土传病害的复合生防菌剂 PSX合剂， 含三种细菌成 分： PX35、 SM21禾卩 XY21， PX35、 SM21两个菌株均为芽孢杆菌属 Bacill spp. )， 均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， PX35菌种 保藏号为 CGMCC NO. 1930， 保藏日期 2007年 1月 26日； SM21菌种保藏号 为 CGMCC NO.2058 ,保藏日期 2007年 5月 24日。XY21为沙雷氏菌属（Serrat/a sp. )， 于 2007年 05月 24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心， 菌种保藏号为 CGMCC NO.2059。
3、 权利要求 1所述的一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂 PS合 剂的制备方法， 已申请中国专利， 申请号为 200910026822.9， 申请日为 2009 年 5月 27日， 申请国际专利优先权。
4、权利要求 2所述的一种防治多种作物土传病害的复合生防菌剂 PSX合 剂的制备方法， 其特征在于，
1 ) 分别将权利要求 2 所述三菌株接种到 PDA培养液中分别培养 37°C 180rpm， 16— 20小时后在超净工作台中分别取样测 600nm处的 OD值， 测定 过程中以未接菌的培养液来调零； 所用 PDA培养液配制方法为： 用 200克土 豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至少煮 20分钟以上， 接着用四层医用 纱布过滤， 滤液加 20克普通蔗糖， 定容至 1000毫升， pH值调至 7.2-7.4， 然 后 121 °C灭菌 20分钟；
2 )当培养至 OD值在 0.5— 0.8之间时， 将种子菌液以 1 : 100体积比加入 PDA培养液中， 30°C 180rpm振荡培养 20— 24小时，然后 4000g离心 10min， 每 1000ml培养液获得 13— 16g湿菌， 每克湿菌含 4 X 101Q— 1015个菌体； 3 ) 分别取湿菌与菌体保藏液按 1 g: 40 ml 配成菌剂， 菌体保藏液为 0.01mol/L磷酸盐缓冲液， 还含有浓度为 0.001mol/L的 Tween20; 再将权利要 求 3所述三菌株菌剂按体积比 1 : 1： 1混合均匀， 得复合生防菌剂 PSX合剂， 成品中活菌总浓度为 1 X 109— 1 X 1012cfu/ml，
5、 权利要求 1或 3所述一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂 PS 合剂在防治温室及大田蔬菜青枯病、 疫病、 和根结线虫土传病害方面的应用。 已申请中国专利， 申请号为 200910026822.9， 申请日为 2009年 5月 27日， 申请国际专利优先权。
6、权利要求 2或 4所述防治多种作物土传病害的复合生防菌剂 PSX合剂 及其活性组成成分在防治温室及大田蔬菜、 香蕉、 水稻等多种作物土传病害 方面的应用。
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