CN104130037B - 一种应用海洋拮抗细菌综合防治香蕉枯萎病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用海洋拮抗细菌综合防治香蕉枯萎病的方法，包括制备抗菌海洋微生物，香蕉袋装苗培育和香蕉苗种植及后期管理。本发明的方法从香蕉生产的整个过程的各个环节进行防治，实现了良好的防治效果。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术领域，特别地，涉及一种应用海洋拮抗细菌综合防治香蕉枯萎病的方法。
背景技术
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E F.Smith)Snyder et Hansen(anamorph)]引起的一种土传病害，该病已经严重到危害亚洲、非洲、南美洲等20多个国家和地区的香蕉产区。在我国广东、福建、海南、广西、台湾、云南部分地区危害相当严重。特别在广东省的番禺、中山、东莞危害非常严重，导致蕉园毁灭，在花都、珠海、肇庆、信宜、湛江等局部地区发生严重，有的地方发病率达96-100％，可使毁灭整个香蕉产业。
香蕉枯萎病是香蕉的癌症，目前还没有一条行之有效的防治方法，抗病品种资源缺乏、化学药物的防治效果非常不理想，而且长期使用化学药物易使病原菌产生抗药性和造成环境污染。很多学者期望寻找新的途径来解决香蕉枯萎病的防治问题，他们主要集中在抗病品种选育与生物防治。在生物防治方面，主要通过筛选拮抗菌用来防治，目前已经筛选出很多菌如哈茨木霉、非致病尖孢镰刀菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌等。
筛选出的菌主要用于防治开发防病菌剂或抗菌微生物肥料，这方面的专利有不少，如下表：
这些主要集中注意在某个菌株、或某种产品上，防治香蕉枯萎病不是在某一个环节就可以防治好的，需要从香蕉生产的整个过程的各个环节进行防治，其中一个环节出问题，都会导致防治措施失败，不管其防病产品的防治效果有多好。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用海洋拮抗细菌综合防治香蕉枯萎病的方法。为实现上述发明目的，本发明拟采用如下技术方案：
本发明涉及一种应用海洋拮抗细菌综合防治香蕉枯萎病的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将农业固体废弃物进行堆沤、无害化处理，粉碎后加入生物防治菌TC-1发酵，进一步深度熟化，得到抗菌海洋微生物基肥，有效微生物的含量大于1×108CFU/g；
(2)培育袋装苗时，在营养土加入18％(W/W)的抗菌海洋微生物基肥，按照香蕉袋装苗培育管理方法进行装袋、排放；瓶苗炼苗后移栽前，在TC-1发酵液中浸泡蕉苗根部5分钟，种植后将发酵液与水混匀，作为定根水进行浇灌。每半个月浇灌一次TC-1发酵液，5-10ml/株，其他后期管理措施，与袋装苗苗床肥水管理培育方法相同；
(3)移栽时，穴施抗菌海洋微生物基肥，每穴施4-6kG；移栽后每株浇灌TC-1发酵液；
(4)成苗后，前3个月每月浇灌TC-1发酵液一次，50-100ml/株，待植株高0.8-1.2m，在水中加发酵菌液淋灌，其余管理措施与香蕉常规种植技术相同。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的TC-1为解淀粉芽孢杆菌。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述的TC-1为保藏编号为CCTCC NO：M2014227的解淀粉芽孢杆菌。
微生物信息
本发明的一个优选实施方式以及具体实施方式中所使用的拮抗海洋细菌TC-1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已经保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2014227，保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年5月25日。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
1、拮抗海洋细菌TC-1的来源与鉴定
通过平板对峙试验，从1800多株海洋微生物中，经过初步和复筛筛选，得到对香蕉枯萎病菌4号小种抑菌效果好，抑菌带宽为22.6mm海洋细菌菌株TC-1，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
2、拮抗海洋细菌TC-1的抑菌谱
TC-1除对香蕉枯萎病菌有很好的抑菌作用外，对其他14种植物病原菌也有抑制效果，其抑菌谱广。
表1 TC-1的抑菌谱
3、拮抗海洋细菌TC-1发酵液的抑菌效果
(1)对香蕉枯萎病菌孢子萌发的抑制
采用凹玻片法，测定了经稀释40倍后的无菌发酵液对香蕉枯萎病菌4号小种的分生孢子的抑制作用，其对香蕉枯萎病菌的孢子萌发有很好的抑制效果，孢子萌发抑菌率达92.5％。
(2)对香蕉枯萎菌生长的抑制
TC-1菌株的不同稀释倍数无菌发酵液对香蕉枯萎菌生长都有明显的抑制作用，50倍稀释液的抑菌率为57.8％。
4、抑菌机制
TC-1抑制孢子萌发，使孢子发生变形，孢子两端变钝圆或成哑铃状；使萌发孢子的芽管尖端膨大成泡状崩解，使孢子的细胞壁发生破裂。
抑制菌丝，使菌丝生长不正常，导致菌丝顶端及中间变成囊泡状，菌丝不规则扭曲、断裂，大量菌丝成串珠状，有的菌丝细胞内含物渗出，原生质外流，变成空泡。
5、抑菌物质
从TC-1发酵液中分离得到了蛋白类和脂肽类抗菌活性物质，在PDA平板上均形成明显的抑菌圈。
一、应用TC-1综合防治香蕉枯萎病技术体系
1、拮抗菌发酵液制备技术
将从海洋中筛选到的对香蕉枯萎病菌有很好抑制作用的拮抗芽孢杆菌(TC-1)菌种在BDPA培养基(马铃薯200g，牛肉膏20g，葡萄糖20g，琼脂15-18g，蒸馏水1000mL，pH自然)活化后，挑取TC-1用无菌水稀释得到106～107CFU/ml的菌液。取菌液按1％接种量接种到发酵培养液内发酵3天，可得OD值为2.0左右，菌体含量为1×109-1×1010CFU/ml的发酵液。
2、抗菌海洋微生物基肥制备技术：
将农业固体废弃物进行堆沤、无害化处理，粉碎后加入生物防治菌TC-1发酵，进一步深度熟化，得到抗菌海洋微生物微生物基肥，有效微生物的含量大于1×108CFU/g。
3、香蕉袋装苗培育技术
培育袋装苗时，在营养土加入18％(W/W)的抗菌微生物肥料，按照香蕉袋装苗培育管理方法进行装袋、排放。瓶苗炼苗后移栽前，在TC-1发酵液中浸泡蕉苗根部5分钟，种植后将发酵液与水混匀，作为定根水进行浇灌。每半个月浇灌一次TC-1发酵液，5-10ml/株，其他后期管理措施，与袋装苗苗床肥水管理培育方法相同。
通过试验，分别为：1)不接生防菌和香蕉枯萎病菌；2)先浇灌200ml浓度为1.0×107cfu/ml的TC-1发酵液，7天后再次浇灌相同量的TC-1发酵液；3)先浇灌200ml浓度为1.0×107cfu/ml的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，7天后再浇灌相同量的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液；4)先浇灌200ml浓度为1.0×107cfu/ml的TC-1发酵液，7天后再浇灌200ml浓度为1.0×107cfu/ml的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液；5)先浇灌200ml浓度为1.0×107cfu/ml的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，7天后再浇灌200ml浓度为1.0×107cfu/ml的TC-1发酵液。
TC-1发酵液含有丰富的氨基酸等营养成分，也含有多种抗菌物质，在苗期使用拮菌菌液以及抗菌微生物肥有两个方面的作用：(1)促进香蕉苗的生长，增强植株抗逆性；(2)使拮抗菌在苗期开始定植在香蕉苗体内，提高苗的质量；(3)由于现市场销售的苗有部分带菌，主要是由于营养土带菌的原因，在袋装苗培育阶段使用拮抗菌发酵液以及抗菌肥料，大大降低了袋装苗被 香蕉枯萎病菌侵染的几率。
TC-1可以在植株体内很好的定殖，并且从根部逐渐向叶部移动。在没有病原菌存在时，维持在较低水平，可与香蕉苗形成共生状态，并且可以阻止病原菌入侵；当有病原菌存在时，可以迅速增长，灭杀病原菌，达到防病目的，待病原菌数量减少时，又可以降低含量，维持降低水平。
通过应用TC-1处理后，出苗时，病原菌的检出率为0。
4、香蕉苗种植及后期管理技术
移栽时，穴施TC-1抗菌微生物基肥，每穴施5kG。移栽后每株浇灌发酵菌液50ml。
成苗后，前3个月每月浇灌发酵液一次，50-100ml/株，待植株高1m左右，在水中加发酵菌液(水∶菌液为1000∶1)淋灌，其余管理措施与香蕉常规种植技术相同。
将Tc-1发酵液用有机质载体混匀后制成的抗菌海洋微生物肥料应用于香蕉的栽培。试验设计如下：
处理1：将农业固体废弃物加TC-1菌液堆沤进行固体发酵，腐熟后干燥，再与TC-1菌液混匀制成的抗菌有机肥作为基肥，每株施5kg作为定植基肥，移栽后，浇注菌液200ml。
处理2：将农业固体废弃物加TC-1菌液堆沤进行固体发酵，腐熟后干燥作为基肥，每株施5kg作为定植基肥，移栽后，不浇注菌液。
处理3：将农业固体废弃物直接堆沤进行固体发酵，腐熟后干燥作为基肥，每株施5kg作为定植基肥，移栽后，浇注菌液200ml。
处理4：将农业固体废弃物直接堆沤进行固体发酵，腐熟后干燥作为基肥，每株施5kg作为定植基肥，移栽后，不浇注菌液。四个月后调查发病情况。
处理5：不做任何处理，按常规种植方法管理，即试验地周围农户种植的香蕉，此处理作为对照。
防病效果：
| 处理 | 株数 | 发病株数 | 发病率(％) | 防效(％) |
| TC-1与农业固体废弃物堆沤+菌液浇注 | 85 | 3 | 3.53 | 91.15 |
| TC-1与农业固体废弃物堆沤+无菌液浇注 | 89 | 5 | 5.62 | 85.92 |
| 农业固体废弃物直接堆沤+菌液浇注 | 84 | 15 | 17.86 | 55.23 |
| 农业固体废弃物直接堆沤+无菌液浇注 | 82 | 16 | 19.51 | 51.08 |
| CK(周边田间病害调查) | 356 | 142 | 39.89 | -- |
海洋拮抗菌TC-1对可诱导香蕉抵抗香蕉枯萎病菌的侵染，盆栽试验表明，不对香蕉苗浇灌TC-1也不接种香蕉枯萎病菌、仅浇灌TC-1、仅接种病原菌和既浇灌TC-1又接种病原菌等4种处理后，测定并比较不同处理的香蕉苗体内5种防御酶活性的差异，探讨生防菌的诱导抗病作用。在未接种香蕉枯萎病菌时，海洋细菌TC-1处理的香蕉苗与未处理的5种防御酶活性没有显著差异(P＞0.05)。在接种香蕉枯萎病菌时，用TC-1处理与未处理的对照相比，香蕉苗防御酶活性有显著提高：浇灌TC-1菌液6天后，过氧化物酶和多酚氧化酶活性分别提高了248％和12％；9天后，苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶活性分别提高了16％和10％；12天后，过氧化氢酶活性提高了363％。因此菌株TC-1可诱导提高香蕉植株CAT、POD、PPO、PAL、SOD5种防御酶活性抵抗香蕉枯萎病菌的侵染。在进行田间试验时，采用TC-1抗菌微生物基肥与发酵液淋灌，最有利于植株抗病，防病效果可达91.15％。
在自然界，香蕉枯萎病菌侵染多在幼苗移栽期，这时由于香蕉苗根在移栽时受到损伤，非常容易遭受病原菌的侵染，通过使用TC-1抗菌微生物基肥以及浇灌TC-1发酵液，实现在移栽期架设三道防线阻隔病原菌入侵。移栽时用抗菌肥作为基肥，抗菌肥中的TC-1可以抑制香蕉枯萎病菌对香蕉苗的侵染，将香蕉植株与病原菌进行物理隔离；用TC-1堆沤的有机肥及发酵液可以促进香蕉植株的生长和免疫里，达到防病效果；在香蕉苗体内定殖的拮抗菌可诱导植株产生防御酶抵抗病菌的入侵。
总体讲：就是在现有的香蕉栽培技术体系下，将拮抗海洋细菌TC-1应用在各个环节。特别是袋装苗防范病原菌侵染(香蕉枯萎病在苗期被侵染，并产 生症状，这个是技术关键)和移栽时通过拮抗菌阻隔减少病原菌侵染的机会是本技术的两个关键部分。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种应用海洋拮抗细菌综合防治香蕉枯萎病的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将农业固体废弃物进行堆沤、无害化处理，粉碎后加入生物防治菌TC-1发酵，所述的TC-1为保藏编号为CCTCC NO：M 2014227的解淀粉芽孢杆菌，进一步深度熟化，得到抗菌海洋微生物基肥，有效微生物的含量大于1×108CFU/g；
将TC-1菌种在BDPA培养基中活化后，挑取TC-1用无菌水稀释得到106～107CFU/ml的菌液，取菌液按1％接种量接种到发酵培养液内发酵3天，可得OD值为2.0左右，菌体含量为1×109-1×1010CFU/ml的发酵液；所述的BDPA培养基组成为：马铃薯200g，牛肉膏20g，葡萄糖20g，琼脂15-18g，蒸馏水1000mL，pH自然；
(2)培育袋装苗时，在营养土加入18％(W/W)的抗菌海洋微生物基肥，按照香蕉袋装苗培育管理方法进行装袋、排放；瓶苗炼苗后移栽前，在TC-1发酵液中浸泡蕉苗根部5分钟，种植后将发酵液与水混匀，作为定根水进行浇灌，每半个月浇灌一次TC-1发酵液，5-10ml/株，其他后期管理措施，与袋装苗苗床肥水管理培育方法相同；
(3)移栽时，穴施抗菌海洋微生物基肥，每穴施4-6kG；移栽后每株浇灌TC-1发酵液；
(4)成苗后，前3个月每月浇灌TC-1发酵液一次，50-100ml/株，待植株高0.8-1.2m，在水中加发酵菌液淋灌，其余管理措施与香蕉常规种植技术相同。
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