WO2014098089A1 - 真菌の生育を促進する方法 - Google Patents

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森山 裕充
俊一 浦山
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国立大学法人東京農工大学
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    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • C12N2720/00031Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting fungal growth, a polypeptide useful for the method, and a nucleic acid encoding the same.
  • fungi Almost all fermentation industries use fungi. For example, Aspergillus fungi are used for brewing sake, soy sauce, and miso. Penicillium fungi are also used for cheese ripening. It goes without saying that Saccharomyces yeasts are essential for brewing sake, beer and wine. Furthermore, yeasts such as Pichia are frequently used as hosts in gene recombination techniques. These fermentation steps are usually performed under an optimum environment for the growth of the fungus used, for example, at an optimum temperature and pH.
  • yeast fermentation involves fever, and it is usual to cool the culture to maintain the optimal growth temperature of the yeast.
  • salt if a large amount of salt is consumed to maintain the optimum pH for yeast growth, there may be a problem of environmental pollution due to waste liquid.
  • Non-Patent Document 1 relates to a technique for producing useful substances such as fatty acids by budding yeast. This document describes that Saccharomyces cerevisiae in which ⁇ 12 desaturase and ⁇ 3 desaturase are expressed by a foreign gene is more resistant to alkaline pH than the parent strain.
  • Non-Patent Document 2 discloses a high temperature resistant S. cerevisiae useful in bioethanol production . cerevisiae mutants have been obtained by UV irradiation.
  • Non-Patent Document 3 also discloses a high-temperature resistant S.P. obtained by UV irradiation . cerevisiae mutants are described.
  • This mycovirus (hereinafter sometimes referred to as “MoCV1”) has four types of double-stranded RNAs of 2.8 to 3.6 kb that differ from any of the known mycovirus RNA base sequences. It was. Moreover, the number of lesions could be remarkably reduced by inoculating rice with the conidia of rice blast fungus ( Magnaporthe oryzae ) infected with MoCV1 together with the conidia of highly toxic rice blast fungus (Patent Document 1). .
  • Non-patent Document 4 Saccharomyces cerevisiae overexpressing ORF4 encoding the P70 protein of the four major proteins of MoCV1 is a growth failure associated with morphological abnormalities such as cell hypertrophy and intracellular granulation.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for promoting fungal growth. Another object of the present invention is to provide a polypeptide useful for the method and a nucleic acid encoding the polypeptide.
  • the ORF4 gene translation product of MoCV1 inhibits fungal growth.
  • a domain that promotes fungal growth is encoded on the C-terminal side of the translation product, and it has been found that the N-terminal side is responsible for fungal growth inhibition. It was a surprising finding that a single polypeptide chain had a domain that promoted fungal growth and a domain that inhibited growth. And the recombinant yeast which expresses the C terminal side of the ORF4 gene translation product of MoCV1 showed remarkable stress tolerance.
  • the first aspect of the present invention is [1] A polypeptide having the ability to promote fungal growth, which has the following amino acid sequence: 1) A sequence that does not include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 from position 435 to glutamine, and that includes at least position 436 from glycine to position 693 to cysteine of SEQ ID NO: 2; 2) Amino acid sequence showing at least 60% homology with respect to 1) above, or 3) Deletion, substitution, insertion or addition of one or several amino acids to the amino acid sequence of 1) above An amino acid sequence having, The polypeptide consisting of: It is.
  • a typical polypeptide of the above 1) includes an amino acid sequence from position 436-glycine to position 693-cysteine as described in Examples below. Accordingly, a preferred embodiment of the present invention is [2] The polypeptide according to [1] above, wherein the amino acid sequence of 1) above is the sequence from position 436-glycine to position 693-cysteine of SEQ ID NO: 2, It is.
  • the polypeptide of the present invention can be suitably produced by overexpressing the nucleic acid encoding it in an appropriate host cell. Therefore, the second aspect of the present invention is [3] A nucleic acid encoding the polypeptide according to [1] or [2] above, [4] A vector in which the nucleic acid according to [3] is operably linked, and [5] a host cell transformed with the vector according to [4], It is.
  • polypeptide and nucleic acid of the present invention can be suitably used as an active ingredient of a composition for promoting fungal growth.
  • a further aspect of the present invention is [6] A composition for promoting fungal growth, comprising the polypeptide according to [1] or [2], the nucleic acid according to [3], or the vector according to [4], It is.
  • this aspect of the present invention is the polypeptide according to any one of the above [1] or [2], which is used for promoting fungal growth. Or it is a nucleic acid as described in said [3] used in order to accelerate
  • the vector according to the above [4] which is used for promoting fungal growth.
  • the present invention contemplates a method for promoting the growth of useful fungi and a method for improving the stress resistance of such fungi. That is, another aspect of the present invention is [7] A method of promoting fungal growth, wherein the polypeptide according to [1] or [2] above, or the nucleic acid according to [3] above against fungi that require such treatment, Administration of the vector according to [4] above, and [8] a method for improving stress resistance of fungi, wherein the above-mentioned [1] Or the polypeptide according to [2], the nucleic acid according to [3] above, or the vector according to [4] above, It is.
  • the polypeptide of the present invention exhibits remarkable fungal growth promoting activity and stress resistance enhancing activity
  • the polypeptide and the nucleic acid encoding it are useful as active ingredients for promoting fungal growth.
  • the fungus transformed to overproduce the polypeptide of the present invention can be advantageously used in various fermentation productions.
  • the polypeptide of the present invention exhibits fungal growth promoting activity and stress resistance improving activity, it can be used in studies for elucidating the fungal growth mechanism.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a lead substance for a further highly active polypeptide.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of MoCV1-dsRNA4 cDNA (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of the ORF4 gene translation product of MoCV1 virus (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 3 shows a map of plasmid pRS426.
  • FIG. 4 shows a map of the expression plasmid pRST426.
  • FIG. 5 shows the procedure for constructing the expression plasmid pRST426.
  • FIG. 6 shows the growth test of yeasts into which full-length ORF4 (Reference Example 1), 24 (present invention) and 1B (Reference Example 2) have been introduced (pH, turbidity, dissolved oxygen concentration, glucose concentration, and number of viable cells). Change).
  • FIG. 7 shows the results of cell morphology observation and colony morphology of a yeast into which full length ORF4 (Reference Example 1), 24 (present invention) and 1B (Reference Example 2) were introduced.
  • PRST426 is a negative control strain into which an empty vector was introduced.
  • PRST426-ORF4 is a transformant expressing full-length ORF4.
  • PRST426-24 is a transformant expressing the peptide of the present invention.
  • PRST426-1B is a transformant expressing a fungal growth-inhibiting active moiety in the ORF4 translation product, which is different from the present invention.
  • the white bar in the micrograph of the cell morphology corresponds to 10 ⁇ m.
  • FIG. 8 shows the results of Western blotting analysis using anti-ORF4p antibody after extracting proteins from yeast introduced with full-length ORF4 (Reference Example 1), 24 (present invention) and 1B (Reference Example 2). All samples are insoluble fractions. The numbers at the top indicate the culture time.
  • the gel used is an 8% gel. From the 24 region sample, a signal is seen at a size of approximately 28 kDa.
  • polypeptide of the present invention is a partial polypeptide containing the C-terminal sequence of the ORC4 gene translation product of MoCV1 virus.
  • partial polypeptide means that in any case the polypeptide is not identical in amino acid sequence to the full-length ORF4 gene translation product.
  • the partial polypeptide obtained by truncating amino acid residues from the 1st position to the 15th position of the ORF4 gene translation product expresses the polypeptide more than the full-length ORF4 gene translation product, as described in the respective reference examples described later.
  • the increase in viable cell count and turbidity and the decrease in pH and glucose concentration in yeast culture were further suppressed.
  • a partial polypeptide obtained by truncating all amino acid residues from the 1st to 15th positions and the 436th and subsequent positions of the ORF4 gene translation product also expresses the polypeptide more than the full-length ORF4 gene translation product.
  • the increase in viable cell count and turbidity and the decrease in pH were further suppressed in the culture.
  • the minimum unit of the polypeptide of the present invention consists of the following sequence from ORF4 gene translation product from position 436 to glycine to position 693 to cysteine.
  • Patent Document 1 discloses that the dsRNA fragment of La France disease virus has homology with the ORF4 gene of MoCV1 virus.
  • a person skilled in the art obtains a polypeptide showing high amino acid sequence homology with the partial polypeptide of the present invention containing at least the sequence from position 436-glycine to position 693-cysteine of the ORF4 gene translation product, from which a fungus is obtained. Those having the ability to promote the growth of can be easily identified.
  • Such polypeptides are also within the scope of the present invention.
  • the homology of the amino acid sequence may be 60% or more, 70% or more, or 80% or more. In particular, polypeptides showing 90% or more amino acid sequence homology are preferred.
  • a polymorphism having one or several amino acid deletions, substitutions, insertions or additions to the partial polypeptide comprising at least the ORF4 gene translation product 436-glycine to 693-cysteine sequence of the present invention.
  • Peptides are also available in the present invention. For example, substitution of leucine for valine, lysine for arginine, and glutamine for asparagine may not change the function of the polypeptide. Accordingly, it is within the scope of the present invention that such polypeptides have the ability to inhibit fungal growth.
  • Nucleic acid The polypeptide of the present invention can be easily obtained by overexpressing a nucleic acid encoding the amino acid sequence in an appropriate host. Such overexpression can also take place in situ, ie in fungal cells whose growth is to be promoted.
  • a nucleic acid that can be used for such purposes will have at least the nucleotide sequence from position 1467-glycine to position 2240-thymine of SEQ ID NO: 1 herein.
  • the portion is a natural sequence encoding the amino acid sequence from position 436-glycine to position 693-cysteine of the ORF4 gene translation product.
  • nucleic acid of the present invention may have all mutations that can occur in the natural world, and artificially introduced mutations and modifications. For example, it is known that there are extra codons in various codons that code for specific amino acids. Therefore, in the present invention, alternative codons that are finally translated into the same amino acid may be used. That is, since the genetic code is degenerate, multiple codons can be used to encode a particular amino acid, so that the amino acid sequence can be encoded with any set of similar DNA oligonucleotides.
  • the nucleic acid of the present invention may be not only DNA but also RNA. Furthermore, the nucleic acid of the present invention may be modified DNA and modified RNA. That is, the nucleic acid of the present invention may be labeled with a fluorescent substance such as Cy3 or Cy5, a chemiluminescent substance, or the like, depending on the application. Alternatively, the nucleic acid of the present invention may be prepared as a stable DNA derivative such as phosphorothioate or methylphosphonate, or a stable RNA derivative such as 2'-O-alkyl RNA. All of these nucleic acids are also included in the nucleic acids of the present invention.
  • expression cassette means a nucleotide comprising a nucleic acid to be expressed or a nucleic acid sequence that regulates transcription and translation operably linked to a gene to be expressed.
  • the expression cassette of the present invention comprises a promoter sequence 5 ′ upstream from the coding sequence, a terminator sequence 3 ′ downstream, and optionally further normal regulatory elements, operably linked, such as
  • the nucleic acid to be expressed or the gene to be expressed is “operably” introduced into the host.
  • a promoter is defined as a DNA sequence that binds RNA polymerase to DNA and initiates RNA synthesis, whether it is a structural promoter or a regulated promoter.
  • a strong promoter is a promoter that initiates mRNA synthesis at a high frequency, and is also preferably used in the present invention.
  • TDH3 promoter is preferred.
  • examples include SV40 gene promoter, adenovirus major late gene promoter, thymidine kinase gene promoter, metallothionein gene promoter, immunoglobulin gene promoter, and the like.
  • examples include CaMV-derived 35S transcript, maize ubiquitin, nopaline synthase (NOS) gene, octopine (OCT) synthesis gene promoter, and the like.
  • the lac system for prokaryotic host cells, the lac system, trp system, TAC or TRC system, lambda phage major operator and promoter region, fd coat protein control region, glycolytic enzymes (eg, 3-phosphoglycerates) Kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), glutamate decarboxylase A, a promoter for serine hydroxymethyltransferase, and the like can be used.
  • glycolytic enzymes eg, 3-phosphoglycerates
  • Kinase glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • glutamate decarboxylase A a promoter for serine hydroxymethyltransferase
  • promoter and terminator sequences examples include selection markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185”, Academic Press (1990).
  • the expression cassette described above is inserted into a host cell after being incorporated into a vector comprising, for example, a plasmid, virus, phage, transposon, IS element, fasmid, cosmid, or linear or circular DNA.
  • vectors may be autonomously replicated in the host cell or may be replicated by chromosome.
  • Suitable vectors for fungal host cells include pRS426 (available from ATCC), pAUR101 and pAUR316 (available from Takara BIO Inc.), pYepSec1, pMFa, pJRY88, pYES2 and “Gene transfer system: fungi ", Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al. Eds.
  • Suitable vectors for animal host cells include pCDM8 and pMT2PC, as well as adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, herpes virus vectors, and the like.
  • Suitable vectors for plant host cells include binary vector plasmids such as pBE2113Not, pBI2113Not, pBI2113, pBI101, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG, and pGreen, and intermediate vector plasmids such as pLGV23Neo, pNCAT, and pMON200. Can be mentioned.
  • Suitable plasmids for prokaryotic host cells are, for example, E.
  • Other usable plasmids are described in “Cloning Vectors”, Elsevier, 1985.
  • the expression cassette can be introduced into a vector by a conventional method including excision, cloning, and ligation with an appropriate restriction enzyme.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by incubating a host cell transformed with the vector of the present invention as described above under the optimal culture conditions for the cell. Thereafter, the polypeptide of the present invention can be purified from the culture by combining centrifugation, salting out, pH precipitation, dialysis, and various types of chromatography. For example, a His tag may be added to the end of the polypeptide of the present invention, and it may be purified by affinity chromatography. Therefore, the active ingredient of the composition of the present invention can be the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by the fungus itself by directly transforming the fungal cell whose growth should be promoted by the nucleic acid of the present invention operably linked in a fungal vector. Also good. Such production will provide transformed fungi with high growth potential and improved stress tolerance. Therefore, the active ingredient of the composition of the present invention may be the nucleic acid of the present invention or the vector of the present invention.
  • composition of the present invention can contain any carrier in addition to an effective amount of the polypeptide, nucleic acid or vector of the present invention.
  • Such carriers include excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, menthol and the like. Fragrances, preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspensions such as methylcellulose and polyvinylpyrrolide, dispersants such as surfactants, water, physiological saline Although diluents, such as water, base wax, etc. are mentioned, it is not limited to them.
  • the composition of the present invention can further contain a reagent for nucleic acid introduction.
  • a reagent for nucleic acid introduction cationic lipids such as atelocollagen, ribosome, nanoparticle, lipofectin, lipfectamine, DOGS (transfectam), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDAB, HDAB, polybrene, or polyethyleneimine are used. I can do it.
  • the nucleic acid or vector of the present invention can be efficiently delivered to the cell in which the polypeptide of the present invention is to be produced, and efficiently incorporated into the cell. Can do.
  • composition of the present invention can be administered to a fungal culture, for example, solid culture or liquid culture, whose growth is to be promoted or stress resistance is to be improved.
  • a fungal culture for example, solid culture or liquid culture, whose growth is to be promoted or stress resistance is to be improved.
  • the composition of the invention is mixed into a fungal liquid culture.
  • Examples of the content of the active ingredient in the composition of the present invention include about 0.1 to 100% by weight of the whole composition.
  • those yeasts transformed with the vectors of the present invention show sufficiently good growth above the normal optimum growth temperature, for example at 35 ° C., so a special large cooler for the fermentation process is required. It will not be necessary and will not consume much energy.
  • those yeasts transformed with the vector of the present invention show sufficiently good growth even in an environment lower than the normal optimum pH, so the effort of adding alkali to increase the pH during fermentation Not only will this reduce the waste solution problem.
  • the polypeptide of the present invention can be used in studies for elucidating the growth promotion mechanism of fungi.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a lead substance for a further highly active polypeptide.
  • any of the polypeptides, nucleic acids, and vectors of the present invention can be used as reagents for research.
  • the reagent comprises the polypeptide, nucleic acid or vector of the present invention, for example, a preservative such as sodium benzoate or sodium bisulfite, a stabilizer such as citric acid or sodium citrate, and a dispersant such as a surfactant. It can be obtained by dissolving in a buffer solution having an appropriate pH.
  • Reference Example 1 Preparation of yeast introduced with full-length ORF4 coding sequence A transformant producing a protein encoded by an open reading frame in the ORF4 gene of MoCV1 was prepared by the following procedure.
  • ⁇ 1-a> plasmid pRS426 purchased from the construction of the expression vector ATCC ( Figure 3) based on, S. Plasmid pRST426 having a multi-cloning site sandwiched between the promoter region and terminator region of C. cerevisiae TDH3 gene was prepared (FIG. 4). For details, see S.A. cerevisiae W303-1A [LAO] strain was extracted, and the TDH3 gene promoter region (Primer1: forward2 and reverse2) and terminator region (Primer3: forward and Primer 4: reverse) were amplified by PCR. Each was cloned into a commercially available pUC19 plasmid.
  • the PCR conditions were in accordance with the manual for KOD-plus- (trade name, manufactured by TOYOBO).
  • the promoter region was excised from the plasmid containing the promoter region with BlnI1 / BamHI and inserted into the plasmid containing the terminator region cleaved with the same restriction enzymes.
  • the gene expression cassette portion was cut out from this plasmid with NotI / XhoI and inserted into the pRS426 plasmid cut with the same restriction enzymes (FIG. 5).
  • ORF4 (Primer A: forward and Primer B: reverse) was amplified by PCR using MoCV1-dsRNA4 cDNA (SEQ ID NO: 1) as a template. PCR conditions followed the manual of KOD-plus- (trade name, manufactured by TOYOBO). The PCR amplification product was cloned into the pUC19 plasmid, and the inserted fragment was excised from the plasmid with EcoRI / HpaI. The fragment was inserted into pRST426 cut with the same restriction enzyme to construct an expression vector for full-length ORF4.
  • Reference Example 2 Preparation of yeast in which coding sequence from ORF4 position 16-isoleucine to position 812-serine was introduced
  • the expression vector pRST426 prepared in the above ⁇ 1-a> has the 16th position of ORF4 in the multi-cloning site.
  • -A coding sequence from isoleucine to position 812-serine (hereinafter, the sequence and its translation product are abbreviated as "1B") was inserted.
  • 1B (PrimerC: forward and PrimerB: reverse) was amplified by PCR using MoCV1-dsRNA4 cDNA (SEQ ID NO: 1) as a template. PCR conditions followed the manual of KOD-plus- (trade name, manufactured by TOYOBO).
  • the PCR amplification product was cloned into the pUC19 plasmid, and the inserted fragment was excised from the plasmid with EcoRI / HpaI.
  • the fragment was inserted into pRST426 cut with the same restriction enzyme to construct a 1B expression vector.
  • Reference Example 3 Production of yeast in which coding sequence from ORF4 position 16-isoleucine to position 435-glutamine was introduced
  • the expression vector pRST426 prepared in the above ⁇ 1-a> has the 16th position of ORF4 in the multi-cloning site.
  • a coding sequence from isoleucine to position 435 to glutamine (hereinafter, the sequence and its translation product are abbreviated as “13”) was inserted. Specifically, 13 (PrimerC: forward and Primer D: reverse) was amplified by PCR using MoCV1-dsRNA4 cDNA (SEQ ID NO: 1) as a template. PCR conditions followed the manual of KOD-plus- (trade name, manufactured by TOYOBO).
  • the PCR amplification product was cloned into the pUC19 plasmid, and the inserted fragment was excised from the plasmid with EcoRI / SmaI.
  • the fragment was inserted into pRST426 cut with the same restriction enzymes to construct 13 expression vectors.
  • Example 1 Preparation of Yeast Introducing Coding Sequence from ORF4 Position 436-Glycine to Position 693-Cysteine Position ORF4 at position 436 in the multi-cloning site of expression vector pRST426 prepared in ⁇ 1-a> above.
  • -A coding sequence from glycine to position 693-cysteine (hereinafter, the sequence and its translation product are abbreviated as "24") was inserted.
  • 24 (Primer E: forward and Primer F: reverse) was amplified by PCR using MoCV1-dsRNA4 cDNA (SEQ ID NO: 1) as a template. PCR conditions followed the manual of KOD-plus- (trade name, manufactured by TOYOBO).
  • the PCR amplification product was cloned into the pUC19 plasmid, and the inserted fragment was excised from the plasmid with EcoRI / SmaI.
  • the fragment was inserted into pRST426 cut with the same restriction enzymes to construct 24 expression vectors.
  • Example 2 Growth test of full length ORF4, 1B, 13 and 24 introduced yeast The growth of each transformed yeast was tested by jar fermenter culture.
  • yeast introduced with the title sequence was cultured, and its growth was tested.
  • yeast introduced with pRST426 was used.
  • the above culture solution was sampled over time. Specifically, a syringe was connected to the sampling port of the microorganism culture apparatus with a silicon tube, 10 ml of the culture solution was taken out with the syringe, and transferred to a sterile centrifuge tube. A part of the culture solution sample thus obtained was diluted with sterilized water and then spread on an agar plate. After incubating these plates at 28 ° C. for 3 days, the number of colonies formed on the plates was counted to determine the number of viable cells. Further, the absorbance of another part of the culture solution sample was measured with a spectrophotometer (UV-1800, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the sample after measuring the absorbance was centrifuged to separate into a supernatant and cells.
  • the glucose concentration in the supernatant was measured using a biosensor (BF-5, BF-30AS, glucose sensor: ED05-0003, manufactured by Oji Scientific Instruments).
  • protein was extracted from the microbial cells, and it confirmed that the target protein was produced by the western blotting using the anti- ORF4p antibody (FIG. 8).
  • cell morphology was observed for some of the cells using a microscope (an inverted research microscope, IX71 Olympus) (magnification 1,000 times, differential interference).
  • the polypeptide of the present invention exhibits remarkable fungal growth promoting activity and stress resistance improving activity, and thus can be used in various fermentation productions. Further, since it can be used as a research reagent, it can be useful in the chemical manufacturing industry.

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Abstract

 真菌の生育を促進する新規な方法を提供すること、また、当該方法に有用なポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする核酸を提供すること、更に、例えば、バイオエタノールの酵母による生産に最適な方法を提供することを目的とする。 真菌の生育を促進する能力を有するポリペプチドであって、配列番号2で示されるアミノ酸配列のうちの435位-グルタミンまでを含まず、少なくとも配列番号2の436位-グリシンから693位-システインまでを含むアミノ酸配列から成るポリペプチドが提供される。

Description

真菌の生育を促進する方法
 本発明は、真菌の生育を促進する方法、並びに当該方法に有用なポリペプチド及びそれをコードする核酸に関する。
 ほとんど全ての発酵産業は、真菌を利用している。例えば、清酒、醤油、味噌の醸造にはアスペルギルス属の糸状菌が利用される。チーズの熟成にはペニシリウム属の糸状菌も利用される。清酒、ビールやワインの醸造には、サッカロミセス属の酵母が不可欠なことは言うまでもない。更にピキァ属等の酵母は、遺伝子組換え技術における宿主として多用されている。これらの発酵工程は、通常、用いられる真菌の生育にとって最適な環境下、例えば至適温度やpHで実施される。
 しかしながら、真菌の生育にとって最適な環境条件を維持するためには、多くのエネルギーと精緻なコントロールを必要とする。従って、発酵生産が、より広範な環境条件下(例えば、高温、低温、高pH、低pH、高アルコール濃度環境下等)でも生育可能な真菌、つまり環境ストレスに対して耐性を示す真菌が利用できれば、発酵工程の省エネルギー化や収量の増大を期待できるであろう。
 とりわけ、近年、バイオエタノール燃料生産における酵母の利用が脚光を浴びている。典型的なそれらの技術では、廃糖蜜、セルロース及びリグノセルロース等の植物体由来の原料を酵母により発酵してエタノールを得る。従って、当該技術の重要な課題は、その発酵工程に多大なエネルギーを費やさないということである。例えば、酵母の発酵には発熱を伴うので、酵母の最適な生育温度を維持するためには培養物を冷却しなければならないのが通常である。その他にも、酵母生育に最適なpHを維持するために多量の塩類を消費すると廃液による環境汚染の問題が生じるかもしれない。
 非特許文献1は、脂肪酸等の有用物質を出芽酵母により生産させる技術に関連している。当該文献は、外来遺伝子によりΔ12不飽和化酵素及びω3不飽和化酵素を発現させたSaccharamyces cerevisiaeは、親株よりもアルカリpHに対して耐性を示すことを記載している。非特許文献2は、バイオエタノール生産において有用な、高温耐性のS.cerevisiae突然変異株を、UV照射により得ている。非特許文献3も、UV照射により得られた高温耐性のS.cerevisiae突然変異株を記載している。
 ところで、最近、本発明者らは、特定のイネいもち病菌株に内在的に存在する新規なマイコウイルスを見出した。このマイコウイルス(以下、「MoCV1」と記載することもある。)は、既知のマイコウイルスRNAの塩基配列のいずれとも異なる、2.8~3.6kbの4種類の二本鎖RNAをしていた。また、MoCV1に感染したイネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)の分生子を、強毒性のイネいもち病菌の分生子と共にイネに接種することにより、病斑数を顕著に減少させ得た(特許文献1)。
 更に、本発明者らは、MoCV1の4つの主要蛋白質のうちのP70蛋白質をコードするORF4を過剰発現させたSaccharomyces cerevisiaeが、細胞の肥大化や細胞内の顆粒化といった形態異常を伴った生育不全示すことを見出した(非特許文献4)。
 しかしながら、本発明者らの知る限りにおいて、これまでにマイコウイルスを利用して真菌の生育を促進しようというアプローチはとられたことが無い。したがって、いずれの先行文献も、マイコウイルス及び当該ウイルス由来の蛋白質が、真菌の生育を促進することや、真菌にストレス耐性を付与し得ることを開示も示唆もしていない。
国際公開第WO2009/093409号パンフレット
植村 浩、「出芽酵母(S.cerevisiae)の脂肪酸組成とストレス耐性 ~エタノール耐性とアルカリ耐性の解析~」、第183回酵母研究会例会、講演要旨(2012年11月) Hosein Shahsavaraniら、「Development of multiple stress tolerant hubrid Saccharomyces cerevisiae strain TJ14 for cost-efficient production of bio-ethanol」、酵母遺伝学フォーラム 第45回研究報告会、講演要旨(2012年9月) Masahi Kobataら、「High ethanol fermentation from sugarcane molasses by Saccharomyces cerevisiae strain TJ14-U54 under high-temperature condition」、酵母遺伝学フォーラム 第45回研究報告会、講演要旨(2012年9月) J.Virol.,2012,86(15),p.8287-8295
 本発明は、真菌の生育を促進する新規な方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該方法に有用なポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする核酸を提供することを課題とする。
 前記のとおり、MoCV1のORF4遺伝子翻訳産物(配列番号2)は、真菌の生育を阻害する。しかしながら、当該翻訳産物のC末端側には、真菌の生育を促進するドメインがコードされており、そのN末端側が真菌の生育抑制を担うことが見出された。単一のポリペプチド鎖が、真菌の生育を促進するドメインと、生育を抑制するドメインを有することは驚くべき知見であった。そして、MoCV1のORF4遺伝子翻訳産物のC末端側を発現する遺伝子組換酵母は、顕著なストレス耐性を示した。従って、本発明の第1の局面は、
[1]真菌の生育を促進する能力を有するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列:
 1) 配列番号2で示されるアミノ酸配列のうちの435位-グルタミンまでを含まない配列であって、少なくとも配列番号2の436位-グリシンから693位-システインまでを含むアミノ酸配列;
 2) 上記1)に対して少なくとも60%以上の相同性を示すアミノ酸配列;、又は
 3) 上記1)のアミノ酸配列に対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、
から成る、前記ポリペプチド、
である。
 典型的な上記1)のポリペプチドは、後記実施例のとおり、436位-グリシンから693位-システインまでのアミノ酸配列を含む。従って、本発明の好適な態様は、
[2]上記1)のアミノ酸配列が、配列番号2の436位-グリシンから693位-システインまでの配列である、上記[1]記載のポリペプチド、
である。
 本発明のポリペプチドは、それをコードする核酸を適切な宿主細胞内で過剰発現させることにより好適に生産され得る。従って、本発明の第2の局面は、
[3]上記[1]又は[2]に記載のポリペプチドをコードする核酸、
[4]上記[3]に記載の核酸が作動可能に連結されたベクター、及び
[5]上記[4]に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞、
である。
 本発明のポリペプチド及び核酸は、真菌の生育を促進するための組成物の有効成分として好適に使用できる。従って、本発明の更なる局面は、
[6]上記[1]又は[2]に記載のポリペプチド、上記[3]に記載の核酸或いは上記[4]に記載のベクターを含む、真菌の生育を促進するための組成物、
である。言うなれば、本発明のこの局面は、真菌の生育を促進するために用いる、上記[1]又は[2]のいずれかに記載のポリペプチドである。或いは、真菌の生育を促進するために用いる、上記[3]に記載の核酸である。更には、真菌の生育を促進するために用いる、上記[4]に記載のベクターである。
 更に、本発明は、有用な真菌の生育を促進する方法、及び当該真菌の耐ストレス性を向上させる方法を意図する。すなわち、本発明の別の局面は、
[7]真菌の生育を促進する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して上記[1]又は[2]に記載のポリペプチド、上記[3]に記載の核酸或いは上記[4]に記載のベクターを投与することを含む、前記方法、及び
[8]真菌のストレス耐性を向上する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して上記[1]又は[2]に記載のポリペプチド、上記[3]に記載の核酸或いは上記[4]に記載のベクターを投与することを含む、前記方法、
である。
 本発明のポリペプチドは、顕著な真菌生育促進活性及び耐ストレス性向上活性を示すので、当該ポリペプチド及びそれをコードする核酸は、真菌の生育を促進するための有効成分として有用である。更に、本発明のポリペプチドを過剰生産するように形質転換された真菌は、各種の発酵生産において有利に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、真菌生育促進活性及び耐ストレス性向上活性を示すので、真菌の生育機構を解明するための研究に用いることが可能である。また、本発明のポリペプチドは、更なる高活性ポリペプチドのリード物質として利用可能である。
図1は、MoCV1-dsRNA4 cDNAのヌクレオチド配列を示す(配列番号1)。 図2は、MoCV1ウイルスのORF4遺伝子翻訳産物のアミノ酸配列を示す(配列番号2)。 図3は、プラスミドpRS426のマップを示す。 図4は、発現用プラスミドpRST426のマップを示す。 図5は、発現用プラスミドpRST426の構築手順を示す。 図6は、全長ORF4(参考例1)、24(本発明)及び1B(参考例2)を導入した酵母の成育試験(pH、濁度、溶存酸素濃度、グルコース濃度及び生菌細胞数の経時変化)の結果である。陰性対照には、空のベクターのみを導入した。全てのグラフにおいて、■は陰性対照を表している。△は全長ORF4を表している。*は本発明の実施例(24)を表している。〇は1Bを表している。 図7は、全長ORF4(参考例1)、24(本発明)及び1B(参考例2)を導入した酵母の顕微鏡による細胞形態観察の結果及びコロニー形態である。図中、「pRST426」は、空のベクターを導入した陰性対照株である。「pRST426-ORF4」は、全長ORF4を発現する形質転換体である。「pRST426-24」は、本発明のペプチドを発現する形質転換体である。「pRST426-1B」は、本発明とは別の、ORF4翻訳産物中の真菌生育阻害活性部分を発現する形質転換体である。細胞形態の顕微鏡写真中の白抜きバーは、10μmに相当する。 図8は、全長ORF4(参考例1)、24(本発明)及び1B(参考例2)を導入した酵母からタンパク質を抽出し、抗ORF4p抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す。サンプルは全て不溶性画分である。上段の数字はそれぞれ培養時間を示す。使用したゲルは8%ゲルである。24領域のサンプルからは、約28kDaのサイズにシグナルが見られる。 図9は、全長ORF4(参考例1)、1B(参考例2)及び13(参考例3)を導入した酵母の成育試験(pH、濁度及び生菌細胞数の経時変化)の結果である。全てのグラフにおいて、△は全長ORF4を表している。〇は1Bを表している。◇は13を表している。
ポリペプチド
 本発明のポリペプチドは、MoCV1ウイルスのORF4遺伝子翻訳産物ののC末端側配列を含む部分ポリペプチドである。本明細書において、用語「部分ポリペプチド」は、いかなる場合にもそのポリペプチドが、アミノ酸配列において全長ORF4遺伝子翻訳産物と同一ではないことを意味する。
 前記のとおり、元の全長ORF4遺伝子翻訳産物が真菌の生育阻害活性を示すにもかかわらず、そのC末端側ポリペプチドは、真菌の生育を促進する活性だけでなく、真菌のストレス耐性を向上させる活性を示したことは、驚嘆すべき発見であった。
 具体的に、後記の実施例のとおり、ORF4遺伝子翻訳産物の436位-グリシンから693位-システインまでのアミノ酸残基から成る部分ポリペプチドが、真菌の生育を有意に促進することが明らかにされた。そして、当該部分ポリペプチドを過剰生産するように形質転換されたS.cerevisiaeは、35℃といった高温条件下でも良好に成育した。さらにその生育は、培地がpH4.0を下回る酸性になった以降でさえも持続した。通常のS.cerevisiaeの最適生育温度は25℃前後であり、最適pHは約5.0~6.0であるので、35℃の温度及びpH4.0を下回る水素イオン濃度は、当該酵母の生育にとって実質的なストレス条件と看做される。
 一方、後記の各参考例のとおり、ORF4遺伝子翻訳産物の1位から15位までのアミノ酸残基を切詰めて得た部分ポリペプチドは、全長ORF4遺伝子翻訳産物よりも、当該ポリペプチドを発現する酵母の培養における生菌数及び濁度の上昇並びにpH及びグルコース濃度の低下をいっそう強く抑制した。同様に、ORF4遺伝子翻訳産物の1位から15位まで及び436位以降の全てのアミノ酸残基を切詰めて得た部分ポリペプチドも、全長ORF4遺伝子翻訳産物よりも、当該ポリペプチドを発現する酵母の培養における生菌数及び濁度の上昇並びにpHの低下をいっそう強く抑制した。従って、これらの結果は、ORF4遺伝子翻訳産物のN末端側に、真菌の生育を阻害するドメインが存在することを意味する。(本発明者らは、この発明について、本願と同じ優先権主張及び出願日を有する日本国特許出願において開示及び特許請求している。)。単一のポリペプチド鎖上に、宿主細胞の成育を阻害する部分と促進する部分が共存していたことは、とりわけ驚嘆すべき発見であったが、ウイルスの種の存続という観点からすれば、その宿主を完全に殺滅してしまわないのは、MoCV1ウイルスにとって合理的な戦略かもしれない。いずれにせよ、真菌の生育を促進する活性に対して、ORF4遺伝子翻訳産物のN末端側は重要でないと考えられる。
 従って、本発明のポリペプチドの最小単位は、以下に示すORF4遺伝子翻訳産物の436位-グリシンから693位-システインまでの配列から成る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001

 MoCV1ウイルスのORF4遺伝子に対応するDNA配列(つまり、MoCV1ウイルスはdsRNAウイルスであるので、その遺伝子は、本来はRNAである。)及びその全長翻訳産物のアミノ酸配列は、特許文献1において、それぞれ、同文献の配列番号3及び配列番号7として開示されている。また、特許文献1は、ラ・フランス病ウイルスのdsRNA断片が、MoCV1ウイルスのORF4遺伝子と相同性を有することを開示している。従って、当業者は、少なくともORF4遺伝子翻訳産物の436位-グリシンから693位-システインまでの配列を含む本発明の部分ポリペプチドと高いアミノ酸配列相同性を示すポリペプチドを得て、その中から真菌の生育を促進する能力を有するものを容易に同定できるであろう。そして、そのようなポリペプチドも、本発明の範囲内である。当該アミノ酸配列の相同性としては、60%以上、70%以上、80%以上のいずれかであればよい。特に、90%以上のアミノ酸配列の相同性を示すポリペプチドが好ましい。なお、本明細書において、アミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ(マトリクス=Blosum62;ギャップ存在コスト=11、ギャップ拡張コスト=1)を用いた検索で、インターネットサイトhttp://www.ncbi.n/m.nih.gov/egi-gin/BLASTで実装可能なBLASTPアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義される。
 また、本発明の、少なくともORF4遺伝子翻訳産物436位-グリシンから693位-システインまでの配列を含む部分ポリペプチドに対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するポリペプチドもまた、本発明において利用可能である。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともあり得る。従って、そのようなポリペプチドのうちで真菌の生育を阻害する能力を有するものは本発明の範囲内である。
核酸
 本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列をコードする核酸を適切な宿主内で過剰発現させることで、容易に得ることができる。また、そのような過剰発現は、その場で(in situ)、つまり生育が促進されるべき真菌細胞内でも行い得る。そのような目的に用いることができる核酸は、本明細書の配列番号1の1467位-グリシンから2240位-チミンまでのヌクレオチド配列を少なくとも有するであろう。その部分が、ORF4遺伝子翻訳産物の436位-グリシンから693位-システインまでのアミノ酸配列をコードする天然型の配列である。しかしながら、本発明の核酸は、上記した本発明のポリペプチドに翻訳される限り、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン(redundancy)が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の1セットの類似のDNAオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるDNAオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下(例えば、3xSSC、68℃でハイブリダイズし、2xSSC、0.1%SDS及び68℃で洗浄)で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするDNAを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン(最適コドン)のサブセットを優先的に用いることが知られているので(Gene、Vol.105、pp.61-72、1991等)、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。
 なお、本発明のポリペプチドはdsRNAウイルスの蛋白質に由来するので、本発明の核酸はDNAだけでなく、RNAであってもよい。更に、本発明の核酸は、修飾DNA及び修飾RNAであってもよい。つまり、用途に応じて本発明の核酸を、例えばCy3やCy5等の蛍光物質、化学発光物質等により標識してもよい。或いは、本発明の核酸を、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート等の安定なDNA誘導体、2’-O-アルキルRNA等の安定なRNA誘導体として作製してもよい。それらの核酸も、全て本発明の核酸に含まれる。
ベクター
 しかるに、本発明の核酸は、「発現カセット」として宿主細胞内に導入されることにより、より安定的で高レベルの本発明のポリペプチド生産を達成することを当業者は理解するであろう。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写及び翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から5’上流にプロモーター配列、3’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主に、「作動可能」に導入される。
 プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、RNAポリメラーゼをDNAに結合させ、RNA合成を開始させるDNA配列と定義される。強いプロモーターとはmRNA合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。例えば、宿主細胞が真菌細胞である場合、TDH3、ADH1、ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH並びにアミラーゼ系遺伝子及びtrpCのプロモーターが使用できるが、TDH3プロモーターが好ましい。宿主が動物細胞である場合、SV40遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモーター等が例示できる。宿主が植物細胞である場合は、CaMV由来の35S転写物、トウモロコシのユビキチン、ノパリン合成酵素(NOS)遺伝子、オクトピン(OCT)合成遺伝子のプロモーターなどが挙げらる。また、原核生物宿主細胞のためには、lac系、trp系、TAC又はTRC系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素(例えば、3-ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸脱水素酵素)、グルタミン酸デカルボキシラーゼA、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が利用可能である。プロモーター及びターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185”、Academic Press (1990)に記載されている。
 上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のDNA等から成るベクターに組み入れて、宿主細胞中に挿入される。これらのベクターは、宿主細胞中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。真菌宿主細胞のための好適なベクターとしては、pRS426(ATCCより入手可能)、pAUR101及びpAUR316(Takara BIO Inc.より入手可能)、pYepSec1、pMFa、pJRY88、pYES2や“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”、Applied Molecular Genetics of Fungi、J.F.Peberdy et al.、eds.、p.1-28、Cambridge University Pressに記載されたものが挙げられる。動物宿主細胞のための好適なベクターとしては、pCDM8及びpMT2PC、並びにアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。植物宿主細胞のための好適なベクターとしては、pBE2113Not、pBI2113Not、pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH、pBIG、pGreen等のバイナリーベクター系のプラスミドやpLGV23Neo、pNCAT、pMON200等の中間ベクター系のプラスミドが挙げられる。原核生物宿主細胞のための好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11又はpBdCI;桿菌のpUB110、pC194又はpBD214;コリネバクテリウム属のpSA77又はpAJ667などである。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Cloning Vectors”、Elsevier、1985に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。
 上記ようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法及びトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、F. Ausubelら、Publ.Wiley Interscience、New York、1997、またはSambrookら、「分子クローニング:実験室マニュアル」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。
本発明の組成物
 上記のようにして本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を、その細胞の至適培養条件下でインキュベーとすることにより、本発明のポリペプチドを生産することができる。その後、培養物から、遠心分離、塩析、pH沈殿、透析及び各種のクロマトグラフィーを組み合わせることで、本発明のポリペプチドを精製することができる。たとえば、本発明のポリペプチドの末端にHisタグを付加しておき、それをアフィニティ・クロマトグラフィーにより精製してもよい。従って、本発明の組成物の有効成分は、本発明のポリペプチドあり得る。また、本発明のポリペプチドは、真菌用ベクター内に作動可能に連結された本発明の核酸により、その生育を促進すべき真菌の細胞を直接形質転換することで、当該真菌自身に生産させてもよい。そのような生産は、形質転換された真菌に高い増殖能と向上したストレス耐性をもたらすであろう。従って、本発明の組成物の有効成分は、本発明の核酸又は本発明のベクターであってよい。
 従って、本発明の組成物は、有効量の本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターに加え、任意の担体を含むことができる。
 そのような担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
 その有効成分が核酸又はベクターである場合、本発明の組成物は、更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リボソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、DOGS(トランスフェクタム)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。つまり、本発明の核酸ないしベクターをアテロコラーゲン等に含ませることにより、本発明のポリペプチドを生産させるべき細胞に対して本発明の核酸又はベクターを効率よく送達し、当該細胞に効率よく取り込ませることができる。
 本発明の組成物は、その生育を促進し、或いは耐ストレス性を向上させるべき真菌の培養物、例えば固体培養や液体培養に対して投与することができる。好ましくは、本発明の組成物を真菌の液体培養に混合する。本発明の組成物中の有効成分の含有量としては、例えば、組成物全体の約0.1ないし100重量%が例示される。
 本発明によりその増殖の促進、或いは耐ストレス性を向上させることが可能な真菌類として、AmbrosiozymaArxulaBabjeviaBlastobotrysCandidaCiteromycesClavisporaDebaryomycesDekkeraDipodascusGalactomycesGeotrichumHanseniasporaKazachstaniaKloeckeraKluyveromycesLipomycesLodderomyces、MetschnikowiaMyxozymaNadsoniaPachysolenPichiaSaccharomycesSaccharomycopsisSaitoellaSaprochaeteSaturnisporaSchizoblastosporiumSchizosaccharomycopsisSporopachydermaStarmerellaStephanoascusSymbiotaphrinaSympodiomycesTetrapisisporaTorulasporaTrigonopsisWickerhamiaWickerhamiellaWilliopsisYarrowiaZygoascusZygosaccharomyces、及びZygozyma属等の子嚢菌系酵母;BannoaBensingtoniaBulleraBulleromycesCryptococcusCurvibasidiumCystofilobasidiumDioszegiaErythrobasidiumFellomycesFibulobasidiumFilobasidiumFilobasidiellaGuehomycesKockovaellaKondoaKurtzmanomycesLeucosporidiumMalasseziaMastigobasidiumMrakiaOccultifurPseudozymaRhodosporidiumRhodotorulaSakaguchiaSirobasidiumSporidiobolusSporobolomycesSterigmatomycesSterigmatospororidiumSympodiomycopsisTausoniaTilletiopsisTrichosporiellaTrichosporonTsuchiyaeaUdeniomyces、及びXanthophyllomyces属等の担子菌系酵母;並びにAspergillusMucorPenicillium、及びRhizopus属等の糸状菌が挙げられるが、これらに限定されない。
 特に、バイオエタノール生産に用いられる、Saccharomyces cerevisiaeの天然或いはその変異体への本発明の適用は興味深い。つまい、本発明のベクターにより形質転換されたそれらの酵母は、通常の最適生育温度よりも高い、例えば35℃でも十分に良好な生育を示すので、発酵工程のための特別に大きな冷却器を必要とせず、また多大なエネルギーを消費しないであろう。また、本発明のベクターにより形質転換されたそれらの酵母は、通常の最適なpHよりも低い環境下でも十分に良好な生育を示すので、発酵中にpHを高くするためのアルカリの添加の労力を減らすだけでなく、廃液の問題も低下させるであろう。
その他の用途
 上記のとおり、本発明のポリペプチドは、真菌の生育促進機構を解明するための研究に用いることが可能である。また、本発明のポリペプチドは、更なる高活性ポリペプチドのリード物質として利用可能である。そのような用途のために、本発明のポリペプチド、核酸及びベクターのいずれも、研究のための試薬として利用できる。当該試薬は、本発明のポリペプチド、核酸又はベクターを、例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、及び界面活性剤等の分散剤とともに、適切なpHの緩衝液に溶解して得ることができる。
 以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は5’から3’方向に向けて記載され、アミノ酸配列はN末端からC末端方向に向けて記載される。
参考例1:全長ORF4コード化配列を導入した酵母の作製
 MoCV1のORF4遺伝子中のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質を生産する形質転換体を、以下の手順で作製した。
<1-a> 発現ベクターの構築
 ATCCより購入したプラスミドpRS426(図3)をもとにして、S.cerevisiaeのTDH3遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域の間に挟まれたマルチ・クローニング・サイトを有する、プラスミドpRST426を作製した(図4)。詳細には、S.cerevisiae W303-1A[L-A-o]株よりゲノムDNAを抽出し、PCRにてTDH3遺伝子のプロモーター領域(Primer1:forwardとPrimer2:reverse)とターミネーター領域(Primer3:forwardとPrimer4:reverse)を増幅し、それぞれ市販のpUC19プラスミドへクローニングした。なお、PCR条件は、KOD-plus-(商品名、TOYOBO社製)のマニュアルに従った。次に、プロモーター領域を含むプラスミドからBlnI1/BamHIでプロモーター領域を切り出し、同じ制限酵素で切断したターミネーター領域を含むプラスミドに挿入した。NotI/XhoIでこのプラスミドから遺伝子発現用カセット部分を切り出し、同じ制限酵素で切断したpRS426プラスミドに挿入した(図5)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002

 一方、MoCV1-dsRNA4 cDNA(配列番号1)を鋳型として、PCRにてORF4(PrimerA:forwardとPrimerB:reverse)を増幅した。PCR条件は、KOD-plus-(商品名、TOYOBO社製)のマニュアルに従った。PCR増幅産物は、pUC19プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからEcoRI/HpaIで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したpRST426へ挿入して、全長ORF4の発現ベクターを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003

<1-b> 酵母の形質転換
 S.cerevisiae W303-1A(Mat a ura3 leu2 his3 trp1 ade2 L-A-o)株を30℃で培養した後、遠心分離により回収してから蒸留水で懸濁し、再度遠心分離にかけて洗浄した。沈殿物にSolA(0.1M Lithium acetate、10mM Tris-HCl pH7.8、1mM EDTA)を加えて懸濁して遠心分離し、沈殿物に再びSolAを加えて懸濁して酵母溶液とした。これを30℃で50分間インキュベートした後、熱処理したssDNA(1mg/ml、サーモンスパーム)10μl、酵母溶液50μl、上記の全長ORF4の発現ベクター10μl、SolA 20μl、50% ポリエチレングリセロール750μlの順に加えた後、30℃で30分間、42℃で15分間インキュベートした。遠心分離後、沈殿物に蒸留水を加えてSC寒天平板培地(シャトルベクターの選択マーカーに合わせてドロップアウト培地を選択する)にまいて、30℃で培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

参考例2:ORF4の16位-イソロイシンから812位-セリンまでのコード化配列を導入した酵母の作製
 上記<1-a>で作製した発現ベクターpRST426のマルチ・クローニング・サイトに、ORF4の16位-イソロイシンから812位-セリンまでのコード化配列(以下、当該配列及びその翻訳産物を「1B」と略す。)を挿入した。詳細には、MoCV1-dsRNA4 cDNA(配列番号1)を鋳型として、PCRにて1B(PrimerC:forwardとPrimerB:reverse)を増幅した。PCR条件は、KOD-plus-(商品名、TOYOBO社製)のマニュアルに従った。PCR増幅産物は、pUC19プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからEcoRI/HpaIで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したpRST426へ挿入して、1Bの発現ベクターを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005

 上記<1-b>と同じ手順で、得られた1B発現ベクターによりS.cerevisiae W303-1A(Mat a ura3 leu2 his3 trp1 ade2 L-A-o)株を形質転換した。
参考例3:ORF4の16位-イソロイシンから435位-グルタミンまでのコード化配列を導入した酵母の作製
 上記<1-a>で作製した発現ベクターpRST426のマルチ・クローニング・サイトに、ORF4の16位-イソロイシンから435位-グルタミンまでのコード化配列(以下、当該配列及びその翻訳産物を「13」と略す。)を挿入した。詳細には、MoCV1-dsRNA4 cDNA(配列番号1)を鋳型として、PCRにて13(PrimerC:forwardとPrimerD:reverse)を増幅した。PCR条件は、KOD-plus-(商品名、TOYOBO社製)のマニュアルに従った。PCR増幅産物は、pUC19プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからEcoRI/SmaIで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したpRST426へ挿入して、13の発現ベクターを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006

 上記<1-b>と同じ手順で、得られた13発現ベクターによりS.cerevisiae W303-1A(Mat a ura3 leu2 his3 trp1 ade2 L-A-o)株を形質転換した。
実施例1:ORF4の436位-グリシンから693位-システインまでのコード化配列を導入した酵母の作製
 上記<1-a>で作製した発現ベクターpRST426のマルチ・クローニング・サイトに、ORF4の436位-グリシンから693位-システインまでのコード化配列(以下、当該配列及びその翻訳産物を「24」と略す。)を挿入した。詳細には、MoCV1-dsRNA4 cDNA(配列番号1)を鋳型として、PCRにて24(PrimerE:forwardとPrimerF:reverse)を増幅した。PCR条件は、KOD-plus-(商品名、TOYOBO社製)のマニュアルに従った。PCR増幅産物は、pUC19プラスミドへクローニングし、当該プラスミドからEcoRI/SmaIで挿入断片を切り出した。その断片を、同じ制限酵素で切断したpRST426へ挿入して、24の発現ベクターを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007

 上記<1-b>と同じ手順で、得られた24発現ベクターによりS.cerevisiae W303-1A(Mat a ura3 leu2 his3 trp1 ade2 L-A-o)株を形質転換した。
実施例2:全長ORF4、1B、13及び24導入酵母の生育試験
 ジャーファーメンター培養により、それぞれの形質転換酵母の生育を試験した。
<2-a> 全長ORF4、1B及び24の比較
 微生物培養装置(BM2-02NP3、ABLE社製)を用いて標題の配列を導入した酵母を培養し、その生育を試験した。なお、陰性対照としては、pRST426を導入した酵母を用いた。培地は全てSC-ura液体培地を用いた。詳細には、5mlの液体培地(試験管)に30℃、3日間寒天培地上で培養した酵母を植菌し、28℃、145rpmで16時間震盪培養した(前々培養)。この培養液をOD600=0.1となるように50mlの液体培地(200mlコルベン)に加え、28℃、140rpmで12時間培養した(前培養)。この培養液をOD600=0.03となるように液体培地1Lを入れた微生物培養装置に植菌し、温度35℃、空気流量1.5L/min、撹拌100rpmの条件で培養した(本培養)。溶存酸素濃度を、ABLE社製のDOセンサー(直径12ミリ密閉型 L=220mm)により測定した。
 上記の培養液を経時的にサンプリングした。詳細には、微生物培養装置のサンプルング口にシリコンチューブでシリンジを接続し、培養液10mlをシリンジで取り出し、滅菌遠心管に移した。そのようにして得た培養液サンプルの一部を滅菌水で希釈した後に寒天平板上に撒いた。それらの平板を28℃で3日間インキュベートした後、平板上のコロニーの形成数を計測して、生菌細胞数を測定した。また、培養液サンプルの別の一部の吸光度を、分光光度計(UV-1800、島津社製)により測定した。次いで、吸光度を測定した後のサンプルを遠心分離して、上清と菌体に分けた。上清中のグルコース濃度を、バイオセンサー(BF-5、BF-30AS、グルコースセンサー:ED05-0003、王子計測機器社製)を用いて測定した。また、菌体からはタンパク質を抽出し、抗ORF4p抗体を用いたウエスタンブロッティングにより目的のタンパク質が生産されていることを確認した(図8)。更に、一部の菌体について、顕微鏡(倒立型リサーチ顕微鏡 IX71 Olympus)を用いて細胞形態を観察した(倍率1,000倍、微分干渉)。
 培養液サンプルの試験結果として、1B導入株で顕著な生育不良が認められた。一方、24導入株では生育速度の上昇が見られた(図6)。なお、24導入株において、濁度の上昇とCFUの上昇が培養26時間付近で停滞しているが、下記のように菌体の異常な凝集が確認されており、その影響と考えられた。
 また、細胞形態観察の結果として、ORF4と1Bの導入株では細胞が肥大化し、細胞内が顆粒化しているのが認められた。一方、24導入株では細胞の肥大化はあまり見られなかったが、多数の細胞が集まり、巨大な細胞凝集体を形成していた(図7)。また、プレート上のコロニーは、1B導入株でサイズが顕著に小さく、逆に24導入株では凸凹したサイズの大きなコロニーが見られた(図7)。
<2-b> 全長ORF4、1B及び13の比較
 上記<2-a>の生育試験(pH、濁度及び生菌細胞数)を、全長ORF4、1B及び13を導入した酵母について行った。結果として、pHの低下、濁度の上昇及び生菌細胞数の増加のいずれの項目においても、1B及び13導入株は、全長ORF4よりも著しい生育阻害活性を示した。なお、pHの低下や濁度の上昇速度は1B導入株が最も緩やかであった。しかし、生菌細胞数は13導入株でも1B導入株と同程度の抑制が見られ、常に低い値が示された(図9)。このことから、ORF4の16位-イソロイシンから435位-グルタミンまでの領域は、真菌の生育を阻害する活性を有していると考えられた。
 本発明のポリペプチドは、顕著な真菌の生育促進活性及び耐ストレス性向上活性を示すので、各種の発酵生産において利用可能である。また、研究用試薬としても利用可能であるので、化学品製造業においても有用であり得る。

Claims (8)

  1. 真菌の生育を促進する能力を有するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列:
     1) 配列番号2で示されるアミノ酸配列のうちの435位-グルタミンまでを含まない配列であって、少なくとも配列番号2の436位-グリシンから693位-システインまでを含むアミノ酸配列;
     2) 上記1)に対して少なくとも60%以上の相同性を示すアミノ酸配列;、又は
     3) 上記1)のアミノ酸配列に対して、一個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、
    から成る、前記ポリペプチド。
  2. 上記1)のアミノ酸配列が、配列番号2の436位-グリシンから693位-システインまでの配列である、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. 請求項1又は2に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  4. 請求項3に記載の核酸が作動可能に連結されたベクター。
  5. 請求項4に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
  6. 請求項1又は2に記載のポリペプチド、請求項3に記載の核酸或いは請求項4に記載のベクターを含む、真菌の生育を促進するための組成物。
  7. 真菌の生育を促進する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して請求項1又は2に記載のポリペプチド、請求項3に記載の核酸或いは請求項4に記載のベクターを投与することを含む、前記方法。
  8. 真菌のストレス耐性を向上する方法であって、そのような処理が必要とされる真菌に対して請求項1又は2に記載のポリペプチド、請求項3に記載の核酸或いは請求項4に記載のベクターを投与することを含む、前記方法。
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