CN101423507A - 杨树抗菌化合物的制备及作为杀菌剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及杨树抗菌化合物的制备及作为杀菌剂的应用。本发明所述的抗菌化合物是从欧美107杨树枝条中追踪分离出来的，经结构解析分别为：对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯、5－羟基－7－甲氧基黄酮、5，7－二羟基黄酮、5，7－二羟基黄酮醇。本发明首次明确了黄酮类化合物是杨树中的主要抗菌活性成分，同时明确了欧美107杨树提取物及其抗菌成分对多种植物病原菌具有明显的抑制活性，可用于植物病害防治。
Description
技术领域
本发明涉及杨树具抗菌活性化合物的制备、化合物的结构鉴定及其抗菌活性，属于农药技术领域。
背景技术
杨树(Populus spp.)是杨柳科(Salicaceae)杨属植物的统称。中国有杨树60余种，此外还有很多变种和引种的品种，主要分布在北方和西南地区，遍及全国，资源丰富，是中国绿化、造林的主要树种。杨树具有抗旱、耐寒、生长快、轮伐期短、纤维品质高等特点，在防风固沙、环境保护、水土保持、农田改良等方面起着十分重要的作用，在工业和生活上具有多种用途。同时，杨树还具有抗菌、消炎、镇痛等多种药理作用。在民间，杨树可用来治疗风湿、高血压等疾病。迄今为止，已从杨树植物中分离到黄酮、有机酸、三萜等多种化学成分。
植物抗菌化合物(plant antimicrobial compounds)是一类由植物产生的具抗菌活性的化合物，包括组成性抗菌化合物和诱导性抗菌化合物。迄今，尚未见从杨树中追踪分离抗菌化合物的报道。
本发明着重于欧美107杨树枝条抗菌化合物的制备。欧美107杨为意大利杨树栽培研究所Sekawin博士于1973年春人工控制杂交选育的欧美杨品种，系欧洲黑杨(Populus nigra Linn.)和美洲黑杨(Populusdeltoides Marsh.)的杂交种，1984年引入到中国，编号为84-I-74，在国际杨树委员会登录注册品种种加词为Neva，命名为Pupulus×canadensis Moench′Neva′。本发明同时测定了欧美107杨树化合物对植物病原细菌和病原真菌的抑制活性，为新型植物源杀菌剂的研究与开发，杨树资源的有效利用提供依据。
为了保护环境，保护人类及农业的可持续发展，急需进行高效、低毒、低残留的环境相容型农药的研制。本发明的目的之一是提供杨树抗菌化合物的制备方法；另一个目的是提供杨树抗菌化合物作为高效抗菌剂的例子。
发明内容
本发明涉及用于抑制植物病原菌的杨树抗菌化合物及其制备方法，提供如下的技术方法。
1、杨树乙醇粗提物以及不同极性提取物的制备
取欧美107杨树枝条，室内晾干，粉碎，用95％乙醇提取，减压浓缩得乙醇粗提物(得率为6.76％)。将乙醇粗提物用蒸馏水加热溶解制成混悬液，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，将乙酸乙酯层、正丁醇层，以及剩余的水层减压浓缩，分别得乙酸乙酯部分(得率为4.21％)、正丁醇部分(得率为1.34％)和水部分(得率为1.05％)。
2、杨树抗菌化合物的追踪分离特征
取欧美107杨树枝条，室内晾干，粉碎，经95％乙醇提取，乙醇粗提物用水混悬，然后用乙酸乙酯和正丁醇萃取，获得具有较好抗菌活性的乙酸乙酯萃取部分，反复进行常压正相硅胶柱层析、常压反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、中压正相或反相硅胶柱层析，得4个抗菌化合物。
3、杨树抗菌化合物的结构特征
追踪分离得到的4个抗菌化合物，经结构解析，分别为：对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯(1)、5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)、5，7-二羟基黄酮(3)、5，7-二羟基黄酮醇(4)。
4、杨树粗提物以及不同极性提取物的抗菌活性特征
采用带毒平板菌丝生长扩展法测定，欧美107杨树枝条乙醇粗提物及不同极性提取物对植物病原真菌和细菌均表现出一定的抗菌活性，尤其是对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)等菌丝生长表现出较强的抑制作用。不同极性提取物中，以乙酸乙酯萃取部分的抗菌活性最强。采用薄层层析-生物自显影-MTT法测定，欧美107杨树枝条乙醇粗提物和乙酸乙酯萃取部分对番茄疮痂病菌和番茄青枯病菌均表现出一定的抑制活性。
5、杨树抗菌化合物的抗菌活性特征
从欧美107杨树枝条中追踪分离的4个抗菌活性成分对稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)孢子萌发、植物病原细菌：黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)的生长均表现出一定的抑制活性。
本发明的优点：本发明首次明确了欧美107杨树枝条中具有广谱的抗植物病原菌活性的成分，其中的黄酮类成分是欧美107杨树的主要抗菌活性成分。本发明的目的是利用杨树资源，以求获得抗菌活性成分，为植物源农药的研究与开发，为探讨植物抗菌化合物的生理生态功能提供依据。
为了更好地理解本发明，下面结合本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
具体实施方式
实施例1：杨树不同极性提取物的小规模制备
取欧美107杨树枝条，在室内晾干，粉粹，取900g，用95％乙醇(样品:乙醇＝1:5，g/mL)于80℃下回流提取3次，每次1h，合并3次乙醇提取液，减压浓缩得乙醇粗提物(60.81g，得率为6.76％)。取乙醇粗提物52.93g，用蒸馏水加热溶解制成混悬液，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，将乙酸乙酯层、正丁醇层、最后剩余的水层减压浓缩，分别得乙酸乙酯部分(32.95g，得率为4.21％)、正丁醇部分(10.53g，得率为1.34％)和水部分(8.21g，得率为1.05％)。
实施例2：杨树抗菌化合物的追踪分离与制备
取欧美107杨树枝条，室内晾干，粉碎，取5.79kg，用95％乙醇(样品:乙醇＝1:5，g/mL)于80℃下回流提取3次，每次1h，合并3次乙醇提取液，减压浓缩得乙醇粗提物(430.16g)。取乙醇粗提物420.00g，用蒸馏水加热溶解制成混悬液，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，将乙酸乙酯层、正丁醇层、最后剩余的水层减压浓缩，分别得乙酸乙酯部分(236.32g)、正丁醇部分(135.70g)和水部分(46.23g)。对具有较好抗菌活性的乙酸乙酯萃取部分进一步进行活性成分的追踪分离，反复进行常压正相或反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、中压正相或反相硅胶柱层析，得4个抗菌化合物，得率分别为：化合物1为80mg；化合物2为20mg；化合物3为15mg；化合物4为8mg。
实施例3：对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯(1)的结构鉴定
按实施例2所述的方法制备到一白色粉末(氯仿)，用石油醚:丙酮(2:1，v/v)系统进行正相硅胶板展开后，在254nm紫外光下可见单一的暗斑(Rf＝0.70)，硫酸显色剂显暗黄色斑点。
1H NMR(CDCl3，300MHz)，芳香区δ：7.63ppm(1H，d，J＝15.96Hz)和6.30ppm(1H，d，J＝15.96Hz)的信号说明分子中存在一个反式双键；δ：7.43ppm(2H，m)和6.83ppm(2H，m)说明分子中存在一个对位取代的苯环；在δ：5.22ppm(1H，brs)处的宽单峰说明苯环中有一个羟基取代，13C NMR(CDCl3，75MHz)，δ：157.5ppm的信号也验证了苯环中有一个羟基取代；1H NMR高场区的质子信号δ：4.19ppm(2H，t，J＝6.75Hz)说明分子中存在一个与氧原子和一个亚甲基相连的亚甲基；δ：1.67ppm(2H，m)、1.25ppm(约52个H，m)和0.88ppm(3H，t，J＝6.48Hz)说明分子中存在着长链脂肪烷醇。13CNMR数据，δ：167.5ppm说明分子中存在有羧基基团，因此此物质可以鉴定为对羟基肉桂酸酯。13CNMR数据：δ：144.2ppm和115.8ppm可归属为对羟基肉桂酸的反式双键碳信号；δ：157.5ppm、129.9ppm、127.5ppm、115.9ppm为对位取代的苯环信号；δ：64.7ppm为长链烷醇与氧相连的碳，δ：31.9ppm、29.7ppm、28.8ppm、26.0ppm、22.7ppm、14.1ppm可以归属为长链烷醇的碳信号；从1H NMR谱图中长链烷烃质子信号δ：1.25ppm出现多重峰，以及13C NMR谱图中δ：29.7ppm的谱线变宽，说明化合物1可能为一系列不同长度的烷基酯混合物。
EI-MS给出了m/z：472、486、500、528、542、556、570、584等一系列的信号，说明化合物1烷基的长度分别为C22、C23、C24、C26、C27、C28、C29、C30。
将化合物1的波谱数据与文献[(1)李满飞等。流苏石斛化学成分的研究。中草药，1992，23(5)：227-228；(2)裴月湖等。仙鹤草根芽中新异香豆精甙的结构研究。药学学报，1989，24(11)：837-840；(3)Fang S-C，et al..Isoprenylated flavonols of formosan Broussonetia payrifera.Phytochemistry，1995，38(2)：535-537。]进行对照，基本一致，所以化合物1被鉴定为长链烷基(C22～24，C26～30)-对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯(Alkyl-p-hydroxy-trans-cinnamates)。化合物1碳谱和氢谱数据见表1，结构式如下：
表1 化合物1的1HNMR和13CNMR的化学位移(δ，ppm)数据
a溶剂为CDCl3。
实施例4：5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)的结构鉴定
按实施例2所述的方法制备到一黄色片状结晶(氯仿)，mp.161-162℃；用石油醚:丙酮(2:1，v/v)系统进行正相硅胶板展开后，在可见光下可见一黄色斑点(Rf＝0.68)；EI-MS m/z：268[M]+，结合NMR数据，确定其分子式为C16H12O4；1HNMR谱(CDCl3，300MHz)，芳香区δ：6.38ppm(1H，d，J＝2.25Hz)、6.50ppm(1H，d，J＝2.26Hz)，可归属为两个苯环间位取代的质子；δ：7.89ppm(2H，m)、7.52ppm(3H，m)，可归属为单取代苯环上的5个质子；δ：6.67ppm(1H，s)，为黄酮类化合物3位特征性的质子信号；从芳香区信号分析可以初步判断化合物2为一个在A环上具有间位取代的黄酮类化合物；在最低场δ：12.71ppm(1H，s)处有一可归属为活泼质子的氢信号，可以判断此化合物在5位具有一个与4位羰基相耦合的羟基质子；在δ：3.89ppm(3H，s)处给出一个与氧原子相连的甲基信号，说明在7位有一个甲氧基取代。将化合物2的理化数据和波谱数据与文献[(1)周立东等。北京蜂胶的黄酮类成分。1999，24(3)：162-164；(2)Park Y，et al..Spectral assignments and reference data complete assignments of NMR data of 13hydroxymethoxyflavones.Magnetic Resonance in Chemistry，2007，45(12)：1072-1075.]比较，基本一致，确定化合物2为5-羟基-7-甲氧基黄酮(5-Hydroxy-7-methoxy-flavone)，又称为柚木杨素(Tectochrysin)。化合物2碳谱和氢谱数据见表2，结构式如下：
表2 化合物2的1HNMR和13C NMR的化学位移(δ，ppm)数据
a溶剂为CDCl3。
实施例5：5，7-二羟基黄酮(3)的制备和结构鉴定
按实施例2所述的方法制备到一黄色粉末(丙酮)，mp.270-272℃；用石油醚:丙酮(2:1，v/v)系统进行正相硅胶板展开后，在可见光下可见一黄色斑点(Rf＝0.63)；1H NMR谱(C5D5N，300MHz)，芳香区δ：6.75ppm(1H，d，J＝2.1Hz)和6.80ppm(1H，d，J＝2.1Hz)，可归属为两个苯环间位取代的质子；δ：7.45ppm(3H，m)和7.92ppm(2H，m)，可归属为单取代苯环上的5个质子；δ：6.97ppm(1H，s)，为黄酮类化合物3位特征性的质子信号；在低场δ：13.56ppm(1H，s)处的单一质子信号可归属为5位羟基质子；7位羟基峰消失是由于所用氘代试剂中活泼质子将其取代所致。将化合物3的理化数据和波谱数据与文献[(1)周珊等。山杨的化学成分研究。2002，14(5)：43-45；(2)Popova V，et al..Chrysin and its derivativesin plants of the genus Scutellaria.Chemistry of Natural Compounds，1976，12(6)：656-660.]比较，基本一致，确定化合物3为5，7-二羟基黄酮(5，7-Dihydoxyflavone)，又称为柯因(Chrysin)。化合物3的氢谱数据见表3，结构式如下：
表3 化合物3的1HNMR的化学位移(δ，ppm)数据
a溶剂为C5D5N。
实施例6：5，7-二羟基黄酮醇(4)的制备和结构鉴定
按实施例2所述的方法制备到一黄色针状结晶(丙酮)，mp.213-215℃；用石油醚:丙酮(2:1，v/v)系统进行正相硅胶板展开后，在可见光下可见一黄色斑点(Rf＝0.57)；1H NMR谱(Acetone-d6，300MHz)，芳香区δ：6.29ppm(1H，d，J＝2.04Hz)和6.56ppm(1H，d，J＝2.04Hz)可归属为两个苯环间位取代的质子信号；δ：7.54ppm(3H，m)和8.24ppm(2H，m)可归属为单取代苯环上的5个质子信号；在低场δ：12.09ppm单一质子信号归属为5位羟基质子：3位和7位羟基峰消失是由于所用氘代试剂中活泼质子将其取代所致。将化合物4的理化数据和波谱数据与文献[(1)周珊等。山杨的化学成分研究。2002，14(5)：43-45；(2)Facundo VA and SM Morais SM.Constituents of Piper aleyreanum(Piperaceae).Biochemical Systematics andEcology，2003，31：111-113.]比较，基本一致，确定化合物4为5，7-二羟基黄酮醇(5，7-dihydroxy flavonol)，又称为高良姜精(Galangin)。化合物4氢谱数据见表4，结构式如下：
表4 化合物4的1HNMR的化学位移(δ，ppm)数据
a溶剂为Acetone-d6。
实施例7：杨树粗提物以及不同极性提取物对细菌生长的抑制活性
(1)TLC板的制作：10cm×10cm玻璃板，薄层层析硅胶(GF254)：0.3％羧甲基纤维素钠溶液＝1.0：2.5(g/mL)。称取一定量的薄层层析硅胶(GF254)倒入研钵中，按照比例向研钵中加入定量的羧甲基纤维素钠溶液，接着按照一定方向(如顺时针)研磨至均匀粘稠液。然后用勺子取适量研磨好的硅胶液铺至玻璃板上，轻轻振动，使其均匀一致，隔夜，待水分挥发，硅胶与玻璃板结合。最后将制备好的薄层板置于100-110℃烘箱中烘烤活化1h，待自然冷却后即可。
(2)样品的准备：用分析天平称取一定量(待检测提取物)的样品，转入西林瓶中，向其中加入一定量的有机溶剂(甲醇)，然后用超声助溶，完全溶解即可。
(3)点样：用点样毛细管(内径：0.5mm)吸取一定量的样品溶液，点在薄层板上，点样要均匀(少量多次)，每个点的直径约为5mm为宜，相邻两点之间的距离大于或等于1cm(防止扩散干扰)，溶剂用电吹风或让其自然挥干即可。
(4)培养基：LB琼脂培养基和LB液体培养基。LB琼脂培养基配方如下：每升培养基中含氯化钠5g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂15g。LB液体培养基配方除不加琼脂外，同于LB琼脂培养基的配方。
(5)供试细菌的准备：活性测定的细菌菌株有黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans)、番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)。上述供试细菌长期保存在4℃下。在活性测定前，需要在LB培养基平板上对供试细菌进行活化培养(28℃，暗)48h，然后挑取单菌落，接种于25mL LB液体培养基中，置于恒温振荡摇床中(28℃，150rpm)，培养24h，菌的浓度一般应为109cfu/mL，即可用于活性测定。
(6)加菌及培养：往LB琼脂培养基(琼脂浓度为0.3％)中加入一定量准备好的菌液(45mL LB+5mL菌液，将其浓度调至约108CFU/mL，振荡、均匀。接着用无菌枪头吸取该菌液加到TLC板上，轻轻振动，使其均匀一致。待其凝固后，将该板放入培养皿中(四层吸水纸加入适量无菌水，以便保湿培养)，转入4℃冰箱中放置2h(有助于化合物的扩散)，然后将其转入恒温培养箱中(28℃)培养12-16h即可。
(7)MTT显色：取出培养好的TLC板后，向其上面喷入适量的0.5mg/mL的MTT溶液，约10min左右，即可根据板上颜色和抑菌圈的大小来判断样品对供试菌抗菌活性能力的大小。
(8)结果观察：发现欧美107枝条的乙醇提取物及乙酸乙酯萃取部分对三种供试细菌的生长均有一定的抑制活性。
实施例8：杨树粗提物以及不同极性提取物对真菌菌丝生长的抑制活性
(1)配制马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：配制1L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar，PDA)的步骤为：将洗净去皮的马铃薯200g，切成小块，加去离子水1000mL，煮沸30min，过滤，取滤液，加琼脂20g和葡萄糖20g，加热使琼脂融化后，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。121℃湿热灭菌20min。
(2)供试的植物病原真菌：番茄早疫病菌(Alternaria solani)、玉米弯孢(Curvularia lunata)、杨树溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)。上述病原真菌长期保存在4℃石蜡油中，在活性测定前，需要在PDA平板上对供试真菌进行活化培养(28℃，暗)1-2代。
(3)带毒培养基的制备：针对不同的病原菌，溶解提取物或萃取部分的有机溶剂不同。针对小麦纹枯病菌、番茄早疫病菌、番茄枯萎病菌，用丙酮溶解；针对小麦赤霉病菌、玉米弯孢、杨树溃疡病菌，用乙醇溶解；针对棉花枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌，用二甲基亚砜溶解。在PDA培养基未凝固前(约50℃)，将供试样液1mL加入到100mL培养基中，使供试样品在培养基中的浓度为0.00mg/mL和2.00mg/mL，摇匀后迅速倒入培养皿(Φ＝90mm)中，每皿15mL，放置待其凝固后待用。
由于乙醇粗提物对小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌菌丝生长具有较好的抑制作用，故选用上述三种真菌为选供试菌，测定枝条和叶不同极性萃取部分对真菌菌丝生长的抑制作用，选取合适的溶剂溶解样品，在PDA培养基未凝固前(约50℃)，将供试样液1mL加入到100mL培养基中，使供试样品在培养基中的浓度分别为0.00mg/mL、0.25mg/mL、1.00mg/mL、2.00mg/mL，摇匀后迅速倒入培养皿(Φ＝90mm)中，每皿15mL，放置待其凝固后待用。
实验设空白对照和阳性对照(10μg/mL多菌灵)，每个处理三个重复。
(4)制备菌饼：制备菌饼应在无菌条件下进行，用打孔器(Φ＝5mm)在培养好的菌落外缘切下带菌培养基柱-菌饼。这种来自菌落外缘的菌饼接在新鲜培养基上的生长速率的差异较小。
(5)移植菌饼：用接种针或消毒的摄子将菌饼反面(有菌丝的一面向下和培养基贴合)移植到带毒培养基上，一个培养皿中央接一个菌饼。
(6)结果观察和数据处理：待空白对照菌落接近培养皿边缘时观察结果，取出培养皿用卡尺测量菌落直径，每个菌落采用十字交叉法测两次直径。用下述公式计算抑制率(计算抑制率时用溶剂作对照)：
菌落扩展直径(mm)＝测量菌落的平均扩展直径(mm)-5(菌饼直径mm)
试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据处理。
采用菌丝生长速率抑制法测定欧美107杨树枝条乙醇粗提物对番茄早疫病菌、玉米弯孢、杨树溃疡病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、小麦纹枯病菌等8种植物病原真菌的抑制作用(结果见表5)，其中对小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌表现具有较好的抑制作用。
表5 欧美107杨树枝条乙醇粗提物对真菌菌丝生长的抑制作用
注：杨树枝条乙醇粗提物、多菌灵浓度分别为2.00mg/mL和10.00μg/mL。
由于乙醇粗提物对小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌菌丝生长具有较好的抑制作用，故选用上述三种真菌为供试菌，测定杨树乙醇粗提物及其不同极性萃取部分在不同浓度下对真菌菌丝生长的抑制作用，结果见表6。乙酸乙酯萃取部分抗菌活性最强，且具有较好的量效关系，浓度为2.00mg/mL时，对小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌菌丝生长的抑制率分别为41.29％、29.10％和29.93％，正丁醇萃取部分活性次之，水层部分活性最低。
表6 欧美107杨树枝条乙醇粗提物和各萃取部分对真菌菌丝生长的抑制作用
注：多菌灵浓度分别为10.00μg/mL，对供试真菌菌丝生长的抑制率为100％。
实施例9：对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯(1)对稻瘟菌孢子萌发的抑制活性
(1)培养基：采用燕麦西红柿培养基(Oat-tomato agar medium，OTA)。配制1L的燕麦西红柿培养基的步骤为：将成熟的西红柿切碎，用榨汁机榨汁，汁液用四层纱布过滤，取已过滤的汁液150mL待用。同时，称取燕麦片30g，加入1000mL去离子水，煮沸30min，注意边煮边搅拌。煮好的燕麦片用两层纱布过滤。收集滤液，然后往滤液中加入已准备好的番茄汁150mL和20g琼脂，加热融化，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。分装后121℃湿热灭菌20min。该培养基用于稻瘟菌的培养。
(2)供试的植物病原真菌：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)。
(3)稻瘟菌活化培养：用灭菌的接种针从保存菌种的试管中挑取少量菌丝，接种到燕麦番茄汁培养基平板上，用封口膜封好，25℃下培养。
(4)稻瘟菌继代培养：倒燕麦番茄汁培养基平板，每皿倒培养基约40mL。用移液枪在稻瘟菌菌落中央滴加无菌水1mL，然后用灭菌后的接种针轻轻擦洗菌落表面，注意用力要轻，以免擦破培养基表面。待无菌水变浑浊后，再用移液枪吸取100μL滴加到倒好的燕麦番茄汁培养基平板表面，然后用玻璃涂棒将其涂散均匀。待培养基表面水分挥干后，盖好倒置25℃下培养。
(5)机械刺激诱导产孢：接种活化的稻瘟菌室温下培养48h后，在其表面滴加无菌水约3mL，然后用灭菌后的棉签轻轻擦洗菌丝，将菌丝机械擦断，连续擦洗两次，待灰色菌落变为黑色后即可，将表面的水倒掉，然后倒扣于灭菌后的吸水纸上，晾干水分，用三层灭菌后的纱布将皿口封住，置于干燥有光的条件下培养48h后，诱导产孢，即可得到稻瘟菌孢子。
(6)配制化合物母液：称取待测化合物1.00mg到Eppendorf管中，加入乙醇溶解，配成2mg/mL的母液，然后稀释成含20％乙醇的母液浓度梯度：400μg/mL、300μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL。
阳性对照采用多菌灵(Aldrich)，称取多菌灵1.0mg到Eppendorf管中，向其中加入纯乙醇溶液1.0mL，振荡溶解，得到1.0mg/mL的多菌灵母液。然后将多菌灵母液配制成系列浓度为30μg/mL、20μg/mL、16μg/mL、10μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL，溶剂为20％乙醇的溶液。
(7)配制孢子悬浮液：在机械诱导产孢好的平板上滴加无菌水3.0mL，然后用无菌棉签轻轻擦洗菌落表面，洗下孢子，将孢子洗液装到1.0mL的离心管中，离心3次(离心力8000g，每次离心10min)。然后配制孢子悬液，利用血球记数板测定孢子浓度，将孢子浓度配制为2×106个/mL。
(8)进行活性测定：准备洁净培养皿，然后在每个培养皿中放上四层吸水纸，进行灭菌。灭菌后，往每皿中加无菌水5.0mL，使吸水纸湿润，在吸水纸上平行放置两根无菌牙签。另准备好凹玻片，用75％的乙醇浸泡24h，然后晾干。在每个凹洞上滴加25μL配制好的稻瘟菌孢子悬浮液(2×106个/mL)和25μL系列浓度梯度的待测化合物溶液(滴加前应在振荡器上充分振荡，以保证孢子悬浮液和药剂溶液充分混匀)，这样得到对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯的检测终浓度分别为：200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL。而阳性对照的检测终浓度分别为：15μg/mL、10μg/mL、8μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。同时设空白对照和溶剂对照(10％乙醇)，每个处理3个重复。然后将凹玻片放在培养皿中的牙签上，室温下培养7h后进行观察孢子的萌发情形。
(9)观察记录实验结果和孢子萌发率的计算
在显微镜10×10(目镜×物镜)倍下观测每一凹玻片上的孢子萌发情况，选择3个不同的视野，每个视野中100个以上孢子，共数3个视野(即：300个孢子)，用计数器记下萌发的孢子数，计算孢子萌发率(％)。
(10)数据处理和半抑制浓度的计算
试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度取对数(X)，抑制率换算成生物统计机率值(Y)，求得抑制活性回归方程(Y＝aX+b)，从而可以求得半抑制浓度(IC50)。实验设空白对照和溶剂对照(10％乙醇，v/v)，每个处理3个重复。
(11)实验结果
对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯(1)在浓度为200μg/mL时，对稻瘟菌孢子萌发的抑制率为20.88％，抑制作用相对较弱。阳性对照多菌灵对稻瘟菌孢子萌发半抑制浓度(IC50)为2.11μg/mL。
实施例10：5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)对稻瘟菌孢子萌发的抑制活性
(1)培养基：同实施例9。
(2)供试的植物病原真菌：同实施例9。
(3)稻瘟菌活化培养：同实施例9。
(4)稻瘟菌继代培养：同实施例9。
(5)机械刺激诱导产孢：同实施例9。
(6)配制化合物母液：同实施例9。
(7)配制孢子悬浮液：同实施例9。
(8)进行活性测定：同实施例9。
(9)观察记录实验结果和孢子萌发率的计算：同实施例9。
(10)数据处理和半抑制浓度的计算：同实施例9。
(11)实验结果：5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)对稻瘟菌孢子萌发的回归方程为Y＝3.6042X-1.3143，由“反应率-几率值转换值表”可以查得，当抑制率几率值Y＝5时，所对应的抑制率为50％，此时可以通过回归方程求出X＝1.7519，再求X的反对数，得出浓度值为56.48μg/mL，此浓度值即为抑制中浓度(IC50)。所以5-羟基-7-甲氧基黄酮对稻瘟菌孢子萌发半抑制浓度(IC50)为56.48μg/mL。阳性对照多菌灵对稻瘟菌孢子萌发的IC50为2.11μg/mL。
实施例11：5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)对植物病原细菌的最低抑制浓度
(1)培养基：LB琼脂培养基和LB液体培养基。LB琼脂培养基配方如下：每升培养基中含氯化钠5g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂15g。LB液体培养基配方除不加琼脂外，同于LB琼脂培养基配方。
(2)供试的植物病原细菌：黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans)、番茄青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)。上述供试细菌长期保存在4℃下。在活性测定前，需要在LB平板上对供试细菌进行活化培养(28℃，暗)48h，然后挑取单菌落，接种于25mL LB液体培养基中，置于恒温振荡摇床中(28℃，150rpm)，培养24h，菌的浓度一般应为109cfu/mL，即可用于活性测定。
(3)测试样品母液的配制：取3mg单体化合物溶于1mL 20％的乙醇中，配成3mg/mL的药液，然后，取500μL 3mg/mL药液，用20％的乙醇溶液将其稀释，配得浓度分别为：3000μg/mL、2500μg/mL、2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、300μg/mL、250μg/mL、200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL。
阳性对照选用硫酸链霉素(SERVA公司产品)，其母液浓度分别为：1000μg/mL、800μg/mL、600μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL的溶液。
MTT用pH 7.20.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS)配制成5mg/mL的溶液，过滤除菌待用。
(4)最低抑制浓度的测定：采用多孔板-MTT显色法测定其最低抑制浓度(MIC)。具体操作步骤如下：在洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为106cfu/mL的供试菌液90μL，不同浓度梯度的测试样品母液10μL，溶剂(乙醇)终浓度为2.0％。同时设空白对照和溶剂对照(2.0％乙醇)，每个处理3个重复。将96孔板于28℃下培养24h后每孔中加入MTT溶液(5mg/mL)10μL，继续培养4h后，在1500g下离心20min，去上清，每孔加入DMSO 100μL终止反应，振荡(15rpm)30min，以助其溶解。肉眼即可观察判断化合物的MIC值，即培养基中刚好无蓝色物质生成的药剂浓度。为了进一步验证MIC值，从多孔板每个孔中吸取10μL培养液涂布到LB平板上，在37℃下培养24h后观察统计平板菌落数即可。
(5)实验结果：5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)对番茄疮痂病菌的最低抑制浓度为250μg/mL；在最大浓度为300μg/mL时，未检测出对黄瓜角斑病菌和番茄青枯病菌的最低抑制浓度。阳性对照硫酸链霉素对3种供试细菌的最低抑制浓度均为8μg/mL。
实施例12：5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)对植物病原细菌的半抑制浓度
(1)培养基：同实施例11。
(2)供试的植物病原细菌：同实施例11。
(3)测试样品母液的配制：同实施例11。
(4)半抑制浓度的测定：采用多孔板-MTT比色法测定其半抑制浓度(IC50)。具体操作步骤如下：在洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为106cfu/mL的供试菌液90μL，不同浓度梯度的测试样品母液10μL，溶剂(乙醇)终浓度为2.0％。同时设空白对照和溶剂对照(2.0％乙醇)，每个处理重复3次。将96孔板于28℃下培养24h后每孔中加入MTT溶液(5mg/mL)10μL，继续培养4h后，在1500g下离心20min，去上清，每孔加入DMSO100μL终止反应，振荡(15rpm)30min，以助其溶解。在1500g下离心20min，将上清(100μL DMSO)转移至另一干净的96孔板中，采用多孔板阅读器(Bio-Rad-550，USA)测定590nm处的光吸收值，按下式计算供试药物(化合物)的抑制率(％)：
根据抑制率，查机率值表，可得抑制率机率值(Y)，将药液浓度(μg/mL)换算成浓度对数(X)，即可求出线性方程Y＝aX+b，根据线性方程可求出半抑制浓度(IC50)。
(5)实验结果：仅测定出5-羟基-7-甲氧基黄酮(2)对番茄疮痂病菌生长的半抑制浓度，回归方程为Y＝0.8694X+3.091，由“反应率-几率值转换值表”可以查得，当抑制率几率值Y＝5时，所对应的抑制率为50％，此时可以通过回归方程求出X＝1.909，再求X的反对数，得出半抑制浓度值(IC50)为156.95μg/mL。
实施例13：5，7-二羟基黄酮(3)对植物病原细菌的最低抑制浓度
(1)培养基：同实施例11。
(2)供试的植物病原细菌：同实施例11。
(3)测试样品母液的配制：同实施例11，不同之处在于所用溶剂DMSO代替了乙醇。
(4)最低抑制浓度的测定：同实施例11。
(5)实验结果：5，7-二羟基-黄酮对黄瓜角斑病菌、番茄青枯病菌、番茄疮痂病菌的最低抑制浓度均为25μg/mL。阳性对照硫酸链霉素对3种供试细菌的最低抑制浓度均为8μg/mL。
实施例14：5，7-二羟基黄酮(3)对植物病原细菌的半抑制浓度
(1)培养基：同实施例11。
(2)供试的植物病原细菌：同实施例11。
(3)测试样品母液的配制：同实施例11，不同之处在于所用溶剂DMSO代替了乙醇。
(4)半抑制浓度的测定：同实施例11。
(5)实验结果：5，7-二羟基黄酮对黄瓜角斑病菌、番茄青枯病菌、番茄疮痂病菌的半抑制浓度(见表7)分别为17.725μg/mL、11.666μg/mL和14.556μg/mL。
表7 多孔板-MTT比色法测定5，7-二羟基黄酮(3)的抗细菌活性
实施例15：5，7-二羟基黄酮醇(4)对番茄青枯病菌的抑制活性
(1)培养基：同实施例11。
(2)供试的植物病原细菌：番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)。
(3)测试样品母液的配制：同实施例11，不同之处在于所用溶剂丙酮代替了乙醇。
(4)抗菌活性的测定：同实施例11。
(5)实验结果：5，7-二羟基黄酮醇对番茄青枯病菌的抑制活性见表8，在浓度为15μg/mL和30μg/mL时，抑制率分别为75.6％和80.6％。
表8 多孔板-MTT比色法测定5，7-二羟基黄酮醇(4)对番茄青枯病菌的抑制活性
Claims (8)
1、采用活性追踪分离方法制备杨树提取物和抗菌化合物。
2、一种按权利要求1所述的追踪分离方法是指在分离化合物的同时，进行抗菌活性检测，分离化合物的方法包括常压正相硅胶柱层析、常压反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、中压正相或反相硅胶柱层析，抗菌活性检测包括带毒平板菌丝生长扩展法、薄层层析-生物自显影-MTT法。
3、一种按权利要求1所述的杨树为欧美107杨(Populus×canadensis Moench′Neva′)，该杨树为欧洲黑杨(Populus nigra Linn.)和美洲黑杨(Populus deltoids Marsh.)的杂交种。
4、一种按权利要求1所述的制备杨树提取物的方法是指杨树枝条室内晾干后，粉碎，用乙醇提取，减压浓缩得乙醇粗提物，将乙醇粗提物用蒸馏水加热溶解制成混悬液，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，将乙酸乙酯层、正丁醇层，以及剩余的水层减压浓缩，分别得乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分，粗提物或提取物对植物病原菌表现出抑制活性。
5、一种按权利要求2所述的追踪分离对羟基肉桂酸脂肪烷醇酯的方法是指采用多种层析分离手段，并结合抗菌活性测定进行，该化合物对植物病原菌具有抑制活性。
6、一种按权利要求2所述的追踪分离5-羟基-7-甲氧基黄酮的方法是指采用多种层析分离手段，并结合抗菌活性测定进行，该化合物对植物病原菌具有抑制活性。
7、一种按权利要求2所述的追踪分离5，7-二羟基黄酮的方法是指采用多种层析分离手段，并结合抗菌活性测定进行，该化合物对植物病原菌具有抑制活性。
8、一种按权利要求2所述的追踪分离5，7-二羟基黄酮醇的方法是指采用多种层析分离手段，并结合抗菌活性测定进行，该化合物对植物病原菌具有抑制活性。
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